JP2011524742A - 変異体Ｈｈｉｐ１タンパク質およびその方法および使用 - Google Patents

変異体Ｈｈｉｐ１タンパク質およびその方法および使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｈｈｉｐ１の誘導体と哺乳動物における癌の治療及び診断のためにそれらを使用する方法に関するものである。

Description

（関連出願）
本出願は、２００８年５月３０日に出願された米国特許仮出願番号６１／０５７７６２の優先権を主張し、この内容全体を出典明記により本明細書に援用する。
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物における腫瘍の診断と治療に有用な組成物と、同用途のために該組成物を使用する方法に関する。
分泌モルフォゲンＨｅｄｇｅｈｏｇ(Ｈｈ)の中で高く保存されたホモログは、無脊椎動物および脊椎動物の胚発生の間の適当な細胞性分化を担っている(Ingham and McMahon (2001) Genes Dev. 15: 3059-3087において概説される)。哺乳動物において、ソニックＨｅｄｇｅｈｏｇ(Ｓｈｈ)、インディアンＨｅｄｇｅｈｏｇ(Ｉｈｈ)およびデザートＨｅｄｇｅｈｏｇ(Ｄｈｈ)タンパク質をコードする３つのＨｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子が同定されている。それらの役割は、左右非対称、神経管パターン化、肢パターン化および分岐形態形成から骨形成および精子形成までにわたる。経路構成成分の突然変異は著しい発生上の疾患につながりうる。Ｈｈシグナル伝達は主に成体において静止しているのに対して、多くの癌に関係していたことから、この経路の阻害が治療的利点を有しうることが示唆される(Beachy, P.A. et al. (2004) Nature 432:324-331；Pasca di Magliano and Hebrok (2003) Nat. Rev. Cancer 3:903-911；Rubin and de Sauvage (2006) Nat Rev Drug Discov. 5(12): 1026-33において概説される)。
Ｈｅｄｇｅｈｏｇの過剰発現によるＨｅｄｇｅｈｏｇ経路の活性化は多くの癌の特徴である。文献は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇの過剰発現が、例えば小細胞肺癌(ＳＣＬＣ)、胃及び上部胃腸管癌、膵癌および前立腺癌を含む多くのヒト腫瘍生検および異なる種類の細胞株において検出されたこと示す。
Ｓｈｈの適切な短期及び長期のシグナル伝達を担う成熟したＨｈアミノ末端ドメイン(稀にＳｈｈ-Ｎとも称される)は、Ｃ末端インテイン様ドメインの自己タンパク質分解切断の後に(Lee, J.J. et al. (1994) Science 266:1528-1537；Porter, J.A. et al. (1995) Nature 374:363-366；Porter, J. A. et al. (1996) Cell 86:21-34)、Ｃ末端にコレステロールそしてＮ末端にパルミトイル化が付加されて生成される(Pepinsky et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:14037-14045；Porter, J.A. et al. (1996) Science 274:255-259)。マウスＳｈｈの結晶構造により、メタロプロテアーゼのＭＤ系のものと類似の全体の形態を有する四面体で調整されたＺｎ２＋陽イオンが明らかとなった(Hall, T.M. et al. (1995) Nature 378:212-216)(Rawlings, N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36: D320-325)。このＭＤ系には細菌 リゾスタフィン(Bochtler, M. et al. (2004) Protein Sci. 13: 854-861)およびＶａｎＸジペプチターゼ(Bussiere, D.E. et al. (1998) Mol. Cell 2:75-84)が含まれる。Ｓｈｈがメタロプロテアーゼ偽活性部位を含むにもかかわらず、活性部位の突然変異は生物学的なアッセイシグナル伝達活性に悪影響を与えないことから、Ｓｈｈが酵素的に活性なプロテアーゼとしてというよりはむしろ膜結合型レセプターの結合パートナーとして働くことが示唆される(Fuse, N. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10992-10999)。
細胞表面で、Ｈｈシグナルは２つの多膜貫通タンパク質によって中継される。１２-貫通膜貫通タンパク質Ｐａｔｃｈｅｄ(Ｐｔｃｈ)は経路のネガティブ調節因子であり、リガンドがない場合には７-貫通膜貫通タンパク質Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ(Ｓｍｏ)を抑制することによってシグナル伝達を阻害する(Chen and Struhl (1996) Cell 87:553-563；Marigo, V. et al. (1996) Nature 384:176-179；Stone, D.M. et al. (1996) Nature 384:129-134)。ＰｔｃｈへのＳｈｈの結合がＳｍｏの阻害を低減するため、一次絨毛へそれが転移できる(Rohatgi and Scott (2007) Nat. Cell Biol. 9:1005-1009)。このまだ十分に解明されていない下流のシグナル伝達現象によりＧｌｉと呼ばれるＺｎフィンガー転写因子のファミリが活性化される(Ingham and McMahon (2001) Genes Devel. 15: 3059-3087)。
Ｐｔｃｈによる細胞表面のＨｈシグナルの調節は、無脊椎タンパク質Ｉｈｏｇ(干渉Ｈｅｄｇｅｈｏｇ)(Lum, L. et al. (2003) Science 299:2039-2045；Yao, S. et al. (2006) Cell 125:343-357)及びＢｏｉ(Ｉｈｏｇの一種)(Yao, S. et al. (2006) Cell 125:343-357)およびそれらの対応する脊椎動物のホモログＣｄｏｎ(Kang, J.S. et al. (1997) J. Cell. Biol. 138:203-213；Zhang, W. et al. (2006) Dev. Cell 10: 657-65)及びＢｏｃ(バイオ領域のＣｄｏｎ-結合タンパク質)(Kang, J.S. et al. (2002) EMBO J. 21:114-124；Tenzen, T. et al. (2006) Dev. Cell 10:647-656)といった多くの多の細胞表面分子によって細かく調節される。ショウジョウバエの公知のホモログを欠いている、コレセプターＩｈｏｇ／Ｂｏｉ Ｃｄｏｎ／Ｂｏｃ及びＧａｓ１(増殖静止-特異的１タンパク質は、シグナル受信を上げる経路アゴニストである(Allen Allen, B.L. et al. (2007) Genes Dev. 21: 1244-1257)。
Ｐｔｃｈと同様に、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ相互作用タンパク質(Ｈｈｉｐ１、別名Ｈｉｐ)は経路のネガティブ調節因子であり、その転写はＨｈシグナル伝達に応答して上方制御される(Chuang, P.T. et al. (2003) Genes Dev. 17: 342-347；Chuang, P.T. et al. (1999) Nature 397:617-621)。細胞上のＨｈｉｐ１及びＰｔｃｈに対するＳｈｈの結合親和性は類似しており、Ｈｈｉｐ１に対しては５ｎＭ及びＰｔｃｈに対しては４ｎＭのＫＤ値である(Chuang and McMahon (1999) Nature 397:617-621)。Ｈｈｉｐ１の発現レベルの減少がいくつかのヒト腫瘍組織タイプにみられたことから、腫瘍発達の抑制におけるＨｈｉｐ１の重要な役割が示唆される(Olsen, C.L. et al. (2004) BMC Cancer 4:43)。
Ｈｈｉｐ１は、疎水性Ｃ末端ストレッチにて終わっている大きな細胞外領域とＮ末端シグナルペプチドを有する７００残基のタンパク質である(Chuang and McMahon (1999) Nature 397:617-621)。主に膜結合型であることに加えて、Ｈｈｉｐ１の可溶型は、成体齧歯動物の成熟した脳においても検出された(Coulombe, J. et al. (2004) Mol. Cell. Neurosci. 25:323-333)。２つの上皮性増殖因子(ＥＧＦ)ドメインと４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位がおそらくある以外に(Chuang and McMahon (1999) Nature 397:617-621)、Ｈｈｉｐ１細胞外ドメイン(ＥＣＤ)の構造配列について知られていることはない。
しばらくの間Ｓｈｈの構造が知られていたが、その膜結合レセプターとの分子相互作用の正確な理解は得られないままであった。近年、ショウジョウバエＨｈ及び脊椎動物Ｓｈｈと複合したＩｈｏｇのフィブロネクチンIII型(ＦＮIII)ドメイン１およびＣｄｏｎのＦＮIIIドメイン３の構造をそれぞれ比較することにより、完全に異なる結合様式が明らかになった(McLellan, J.S. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:17208-17213)。
現在まで、Ｈｈｉｐ１の結晶構造は解明されておらず、Ｈｈｉｐ１がどのようにＨｈと相互作用しその効果を発揮しているかは知られていなかった。同様に、Ｐｔｃｈは結晶化しなかったので、ＰｔｃｈがどのようにＨｈと相互作用したかも知られていなかった。
ゆえに、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路関連の腫瘍と効率よく戦うために、Ｈｈｉｐ１およびＰｔｃｈといったＨｈ制御分子とＨｈとの正確な相互作用をよりよく理解することが当分野では差し迫って必要である。Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達経路のメンバーの構造的／機能的な関連を完全に理解すること、特に、ＰｔｃｈとＨｈｉｐ１との分子相互作用をよりよく理解することにより、Ｈｈの小分子及び大分子のインヒビターの合理的な設定やＨｈ関連の癌及び症状のための治療法についての必要な情報が得られる。
Ｈｈｉｐ１によるＳｈｈの調節を理解するために、発明者等は、単独及びＳｈｈと複合したＨｈｉｐ１外部ドメインの切断型の結晶構造を決定した。複合構造により、Ｈｈｉｐ１β-プロペラのループとＳｈｈ偽活性部位のＺｎ２＋含有グローブとの間の重要な相互作用が明らかとなる。注目すべきことに、Ｐｔｃｈに類似のモチーフが見られることから、ＰｔｃｈおよびＨｈｉｐ１がＳｈｈ偽活性部位への結合について競合することが示唆される。これにより、Ｐｔｃｈ結合及び経路活性化を妨げるＳｈｈの構造的デコイとしてのＨｈｉｐ１によるネガティブ調節が説明される。また、データから、ヒトの疾患と関連があるＨｈタンパク質の偽活性部位の内外での突然変異の効果が洞察される(Dubourg et al. (2004)；Gao and He (2004) )。まとめると、データから、レセプター相互作用によるＨｈ活性の調節のためのモデルを提案し、Ｈｈシグナル伝達のアンタゴニストを開発するための新規のアプローチが提案できる。
ゆえに、本明細書は、本明細書中で「Ｈｈｉｐ１β１２」と称する、推定ｆｒｉｚｚｌｅｄドメインを欠くＨｅｄｇｅｈｏｇ相互作用タンパク質(Ｈｈｉｐ１)変異体と、この結晶構造を記載する。驚くべきことに、Ｈｈｉｐ１β１２タンパク質により完全にＨｈ阻害活性を維持したまま安定性が増したＨｈｉｐ１β１２タンパク質が提供されることを発見した。ゆえに、Ｈｈｉｐ１β１２の結晶構造を解析し、ＨｈとＰｔｃｈといった他のタンパク質との相互作用を分析した。Ｈｈｉｐ１β１２は、ＨｈおよびＰｔｃｈと相互作用する重要なアミノ酸を含有し、例えばポリペプチドアゴニストおよびアンタゴニスト、イムノアドヘシン、抗体および小分子インヒビターおよびアゴニストのような相互作用分子の設定が可能となる。
したがって、本発明の一実施態様では、本発明は、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド又はその生物学的に活性な断片(まとめて「Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド」)をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。
ある態様では、単離された核酸分子は、(ａ) 完全長Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子；(ｂ) ここで開示するアミノ酸配列を有するＨｈｉｐ１β１２細胞外ドメイン(ＥＣＤ)ポリペプチド(「Ｈｈｉｐ１β１２ＥＣＤ」)(すなわち、推定ＧＰＩアンカーシグナル配列を欠くＨｈｉｐ１β１２)；(ｃ) ここで開示するアミノ酸配列を有するＨｈｉｐ１β１ポリペプチド(すなわち、シグナルペプチド、推定Ｆｚドメイン、ＥＧＦ２ドメインおよび推定ＧＰＩアンカーシグナル配列を欠くもの)；(ｄ) ここで開示されるアミノ酸配列を有するＨｈｉｐ１βポリペプチド(すなわち、シグナルペプチド、推定Ｆｚドメイン、ＥＧＦドメインおよび推定ＧＰＩアンカーシグナル配列を欠くもの)；(ｅ) Ｈｈｉｐ１Ｆｚβポリペプチド(すなわち、シグナルペプチド、ＥＧＦドメインおよび推定ＧＰＩアンカーシグナル配列を欠くもの)；(ｆ) Ｈｈｉｐ１Ｆｚポリペプチド(すなわち、シグナルペプチド、プロペラドメイン、ＥＧＦドメインおよび推定ＧＰＩアンカーシグナル配列を欠くもの)；又は、ここに開示する完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定義した断片に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は(ｂ)上記いずれかのＤＮＡ分子の相補鎖を含む。
本発明の他の態様は、欠失又は不活性な推定ＧＰＩシグナル配列を有するＨｈｉｐ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はそのコード化ヌクレオチド配列に相補的である単離された核酸分子を提供する。このとき該ポリペプチド(一又は複数)の推定ＧＰＩシグナル配列は本明細書中で開示されるものである。したがって、ここに記載のＨｈｉｐ１ポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
他の態様では、本発明は、(ａ) ここに開示する完全長アミノ酸配列を有するＨｈｉｐ１ポリペプチド、ここに開示するシグナルペプチドを欠くＨｈｉｐ１ポリペプチドアミノ酸配列、ここに開示するＨｈｉｐ１β１２アミノ酸配列、ここに開示するＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチドアミノ酸配列の任意の具体的に定義した他の断片をコードするヌクレオチド配列、又は(ｂ) (ａ)のヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズする単離された核酸分子に関する。この点に関して、本発明の実施態様は、例えば、診断用プローブ、ＰＣＲプライマー、アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとして有用なハイブリダイゼーションプローブとしての用途を見出し得る、ここに開示される、完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチドコード化配列の断片、又はその相補鎖、又は抗Ｈｉｐポリペプチド抗体、Ｈｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチド(アゴニスト又はアンタゴニスト)又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドに結合する他の小有機分子の結合部位を含むポリペプチドを任意にコードし得る完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチドのコード化断片に関する。このような核酸断片は、通常は少なくとも約５のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈において「約」という用語は、表示ヌクレオチド配列長にその表示長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。更に、このような核酸断片は、通常、Ｈｈｉｐ１ポリペプチド又はその相補鎖の完全長コード化配列から得られる連続するヌクレオチドからなる。Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド又はその相補鎖のコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、よく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用してＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片、又はその相補鎖が新規であるかを決定することによって、常套的に決定しうることが知られている。そのようなＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片の全て、又はその相補鎖がここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子断片によりコードされるＨｈｉｐ１ポリペプチド断片、好ましくは抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドに結合する他の小有機分子に対する結合部位を含んでなるＨｈｉｐ１ポリペプチド断片、及びＨｈを結合するＨｈｉｐ１β１２ペプチドである。
他の実施態様では、本発明は上記において特定した単離された核酸配列の何れかによりコードされる単離されたＨｈｉｐ１ポリペプチドを提供する。
ある態様では、本発明は、ここに開示される完全長アミノ酸配列を有するＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド、ここに開示される核酸配列の任意のものによってコードされるアミノ酸配列、又はここに開示される完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチドアミノ酸配列でその他の具体的に定まった断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドに関する。
また別の態様では、本発明は単離されたＴＡＴポリペプチドに関し、本単離されたＴＡＴポリペプチドは、（ａ）本明細書に開示される完全長Ｈｈｉｐ１β１２アミノ酸配列を有するＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド、（ｂ）本明細書に開示されるＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドタンパク質の細胞外ドメイン、（ｃ）本明細書に開示される核酸配列のいずれかによってコードされるアミノ酸配列、又は（ｄ）本明細書に開示される完全長Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドアミノ酸配列の、特に規定された他のいずれかの断片、をコードするＤＮＡ分子の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。
特定の態様では、本発明は、単離されたＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド；単離されたＨｈｉｐ１β１２ＥＣＤ；単離されたＨｉｐβ１ポリペプチド；単離されたＨｉｐβ；を提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされている。これを製造する方法もまたここに開示され、これらの方法には、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドの発現に適した条件下で適切なコード化核酸分子を含有するベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養物からＨｈｉｐ１ポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の態様は、単離されたＨｈｉｐ１β１２ＥＣＤポリペプチドを提供する。これを製造する方法もまたここに開示され、これらの方法には、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドの発現に適した条件下で適切なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養物からＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の実施態様では、本発明は、ここで記載されているポリペプチドの何れかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例を挙げると、宿主細胞は哺乳動物細胞、ＣＨＯ細胞、昆虫細胞、大腸菌、又は酵母菌であり得る。ここに開示されているポリペプチドの何れかの製造方法がさらに提供され、所望するポリペプチドの発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物からその所望するポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、異種（非-Ｈｉｐ）ポリペプチドに融合した、ここに開示のＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド(例えばＨｈｉｐ１β１２、Ｈｉｐβ１、Ｈｉｐβ及びＨｈｉｐ１Ｆｚβ)の何れかを含む単離したキメラポリペプチドを提供する。そのようなキメラ分子の例は、例えば、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域等の異種ポリペプチドと融合したここに開示のＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの何れかを含む。
その他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの何れかと、好ましくは特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、その抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体又は抗Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド抗体がその各抗原性エピトープと結合するのを競合的に阻害する抗体である。本発明の抗体は、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートし得る。本発明の抗体は、場合によってはＣＨＯ細胞又は細菌細胞で産生され、好ましくは、それが結合する細胞の成長又は増殖を阻害するか、又は死を誘導する。診断の目的に対しては、本発明の抗体は、検出可能に標識されたり、固体支持体に付着されたりする。
ある実施態様では、本発明の抗体は、ＨｈとＨｈｉｐ１又はＨｈとＰｔｃｈの相互作用を干渉する。ある実施態様では、抗体は５Ｅ１以外である。他の実施態様では、抗体はＨｈシグナル伝達を刺激する。
本発明の他の実施態様では、本発明はここで開示されている抗体の何れかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例を挙げると、この宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であり得る。ここに記載されている抗体の製造方法が更に提供され、所望する抗体の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物からその所望する抗体を回収することを含んでなる。
ある実施態様では、オリゴペプチドは、ＨｈとＨｈｉｐ１又はＰｔｃｈの相互作用を干渉する。他の実施態様では、オリゴペプチドはＰｔｃｈに結合することによってＨｈシグナル伝達を刺激する。
他の実施態様では、本発明は、記載のＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの何れかに、好ましくは特異的に、結合するオリゴペプチド（「Ｈｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチド」）を提供する。場合によっては、本発明のＨｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチドは、例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような増殖阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等とコンジュゲートされうる。本発明のＨｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチドは、場合によってはＣＨＯ細胞又は細菌細胞中で産生され、好ましくは、それが結合する細胞の成長又は増殖を阻害するか、又は死を誘導する。診断の目的に対しては、本発明のＨｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチドは、検出可能に標識されたり、固体支持体等に付着させられたりする。
他の実施態様では、本発明は、Ｈｈポリペプチドに、好ましくは特異的に、結合するオリゴペプチド（「Ｈｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣オリゴペプチド」）を提供する。場合によっては、本発明のＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣オリゴペプチドは、例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような増殖阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等とコンジュゲートされうる。本発明のＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣オリゴペプチドは、場合によってはＣＨＯ細胞又は細菌細胞中で産生され、好ましくは、それが結合する細胞の成長又は増殖を阻害するか、又は死を誘導する。診断の目的に対しては、本発明のＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣オリゴペプチドは、検出可能に標識されたり、固体支持体等に付着させられたりする。
本発明の他の実施態様では、本発明は、ここで記載されているＨｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチド及びＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣オリゴペプチドの何れかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であり得る。ここに記載されているＨｈｉｐ１β１２結合及びＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣オリゴペプチドの任意のものを製造する方法が更に提供され、所望するオリゴペプチドの発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養からその所望するオリゴペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、上記の又は下記のＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの何れかに、好ましくは特異的に、結合する小有機分子（「Ｈｈｉｐ１β１２結合有機分子」）を提供する。場合によっては、本発明のＨｈｉｐ１β１２結合有機分子は、例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等とコンジュゲートし得る。本発明のＨｈｉｐ１β１２結合有機分子は、好ましくは、それが結合する細胞の成長又は増殖を阻害するか、又は死を誘導する。診断の目的に対しては、本発明のＨｈｉｐ１β１２結合有機分子は、検出可能に標識されたり、固体支持体等に付着させられたりしうる。
ある実施態様では、小有機分子は、ＨｈとＨｈｉｐ１又はＰｔｃｈの相互作用を干渉する。ある実施態様では、小分子はｒｏｂｏｔｎｉｋｉｎｉｎ以外である(Stanton et al. (2009) Nat. Chem Biol. 5(3):154-156)。他の実施態様では、小分子はＨｈシグナル伝達を刺激する。
他の実施態様では、本発明は、Ｈｈポリペプチドに、好ましくは特異的に、結合する小有機分子（「Ｈｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣有機分子」）を提供する。場合によっては、本発明のＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣有機分子は、例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような増殖阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等とコンジュゲートされうる。本発明のＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣有機分子は、好ましくは、それが結合する細胞の成長又は増殖を阻害するか、又は死を誘導する。診断の目的に対しては、本発明のＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣有機分子は、検出可能に標識されたり、固体支持体等に付着させられたりする。
より更なる実施態様では、本発明は、担体と組み合わされて、ここに記載のＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド、ここに記載のキメラＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド、ここに記載の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、ここに記載のＨｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチド、ここに記載のＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣オリゴペプチド、ここに記載のＨｈｉｐ１β１２結合有機分子、又はここに記載のＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣有機分子を含有する組成物に関する。場合によっては、この担体は薬学的に受容可能な担体である。
更に他の実施態様では、本発明は、容器及び容器内に収容された組成物を含む製造品に関し、その組成物には、ここに記載のＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドないしその誘導体、ここに記載のキメラＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドないしその誘導体、ここに記載の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、ここに記載のＨｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチド、又はここに記載のＨｈｉｐ１β１２結合有機分子が含まれ得る。製造品は、更に場合によっては、腫瘍の治療的処置又は診断的検出のためのこの組成物の使用に言及する、容器に添付したラベル、又は容器内に含まれるパッケージ挿入物を含みうる。
本発明の他の実施態様は、ここに記載のＨｈｉｐ１ポリペプチド、ここに記載のキメラＨｈｉｐ１ポリペプチド、ここに記載の抗Ｈｈｉｐ１ポリペプチド抗体、ここに記載のＨｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチド、ここに記載のＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣オリゴペプチド、ここに記載のＨｈｉｐ１β１２結合有機分子、又はここに記載のＨｈｉｐ１Ｌ２ループ模倣有機分子の、Ｈｈシグナル伝達に反応する症状の治療に有用な医薬の調製のための使用に関する。
Ｂ．更なる実施態様
本発明の他の実施態様は、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドを発現する細胞の成長を阻害する方法に関し、該方法は、細胞を、Ｈｈｉｐ１β１２及び／又はＰｔｃｈポリペプチドと結合する抗体、オリゴペプチド又は小有機分子と接触させることを含み、ここでＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドへの抗体、オリゴペプチド又は有機分子の結合がＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドを発現する細胞の成長の阻害を引き起こす。好適な実施態様では、細胞は癌細胞であり、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドへの抗体、オリゴペプチド又は有機分子の結合がＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドを発現する細胞の死を引き起こす。場合によっては、抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体である。本発明の方法に用いられる抗体、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチド及びＨｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合有機分子は、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートし得る。本発明の方法に用いられる抗体及びＨｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチドは、場合によってはＣＨＯ細胞又は細菌細胞中で産生され得る。
