JP2012041348A - ｓＡＰＰα分泌を増強させる及びブリオスタチン型化合物を用いて認知を改善させるための手段としてのＰＫＣ活性化 - Google Patents

Abstract

【課題】α−セクレターゼを調節する、および／または、認知能力を改善する、組成物および方法の提供。
【解決手段】ＰＫＣ活性化因子、特にＰＫＣα、ＰＫＣδ、およびＰＫＣεを選択的に活性化する因子を投与する。具体的には、マクロサイクリックラクトン（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ ｌａｃｔｏｎｅ）、ベンゾラクタム（ｂｅｎｚｏｌａｃｔａｍ）、ピロリジノン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）又はその組み合わせが好ましく用いられる。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

［発明の背景］
（ｉ）発明の分野
本発明は、α−セクレターゼおよび認知増強（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）に関する。更に、本発明は、アミロイドプロセッシングに関連する容態（例えば、アルツハイマー病）の治療のための化合物及び係る容態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）の治療のための組成物に関する。

（ｉｉ）発明の背景
認知（ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）に影響する様々な障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）および疾患（ｄｉｓｅａｓｅｓ）が存在する。認知は、一般に少なくとも３つの異なるコンポーネントを含んでいると説明できる、即ち：注意（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ）、学習（ｌｅａｒｎｉｎｇ）、および記憶（ｍｅｍｏｒｙ）である。これらのコンポーネントの各々とそれらの個々のレベルとは、被験者の認知能力の全体のレベルに影響する。例えば、アルツハイマー病患者は全体の（ｏｖｅｒａｌｌ）認知の損失、それに伴うそれらの個々の特性の衰退（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）を受けるが、前記疾患に最も多く関連するものは記憶喪失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ）である。他の疾患において、患者は、認知の異なる特性と優先的に関連する認知損傷（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）を経験する。例えば、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）は、注意状態（ａｔｔｅｎｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ）を維持する個体の能力に集中（ｆｏｃｕｓｅｓ）している。他の容態には、他の神経疾患、加齢、および精神的な能力（ｍｅｎｔａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ）に有害な（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ）効果を生じ得る容態の治療（例えば、癌治療、発作／虚血、および精神遅滞）と関連する、一般的な痴呆が含まれる。
認知障害（Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）は、現在の社会に様々な問題を生み出している。

それゆえに、科学者は、認知増強剤（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）または認知活性化因子（ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）を開発する努力に労力を費やしてきた。開発された認知の増強剤または活性化剤には、向知性因子（ｎｏｏｔｒｏｐｉｃｓ）、血管拡張因子（ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒｓ）、代謝増強因子（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）、精神刺激因子（ｐｓｙｃｈｏｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ）、コリン作用性因子、生体アミン薬およびニューロペプチド（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）が含まれると一般的に分類されている。

血管拡張因子および代謝増強因子（例えば、ジヒドロエルゴトキシン）は、大脳血管 連結−虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｖｅｓｓｅｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｉｓｃｈｅｍｉａ）により誘導された認知障害において主に効果的である；しかしながら、それらは臨床使用に及び他のタイプの認知障害に無効である。開発された認知増強剤の中で、典型的には代謝性薬物のみが臨床使用（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ）に用いられるが、他のものはいまだ研究段階である。向知性因子の中で、例えば、ピラセタム（ｐｉｒａｃｅｔａｍ）は末梢性の内分泌系を活性化し、患者において産生される高濃度のステロイドのためにアルツハイマー病に適切ではない、一方タクリン（コリン作動薬）は、嘔吐、下痢、および肝毒性を含む様々な副作用を有している。

罹患した個体の認知能力を改善する方法は、様々な研究の主題となっている。近年、アルツハイマー病に関する認知状態（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ）と患者の記憶を改善する異なる方法とは、多様なアプローチおよび戦略の主題となっている。残念ながら、これらのアプローチおよび戦略は、罹患した個体における症候性の（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ）及び一過性の認知のみを改善するものであり、疾患の進行に対処するものではなかった。アルツハイマー病のケースにおいて、典型的にはコリン作用性経路を介した又は他の脳伝達物質経路を介した、認知を改善する取り組みが研究されてきた。主要なアプローチは、薬物療法を介したアセチルコリンエステラーゼ酵素の阻害に依存するものである。

アセチルコリンエステラーゼは主要な脳酵素であり、そのレベルを操作することにより他の神経学的な機能に多様な変化を生じさせ、副作用を生じさせる。

それらの方法および他の方法により認知が改善されるが（少なくとも一過性に）、それらにより疾患の進行は修正されず、疾患の原因が特定されることもない。例えば、アルツハイマー病は、典型的にはアミロイド前駆体タンパク質の蓄積を介した、プラーク（ｐｌａｑｕｅｓ）の形成に関連する。免疫学的な応答を惹起するための試行（アミロイドおよびプラーク形成に対する治療を介した）が、動物モデルで実施されたが、ヒトに首尾よく応用されてはいない。

さらにまた、コリンエステラーゼ阻害剤は、いくつかの症候を短時間改善し、これは中間から中等度（ｍｉｄ ｔｏ ｍｏｄｅｒａｔｅ）の症状（ｓｙｍｐｔｏｍｓ）を有するアルツハイマー病患者の一部のみにおいて生じ、それゆえに全体の患者集団の小部分に対してのみ有用な治療である。さらに重大なことは、認知を改善することに対しての本試行は、疾患状態の治療に至らず、症状を単に寛解（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｖｅ）させるだけである。現行の治療は、疾患の進行に影響しない。これらの治療には、アルツハイマー病患者の症状を治療するための「ワクチン」の使用も含まれ、これは（理論的に妥当であり、マウス試験では効果的であるが）ヒトにおいは重度な副作用の原因であることが示されている。

結果として、認知損傷（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）の（特にアルツハイマー病の）治療に対するコリン作用性経路の使用は、不十分（ｉｎａｄｅｑｕａｔｅ）であることが証明されている。

更に、認知改善（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）に対する現在の治療は、特定の神経変性疾患に限定されており、他の認知状態（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）の治療に効果的であるとは証明されていない。

アルツハイマー病は、脳における特定のニューロンのサブポピュレーションの広範な損失と関連し、最も普遍的な症状である記憶喪失（ｍｅｍｏｒｙ ｌｏｓｓ）を伴う（Ｋａｔｚｍａｎ， Ｒ． （１９８６） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３１４：９６４）。アルツハイマー病は、神経病理学的な変化に関して良く特性が調べられている。しかしながら、異常性（ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）が末梢組織において報告されており、これはアルツハイマー病が全身性の障害（最も顕著である中枢神経系の病状（ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）を伴う）である可能性を支持している（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ， Ｇ．， Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ： ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ， Ｒｅｖｉｅｗ， ＴｉＰＳ Ｖｏｌ． １９， １７１−７７ （１９９８））。

アルツハイマー病の議論に関しては、遺伝的起源、染色体１、１４、および２１にリンクする（Ｓｔ． Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ， Ｐ． Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５： ８８５ （１９８７）； Ｔａｎｚｉ， Ｒｕｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ Ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｒｅｖｉｅｗ， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ３， １５９−１６８ （１９９６）； Ｈａｒｄｙ， Ｊ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃａｎｄ： Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １６５： １３−１７ （１９９６）を参照されたい）。

ニューロンの損失に至る細胞変化および疾患の根底にある病因学は調査中であるが、ＡＰＰ代謝の重要性に関しては確立されている。アルツハイマー病を有する患者の脳において、一貫してその存在が同定され、脳の生理学または病態生理学において作用する２つのタンパク質は、β−アミロイドおよびｔａｕである。（Ｓｅｌｋｏｅ， Ｄ．， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓｅａｓｅ： Ｇｅｎｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｖｏｌ． ８１， Ｎｏ．２， ２００１を参照されたい）。β−アミロイドタンパク質代謝および異常なカルシウムホメオスタシスおよび／またはカルシウム活性化キナーゼにおける欠陥（ｄｅｆｅｃｔｓ）の考察（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｌｃｉｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｒｅ ａｌｔｅｒｅｄ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｒｅ−ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ＰＳＩ ｃａｒｒｉｅｒｓ： ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ， Ｖｏｌ． ３， Ｎｏｓ． ５ ＆ ６， ｐｐ． ３０５−３１２ （２０００）； Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｉｓｏｚｙｍｅｓ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｉｒｗａｙｓ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｔｏｎｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １３０， ｐｐ １４３３−５２ （２０００））。
正常な及び異常な記憶に関する更なる事項は、Ｋ^＋およびＣａ^２＋チャネルの双方が、記憶（ｍｅｍｏｒｙ）の保存（ｓｔｏｒａｇｅ）および想起（ｒｅｃａｌｌ）において鍵となる役割を担っていることが実証されていることである。

例えば、カリウムチャネルが記憶の保存の間に変化することが見出されている（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８９：７１８４； Ｓａｎｃｈｅｚ−Ａｎｄｒｅｓ， Ｊ． Ｖ． ａｎｄ Ａｌｋｏｎ， Ｄ． Ｌ． （１９９１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６５：７９６； Ｃｏｌｌｉｎ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ５５：９５５； Ａｌｋｏｎ， Ｄ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４４：２７８； Ａｌｋｏｎ， Ｄ． Ｌ． （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：１０３７）。この観察は、アルツハイマー患者における記憶喪失の殆ど全ての一般的な症状と連関しており、このことにより、アルツハイマー病の病状に関連し得る部位としてカリウムチャネル機能および認知におけるＰＫＣ調節（ＰＫＣ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）の効果の研究が導かれた。

ＰＫＣは、非受容体型セリン−スレオニンタンパク質キナーゼの最大の遺伝子ファミリーの１つとして同定された。Ｎｉｓｈｉｚｕｋａおよび共同研究者による８０年代初期のＰＫＣの発見（Ｋｉｋｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５７， １３３４１ （１９８２）， ）及びそのホルボールエステルに対する主要な受容体としての同定（Ａｓｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４３， ４３３３ （１９８３） ）により、多数の生理的なシグナル伝達機構に本酵素がかかわっていることが理解されている。ＰＫＣに関する多大な興味は、カルシウムおよびジアシルグリセロール（およびそのホルボールエステル模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ））によって、インビトロで活性化されるそのユニークな能力に起因する。ジアシルグリセロールは、その形成が成長および分化因子の作用によるリン脂質ターンオーバーと連関（ｃｏｕｐｌｅｄ）しているエフェクターである。

現在、ＰＫＣ遺伝子ファミリーは１１遺伝子からなり、これらは４つのサブグループに分けられる、即ち：１）古典的（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）ＰＫＣα、β_１、β_２（β_１およびβ_２は同じ遺伝子の選択的スプライシングされた形態である）およびγ、２）新規（ｎｏｖｅｌ）ＰＫＣδ、ε、ηおよびθ、３）非定型（ａｔｙｐｉｃａｌ）ＰＫＣζ、λ、ηおよびι並びに４）ＰＫＣμである。ＰＫＣμは、新規ＰＫＣアイソフォームと似ているが、推定上の膜貫通ドメインを有していることにより異なっている（Ｂｌｏｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ． Ｒｅｖ．， １３， ４１１ （１９９４）； Ｉｌｕｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．， ２９１，３２９ （１９９３）； Ｋｉｋｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５８，３１ （１９８９） により論評された）。α、β_１、β_２、およびγアイソフォームは、Ｃａ^２＋、リン脂質、およびジアシルグリセロール−依存的であり、ＰＫＣの古典的アイソフォームを代表する。他のアイソフォームは、リン脂質およびジアシルグリセロールにより活性化されるが、Ｃａ^２＋依存的ではない。全アイソフォームは、５つの可変性（Ｖ１−Ｖ５）領域を含む、またα、β、γアイソフォームは４つの（Ｃ１−Ｃ４）構造ドメインを含有しており、これらは高度に保存されている。

全アイソフォーム（ＰＫＣα、βおよびγ以外）はＣ２ドメインを欠いている。またλ、ηおよびアイソフォームも、ジアシルグリセロールが結合するＣ１における２つのシステインリッチジンクフィンガードメインの９（ｎｉｎｅ）を欠いている。またＣ１ドメインは偽基質配列を含み、該偽基質配列は全アイソフォーム間で高度に保存され、また該偽基質配列は基質結合サイトをブロッキングすることにより自己制御的な機能を提供して酵素の不活性のコンホメーションを形成する（Ｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３８， １７２６ （１９８７））。

これらの構造的な特徴が理由で、多様なＰＫＣアイソフォームは、生理的な刺激に（Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ， Ｃａｎｃｅｒ， １０， １８９２ （１９８９））、同様に腫瘍性転化（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および分化に（Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ， Ｃａｎｃｅｒ， １０， １８９２ （１９８９））応答するシグナル伝達に、高度に特殊化した役割を有していると考えられる。既知のＰＫＣ調節因子の議論に関しては、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８１４１、米国特許第５，６５２，２３２；６，０４３，２７０；６，０８０，７８４；５，８９１，９０６；５，９６２，４９８；５，９５５，５０１；５，８９１，８７０および５，９６２，５０４号を参照されたい。

