JP2011526374A - 平行光ビームまたは収束光ビームのどちらかを選択的に提供する光学システム - Google Patents

平行光ビームまたは収束光ビームのどちらかを選択的に提供する光学システム Download PDF

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Abstract

光学システムの第１の動作モード時に光学システムから平面に平行光ビームを投射することと、光学システムの第２の動作モード時に光学システムから平面に収束光ビームを投射することとを含む方法が提供される。この方法は、（ａ）第１の動作モード時に、光学システムの第１の光路における第１の光束の軌道を制御して、平行光ビームを導き指定の入射角で平面に通すことと、（ｂ）第２の動作モード時に、光学システムの第２の光路における第２の光束の軌道を制御して、収束光ビームを平面内の目標位置に導くこととをさらに含む。また、この方法を用いる装置およびシステムも提供される。

Description

発明の背景
１．発明の分野
本開示は照明システムに関し、より詳細には、平行光ビームまたは収束光ビームのどちらかを選択的に提供する光学システムに関する。このシステムは、全内反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡と光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）または光活性化実験の両方に照明が求められる場合に、特に適合する。
２．関連技術の説明
本項で示す手法は、追求され得るはずの手法であり、必ずしも、以前に考案され、または追求されたことのある手法であるとは限らない。したがって、特に指示しない限り、本項で示す手法は、本出願における特許請求の範囲に対する従来技術ではない場合もあり、本項に含まれることによって従来技術であると認められるものではない。
蛍光顕微鏡は、反射および吸収の代わりに、またはこれに加えて、蛍光およびりん光の現象を使って有機物または無機物の特性を研究するのに使用される光学顕微鏡である。場合によって、例えば、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）においては、顕微鏡の画像平面は、収束光ビームによって最適に照明される。場合によって、例えば、全内反射蛍光（ＴＩＲＦ）においては、画像平面は、平行光ビームによって最適に照明される。
光学システムの第１の動作モード時に光学システムから平面に平行光ビームを投射することと、光学システムの第２の動作モード時に光学システムから平面に収束光ビームを投射することとを含む方法が提供される。この方法は、（ａ）第１の動作モード時に、光学システムの第１の光路における第１の光束の軌道を制御して、平行光ビームを導き指定の入射角で平面に通すことと、（ｂ）第２の動作モード時に、光学システムの第２の光路における第２の光束の軌道を制御して、収束光ビームを平面内の目標位置に導くこととをさらに含む。また、この方法を用いる装置およびシステムも提供される。
照明システムを示すブロック図である。
平面に平行光ビームを投射する動作モードにある図１のシステムの動作を示す図である。
平面に収束光ビームを投射する動作モードにある図１のシステムの動作を示す図である。
楕円ゾーン反射鏡（ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｚｏｎｅ ｍｉｒｒｏｒ）を示す図である。
平行ビームの入射角の表示器として全画像積分強度を使用する粗グリッドスキャン（ｒｏｕｇｈ ｇｒｉｄ ｓｃａｎ）を示す図である。
ある一定の軌道に沿った低速度走査検流計（ｓｌｏｗｌｙ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｇａｌｖａｎｏｍｅｔｅｒ）を使用して臨界角を特定することができることを示す図である。
照明システムを示すブロック図である。
平面に平行光ビームを投射するモードにある図７のシステムの動作を示す図である。
平面に収束光ビームを投射するモードにある図７のシステムの動作を示す図である。
顕微鏡のためのシステムを示すブロック図である。
複数の図面に共通の構成部分または特徴は、各図面において同じ符号で示す。
図１は、平面１９９に平行光ビームを投射する動作モードと、平面１９９に収束光ビームを投射する動作モードとを有する照明システム、すなわちシステム１００のブロック図である。便宜上、平面１９９に平行光ビームを投射する動作モードを「平行モード」と呼び、平面１９９に収束光ビームを投射する動作モードを「収束モード」と呼ぶ。
システム１００は、光源１０５、光ステアリング装置１１０、レンズ１１５、１３０、１５０、１９５、反射鏡１４５、１９０、拡散体１７５、および光ステアリング装置１８５を含む。
光源１０５は光ビーム１０７を放射する。光源１０５は、例えば、レーザとして実施することができ、また好ましくは、光ビーム１０７を平行ビームとして放射する。
光ステアリング装置１１０は、光源１０５から光ビーム１０７を受け取る。光源１０５は、光ファイバケーブル（不図示）とコリメータ（不図示）を用いて光ステアリング装置１１０に結合することもでき、反射鏡（不図示）を使用して直接結合することもできる。
光ステアリング装置１１０は、光を、一般に光路１１２および光路１１３と呼ぶ２つの光路のうちの１つに選択的に方向づけ、より詳細には、収束モードでは光を光路１１２へと方向づけ、平行モードでは光を光路１１３へと方向づける。光ステアリング装置１１０は、例えば、検流計式走査鏡（ｇａｌｖａｎｏｍｅｔｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｒｒｏｒ）や、音響光学偏向器を含むことができる。