本発明の更に他の実施態様は、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドを発現する細胞を含む癌性細胞を持つ哺乳動物を治療的に処置する方法に関し、該方法は、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドと結合する抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合小有機分子アンタゴニストの治療的に有効な量を哺乳動物に投与することを含み、それによって腫瘍の効果的な治療的処置が達成される。場合によっては、抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体である。本発明の方法に用いられる抗体、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチド及びＨｈｉｐ１β１２結合有機分子は、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような増殖阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートされうる。本発明の方法に用いられる抗体及びオリゴペプチドは、場合によってはＣＨＯ細胞又は細菌細胞中で産生され得る。
本発明の更に他の実施態様は、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドを含むと思われる試料中のＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドの存在を決定する方法に関し、該方法は、試料をＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドと結合する抗体、オリゴペプチド又は小有機分子に曝して、試料中のＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドへの抗体、オリゴペプチド又は有機分子の結合を定量することを含み、そのような結合の存在が、試料中のＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドの存在を示す。場合によっては、試料は、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドを発現すると思われる細胞（癌細胞であり得る）を含み得る。この方法で用いる抗体、Ｈｈｉｐ１β１２結合Ｌ２ループ結合オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合有機分子は、場合によっては検出可能なように標識されたり、固体支持体に付着させられたりする。
本発明の更なる実施態様は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に関し、該方法は、（ａ）前記哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料、及び（ｂ）同じ組織源又は型の既知の正常な非癌性細胞のコントロール試料中における、Ｈｈｉｐ１ポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出することを含んでなり、コントロール試料と比較して、試験試料中のＨｈｉｐ１ポリペプチドのより高いレベルの発現が、試験試料が得られた哺乳動物での腫瘍の存在を示す。このようなアッセイのためのプローブはＨｈｉｐ１β１２-コード核酸に由来する。
本発明の他の実施態様は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に関し、該方法は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料を、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドと結合する抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合小有機分子と接触させ、（ｂ）試験試料中での、抗体、オリゴペプチド又は小有機分子とＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドの間で形成される複合体を検出することを含んでなり、複合体の形成が、哺乳動物での腫瘍の存在を示す。場合によっては、用いられる抗体、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合有機分子は、検出可能に標識されたり、固体支持体に付着されたりするか、及び／又は組織細胞の試験試料が癌牲腫瘍を有すると思われる個体から得られる。
本発明の更に他の実施態様は、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドの改変、好ましくは増加された発現又は活性に関連した細胞増殖性疾患を治療又は防止する方法に関し、該方法はそのような治療を必要とする患者に、有効量のＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含んでなる。好ましくは、細胞増殖性疾患は癌であり、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドのアンタゴニストは抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合有機分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。細胞増殖性疾患の効果的な治療又は防止はＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドを発現する細胞の直接の死滅化又は増殖阻害の結果又はＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドの細胞増殖増強活性のアンタゴナイズによるものでありうる。
本発明の更に他の実施態様はＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドを発現する細胞へ抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合小有機分子を結合させる方法に関し、該方法は、該Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドを発現する細胞を、上記抗体、オリゴペプチド又は小有機分子に、抗体、オリゴペプチド又は小有機分子が上記Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドに結合するのに適した条件下で接触させ、それらの結合を可能にすることを含んでなる。好ましい実施態様では、抗体、オリゴペプチド、又は小有機分子の細胞に対する結合の位置及び／又は量の、定性的及び／又は定量的な決定に有用な化合物又は分子を用いて抗体を標識する。
本発明の他の実施態様は（ａ）Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド、（ｂ）Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードする核酸又はその核酸を含むベクター又は宿主細胞、（ｃ）抗Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド抗体、（ｄ）Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチド、又は（ｅ）Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合小有機分子の、（ｉ）癌又は腫瘍の治療的処置又は診断的検出、又は（ｉｉ）細胞増殖性疾患の治療的処置又は防止に有用な医薬の製造における使用に関する。
本発明の更なる実施態様は、本明細書を読むことにより当業者に明白であろう。
本発明の簡潔な記載
１． 配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６の何れか一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列、又はその相補鎖を有する単離された核酸。
２． 配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６の何れか一に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又はその相補鎖を有する単離された核酸。
３． １又は２に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
４． 前記核酸がベクターによって形質転換した宿主細胞によって認識されるコントロール配列と作用可能に結合している、３に記載の発現ベクター。
５． ３に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
６． ＣＨＯ細胞、大腸菌又は酵母菌である、５に記載の宿主細胞。
７． ポリペプチドの製造方法において、請求項５に記載の宿主細胞を上記ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、上記ポリペプチドを細胞培養物から回収することを含んでなる方法。
８． 配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６の何れか一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
９． 配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６の何れか一のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
１０． 異種ポリペプチドに融合せしめられた８又は９に記載のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド。
１１． 前記異種ポリペプチドがエピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域である、１０に記載のキメラポリペプチド。
１２． 配列番号：７、１７、１９−２５、３８、５３−５５、及び７２−８２の何れか一のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する単離されたオリゴペプチド。
１３． 増殖阻害性剤にコンジュゲートされている、１２に記載のオリゴペプチド。
１４． 細胞障害性剤にコンジュゲートされている、１２に記載のオリゴペプチド。
１５． 細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核分解性酵素からなる群から選択される、１４に記載のオリゴペプチド。
１６． 細胞障害性剤が毒素である、１４に記載のオリゴペプチド。
１７． 毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、１６に記載のオリゴペプチド。
１８． 毒素がメイタンシノイドである、１６に記載のオリゴペプチド。
１９． 結合する細胞の死を誘導する、１２に記載のオリゴペプチド。
２０． 検出可能に標識される、１２に記載のオリゴペプチド。
２１． 配列番号：３９のアミノ酸配列を有するペプチドを含んでなり、Ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドに結合するＨｈｉｐ１ Ｌ２ループ模倣オリゴペプチド。
２２． 前記オリゴペプチドが配列番号：５６−７１のアミノ酸配列を含んでなる、２１に記載のオリゴペプチド。
２３． 増殖阻害性剤にコンジュゲートされている、２１に記載のオリゴペプチド。
２４． 細胞障害性剤にコンジュゲートされている、２１に記載のオリゴペプチド。
２５． 細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核分解性酵素からなる群から選択される、２４に記載のオリゴペプチド。
２６． 細胞障害性剤が毒素である、２５に記載のオリゴペプチド。
２７． 毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、２６に記載のオリゴペプチド。
２８． 毒素がメイタンシノイドである、２６に記載のオリゴペプチド。
２９． 結合する細胞の死を誘導する、２１に記載のオリゴペプチド。
３０． 検出可能に標識される、２１に記載のオリゴペプチド。
３１． Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈタンパク質のＬ２ループに結合する化合物を含んでなる有機小分子であり、Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈへのＨｈポリペプチドの結合を阻害する有機小分子。
３２． 前記分子がロボトニキニン(ｒｏｂｏｔｎｉｋｉｎｉｎ)以外である、３１に記載の小分子。
３３． Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈタンパク質のＬ２ループを模倣する化合物を含んでなる有機小分子であり、Ｈｈポリペプチドポリペプチドに結合し、Ｈｈシグナル伝達を阻害する有機小分子。
３４． Ｐｔｃｈタンパク質のＬ２ループに結合し、Ｈｈシグナル伝達をアンタゴナイズする化合物を含んでなる有機小分子。
３５．
（ａ）８のポリペプチド；
（ｂ）９のポリペプチド；
（ｃ）１０のキメラポリペプチド；
（ｆ）１２のオリゴポリペプチド；
（ｇ）２１のオリゴポリペプチド；
（ｈ）３１の有機分子；
（ｉ）３２の有機分子；
（ｊ）３３の有機分子；又は
（ｋ）３４の有機分子
を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含有する物質の組成物。
３６．
（ａ）容器と
（ｂ）該容器に収容された３５に記載の物質の組成物
を含んでなる製造品。
３７． 癌の治療上の処置又は診断用検出のための前記組成物の使用を示す、前記容器に添付されるラベル又は前記容器に内包されるパッケージ挿入物をさらに含む、３６に記載の製造品。
３８． Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈを発現する細胞の増殖を阻害する方法において、該Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈに結合するオリゴペプチド又は有機分子と該細胞を接触させることを含み、該Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈへの該オリゴペプチド又は有機分子の結合が該細胞の増殖の阻害を引き起こす方法。
３９． 前記オリゴペプチド又は有機分子が増殖阻害性剤にコンジュゲートしている、３８に記載の方法。
４０． 前記オリゴペプチド又は有機分子が細胞障害性剤にコンジュゲートしている、３８に記載の方法。
４１． 細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核分解性酵素からなる群から選択される、４０に記載の方法。
４２． 細胞障害性剤が毒素である、４０に記載の方法。
４３． 毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、４２に記載の方法。
４４． 毒素がメイタンシノイドである、４２に記載の方法。
４５． 前記細胞が癌細胞である、３８に記載の方法。
４６． 前記癌細胞が、放射線治療又は化学療法剤にさらにさらされる、４５に記載の方法。
４７． 前記癌細胞が、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、子宮頸部癌細胞、メラノーマ細胞および白血病細胞からなる群から選択される、４５に記載の方法。
４８． 前記タンパク質が、同じ組織起源の正常細胞と比較して前記癌細胞に多く発現されている、４５に記載の方法。
４９． 前記細胞の死を引き起こす、３８に記載の方法。
５０． Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈタンパク質を発現する細胞を含む癌性腫瘍を持つ哺乳動物を治療的に処置する方法において、そのような処置を必要とする被検体に、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合抗体、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ抗イディオタイプ抗体、Ｈｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２結合有機分子、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣オリゴペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣有機分子の有効量を投与し、それによって上記哺乳動物を効果的に処置することを含む方法。
５１． 前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子が増殖阻害性剤にコンジュゲートしている、５０に記載の方法。
５２． 前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子が細胞障害性剤にコンジュゲートしている、５０に記載の方法。
５３． 細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核分解性酵素からなる群から選択される、５２に記載の方法。
５４． 細胞障害性剤が毒素である、５２に記載の方法。
５５． 毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、５４に記載の方法。
５６． 毒素がメイタンシノイドである、５４に記載の方法。
５７． 前記腫瘍が、放射線治療又は化学療法剤にさらにさらされる、５０に記載の方法。
５８． 前記腫瘍が、胸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、中枢神経系腫瘍、肝腫瘍、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍又は子宮頸部腫瘍である、５０に記載の方法。
５９． 前記タンパク質が、同じ組織起源の正常細胞と比較して前記腫瘍の癌性細胞に多く発現されている、５０に記載の方法。
６０． Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈタンパク質を発現する細胞における細胞増殖を治療又は予防する方法において、そのような処置を必要とする被検体に、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合抗体、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ抗イディオタイプ抗体、Ｈｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２結合有機分子、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣オリゴペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣有機分子の有効量を投与し、それによって上記細胞増殖性疾患を効果的に治療又は予防することを含む方法。
６１． 前記細胞増殖性疾患が癌である、６０に記載の方法。
６２． 細胞の増殖を阻害する方法であって、Ｐｔｃｈ又はＨｈｉｐ１を発現する細胞に、Ｈｈｉｐ１β１２ Ｌ２ループ結合抗体又はＨｈｉｐ１β１２ Ｌ２ループ抗イディオタイプ抗体の有効量を投与することを含む方法。
６３． 前記抗体がモノクローナル抗体である、６２に記載の方法。
６４． 前記抗体が抗体断片である、６２に記載の方法。
６５． 前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項６２に記載の方法。
６６． 前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子が増殖阻害性剤にコンジュゲートしている、６２に記載の方法。
６７． 前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子が細胞障害性剤にコンジュゲートしている、６２に記載の方法。
６８． 細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核分解性酵素からなる群から選択される、６７に記載の方法。
６９． 細胞障害性剤が毒素である、６７に記載の方法。
７０． 毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、６９に記載の方法。
７１． 毒素がメイタンシノイドである、６９に記載の方法。
７２． 前記抗体が細菌で産生される、６２に記載の方法。
７３． 前記抗体がＣＨＯ細胞で産生される、６２に記載の方法。
７４． 前記細胞が癌細胞である、６２に記載の方法。
７５． 前記癌細胞が、放射線治療又は化学療法剤にさらにさらされる、７４に記載の方法。
７６． 前記癌細胞が、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、子宮頸部癌細胞、メラノーマ細胞および白血病細胞からなる群から選択される、７４に記載の方法。
７７． 前記タンパク質が、同じ組織起源の正常細胞と比較して前記癌細胞に多く発現されている、７５に記載の方法。
７８． 前記細胞の死が引き起こされる、６２に記載の方法。
７９． 癌の治療のための医薬の調製における１２から３０の何れか一に請求されるのオリゴペプチドの使用。
８０． 細胞増殖性疾患の治療又は予防のための医薬の調製における１２から３０の何れか一に請求されるオリゴペプチドの使用。
８１． 抗Ｈｉｐ Ｌ２ループ抗体。
８２． 抗イディオタイプＨｈｉｐ１ Ｌ２ループ抗体。
８３． 抗Ｐｔｃｈ Ｌ２ループ抗体。
８４． 抗イディオタイプＰｔｃｈ Ｌ２ループ抗体。
８５． 癌の治療のための医薬の調製における８１から８４の何れか一に請求される抗体の使用。
８６． 腫瘍の治療のための医薬の調製における８１から８４の何れか一に請求される抗体の使用。
８７． 細胞増殖性疾患の治療又は予防のための医薬の調製における８１から８４の何れか一に請求される抗体の使用。
８８． 癌の治療的処置又は診断用検出のための医薬の調製における３１に記載のＨｈｉｐ１β１２結合有機分子の使用。
８９． 腫瘍を治療するための医薬の調製における３１に記載のＨｈｉｐ１β１２結合有機分子の使用。
９０． 細胞増殖性疾患の治療又は予防のための医薬の調製における３１に記載のＨｈｉｐ１β１２結合有機分子の使用。
９１． 癌の治療的処置のための医薬の調製における３３に記載のＨｈｉｐ１ Ｌ２ループ模倣有機分子の使用。
９２． 腫瘍を治療するための医薬の調製における３３に記載のＨｈｉｐ１ Ｌ２ループ模倣有機分子の使用。
９３． 細胞増殖性疾患の治療又は予防のための医薬の調製における３３に記載のＨｈｉｐ１ Ｌ２ループ模倣有機分子の使用。
９４． 癌の治療的処置のための医薬の調製における３４に記載の組成物の使用。
９５． 腫瘍を治療するための医薬の調製における３４に記載の組成物の使用。
９６． 細胞増殖性疾患の治療又は予防のための医薬の調製における３５に記載の組成物の使用。
９７． 癌の治療的処置のための医薬の調製における３６に記載の製造品の使用。
９８． 腫瘍を治療するための医薬の調製における３６に記載の製造品の使用。
９９． 細胞増殖性疾患の治療又は予防のための医薬の調製における３６に請求される製造品の使用。
１００． 細胞におけるＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達を阻害する方法において、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ産生細胞又はＨｅｄｇｅｈｏｇ応答組織に、配列番号：１７−４４の何れか一のアミノ酸配列を含む少なくとも８から１５のアミノ酸長のオリゴペプチドを投与することを含む方法。
１０１． オリゴペプチドが配列番号：３９−４４の何れかのアミノ酸配列を含む、１００に記載の方法。
１０２． 前記アミノ酸配列が、配列番号：６０の同じ位置のアミノ酸に関して位置Ｘのアミノ酸の保存的置換を含む、１００に記載の方法。
１０３． 前記オリゴペプチドが８から１２のアミノ酸長である、１００に記載の方法。
１０４． 前記オリゴペプチドが８から１０のアミノ酸長である、１００に記載の方法。
１０５． 配列番号：１７−４４の何れか一のアミノ酸配列を含み、少なくとも８から１５のアミノ酸長のオリゴペプチド。
１０６． 前記オリゴペプチドが８から１２のアミノ酸長である、１０５に記載のオリゴペプチド。
１０７． 前記オリゴペプチドが８から１０のアミノ酸長である、１０５に記載のオリゴペプチド。
１０８． オリゴペプチドが配列番号：３９−４４の何れか一のアミノ酸配列を含む、１０５に記載のオリゴペプチド。
１０９． 前記アミノ酸配列が、配列番号：６０の同じ位置のアミノ酸に関して位置Ｘのアミノ酸の保存的置換を含む、１０８に記載のオリゴペプチド。
１１０． 配列番号：１７−４４の何れか一のアミノ酸配列を含み少なくとも８から１５のアミノ酸長のオリゴペプチドと薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物。
１１１． 前記オリゴペプチドが８から１２のアミノ酸長である、１１０に記載の薬学的組成物。
１１２． 前記オリゴペプチドが８から１０のアミノ酸長である、１１０に記載の薬学的組成物。
１１３． オリゴペプチドが配列番号：３９−４４の何れか一のアミノ酸配列を含む、１１０に記載の薬学的組成物。
１１４． 前記アミノ酸配列が、配列番号：６０の同じ位置のアミノ酸に関して位置Ｘのアミノ酸の保存的置換を含む、１１３に記載の薬学的組成物。
１１５． 前記オリゴペプチドが線形である、１００に記載の方法。
１１６． 前記オリゴペプチドが環状である、１００に記載の方法。
１１７． 前記オリゴペプチドが線形である、１０５に記載のオリゴペプチド。
１１８． 前記オリゴペプチドが環状である、１０５に記載のオリゴペプチド。
１１９． 前記オリゴペプチドが線形である、１１０に記載の薬学的組成物。
１２０． 前記オリゴペプチドが環状である、１１０に記載の薬学的組成物。
１２１． ＨｈｉｐのＬ２ループを含んでなるエピトープに特異的に結合する抗体。
１２２． ＰｔｃｈのＬ２ループを含んでなるエピトープに特異的に結合する抗体。
１２３． Ｈｈの偽活性部位を含んでなるエピトープに特異的に結合する抗体。
１２４． 前記抗体が５Ｅ１以外である、１２３に記載の抗体。
Ｈｈｉｐ１β１２のヒトｃＤＮＡ(配列番号：１)および予測されるアミノ酸配列(配列番号：２)のアラインメントを示す。また、１Ｂは、Ｌ２ループ(影付き)を↑および＊を付した重要なアミノ酸残基と共に示す。 Ｈｉｐの領域の推定の位置を示す：２Ａは、リーダー(配列番号：３)；推定のＦｚドメイン(配列番号：４)；リンカー(配列番号：５)；β-プロペラ(配列番号：６)；Ｌ２ループ(配列番号：７)；ＥＧＦ１ドメイン(配列番号：８)；ＥＧＦ２ドメイン(配列番号：９)；及び推定のＧＰＩシグナル配列(配列番号：１０)の推定位置を示すＨｈｉｐ１β１２のアミノ酸配列を示す。２Ｂは、ヒトＨｈｉｐ１β１２(配列番号：７)、ヒトＰｔｃｈ(配列番号：１７)、マウスＰｔｃｈ(配列番号：１８)、ヒヨコＰｔｃｈ(配列番号：１９)、ゼブラフィッシュＰｔｃｈ(配列番号：２０)、ショウジョウバエＰｔｃｈ(配列番号：２１)、虫Ｐｔｃｈ(配列番号：２２)、ヒトＰｔｃｈ２(配列番号：２３)およびマウスＰｔｃｈ２(配列番号：２４)のＬ２ループ領域のアラインメントを示す。 Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路阻害のために必要なＨｈｉｐ１ＥＣＤの最小領域の特徴づけを示す。パネルＡ：バイオインフォマティック分析から予測されるＨｈｉｐ１ドメイン構築物。研究に用いるコンストラクトのドメイン境界線を定める残基を示す。原形質膜(ＰＭ)内の線はＧＰＩアンカーの脂質尾部を表す。Ｈｈｉｐ１ＥＣＤ(配列番号：１１)、Ｈｈｉｐ１β１２(配列番号：１２)、Ｈｉｐβ１(配列番号：１３)、Ｈｉｐβ(配列番号：１４)およびＨｈｉｐ１Ｆｚ(配列番号：１６)を含むコンストラクトは、それぞれ配列番号：２の残基２０−６６７、１９３−６６７、残基１９３−６３７および１９３−６０７および２０−１９３を含む。パネルＢ：Ｇｌｉ-ルシフェラーゼ共培養シグナル伝達アッセイにおけるＨｈｉｐ１ＥＣＤの異なるドメインによるＳｈｈシグナル伝達の阻害。このアッセイにおいて、Ｓｈｈを生産するＨＴ−２９細胞は、安定して発現するＧｌｉ-ルシフェラーゼＳ１２線維芽細胞上に重ね、その後Ｈｈｉｐ１ドメインと共にインキュベートし、実験手順に記載のように、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、３回の独立した三つ組の平均±標準偏差としてプロットする。パネルＣ：Ｈｈｉｐ１β１２構築物全体を模写する。Ｈｈｉｐ１ＥＣＤは、６ブレードβ-プロペラと２つのＥＧＦドメインを含む。Ｎ末端およびＣ末端を示す。パネルＤ：三方晶系および斜方晶系を含むＳｈｈ結合結晶構造とフリーからのＨｈｉｐ１β１２の５つのモデルのスーパーインポーズ。矢印は、２つのＥＧＦドメイン間の可動部を示す。パネルＥ：Ｃ４０２とＣ６２４間のドメイン間ジスルフィド結合を強調しているβ-プロペラとＥＧＦ１(挿入図)の相互作用のクローズアップの図。 Ｈｈｉｐ−Ｓｈｈ複合体の構造および機能を示す。パネルＡ：Ｈｈｉｐ１β１２とＳｈｈ(挿入図)の複合体の模写図。Ｓｈｈと接触しているＨｈｉｐ１β１２の３つのループは、Ｌ１−Ｌ３と記す。Ｚｎ２＋およびＣａ２＋陽イオンを矢印で示す(唯一のＣａ２＋陽イオンを示す)。９０°に回転させた図も示す。ＳｈｈのＮ-およびＣ-末端、並びにＨｈｉｐのＣ末端がすべて複合体の同じ側にあることから、両構成成分が同じ細胞膜に固定されうることが示唆される。パネルＢは、Ｈｈｉｐ１β１２の３つのループと接触しているＳｈｈの表面描写を示す。パネルＣ：Ｓｈｈと接触しているＨｈｉｐループのアラニン変異体。３つのＨｈｉｐループ内のアラニンに変異した残基を円で囲って示し、Ｓｈｈ結合を壊すものをアスタリスク(＊)で示し、有意な影響を持っていたものをプラス記号(＋)で示し、僅かな結果を有するものを格子記号(＃)で示す。パネルＤ：ＳｈｈおよびＨｈｉｐβ１２の残基によるＺｎ２＋陽イオンの配位。Ｚｎ２＋(灰色の円)は、Ｓｈｈからの残基Ｈ１４０、Ｄ１４７およびＨ１８２、及びＨｈｉｐβ１２からのＤ３８３によって配置される。パネルＥ：Ｓｈｈ Ｚｎ２＋含有グローブおよびＣａ２＋結合部位は異なっている。表面を透明で示す、Ｈｈｉｐ Ｌ２ループについて示すＳｈｈおよびＨｈｉｐ(正方形の挿入図)。Ｚｎ２＋およびＣａ２＋陽イオンを矢印で示す。Ｉｈｈ内の短指症タイプＡ１と一般的に関連しているＳｈｈ残基を棒で示し、炭素原子をヒトＳｈｈ配列に従って番号付けする。パネルＦ：Ｈｈｉｐβ１２変異体によるＧｌｉ-ルシフェラーゼ共培養アッセイにおけるＳｈｈシグナル伝達の阻害。図３Ｂにおいてアッセイを行った。結果は、１００％(インヒビターなし)に基準化した３つの３通り結果の平均±標準偏差としてプロットする。 Ｐｔｃｈ内の「Ｌ２ループ」の存在を示す。パネルＡ：Ｈｈ上のＩｈｏｇ結合部位を有するＳｈｈ上のＨｈｉｐ１およびＰｔｃｈ結合部位。濃い灰色で示したＨｈｉｐ１(左)およびＩｈｏｇ(中心)の４．５Å内の残基を有するＳｈｈ及びＨｈの表面描写。右パネルはＳｈｈの表面を表し、Ｐｔｃｈ活性に作用した変異残基の群を濃い灰色で、作用しなかった残基を淡い灰色で示す。番号はマウスＳｈｈを指す(Fuse et al., 1999；Pepinsky et al., 2000)。Ｐｔｃｈ結合およびシグナル伝達にごくわずかな影響を及ぼしたＳｈｈ残基の突然変異は、有色の黄色である。パネルＢは、Ｈｈｉｐ１Ｌ２ループに対応する領域内のＨｈｉｐ１及びＰｔｃｈの配列アラインメントを示す。Ｌ２ループ内の残基の保存を下に示す。プロット線は、１５の脊椎動物のＨｈｉｐ１タイプ１配列(図１１)及び列挙したＰｔｃｈ配列のアラインメントから作成した。便宜的に、ヒトＨｈｉｐ１のみを示す。Ｈｈｉｐ１のＤ３８３を適宜位置０とした。特定の重要な残基をアスタリスクで示す。プロット線は、weblogo.berkeley.eduのＵＲＬアドレスを有するＷｅｂＬｏｇｏを使用して刻んだ。パネルＣは、ＳｈｈへのＨｉｐβ１結合についてのＨｈｉｐ１-Ｌ２ペプチドの競合ＥＬＩＳＡを示す。データは、ＩＣ５０が得られた４-パラメータ方程式にフィットさせた。パネルＤは、Ｓｈｈ単独(灰色)及び過剰な非標識Ｈｉｐ-Ｌ２ペプチド存在下でのＳｈｈ(黒色)の１５Ｎ、１Ｈ-ＨＳＱＣスペクトルを示す。パネルＥは、Ｐｔｃｈ-Ｌ２ペプチドを用いたこと以外はパネルＤと同じであることを示す。 経路調節に至るＳｈｈ−レセプター複合体のモデルを示す。Ｈｈ経路が活性である場合、膜結合型Ｓｈｈは、Ｓｍｏの阻害を低減するＣｄｏｎおよびＰｔｃｈと多複合体を形成する。これにより、Ｇｌｉの活性型が核へ転移され、Ｈｈ標的遺伝子の転写が開始される。ＳｈｈへのＰｔｃｈ結合はおそらく、Ｐｔｃｈ Ｌ２-等価物ループとＳｈｈ Ｚｎ２＋含有グローブとの相互作用を引き起こすであろう。 Ｈｈシグナル伝達がＨｈｉｐ１によって阻害される場合であることを除き、図６と同じ経路を示す。このＨｈｉｐ１はＳｈｈ上のＺｎ２＋含有グローブを占めることによってＰｔｃｈの構造的デコイレセプターとして作用する。Ｈｈｉｐ１、ＣｄｏｎおよびＳｈｈは、Ｐｔｃｈを残して安定な三元複合体を形成し、Ｓｍｏを抑制して、シグナル伝達を阻害する。その結果、Ｇｌｉはプロテアソームによって転写リプレッサにプロセシングされ、結果としてＨｈ標的遺伝子転写が阻害される。ＦＮおよびＩｇはそれぞれ、Ｃｄｏｎのフィブロネクチンタイプ-III(ＦＮIII)およびＩｇ様ドメインを表す。 Ｄｈｈ、ＩｈｈおよびＳｈｈとのＨｈｉｐ１β１２競合結合ＥＬＩＳＡを示す。パネルＡ：ＥＬＩＳＡフォーマットにおける固定化Ｈｉｐβ１２に対するビオチニル化ＳｈｈＮ−Ｃｙｓと非標識Ｄｈｈ、ＩｈｈおよびＳｈｈとの間の競合結合を示す。データ及び曲線フィット中、Ｄｈｈ(○)、Ｉｈｈ(■)及びＳｈｈ(◇)についてそれぞれ40nM、53nM及び87nMのＩＣ５０値を示す。描かれた線は４-パラメータ方程式へフィットしたデータを表す、そこからＩＣ５０を得た。パネルＢ：Ｓｈｈ、ＤｈｈおよびＩｈｈの配列アライメント。