ＰＫＣがシグナル伝達に作用するという中心的役割の考察において、ＰＫＣがＡＰＰプロセッシングの調節の興味深い標的であることが証明されている。ＰＫＣがＡＰＰプロセッシングに作用することは確立されている。例えば、ホルボールエステルは、ＰＫＣ活性化を介して分泌される非アミロイド形成性の可溶性ＡＰＰ（ｓＡＰＰ）の相対量を顕著に増加させることが示されている。しかしながら、ホルボールエステルによるＰＫＣの活性化が、ＡＰＰ分子の直接のリン酸化を生じるようには思われない。作用の正確な部位とは無関係に、ホルボール誘導性のＰＫＣ活性化は、α−セクレターゼ、非アミロイド形成性の経路の増強または支援を生じる。従って、ＰＫＣ活性化は、無害（ｎｏｎ−ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ）のｓＡＰＰの産生に影響する、および、更に有益なｓＡＰＰを産生する、および、同時にＡβペプチドの相対量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）を減らす、ための魅力的なアプローチである。しかしながら、ホルボールエステルは、最終的な薬剤開発に向けた適切な化合物ではない、なぜならそれらは腫瘍促進活性（ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有しているからである（ｌｂａｒｒｅｔａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｅｎｚｏｌａｃｔａｍ （ＢＬ） ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓＡＰＰ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｉｎ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ， ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ， Ｖｏｌ． １０， Ｎｏ． ５＆６， ｐｐ １０３５−４０ （１９９９））。

個々のＰＫＣアイソザイムが、生物学的プロセスにおいて異なる（場合によっては逆の）作用を発揮するという証拠が増えており、このことは薬理学的な探索に２つの方向性を提起する。１つは、ＰＫＣの特異的な（好ましくは、アイソザイム特異的な）阻害剤の設計である。触媒ドメインがＰＫＣのアイソタイプ特異性を主に決定するドメインではないとの事実から考えると、このアプローチは困難である。他のアプローチは、アイソザイム選択的で、制御部位特異的（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）なＰＫＣ活性化因子を開発することである。これらにより、他のシグナル伝達経路の効果を、逆の生物学的効果で支配（ｏｖｅｒｒｉｄｅ）する方法を提供し得る。或いは、急性活性化（ａｃｕｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）の後にＰＫＣのダウンレギュレーションを誘導することにより、ＰＫＣ活性化因子は長期の拮抗作用を生じ得る。現在、ブリオスタチン（Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ）が、抗癌剤として臨床試験中である。ブリオスタチンが、ＰＫＣの制御ドメインに結合すること、また本酵素を活性化することが知られている。ブリオスタチンは、ＰＫＣのアイソザイム選択的活性化因子の例である。

化合物（ブリオスタチンに加えて）が、ＰＫＣを調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）することが発見されている（例えば、ＷＯ９７／４３２６８を参照されたい）。認知能力（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ）の特定の特性または一般的な認知（ｇｅｎｅｒａｌ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）の何れかを介して、全体の認知を改善する治療方法を開発する必要性がいまだ存在している。また、認知増強（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）を改善する方法を開発する必要性がいまだ存在している（それが特定の疾患状態または認知障害（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）に関するかどうにかかわらず）。本発明の方法および組成物は、それらの必要性を充足（ｆｕｌｆｉｌｌ）し、アルツハイマー病および他の神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）のための臨床治療を多大に改善し、同様に改善された認知増強を提供する。また、前記の方法および組成物は、αセクレターゼの調節を介した、認知状態の治療および／または増強を提供する。

［発明の概要］
本発明は、認知能力の増強／改善に関連する容態の治療のための、化合物、組成物、および方法に関する。好適な態様において、更に本発明は、アミロイドプロセッシングに関連する容態（例えば、アルツハイマー病）の治療のための、化合物、組成物、および方法に関し、治療された被検者における改善された／増強された認知能力のために提供される。特に、本発明の化合物および組成物は、ブリオスタチンクラスおよびネリスタチンクラスのマクロサイクリックラクトンから選択される。

別の側面において、本発明は、マクロサイクリックラクトン化合物、組成物、およびα−セクレターゼ活性を調節する方法に関する。特にブリオスタチンおよびネリスタチンクラス化合物に関する、更にブリオスタチン−１に関する。

本発明の別の側面は、ＰＫＣ活性化因子としての、ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ）およびネリスタチン（ｎｅｒｉｓｔａｔｉｎ）クラス化合物に関し、これらはアミロイドプロセッシングに関連する容態を変化させるためのものであり、α−セクレターゼを増強して可溶性α−アミロイド前駆体タンパク質（αＡＰＰ）を産生してβ−アミロイド凝集を阻止（ｐｒｅｖｅｎｔ）し、認知能力を改善／増強するためのものである。そのような活性化は、例えば、アルツハイマー病の治療において実施し得る（特に、ブリオスタチン―１）。

別の側面において、本発明は、プラーク形成（例えば、アルツハイマー病と関連する）を治療するための方法、および被験者の認知状態を改善／増強するために、被験者にブリオスタチンまたはネリスタチンクラス化合物の効果的な量を投与することを含む方法に関する。より好適な態様において、前記化合物はブリオスタチン−１である。

本発明の別の側面は、プラーク形成を治療する及び認知能力を改善／増強するための組成物、即ち：（ｉ）可溶性のβ−アミロイドを上昇させ、可溶性αＡＰＰを産生し、β−アミロイド凝集を阻止するために効果的な量のマクロサイクリックラクトン；および（ｉｉ）薬学的に効果的な担体、を含む組成物に関する。好適な態様において、前記組成物は、アルツハイマー病に関連する認知能力を改善／増強するために使用される。前記マクロサイクリックラクトンは、好ましくはブリオスタチンまたはネリスタチンクラス化合物、特にブリオスタチン−１から選択される。

本発明の一態様において、ＰＫＣアイソザイムの活性化は、改善された認知能力を生じる。一態様において、前記改善された認知能力は記憶である。別の態様において、前記改善された認知能力は、学習である。別の態様において、前記改善された認知能力は、注意である。別の態様において、ＰＫＣのアイソザイムは、マクロサイクリックラクトン（即ち、ブリオスタチンクラスおよびネリスタチンクラス）により活性化される。特に、ブリオスタチン−１から１８およびネリスタチンを使用して、ＰＫＣアイソザイムが活性化される。好適な態様において、ブリオスタチン−１が使用される。

別の側面において、本発明は、認知能力を改善するために効果的な量で投与される、ＰＫＣアイソザイム活性化因子の組成物を含む。好適な態様において、前記ＰＫＣアイソザイム活性化因子は、マクロサイクリックラクトン（即ち、ブリオスタチンクラスおよびネリスタチンクラス）から選択される。好適な態様において、投与されるＰＫＣアイソザイム活性化因子の量は、ｓＡＰＰの産生を増加するために効果的な量である。より好適な態様において、投与される組成物の量は、筋肉痛（ｍｙａｌｇｉａ）を生じさせない。

好適な態様において、前記ＰＫＣアイソザイムは、被検者において活性化され、この被検者は神経疾患、発作（ｓｔｒｏｋｅｓ）、または低酸素症（ｈｙｐｏｘｉａ）を罹患している（ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ ｏｒ ｈａｖｅ ｓｕｆｆｅｒｅｄ）被検者である。

より好適な態様において、前記ＰＫＣアイソザイムは、アルツハイマー病の被検者またはモデルにおいて活性化される。

本発明の別の態様において、前記ＰＫＣ活性化は、アミロイド前駆体タンパク質代謝の調節を生じる。更にＰＫＣ活性化による調節は、アルファ・セクレターゼ経路において増加を生じる。アルファ・セクレターゼ経路は、認知損傷に関連する非毒性（ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ）で非アミロイド形成性（ｎｏｎ−ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ）の断片を生じる。結果的に被検者の認知状態が改善する。

本発明の別の態様において、前記ＰＫＣ活性化は、アミロイド形成性の及び毒性の断片であるＡｂｅｔａ４０およびＡｂ４２を減少させる。

本発明の別の態様は、ＰＫＣアイソエンザイムの活性化を介した、認知能力を改善する方法である。本発明の別の態様において、前記ＰＫＣ活性化は、「正常（ｎｏｒｍａｌ）」な被検者において生じる。本発明の別の態様において、ＰＫＣ活性化は、認知能（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｆａｃｕｌｔｉｅｓ）を衰退させる、または認知を機能不全にする、疾患を罹患している被検者において生じる。好適な態様において、前記方法は、アルツハイマー病を治療するための方法である。

本発明の別の態様において、ＰＫＣの調節は、非腫瘍促進因子（ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の使用を介したものであり、改善された認知能力を生じる。好適な態様において、前記ＰＫＣ活性化因子は、ブリオスタチン−１からブリオスタチン−１８およびネリスタチンから選択される。より好適な態様において、ブリオスタチン−１が使用される。

別の態様において、ブリオスタチン−１は、非ブリオスタチンクラス化合物と組み合わせて使用して、認知能力を改善し、副作用を減らす。

本発明の別の態様において、マクロサイクリックラクトン（即ち、ブリオスタチンクラスおよびネリスタチンクラス）を介したＰＫＣの調節は、アルツハイマー病と関連した容態の検査のためにインビトロで使用される。インビトロ使用（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｕｓｅ）は、例えば、線維芽細胞、血液細胞の検査、または細胞モデル（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｓ）におけるイオンチャネルコンダクタンスのモニタリング（ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を含み得る。

本発明の好適な態様において、前記化合物および組成物は、経口のおよび／または注射可能な、形態で投与され、これには静脈内および脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｙ）への投与が含まれる。

以上のとおり、本発明は、障害された記憶（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｍｅｍｏｒｙ）または学習障害（ｌｅａｒｎｉｎｇ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を治療する方法を提供し、該方法は対象者に本化合物の１つの治療的に効果的な量を投与することを含む。本化合物（ｐｒｅｓｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）は、記憶欠陥（ｍｅｍｏｒｙ ｄｅｆｅｃｔｓ）または障害された学習（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｌｅａｒｎｉｎｇ）が発生する、臨床症状（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）の治療上の処置において使用し得る。このようにして記憶および学習を改善し得る。被験者の容態をこのようにして改善し得る。

前記組成物および方法は、臨床症状および障害（それらでは中心的な特性又は関連する症状の何れかとして、障害された記憶または学習障害が発生している）の治療に有用性を有する。本化合物（ｐｒｅｓｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）を治療に使用できる容態の例には、アルツハイマー病、多重梗塞性痴呆症（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｆａｒｃｔ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、およびパーキンソン病と関連（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）する又はしないアルツハイマー病のローリー体バリアント（Ｌｅｗｙ−ｂｏｄｙ ｖａｒｉａｎｔ）；クロイツフェルトヤコブ病およびカルサコフ障害（Ｋｏｒｓａｋｏｗ’ｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）が含まれる。

前記組成物および方法を使用して、障害された記憶または学習を治療でき、それは年齢に関連したもの、電気痙攣療法（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｏｎｖｕｌｓｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ）の結果として発症したものである又はそれは脳損傷（例えば、発作（ｓｔｒｏｋｅ）、麻酔事故（ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃ ａｃｃｉｄｅｎｔ）、頭部外傷（ｈｅａｄ ｔｒａｕｍａ）、低血糖（ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ）、一酸化炭素中毒（ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ）、リチウム中毒（ｌｉｔｈｉｕｍ ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ）またはビタミン欠乏症（ｖｉｔａｍｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）により発生した脳損傷）の結果として発症したものである。

前記化合物は、非腫瘍促進性（ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ）であること、また既に第二相臨床試験に入っていること、から付加的な利点（ａｄｄｅｄ ａｄｖａｎｔａｇｅ）を有している。

本発明は、認知を増強し、認知障害を阻止および／または治療するための薬学的組成物に関する。より具体的には、本発明は、認知を増強し、認知障害を阻止および／または治療するための活性成分として、マクロサイクリックラクトン（即ち、ブリオスタチンクラスおよびネリスタチンクラス）及びその誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を含む薬学的組成物に関する。

以上のとおり、認知を増強し、認知障害を阻止および／または治療するための薬学的組成物を提供することは、本発明の主要な課題である。前記薬学的組成物は、マクロサイクリックラクトン（特にブリオスタチンおよびネリスタチンクラス）、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体、および薬学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）もしくは賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含む。

本発明による薬学的組成物は、認知の増強、認知障害の予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）および／または治療に有用であり、この認知障害には、本明細書中に記載された学習獲得（ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）、記憶連結（ｍｅｍｏｒｙ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）、および想起（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明は、神経疾患（アルツハイマー病を含む）に関連するアミロイド症（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）の治療のための方法であって、哺乳類細胞におけるタンパク質のリン酸化を調節する、又は、に影響（ａｆｆｅｃｔｓ）する、少なくとも１つの薬剤の効果的な量を患者に投与することにより治療する方法に関する。

また、本発明は、アルツハイマー病を治療するための方法であって、マクロサイクリックラクトン（即ち、ブリオスタチンクラスおよびネリスタチンクラス）の効果的な量を患者に投与することを含む方法を提供する。

別の態様において、前記ブリオスタチンまたはネリスタチンクラス化合物は、被験者における腫瘍形成性の応答を阻止する又は減少させるために、ホルボールエステルと組み合わせて、上記方法において使用し得る。