光路１１２は、光ステアリング装置１１０から、レンズ１１５を通り、レンズ１３０を通って反射鏡１４５まで、次いで、光ステアリング装置１８５まで伸びている。光路１１３は、光ステアリング装置１１０から、レンズ１５０を通り、拡散体１７５を通り、次いで光ステアリング装置１８５まで伸びている。
光ステアリング装置１８５は、光路１１２を介して反射鏡１４５から、または光路１１３を介して拡散体１７５から光を受け取り、この光を下流側の光路、すなわち光路１８７に放射する。光ステアリング装置１８５は、例えば、楕円ゾーン反射鏡（ＥＺＭ）、楕円反射鏡、円形反射鏡、開放口を有する反射鏡、ビーム結合器、ビームスプリッタ、ビームキューブ、または偏光ビームキューブを含むことができる。光路１８７は、光ステアリング装置１８５から、反射鏡１９０、レンズ１９５を通り、次いで平面１９９まで伸びている。
収束モードでは、光は、光路１１２および１８７を通って伝搬し、システム１００は平面１９９において収束光ビームを生じる。平行モードでは、光は、光路１１３および１８７を通って伝搬し、システム１００は平面１９９において平行光ビームを生じる。
光ステアリング装置１１０が光を光路１１２または光路１１３に方向づける角度は、光が平面１９９に到達する角度に影響を及ぼす。収束モードでは、光ステアリング装置１１０は、光路１１２への光の軌道を制御することによって、収束光ビームを平面１９９内の目標位置に導く。平行モードでは、光ステアリング装置１１０は、光路１１３への光の軌道を制御することによって、平行光ビームを導き指定の入射角で平面１９９に通す。
光の２次元、すなわちｘ方向とｙ方向とのステアリングでは、光ステアリング装置１１０は、直交する１対の検流計式走査鏡または二軸音響光学偏向器として実施され得る。検流計式走査鏡は、１ミリ秒未満の応答時間を有し、したがって、小ビーム口径および中程度の角度ステップに使用することができる。よって、検流計式走査鏡は、光ビーム１０７を、指定の出口角座標まで迅速に進ませることができる。光ステアリング装置１１０によって指定される出口角に応じて、システム１００は、平面１９９内の集束点、すなわち目標位置を照明することもでき、平面１９９を貫通して指定の入射角で平行ビームを投射することもできる。また、他のビーム変調の手段が利用できない場合には、必要ならば、光ステアリング装置１１０を使用して、これをビーム停止（不図示）に向けることにより、光ビーム１０７をブロックすることもできる。
システム１００は、顕微鏡のための照明システムとして用いることができ、平面１９９は、顕微鏡の画像平面と符合する。平行モードは、（ａ）全内反射蛍光照明や、（ｂ）光退色後エバネッセント場蛍光回復照明などの工程と併せて用いることができる。収束モードは、（ａ）光退色後蛍光回復照明、（ｂ）光活性化照明、（ｃ）光退色照明、（ｄ）光ピンセット操作、（ｅ）光分解（ｏｐｔｉｃａｌ ｕｎｃａｇｉｎｇ）操作などの工程と併せて用いることができる。
共用光源ビームおよび共用二軸ビームステアリング装置を利用して、システム１００は、共通の目標平面、すなわち平面１９９に向けた、２つの異なる照明条件、すなわち入射角アドレス指定可能平行照明と位置アドレス指定可能焦点照明（ｆｏｃａｌ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）とを作り出す。
平行モードでは、システム１００は、平面１９９の中心を通るように平行ビームを方向づける。このモードでは、光ステアリング装置１１０を出る平行ビームの角度方向座標が、平面１９９と交差する平行ビームの入射方向を決定する。
収束モードでは、システム１００は、収束する光ビームを、平面１９９内の集束点へと方向づける。このモードでは、光ステアリング装置１１０を出る平行ビームの角度方向座標が、平面１９９内の集束点の横方向の位置を決定する。
動作モードは、光ステアリング装置１１０による、対応する角度方向座標の範囲の選択によって決定される。各動作モードに適用できる角度範囲は重複しない。光ステアリング装置１１０は電子的に制御され、フィードバックおよび分析を利用して、生じる照明を最適化することができる。
便宜上以下では、光セグメントを示すのに「光束（ｌｉｇｈｔ ｂｕｎｄｌｅ）」という表現を使用する。
図２は、平行モードにおけるシステム１００の動作の図である。平行モードでは、光ステアリング装置１１０は、光源１０５から光束を受け取り、この光束を光路１１３へと方向づける。光束は、（ａ）平行ビーム２０５として光ステアリング装置１１０からレンズ１５０まで、（ｂ）収束ビーム２１０としてレンズ１５０を通って拡散体１７５まで、（ｃ）発散ビーム２１５として拡散体１７５を通って光ステアリング装置１８５まで、（ｄ）発散ビーム２２０として光ステアリング装置１８５から反射鏡１９０まで、（ｅ）発散ビーム２２５として反射鏡１９０からレンズ１９５まで、（ｆ）平行ビーム２３０としてレンズ１９５から平面１９９まで伝搬する。
レンズ１５０は、平行ビーム２０５を収束ビーム２１０として拡散体１７５上に当てる。拡散体１７５は平面１７０に位置し、回転子１６５によって回転する。拡散体１７５は平面１９９に平行光２３０による均一な照明を作り出す。レンズ１５０および拡散体１７５は、光束が平行ビーム２３０として平面１９９に投射されるように光束を変換する光学サブシステムとみなすことができる。光ステアリング装置１８５は発散ビーム２１５として光束を受け取り、この光束を発散ビーム２２０として反射鏡１９０へと方向づける。反射鏡１９０は光束を反射し、よって、発散ビーム２２５としてレンズ１９５へと方向づける。レンズ１９５は発散ビーム２２５として光束を受け取り、この光束を平行ビーム２３０として投射する。光ステアリング装置１１０は、光路１１３における光束の軌道を制御して、平行ビーム２３０を導き指定の入射角で平面１９９に通す。