Ｈｈｉｐ１と接触する残基をアスタリスクにて示す。Ｃａ２＋(▲)及びＺｎ２＋(■)陽イオンを統合する残基、並びにＩｈｈ(◆)短指症タイプＡ１に関連した残基も示す。５Ｅ１エピトープはヒトＳｈｈ１,２のＳｅｒ１７７(●)に位置し、トリプシン消化から５Ｅ１によって保護されたＳｈｈペプチドを下線で示す。破線の伸展は、Ｉｈｈ又はＳｈｈと比較してＤｈｈに対して５Ｅ１の親和性が低いことに基づいた推定の伸展エピトープを示す。 β-プロペラとＥＧＦ１との間の会合の性質を示す。パネルＡ：線およびリボンのβ-プロペラ(静電気性質を有する表面として、陽性を淡い灰色で、陰性を濃い灰色で示す)とＥＧＦ１(描写)との会合。パネルＢ：９０°回転させたパネルＡの図を示す。 バイオ層インターフェロメトリーによって測定したＥＤＴＡの有無の下でのビオチン化ＳｈｈＮ−Ｃｙｓに対するＨｉｐβ１の結合を示す。パネルＡ：１０ｍＭ ＥＤＴＡの有無の下での４つの異なる濃度のＨｉｐβ１(１．２、１．０、０．８及び０．６μＭ)のセンサーグラム結合曲線。パネルＢ：Ｓｈｈ単独、及び、１０ｍＭのＥＤＴＡ存在下でのＳｈｈの１５Ｎ,１Ｈ-ＨＳＱＣスペクトル。パネルＣ：Ｈｉｐ−Ｓｈｈ複合体の構造のヒトＳｈｈ(淡い灰色)がショウジョウバエＨｈ(濃い灰色、ＰＤＢ受託番号２ＩＢＧ、残基４９−１９６)と重なることを示す。Ｚｎ２＋陽イオンはＳｈｈのみに存在し、灰色の球として示される。明確にするため、Ｃａ２＋陽イオンはＳｈｈ構造から省略する。重なりのｒｍｓｄは０．６Åである。パネルＤ：ＳｈｈのＺｎ２＋配位を強調しているヒトＳｈｈおよびショウジョウバエＨｈ構造の拡大図を示す。Ｓｈｈ Ｚｎ２＋を配する残基位置と等しいショウジョウバエＨｈの残基を示す。色の区別はパネルＣと同じである。 Ｈｈｉｐ１タイプ１の１５の脊椎動物種を示すＬ２ループに対応するＨｈｉｐ１配列のアライメントを示す。強調部分はたった２つの同一でない位置にある残基である。図５Ｂに示すように保存プロットをアライメントの下に示す。残基の保存はＣｏｎＳｕｒｆ(consurf.tau.ac.il)にて生成した。 Ｈｈｉｐ−Ｓｈｈ複合体の保存された表面部分を示す。パネルＡは、Ｈｈｉｐ１(図１１の１５の配列)およびＳｈｈ(Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの２５の配列)について決定された表面残基配列の保存を示し、濃い灰色(同一残基)から淡い灰色(保存性の低い残基)まで色の勾配で示す。破線の卵形の範囲内の領域は非常に保存されたパッチを指す。パネルＢは、保存された表面パッチが高い酸性領域を含むことを示す。表面静電電位は、淡い灰色の正電荷と濃い灰色の陰電荷にて表される。破線の卵形の範囲内の領域は、パネルＡに示される非常に保存されたパッチを指す。残基の保存はＣｏｎＳｕｒｆ (consurf.tau.ac.il)にて生成した。 タイプＡ１短指症変異体Ｉｈｈ Ｔ１５４ＩがＰｔｃｈ１への結合およびＨｈシグナル伝達の活性化を損なうことを示す。パネルＡは、Ｉｈｈ Ｔ１５４ＩがＰｔｃｈ１へのＳｈｈ結合の野生型より競合が低いことを示す。示したタンパク質とプレインキュベートしたＳｈｈ６４９(１ｎＭ)をＰｔｃｈ１発現細胞に結合させ、洗浄し、ＦＡＣＳにて分析した。２つの独立した希釈物質の平均Ｓｈｈ６４９蛍光強度(ＭＦＩ)をインヒビター濃度に対してプロットし、誤差バーは標準偏差を示す。Ｉｈｈ及びオクチル-Ｉｈｈは同様に阻害するのに対して(それぞれ１．１ｎＭ及び０．６４ｎＭのＩＣ５０値)、Ｔ１５４Ｉ及びオクチル-Ｔ１５４Ｉによる阻害は損なわれる(それぞれ１４０ｎＭ及び１０ｎＭのＩＣ５０値)。パネルＢは、Ｓ１２ ＧｌｉルシフェラーゼアッセイにおけるＨｈシグナル伝達の活性化を示す。アッセイは、オクチル化Ｉｈｈ野生型及びＴ１５４Ｉタンパク質を用いて行った。濃度依存性相対的ルシフェラーゼ単位(ＲＬＵ)は４つの独立した希釈物の平均±標準偏差としてプロットし、１００％とした各プレート上の最大Ｉｈｈ ＷＴ刺激に対して基準化した。曲線は４-パラメータ方程式に対してフィットしたデータを表し、これによりＩｈｈ及びＩｈｈ Ｔ１５４Ｉについてそれぞれ１６ｎＭ及び３３０ｎＭのＥＣ５０値を得た。データは３回の独立した実験の代表である。 モノクローナル抗体５Ｅ１がＳｈｈ結合についてＨｈｉｐ１β１２と競合することを示す。パネルＡは、Ｓｈｈ上の５Ｅ１エピトープがＨｈｉｐおよびＰｔｃｈ１結合部位と重なることを示す。Ｓｈｈの表面描写は、Ｈｈｉｐの４．５Å内の残基(淡い灰色)と突然変異がＰｔｃｈ１活性を変える残基(濃い灰色)を示す。５Ｅ１結合に対して重要な残基、アスタリスク(＊)を付して示したＳ１７７は、ＨｈｉｐおよびＰｔｃｈ１と相互作用するＳｈｈの領域内に存在する。番号付けはヒトＳｈｈを指す(Fuse, N. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10992-10999；Pepinsky R.B. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:10995-11001)。パネルＢは、ＥＬＩＳＡによる固定化Ｈｈｉｐ１β１２に対するビオチン化ＳｈｈＮ−Ｃｙｓと５Ｅ１との間の競合結合を示す。曲線は４-パラメータ方程式にフィットしたデータを表し、これから２３ｎＭのＩＣ５０を得た。パネルＣは、高濃度のＨｈｉｐ１β１２(ここでは５２０ｎＭ)及びＨｈｉｐ１β１２−Ｆｃ(データは示さず)が、Ｐｔｃｈ１に依存しない様式でＳｈｈ６４９(１５ｎＭ)を増やすにつれて、２９３細胞に非特異的に結合することを示す。ゆえに、Ｈｈｉｐ１β１２はＳｈｈ６４９と比較して３５倍存在していた。この漸加は(コントロールｍＩｇＧ１ではなく)５２０ｎＭの５Ｅ１によって完了することから、５Ｅ１はＳｈｈ６４９結合についてＨｈｉｐ１β１２と競合することが示される。黒のバーは比較のためにＰｔｃｈ１細胞への結合を示す。データは、図１５Ｊと同じ方法の、他のタンパク質の無い条件化でのＰｔｃｈ１細胞に結合するＳｈｈ６４９(「Ｃｔｒｌ」)に基準化した、２つの独立した(２通り及び３通り)実験の平均蛍光強度及びＳＤである。Ｈｈｉｐ１β１２に対するＰｔｃｈ１に依存しないＳｈｈ６４９の結合を検出するために、Ｓｈｈ６４９及びＨｈｉｐ１β１２は、図１５Ｊのそれぞれ４５倍及び１０倍の濃度で存在する。 Ｈｈｉｐ及びＰｔｃｈ１はＳｈｈ偽活性部位グルーブに競合して結合することを示す。パネルＡは、図４Ａに示すようにＨｈｉｐ−Ｓｈｈ複合体の描写を示す。パネルＢは、Ｃｄｏｎの第３ＦＮIIIドメインとＳｈｈ(ＰＤＢ受託番号３Ｄ１Ｍ)との間の複合体の描写を示す。Ｓｈｈは、パネルＡにおいてＨｈｉｐ−Ｓｈｈ複合体と同じ方向である。Ｚｎ２＋及びＣａ２＋陽イオンを示す。パネルＣは、Ｓｈｈ上のＨｈｉｐとＣｄｏｎの重なり合う結合部位を示す。Ｈｈｉｐ(影付きの灰色)およびＣｄｏｎ(格子を付けた領域)の４．５Å内の残基を有するＳｈｈの表面描写。ドットで囲った領域は、Ｃｄｏｎフットプリントの境界を示し、これはＨｈｉｐ結合表面に重なる。パネルＤは、Ｓｈｈ偽活性部位の５つのヒスチジン残基がＨｈｉｐ Ｌ２ループに近位であることを示す。Ｓｈｈヒスチジン残基を濃い色の窒素原子を付して示す。Ｈｈｉｐ Ｌ２ループは透明表面で示し、Ｚｎ２＋陽イオンを示す。Ｓｈｈ構造の配列した部分がＬ４０で始まるので、ヒスチジン３５は示されない。パネルＥは、Ｓｈｈ単独(灰色)単独、及び、１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下でのＳｈｈ(黒色)の、１３Ｃ,１Ｈ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。ヒスチジン側鎖のスペクトル領域を示す。パネルＦは、ＥＤＴＡの代わりに２ｍＭ Ｈｈｉｐ Ｌ２ペプチドの存在下であることを除き、パネルＥと同じであることを示す。パネルＧは、ＥＤＴＡの代わりに２ｍＭ Ｐｔｃｈ１ Ｌ２様ペプチドの存在下であることを除き、パネルＥと同じであることを示す。パネルＨがＨｈｉｐＬ２ペプチドがＳｈｈのＰｔｃｈ１Ｌ２様ペプチドにとって代わることを示すことから、これらがＳｈｈに競合することが示される(２ｍＭ ＨｈｉｐＬ２ペプチドを、Ｓｈｈ及び２ｍＭ Ｐｔｃｈ１Ｌ２様ペプチド(黒色)を含む試料に添加したところ、ＳｈｈのＰｔｃｈ１Ｌ２様ペプチドの置き換えが生じた。これは他のスペクトルの出現により示される)(パネルＧを、新しいスポットの存在を示すパネルＨと比較する)。これは、Ｓｈｈに結合するＨｈｉｐＬ２ペプチドの存在を示す。パネルＩは、Ｈｈｉｐ及びＰｔｃｈ１がＳｈｈ結合について競合することを示す。１ｎＭのＳｈｈ６４９を様々なタンパク質とプレインキュベートした後、Ｐｔｃｈ１発現細胞をインキュベートし、洗浄し、ＦＡＣＳにて分析した。２つの独立した希釈物の平均Ｓｈｈ６４９蛍光強度(ＭＦＩ)をタンパク質濃度に対してプロットし、誤差バーは標準偏差を示す。ＣｔｒｌはＨｉｓ６タグ付加ＨＧＦβタンパク質を指す。パネルＪは、Ｐｔｃｈ１に結合するＳｈｈに対してＨｈｉｐ競合物が特異的であることを示す。Ｓｈｈ６４９(０．３３ｎＭ)を５６ｎＭ(１７０倍)のＨｈｉｐβ１２野生型又はＬ２変異タンパク質、５Ｅ１又はコントロールと共にプレインキュベートし、次いでＰｔｃｈ１細胞(黒色)又は２９３細胞(灰色)に結合させ、洗浄し、ＦＡＣＳにて分析した。インヒビターの無い条件下でＰｔｃｈ１細胞に結合するＳｈｈ６４９を１００％に基準化し、データをこのシグナルの割合として表した(２つの独立した結果の平均を標準偏差と共に示す)。ＣｔｒｌおよびＣｔｒｌＦｃはそれぞれ、ＨＧＦβおよびＩｇＧ１アイソタイプコントロールトラスツズマブを指す。データは少なくとも３つの独立した実験の代表である。
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
「Ｈｈｉｐ１」、「Ｈｈｉｐ」及び「Ｈｉｐ」なる用語は明細書中で交換可能に用いられてよい。
「Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド」及び「Ｈｈｉｐ１β１２誘導体」又はＨｉｐβ１２なる用語は、Ｈｈｉｐ１の推定Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメインを欠いている完全長Ｈｈｉｐ１β１２(配列番号：８３)由来の様々なポリペプチドを指す。この用語には、配列番号：と、例えばＨｈｉｐ１β１２ＥＣＤ(配列番号：１２)、Ｈｉｐβ１(配列番号：１３)及びＨｉｐβ(配列番号：１４)などの記号によってここで定義される特定の同定された断片が包含される。さらに、特定のアミノ酸と共に表される場合(例えばＨｈｉｐ１ １４−６７)、完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチド(配列番号：２)を参照して特別に指定されるアミノ酸を指す。ここに記載されるＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成法によって調製してもよい。「Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド」なる用語は、本明細書中に開示される各個々のＨｈｉｐ１β１２／数字ポリペプチドを指す。「Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド誘導体」を指す本明細書のすべての開示は、各ポリペプチドを個々に指すと同時に集合的に指す。例えば、調製、精製、誘導、抗体の形成、Ｈｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチドの形成、Ｈｈｉｐ１β１２結合有機分子の形成、投与、含有する組成物、疾患の治療等の記載は、本発明の各ポリペプチドに関している。「Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド変異体」なる用語は、本明細書中に開示されるＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドと誘導体の変異体を包含する。完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチドの配列は配列番号：２に示す。完全長Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドの配列は配列番号：８３に示す。
「天然配列Ｈｈｉｐ１ポリペプチド」には、天然由来の対応するＨｈｉｐ１ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。このような天然配列Ｈｈｉｐ１ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生成することもできる。「天然配列Ｈｈｉｐ１ポリペプチド」という用語には、特に、特定のＨｈｉｐ１ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。
Ｈｈｉｐ１ポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、Ｈｈｉｐ１ポリペプチドがＧＰＩ-リンケージによって繋留された場合に除去される推定ＧＰＩシグナル配列を基本的に有していないＨｈｉｐ１ポリペプチドの形態(ここでは「Ｈｈｉｐ１ＥＣＤ」と略す)を指す。通常、本発明のＨｈｉｐ１ポリペプチドについて同定された推定ＧＰＩシグナル配列は、ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。ＧＰＩシグナル配列の厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインの何れかの末端から約５アミノ酸を超えない可能性が高い。ある例では、Ｈｈｉｐ１ＥＣＤは配列番号：１１のアミノ酸配列を有する。したがって、場合によって、Ｈｈｉｐ１ポリペプチドの細胞外ドメインは、実施例又は明細書で同定されるように推定ＧＰＩシグナル配列ドメイン／細胞外ドメインの境界の何れかの側から約５を超えないアミノ酸を含んでもよく、関連のシグナルペプチドを伴う又は伴わない、それらのポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。同様に、Ｈｈｉｐ１β１２ＥＣＤは、推定ＧＰＩシグナル配列を基本的に含まないＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド(ここで「Ｈｈｉｐ１β１２ＥＣＤ」と略す)を指す。
ここに開示する種々のＨｈｉｐ１ポリペプチドの同義的に用いられる「シグナルペプチド」、「シグナル配列」又は「リーダー配列」のおおよその位置は、本明細書及び／又は添付図に示されうる。しかし、シグナルペプチドのＣ末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ末端境界の何れかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうることに留意される（例えば、Nielsen等, Prot. Eng.10: 1-6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。更に、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全に均一ではなく、一つ以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに同定されるシグナルペプチドのＣ末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断される場合のこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
「Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド変異体」とはＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド、好ましくは、ここに開示するような完全長天然配列Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド配列、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド配列の任意の他の断片（例えば、完全長Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドの完全なコード配列の一部のみを示す核酸によってコードされるもの）と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するここで定義するような活性なＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドを意味する。このようなＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド変異体には、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドが含まれる。通常、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド変異体は、ここに開示する完全長天然配列Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド配列、ここに開示するＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチド配列の任意の具体的に定義した他の断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常、Ｈｈｉｐ１β１２変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸長、又はそれ以上である。場合によっては、Ｈｈｉｐ１β１２変異体ポリペプチドは、天然Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド配列に比較して一つ以下の保存的アミノ酸置換、あるいは天然Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド配列に比較して２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以下の同類アミノ酸置換を有するにすぎない。
ここで同定したＨｈｉｐ１ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のＨｈｉｐ１ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、米国特許第７３６１７３２号に示したソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。そのソースコードは出典明記によって本明細書中に援用される。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、米国特許第７３６１７３２号に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「Ｈｈｉｐ１β１２」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「Ｈｈｉｐ１β１２」は対象の仮想Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は対象の「Ｈｈｉｐ１β１２」ポリペプチドと比較され、これに対するポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は、それぞれ異なる仮定アミノ酸残基を表す。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて直ぐ上の段落に記載されるようにして得られる。
「Ｈｈｉｐ１β１２変異体ポリヌクレオチド」又は「Ｈｈｉｐ１β１２変異体核酸配列」とは、ここで定義されるように、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド、好ましくは活性なＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードし、ここに開示する完全長Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド配列、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチド配列の他の任意の断片（完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチドの完全なコード化配列の一部分のみを表す核酸によってコードされたもの）をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、Ｈｈｉｐ１β１２変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示する完全長Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド配列、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有している。このような変異体はＨｈｉｐ１β１２変異体を包含する。変異体は天然ヌクレオチド配列を包含しない。
通常、Ｈｈｉｐ１β１２変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、表示ヌクレオチド配列長にその表示長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
ここで同定されるＨｈｉｐ１β１２コード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、対象のＨｈｉｐ１β１２核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが先に示されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、「Ｈｈｉｐ１β１２-ＤＮＡ」が対象となる仮説的Ｈｉｐコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象となる「Ｈｈｉｐ１β１２-ＤＮＡ」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々が異なった仮想ヌクレオチドを表していて、表３及び４が「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「Ｈｈｉｐ１β１２-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
他の実施態様では、Ｈｈｉｐ１β１２変異体ポリヌクレオチドとは、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに記載の完全長Ｈｈｉｐ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションすることができる。Ｈｈｉｐ１β１２変異体ポリペプチドは、Ｈｈｉｐ１β１２変異体ポリヌクレオチドによってコードされているものであり得る。
Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードする核酸に関して使用される場合の「完全長コード領域」という用語は、（添付図において開始及び停止コドンの間でしばしば示される）本発明の完全長Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。
ここに開示される種々のポリペプチドを記載するために使用される「単離」とは、自然環境の成分から同定され及び分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。単離されたポリペプチドには、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一つの精製工程により調製される。
「単離された」Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードする核酸又は他のポリペプチドコード化核酸は、同定され、ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然の細胞中に存在する特異的なポリペプチドをコードする核酸分子とは区別される。しかし、ポリペプチドをコードする単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常は発現する細胞に含まれるポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列と、リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）を参照のこと。
ここで定義される「ストリンジェント条件」又は「高度のストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；又は（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストランを用いた溶液中で終夜ハイブリダイゼーション、４２℃で、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中にて１０分間の洗浄、ついで５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる１０分間の高ストリンジェンシー洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記のストリンジェントより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃での終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中にて約３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」と融合したＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド又は抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有し、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜２０の残基)を有する。
ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるＨｈｉｐ１の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの形態を意味し、その中で、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生Ｈｈｉｐ１が保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘発する能力以外の、天然又は天然発生Ｈｈｉｐ１の生物機能を意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生Ｈｉｐが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘発する能力を意味する。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、そしてここに開示した天然Ｈｈｉｐ１ポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和する任意の分子が含まれる。同じように、「アゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然Ｈｈｉｐ１ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子が含まれる。適切なアゴニスト又はアンタゴニスト分子には、特にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、断片、又は天然Ｈｈｉｐ１ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子等が含まれる。Ｈｈｉｐ１ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法は、Ｈｈｉｐ１ポリペプチドと候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子を接触させ、そして通常はＨｈｉｐ１ポリペプチドに関連している一又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することが含まれ得る。
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、標的である病的症状又は疾患を防ぐか又は衰え（小さく）させることである。治療を必要とするものには、疾患に罹りやすいものと同時に疾患に既に罹っているもの、又は疾患が予防されるべきものを含む。Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２イムノアドヘシンの治療量を投与された後に、患者が次の一又は複数のものについて観察可能な及び／又は測定可能な減少又は消失を示したならば、被検体又は哺乳動物は、癌に関して成功裏に「治療された」ことになる：癌細胞の数の減少、又は癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；軟部組織及び骨への癌の広がりを含む、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達の阻害及び／又は特定の癌に関連している一又は複数の症状のある程度の軽減；疾病率及び死亡率の減少、及び生活の質の改善。ある程度、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２オリゴペプチドは、生存癌細胞の成長を防ぐ及び／又は死滅させることができ、それは、細胞増殖抑制及び／又は細胞障害性であり得る。これらの兆候又は症状の低減は、また、患者が感じることができる。
疾患における成功裏の治療及び改善を評価することに関する上記のパラメーターは、医師にとってよく知られている日常的手法によって容易に測定が可能である。癌治療では、有効性は、例えば、病気の進行までの時間（ＴＴＰ）の算定及び／又は反応速度（ＲＲ）を確かめることによって測定できる。転移は、ステージング試験によって、骨のスキャン及び骨への広がりを確かめるためのカルシウムレベル及び他の酵素に関する試験によって確かめることができる。ＣＴスキャンは、また、領域の骨盤及びリンパ節への広がりを探索することで行うことができる。胸のＸ線、及び既知の方法による肝臓の酵素レベルの測定を、それぞれ肺及び肝臓への転移を探索するために用いる。疾患をモニタリングする他の常套的方法には、経直腸的超音波断層法（ＴＲＵＳ）及び経直腸的針生検（ＴＲＮＢ）が含まれる。
より局所化した癌である膀胱癌に対しては、疾患の進行を確かめる方法には、膀胱鏡検査による尿細胞評価、尿中に存在する血液のモニタリング、超音波断層撮影又は静脈性腎盂像、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）及び磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）による尿路上皮性路の可視化が含まれる。遠隔転移の存在は、腹部のＣＴ、胸部Ｘ線、又は骨格の放射性核種画像診断によって評価することができる。
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
癌の治療、症状の緩和又は診断のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(登録商標)を含む。
「固相」又は「固体支持体」とは、本発明の抗体、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２Ｌ２-模倣有機分子が接着又は付着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、径の調整されたガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティークロマトグラフィーカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記載されたような別々の粒子の不連続な固相も含む。
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えばＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド、それらに対する抗体又はＨｈｉｐ１β１２オリゴペプチド）輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は細胞膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。
ここで定義されている「小」分子又は「小」有機分子とは、約５００ダルトン未満の分子量である。
ここに開示するポリペプチド、抗体、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド、Ｈｉｐ模倣有機分子、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの「有効量」とは、特に述べた目的を実施するために十分な量のことである。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的及び常套的な形で決定することができる。