［好適な態様の詳細な記載］
記憶喪失と障害された学習能力とは、臨床症状の範囲（ａ ｒａｎｇｅ ｏｆ）の特性である。例えば、記憶喪失は、アルツハイマー病を含む、痴呆状態の最も一般的な症状である。また、記憶欠陥は、他の種類の痴呆、例えば、多重梗塞性痴呆症（ＭＩＤ）、脳血管性欠乏（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）により発生する老年痴呆（ｓｅｎｉｌｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、およびパーキンソン病と関連する又はしないアルツハイマー病のローリー体バリアント（Ｌｅｗｙ−ｂｏｄｙ ｖａｒｉａｎｔ）、またはクロイツフェルトヤコブ病と共に発症する。記憶喪失は、脳損傷の患者に共通する特性である。脳損傷（Ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ）は、例えば、古典的な発作（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｔｒｏｋｅ）の後または麻酔事故、頭部外傷、低血糖、一酸化炭素中毒、リチウム中毒、ビタミン（Ｂ１、チアミンおよびＢ１２）欠乏、もしくは過剰なアルコール使用もしくはカルサコフ障害の結果として発症し得る。更に、記憶障害（Ｍｅｍｏｒｙ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）は、年齢関連の；年齢の増加と共に減少するように思われる、例えば、名前、場所および単語などの情報を想起する能力であってもよい。一過性の記憶喪失は、電気痙攣療法（ＥＣＴ）後の主要な抑鬱性の障害（ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）に罹患した患者においても発生し得る。アルツハイマー病は、老齢人口（ａｇｅｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）における進行性の痴呆に関して、実際に最も重要な臨床上の本体（ｅｎｔｉｔｙ）であり、一方で低酸素症／発作は、神経学的な障害に関連しない顕著な記憶欠陥の原因である。

アルツハイマー病を有する個体は、進行性の記憶障害、言語および視空間能力（ｖｉｓｕｏｓｐａｔｉａｌ ｓｋｉｌｌｓ）の損失並びに行動欠陥（ｂｅｈａｖｉｏｒ ｄｅｆｉｃｉｔｓ）により特徴づけられる（ＭｃＫｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ３４：９３９−９４４）。アルツハイマー病を有する個体の認知損傷は、大脳皮質、海馬、前脳基底核（ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ）、および他の脳領域に局在するニューロン細胞の変性の結果である。

剖検で採取されたアルツハイマー病の脳の組織学的分析は、変性しているニューロンの核周部（ｐｅｒｉｋａｒｙａ）およびアクソンにおける神経原線維タングル（ＮＦＴ；ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ）、細胞外の神経炎（老年性）プラーク、並びに罹患した脳領域の血管の内側および周囲のアミロイドプラーク、の存在を実証した。神経原線維タングルは、ラセン状様式（ｈｅｌｉｃａｌ ｆａｓｈｉｏｎ）でペアを形成した線維（直径、約１０ｎｍ）を含有している、異常なフィラメント状構造体であり、ペアのラセン状フィラメント（ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）とも称される。神経炎プラーク（Ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）は、変性している神経末端（軸索および樹状の双方）に局在し、アミロイドタンパク質線維のコア混合物（ｃｏｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を含有する。要約すると、アルツハイマー病は、神経病理学的な特性（これには、主に細胞骨格タンパク質、並びに細胞外の実質性の（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ）及び脳血管のアミロイドから構成される、細胞内の神経原線維タングルが含まれる）により特徴付けられる。更に現在、当該技術分野において、アルツハイマー患者、正常な老齢集団（ｎｏｒｍａｌ ａｇｅｄ ｐｅｏｐｌｅ）、および他の神経変性疾患（例えば、パーキンソン、ハンチントン舞踏病、ウェルニッケ・コルサコフまたは統合失調症）の間を区別するための方法が存在し、例えば、米国特許第５，５８０，７４８号および米国特許第６，０８０５８２号に更に記載されている。

アルツハイマー病は、変化したタンパク質カタボリズム（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ）により特徴付けられる脳障害であり、典型的には早期の記憶喪失と共に発症する。ＡＤの最も特徴的な臨床症状は、記憶喪失である。記憶喪失は、典型的には病気の進行の初期に生じ、主に最近の情報の学習に影響する。正常な連想記憶（ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ ｍｅｍｏｒｙ）貯蔵に関連する及びＡＤ患者の細胞において影響される又は非制御された（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ）、分子的および細胞的なプロセスは、ＡＤを治療する又は緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）するための手段および／または記憶を改善させるための手段である。ＡＤにおける記憶獲得（ｍｅｍｏｒｙ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）および記憶喪失の間の集束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ）の中心的および部分的に重要な中心（ｌｏｃｕｓ）は、プロテインキナーゼＣである。動物モデルにおける連想記憶に関する、いくつかの分子および分子的なイベントは、ＡＤにおいて変更されているか又は欠陥のある（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）ことが示されている。これらには、Ｋ＋チャンネル、カルシウム制御、およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）が含まれる。また、ＰＫＣは、アミロイド前駆物質タンパク質（ＡＰＰ）（ＡＤ病態生理学において中心的な要素）のプロセッシングに関与する。変化したタンパク質リン酸化は、アルツハイマー病に認められる細胞内の神経原線維タングルの形成と結び付けられている。ＡＤに認められるアミロイドプラークの主要なコンポーネントが由来する、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のカタボリズムにおけるタンパク質リン酸化の役割も調査されている。アルツハイマー病の病状の中心的な特性は、プラーク内でのアミロイドタンパク質の沈着である。

アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセッシングは断片の産生を決定付ける、該断片は、後に凝集して、アルツハイマー病（ＡＤ）に特徴的な老年性またはＡＤプラークとして知られる、アミロイド沈着を形成する。従って、ＡＰＰプロセッシングは、ＡＤにおける、早期の及び鍵となる病態生理学的なイベントである。

３つの代替的なＡＰＰプロセッシング経路が同定されている。以前に命名された「正常」なプロセッシングは、ＡＰＰをＡβ配列内の残基Ｌｙｓ１６（またはＬｙｓ１６およびＬｅｕ１７の間；ＡＰＰ７７０命名法（ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ））で切断する酵素の関与を含み、非アミロイド形成性の断片：大きいＮ−末端の外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）および小さい９ｋＤａの膜結合断片を生じる。この酵素は、いまだ完全に同定されていない、α−セクレターゼとして知られている酵素である。２つの付加的なセクレターゼが、ＡＰＰプロセッシングに関与する。１つの副経路（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ）では、Ａβドメインの外側のＡＰＰの切断（Ｍｅｔ６７１およびＡｓｐ６７２の間（β−セクレターゼによる））およびエンドソーム―リソゾーム系が関与する。付加的な切断部位は、Ａβ部分のカルボキシル末端に生じ、それは形質膜内でＡβペプチドのアミノ酸３９の後である。セクレターゼ（γ）作用は、細胞外のアミノ酸末端（全体のＡβ配列を含有する）および〜６ｋＤａの細胞と相互作用する断片（ａ ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を産生する。従って、βおよびγセクレターゼによるプロセッシングは、潜在的なアミロイド形成性の断片を産生する（それらが完全なＡβ配列を含有しているので）。いくつかの証拠は、全ての副経路が特定の系（ｇｉｖｅｎ ｓｙｓｔｅｍ）において発生すること及び可溶性のＡβが「正常な産物」であろうことを示している。しかしながら、ＣＳＦおよびプラズマにおける循環型（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）Ａβの量が、「スウェーデン（Ｓｗｅｄｉｓｈ）」変異を保持している患者において上昇しているとの証拠も存在する。そのうえ、この変異またはＡＰＰ_７１７変異を形質移入した培養細胞は、大量のＡβを分泌する。最近、他のＡＰＰ変異並びにＰＳ１およびＰＳ２変異の保因者が、特定の形態、長い（４２−４３アミノ酸）Ａβ、を多量に分泌することが示された。

従って、全ての副経路は正常に生じ得るが、アミロイド形成性のプロセッシングに有利なアンバランスが家族性の及びおそらく散発性の（ｓｐｏｒａｄｉｃ）ＡＤにおいて発生する。これらの増強されたアミロイド形成性の経路により、最終的にはＡＤ患者の脳における原繊維（ｆｉｂｒｉｌ）およびプラークの形成が生じる。従って、非アミロイド形成性の、α−セクレターゼ経路を支援する方向への干渉（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）は、ＡＰＰプロセッシングのバランスを、おそらく非病原性のプロセス（このプロセスは、ｓＡＰＰの相対量を潜在的に毒性のＡβペプチドと比較して増加させる）の方向に効果的にシフトさせる。

ＰＫＣアイソザイムは、決定的（ｃｒｉｔｉｃａｌ）、特異的、および律速（ｒａｔｅ ｌｉｍｉｔｉｎｇ）となる分子標的（この分子標的を介して、生化学的な、生物物理学的な、および行動的な（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ）有効性のユニークな関連性を実証できる）を提供し、そして被検者に適用されて認知能力が改善される。

本発明者は、プロテインキナーゼ（ＰＫＣ）の活性化因子としてのブリオスタチンを研究してきた。ＰＫＣにおける変化（Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）、同様にカルシウム制御およびカリウム（Ｋ^＋）チャネルにおける変化は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の線維芽細胞における変化に含まれる。ＰＫＣ活性化は、正常なＫ^＋チャンネル機能を回復させることが示され、これはＴＥＡ誘導による［Ｃａ^２＋］上昇によって測定された。更にパッチクランプデータは、１１３ｐＳ Ｋ^＋チャンネル活性の回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）におけるＰＫＣ活性化因子の効果を裏付けている（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｔｅｓ）。従って、Ｋ^＋チャンネルのＰＫＣ活性化因子に基づく回復は、ＡＤ病態生理学の研究に対する１つのアプローチとして完成され、ＡＤ薬物療法学（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に関する有用なモデルを提供する。（その全体が本明細書中に援用される、係属中の出願０９／６５２，６５６を参照されたい。）
アルツハイマー病（ＡＤ）患者からの末梢組織および動物ニューロン細胞の使用により、ＡＤ脳における対応するプロセスを反映している多くの細胞／分子の変化の識別が可能となり、その結果として多くの病態生理学的な関連性を識別することが可能となった（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｓｃｏｔｔ， １９９３； Ｈｕａｎｇ， １９９４； Ｓｃｈｅｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ ＆ Ａｌｋｏｎ， １９９７； Ｇａｓｐａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
カリウムチャネル機能の変化が、ＡＤ患者から採取された線維芽細胞（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３）および血液細胞（Ｂｏｎｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９９６）において同定されている。更に、ＡＤ病態生理学における主たる因子であると広く受け入れられた、β−アミロイド（Ｇａｎｄｙ ＆ Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ， １９９４； Ｓｅｌｋｏｅ， １９９４； Ｙａｎｋｎｅｒ， １９９６）は、コントロール線維芽細胞においてＡＤ類似のＫ^＋チャネル変化を誘導する能力を有していたことが示された（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。Ｋ^＋チャンネルにおけるβ−アミロイドの類似する又は対応する（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）効果が、実験動物のニューロンに関して報告されている（Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， １９９６； ａｌｓｏ ｆｏｒ ａ ｒｅｖｉｅｗ ｓｅｅ Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。ＡＤ脳におけるアパミン（ａｐａｍｉｎ）感受性Ｋ^＋チャンネルの海馬での変化の早期の観察（アパミン結合により測定された）により、Ｋ^＋チャンネルがＡＤにおいて病態生理学的に関連性を有するとの示唆を更に支持するデータが提供された（Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
さらにまた、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、ＡＤ患者の末梢および脳の組織において並行的な変化を提示させる。この酵素のレベル（Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ）および／または活性が、ＡＤ患者の脳および線維芽細胞に導入された（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｖａｎ Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｇｏｖｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。免疫ブロット分析を用いた研究により、多様なＰＫＣアイソザイムのうち、主にαアイソフォームが線維芽細胞中で有意に減少していたこと（Ｇｏｖｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）、一方でαおよびβアイソフォームの双方がＡＤ患者の脳で減少していること（Ｓｈｉｍｏｈａｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．， １９９０）が明らかにされた。これらの脳のＰＫＣ変化は、疾病プロセスにおける初期のイベントであろう（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。ＰＫＣ活性化が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の非アミロイド形成性のプロセッシングを支援（ｆａｖｏｒ）するように思われる（Ｂｕｘｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｓｅｌｋｏｅ， １９９４； Ｇａｎｄｙ ＆ Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ， １９９４； Ｂｅｒｇａｍａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｄｅｓｄｏｕｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｅｆｈｉｍｉｏｐｏｕｌｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６）ことも興味深い。従って、ＰＫＣおよびＫ^＋チャンネルの変化の双方がＡＤにおいて共存し、ＡＤにおける末梢および脳での発現を伴う。