平行モードでは、光ステアリング装置１１０および平面１９９は、レンズ１５０および１９５によって形成される望遠鏡の瞳のところに位置する。よって、光ステアリング装置１１０によって投射されるあらゆるビームが、平面１９９とこれの光学軸との交差の交差点に集中することになる。光学システムによって平面１９９まで中継される光路１１３近傍のわずかな偏向によって変化するのが、光学軸に対するアプローチ角である。
光ステアリング装置１１０からレンズ１５０までの距離は、レンズ１５０の焦点距離に等しく、このため、平面１７０に入る収束ビームはテレセントリックである。拡散体１７５とレンズ１９５の間の距離はレンズ１９５の焦点距離に等しく、結果的に、光路２３０に沿った平行ビームのテレセントリックな動き、および平面１９９の中心における平行ビームの固定交差（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ）を生じる。
平行ビーム２３０のコリメーションは、矢印１５５で示すように、このための共通の並進マウント１６０上に取り付けられているレンズ１５０と拡散体１７５を移動させることによって調整することができる。
システム１００は、顕微鏡で用いられるときには、平面１９９、すなわち出口平面が、顕微鏡対物レンズの焦点面に対する共役平面と符合するように位置するように構成される。対物レンズ焦点面は、多くの場合試料面と呼ばれ、これは顕微鏡によって結像される試料の焦点面である。共役平面は、一般には、顕微鏡対物焦点面の拡大像である。
共役平面に入射する平行ビームは、顕微鏡中間光学システムおよび顕微鏡対物レンズを通って中継され、顕微鏡対物レンズ焦点面から平行ビームとして出る。よって、顕微鏡対物から所望の平行ビーム射出方向を得るために、平行光路１１３に関する適切なビーム方向が選択される。
ＴＩＲＦ顕微鏡は、光学定数の高い材料と光学定数の低い材料の間の界面が、臨界角（全内反射の角度）より大きい入射角で照明されるときに生じる非常に希薄なエバネッセント場を利用することによって、試料の薄片を結像するのに使用される。この照明条件を、超臨界入射角における照明、または単に、超臨界照明と呼ぶ。
典型的な「対物を通した（ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）」ＴＩＲＦ顕微鏡構成では、対象とする試料が、顕微鏡対物の焦点面に配置された薄いカバーガラス上に、表面上の試料が顕微鏡対物から見て外方向を向くように配置される。カバーガラスは、顕微鏡対物から見て外方向を向いたカバーガラスの表面に沿って希薄なエバネッセント場を生じるように、超臨界角の平行光で照明される。
システム１００が顕微鏡に結合されたＴＩＲＦ顕微鏡の照明条件を作り出すために、カバーガラスに対して超臨界入射角で顕微鏡対物から出る平行ビームを中継するように、平行光路１１３に関する適切なビーム方向が選択される。
照明を十分に均質化し、照明からのアーチファクトを除去するためには、同じ傾斜角を維持しながら、あらゆる角度から試料焦点面を照明した方がよい。これは、光学軸１１３の周りの環状経路２０２において平行ビーム２０５を走査することによって実現される。この平行ビームは、前述のようにカバーガラスまで中継される。
図３は、収束モードにおけるシステム１００の動作の図である。光ステアリング装置１１０は、光源１０５から光束を受け取り、この光束を光路１１２へと方向づける。光束は、（ａ）平行ビーム３０５として光ステアリング装置１１０からレンズ１１５まで、（ｂ）収束ビーム３１０としてレンズ１１５を通って平面１２５まで、（ｃ）発散ビーム３１５として平面１２５からレンズ１３０まで、（ｄ）平行ビーム３２０としてレンズ１３０から反射鏡１４５まで、（ｅ）平行ビーム３２５として反射鏡１４５から、平面１８０を通り、光ステアリング装置１８５を通って反射鏡１９０まで、（ｆ）平行ビーム３３０として反射鏡１９０からレンズ１９５まで、（ｇ）収束ビーム３３５としてレンズ１９５から平面１９９まで伝搬する。レンズ１１５、レンズ１３０および反射鏡１４５は、光束が収束ビーム３３５として平面１９９に投射されるように光束を変換する光学サブシステムとみなすことができる。光ステアリング装置１１０は、光路１１２における光束の軌道を制御して、収束ビーム３３５を平面１９９内の目標位置に導く。
システム１００は、ＦＲＡＰ／光活性化照明のための顕微鏡と共に使用されるときには、収束モードであり、したがって、光ステアリング装置１１０は、光を光路１１２上または光路１１２の近くへと方向づけるように設定される。この光学軸上の方向は、顕微鏡視野の中心のところの退色位置に対応する。平行ビーム３０５はレンズ１１５を通過して収束ビーム３１０になり、収束ビーム３１０は平面１２５において焦点を結び、レンズ１３０によって再度平行にされる。レンズ１３０は、ユーザが収束ビーム３３５の焦点を顕微鏡の画像平面に合わせることを可能にするために、矢印１３５で示すように移動する並進マウント上に位置する。この調整は、平行モード（図２）における光路の調整とは独立のものである。反射鏡１４５は、平行ビーム３２５が平面１８０のところの固定された瞳位置を通るように方向づける。次いで光は、光ステアリング装置１８５を通過して反射鏡１９０に至る。平行ビーム３３０は、レンズ１９５によって中間平行光ビームとして受け取られ、次いでレンズ１９５によって、収束ビーム３３５として顕微鏡の画像平面に位置する平面１９９上に集中される。
光ステアリング装置１１０の瞳とレンズ１１５の瞳は、平面１２５における焦点がテレセントリックに移動するように、レンズ１１５の焦点距離だけ隔てられる。同様に、平面１２５とレンズ１３０もレンズ１３０の焦点距離だけ隔てられ、レンズ１３０とレンズ１９５も、これらの焦点距離の和に等しい距離だけ隔てられる。よって、システム１００は、全体にわたってテレセントリックな性能を有する。