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体、ポリペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２-模倣有機分子又は他の薬剤の量を指す。癌の場合、治療的に有効量の薬は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍成長をある程度まで阻害し；Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達を抑制し；及び／又は癌に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。「治療する」のここでの定義を参照せよ。薬が存在する癌細胞の成長を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、それは、細胞分裂停止及び／又は細胞障害性であり得る。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２Ｌ２-模倣有機分子の「増殖阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞増殖の阻害の目的のための抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１ポリペプチド、Ｈｈｉｐ１結合オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１結合有機分子の「増殖阻害量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２Ｌ２-模倣有機分子の「細胞障害性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のための抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２Ｌ２-模倣有機分子の「細胞障害性量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗Ｈｈｉｐ１β１２モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ(polyepitopic)特異性を持つ抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体組成物、ポリクローナル抗体、一本鎖抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、及び所望する生物学的又は免疫学的活性を示す限りは抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体の断片（下記を参照）を包含する。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、ここでの抗体と相互に置き換え可能に用いられる。
「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって定量して９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％以上の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え体細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
基本的な４-鎖抗体ユニットは２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパクである(ＩｇＭ抗体は、基本的なヘテロ四量体ユニットとそれに付随するＪ鎖と称される付加的なポリペプチドの５つからなり、よって１０の抗原結合部位を有するが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、基本的４-鎖ユニットとそれ付随するＪ鎖のうち２-５つを含む多価集合を形成可能である)。ＩｇＧの場合、４-鎖ユニットは一般的に約１５００００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合するが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれのＨ及びＬ鎖はまた規則的な間隔を持った鎖内ジスルフィド結合を持つ。それぞれのＨ鎖は、α及びγ鎖の各々に対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)が、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)をＮ末端に有する。それぞれのＬ鎖は、その他端に定常ドメイン(ＣＬ)が続く可変ドメイン(ＶＬ)をＮ末端に有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＬとＶＨは共同して対になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性は、例えばBasic and Clinical Immunology, ８版, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(編), Appleton ＆ Lange, Norwalk, CT, 1994, ７１頁及び６章を参照のこと。
任意の脊椎動物種からのＬ鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。また、その重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンには異なったクラス又はアイソタイプを割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。さらにγ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能等の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えば、ヒトにおいては次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が発現する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合性を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定める。しかし、可変性は可変ドメインの１１０-アミノ酸スパンを通して均等には分布されていない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と称される極度の可変性を有するより短い領域によって分離された１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる比較的不変の伸展からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各々は、大きなβ-シート配置をとり、３つの高頻度可変領域により接続された４つのＦＲ領域を含み、それはループ状の接続を形成し、β-シート構造の一部を形成することもある。各鎖の高頻度可変領域はＦＲにより他の鎖からの高頻度可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ED. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係ないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)における抗体の寄与を示す。
ここで使用される「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、ＶＬの、概ね残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）周辺と、ＶＨの概ね３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Kabatら、Sequences of Protein of Immunological Interest, 第５版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）、及び／又は「高頻度可変ループ」由来のそれらの残基（例えば、ＶＬの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５１（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）と、ＶＨの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）とを含む。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、最初にKohler and Milstein, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって、細菌、真核細胞動物又は植物細胞から作ることができる(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991) に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。ここで対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば旧世界ザル、類人猿等)から由来する可変ドメイン抗原-結合配列及びヒト定常領域配列を含む「プリマタイズ(primatized)」抗体を含む。
「インタクト」の抗体は、抗原-結合部位、並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、無傷の抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は全長Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)、及び一つの重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合性に関して一価である、すなわち単一の抗原-結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ(ａｂ')２断片が生じ、これは２価の抗原結合部位を持つ２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、抗原を交差結合させることができるものである。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、通常はＦａｂ'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
Ｆｃ断片はジスルフィドにより一緒に保持されている双方のＨ鎖のカルボキシ末端部位を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され、その領域は、所定の型の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)によって認識される部位である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原-認識及び-結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borrebaeck 1995, 以下を参照のこと。
「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、鎖間ではなく鎖内でＶドメインを対形成させ、結果として二価の断片、すなわち２つの抗原-結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨとＶＬドメインとの間に、短いリンカー(約５-１０残基)を持つｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築することにより調製される小型の抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディは２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロダイマーであり、そこでは２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
抗イディオタイプ抗体は対象の抗体の抗原結合領域に結合する抗体である。このような抗イディオタイプ抗体は対象の抗体によって結合されるエピトープを模倣する。例えば、Ｈｈｉｐ１のＬ２ループを特異的に結合するＨｈｉｐ１β１２抗体は、Ｌ２に結合するＨｅｄｇｅｈｏｇの一部を模倣しうる。ゆえに、この対象抗体に対して生じた(抗原結合部位に対して特異的である)抗イディオタイプ抗体は、Ｈｈｉｐ１のＬ２部位がＨｅｄｇｅｈｏｇを結合するのと同じ様式でＨｅｄｇｅｈｏｇを認識し、特異的に結合しうる。
非ヒト(例えば齧歯類)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
「種依存性抗体」、例えば哺乳動物抗-ヒトＩｇＥ抗体は、二番目の哺乳動物種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも、一番目の哺乳動物種からの抗原に対してより強力な結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原（すなわち、約１ｘ１０−７Ｍ以下、好ましくは約１ｘ１０−８以下、最も好ましくは約１ｘ１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）と「特異的に結合」するが、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い、二番目の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上にて定義した種々の型の抗体のいずれでもあることが可能だが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
「Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド」はＨｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドに好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。Ｈｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成方法論を用いて化学的に合成することができ、あるいは組み換え技術を用いて調製及び精製することができる。Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチドは通常、少なくとも約５のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載されるＨｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。いくつかのＨｈｉｐ１β１２オリゴペプチドは本明細書中に記載される。他のＨｈｉｐ１β１２オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
「Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチド」は、Ｐｔｃｈのアナログ部位及び／又は天然のＨｈと相互作用するＨｈｉｐ１の部位のＨｈｉｐ１ポリペプチド(すなわちＬ２ループ)に好ましくは特異的に結合するＨｈｉｐ１β１２オリゴペプチドの一形態である。Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成方法論を用いて化学的に合成することができ、あるいは組み換え技術を用いて調製及び精製することができる。Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチドは通常、少なくとも約５のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載されるＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。
「Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合有機分子」とは、ここに記載されるようなＰｔｃｈ及びＰｔｃｈ２ポリペプチドのアナログモチーフを含む、タンパク質内のＨｈｉｐ１β１２Ｌ２ループモチーフに、好ましくは特異的に結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合有機分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開００／００８２３及び００／３９５８５参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合有機分子は通常、約２０００ダルトン未満の大きさであり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさであり、ここに記載される様なＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチドに好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリーをスクリーニングする技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開００／００８２３及び００／３９５８５参照）。このような分子は、Ｈｈｉｐ１ Ｌ２及びＰｔｃｈ Ｌ２ドメインに構造が類似しているためにＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈに対してアゴニスト又はアンタゴニストの効果を有しうる。
「Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣オリゴペプチド」は、天然のＨｈｉｐ１と相互作用するＨｈの部位のＨｈポリペプチドに好ましくは特異的に結合するペプチドである。Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成方法論を用いて化学的に合成することができ、あるいは組み換え技術を用いて調製及び精製することができる。Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣オリゴペプチドは通常、少なくとも約５のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載されるＨｈポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。
「Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２模倣有機分子」とは、ここに記載されるようなＨｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドに好ましくは特異的に結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２模倣有機分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開００／００８２３及び００／３９５８５参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２模倣有機分子は通常、約２０００ダルトン未満の大きさであり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさであり、ここに記載されるＨｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドに好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリーをスクリーニングする技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開００／００８２３及び００／３９５８５参照）。
対象の抗原、例えば腫瘍関連ポリペプチド抗原標的と「結合する」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、その抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子がその抗原を発現している細胞又は組織を標的とする診断及び／又は治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意には交差反応しないように十分な親和性でその抗原と結合するものである。そのような実施態様では、抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子の「非標的」タンパク質との結合の程度は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析又は放射免疫沈降（ＲＩＡ）によって定量して、その特定の標的タンパク質との抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子の結合の約１０％よりも低い。標的分子への抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子の結合に関して、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープと「特異的に結合」又は「特異的に結合する」、又はそれに対して「特異的である」という用語は、非特異的な相互作用とは測定して異なる結合を意味する。特異的な結合は、例えば、一般に結合活性を持たない類似した構造の分子であるコントロール分子の結合性と比較して、分子の結合性を定量することによって測定することができる。例えば、特異的な結合性は、標的、例えば過剰の非標識標的に類似したコントロール分子とも競合にとって定量することができる。この場合、プローブに対する標識標的の結合が過剰の非標識標的によって競合的に阻害されるならば、特異的結合が表示される。ここで使用される特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープと「特異的に結合」又は「特異的に結合する」、又はそれに対して「特異的である」という用語は、例えば標的に対して少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、あるいはそれ以上のＫｄを持つ分子によって示されうる。一実施態様では、「特異的に結合する」という用語は、如何なる他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープへ実質的に結合することなく分子が特定のポリペプチド又は特定のポリペプチドのエピトープに結合する結合を意味する。
Ｈｈｉｐ１ Ｌ２とＰｔｃｈ Ｌ２ループの構造が類似しているため、Ｌ２ループを標的とする抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体の交差反応が可能である。ゆえに、ある実施態様では、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループを結合する抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体もＰｔｃｈ Ｌ２ループを特異的に結合しうる。同様に、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ又はＨｈｉｐ１β１２Ｌ２ループと相互作用するＨｅｄｇｅｈｏｇの部分を結合するように設定した小有機分子もＰｔｃｈ Ｌ２の構造的にアナログな部分に結合しうる。
ここで用いる「Ｐｔｃｈｅｄ」又は「Ｐｔｃｈ」は、本明細書中に記載の抗体、オリゴペプチド及び小有機分子並びにこれらを用いた様々な方法を指す場合には、Ｐｔｃｈ及びＰｔｃｈ２ポリペプチドの両方を包含する。
「腫瘍細胞の増殖を阻害する」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子、又は「増殖阻害」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ刺激に反応する癌細胞の測定可能な程の増殖阻害を引き起こすものである。好ましい増殖阻害抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、一般的には、試験された抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子で処理されていない腫瘍細胞であるコントロールである、適切なコントロールと比較して、２０％より多く、好ましくは約２０％から約５０％、そしてさらに好ましくは５０％よりも多く（例えば、約５０％から約１００％）でＨｅｄｇｅｈｏｇ応答腫瘍細胞の増殖を阻害する。一実施態様では、増殖阻害は、細胞培養で約０．１から３０μｇ／ｍｌ又は約０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、抗体への腫瘍細胞の曝露の後、増殖阻害を１−１０日で確かめる。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体の投与が、最初の抗体の投与から約５日から３か月内、好ましくは約５から３０日内に腫瘍の大きさ又は腫瘍細胞増殖に減少を引き起こす場合、抗体はインビボで増殖阻害性である。
通常、腫瘍細胞はＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達に反応するものである。好ましくは、腫瘍細胞は、例えば基礎細胞癌、前立腺、胸部、卵巣、胃、子宮内膜、肺、腎臓、大腸、膀胱の細胞である。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型レセプター」）が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ）を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ）を含んでいる（Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧｓが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性レセプターＦｃＲｎ（Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))も含まれる。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ様悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)(例えば扁平上皮細胞癌)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃(gastric)又は腹部(stomach)癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫、脳、並びに頭部及び頸部の癌、基礎細胞癌(ＢＣＣ)膵管腺癌(ＰＤＡ)、及び関連した転移が含まれる。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
「細胞死を誘導する」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、生細胞を生育不能にするものである。細胞は、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈを発現するものといったＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達に反応するもの、好ましくは、同じ組織型の正常細胞と比較してＰｔｃｈポリペプチドを過剰に発現する細胞である。好ましくは、その細胞は癌細胞、例えば、基礎細胞、膵臓、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺又は膀胱細胞である。インビトロ細胞死は、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性障害（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死を識別するために、補体及び免疫エフェクター細胞の無い状態で確かめてもよい。従って、細胞死に関するアッセイは、熱不活性化血清（すなわち、補体の無い）を用いて、免疫エフェクター細胞が無い状態でおこなってもよい。抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子が細胞死を誘導するか否かを確かめるために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Moore等 Cytotechnology 17: 1-11(1995)）又は７ＡＡＤの取り込みによって評価した膜整合性の損失を、未処理細胞と関連して評価することができる。好ましい細胞死を誘導する抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、ＢＴ４７４細胞でのＰＩ取り込みアッセイで、ＰＩ取り込みを誘導するものである。
「Ｈｈｉｐ１β１２発現細胞」は、細胞の表面上に又は分泌形態で内因性又は形質移入されたＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドを発現する細胞である。「Ｈｅｄｇｅｈｏｇ応答癌」は、細胞表面上に存在するＨｈｉｐ１ポリペプチド及び／又はＰｔｃｈポリペプチドを有する細胞を含む癌である。「Ｈｅｄｇｅｈｏｇ応答癌」は、その細胞表面上に十分なレベルのＨｈレセプターポリペプチドを生成するので、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体(例えばＨｈｉｐ１及びＰｔｃｈのＬ２ループに結合し、Ｈｈ結合を阻害する抗体)、オリゴペプチド又は他の有機分子は結合し、癌に関して治療上の効果を有しうる。
ここで用いられているように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
「標識」という語は、ここで用いられる場合、「標識化」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子を作製するために、抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子に直接的又は間接的に結合させる検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；δ-９-テトラヒドロカンナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標))；β-ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)(HYCAMTIN(登録商標))、ＣＰＴ-１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン(acetylcamptothecin)、スコポレクチン(scopolectin)、及び９-アミノカンプトテシン(9-aminocamptothecin)を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；ポドフィリン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCB1-TM1を含む）；エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin）；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；エスペラマイシン(esperamicin）；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）などの抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ABRAXANETM クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標）ドキセタキセル、（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボリン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)(XELODA(登録商標))；上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの併用治療の略記号であるCHOP、及び５-ＦＵとロイコボリン(leucovovin)と組み合わされるオキサリプラチン(ELOXATINTM)による治療投薬計画の略記号であるFOLFOXが含まれる。
また、癌の成長を促進しうるホルモンの影響を調節、低減、阻止(ブロック)又は阻害するように作用し、たびたび全身性、又は全身治療の形態にある抗ホルモン剤もこの定義に含まれる。これらはホルモン類自体でもよい。例として、抗卵胞ホルモン類及び、選択的なエストロゲンレセプターモジュレータ類(ＳＥＲＭ)、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェン)、EVISTA(登録商標)ラロキシフェン、ドロロキシフェン(droloxifene)、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストン及びFARESTON(登録商標)トレミフェン、抗プロゲステロン類、エストロゲンレセプター下方制御因子(ＥＲＤ)、卵巣を抑制するか又は一時停止させるように機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン(ＬＨＲＨ)アゴニスト、例えば、LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標)酢酸ロイプロリド、ゴセレリンアセテート、ブセレリンアセテート及びトリプトレリン(tripterelin)、他の抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド、及び、副腎のエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例として、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標) エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標) ボロゾール、FEMARA(登録商標) レトロゾール及びARIMIDEX(登録商標) アナストロゾールなどがある。加えて、化学療法剤のこのような定義には、ビスホスホネート、例えばクロドロン酸(例えば、BONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、DIDROCAL(登録商標)エチドロン酸、NE-58095、ZOMETA(登録商標) ゾレドロン酸／ゾレドロネート、FOSAMAX(登録商標)アレンドロネート、AREDIA(登録商標)パミドロン酸、SKELID(登録商標) チルドロン酸又はACTONEL(登録商標)、リセドロン酸、並びにトロキサチタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を阻害するもの、例として、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、Ｈ-Ｒａｓ及び上皮性成長因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)、ワクチン、例えばTHERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン、LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター、ABARELIX(登録商標) ｒｍＲＨ、ラパチニブジトシラート(ＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子インヒビター、GW572016とも称される)、及び、上記の何れかの薬学的に受容可能な塩類、酸又は誘導体が含まれる。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞、特にＨｉｐ-又はＰｔｃｈ-発現癌細胞(すなわち、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ応答癌細胞)の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期でＨｉｐ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１ａ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌及び／又はその治療薬の用途に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指す。