ＰＫＣおよびＫ^＋チャンネルの変化の間のリンク（ｌｉｎｋ）が調査された。なぜならＰＫＣがイオンチャネル（Ｋ^＋チャンネルを含む）を制御することが知られており、欠陥のある（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）ＰＫＣが欠陥のあるＫ^＋チャンネルを生じるからである。これは、ＡＰＰの調節に関してのみならず、ＰＫＣおよびＫ^＋チャンネルが記憶の確立（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ）および想起に作用するという役割に関しても重要である。（例えば、Ａｌｋｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａｌ． ， １９９４； Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６を参照されたい） ＡＤ線維芽細胞を使用してＫ^＋チャンネルおよびＰＫＣ欠陥の双方を実証している（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｇｏｖｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３， １９９６）。研究は次のことも示している、ＰＫＣ活性化因子で処理された、既知の機能障害性の（ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）Ｋ^＋チャンネルを有する線維芽細胞が、ＴＥＡで誘導されたカルシウム上昇の存在／非存在（ａｂｓｅｎｃｅ）によりモニターされたチャンネル活性を回復する。更に、テトラエチルアンモニウムクロライド（ＴＥＡ；ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）誘導性の［Ｃａ^２＋］上昇に基づくアッセイを使用して、機能的な１１３ｐＳ Ｋ^＋チャンネル（ＴＥＡ遮断に感受性）が示されている（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３， １９９４； Ｈｉｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。コントロール個体の線維芽細胞において観察された、ＴＥＡ誘導性［Ｃａ^２＋］上昇およびＫ^＋チャンネル活性は、ＡＤ患者の線維芽細胞において実質的に欠除している（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｈｉｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ＰＫＣ活性化因子の使用がＡＤ線維芽細胞株のＴＥＡチャレンジに対する応答性を回復できることを、これらの研究は実証している。更に、これらの研究の免疫ブロットの証拠は、この回復がαアイソフォームの優先的な関与と関連することを実証している。

また、本発明者は、プロテインキナーゼＣの活性化が、アルツハイマー病（ＡＤ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のα−セクレターゼ・プロセッシングを支援し、非アミロイド形成性の可溶性ＡＰＰ（ｓＡＰＰ）の産生を生じることをも観察した。結果的に、アミロイド形成性のＡ_１−４０およびＡ_{１−４２（３）}の相対的な分泌が減少する。これは特に重要である、なぜならＡＰＰおよびプレセニリンＡＤ変異体を発現している線維芽細胞および他の細胞は、増加した量の全体Ａβを分泌する、および／または、Ａ_{１−４２（３）}／Ａ_１−４０比の増加を生じるからである。興味深いことに、ＰＫＣ欠陥は、ＡＤ脳（αおよびβアイソフォーム）において及びＡＤ患者の線維芽細胞（α−アイソフォーム）において発見されている。

いくつかの研究は、α、βおよびγアイソフォームに対して改善された選択性を有する、他のＰＫＣ活性化因子（即ち、ベンゾラクタム（ｂｅｎｚｏｌａｃｔａｍ））が、ｓＡＰＰ分泌を基礎レベルを超えて増強することを示している。また、ベンゾラクタム処理したＡＤ細胞におけるｓＡＰＰ分泌は、１０μＭ ＢＬ処理後のｓＡＰＰ分泌の顕著な増加のみを示した、コントロールのベンゾラクタム処理した線維芽細胞と比較して若干高かった。スタウロスポリン（ＰＫＣ阻害剤）がコントロールおよびＡＤ線維芽細胞の双方におけるベンゾラクタムの効果を排除（ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ）し、一方で関連化合物（ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）がＰＣ１２細胞に〜３倍のｓＡＰＰ分泌を生じさせることが更に報告された。本発明者は、非アミロイド形成性のＡＰＰプロセッシングを支援するＰＫＣ活性化因子としてのブリオスタチンの使用は、特に治療的な価値を有することを見出した、なぜならブリオスタチンは非腫瘍促進性であり、またステージＩＩの臨床試験に既に入っているからである。

記憶は、情報処理に関する脳構造における、継続的な（ｌａｓｔｉｎｇ）シナプスの修飾の結果生じると考えられる。シナプスは、最終的な標的における決定的な部位であると考えられ、それを介して記憶関連イベントがそれらの機能的な発現を実現する（前記イベントが、変化した遺伝子発現およびタンパク質翻訳、変化したキナーゼ活性、または修飾されたシグナル伝達カスケードに関与しているかどうかにかかわらず）。少数のタンパク質が連想記憶（ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ ｍｅｍｏｒｙ）に関与していると指摘されており、これにはＣａ^２＋／カルモジュリンＩＩキナーゼ、プロテインキナーゼＣ、カレクシチン（ｃａｌｅｘｃｉｔｉｎ）、２２−ｋＤａの学習に関連するＣａ^２＋結合タンパク質、およびＩＩ型リアノジンレセプターが含まれる。マクロサイクリックラクトンの投与を介したＰＫＣの調節は、シナプス修飾に作用する機構を提供する。

記憶および学習機能障害の領域は、記憶および学習過程の異なる特性を実証することが可能な動物モデルにおいて豊富（ｒｉｃｈ）である。（例えば、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ， Ｌ．Ｅ．， １９９０， Ｐｈａｒｍａｃｏｐｓｙｃｈｉａｔ．， ２３， （ＳＵＰＰＬ １１） ３３−３６を参照されたい）。記憶喪失および障害された学習に関して利用可能な動物モデルでは、別々のイベントを記憶する動物の能力の測定を実施する。これらの試験には、モーリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ Ｗａｔｅｒ Ｍａｚｅ）および受動的回避手順（ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）が含まれる。モーリス水迷路において、動物は４つのクワドラント（ｑｕａｄｒａｎｔｓ）に分けられたタンク中で泳がされ、その中で１つのみが水面下に安全な足場（ｓａｆｅｔｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ）を有している。その足場が除去され、その動物は、正しいクアドラント（間違ったクアドラントと比べて）を如何に長く探索するかに関して試験される。受動的回避手順において、動物は、区別される（ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ）環境（穏やかな電撃が与えられ、次の機会にはそれが回避される）を記憶する。受動的回避手順のバリアントは、暗い閉鎖された環境に対する（明るい解放された環境に比べ）、げっ歯類の嗜好性を利用するものである。更なる考察は、文献（Ｃｒａｗｌｅｙ， Ｊ．Ｎ．， １９８１， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｅｈａｖ．， １５，６９５−６９９ ； Ｃｏｓｔａｌｌ， Ｂ． ｅｔ ａｌ， １９８７， Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ２６，１９５−２００ ； Ｃｏｓｔａｌｌ， Ｂ． ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｅｈａｖ．， ３２， ７７７−７８５ ； Ｂａｒｎｅｓ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｂｒ． Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ９８ （ｓｕｐｐｌ） ６９３Ｐ； Ｂａｒｎｅｓ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ， １９９０， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｅｈａｖ．， ３５， ９５５−９６２．）中に記載されている。

「正常（ｎｏｒｍａｌ）」の用語により、減退した（ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ）又は別の障害された（ｉｍｐａｉｒｅｄ）認知機能（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を、伴うと診断されていないか或いは現在提示していない個体を含むことが意味される。異なる認知能力（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ）は、当該技術分野において樹立されている既知の手段により試験及び評価でき、これらには基礎の運動空間的な（ｍｏｔｏｒ−ｓｐａｔｉａｌ）能力から複雑な記憶想起試験が含まれるが、これらに限定されない。非霊長類の認知能力に関して使用される試験の非限定的な例には、モーリス水迷路、放射状迷路（Ｒａｄｉａｌ Ｍａｚｅ）、Ｔ迷路（Ｔ Ｍａｚｅ）、眼瞬き条件づけ（Ｅｙｅ Ｂｌｉｎｋ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）、遅延再生（Ｄｅｌａｙｅｄ Ｒｅｃａｌｌ）、および手掛かり想起（Ｃｕｅｄ Ｒｅｃａｌｌ）が含まれ、一方で霊長類被験者の試験には眼瞬き（Ｅｙｅ Ｂｌｉｎｋ）、遅延再生、手掛かり想起、顔認識（Ｆａｃｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）、ミニメンタル（Ｍｉｎｉｍｅｎｔａｌ）、およびＡＤＡＳ−Ｃｏｇが含まれ得る。これらの試験の多くは、ＡＤを罹患した患者に関する精神的な状態評価に一般的に使用される。同様に、類似の目的のための動物モデルに関する評価は、文献に記載されている。

特に重要なものは、ＰＫＣを刺激するマクロサイクリックラクトン（即ち、ブリオスタチンクラスおよびネリスタチンクラス）である。ブリオスタチンクラス化合物のうち、ブリオスタチン−１は、ＰＫＣを活性化することが示されており、また腫瘍促進活性がないことが証明されている。ブリオスタチン−１（ＰＫＣ活性化因子として）は特に有用であり、その理由はブリオスタチン−１の用量反応曲線が二相性（ｂｉｐｈａｓｉｃ）だからである。更に、ブリオスタチン−１は、ＰＫＣアイソザイム（ＰＫＣα、ＰＫＣδ、およびＰＫＣεを含む）において異なる制御を示す。ブリオスタチン−１は、動物およびヒトにおける毒性および安全性試験が実施され、抗癌剤として活発に調査されている。試験にブリオスタチン−１を使用することにより、ヒトにおける主な副作用が筋肉痛（ｍｙａｌｇｉａ）であることが決定され、最大用量は４０ｍｇ／ｍ^２に制限された。本発明は、０．１ｎＭの濃度のブリオスタチン−１を利用して、ｓＡＰＰ分泌の劇的な増加を生じさせた。ブリオスタチン−１は、ビヒクル単独と、また別のＰＫＣ活性化因子であるベンゾラクタム（ＢＬ）（１０，０００倍高い濃度で使用された）と比較された。また、ブリオスタチンの０．０１ｎＭでの使用は、ｓＡＰＰ分泌の増加になおも効果的であることが証明された。（図１（ａ）を参照されたい）。活性化の測定が、３０ｍｉｎで最大となり、次に部分的に減退し、６時間まで基礎のトランスロケーションレベルよりも高いまま維持されることを、ＰＫＣトランスロケーションは示している（図１（ｂ）、２、８、および９を参照されたい）。ＰＫＣ阻害薬スタウロスポリンの使用は、ｓＡＰＰ分泌におけるブリオスタチンの効果を完全に阻止する。更に、ＰＫＣ活性化が、ｓＡＰＰ分泌におけるブリオスタチンの効果を仲介することを、データは実証している。（図１および２を参照されたい）
マクロサイクリックラクトン、および特にブリオスタチン−１は、米国特許第４，５６０，７７４号に記載されている。マクロサイクリックラクトン及びその誘導体は、当該技術分野における他の文献（例えば、米国特許第６，１８７，５６８号、米国特許第６，０４３，２７０号、米国特許第５，３９３，８９７号、米国特許第５，０７２，００４号、米国特許第５，１９６，４４７号、米国特許第４，８３３，２５７号、および米国特許第４，６１１，０６６号）に記載されている。上記特許は、マクロサイクリックラクトンに関する多様な化合物および多様な使用を記載しており、それには抗炎症性の又は抗腫瘍性の薬剤としてのそれらの使用が含まれる。ブリオスタチンクラス化合物に関する他の議論は、以下の文献中に見つけることができる、即ち：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ Ｉｓｏｚｙｍｅｓ ｂｙ Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ １ ａｎｄ Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−Ａｃｅｔａｔｅ ｉｎ ＮＩＨ ３Ｔ３ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ， Ｓｚａｌｌａｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２６９， Ｎｏ．３， ｐｐ．２１１８−２４ （１９９４）； Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔ Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ １， ａｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ， Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６， ８０２−８０８ （１９９６）； Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ １， ａｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ， ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｂｙ ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒｓ ｉｎ ＳＥＮＣＡＲ ｍｏｕｓｅ ｓｋｉｎ， Ｈｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｖｏｌ． ８， ｎｏ． ９， ｐｐ １３４３−４６ （１９８７）； Ｐｈａｓｅ ＩＩ Ｔｒｉａｌ ｏｆ Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ １ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｌａｐｓｅ Ｌｏｗ−Ｇｒａｄｅ Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ， Ｖａｒｔｅｒａｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ６， ｐｐ． ８２５−２８ （２０００）；および総説：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎｓ， Ｍｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８， ｐｐ． １８４１−１８６０ （２０００）である。

マクロサイクリックラクトン（ブリオスタチンクラスを含む）は、もとはＢｕｇｕｌａ ｎｅｒｉｔｉｎａ Ｌに由来する既知の化合物を示す。マクロサイクリックラクトン、特にブリオスタチンクラスに関して複数の用途（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｕｓｅ）は既知であるが、マクロサイクリックラクトンと認知増強との間の関連性は以前は未知であった。

本発明に使用し得る化合物の例は、マクロサイクリックラクトン（即ち、ブリオスタチンクラスおよびネリスタチンクラス化合物）を含む。

これらの化合物の特定の態様が、例および詳細な記載に記載されるが、参照文献中に開示される化合物およびその誘導体が、本発明の組成物および方法にも使用できるだろうことを理解すべきである。

当該技術における通常の知識を有する当業者により認識されるとおり、マクロサイクリックラクトン化合物およびその誘導体、特にブリオスタチンクラスをコンビナトリアル合成技術（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）に適用し、次に前記化合物のライブラリーを作製して、薬理学的パラメーター（前記化合物の有効性および安全性を含むが、これらに限定されない）を至適化できる。更に、それらのライブラリーをアッセイして、好ましくはα−セクレターゼおよび／またはＰＫＣを調節するメンバーを決定できる。