実験において、ビームは、平面１９９における視野内の一連の慎重なまたは区別した位置へと方向づけることもでき、ある領域を退色させるためにラスタモーションで走査させることもできるはずである。平面１９９におけるビームの位置は、光が光ステアリング装置１１０から光路１１２または光路１１３に向けられる角度に依存する。この動きはコンピュータによって制御されるはずであり、光源１０５がレーザである場合には、（例えば、ＡＯＴＭを使用する）レーザ上でこのための機能が実施される場合には、これと併せてレーザ電力を切り換え、または別の方法で調整することもできるはずである。
前述のように、光ステアリング装置１８５は、楕円ゾーン反射鏡（ＥＺＭ）を含むことができる。図４は、４５度で入射する環状ビームのための、鏡映面４０５および開放口、すなわち開口４１０を有するＥＺＭ４００の図である。光ステアリング装置１８５がＥＺＭ４００を用いて実施される場合を考える。システム１００の平行モード（図２参照）では、発散ビーム２１５としての光束は、鏡映面４０５によって反射され、この後引き続き発散ビーム２２０として進む。システム１００の収束モード（図３参照）では、平行ビーム３２５としての光束は反射鏡１４５から伝搬し、開口４１０を通過して反射鏡１９０に至る。
図２に戻って、ステアリング装置１８５がＥＺＭ４００を用いて実施され、システム１００が平行モードにあり、ＴＩＲＦ照明に使用されている場合を考える。開口４１０は、平面１７０の近くに位置しているため、ＴＩＲＦ照明を実施しないことに留意されたい。平面１７０は、対物レンズの入射瞳に対する共役平面である。ＴＩＲＦ照明条件は、光が、対物レンズ開口の周辺に集中されることを必要とする。開口４１０は、発散ビーム２１５が、開口４１０に当たるのではなく、鏡映面４０５に当たるようなサイズとされる。
図３に戻って、ステアリング装置１８５がＥＺＭ４００を用いて実施され、システム１００が収束モードにあり、ＦＲＡＰ照明のために使用されている場合を考える。鏡映面４０５は、ＦＲＡＰ性能に最小限の影響しか及ぼさない。鏡映面４０５は平面１８０の近くに位置しており、平面１８０において平行ビーム３２５は軸上にあり、また固定もされている。開口４１０は、ＦＲＡＰ焦点の開口数を幾分制限するが、実験においては、領域が通常は退色するため、回折限界の性能は不要である。
光学的変動
テレセントリックな光学的構成は最適な照明条件を生じるが、絶対に必要なものではないことに留意すべきである。このシステムの実際的な実装形態は、焦点合わせ、コリメーション調整のための光学システムの移動、およびビーム路に沿った厳密に同じ位置で生じない場合もある二軸の光ステアリングを有するという物理的制約条件に適応するために、必然的に不完全にテレセントリックなものとなる。
照明の迅速な切り換えは、単に、光ステアリング装置１１０からの光束を、平行ビーム路１１３または収束ビーム路１１２以外の位置へと方向づけることによって実現することができる。光は、中間位置に配置されたビームダンプに向けることもできる。
平行モードにおける照明領域を拡大するのに拡散体１７５が使用される。拡散体１７５は、システム１００に不可欠な構成部分ではなく、最も実際的な実装形態は拡散体１７５を必要としないことに留意すべきである。
実施例
開口数１．４５である６０×対物の例を考える。このようなレンズは、以下のパラメータを有する。
ビーム受入れ開口＝８．７ｍｍ（管長を２００ｍｍとする）
油浸定数（ｏｉｌ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）（ｎ３）＝１．５１８
組織定数（ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｄｅｘ）（ｎ１）＝１．３８
ＴＩＲＦのための臨界角＝６３．６度（ｎ１とｎ３に基づく）
対物瞳（開口）における臨界直径＝８．１６ｍｍ
このようなレンズでは、開口４１０の直径を５ｍｍとすることができる。これは、（ＥＺＭ４００は厳密には平面１７０のところの瞳に位置しないため）３ｍｍのＦＲＡＰビームに、若干の走査余地を与えるはずである。ＴＩＲＦビームは、焦点の後の拡散のための若干の余地を有し、さらに、臨界未満（＜８．１６ｍｍ）、臨界（８．１６ｍｍ）、および超臨界（＞８．１６）の各位置において照明することができる。これらの関係は、レンズ１９５が、組み合わせリレー望遠鏡の倍率が１であるような顕微鏡の結像レンズと等しい焦点距離を有すると仮定したものである。そうでない場合には、倍率を適用する必要がある。
検流計位置の較正
この考察は、ＣＣＤまたは他のカメラを使用して実験がモニタされており、このカメラからの画像が分析に利用できると仮定したものである。
検流計およびＣＣＤのパラメータ
検流計位置座標：（Ｇｘ，Ｇｙ）
ＣＣＤカメラ位置座標：（Ｃｘ，Ｃｙ）
ＦＲＡＰ変換座標：
検流計原点位置：（Ｇｘ０，Ｇｙ０）
検流計位置微分：（ＧｘｄＣｘ，ＧｙｄＣｘ）、（ＧｘｄＣｙ，ＧｙｄＣｙ）
ＦＲＡＰのためのＣＣＤカメラ座標から検流計座標への変換
Ｇｘ＝Ｇｘ０＋（ＧｘｄＣｘ，ＧｘｄＣｙ）・（Ｃｘ，Ｃｙ）
Ｇｙ＝Ｇｙ０＋（ＧｙｄＣｘ，ＧｙｄＣｙ）・（Ｃｘ，Ｃｙ）
ＴＩＲＦ変換座標：
ＴＩＲＦ軸のための検流計座標：（Ｔｘ０，Ｔｙ０）
ＦＲＡＰ検流計位置の自動較正
単純な線形変換を使用して、カメラ座標（Ｃｘ，Ｃｙ）から検流計座標（Ｇｘ，Ｇｙ）への変換を行うことができる。この較正は自動化に適し、または単純なユーザ主導の手順によるものである。
画像解析を使用してＣＣＤカメラ上の集束点位置のフィードバックを提供すれば、集束点を原点位置（おそらくは、ＣＣＤの中心または隅）に向け、この座標を（Ｇｘ０，Ｇｙ０）として記録することができる。次に、（フィードバックを用いて）検流計を原点に対して水平に位置する位置（ｄＣｙ＝０）まで駆動して、Ｘ軸の位置微分（ＧｘｄＣｘ，ＧｙｄＣｘ）を計算することができる。同様に、原点に対して垂直に位置する位置（ｄＣｘ＝０）を使用して、Ｙ軸の位置微分（ＧｘｄＣｙ，ＧｙｄＣｙ）を求めることもできる。