表１
Ｈｈｉｐ１β１２ XXXXXXXXXXXXXXX (長さ＝１５アミノ酸)
比較タンパク質 XXXXXYYYYYYY (長さ＝１２アミノ酸)
% アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定される２つのポリペプチド配列間の同一に一致するアミノ酸残基の数）÷（Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドのアミノ酸残基の総数）＝５÷１５＝３３．３％
表２
Ｈｈｉｐ１β１２ XXXXXXXXXX (長さ＝１０アミノ酸)
比較タンパク質 XXXXXYYYYYYZZYZ (長さ＝１５アミノ酸)
% アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定される２つのポリペプチド配列間の同一に一致するアミノ酸残基の数）÷（Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドのアミノ酸残基の総数）＝５÷１０＝５０％
表３
Ｈｈｉｐ１β１２−ＤＮＡ NNNNNNNNNNNNNN (長さ＝１４ヌクレオチド)
比較ＤＮＡ NNNNNNLLLLLLLLLL (長さ＝１６ヌクレオチド)
％核酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定される２つの核酸配列間の同一に一致するヌクレオチドの数）÷（Ｈｉｐ−ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの総数）＝６÷１４＝４２．９％
表４
Ｈｈｉｐ１β１２−ＤＮＡ NNNNNNNNNNNN (長さ＝１２ヌクレオチド)
比較ＤＮＡ NNNNLLLVV (長さ＝９ヌクレオチド)
％核酸配列同一性＝<BR>
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定される２つの核酸配列間の同一に一致するヌクレオチドの数）÷（Ｈｉｐ−ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの総数）＝４÷１２＝３３．３％
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド
本発明のある実施態様では、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドは、配列番号：８３、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５及び配列番号：１６から選択されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドである。他の実施態様では、本発明は、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９及び配列番号：１０のアミノ酸配列を有する個々のドメインといったＨｈｉｐ１β１２由来のポリペプチドを提供する。
これらのポリペプチドをコードする核酸配列は適切な発現ベクターにクローニングされ、適切な宿主細胞に形質移入されてよい。発現されたポリペプチドは当分野で公知な及び本明細書中に記載される様々な方法を用いて単離されうる。
Ｂ．抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体
一実施態様では、本発明は治療上及び／又は診断上の試薬としての本明細書中での使用が見出されうる抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体を提供する。ある実施態様では、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドにて動物を免疫化することによって産生され、このような抗体は、天然のＨｈｉｐ１タンパク質(推定Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメインを含む)による免疫化により引き起こされない天然のＨｈｉｐ１上のエピトープに特異的に結合する。ある例では、抗体は、Ｈｈｉｐ１のＬ２ループに対する抗体及びその抗イディオタイプ抗体を包含する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、抗イディオタイプ及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質へ、関連する抗原（特に、合成ペプチドが用いられる場合）を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることができる。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合のパートナーとも呼ばれる）の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい融合のパートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合しない親細胞に対して選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１およびＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、例えばマウスへの細胞の腹腔内注射によって、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロースを用いる）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等のような常套的な抗体精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）の配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾してキメラ又は融合抗体ポリペプチドを生成することができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-Ｈｈｉｐ１抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応(ヒト抗-マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク（ＦＲ）をヒト化抗体のために受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫結合体を生成するために、状況に応じて一又は複数の細胞傷害剤(類)と結合していてもよい抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってもよい。
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（全てジェンファーム(GenPharm)）；同５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
上述したように、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。
４．抗体断片
ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さな大きさの断片によって迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、すべて大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が増した、サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、本明細書中に記載のＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位とＨｈｉｐ１β１２結合部位とが結合しうる。あるいは、標的特異的アーム(例えばＬ２特異的アーム)は、Ｈｉｐ-又はＰｔｃｈ-発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＨｉｐ-又はＰｔｃｈ-結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公開第９６／１６６７３号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５８３７２３４号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＣＤ３抗体を教示するものである。よって、二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５７３１１６８号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
８．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原-依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存細胞障害性（ＣＤＣ）を向上させることは望ましい。これは、抗体のＦｃ領域で一又は複数のアミノ酸置換を誘導することによりなされうる。あるいは又はさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
９．免疫複合体
また、本発明は、化学治療薬、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
i．メイタンシン及びメイタンシノイド
好ましい一実施態様では、本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体を化学的に結合させることにより調製される。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３-４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び２００４年１０月８日出願の米国特許出願番号第１０／９６０６０２号（ここで参照することにより開示内容を本明細書に包含する）に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、２００４年１０月８日出願の米国特許出願番号第１０／９６０６０２号に開示されているようにして調整することができる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基をここに開示及び例示する。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
ii．アウリスタチン及びドロスタチン
一部の実施態様では、免疫複合体は、ドラスタチン又はドラスタチンのペプチド類似体及び誘導体である、アウリスタチン（米国特許第５６３５４８３号、同第５７８０５８８号）にコンジュゲートした本発明の抗体を含む。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管の動態、ＧＴＰ加水分解、核分裂、及び細胞分裂を妨害することが判明しており（Woyke等、(2001) Antimicrob. Agents and Chemother 45(12):3580-3584）、抗癌活性（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌活性（Pettit等、(1998) Antimicrob. Agents Chemother 42:2961-2965）を有する。ドラスチン又はアウリスタチンの薬剤成分は、ペプチド剤成分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端で抗体に付着させることができる（国際公開０２／０８８１７２）。
例示的なアウリスタチンの実施態様には、Senter等、Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623、（２００４年３月２８日）に開示された、Ｎ末端にリンクしたモノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦ（即ちＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）が含まれる。前記文献の開示内容の全体を、参照により本明細書に包含する。
一般的に、ペプチドに基づく薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片の間にペプチド結合を形成することにより調整することができる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で周知の液相合成法（E. Schroder及びK. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press参照）に従って調整することができる。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第５６３５４８３号、同第５７８０５８８号、Pettit等、(1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465、Pettit等、(1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277、Pettit, G.R.等、 Synthesis, 1996, 719-725、Pettit等、(1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863、及びDoronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784に記載の方法に従って調製することができる。
iii．カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ １(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
iv．他の細胞障害剤
本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
本発明の化合物として、（例えば米国イリノイ州ロックフォードのPierce Biotechnology, Inc.より）市販のクロスリンカー試薬、即ちＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸）を用いて調製したＡＤＣを特に考慮するが、これに限定されない。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照のこと。
別法として、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
１０．免疫リポソーム
ここで開示されている抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
Ｂ．Ｈｈｉｐ１結合オリゴペプチド
本発明のＨｈｉｐ１β１２オリゴペプチドはＨｈｉｐ１ポリペプチドに、好ましくは特異的に、結合するオリゴペプチドである。Ｈｈｉｐ１結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成法を用いて化学的に合成することができ、あるいは組換え技術を用いて調製及び生成することができる。Ｈｈｉｐ１結合オリゴペプチドは通常、少なくとも約５のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはＨｈｉｐ１ポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。あるＨｈｉｐ１β１２オリゴペプチドは本明細書中に詳細に記載される。他のＨｈｉｐ１β１２オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリーを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリーのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として表示されることによる技術である（Scott,J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムクローンｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）又はタンパク質（Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）ライブラーリのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。ランダム突然変異体のファージライブラリーの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号。
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム（国際公開９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ren等 Gene, 215:439 (1998)；Zhu等Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998)；Jiang等, Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997)；Ren等, Gene, 195(2):303-311 (1997)；Ren, Protein Sci., 5:1833 (1996)；Efimov等, Virus Genes, 10:173 (1995)及びＴ７ファージディスプレイシステム（Smith及びScott, Methods in Enzymology, 217, 228-257 (1993)；米国特許第５７６６９０５号）も知られている。
現在、基礎的なファージディスプレイ構想の多くの他の改良及び変形が開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングするための、及びこれらのタンパク質が所望の特性をスクリーニングする潜在能力で機能性タンパク質をディスプレイするためのディスプレイシステムの能力を増強する。ファージディスプレイ反応のための組み換え反応手段について記載があり（ＷＯ９８／１４２７７）及びファージディスプレイライブラリーは二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）及び拘束性へリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を分析及び制御するために使用されている。ＷＯ９７／３５１９６は、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリーを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法を記載する。ＷＯ９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリーをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌（Staphlylococcus aureus）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている（Li等, (1998) Mol Biotech., 9:187）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーでもよいコンビナトリアルライブラリーを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法はＷＯ９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及びＷＯ９８／１５８３３に記載されている。
ペプチドライブラリーの作製及びこれらのライブラリーのスクリーニングの方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載される。
ある実施態様では、Ｈｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチドは、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合オリゴペプチドといったＨｈｉｐ１のＬ２ループに結合する。これらのペプチドは、Ｈｈｉｐ１のＬ２ループモチーフの性質が保存されているために、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈのＬ２ループに結合する。いくつかの実施態様では、オリゴペプチドは、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈに結合するＨｈに干渉し、Ｈｈシグナル伝達を阻害する。他の実施態様では、オリゴペプチド自体が、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈに結合して、ＰｔｃｈへのＨｈ結合を模倣することによってＨｈシグナル伝達を作動してもよい。
Ｃ．Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣オリゴペプチド
ある実施態様では、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチドはＨｈｉｐ１のＬ２ループ(配列番号：５４)に基づく。Ｈｈｉｐ１β１２のＬ２ループは、Ｈｅｄｇｅｈｏｇに結合し、Ｈｅｄｇｅｈｏｇを結合するＰｔｃｈのアナログ部位を有する保存された残基を含む部位である。したがって、本発明は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇと相互作用するＨｈｉｐ１のβプロペラドメインのＬ２ループのアミノ酸配列に基づいたオリゴペプチドを提供する。これらオリゴペプチドは、組み換え系で発現されても、当分野で公知の任意の方法によって化学的に合成されてもよい。オリゴペプチドは線状であっても、環状に造られてもよい。一般にオリゴペプチドは少なくとも８アミノ酸の長さである。ある実施態様では、オリゴペプチドは９〜２１のアミノ酸の長さであり、ある実施態様では、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１のアミノ酸長である。
本発明のオリゴペプチドは、少なくとも以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2011524742
ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、括弧で囲んだアミノ酸はその位置においてオルタナティブなアミノ酸を表す。好ましくは、位置Ｘのアミノ酸は、Ｈｈｉｐ１のＬ２ループの位置のアミノ酸と同じであるか、又はそのアミノ酸の保存的置換であるものである。いくつかのオリゴペプチドの例には、以下が含まれる。
Figure 2011524742
ここで、Ｘは任意のアミノ酸であるが、好ましくは、Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈのＬ２ループの位置のアミノ酸と同じであるか、又はそのアミノ酸の保存的置換であるものである。いくつかのオリゴペプチドの例には、以下が含まれる。
Figure 2011524742
ここで、Ｘは任意のアミノ酸であるが、好ましくは、Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈのＬ２ループの位置のアミノ酸と同じであるか、又はそのアミノ酸の保存的置換であるものである。
Ｌ２ループオリゴペプチドの特定の例には、例えば以下のものが含まれる(供給源と共に、配列番号：３９のコア領域を影付きで示して列挙する)。
Figure 2011524742
他の実施態様では、本発明のオリゴペプチドは少なくとも以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2011524742
ここで、Ｘは任意のアミノ酸であるが、好ましくは、ＰｔｃｈのＬ２ループの位置のアミノ酸と同じであるか、又はそのアミノ酸の保存的置換であるものである。いくつかのオリゴペプチドの例には以下が含まれる。
Figure 2011524742
例えば、限定するものではないが、Ｌ２ループオリゴペプチドの特定の例には以下のものが含まれる(供給源と共に、基本配列(配列番号：７８)を影付きで示して列挙する)。
Figure 2011524742
実施可能性についてある特定の理論に結びつけられるものではないが、本発明のオリゴペプチドは、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈのＬ２ループを模倣し、Ｈｅｄｇｅｈｏｇと相互作用するように設定される。本発明のオリゴペプチドは、Ｈｅｄｇｅｈｏｇに結合し、それによって癌細胞などの細胞の表面上のＰｔｃｈ及びＨｈｉｐ１レセプターへのＨｅｄｇｅｈｏｇの結合を阻害するために有用である。ゆえに、Ｈｅｄｇｅｈｏｇに反応する細胞(例えば癌細胞)の増殖を阻害するか又は停止させる。
また、本発明のペプチドは、Ｌ２ループ特異的抗体の生成における抗原として有用である。このような抗体は、天然のＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈを結合し、(それ自身レセプターを刺激せずに)これらのレセプターへのＨｅｄｇｅｈｏｇの結合を阻害し、Ｈｅｄｇｅｈｏｇに反応する細胞(例えば癌細胞)の増殖を阻害するか又は停止させうる。加えて、抗Ｌ２ループ抗体に対する抗イディオタイプ抗体は、Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈのＬ２ループを模倣することにより、Ｈｅｄｇｅｈｏｇを結合しうるように作製されてよい。また、このような抗体は、Ｐｔｃｈ又はＨｈｉｐ１へのＨｅｄｇｅｈｏｇの結合を阻害する際に有用であり、Ｈｅｄｇｅｈｏｇに反応する細胞の増殖を阻害するか又は停止させる。これらの抗体は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ関連癌を治療する際に有用である。
あるいは、ある実施態様では、抗Ｌ２-特異的抗体は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達のアゴニストとして有用であり、例えば神経組織の増殖の調節、骨および軟骨形成および修復、精子形成の調節、平滑筋の調節、原始腸管から生じる肺、肝臓および他の臓器の調節、造血性機能の調節、皮膚の調節および体毛成長などの用途においてＨｅｄｇｅｈｏｇアゴニストとして有用となりうる。
Ｄ．Ｈｈｉｐ１β１２結合およびＨｈｉｐ１β１２ Ｌ２ループ模倣有機分子
Ｈｈｉｐ１結合有機分子は、本明細書中で定義されるオリゴペプチド又は抗体以外の、Ｈｈｉｐ１ポリペプチド及び／又はＰｔｃｈポリペプチドに好ましくは特異的に結合し、Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達を調節する有機分子である。他の実施態様では、小有機分子は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ結合領域内のＨｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ構造に基づき、Ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドに結合し、Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達を調整するように設計される。
いくつかの実施態様では、有機分子は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇを結合し、Ｈｅｄｇｅｈｏｇアンタゴニストとして作用する(すなわち、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ応答性細胞のＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達を阻害する)。他の実施態様では、有機分子は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇを結合し、Ｈｅｄｇｅｈｏｇアゴニストとして作用する(すなわち、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ応答性細胞のＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達を刺激する)。他の実施態様では、有機分子は、Ｈｈｉｐ１及び／又はｐａｔｅｃｈｅｄを結合し、Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達アンタゴニストとして作用する(すなわち、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ応答性細胞のＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達を阻害する)。他の実施態様では、有機分子は、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈを結合し、Ｈｅｄｇｅｈｏｇアゴニストとして作用する(すなわち、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ応答性細胞のＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達を刺激する)。
タンパク質の構造に基づく薬剤の合理的な設定は当分野で周知であり、Ｈｈｉｐ１β１２についての本明細書において提供される情報に基づく薬剤設計のための方策は慣例的な試験により当業者によって用いられる。このような方法および技術についての手引きは、例えばGreer J. et al. (1994) "Application of the three-dimensional structures of protein target molecules in structure-based drug design" J Med. Chem. 37(8): 1035-1054およびGubernator K., and H.J. Bohm STRUCTURE-BASED LIGAND DESIGN, METHODS AND PRINCIPLES IN MEDICINAL CHEMISTRY, Weinheim: Wiley-VCH, 1998において示される。
Ｈｈｉｐ１結合有機分子とは、ここに記載されるようなＨｈｉｐ１ポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。Ｈｈｉｐ１結合有機分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。Ｈｈｉｐ１Ｌ２結合有機分子は通常、約２０００ダルトンの大きさ未満であり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトンの大きさであり、ここに記載される様なＨｈｉｐ１ポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）。Ｈｈｉｐ１結合有機分子は、例えばアルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバミン酸塩、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸塩、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
Ｅ．所望する特性を有する抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１オリゴペプチド及びＨｈｉｐ１結合有機分子のスクリーニング
Ｈｈｉｐ１ポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド及び有機分子を生成する技術を、上記にて記載した。所望するような、所定の生物学的特性を有する抗体、オリゴペプチド又は有機分子をさらに選択することができる。