コンビナトリアルライブラリー、天然産物の高スロープットスクリーニングおよび発酵ブロス（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈｓ）により、新しい薬物が発見されている。現在、化学的な多様性を作り出し、そしてスクリーニングすることは、リード化合物を発見するための主な技術として広範に利用されており、これは確実に創薬（ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の領域における主な重要な進歩である。更に、「リード（ｌｅａｄ）」化合物が同定された後でさえも、コンビナトリアル技術は所望の生物活性の至適化のための価値ある道具を提供する。理解されるであろうとおり、対象反応（ｓｕｂｊｅｃｔ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）は、容易に薬学的または他の生物学的または医学的に関連した活性の又は材料に関連する品質の、スクリーニングのための化合物のコンビナトリアルライブラリーの作製に適用される。本発明の課題に関するコンビナトリアルライブラリーは、化学的な関連化合物の混合物であり、これらは共に所望の性質に関してスクリーニングされてもよく；前記ライブラリーは溶液中に存在していてもよく又は固体の支持体に共有結合で連結されてもよい。多くの関連化合物を一反応で調製することにより、実施すべきスクリーニングプロセスの数が大きく減らされ、単純化される。適切な生物学的性質に対するスクリーニングは、従来の方法により実施し得る。従って、本発明は、１以上の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）発明化合物（ｉｎｖｅｎｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）のα−セクレターゼおよび／またはＰＫＣに結合して効果的に調節する能力を決定するための方法をも提供する。

種々の技術が、以下に記載されるコンビナトリアルライブラリーを作製するための技術に利用可能であるが、本発明は上述（ｆｏｒｅｇｏｉｎｇ）の例および記載により限定されない。例えば、以下の文献、即ち、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １４： ８３；Ａｆｆｙｍａｘ 米国特許第５，３５９，１１５号および５，３６２，８９９号：Ｅｌｌｍａｎ 米国特許第５，２８８，５１４号：Ｓｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ． ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０８０５１；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） ＪＡＣＳｌ １ ６： ２６６ １ ： Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＪＡＣＳｌ １ ５： ２５２：：ＰＣＴ公開番号Ｗ０９２／１００９２、Ｗ０９３／０９６６８およびＷ０９１／０７０８７；およびＬｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ． ＰＣＴ公開番号Ｗ０９３／２０２４２）を参照されたい。結果的に、約１６から１，０００，０００以上のディバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｓ）のオーダーの様々なライブラリーを、特定の活性または特性に関して合成し、スクリーニングできる。

本化合物を、種々の経路、種々の剤形（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｓ）で投与でき、これらには口内、直腸内、非経口的（例えば、皮下、筋肉内および静脈内）、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）、くも膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、関節内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒ）、局所的（ｔｏｐｉｃａｌ）および頬内（ｂｕｃｃａｌ）投与に関するものが含まれる。ヒト成体に対する用量範囲は、年齢、重量および患者の容態および投与経路を含む多くの因子に依存する。

経口投与に関して、希釈、分散および／または界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）を含んでいる微粉（ｆｉｎｅ ｐｏｗｄｅｒｓ）または顆粒（ｇｒａｎｕｌｅｓ）を、ドラフト（ｄｒａｕｇｈｔ）に、水またはシロップに、乾燥状態でカプセルまたはサチェット（ｓａｃｈｅｔｓ）に、非水性懸濁液（懸濁剤を含めてもよい）に、或いは水またはシロップ中で懸濁状態に、存在させてもよい。望ましいか又は必要な場合には、香味剤（ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ）、保存剤（ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ）、懸濁剤、濃化剤（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ）または乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ）を含めてもよい。

混合物（ａｄｍｉｘｔｕｒｅ）に含めてもよい他の化合物は、例えば、医学的に不活性な成分、例えば、固形および液体の希釈剤、ラクトース、デキストロース、ショ糖、セルロース、澱粉またはリン酸カルシウムなどを錠剤またはカプセルに対して、オリーブ油またはエチルオレアート（ｅｔｈｙｌ ｏｌｅａｔｅ）を軟カプセルに対して、および水または野菜油を懸濁剤またはエマルジョン剤に対して；潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、例えば、シリカ、滑石（ｔａｌｃ）、ステアリン酸、マグネシウムまたはカルシウム ステアレート（ｓｔｅａｒａｔｅ）および／またはポリエチレングリコール；ゲル化剤、例えば、コロイド粘土（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｃｌａｙｓ）；濃縮剤（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、例えば、トラガカントゴムまたはアルギン酸ナトリウム、結合剤、例えば、澱粉、アラビアガム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン；崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、例えば、澱粉、アルギン酸、アルギナートまたはソジュウム・スターチ・グリコレート（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔａｒｃｈ ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）；沸騰剤（ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｉｎｇ ｍｉｘｔｕｒｅｓ）；染料（ｄｙｅｓｔｕｆｆ）；甘味剤（ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ）；湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、例えば、レシチン、ポリソルベートまたはラウリルサルフェート（ｌａｕｒｙｌｓｕｌｐｈａｔｅｓ）；並びに他の治療上許容される副成分、例えば、保湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔｓ）、保存剤、緩衝剤および抗酸化剤であって、これらは係る処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）に関して既知の添加物である。

経口投与に対する液体分散剤（Ｌｉｑｕｉｄ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ）は、シロップ、エマルジョンまたは懸濁剤であってもよい。前記シロップは、担体として、例えば、ショ糖またはショ糖（グリセリンを添加）および／またはマンニトールおよび／またはソルビトールを含んでいてもよい。特に糖尿病患者のためのシロップは、担体として、例えば、ソルビトール（グルコースに代謝されないか又は極少量がグルコースに代謝される）を含有できる。前記懸濁剤およびエマルジョン剤は、担体、例えば、天然ガム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルアルコールを含み得る。

筋肉内注射に関する懸濁剤または溶剤は、活性化合物と共に、薬学的に許容される担体、例えば、滅菌水、オリーブ油、エチルオレアート、グリコール、例えば、プロピレングリコールおよび、必要に応じて適切な量のリドカインハイドロクロライドを含んでもよい。静脈内注射または点滴のための溶剤は、担体、例えば、滅菌水（一般に注射のための水）を含み得る。好ましくは、それらは無菌の、水性の、等張性の塩類溶液の形態であってもよい。或いは、本化合物は、リポソーム内に被包されてもよい。また、本化合物は、他の既知の活性薬剤デリバリーシステム（ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用し得る。

また、本化合物は、他の添加物と非関連（ｕｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）の純粋な形態で投与されてもよく、この場合はカプセル剤、サチェットまたは錠剤が好適な剤形である。

別々のユニットで提示される、錠剤および他の形態は、本化合物の１つの、一日量（ｄａｉｌｙ ｄｏｓｅ）、または適切なその分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を適切に含有する。例えば、ユニット（ｕｎｉｔｓ）は、本化合物の１つを５ｍｇから５００ｍｇ含有し得るが、より一般的には１０ｍｇから２５０ｍｇ含有し得る。

本発明の化合物の薬理学的な活性は、当該技術において既知の標準的な薬理学的モデルを用いて実証できる。さらにまた、発明組成物（ｉｎｖｅｎｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）を、部位特異的なデリバリーのために、適切なポリマーのマトリックスまたは膜に導入または被包できる、或いは、該組成物を、部位特異的なデリバリーに作用する能力を有する特異的なターゲティング因子と共に機能的にする（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）ことができる。これらの技術、同様に他の薬物デリバリー技術は、当該技術において周知である。

要約すると、ＰＫＣの活性化は、記憶獲得に影響し、同様に非アミロイド形成的、α−セクレターゼ、ＡＰＰのプロセッシングを促進する。非腫瘍プロモーターＰＫＣ活性化物質（ブリオスタチン１）は、ＡＤ患者の線維芽細胞において、α―セクレターゼ産物（ｓＡＰＰα）の分泌を劇的に増強させる。その効果は、ブリオスタチンのサブナノモーラー（ｓｕｂ−ｎａｎｏｍｏｌａｒ）濃度で著明であった。また、ブリオスタチン（脳室内に注射された）は、モーリス水迷路パラダイム（Ｍｏｒｒｉｓ Ｗａｔｅｒ Ｍａｚｅ ｐａｒａｄｉｇｍ）に供試されたラットの能力（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を増強した。最近のインビボ研究により次のことが示された、即ち、ベンゾラクタム（ＰＫＣ活性化物質であって、Ｋ^＋チャンネル欠陥（Ｋ^＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｄｅｆｅｃｔｓ）を逆転させること及びＡＤ細胞におけるｓＡＰＰαを増強することが以前に示された）は、ｓＡＰＰαの量を有意に増加させ、Ｌｏｎｄｏｎ Ｖ７１７Ｉ ＡＰＰ突然変異を保持しているトランスジェニックマウスの脳におけるＡβ４０を減少させる。これらの結果は、ＰＫＣ（及びその活性化）がＡＤおよび記憶喪失に関連する症状の治療する又は緩和させるための道具になり得ることを実証した。ブリオスタチン１は特に重要である；というのもより強力（ｐｏｔｅｎｔ）であるのみならず、腫瘍促進活性を欠いており、ヒトにおいて癌治療に関する臨床試験をもう経験しているからである。以下の例は次の証拠を提供する、それはブリオスタチン１が劇的に且つ強力にＡＰＰのα−プロセッシング（ｓＡＰＰα量の増加を発生させる）を増強し、モーリスの水迷路課題においてラットの能力を有意に改善させるということである。また、前記例は次の証拠を提供する、それは別のＰＫＣ活性化物質（ベンゾラクタム）が、有意なｓＡＰＰαの増加およびＡβ４０の減少（インビボ）を生ずるということである。

本明細書中の全ての書籍、論文（ａｒｔｉｃｌｅ）、または特許は、本願の開示と矛盾しない範囲内で、参照によって援用される。以下、本発明を例により記載するが、これは例示を目的とするものであり、発明の範囲を限定するものではない。

図１（ａ）は、ブリオスタチン−１でのｓＡＰＰα分泌における、異なるＰＫＣ阻害剤および濃度の効果を示す（大きな有効性が、コントロールおよびベンゾラクタムよりも低濃度で示されている）。また、ブリオスタチン（０．１ｎＭ、ソリッドバー）は、培地中のｓＡＰＰ−αの量を３ｈインキュベーション後に、特性がよく調査され、剖検により確認されたＡＤ株化細胞において、劇的に増加させた（ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ）。グラフ・ユニットは、ビヒクル（ＤＭＳＯ）単独と比例される。ブリオスタチンは、別のＰＫＣ活性化物質（ＢＬ）の同じ（０．１ｎＭ）濃度よりも有意（ｐ＜０．０１、ターキーのポスト検定）により強力であった。スタウロスポリン（１００ｎＭ）での前処理（一番右のバー）により、ブリオスタチン（０．１ｎＭ）の効果が完全に無効となった。また、ブリオスタチンは、２つのコントロール細胞株における分泌の増強に効果的であったが、より低い程度（前記ＡＤ株化細胞におけるよりも）であった（ハッチバー（ｈａｔｃｈｅｄ ｂａｒ））。 図１（ｂ）は、ｓＡＰＰα分泌におけるブリオスタチン−１の異なる濃度の効果を時間経過に対し示す；分泌は、明白に１５ｍｉｎインキュベーション（ブリオスタチン ０．１ｎＭ）でほぼ増強され（ｎｅａｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ）、１６０ インキュベーションでほぼ最大となり、３ｈまで上昇している。より低い濃度（０．０１ｎＭ）でのブリオスタチンは、非常に緩徐であったが、分泌においては、ほぼ同じ効果を有していた（１２０ｍｉｎインキュベーション後）。 図１（ｃ）は、ｓＡＰＰαの分泌を、多様な実験条件および細胞株を用いて、ヒト繊維芽細胞におけるｓＡＰＰ−αのウエスタンブロット呈示により示している； 図２は、異なる濃度のブリオスタチン−１のＰＫＣαアイソザイムにおける効果を示す。 図３は、治療したラット 対 コントロールの水迷路を学習するために必要な時間の量を示す。モーリス水迷路の学習曲線は、ブリオスタチン（ｉ．ｖ．ｃ．）が前記動物の能力を改善することを示しており、このことは早期の試行からの避難潜伏期の減少により証明される。 図４（ａ）は、コントロールラットが異なるクアドラントにおいて遊泳に費やした時間の量を示す。双方（コントロールおよび治療動物）は、標的クアドラント（ｔａｒｇｅｔ ｑｕａｄｒａｎｔ）に対する優先度の保持を示した（図４（ｂ）も参照されたい）。図４（ｂ）は、治療ラットが異なるクアドラントにおいて遊泳に費やした時間の量を示す。図４（ｃ）は、治療されたラットが標的クアドラントにおいて費やした時間量の間の差異を、コントロールラットと比較して示す。治療された動物は、改善された保持を示した（コントロールと比較して）； 図５（ａ）は、ヒト繊維芽細胞におけるＰＫＣトランスロケーションを棒グラフで示す。このグラフは、膜結合ＰＫＣ（Ｐ＝粒子性）の免疫反応性（総タンパク質量内容でノーマライズした）およびサイトゾルの分画（Ｓ＝可溶性）において検出された免疫反応性の間の比率を示す。ＰＫＣ−αトランスロケーションは、０．１ｎＭブリオスタチン（ソリッドバー）で３０ｍｉｎインキュベーション後に著しかった。トランスロケーションは、１８０ｍｉｎインキュベーション（一番右のバー）で、なおも存在していた（Ｐ＞Ｓ）。図５（ｂ）は、他のＰＫＣアイソエンザイムが検出され、それらのトランスロケーションレベルがＰＫＣ−αに対して観察されたレベルに匹敵していたことを示す。 図６（ａ）は、トランスジェニックマウス（若い動物）を用いたインビボ試験を示す。該トランスジェニックマウスは、離乳直後（３週）から開始された、ＢＬ １ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．、毎日）での１７週間の治療を施された。治療群の脳のｓＡＰＰ−αにおいて有意な増加が認められた（ビヒクル単独と比較して）。図６（ｂ）は、同じ動物がＡβ４０の比例減力（ａ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を有していたことを示す。 図７（ａ）は、約６月齢のトランスジェニックマウス（成体動物）を用いたインビボ試験を示す。該トランスジェニックマウスは、ＢＬおよびＬＱ１２治療を棒グラフに示される用量とスケジュールとで７週間実施された。治療でｓＡＰＰ−αの少量の増加が認められた（ソリッドバーにより示される）。図（７ｂ）は、小さいＡβ４０減少（有意差なし）を示す、これはＢＬおよびＬＱ１２（双方は１０ｍｇ／ｋｇ 毎週）で治療された動物において観察された（ソリッドバー）。Ａβ４０における予想外の（ハッチバー）の増加が、ＢＬ １０ｍｇ／ｋｇ（毎日）で治療された動物において観察された。 図８は、コントロールおよびＡＤ細胞の双方に対するブリオスタチン ０．１ｎＭの投与後のヒト線維芽細胞におけるｓＡＰＰα分泌を示す。 図９は、ＡＤ細胞にブリオスタチン投与した後のｓＡＰＰの免疫ブロットを示す。 図１０は、治療したマウスにおけるブリオスタチンのポジティブ効果および寿命（ｌｉｆｅ ｓｐａｎ）の増加（コントロールと比較した）を示す。 図１１は、治療した動物 対 無治療の動物に関する、水の試験における時間経過の期間（ｄｕｒａｔｉｏｎ）を示す。 図１２は、治療した動物 対 コントロールにおける、可溶性Ａβ−４０の濃度の減少を示す。 図１３は、治療した動物 対 コントロールにおける、可溶性Ａβ−４２の濃度の減少を示す。 図１４は、チオフラビンＳ染色後に、治療した動物において認められたプラークのパーセントの減少（コントロールと比較した）を示す。