この技法は、試料に焦点が合っており、集束点が見えることを必要とするはずである。集束点を位置決めするのに使用される画像解析は、強度最大値、またはおそらく、２次元重心計算を使用することができる。
ＴＩＲＦ検流計位置の自動較正
ＴＩＲＦ検流計較正は、ビームの焦点が試料焦点面に合っておらず、したがって、直接位置決めすることができないことにより複雑になる。最も有用なフィードバック機構は全画像の輝度であろう。これは、照明透過度がより深くなるほど、試料は、ＴＩＲＦ照明下においてよりも落射照明条件下においてより明るく照明されるという知見に基づくものである。このことは、カバーガラスからの蛍光さえも表面化させる水性蛍光液体試料に特に当てはまる。別の有用な試料は、量子ドットまたは別の薄い蛍光塗料で均一に被覆されたカバーガラスであろう。このような較正試料を使用して、較正アルゴリズムを自動化することができる。
全積分画像強度がフィードバックとして使用される。これはＴＩＲＦ光路の近くのすべての検流計位置に適する。というのは、拡散体１７５が視野全体を占めるからである。ラスタ走査が、ＴＩＲＦ光路軸の近くのすべての検流計位置からなるものであった場合、結果的に生じる画像は、臨界照明角に対応する半径の外部でより暗い値に急激に下がる、明るい塗りつぶされた円になるはずである。この円の中心は、ＴＩＲＦ光路軸の検流計座標（Ｔｘ０，Ｔｙ０）に対応するはずである。
全積分画像強度は、カメラによって記録された画像の画素を数値的に合計することによって、または顕微鏡対物瞳に対する共役平面の近くに光検出器を配置して、広視野に及ぶ総試料蛍光を直接測定することによって測定することができる。
図５に、どのようにして、検流計位置の粗グリッド上の点における全視野の積分強度の測定が、どの検流計位置が臨界未満、臨界および超臨界の各照明条件を生じるか表示するのに使用され得るかを示す。
円の中心は、おおよそ位置決めされた後で、中心から外に向かって放射状に広がる軌道に沿ってサンプリングすることによって、より正確に位置決めすることができる。これらの軌道は、正確に臨界角位置（Ｇｘ，Ｇｙ）を、閾値尺度を使って、または最大傾斜を有する臨界角位置を位置決めすることによって特定するのに使用することができる。この情報を用いれば、非常に正確なＴＩＲＦ画像軌道を設計することができる。これらの軌道は、所望の透過深度によって、または落射照明にさえもよって、異なる半径を有するＴＩＲＦ光路軸（Ｔｘ０，Ｔｙ０）を中心とする円の形を取るはずである。
図６は、全視野の積分画像強度を測定する間に、大雑把な中心から外に向かって（実線で）示されている軌道（十字線）に沿って検流計を低速で走査することによって、臨界角で顕微鏡対物を通る照明を生じる検流計位置の集合（点線で示す円）を特定するのに使用されることができることを示す図である。
図７は、システム１００と同様に、平面７５５に平行光ビームを投射する平行動作モードと、平面７５５に収束光ビームを投射する収束動作モードとを有する照明システム、すなわちシステム７００のブロック図である。システム７００は、光ステアリング装置７１０、レンズ７２０、７３０、７４０、反射鏡７２５、および光ステアリング装置７４５を含む。
光ステアリング装置７１０は、機能的には光ステアリング装置１１０と同様のものであり、光ステアリング装置１１０と同様のものとして実施することができる。光ステアリング装置７４５は、機能的には光ステアリング装置１８５と同様のものであり、光ステアリング装置１８５と同様のものとして実施することができるが、システム７００には、ビームキューブであるものとして図示されている。
システム７００の平行動作モードでは、光ステアリング装置７１０は、光路７０５を経由して光束を受け取り、この光束を光路７１５へと方向づける。光路７１５は、光ステアリング装置７１０からレンズ７２０を通って反射鏡７２５まで伸び、レンズ７３０を通って光ステアリング装置７４５まで伸びている。光ステアリング装置７４５は、光路７１５を経由して光束を受け取り、この光束を下流側の光路、すなわち光路７５０へと方向づける。
システム７００の収束動作モードでは、光ステアリング装置７１０は、光路７０５を経由して光束を受け取り、この光束を光路７３５へと方向づける。光路７３５は、光ステアリング装置７１０からレンズ７４０を通って光ステアリング装置７４５まで伸びている。光ステアリング装置７４５は、光路７３５を経由して光束を受け取り、この光束を光路７５０へと方向づける。
レンズ７４０は、焦点を調節するために光路７３５の一部分に沿って動かすことができる。レンズ７３０は、コリメーションを調節するために光路７１５の一部分に沿って動かすことができる。
図８は、平行モードにおけるシステム７００の動作の図である。光ステアリング装置７１０は、平行ビーム８０５として光束を受け取り、この光束を平行ビーム８１０としてレンズ７２０へと方向づける。レンズ７２０は平行ビーム８１０としてこの光束を受け取り、これを収束ビーム８１５として平面８２０へと方向づける。平面８２０から、光束は、発散ビーム８２５として反射鏡７２５まで伝搬する。光束は、発散ビーム８３０として反射鏡７２５からレンズ７３０まで伝搬する。レンズ７３０は、この光束を発散ビーム８３０として受け取り、これを平行ビーム８３５として光ステアリング装置７４５へと方向づける。光ステアリング装置７４５は、この光束を平行ビーム８３５として受け取り、これを平行ビーム８４０として平面７５５へと方向づける。レンズ７２０、反射鏡７２５およびレンズ７３０は、光束が平行ビーム８４０として平面７５５に投射されるように光束を変換する光学サブシステムとみなすことができる。光ステアリング装置７１０は、光路７１５における光束の軌道を制御して、平行ビーム８４０を導き指定の入射角８４５で平面７５５に通す。