本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子の成長阻害効果を、例えば、内因的又はＨｈｉｐ１β１２遺伝子によるトランスフェクション後のいずれかでＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドを発現する細胞を用いる当該分野で周知の方法によって評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞株及びＨｉｐ形質移入細胞は、数日間（例えば、２−７）、種々の濃度の本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２モノクローナル抗体、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又は他のＨｈｉｐ１β１２有機分子で処理し、クリスタル・バイオレット又はＭＴＴで染色、又は幾つかの他の比色アッセイによって分析し得る。増殖を測定するその他の方法は、本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２有機分子の存在又は非存在下で処理した細胞の３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。処理の後、細胞を収集し、ＤＮＡへ取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターで定量化した。適切なポジティブコントロールには、細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体でその選択した細胞株を処理することが含まれる。インビボでの成長阻害は、当該分野で知られている種々の方法で確かめることができる。好ましくは、腫瘍細胞は、Ｈｈｉｐ１ポリペプチドを過剰発現するものである。好ましくは、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２有機分子は、ある実施態様では約０．５から３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、未処理腫瘍細胞と比べて約２５−１００％、より好ましくは約３０−１００％、そしてさらにより好ましくは約５０−１００％又は７０−１００％のＨｉｐ発現腫瘍細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害する。成長阻害は、細胞培養で、約０．５から３０μｇ／ｍｌ又は０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、その成長阻害は、抗体への腫瘍細胞の曝露後１-１０日で確かめられる。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重での抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体の投与が、抗体の最初の投与から約５日から３ヶ月、好ましくは約５から３０日以内に腫瘍の大きさの減少又は腫瘍細胞増殖の減少を引き起こすならば、抗体はインビボで成長阻害作用がある。
細胞死を誘発する抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２有機分子を選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いを対照と比較して求める。ＰＩ取込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で行われる。Ｈｈｉｐ１ポリペプチド発現細胞腫瘍細胞を、培地のみ、又は適切な抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体（例えば約１０μｇ／ｍｌ）、Ｈｈｉｐ１結合オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１結合有機分子を含有する培地でインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、細胞を洗浄し、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２×７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。次いで、チューブへＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を与える。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(登録商標）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(登録商標）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析してもよい。ＰＩ取込みによって測定されるような、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発する抗Ｈｈｉｐ１抗体、Ｈｈｉｐ１結合オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１結合有機分子は、細胞死誘発抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２有機分子として選択することができる。
関心のある抗体が結合したＨｈｉｐ１ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。既知の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体のように、試験抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子が同じ部位又はエピトープと結合するならば、このアッセイを確定するために用いることができる。あるいは、又は付加的に、エピトープマッピングを、当該分野で周知の方法によって行うことができる。例えば、接触残基を同定するために、例えばアラニンスキャンニングによって抗体配列を変異させることができる。この変異体抗体は、適切なフォールディングを確かめるために、最初にポリクローナル抗体との結合について試験される。異なる方法では、Ｈｈｉｐ１ポリペプチドの異なる領域と一致するペプチドを、試験抗体群又は試験抗体及び特徴付けられた又は既知のエピトープを有する抗体による競合アッセイで用いることができる。
Ｆ．抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５を参照)を活性な抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へ抗体をコンジュゲートすることによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公開８８／０７３７８及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に変換するようにプロドラッグへ作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを変換させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗Ｈｈｉｐ１抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neuberger等, Nature 312:604-608[1984])。
Ｇ．完全長Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド
また、本発明は、本出願でＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に種々のＨｈｉｐ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（部分及び完全長）が本発明に包含される。本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｈｈｉｐ１をコードする核酸配列と予測されるアミノ酸配列のアラインメントを示す図１を参照して決定されうる。さらに、配列番号：８３は完全長Ｈｈｉｐ１β１２のアミノ酸配列を示し、配列番号：５２はヒトＨｈｉｐ１のｃＤＮＡ配列を示す。Ｈｈｉｐ１β１２の小さい断片はそのアミノ酸配列をコードする任意のポリヌクレオチド配列によってコードされうるが、特定の核酸配列の例により当業者に少なくとも１の参照配列が提供される。
Ｈ．抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１ポリペプチド変異体
ここに記載した抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及び完全長配列Ｈｈｉｐ１β１２及び他のＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドに加えて、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド変異体も調製できると考えられる。抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１ポリペプチド変異体は、コード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、及び／又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによって調製できる。当業者は、アミノ酸変化がグリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などの抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体の翻訳後プロセス又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの翻訳後プロセスを変え得るのを理解するであろう。
ここに記載した抗Ｈｈｉｐ１抗体及びＨｈｉｐ１ポリペプチドの変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に示す保存的及び非保存的変異に関する技術及び指針のいずれかを用いて作成することができる。変異は、結果として天然配列抗体又はポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化を生じる、抗体又はポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。場合によっては、変異は、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドの一つ又は複数のドメインにおける、少なくとも一つのアミノ酸の他の任意のアミノ酸との置換による。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失され得るかを確かめる指針は、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの配列を既知の相同タンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内で生じたアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果であるとすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内であり得る。許容され得る変異は、配列にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、生じた変異体を完全長又は成熟天然配列によって示される活性に関して試験することによって確かめられる。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド断片がここで提供されている。そのような断片は、例えば完全長天然抗体又はタンパク質と比較した時に、Ｎ末端又はＣ末端で切断しているか、又は内部残基を欠いている可能性がある。ある断片は、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの所望される生物学的活性にとって必修ではないアミノ酸残基を欠く。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド断片は、多くの従来技術のいずれかによって調製してもよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法には、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基で確定した部位でタンパク質を切断することが知られた酵素によってタンパク質を処理することで、又は適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによって抗体又はポリペプチド断片を生成することが含まれる。さらにその他の好適な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望の抗体又はポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することが含まれる。ＤＮＡ断片の所望の末端を確定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド断片は、ここに開示した天然抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特定の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換の項目で表５に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表５に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
表５
Figure 2011524742
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は分子疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
（２）中性の親水性：Cys, Ser, Thr; Asn; Gln
（３）酸性：Asp, Glu;
（４）塩基性：His, Lys, Arg;
（５）鎖配向に影響する残基：Gly, Pro; 及び
（６）芳香族：Trp, Tyr, Phe。
非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、又はより好ましくは、残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチド変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドの適切なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐために、概してセリンと置換され得る。逆に、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの安定性（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片）を向上させるために、それにシステイン結合（一又は複数）を加えてもよい。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる開発のために得られた変異体は、それらが生成された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性成熟がふくまれる。簡潔に言えば、高頻度可変領域部位（例えば、６−７部位）を変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として一価形態で表示される。ファージ表示変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変の候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトＨｈｉｐ１ポリペプチドとの接点を同定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここで詳しく記述した技術による置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択することができる。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で周知の種々の方法によって調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、そして抗-Ｈｈｉｐ１β１２抗体の早期に調製した変異体又は非変異体形のカセット突然変異誘発による、天然ソースからの単離（天然発生アミノ酸配列変異体の場合）又は調製が含まれる。
Ｉ．抗Ｈｈｉｐ１抗体及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの修飾
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型には、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることが含まれる。二官能性試薬による誘導体化は、例えば抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドを、抗Ｈｈｉｐ１抗体の精製方法で用いる水不溶性支持体マトリクス又は表面と架橋させるために有用であり、その逆も同じである。通常用いられる架橋剤には、例えば、１,１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸を有するエステル、３,３'-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬が含まれる。
他の修飾には、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれる抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、抗体又はポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。ここで意図される「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドに見られる一又は複数の炭水化物部分を欠失させること（内在するグリコシル化部位を取り除くことによって、又は化学及び／又は酵素的手法でグリコシル化を欠失させることのいずれか）、及び／又は天然配列抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。更には、この語句には、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的な変化が含まれる。
抗体及び他のポリペプチドのグリコシル化とは、典型的にはＮ-結合又はＯ-結合のいずれかである。Ｎ-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付与を指す。トリペプチドは、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンの配列であり、アスパラギン側鎖への炭水化物部分が酵素的に付与される認識部位である。従って、ポリペプチドのこれらトリペプチド配列のいずれかの存在によって、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ-結合グリコシル化とは、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンも用いられるが、殆どの場合にはセリン又はスレオニンへＮ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの一つの糖をヒドロキシアミノ酸へ付与することを指す。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変して、それが上記に記載のトリペプチド配列（Ｎ-結合グリコシル化部位について）の一つ又は複数を含むようにすることによって簡便に完遂できる。この改変は、また、最初の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの配列へ一つ又は複数のセリン又はスレオニン残基を付加、又は置換することによって生成される（Ｏ-結合グリコシル化部位について）。抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通して、特に、コドンが所望するアミノ酸へ翻訳される、あらかじめ選択した塩基での抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、場合によっては改変され得る。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。そのような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行された国際公開８７／０５３３０、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)によって、そしてEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド共有結合的修飾の他の型は、抗体又はポリペプチドを種々の非タンパク質様ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることをを含む。また、抗体又はポリペプチドは、例えばコアセルベーション法によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションで捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, １６版, A. Oslo編(1980)に開示されている。
また、本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドは、その他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合した抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドを含むキメラ分子が形成される方法で修飾されてもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204１−７0 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子は抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えて抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号を参照のこと。
Ｊ．抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１ポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することにより抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１ポリペプチドを産生させる方法に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いて抗Ｈｈｉｐ１抗体及びＨｈｉｐ１ポリペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動を使用することによってインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター シティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望する抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドを生成させてもよい。
１．抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードするＤＮＡは、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒト抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。また抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法（例えば、自動核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、ＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookら，に示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載した抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium）、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
完全長抗体、抗体断片、及び抗体融合タンパク質は、治療用の抗体が細胞傷害剤（例えば、毒素）と結合し、その免疫コンジュゲートそのものが腫瘍細胞の破壊において有効性を示す場合など、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に、細菌で産生させることができる。完全長抗体は、血液循環でより長い半減期を有する。大腸菌での産生が、より迅速でより費用効率的である。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Carter等）、米国特許第５７８９１９９号（Joly等）、及び翻訳開始部位（ＴＩＲ）及び発現と分泌を最適化するシグナル配列を記載している米国特許第５８４０５２３号（Simmons等）を参照のこと。これら特許は、ここに参考文献として取り入れられている。発現の後、抗体は、大腸菌細胞ペーストから可溶性分画へ分離し、例えば、アイソタイプによってプロテインＡ又はＧカラムを介して精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現させた抗体を精製するための工程と同じようにして行うことができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９３８３号）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４９４３５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２２２６号）；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
グリコシル化抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ(カイコガ)等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59 (1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
３．複製可能なベクターの選択及び使用
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドは直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入される抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子がある。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州特許第３６，７７６号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまた抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１ポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開の英国特許第２２１１５０４号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは(通常は約１０から３００塩基対で)、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養での抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
４．宿主細胞の培養
本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン（商品名）薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、配列Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＨｈｉｐ１β１２ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
６．抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１ポリペプチドの精製
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドは、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの性質に依存する。
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内に生成される場合、第１工程として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は超遠心分離にかけて取り除く。Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順について記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、３０分以上かけて解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。抗体が培地へ分泌されている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は抗体に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983]）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 15671575 [1986]）。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX(商標)樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンSEPHAROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製工程に続いて、対象とする抗体と汚染物とを含む混合物に、約２．５−４．５のｐＨでの溶離バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施してもよく、好ましくは低い塩濃度（例えば、約０−０．２５Ｍ塩）で実施される。
Ｊ．製薬製剤
本発明に係る抗Ｈｈｉｐ１抗体、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２有機分子及び／又はＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの治療的製剤は、所望される程度の純度を持つ抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は有機分子を凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th 版, Osol, A. 編. [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、酢酸、Ｔｒｉｓ、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド、ベンズエトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウムなどのトニシファイヤー；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ポリソルベート等の界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はトゥイーン(TWEEN)（登録商標）、プルロニクス(PLURONICS)（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。抗体は、好ましくは５−２００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１０−１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度の抗体で構成される。
ここでの製剤は、また、治療すべき特定の徴候の必要に応じて一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。例えば、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２有機分子に加えて、１つの製剤に、例えば、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド上の異なるエピトープと結合する第二抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、又は特定の癌の成長に影響を与える成長因子のような何らかの他の標的に対する抗体を含めることは望ましい。あるいは、又はさらに、この組成物は、更に化学療法剤、細胞障害性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗-ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤を含んでもよい。このような分子は、意図する目的にとって有効な量の組み合わせで適切に存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-（-）-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