［例］
例Ｉ
細胞培養
培養した皮膚線維芽細胞を、コリエル・セル・レポジトリー（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）から入手し、それらの培養に関して樹立された一般的なガイドラインに若干の修正を加えたものにしたがって成長させた（Ｃｒｉｓｔｏｆａｌｏ ＆ Ｃａｒｐｔｅｎｔｉｅｒ， １９８８； Ｈｉｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。細胞を成長させる培養液は、ダルベッコ修正イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ；ギブコ社）に１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ， Ｉｎｃ．）を添加したものを使用した。コントロール細胞株（ＡＣ） ケース（ｃａｓｅｓ） ＡＧ０７１４１およびＡＧ０６２４１、並びに家族性ＡＤ（ＦＡＤ） ケース （ＡＧ０６８４８）からの線維芽細胞を利用した。

ＰＫＣ活性化因子（Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）
異なる組織分布、異なるアイソザイムの明らかに区別される役割、および病状における差別的な関与という事項は、特異的なアイソザイムを優先的にターゲティングする能力を有する、薬理学的な道具の使用が重要であることを意味している（Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｈｏｆｍａｎｎ， １９９７）。医薬品化学分野における最近の研究により、いくつかのＰＫＣ活性化因子、例えば異なるベンゾラクタムおよびピロリジノン（ｐｙｒｏｌｌｉｄｉｎｏｎｅｓ）が開発された。しかしながら、現在研究されたブリオスタチン ＰＫＣ活性化因子は、アイソスペシフィック（ｉｓｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）な活性を提供するとの利点を有するだけでなく、以前に使用されたＰＫＣ活性化因子（例えば、腫瘍促進性の）の問題（ｓｅｔ ｂａｃｋ）にも影響されない。ブリオスタチンは、ＰＫＣの制御ドメイン（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）と競合し、この部位内で非常に特異的な水素結合による相互作用に関与（ｅｎｇａｇｅ）する。

この化合物の有機化学および分子モデリングに関する付加的な情報は、前記文献中に記載されている。

治療
細胞をコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで、６ｃｍペトリ皿中で５〜７日間成長させた。実験日に培地をＤＭＥＭ（血清なし）で置換し、２ｈ静置した。２時間の血清欠乏を達成させ、治療を、前記培地にＢｒｙｏ、ＢＬおよびＤＭＳＯを適切な濃度で直接適用することにより達成した。（ブリオスタチンに関して、０．１および０．０１ｎＭ；０．１ｎＭ、０．１μＭ、および１μＭ ＢＬ）。ＤＭＳＯは全てのケースで１％未満であった。大抵の場合、ｓＡＰＰ分泌のための処理の３時間後に、培地を収集して処理した。また、他の時間ポイント（ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ）を使用して、分泌の時間経過（ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ）を調査した。

ＰＫＣトランスロケーションに関する免疫ブロットアッセイ
免疫ブロット実験を、樹立された手順を用いて実施した（Ｄｕｎｂａｒ， １９９４）。細胞をコンフルエント（〜９０％）まで、６ｃｍペトリ皿中で成長させた。

０．１ｎＭ ブリオスタチン−１（５、３０、６０、および１２０分）での処理に応答したアイソザイムのレベルを、Ｒａｃｃｈｉ等（１９９４）により樹立された方法を若干修正した手順を用いて定量した。線維芽細胞を、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に剥離し、そして低速度の遠心分離で収集した。ペレットを以下の均質化緩衝剤（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、即ち：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．３２Ｍスクロース、およびプロテアーゼ阻害薬カクテル（シグマ）中に再懸濁した。ホモジネートを、超音波処理で採取し、そして〜１２，０００ｇで２０分間 遠心分離し、そして上清をサイトゾル分画として使用した。
ペレットを同じ緩衝剤（１．０％トリトンＸ−１００を含有している）中で均質化し、氷中で４５分間インキュベーションし、そして〜１２，０００ｇで２０分間 遠心分離した。このバッチの上清を、膜分画（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ）として使用した。タンパク量決定（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）の後、２０μｇのタンパク質を２Ｘ電気泳動法サンプル緩衝剤（Ｎｏｖｅｘ）中に希釈し、５分間煮沸し、１０％アクリルアミドゲルで泳動し、そして電気泳動的にＰＶＤＦ膜へと転写した。前記膜を、５％ミルク・ブロッキング剤（ｍｉｌｋ ｂｌｏｃｋｅｒ）で、室温で１時間インキュベーションすることにより飽和させた。ＰＫＣアイソフォームに対する一次抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、（１：１０００）にブロッキング溶液剤中で希釈し、前記膜と一晩４℃でインキュベーションした。二次抗体 アルカリスファターゼ 抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベーションした後に、前記膜を化学発光基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて製造者の指示にしたがって発色させた。バンド強度をデンシトメトリーにより定量した、その際、ＢｉｏＲａｄ ＧＳ−８００較正走査デンシトメーターおよびＭｕｌｔｉａｎａｌｙｓｔソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いた。

ｓＡＰＰ−決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ）／ｓＡＰＰαの測定
分泌されたＡＰＰの濃度を、従来の免疫ブロット技術を若干修正したプロトコールを用いて測定した。各皿からの沈殿させたタンパク質抽出物／治療を、新たに調製した１０％アクリルアミド Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ミニゲルにロードし、ＳＤＰＡＧＥで分離した。ロードしたサンプルの容量を、皿ごとのトータル細胞タンパク質（ｔｏｔａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）に対して修正した。タンパク質を、次に電気泳動的にＰＶＤＦ膜に転写した。膜を５％無脂肪ドライミルクで飽和させ、非特異的な結合をブロックした。ブロックした膜を商業的に入手可能な抗体６Ｅ１０（１：５００）と一晩４℃でインキュベーションした、この抗体はｓＡＰＰ−アルファを条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）中で認識する（ＳＥＮＥＴＥＫ）。洗浄後、前記膜を、西洋わさびペルオキシダーゼ抱合型の抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ’ｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と室温でインキュベーションした。
次にシグナルを、増強された化学発光を用い、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（アマシャム）へ暴露することにより検出した。バンド強度をデンシトメトリーにより定量した、その際、ＢｉｏＲａｄ ＧＳ−８００較正走査デンシトメーターおよびＭｕｌｔｉａｎａｌｙｓｔソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いた。

図８および９に示したとおり、ブリオスタチン−１は強力な応答を惹起させ、ＰＫＣの活性化を実証した。ＰＫＣの活性化が、僅か０．１ｎＭのブリオスタチン−１用量のデリバリー後３０分間で容易に検出可能であることに注意すべきある。

ＡＰＰ代謝に及びそのサブプロダクト（ｓｕｂ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の効果に関するデータを考慮することも有用である。ＰＫＣ活性化が、非アミロイド形成性（可溶性のＡＰＰ、おそらく前記セクレターゼの産物） ｖｓ． アミロイド形成性（Ａβ１−４０および／またはＡβ１−４２）の分泌された断片の比の量を増加させることを、研究は実証した（Ｂｕｘｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｓｅｌｋｏｅ， １９９４）。この理論を固持するつもりはないが、ＡＤ細胞（低いＰＫＣを有する）が、ｓＡＰＰの障害された分泌を有するだろうこと、および／または、アミロイド形成性断片（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の増加した比を有するだろうことを推測できた。実際、いくつかのＡＤ細胞株が、欠陥のあるＰＫＣおよび障害されたｓＡＰＰ分泌の双方を示すとの証拠が存在する（Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｇｏｖｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。加えて、β−アミロイドが、線維芽細胞においてＡＤ類似のＫ^＋チャンネル欠陥を誘導すること（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９４）および培養されたニューロンにおけるＫ^＋カレントをブロックすること（Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， １９９６）が示されている。従って、アイソザイム特異的なＰＫＣ欠陥が異常なＡＰＰプロセッシングを誘発し、他の潜在的に有害な効果のなかでもとりわけ、このプロセッシングがＫ^＋チャンネル機能を変化させるような機構的なリンク（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｌｉｎｋ）を我々は提唱する。また、最近の予備的なデータは、おそらく悪循環の様式（ｖｉｃｉｏｕｓ ｃｙｃｌｉｃａｌ ｍａｎｎｅｒ）で、β−アミロイドが次々にＰＫＣの減少を生じさせることを示唆している（Ｆａｖｉｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。

要約すると、特定のアイソザイムを標的として、ＰＫＣの機能を上方制御する戦略により、ｓＡＰＰ産生が増加することをデータは示唆している。これらの研究と係る線維芽細胞モデルとを、拡大（ｅｘｐａｎｄｅｄ）することは可能と思われ、これらを根底に存在する病理学的な潜在的プロセスを変化させる、化合物（ブリオスタチン、例えば）の効果をモニターするための道具として使用できるだろう。更に、当該技術において通常の知識を有する当業者は、これらのサンプルを更にＣａ^２＋イメージングおよび電気生理学により如何に試験するかに関して理解するだろう。次に係る化合物を、この障害のための薬学的な薬剤の合理的なデザインのための基礎として使用できるだろう。