図９は、収束モードにおけるシステム７００の動作の図である。光ステアリング装置７１０は平行ビーム８０５として光束を受け取り、この光束を平行ビーム９０５としてレンズ７４０へと方向づける。光束は、収束ビーム９１０としてレンズ７４０から光ステアリング装置７４５まで、収束ビーム９１５として光ステアリング装置７４５を経て平面７５５まで伝搬する。レンズ７４０は、光束が収束ビーム９１５として平面７５５に投射されるように光束を変換する光学サブシステムとみなすことができる。光ステアリング装置７１０は、光路７３５における光束の軌道を制御して、収束ビーム９１５を平面７５５内の（例えば、図９においてオフセット９２０で示されるｘｙ座標のところの）目標位置に導く。
図１０は、顕微鏡のためのシステム１０００のブロック図である。システム１０００は、光源１０１５、光学システム１０２０、顕微鏡１０３５、カメラ１０３０、コンピュータ１００５、およびドライバ電子回路１０１０を含む。
光源１０１５は例えば、レーザであり、光を放射する。光学システム１０２０は、光源１０１５から光を受け取り、この光を調整し、平面１０２５を平行光ビームまたは収束光ビームで照明する。光学システム１０２０は、例えば、システム１００やシステム７００によって実施することができる。平面１０２５は、顕微鏡１０３５の画像平面と符合する。顕微鏡１０３５は、平面１０２５に置かれた試料の画像を生成する。カメラ１０３０は、顕微鏡１０３５からの画像を、コンピュータ１００５によって処理されるディジタルデータ形式の画像に変換する撮像装置である。コンピュータ１００５は、画像を評価し、ドライバ電子回路１０１０に信号を提供し、この信号がさらに光学システム１０２０を制御する。
コンピュータ１００５は、画像の特性、例えば、画像内の物理的特徴や、画像の焦点を示す画像の品質を評価する。この特性に基づき、コンピュータ１００５は、最終的には平面１０２５における照明を制御するための計算を行う。例えば、システム１０００が平面１０２５を平行光ビームで照明するのに用いられている場合、コンピュータ１００５は、光学システム１０２０内の光ステアリング装置を制御して、平行光ビームを導き指定の入射角で平面１０２５に通すための計算を行う。同様に、システム１０００が平面１０２５を収束光ビームで照明するのに用いられている場合、コンピュータ１００５は、光学システム１０２０内の光ステアリング装置を制御して、収束光ビームを平面１０２５内の目標位置に導くための計算を行う。またコンピュータ１００５は、光ビームの焦点を合わせるための光学システム１０２０内のレンズの位置決めも制御する。コンピュータ１００５によって行われるいくつかの計算の例については、前述の、（ａ）検流計位置の較正、（ｂ）ＦＲＡＰ検流計位置の自動較正、および（ｃ）ＴＩＲＦ検流計位置の自動較正に関する考察を参照されたい。
コンピュータ１００５は、プロセッサ１００８と、プロセッサ１００８が実行できる命令を含むメモリ１００９とを含む。命令を実行すると、プロセッサ１００８は、画像の特性の評価、光学システム１０２０を制御するための設定の計算を含み、よって、本明細書で示す様々な動作を含む方法を実行するための光学システム１０２０の最終的な制御を含む方法を実行する。
システム１０００は、本明細書においては、プロセッサ１００８のための命令がメモリ１００９にインストールされているものとして示されているが、命令は、後でメモリ１００９にロードするために、例えば、記憶媒体１００７の外部コンピュータ可読記憶媒体上に有形的に実施することもできる。記憶媒体１００７は、それだけに限らないが、フロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープ、読取り専用メモリ、光記憶媒体を含む、あらゆる従来の記憶媒体とすることができる。また命令は、リモート記憶システムに位置し、メモリ１００７に結合されているランダム・アクセス・メモリ、または別種の電子記憶として実施することもできる。
さらに、コンピュータ１００５は、本明細書においては、命令がメモリ１００９にインストールされており、したがって、ソフトウェアとして実施されるものとして示されているが、コンピュータ１００５の動作は、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、またはこれらの組み合わせのいずれかとして実施することもできる。
システム１０００は、全内反射蛍光（ＴＩＲＰ）顕微鏡に最適な照明条件を作り出す。照明は、大きな視野にわたって均一であり、他の照明システムで見られる干渉じまを生じず、エバネッセント波の透過深度を非常に迅速に変化させることができる。システム１０００は、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）または光活性化のための照明条件を作り出す。
システム１０００が生み出すＴＩＲＦ照明の品質は、固定ビームを使用するシステムより優れている。固定ビームを使用するシステムは、干渉じま、フレア、シャドウイング、および他の種類の不均一性を生じる。システム１０００は、等しい傾斜角を有する各ビームの軌道においてビームを走査することによって、このようなアーチファクトを平均する。
システム１０００は、入射ビームの照明角度をミリ秒単位以下で変動させ、広範囲の入射角に及ぶ多角度ＴＩＲＦ顕微鏡を実現するきわめて迅速な方法を提供する。コンピュータ１００５は、自動探索アルゴリズムをフィードバック制御と共に使用して、多種類の対物およびダイクロイック・フィルタ・キューブのためのＴＩＲＦ条件を自動的に最適化する。
ＦＲＡＰ／光活性化ＴＩＲＦおよび対物レンズ
ＦＲＡＰ実験は、観察される試料の選択される領域が光退色されることを必要とする。ＦＲＡＰ実験後の蛍光回復の速度および程度をモニタし、蛍光回復の空間的パターンを調べることによって、分子の動力学に関する結論を下すことができる。相関法は、細胞環境を操作し（例えば、ケージドカルシウムを分解するなど）、または、光活性化によってより明るくなり、もしくはスペクトル特性が変化し得る、光活性化分子の細胞運命を追跡するために、色素または分子を光活性化するものである。