Ｋ．抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、Ｈｈｉｐ１β１２オリゴペプチド又はＨｈｉｐ１β１２有機分子を用いる診断及び治療
一実施態様では、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ関連腫瘍は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析される。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイへ供してもよいし、次のようなＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈタンパク質染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０ - 染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋ - わずかに／弱く認知できる程度の膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて検出される。細胞はそれらの膜の一部のみが染色される。
スコア２＋ - 弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋ - 中程度から強い完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈポリペプチド発現に関して０又は１＋スコアの腫瘍は、Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈが過剰発現していないことを特徴としうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアの腫瘍はＨｉｐ及び／又はＰｔｃｈが過剰発現していることを特徴としうる。
別に、又は付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばＩＮＦＯＲＭ（登録商標）(Ventana, Arizonaから販売)又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）(Vysis, Illinois)を、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織で実施して、腫瘍におけるＨｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈ過剰発現の程度(生じているならば)を測定してもよい。
Ｈｈｉｐ１及び／又はＰｔｃｈ過剰発現又は増幅は、インビボ診断アッセイを使用して評価することができ、例えば検出される分子に結合し、検出可能な標識(例えば、放射性同位体又は蛍光標識)が付けられた分子(例えば抗体、オリゴペプチド又は有機分子)を投与し、標識の局在化について患者を外部スキャニングする。
実施可能性についてある特定の理論に結びつけられるものではないが、Ｈｈｉｐ１Ｌ２ループを結合する本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体は、Ｐｔｃｈのアナログループと交差反応し、それによってＰｔｃｈ並びにＨｉｐの過剰発現を検出しうると思われる。
上に記載したように、本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子には、種々の非治療的用途がある。本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、Ｈｉｐ-又はＰｔｃｈ-を発現している癌の診断及び染色にとって有用である（例えば、ラジオイメージングで）。他の細胞の精製の工程として、混合細胞の集団からＨｉｐ-発現細胞を死滅させて除去するために、この抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、また、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおいて、インビトロでＨｈｉｐ１ポリペプチドの検出及び定量化のために、細胞からＨｈｉｐ１及びＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドを精製又は免疫沈降するのに有用である。
現在、癌の段階に応じて、癌の治療には、次の治療：外科手術による癌組織の除去、放射線治療、及び化学治療の一つ、又はそれらを組合せたものが含まれる。抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子による治療は、特に、化学治療における副作用や毒素に対する耐性がない老年の患者、及び放射線治療の有用性に限界がある転移性疾患において所望されている。本発明の腫瘍標的化抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、疾患の初期診断時及び再発中におけるＨｉｐ-発現癌の緩和に有用である。治療用途に関しては、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、単独で、あるいは例えば、ホルモン、抗血管形成、又は放射標識された化合物と共に、又は外科手術、寒冷療法、及び／又は放射線治療と組み合わせてもよく、使用してもよい。抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子による治療は、従来的治療の前又は後のいすれかに連続させて、他の形態の従来的治療と共に実施することができる。化学療法剤、例えばタキソテレ(登録商標)(ドセタキセル)、タキソール(登録商標)(パリクタキセル)、エストラムスチン及びミトキサントロンは、癌、特に危険性の少ない患者の癌治療に使用される。癌を治療又は緩和するための本発明の方法において、上述した一又は複数の化学療法剤による治療と組合せて、癌患者に抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子を投与することができる。特に、パリクタキセル及び改変誘導体との組合せ治療が考えられる(例えば、欧州特許第０６００５１７号を参照のこと)。抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子は治療的有効量の化学療法剤と共に投与されるであろう。他の実施態様では、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子は化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性及び効力を高めるための化学治療と組合せて投与される。医師用卓上参考書(ＰＤＲ)には、種々の癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上述の化学療法剤の投薬計画及び用量は、治療される特定の癌、疾患の程度、及び当該技術分野の医師によく知られている他の因子に依存し、医師が決定することができる。
特定の一実施態様では、細胞障害剤に結合した抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有する毒素コンジュゲートを患者に投与する。好ましくは、Ｈｈｉｐ１タンパク質に結合した免疫コンジュゲートは細胞によりインターナリゼーションし、結果として、それが結合した癌細胞の殺傷性における免疫コンジュゲートの治療的効果が向上する。好ましい実施態様では、細胞障害剤は、癌細胞内の核酸を標的とするか、又はこれに干渉する。このような細胞障害剤の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子又はその免疫コンジュゲートは、公知の方法、例えばボーラス、もしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与される。抗体、オリゴペプチド又は有機分子の静脈内又は皮下投与が好ましい。
他の治療計画を抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子の投与と組合せてもよい。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び好ましくは両方(又は全ての)活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間があるいずれかの順での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療効果が生じることが好ましい。
また、特定の癌に関連した他の腫瘍抗原に対する抗体の投与と共に、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体又は抗体類、オリゴペプチド又は有機分子の投与を組合せることが望ましい。
他の実施態様では、本発明の治療方法は、異なる化学療法剤の混合物の同時投与を含む、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体(又は抗体類)、オリゴペプチド又は有機分子と一又は複数の化学療法剤又は成長阻害剤との組合せ投与を含む。化学療法剤には、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５-フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン類(hydroxyureataxanes)(例えばパクリタキセル及びドキセタキセル)及び／又はアントラサイクリン抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service編 M.C.Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。
抗体、オリゴペプチド有機分子は、抗ホルモン化合物；例えばタモキシフェン等の抗-エストロゲン化合物；抗-プロゲステロン、例えばオナプリストン(onapristone)(欧州特許第６１６８１２号を参照)；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドを、このような分子に対して既知の用量で組合せてもよい。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は予め抗アンドロゲン治療を受け、癌がアンドロゲン非依存性になった後、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子(及び場合によってはここに記載した他の薬剤)を患者に投与してもよい。
しばしば、心臓保護剤(治療に関連する心筋の機能不全を防止又は低減するため)又は一又は複数のサイトカインを患者に同時投与することも有益なことである。上述した治療摂生に加えて、抗体、オリゴペプチド又は有機分子治療の前、同時又は治療後に、外科的に癌細胞を取り除くか、及び／又は放射線治療を施してもよい。上述した任意の同時投与される薬剤の適切な用量は現在使用されている量であり、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子と薬剤の組合せ作用(相乗作用)に応じてより少なくしてもよい。
疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、公知の基準に従い、医師により選択されるであろう。抗体、オリゴペプチド又は有機分子の適切な用量は、上記のような治療される疾患の種類、疾患の重症度及び過程、抗体、オリゴペプチド又は有機分子を予防目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体、オリゴペプチド又は有機分子の応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。抗体、オリゴペプチド又は有機分子は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。好ましくは、抗体、オリゴペプチド又は有機分子は静脈注入又は皮下注射により投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、体重１ｋｇ当たり約１μｇないし５０ｍｇ(例えば０．１−１５ｍｇ／ｋｇ／用量)の抗体を患者への最初の投与量の候補とすることができる。投薬計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷量、続いて１週間に約２ｍｇ／ｋｇの維持用量の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体を投与することからなってよい。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、疾患の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。この治療の進行状態は、医師又は他の当業者に公知の基準をベースにした通常の方法やアッセイで容易にモニターされる。
抗体タンパク質の患者への投与の他に、本出願は遺伝子治療による抗体の投与を考察する。抗体をコードする核酸の投与は「抗体を治療的有効量で投与する」という表現に含まれる。例えば、遺伝子治療を用いた細胞内抗体の産生に関する、１９９６年３月１４日に公開された国際公開第９６／０７３２１号を参照のこと。
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第４８９２５３８号及び第５２８３１８７号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
現在好まれているインビボ核酸移入技術は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）での形質移入を含む。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第９３／２５６７３号及びそこに引用された参考文献も参照。
本発明の抗Ｈｈｉｐ１抗体は、ここでの「抗体」の定義により包含される様々な形態であってよい。よって、抗体には、完全長又は無傷抗体、抗体断片、天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト化、キメラ又は融合抗体、免疫コンジュゲート、及びそれらの機能的断片が含まれる。融合抗体において、抗体配列は異種ポリペプチド配列に融合している。抗体はＦｃ領域が修飾されて、所望のエフェクター機能を提供することができる。以下の段落に詳細に記載されるように、適切なＦｃ領域と共に、細胞表面に結合したそのままの抗体は、例えば抗体-依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を介して又は補体依存性細胞障害において補体を補充することにより、又は他のいくつかのメカニズムにより、細胞障害性を誘発し得る。また、副作用及び治療による合併症を最小にするようにエフェクター機能を除去又は低減することが望ましい場合には、所定の他のＦｃ領域が使用される。
一実施態様では、抗体は、本発明の抗体と同じエピトープとの結合に関して競合するか、又はこれに実質的に結合する。また、本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体の生物学的特徴を有する抗体、特にインビボ腫瘍ターゲティング及び任意の細胞増殖阻害又は細胞障害特性を含むものが考察される。
上述した抗体の産生方法をここで詳細に記載する。
本抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、哺乳動物におけるＨｉｐ-発現癌の治療又は一又は複数の癌の徴候の緩和に有用である。このような癌には、前立腺癌、尿道癌、肺癌、乳癌、結腸癌及び卵巣癌、特に前立腺癌腫(prostate adenocarcinoma)、腎細胞癌腫、結腸直腸腺癌、肺腺癌、肺細胞の扁平癌腫、及び胸膜中皮腫が含まれる。癌には、上述した任意の転移性癌が含まれる。抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、哺乳動物においてＨｈｉｐ１ポリペプチドを発現している癌細胞の少なくとも一部に結合可能である。好ましい実施態様では、抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、インビボ又はインビトロで細胞のＨｈｉｐ１ポリペプチドに結合して、Ｈｉｐ-発現腫瘍細胞を破壊又は死滅させるか、又はこのような腫瘍細胞の成長を阻害するのに効果的である。このような抗体には、ネイキッドの抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体(いかなる薬剤にも結合していない)が含まれる。細胞傷害性又は細胞成長阻害特性を有するネイキッド抗体は、細胞障害剤と併用すると、より強く腫瘍細胞を破壊することが可能である。例えば細胞障害剤と抗体とを結合させ、以下に記載するような免疫コンジュゲートを形成させることによって、細胞障害特性を抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体に付与することができる。この細胞障害剤又は成長阻害剤は、好ましくは小分子である。毒素、例えばカリケアマイシン又はメイタンシノイド、及びそれらの類似物又は誘導体が好ましい。
本発明は、本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子と担体を含有する組成物を提供する。癌の治療のために、組成物はその治療の必要性に応じて患者に投与することができ、ここで組成物は免疫コンジュゲート又は裸の抗体として存在する一又は複数の抗Ｈｈｉｐ１抗体を含有し得る。さらなる実施態様においては、組成物は、他の療法剤、例えば化学療法剤を含む成長阻害剤又は細胞障害剤とこれらの抗体、オリゴペプチド又は有機分子を組合せて含有することもできる。また本発明は、本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子と担体を含有する製剤も提供する。一実施態様では、製剤は製薬的に許容可能な担体を含有する治療用製剤である。
本発明の他の態様は、抗Ｈｈｉｐ１抗体をコードする単離された核酸分子である。Ｈ及びＬ鎖、特に高頻度可変領域残基をコードする核酸、天然配列抗体及び変異体をコードする鎖、該抗体の修飾体及びヒト化形態を含む。
本発明は、抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子を治療的有効量、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＨｈｉｐ１ポリペプチド-発現癌の治療又は癌の一又は複数の徴候を緩和するのに有用な方法を提供する。抗体、オリゴペプチド又は有機分子治療組成物は、医師の指示通りに、短い期間(急性)又は慢性的に、又は間欠的に投与することができる。また、Ｈｈｉｐ１ポリペプチド-発現細胞の成長を阻害し、該細胞を殺傷する方法も提供される。
本発明は少なくとも一つの抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有するキット又は製造品も提供する。抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有するキットは、例えばＨｈｉｐ１細胞殺傷アッセイ、細胞からのＨｈｉｐ１ポリペプチドの精製又は免疫沈降における用途が見出されている。例えば、Ｈｈｉｐ１の単離及び精製のためには、キットはビーズ(例えばセファロースビース)に結合した抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有することができる。インビトロにおけるＨｈｉｐ１の検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおける抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有するキットを提供することもできる。検出に有用なこのような抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、蛍光又は放射標識などの標識が付されて提供され得る。
Ｌ．製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、抗Ｈｈｉｐ１発現癌の治療に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、癌の状態の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、癌患者に抗体、オリゴペプチド又は有機分子組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
種々の目的、例えばＨｉｐ発現細胞殺傷アッセイ、細胞からのＨｈｉｐ１ポリペプチドの精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。Ｈｈｉｐ１ポリペプチドの単離及び精製において、キットはビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合した抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含むことが可能である。インビトロにおけるＨｈｉｐ１ポリペプチドの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのための抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には少なくとも１つの本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又は能書は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する注意書きを提供するものである。
Ｍ．Ｈｈｉｐ１ポリペプチド及びＨｉｐ-ポリペプチドコード核酸の用途
Ｈｈｉｐ１ポリペプチドをコードする核酸配列（又はそれらの相補鎖）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡプローブの生成において種々の用途を有している。また、Ｈｉｐコード化核酸は、ここに記載される組換え技術によるＨｈｉｐ１ポリペプチドの調製に有用であり、これらＨｈｉｐ１ポリペプチドは、例えば、ここで記載の抗Ｈｈｉｐ１抗体の調製において用途を見出し得る。
完全長天然配列Ｈｈｉｐ１遺伝子又はその一部は、完全長Ｈｈｉｐ１ｃＤＮＡの単離又はここに開示した天然Ｈｈｉｐ１配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他のｃＤＮＡ（例えば、Ｈｈｉｐ１の天然発生変異体又は他の種からのＨｈｉｐ１をコードするもの）の単離のために、ｃＤＮＡライブラリ用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。このハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に完全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列Ｈｈｉｐ１のプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から判定され得る。例えば、スクリーニング法は、Ｈｈｉｐ１遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識され得る。本発明のＨｈｉｐ１遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーにプローブがハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術を、以下の実施例において更に詳細に記載する。本出願に開示されている任意のＥＳＴ配列は、ここに開示している方法を利用して、同じようにプローブとして用い得る。
Ｈｉｐ-コード核酸の他の有用な断片には、標的Ｈｈｉｐ１ ｍＲＮＡ（センス）又はＨｈｉｐ１ ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明によると、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、Ｈｈｉｐ１ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。そのような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48:2659, 1988）及び van der Krol等（BioTechniques 6:958, 1988）に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の未熟終止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。そのような方法は、本発明に含まれている。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｈｈｉｐ１タンパク質の発現を阻止するのに用いられ、それらＨｈｉｐ１タンパク質は、哺乳動物での癌の誘導を担い得る。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、国際公開９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドを更に含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（つまり、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
アンチセンス結合の好適な遺伝子内部位には、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始／開始コドン（５'-ＡＵＧ／５'-ＡＴＧ）又は終結／停止コドン（５'-ＵＡＡ、５'-ＵＡＧ及び５-ＵＧＡ／５'-ＴＡＡ、５'-ＴＡＧ及び５'-ＴＧＡ）を含む領域が含まれる。これらの領域は翻訳開始又は終結コドンから何れかの方向（つまり５'又は３'）に約２５から約５０の近接ヌクレオチドを包含するｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を意味する。アンチセンス結合のための他の好適な領域には、イントロン；エキソン；イントロン-エキソン接合部；翻訳開始コドンと翻訳終結コドンの間の領域であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は「コード領域」；５'-５'トリホスフェート結合を介してｍＲＮＡの５'−最末端残基に結合したＮ７-メチル化グアノシン残基を含み、５'キャップ構造自体と同様にキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むｍＲＮＡの５'キャップ；翻訳開始コドンから５'方向のｍＲＮＡの部分で、ｍＲＮＡ又は遺伝子上の対応するヌクレオチドの翻訳開始コドンと５'キャップ部位の間のヌクレオチドを含む５'の未翻訳領域（５'ＵＴＲ）；及び翻訳終結コドンから３'方向のｍＲＮＡの部分で、ｍＲＮＡ又は遺伝子上の対応するヌクレオチドの３'末端と翻訳停止コドンの間のヌクレオチドを含む、３'未翻訳領域（３'ＵＴＲ）が含まれる。
Ｈｈｉｐ１タンパク質の発現を阻害するのに有用な好適なアンチセンス化合物の特定の例には、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには骨格にリン原子を保持しているものと骨格にリン原子を有していないものが含まれる。この明細書の目的のために、また当該分野でしばしば引用されるように、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドはまたオリゴヌクレオシドであると考えることができる。好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオネート、キラルホスホロチオネート、ホスホロジチオネート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネートで、３'-アルキレンホスホネート、５'-アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むもの、ホスフィネート、ホスホルアミデートで、３'-アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むもの、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノ-ホスフェートで通常の３'-５'結合を持つもの、これらの２'-５'結合類似体、及び一又は複数のヌクレオチド間結合が３'から３'、５'から５'又は２'から２'結合である逆転された極性を持つものが含まれる。逆転した極性を持つ好適なオリゴヌクレオチドは単一の３'から３'結合を最も３'側のヌクレオチド間結合、つまり、非塩基性(abasic)でありうる単一の逆転ヌクレオシド残基（核酸塩基がないか、又はその代わりにヒドロキシル基を有する）を含む。様々な塩、混合された塩及び遊離の酸形態がまた含まれる。リン含有結合の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許３６８７８０８；４４６９８６３；４４７６３０１；５０２３２４３；５１７７１９６；５１８８８９７；５２６４４２３；５２７６０１９；５２７８３０２；５２８６７１７；５３２１１３１；５３９９６７６；５４０５９３９；５４５３４９６；５４５５２３３；５４６６６７７；５４７６９２５；５５１９１２６；５５３６８２１；５５４１３０６；５５５０１１１；５５６３２５３；５５７１７９９；５５８７３６１；５１９４５９９；５５６５５５５；５５２７８９９；５７２１２１８；５６７２６９７及び５６２５０５０が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
リン原子をそこに含まない好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格は短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は一又は複数の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。このようなオリゴヌクレオチドの調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許５０３４５０６；５１６６３１５；５１８５４４４；５２１４１３４；５２１６１４１；５２３５０３３；５２６４５６２；５２６４５６４；５４０５９３８；５４３４２５７；５４６６６７７；５４７０９６７；５４８９６７７；５５４１３０７；５５６１２２５；５５９６０８６；５６０２２４０；５６１０２８９；５６０２２４０；５６０８０４６；５６１０２８９；５６１８７０４；５６２３０７０；５６６３３１２；５６３３３６０；５６７７４３７；５７９２６０８；５６４６２６９及び５６７７４３９が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
他の好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、糖とヌクレオシド間結合の双方、つまりヌクレオチド単位の骨格が新規な基と置換される。ベース単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。一つのそのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を持つことが示されているオリゴヌクレオチド擬態体はペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置き換えられている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許５５３９０８２；５７１４３３１；及び５７１９２６２が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。ＰＮＡ化合物の更なる教示はNielsen等, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロチオネート骨格及び／又はヘテロ原子骨格、特に-ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｏ-ＣＨ２-［メチレン(メチルイミノ)又はＭＭＩ骨格として知られる］、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-、及び上で参照した米国特許第５４８９６７７号に記載された-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-ＣＨ２-［ここで天然ホスホジエステル骨格は-Ｏ-Ｐ-Ｏ-ＣＨ２-と表される］及び上で参照された米国特許第５６０２２４０号のアミド骨格を含む。また好ましいものは上で参照した米国特許第５０３４５０６号のモルホリノ骨格構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