例ＩＩ
行動研究（Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ）
モーリス水迷路パラダイム（４８）を使用して、ブリオスタチン１の学習および記憶における効果を研究した。２２０−２５０ｇの間である計量されたウィスター アルビノ ラット（ｎ＝２０）を、１週間飼育し（ｈｏｕｓｅｄ）、食物および水を自由に摂食させた。ステンレス・スチールのカニューレを、以前に記載された手順にしたがって、各ラットにおいて両側に配置した（ｐｌａｃｅｄ ｂｉｌａｔｅｒａｌｌｙ）（４９）。全動物は、１週の回復期間を更なる実験に先立って与えられた。引き続いて、動物は、ランダムに実験およびコントロール群へと割当られた。少なくとも、治療および訓練の２４ｈ前に、全動物をＭＷＭ実験状況へと、彼らを水中に配置することにより前暴露（ｐｒｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）し、１２０ｓ泳がせた。前記訓練は、標準の手順（４９）が引き続くもので、２試行／日が４連続日からなるものであった。処理された動物は、（ｉ．ｃ．ｖ．）１μｌ／部位の２μＭ溶液のブリオスタチン１を訓練試行（ｔｒａｉｎｉｎｇ ｔｒｉａｌｓ）１および５の約３０ｍｉｎ前に受けた。コントロール群は、同じ容量のビヒクル単独を、同一のスケジュールで受け取った。第５日（ｔｈｅ ｆｉｆｔｈ ｄａｙ）に、足場は除去され、保持試験（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）を実施した。動物の動作（ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ）および避難潜伏期（ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｉｅｓ）を、自動追跡システムで記録した。学習を、試行から試行の避難潜伏期の減少として測定し、それは治療した動物において顕著に低かった。
記憶の獲得を、関連性のあるクアドラント（第５日）における時間経過（ｔｉｍｅ ｓｐｅｎｔ）として測定した。記憶または保持は、シャム注射動物（ｓｈａｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｉｍａｌｓ）と比較して、治療された動物において有意に増強された（図３から４（ａ）−４（ｃ）を参照されたい）。ブリオスタチン−１で治療したラットは、治療の２日間以内に、コントロールラットと比べて改善された認知を示した（図３を参照されたい）。ブリオスタチン−１は、認知を改善する濃度で使用可能で、その濃度は３００から３００，０００倍 腫瘍を治療するために使用される濃度よりも低い。認知能力を、ブリオスタチン−１の投与により、非罹患の被験者（ｎｏｎ−ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓｕｂｊｅｃｔｓ）において（他の非罹患の被験者と比較して）改善できることを上記の例は更に示している。

以前に実施されていた癌に対する安全性、毒性、および第二相臨床試験ゆえに、ＰＫＣ活性化因子（特にブリオスタチン−１）の使用が安全であると認識されるだろうと、またＡＤ治療／認知増強のための第二相試験を促進できるだろうと、結論付けることができる。さらにまた、ブリオスタチン−１の親油性の性質は、血液脳関門輸送の増加を提供する。本発明は、静脈内、経口、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌｌａｒ）、および他の既知の投与方法を認容するものであろう。

ｓＡＰＰ分泌実験、ＰＫＣ活性化実験、および動物行動実験の試験により、ｓＡＰＰ分泌の増加が増加したＰＫＣ活性化に続いて生じ、動物行動試験において改善された認知が生じることが示された。

例ＩＩＩ
トランスジェニック動物およびインビボ試験
Ｖ７１７Ｉ突然変異を保持しているトランスジェニックマウスを、ＢＬ（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．；毎日）で、〜３週齡（離乳後）から１７週間処理した（ｎ＝４）。コントロール群（ｎ＝４）は、ビヒクル単独（Ｔｗｅｅｎ２０ １％、ＤＭＳＯ ２５％、７４％ ＰＢＳ）を受けた。
別の実験群は、５〜６月齢の動物から構成され、７週間治療された。これらの動物のサブグループは次の試薬で処理された、即ち、ＢＬ １ｍｇ／ｋｇ、一日（ｎ＝５）；ＢＬ １０ｍｇ／ｋｇ、一日（ｎ＝３； ２個体死亡のため）；ＢＬ １０ｍｇ／ｋｇ、毎週（ｎ＝４； １個体死亡）、ＬＱ１２ １０ｍｇ／ｋｇ、一日（ｎ＝５）；およびＬＱ１２ １０ｍｇ／ｋｇ、毎週（ｎ＝５）。５個体の付加的な動物は、ビヒクル単独を同じ期間受けた。治療後、動物をＫ．Ｕ．Ｌ．（Ｂｅｌｇｉｕｍ）ガイドラインにしたがって安楽死させた。
脳を、除去し、ＡＰＰ種の生化学的な分析のために調製した。
ＡＰＰ ｔｇマウスの脳におけるＡＰＰプロセッシングの生化学的分析。

免疫ブロット分析。ＡＰＰ代謝の中間代謝物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）の生化学的分析は、Ｄｅｗａｃｈｔｅｒらにより他に記載されている（Ａｇｉｎｇ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｃａｕｓｅｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｏｆ ｏｌｄ ＡＰＰ／Ｖ７１７Ｉ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｂｙ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｈａｎ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０００； ２０： ６４５２−８．を参照されたい）。要約すると、脳を６．５ｖｏｌ．の氷冷緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、およびプロテイナーゼ阻害剤の混合物（Ｒｏｃｈｅ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有している）中でホモジナイズした。遠心分離（１３５，０００ｘｇ、４°Ｃ、１ｈｒ）の後に、上清を、可溶性のアミロイドペプチドを規定のＥＬＩＳＡ（ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ＥＬＩＳＡ）により分析する前に、再び遠心分離（２ｈｒ、２００，０００ｘｇ）した。最初の遠心分離からのペレットを、ＴＢＳ（２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０およびプロテイナーゼ阻害剤を含有している）に再懸濁し、遠心分離（１００，０００ｘｇ、４°Ｃ、１ｈｒ）した。このタンパク質分画は、膜結合型ＡＰＰの分析に使用された。膜結合型ＡＰＰのウエスタンブロットを、このタンパク質分画（膜結合型のタンパク質を含有している）において、モノクローナル抗体８Ｅ５で実施した。トータルの分泌されたＡＰＰおよびα−セクレターゼで切断された分泌されたＡＰＰ−αを、最初の遠心分離の上清でのウエスタンブロット分析で検出した（それぞれ、モノクローナル抗体８Ｅ５およびモノクローナル抗体ＪＲＦ１４を用いた）。タンパク質を、サンプル緩衝剤（２％ＳＤＳ、１％ ２−ＭＥの終濃度を含有する）中で変性および還元させ、８％ＴＲＩＳグリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）上で分離した。適切な二次抗体とのインキュベーション後、全ウエスタンブロットをＥＣＬ検出システムで発光させ、写真技術で記録した。一連の希釈したサンプルの適用により、定量化が可能であった。
フィルムの濃度測定スキャニングおよびノーマライゼーションを、フラットベッド光学濃度スキャナー（ａ ｆｌａｔｂｅｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｓｃａｎｎｅｒ）並びに分析および測定のための専用ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ； Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて実施した。

アミロイドペプチドのＥＬＩＳＡ タンパク質抽出物を、逆相カラム（Ｃ１８−Ｓｅｐ−ｐａｃｋカートリッジ；Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍｉｌｏｒｄ， ＭＡ）に適用し、アセトニトリル濃度を増加させた溶液（５、２５、および５０％）に０．１％トリフルオロ酢酸を含有している溶液で洗浄した。最後の分画は、アミロイドペプチドを含有していた、そして真空中で一晩乾燥させ、そしてＥＬＩＳＡでの測定のために溶解させた。ヒトＡβ４０およびＡβ４２ペプチドに対するサンドイッチＥＬＩＳＡを、それぞれ捕獲抗血清（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ） ＪＲＦ／ｃＡβ４Ｏ／１Ｏおよび２１Ｆ１２を用いて実施した、そしてそれらをそれぞれモノクローナル抗体ＪＲＦｃＡβｔｏｔ／１４ｈｒｐｏおよび３Ｄ６で発色させた（Ｖａｎｄｅｒｓｔｉｃｈｅｌｅ Ｈ， Ｖａｎ Ｋｅｒｓｃｈａｖｅｒ Ｅ， Ｈｅｓｅ Ｃ， Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ Ｐ， Ｂｕｙｓｅ ＭＡ， Ａｎｄｒｅａｎｓｅｎ Ｎ， Ｍｉｎｔｈｏｎ Ｌ， Ｗａｌｌｉｎ Ａ， Ｂｌｅｎｎｏｗ Ｋ， Ｖａｎｍｅｃｈｅｌｅｎ Ｅ． Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ （１−４２） ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ． Ａｍｙｌｏｉｄ ２０００； ７： ２４５−２５８）。

標準の一般健康評価（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｈｅａｌｔｈ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）およびオープン・フィールド（ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ）を、全動物において生化学的な評価の前に実施した。加えて、半定量的なアド・ホック・スコア（ａｄ ｈｏｃ ｓｃｏｒｅ）を考案（ｄｅｖｉｓｅｄ）して、注射に続く腹腔の収縮を測定した（＋＝ 弱い、≦ ２ｍｉｎ；＋＋：強い、≧ｍｉｎ；＋＋＋：非常に強い、≧１．２ｍｉｎ）。

例ＩＶ
トランスジェニック動物およびブリオスタチンを用いたインビボ試験
第二のトランスジェニック研究（同様の手順／試験およびプロトコールを用いた）を、二重のトランスジェニックマウス（前記Ｖ７１７Ｉ突然変異およびプレセニリン−１（ＰＳ１）突然変異を保持している）を用いて実施した、これにより促進されたアミロイド形成を生じ、次の主要な差異を伴うものであった。約４０マウス（治療およびコントロールの両方を含む）を利用した。治療は、約３週齡で開始され、４０μｇ／ｋｇ． ｉ．ｐ．で週に３回、ブリオスタチン−１を用いた治療からなるものであった。
コントロールには、ビヒクル単独が与えられた。治療は、非治療動物の罹患率が実験の終了を要する前、約７月間継続された（図１０を参照されたい）。治療および非治療の動物の間の行動上の差異は、水の試験（ｗａｔｅｒ ｔｅｓｔｉｎｇ）（図１１を参照されたい）では有意ではなかったが、治療された動物は可溶性Ａβ−４０（図１２を参照されたい）および可溶性Ａβ−４２（図１３を参照されたい）の減少を示していた。さらに、治療したマウスはトータルＡＰＰ（ｔｏｔａｌ ＡＰＰ）が全体的に低量であった；この結果は図１４に示されるとおりであり、ここではチオフラビンＳ染色によりパーセント プラークロード（ｐｅｒｃｅｎｔ ｐｌａｑｕｅ ｌｏａｄ）の減少が示されている（コントロールと比較して）。

上記実験の考察
ｓＡＰＰα分泌： ＡＤ株化細胞ＡＧ０６８４８を０．１ｎＭブリオスタチンで治療した３時間後、ｓＡＰＰαの分泌の劇的な増加が認められた（全ての他の条件と比較して）（全体のＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１（図１（ａ）、ソリッドバー））。また、この効果は、別のＰＫＣ活性化物質（ＢＬ）を同じ（０．１ｎＭ）濃度で使用した際よりも有意に高い効果であった（ｐ＜０．０１、ターキーのポスト検定）。ＢＬ ０．１ｎＭは、如何なる現実的な影響力も分泌において有していなかった；また、ＤＭＳＯ単独と差異はなかった。１００ｎＭのスタウロスポリン（ＰＫＣブロッカー）での前処理により、０．１ｎＭブリオスタチンの効果が無効になった（図１Ａ、一番右のバー）。また、２つの細胞株が、年齢適合コントロール（ａｇｅ−ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ）から使用された。これらの細胞株（プールされた）において、ブリオスタチン（０．１ｎＭ）は同じく有意に（ＤＭＳＯ単独と比較して、ｐ＜０．０５、ターキーの検定）ｓＡＰＰαの分泌を増強したが、ＡＤ株化細胞における程度よりも有意に低い程度までであった（図１Ａ、ハッチバー；ｐ＜０．０５、ターキーの検定）。時間経過実験（図１（ｂ）、インセット）により、ｓＡＰＰα分泌の著しい（ｍａｒｋｅｄ）増加が、０．１ｎＭブリオスタチンで１５分インキュベーションした後に示された。進行性で比例的（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ａｎｄ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ）な増加が、３０および６０ｍｉｎで観察された。インキュベーション期間（２および３ｈ）は、分泌されたＡＰＰαの量に関して、６０ｍｉｎインキュベーションと実質的に異なっていなかった。より低い濃度のブリオスタチン（０．０１ｎＭ）により、ＡＰＰα分泌の強力（ｒｏｂｕｓｔ）な増強が、僅か６０ｍｉｎのインキュベーション後に生じた。しかしながら、低濃度（０．０１ｎＭ）の効果は、より高い濃度（０．１ｎＭブリオスタチン）を２および３ｈインキュベーションした際のものと区別できなかった（図１（ｂ））。代表的な免疫ブロット（多様な実験の条件および細胞株でのｓＡＰＰαの分泌を説明している）を図１（ｃ）に示す。

ＰＫＣトランスロケーション： αアイソエンザイムのサイトゾルおよび膜結合型のレベルを、ブリオスタチン（多様な時間ポイント）を０．１および０．０１ｎＭでインキュベーション後に決定した。ＰＫＣ α−アイソエンザイムの膜結合コンポーネントの相対的な増加（ＤＭＳＯ単独と比較して）が認められ、これは粒子性（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）／可溶性の（Ｐ／Ｓ）免疫反応性の比率として測定された。前記増加は、非常に一貫性（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ）のものであり、３０ｍｉｎのインキュベーション後にＤＭＳＯ単独とは有意に異なるものであった（ｐ＝０．４１１；ｔ−検定、両側）。Ｐ／Ｓ比率は、進行性に下落したが、１８０ｍｉｎのインキュベーション後でさえも、ＤＭＳＯ単独よりも高いまま維持された（統計学的に有意ではないが）（図５ａ）。短期のインキュベーション（５ｍｉｎ）により、ＤＭＳＯ単独と比べて、一貫性の又は有意に異なったトランスロケーションが誘導されなかった（示さず）。０．０１ｎＭブリオスタチンの効果は、著しくなく且つ緩徐であり（ｍｕｃｈ ｌｅｓｓ ｍａｒｋｅｄ ａｎｄ ｓｌｏｗ）、最大Ｐ／Ｓ比の値を１２０ｍｉｎインキュベーションで有するものであった。他のＰＫＣアイソエンザイムのトランスロケーションのレベルは、３０ｍｉｎインキュベーションにおいて０．１ｎＭブリオスタチンで評価された。明瞭な免疫反応性が、ε、βおよびδアイソエンザイムに対する特異的抗体で検出された（膜結合型およびサイトゾルの双方）。比率Ｓ／Ｐは、全例においてＤＭＳＯ単独よりも高く、ＰＫＣ−αのレベルと匹敵するものであった（図５ｂ）。