退色／光活性化は、対象とする領域に限局化されなければならないため、一般には、ラスタ走査または他の領域を対象とするビーム軌道を使用して、対象領域全体にわたって集束光ビームを走査することによって行われる。あるいは、ＦＲＡＰは、共役画像平面のところの調整可能なマスク（例えば、調整可能な幅と高さの長方形）を貫通する落射蛍光を用いた選択的照明を使用して実現することもできる。後者は、費用はより安くつくが、通常は、手作業で行われるため調整するのが遅く、小さい物体、複数の物体、または他の形状（例えば、円）を退色／光活性化させることができない。よって、速度と柔軟性を得るために、一般には、ラスタ走査法が好まれる。
一般に、退色される領域は、観察される領域の部分領域であるため、どちらの領域も、顕微鏡対物の焦点面に位置する。この試料焦点面は、顕微鏡の観察ビーム路における画像平面のところに対応する画像平面を有し、（大部分の顕微鏡では）励起ビーム路上にも対応する画像平面を有する。
ＦＲＡＰ／光活性化とＴＩＲＦ照明での異なる要件
ＦＲＡＰ／光活性化実験では、走査ビーム（またはマスク）の焦点が顕微鏡の画像平面上に合わせられなければならない。最小ＦＲＡＰ／光活性化点のサイズは、照明光の波長、対物の開口数（ＮＡ）、および対物の後焦点面を占める範囲によって決まる。（対物レンズを含む）顕微鏡光学システムは、この焦点を試料画像平面まで中継する。走査光学システムがテレセントリックであり、対物が無限遠補正であると仮定すると、光は、顕微鏡対物レンズ瞳の中心を平行ビームとして貫通する。
ＴＩＲＰ照明では、試料画像平面において平行ビームが必要とされる。ＦＲＡＰとは異なり、ＴＩＲＦ照明では、レーザビームの焦点が対物レンズの後焦点面の外縁上に合わせられなければならない。ＴＩＲが生じるためには、次の２つの条件が満たされなければならない。すなわち、（ｉ）光は高屈折率の媒体（典型的にはガラス）からより低い屈折率の媒体（例えば、水性媒体、細胞質ゾルなど）へと進まなければならないこと、および（ｉｉ）光軸（法線）に対する光の入射角は、観察される試料／カバーガラス界面の臨界入射角より大きくなければならないことである。後者の場合、これらの高入射角焦点は、瞳開口の外周の近くで生じる。平行ビームは、顕微鏡の画像平面のところで入射する場合、試料画像平面まで中継される。対物レンズの瞳において、この光は鮮明な焦点になる。
システム１０００は、（ａ）多角度ＴＩＲＦ顕微鏡、（ｂ）ＴＩＲＦと組み合わせたＦＲＡＰ、（ｃ）ＴＩＲＦと組み合わせた光活性化、（ｄ）ＴＩＲＦと組み合わせた光トラッピング、（ｅ）インビトロまたはインビボのイメージング、（ｆ）材料科学および例えば、リソグラフィのための表面の局所的活性化などの用途に使用することができる。
本明細書で示す技法は例示のためのものであり、本発明に関するいかなる限定も示唆しないものと解釈すべきである。当業者によれば、様々な代替、組み合わせ、および変更が考案され得るはずであることを理解すべきである。本発明は、添付の特許請求の範囲内に該当するすべての代替、変更および変形を包含するものである。
１００５ コンピュータ
１００７ 記憶媒体
１００８ プロセッサ
１００９ メモリ
１０１０ ドライバ電子回路
１０１５ 光源
１０２０ 光学システム
１０３０ カメラ
１０３５ 顕微鏡

Claims (25)

  1. 光学システムの第１の動作モード時に前記光学システムから平面に平行光ビームを投射することと、
    前記光学システムの第２の動作モード時に前記光学システムから前記平面に収束光ビームを投射することとを含む、方法。
  2. 前記平行光ビームを投射することは、前記光学システムにおける第１の光路を経由して第１の光束を送ることを含み、
    前記収束光ビームを投射することは、前記光学システムにおける第２の光路を経由して第２の光束を送ることを含む、請求項１に記載の方法。
  3. （ｉ）前記第１の動作モード時に、
    （ａ）光源から前記第１の光束を受け取ることと、
    （ｂ）前記第１の光束を前記第１の光路へと方向づけることと、
    （ｉｉ）前記第２の動作モード時に、
    （ａ）前記光源から前記第２の光束を受け取ることと、
    （ｂ）前記第２の光束を前記第２の光路へと方向づけることとをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第１の動作モード時に、前記第１の光路における前記第１の光束の軌道を制御して、前記平行光ビームを導き指定の入射角で前記平面に通すことと、
    前記第２の動作モード時に、前記第２の光路における前記第２の光束の軌道を制御して、前記収束光ビームを前記平面内の目標位置に導くこととをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  5. （ｉ）前記第１の動作モード時に、
    （ａ）前記第１の光路を経由して前記第１の光束を受け取ることと、
    （ｂ）前記第１の光束を前記平面に至る下流側の光路へと方向づける
    ことと、
    （ｉｉ）前記第２の動作モード時に、
    （ａ）前記第２の光路を経由して前記第２の光束を受け取ることと、
    （ｂ）前記第１の光束を前記平面に至る下流側の光路へと方向づける
    こととをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  6. 前記平行光ビームを投射することは、発散光ビームを前記平行光ビームに変換するレンズに前記発散光ビームを送ることを含み、
    前記収束光ビームを投射することは、前記レンズに中間平行光ビームを送ることを含み、前記レンズは前記中間平行光ビームを前記収束光ビームに変換する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記第１の動作モードは、（ａ）全内反射蛍光照明および（ｂ）光退色後エバネッセント場蛍光回復照明からなるグループの中から選択される工程と併せて用いられる、請求項１に記載の方法。
  8. 前記第２の動作モードは、（ａ）光退色後蛍光回復照明、（ｂ）光活性化照明、（ｃ）光退色照明、（ｄ）光ピンセット操作、（ｅ）光分解操作からなるグループの中から選択される工程と併せて用いられる、請求項１に記載の方法。
  9. 前記平面は顕微鏡の画像平面と符合する、請求項１に記載の方法。
  10. 光学システムの第１の動作モード時に平面に平行光ビームを投射し、
    前記光学システムの第２の動作モード時に前記平面に収束光ビームを投射する前記光学システムを備える、装置。
  11. 前記光学システムは、
    前記第１の動作モード時に、第１の光束が伝搬して前記平行光ビームを生じさせる第１の光路と、
    前記第２の動作モード時に、第２の光束が伝搬して前記収束光ビームを生じさせる第２の光路とを備える、請求項１０に記載の装置。
  12. 前記光学システムは、
    （ｉ）前記第１の動作モード時に、
    （ａ）光源から前記第１の光束を受け取り、
    （ｂ）前記第１の光束を前記第１の光路へと方向づけ、
    （ｉｉ）前記第２の動作モード時に、
    （ａ）前記光源から前記第２の光束を受け取り、
    （ｂ）前記第２の光束を前記第２の光路へと方向づける機器を備える、
    請求項１１に記載の装置。
  13. 前記光学システムは、
    前記第１の動作モード時に、前記第１の光路における前記第１の光束の軌道を制御して、前記平行光ビームを導き指定の入射角で前記平面に通し、
    前記第２の動作モード時に、前記第２の光路における前記第２の光束の軌道を制御して、前記収束光ビームを前記平面内の目標位置に導く機器を備える、請求項１１に記載の装置。
  14. 前記機器は、検流計式走査鏡および音響光学偏向器からなるグループの中から選択された構成部分を備える、請求項１３に記載の装置。
  15. 前記光学システムは、
    前記第１の動作モード時に、前記第１の光路を経由して前記第１の光束を受け取り、前記第１の光束を前記平面に至る下流側の光路へと方向づけ、
    前記第２の動作モード時に、前記第２の光路を経由して前記第２の光束を受け取り、前記第２の光束を前記平面に至る下流側の光路へと方向づける機器を備える、請求項１１に記載の装置。
  16. 前記機器は、楕円ゾーン反射鏡、楕円反射鏡、円形反射鏡、開放口を有する反射鏡、ビーム結合器、ビームスプリッタ、ビームキューブ、および偏光ビームキューブからなるグループの中から選択された構成部分を備える、請求項１５に記載の装置。
  17. 前記光学システムは、
    前記第１の動作モード時に、前記第１の光束を発散光ビームとして受け取り、前記第１の光束を前記平行光ビームとして方向づけ、
    前記第２の動作モード時に、前記第２の光束を平行光ビームとして受け取り、前記第２の光束を前記収束光ビームとして方向づけるレンズを備える、請求項１１に記載の装置。
  18. 前記第１の動作モードは、（ａ）全内反射蛍光照明および（ｂ）光退色後エバネッセント場蛍光回復照明からなるグループの中から選択される工程と併せて用いられる、請求項１０に記載の装置。
  19. 前記第２の動作モードは、（ａ）光退色後蛍光回復照明、（ｂ）光活性化照明、（ｃ）光退色照明、（ｄ）光ピンセット操作、（ｅ）光分解操作からなるグループの中から選択される工程と併せて用いられる、請求項１０に記載の装置。
  20. 前記平面は顕微鏡の画像平面と符合する、請求項１０に記載の装置。
  21. 第１の光学サブシステムと、
    第２の光学サブシステムと、
    （ｉ）第１の動作モード時に、
    （ａ）光源から第１の光束を受け取り、
    （ｂ）前記第１の光束を前記第１の光学サブシステムにおける第１の光路へと方向づけ、
    （ｃ）前記第１の光路における前記第１の光束の軌道を制御して、前記第１の光束を導き指定の入射角で平面に通し、
    （ｉｉ）第２の動作モード時に、
    （ａ）前記光源から第２の光束を受け取り、
    （ｂ）前記第２の光束を前記第２の光学サブシステムにおける第２の光路へと方向づけ、
    （ｃ）前記第２の光路における前記第２の光束の軌道を制御して、前記第２の光束を前記平面内の目標位置に導く光ステアリング装置とを備え、
    前記第１の光学サブシステムは、前記第１の光束が前記平面に平行光ビームとして投射されるように前記第１の光束を変換し、
    前記第２の光学サブシステムは、前記第２の光束が前記平面に収束光ビームとして投射されるように前記第２の光束を変換する、システム。
  22. 前記平面が顕微鏡の画像平面と符合する前記顕微鏡をさらに備える、請求項２１に記載のシステム。
  23. 前記画像平面において試料の画像を生成する画像装置と、
    前記画像の特性を評価し、前記評価に基づいて、
    前記第１の動作モード時に、前記第１の光束の前記軌道を制御するように前記光ステアリング装置を制御し、
    前記第２の動作モード時に、前記第２の光束の前記軌道を制御するように前記光ステアリング装置を制御する制御信号を生成するプロセッサとをさらに備える、請求項２２に記載のシステム。
  24. 前記第１の動作モードは、（ａ）全内反射蛍光照明および（ｂ）光退色後エバネッセント場蛍光回復照明からなるグループの中から選択される工程と併せて用いられる、請求項２１に記載のシステム。
  25. 前記第２の動作モードは、（ａ）光退色後蛍光回復照明、（ｂ）光活性化照明、（ｃ）光退色照明、（ｄ）光ピンセット操作、（ｅ）光分解操作からなるグループの中から選択される工程と併せて用いられる、請求項２１に記載のシステム。
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