行動（ＭＷＭ）：ブリオスタチンを受けた群の学習曲線（ｌｅａｒｎｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）は、コントロール群よりも有意に速かった。避難潜伏期は、明瞭に早期の試行（ｅａｒｌｙ ｔｒｉａｌｓ）から減少し、試行３からのコントロール群よりも低かった。クアドラント優先度（ｑｕａｄｒａｎｔ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）試験は、両群において保持を示したが、ブリオスタチン治療群に関しては有意に増強していた（コントロールと比較して）。図３〜４（ｃ）は、これらの結果を要約する。

トランスジェニック動物：トランスジェニック動物（ＢＬで治療された、３週齡の動物であって、１７週間治療された動物）は、ｓＡＰＰ−αの有意な増加とＡβ４０の随伴性（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）で比例的な減少とを示している（図６（ａ）−（ｂ））。Ａβ４２、ＡＰＰ膜結合、およびトータルの分泌されたｓＡＰＰ（ｓＡＰＰα＋ｓＡＰＰβ）の量において差異は認められなかった。
動物は一般健康において差異は示されず、また重量増加は両群で類似していた。注射により、可変性の腹腔の収縮（可逆的な）が生じた（両群で同様の頻度）。強度は、ＢＬ治療群において多少（ｓｏｍｅｗｈａｔ）上昇していた（データ示さず）。加えて、ＢＬ治療動物は、オープン・フィールド試験スコアの増加を示した（統計学的な有意性に達しなかった）（示さず）。

高年齢（ｌａｔｅｒ ｉｎ ｌｉｆｅ）（６月齢）の、短期間（〜７週間）治療された動物は、ＡＰＰ種に関連する劇的な変化を示さなかった。しかしながら、一般的な傾向（小さい変化）は、より長期間の治療（前のセクション）に関して記載されたのと同じ方向性であった。ｓＡＰＰαの若干の増加が、ＢＬ １０ｍｇ／ｋｇ（毎日および毎週）で治療された動物において認められた；またＬＱ１２ １０ｍｇ／ｋｇ（毎日）で治療された動物においても認められた（図７（ｂ）、ソリッドバー（ｓｏｌｉｄ ｂａｒｓ））。ＢＬ １ｍｇ／ｋｇ（毎日）およびＬＱ１２ １０ｍｇ／ｋｇ（毎週）は、効果がなかった（図５Ａ、パターンバー）。Ａβ４０における若干の減少が、ＢＬ（ｎ＝５）およびＬＱ１２（ｎ＝５）で治療（両方とも１０ｍｇ／ｋｇ、毎週）された動物において観察された（図７（ｂ）、ソリッドバー）。Ａβ４２において、治療により如何なる観察できる（ｎｏｔｉｃｅａｂｌｅ）有意な変化も認められなかった。同様に、トータルの可溶性ＡＰＰおよび膜結合型ＡＰＰにおいて、如何なる有意な変化も認められなかった。また、腹腔の収縮および後肢の弛緩が、注射の際に老齢の動物（ｏｌｄｅｒ ａｎｉｍａｌｓ）において観察された（可逆的）。それらは用量に関連しているように思われたが、しかし、如何なる明瞭な系も、より正確な評価に関して配置されなかった。一般健康および重量も正常であった。少数（２−３）の動物は、実験の過程の間に、治療に関連して出現しない原因で死亡した（全体の７．８％）。オープン・フィールド試験において差異は認められなかった（示さず）。

しかしながら、ブリオスタチン−１での治療は、双方（Ａβ−４０、Ａβ−４２、およびトータルＡＰＰ）において観察できる変化を示した。（図１２〜１４を参照されたい）。加えて、ブリオスタチン−１で治療した動物は、大きな超過寿命パーセンテージ（ａ ｇｒｅａｔｅｒ ｌｉｆｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｖｅｒ ｔｉｍｅ）を示した。（図１０を参照されたい）。

これらの結果は、ＡＤ病態生理学におけるＰＫＣの役割を実証している。これらの結果は、共通のＡＰＰプールが存在することを更に実証している。従って、１つの酵素経路の増加は、代替的な酵素に対する基質の低下を生じる。この場合において、アミロイド形成性（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｎｉｃ）で毒性の断片（Ａβ４０）の減少は、ＡＰＰの非病原性のα−セクレターゼ・プロセッシングを増加させることにより達成される。トータルの分泌されたＡＰＰ（α＋β産物）が、治療および無治療の動物の間で異なっていないとの事実は、そのような解釈と一貫し、該解釈を確証するものである。ｓＡＰＰαにおける増加が、上昇したトータルＡＰＰ（又は増加した発現）の結果ではないことも明白である、というのも膜結合型ＡＰＰが両群において類似しているからである。

最も著しい「有益な（ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ）」効果が、早期に（そして長い期間）治療を開始した動物において観察された。このことは、毒性の断片の長期間の効果を阻止することが、治療の重要なゴールであるべきことを示唆している。高年齢での及び疾病プロセスの過程の後期での介入（臨床症状なしでさえも）により、毒性の断片による損傷を阻止することにおいて非常に低い影響力が与えられるだろう（老齢の動物で得られた結果により示唆されたように）。この特定のトランスジェニックモデルが、最初に生化学的な変化を生じ、次に認知の欠陥（ｄｅｆｉｃｉｔｓ）を生じ、次に（かなり後に）アミロイドの沈着およびプラークを生じることである。インビトロ試験と一致して、この順序（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、アミロイド種（ａｍｙｌｏｉｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）が有害（おそらく可溶性の形態で）でありえる（任意の顕著な沈着が生じる前に）ということを示していることに言及することも重要である。

ブリオスタチン投与（ｉ．ｃ．ｖ．）後のＭＷＭ課題における正常ラットの能力の改善を示す結果により、ＰＫＣ活性化が認識増強を付加的な治療上の効果として生じ得ることが実証された。加えて、分泌型ＡＰＰは、それ自身で、正常および健忘性（ａｍｎｅｓｔｉｃ）のマウスにおける記憶を改善し得る。これらの実験およびモデルは、ＰＫＣ制御（特にブリオスタチン−１を介した）が、ｓＡＰＰの増加および／または記憶の改善を生じ得ることを実証している。
それらにより、ＰＫＣ活性化物質を含む療法（ｒｅｇｉｍｅ）を使用して、毒性の断片の集積（ｂｕｉｌｄ ｕｐ）を阻止し、記憶減退（ｍｅｍｏｒｙ ｄｅｃｌｉｎｅ）を阻止できることも実証された。

Claims (36)

1. ヒトまたは動物における認知能力を増強するための方法であって、前記ヒトまたは動物にＰＫＣ活性化因子を、薬学的に許容される担体中で認知能力を増強するために効果的な量で投与することを含む方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記ＰＫＣ活性化因子がＰＫＣα、ＰＫＣδ、およびＰＫＣεを選択的に活性化する方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、前記ＰＫＣ活性化因子がマクロサイクリックラクトン（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ ｌａｃｔｏｎｅ）、ベンゾラクタム（ｂｅｎｚｏｌａｃｔａｍ）、ピロリジノン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）又はその組み合わせである方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、前記マクロサイクリックラクトンがブリオスタチンクラスまたはネリスタチンクラス化合物である方法。
5. 請求項３に記載の方法であって、前記ＰＫＣ活性化因子がブリオスタチン−１からブリオスタチン１８であるか又はネリスタチン−１である方法。
6. 請求項１に記載の方法であって、前記の増強された認知能力が学習、記憶、または注意である方法。
7. 請求項５に記載の方法であって、前記動物が霊長類である方法。
8. 請求項５に記載の方法であって、前記動物が非霊長類である方法。
9. 請求項１に記載の方法であって、前記の投与されるＰＫＣ活性化因子の量が神経疾患または障害の認知損傷を治療するために効果的な量である方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、前記神経疾患がアルツハイマー病、多重梗塞性痴呆症、パーキンソン病と関連（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）する又はしないアルツハイマー病のローリー体バリアント（Ｌｅｗｙ−ｂｏｄｙ ｖａｒｉａｎｔ）；クロイツフェルトヤコブ病、カルサコフ障害（Ｋｏｒｓａｋｏｗ’ｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、或いは注意欠陥多動性障害である方法。
11. 請求項９に記載の方法であって、前記障害が年齢、電気痙攣療法、または脳損傷に関連する方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、前記脳損傷が発作、麻酔事故、頭部外傷、低血糖、一酸化炭素中毒、リチウム中毒またはビタミン欠乏症により生じた方法。
13. 請求項１に記載の方法であって、前記ＰＫＣ活性化因子がｓＡＰＰの増加を生じるために効果的な量で投与される方法。
14. イオンチャネルの細胞調節を変更するための方法であって、イオンチャネルの細胞調節を変更するために効果的な量のＰＫＣ活性化因子および薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
15. 請求項１４に記載の方法であって、前記調節がインビボまたはインビトロ調節である方法。
16. 請求項１５に記載の方法であって、前記イオンチャネルがＫ^＋またはＣａ^＋＋チャネルである方法。
17. 神経腫瘍（ｎｅｕｒｏｔｕｍｏｒｓ）を治療するための方法であって、前記神経腫瘍を治療するために効果的な量のマクロサイクリックラクトンおよび薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
18. 請求項１７に記載の方法であって、前記マクロサイクリックラクトンがブリオスタチンクラスまたはネリスタチンクラス化合物である方法。
19. ｓＡＰＰを調節するための方法であって、ｓＡＰＰを調節するために効果的な量のマクロサイクリックラクトンおよび薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
20. 請求項１９に記載の方法であって、前記マクロサイクリックラクトンがＰＫＣを活性化する方法。
21. 請求項１９に記載の方法であって、前記マクロサイクリックラクトンがブリオスタチンクラスまたはネリスタチンクラス化合物である方法。
22. 請求項１９に記載の方法であって、前記マクロサイクリックラクトンがブリオスタチン−１からブリオスタチン１８であるか、又はネリスタチン−１である方法。
23. α−セクレターゼを調節するための方法であって、α−セクレターゼを調節するために効果的な量のマクロサイクリックラクトンおよび薬学的に適切な担体を投与することを含む方法。
24. 請求項２３に記載の方法であって、前記マクロサイクリックラクトンがブリオスタチンクラスまたはネリスタチンクラス化合物である方法。
25. 請求項２３に記載の方法であって、前記マクロサイクリックラクトンがブリオスタチン−１からブリオスタチン１８であるか、又はネリスタチン−１である方法。
26. 請求項２３に記載の方法であって、前記マクロサイクリックラクトンがインビボまたはインビトロで投与される方法。
27. 請求項２３に記載の方法であって、前記のα−セクレターゼの調節が、アミロイドプラーク形成を減少させ、アルツハイマー病の患者における認知能力を増強する方法。
28. アルツハイマー病を治療するための方法であって、患者に、アルツハイマー病を治療するために効果的な量のマクロサイクリックラクトンおよび薬学的に許容される担体を投与する方法。
29. アルツハイマー病を治療するための方法であって、患者に、アルツハイマー病を治療するために効果的な量のブリオスタチン−１および薬学的に許容される担体を投与する方法。
30. ヒトまたは動物における認知能力を増強するための方法であって、前記ヒトまたは動物に、薬学的に許容される担体中の、認知能力を増強するために効果的な量のブリオスタチンまたはネリスタチンクラス化合物を投与することを含む方法。
31. ヒトまたは動物における認知能力を増強するための方法であって、前記ヒトまたは動物に、薬学的に許容される担体中の、認知能力を増強するために効果的な量のブリオスタチン−１を投与することを含む方法。
32. 薬学的に効果的な量のブリオスタチンまたはネリスタチンクラス化合物および薬学的に許容される担体の投与を介した、α−セクレターゼの調節を含む方法。
33. α−セクレターゼを調節するための方法であって、α−セクレターゼを調節するために効果的な量のブリオスタチン−１および薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
34. 細胞に神経保護効果（ａ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ）を提供するための方法であって、低酸素イベント（ｈｙｐｏｘｉｃ ｅｖｅｎｔ）を受けた細胞に対して神経保護効果を提供するために効果的な量のブリオスタチンまたはネリスタチンクラス化合物および薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
35. 細胞に神経保護効果を提供するための方法であって、低酸素イベントを受けた細胞に対して神経保護効果を提供するために効果的な量のブリオスタチン−１および薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
36. アミロイドプラーク形成の減少のための方法であって、アミロイドプラーク形成を減少させるために効果的な量のブリオスタチン１および薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。

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