修飾オリゴヌクレオチドはまた一又は複数の置換糖部分を含みうる。好適なオリゴヌクレオチドは２'位に次のものの一つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ-アルキル、Ｓ-アルキル、又はＮ-アルキル；Ｏ-アルケニル、Ｓ-アルケニル又はＮ-アルケニル；Ｏ-アルキニル、Ｓ-アルキニル又はＮ-アルキニル；又はＯ-アルキル-Ｏ-アルキルを含み、ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルでありうる。特に好ましいものはＯ[(ＣＨ２)ｎＯ]ｍＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、Ｏ(ＣＨ２)ｎＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＮＨ２、及びＯ(ＣＨ２)ｎＯＮ[(ＣＨ２)ｎＣＨ３]２であり、ここでｎ及びｍは１から約１０である。他の好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは２'位に次のものの一つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ-アルカリル又はＯ-アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬理的性質を改善する基、及び同様な性質を持つ他の置換基。好適な修飾は２'-メトキシエトキシ(２'-Ｏ-(２-メトキシエチル)又は２'-ＭＯＥとしても知られている２'-Ｏ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３)（Martin等, Helv. Chim. Acta., 1995, 78, 486-504）、つまりアルコキシアルコキシ基を含む。更に好適な修飾は、以下の実施例に記載されているように２'-ジメチルアミノオキシエトキシ、つまり２'-ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ(ＣＨ２)２ＯＮ(ＣＨ３)２基、及び２'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（２'-Ｏ-ジメチルアミノエトキシエチル又は２'-ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、つまり２'-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ２)を含む。
更に好適な修飾は、２'-ヒドロキシル基が糖環の３'又は４'炭素原子に結合され二環糖部分を形成する固定核酸(Locked Nucleic Acids: ＬＮＡｓ)を含む。結合は好ましくはｎが１又は２である２'酸素原子と４'炭素原子を架橋するメチレン（-ＣＨ２-）ｎ基である。ＬＮＡｓ及びその製造方法は国際公開９８／３９３５２及び国際公開９９／１４２２６に記載されている。
他の好適な修飾は２'-メトキシ(２'-Ｏ-ＣＨ３)、２'-アミノプロポキシ(２'-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２)、２'-アリル(２'-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)、２'-Ｏ-アリル(２'-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)及び２'-フルオロ(２'-Ｆ)を含む。２'-修飾はアラビノ（上）位置又はリボ（下）位置においてでありうる。好適な２'-アラビノ修飾は２'-Ｆである。同様の修飾はまたオリゴヌクレオチドの他の位置、特に３'末端ヌクレオチドの糖の３'位又は２'−５'結合オリゴヌクレオチド及び５'末端ヌクレオチドの５'位になすことができる。オリゴヌクレオチドはまたペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬態体を有しうる。そのような修飾糖構造の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許４９８１９５７；５１１８８００；５３１９０８０；５３５９０４４；５３９３８７８；５４４６１３７；５４６６７８６；５５１４７８５；５５１９１３４；５５６７８１１；５５７６４２７；５５９１７２２；５５９７９０９；５６１０３００；５６２７０５３；５６３９８７３；５６４６２６５；５６５８８７３；５６７０６３３；５７９２７４７；及び５７００９２０が含まれ、その各々は出典明示により全体がここに取り込まれる。
オリゴヌクレオチドにはまた核酸塩基（当該分野ではしばしば単に「塩基」と称される）の修飾又は置換が含まれうる。ここで使用される場合、「未修飾の」又は「天然の」核酸塩基にはプリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基、例えば５-メチルシトシン（５-me-Ｃ）、５-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２-アミノアデニン、６-メチル及び他のアデニン及びグアニンのアルキル誘導体、２-プロピル及び他のアデニン及びグアニンのアルキル誘導体、２-チオウラシル、２-チオチミン及び２-チオシトシン、５-ハロウラシル及びシトシン、５-プロポニル（-Ｃ≡Ｃ-ＣＨ３又はＣＨ２-Ｃ≡ＣＨ）ウラシル及びシトシン及び他のピリミジン塩基のアルキル誘導体、６-アゾウラシル、シトシン及びチミン、５-ウラシル（プソイドウラシル）、４-チオウラシル、８-ハロ、８-アミノ、８-チオール、８-チオアルキル、８-ヒドロキシル及び他の８-置換アデニン類及びグアニン類、５-ハロ、特に５-ブロモ、５-トリフルオロメチル及び他の５-置換ウラシル類及びシトシン類、７-メチルグアニン及び７-メチルアデニン、２-Ｆ-アデニン、２-アミノ-アデニン、８-アザグアニン及び８-アザアデニン、７-デアザグアニン及び７-デアザアデニン及び３-デアザグアニン及び３-デアザアデニンが含まれる。更なる修飾核酸塩基には、三環系ピリミジン類、例えばフェノキサジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾキサジン-２(３Ｈ)-オン)、フェノチアジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾチアジン-２(３Ｈ)-オン)、Ｇ-クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば９-(２-アミノエトキシ)-Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾキサジン-２(３Ｈ)-オン）、カルバゾールシチジン(２Ｈ-ピリミド[４,５-ｂ]インドール-２-オン)、ピリドインドールシチジン(Ｈ-ピリド[３',２'：４,５]ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-２-オン)が含まれる。修飾核酸塩基にはまたプリン又はピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられているもの、例えば７-デアザ-アデニン、７-デアザグアノシン、２-アミノピリジン及び２-ピリドンが含まれうる。更なる核酸塩基には米国特許第３６８７８０８号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, ８５８-８５９頁, Kroschwitz, J.I.編 John Wiley ＆ Sons, 1990に開示されているもの、及びEnglisch等, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30,613に開示されているものが含まれる。これらの核酸塩基のある種のものは本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらには、５-置換ピリミジン、６-アザピリミジン及びＮ-２、Ｎ-６及びＯ-６置換プリンで、２-アミノプロピルアデニン、５-プロピニルウラシル及び５-プロピニルシトシンを含むものが含まれる。５-メチルシトシン置換は０．６−１．２℃だけ核酸二重安定性を増大させることが知られており（Sanghvi等, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278）、より詳細には２'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合には、好適な塩基置換である。修飾核酸塩基の製造を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許３６８７８０８；並びに米国特許４８４５２０５；５１３０３０２；５１３４０６６；５１７５２７３；５３６７０６６；５４３２２７２；５４５７１８７；５４５９２５５；５４８４９０８；５５０２１７７；５５２５７１１；５５５２５４０；５５８７４６９；５５９４１２１；５５９６０９１；５６１４６１７；５６４５９８５；５８３０６５３；５７６３５８８；６００５０９６；５６８１９４１及び５７５０６９２が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを亢進する一又は複数の部分又はコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に結合させる。本発明の化合物は第１級又は第２級ヒドロキシル基のような官能基に共有結合したコンジュゲート基を含みうる。本発明のコンジュゲート基には、介入物（インターカレーター）、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬理的性質を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態学的性質を増強する基が含まれる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、カチオン脂質、リン脂質、カチオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が含まれる。この発明の文脈における薬理学的性質を増強する基には、オリゴマー取り込みを改善し、分解に対するオリゴマーの耐性を亢進し、及び／又はＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを補強する基が含まれる。この発明の文脈における薬物動態学的性質を増強する基には、オリゴマー取り込み、分散、代謝又は排出を改善する基が含まれる。コンジュゲート部分には限定されるものではないが、脂質分子、例えばコレステロール部分（Letsinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸（Manoharan等, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1063）、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan等, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660-306-309; Manoharan等, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser等, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Saison-Behmoaras等, EMBOJ., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov等, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk等, Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチル-アンモニウム１,２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-rac-グリセロ-３-Ｈ-ホスホナート（Manoharan等, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea等, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Manoharan等, Nucleosides ＆ Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、又はアダマンタン酢酸（Manoharan等、Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra等, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた活性な薬物物質、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(Ｓ)-(＋)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２,３,５-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤又は抗生物質にコンジュゲートすることができる。オリゴヌクレオチド-薬剤コンジュゲート及びその製造方法は米国特許４８２８９７９；４９４８８８２；５２１８１０５；５５２５４６５；５５４１３１３；５５４５７３０；５５５２５３８；５５７８７１７；５５８０７３１；５５８０７３１；５５９１５８４；５１０９１２４；５１１８８０２；５１３８０４５；５４１４０７７；５４８６６０３；５５１２４３９；５５７８７１８；５６０８０４６；４５８７０４４；４６０５７３５；４６６７０２５；４７６２７７９；４７８９７３７；４８２４９４１；４８３５２６３；４８７６３３５；４９０４５８２；４９５８０１３；５０８２８３０；５１１２９６３；５２４１１３６；５０８２８３０；５１１２９６３；５２１４１３６；５２４５０２２；５２５４４６９；５２５８５０６；５２６２５３６；５２７２２５０；５２９２８７３；５３１７０９８；５３７１２４１；５３９１７２３；５４１６２０３；５４５１４６３；５５１０４７５；５５１２６６７；５５１４７８５；５５６５５５２；５５６７８１０；５５７４１４２；５５８５４８１；５５８７３７１；５５９５７２６；５５９７６９６；５５９９９２３；５５９９９２８；５６８８９４１及び６６５６７３０に記載され、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
与えられた化合物の全ての位置を一様に修飾する必要はなく、実際、一を超える上述の修飾を単一化合物中に又はオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドにさえ導入することができる。本発明はまたキメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。本発明の文脈における「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」は、それぞれが少なくとも一のモノマー単位、つまりオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドからなる２以上の化学的に区別される領域を含むアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的にはオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する増大した耐性、増大した細胞性取り込み、及び／又は標的核酸に対する増大した結合親和性を付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも一の領域を含む。オリゴヌクレオチドの更なる領域はＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブロッドを切断可能な酵素の基質となりうる。例を挙げると、ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。故に、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の開裂を生じ、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効果を大きく向上させる。従って、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオネートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、より短いオリゴヌクレオチドで同等の結果をしばしば得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物は上述の二以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド擬態体の複合構造体として形成されてもよい。好適なキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性を付与するために３'末端に少なくとも一の２'修飾糖（好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３）とＲＮアーゼＨ活性を付与するために少なくとも４の隣接した２'-Ｈ糖を持つ領域を含む。このような化合物はまた当該分野においてハイブリッド又はギャプマー(gapmers)とも呼ばれている。好適なギャプマーは少なくとも４の隣接した２'-H糖を持つ少なくとも一の領域で分離した３'末端と５'末端２'修飾糖（好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３）の領域を持ち、好ましくはホスホロチオネート骨格結合を含む。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第５０１３８３０；５１４９７９７；５２２０００７；５２５６７７５；５３６６８７８；５４０３７１１；５４９１１３３；５５６５３５０；５６２３０６５；５６５２３５５；５６５２３５６；及び５７００９２２が含まれ、これらのそれぞれが出典明示によりここに取り込まれる。
本発明において使用されるアンチセンス化合物は固相合成のよく知られた技術によって簡便かつ常套的に製造することができる。そのような合成のための装置は、例えばApplied Biosystems (Foster City, Calif.)を含む幾つかのメーカーによって販売されている。当該分野で知られているそのような合成のための任意の他の手段を付加的に又は別に使用してもよい。オリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオネート及びアルキル化誘導体を調製するために類似の技術を使用することはよく知られている。本発明の化合物は、また、取り込み、分散及び／又は吸収を補助するための他の分子、分子構造又は化合物混合物、例えばリポソーム、レセプター標的分子、経口、直腸、局所適用又は他の製剤と、混合、カプセル化、コンジュゲート又はその他、組み合わされてもよい。そのような取り込み、分散及び／又は吸収を補助する製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第５１０８９２１；５３５４８４４；５４１６０１６；５４５９１２７；５５２１２９１；５５４３１５８；５５４７９３２；５５８３０２０；５５９１７２１；４４２６３３０；４５３４８９９；５０１３５５６；５１０８９２１；５２１３８０４；５２２７１７０；５２６４２２１；５３５６６３３；５３９５６１９；５４１６０１６；５４１７９７８；５４６２８５４；５４６９８５４；５５１２２９５；５５２７５２８；５５３４２５９；５５４３１５２；５５５６９４８；５５８０５７５；及び５５９５７５６が含まれ、これらのそれぞれが出典明示によりここに取り込まれる。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、国際公開９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（国際公開９０／１３６４１参照）を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、通常は少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、参照ヌクレオチド配列長にその参照長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
また、プローブをＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＨｈｉｐ１コード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、Ｈｈｉｐ１をコードするヌクレオチド配列は、そのＨｈｉｐ１をコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
Ｈｈｉｐ１のコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、Ｈｈｉｐ１がレセプターである場合）、Ｈｈｉｐ１は、結合相互作用に関わっている他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイに使用することができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。また、このような結合性相互作用に含まれるタンパク質は、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＨｈｉｐ１は関連するリガンドの単離に使用できる。スクリーニングアッセイは、天然Ｈｈｉｐ１又はＨｈｉｐ１のレセプターの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すために設計してよい。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングを施すことができるアッセイを含み、それらアッセイを特に小分子薬剤候補を同定することに適したものにする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く特徴付けられているタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
また、Ｈｈｉｐ１又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施態様では、Ｈｈｉｐ１をコードするｃＤＮＡは、Ｈｈｉｐ１をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、Ｈｈｉｐ１をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４７３６８６６号や第４８７０００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＨｈｉｐ１β１２導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＨｈｉｐ１をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＨｈｉｐ１をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。
あるいは、Ｈｈｉｐ１の非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＨｈｉｐ１をコードする変更ゲノムＤＮＡと、Ｈｈｉｐ１をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、Ｈｈｉｐ１をコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＨｈｉｐ１「ノックアウト」動物を構築するために使用できる。例えば、Ｈｈｉｐ１をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、Ｈｈｉｐ１をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。Ｈｈｉｐ１をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失させたり、組み込みをモニターするために使用する選択性マーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターを胚幹細胞株に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編 (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照のこと］。その後、キメラ胚を適切な偽妊娠の雌性乳母動物に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、Ｈｈｉｐ１ポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
また、Ｈｈｉｐ１ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞内に導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
生細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介トランスフェクションである（Dzau等, Trends in Biotechnology 11, 205-210(1993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシス技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
ここに記載したＨｈｉｐ１ポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、目下のところ新規な染色体マーカーの同定の必要である。本発明の各Ｈｈｉｐ１核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また、本発明のＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングの診断に使用でき、Ｈｈｉｐ１ポリペプチドは、その他の組織と比較して１つの組織において、好ましくは同じ組織型の正常組織に比較して疾患性組織において特異的に発現する。Ｈｈｉｐ１β１２核酸分子には、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
この発明は、Ｈｈｉｐ１ポリペプチド（Ｈｅｄｇｅｈｏｇアンタゴニスト）を模倣、又はＨｈｉｐ１ポリペプチド（アゴニスト）の効果を防ぐものを同定するための化合物をスクリーニングする方法を含む。アンタゴニスト薬候補に関するスクリーニングアッセイは、ここで同定された遺伝子によってコードされたＨｈｉｐ１ポリペプチドと結合又は複合化する、さもなければコードされているポリペプチドと他の細胞タンパク質の相互作用を妨害する化合物、例えば、細胞からのＨｈｉｐ１ポリペプチドの発現を阻害するものを含む化合物を同定するように設計されている。そのようなスクリーニングアッセイには、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングを施すことができるアッセイが含まれ、それらアッセイを特に小分子薬剤候補の同定に適したものにする。
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、そして細胞ベースアッセイを含む、当該分野で良く特徴付けられている種々の形式で行うことができる。
アンタゴニストに関する全てのアッセイは、薬候補をここで同定された核酸によってコードされているＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドと、これら両成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間にわたって接触させることを必要とする点で共通である。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された核酸にコードされるＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド又は薬候補が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体の使用によって検出できる。
候補化合物が相互作用するがここに同定した核酸によってコードされる特定のＨｈｉｐ１ポリペプチドと結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーのカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans Proc.Natl. Acad. Sci. USA,89:5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London),340,:245-246(1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定されたＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞内又は細胞外成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で調製される。候補化合物の結合阻害能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドを、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともに細胞に添加してもよく、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド存在下で対象とする活性を阻害する当該化合物の能力が、当該化合物がＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド及び潜在的アンタゴニストを、膜結合Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドレセプター又は組換えレセプターと、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパニング及びＦＡＣＳソーティングにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは発現クローニングが用いられ、そこではポリアデニル化ＲＮＡがＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又は他のＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドに反応性でない細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を、標識したＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドへ曝露する。Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフ分析を施す。ポジティブプールを同定し、対話型サブプール化及び再スクリーニング法を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＨｈｉｐ１ポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。
他の潜在的なＨｈｉｐ１ポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトであり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、三重螺旋形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでのＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドをコードする核酸は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重螺旋−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979)；Cooney等, Science, 241: 456 (1988)；Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＨｈｉｐ１ポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてｍＲＮＡ分子のＨｈｉｐ１ポリペプチドへの翻訳を阻止する（Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。また上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、Ｈｈｉｐ１ポリペプチドの産生を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
Ｈｈｉｐ１の潜在的アンタゴニストは、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２領域の活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＨｈｉｐ１ポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達の潜在的なアゴニストには、Ｈｉｐ／Ｈｅｄｇｅｈｏｇ結合の活性部位に結合し、それによってＨｈｉｐ１ポリペプチドの正常な生物学的な活性をブロックし、Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達の阻害を防止する小分子が含まれる。小分子の例には、小ペプチドないしペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチヂル有機ないし無機化合物が含まれるが、これらには限定されない。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的開裂により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、国際公開 ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスティン(Hoogsteen)塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのかなり大きな伸張を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のＰＣＴ公報、国際公開９７／３３５５１を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
単離されたＨｈｉｐ１β１２ポリペプチド-コード化核酸は、ここに記載されているような当該分野で良く知られている技術を用いて、組み換え的にＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドを生成するために、ここで用いることが可能である。次に、生成されたＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドは、ここに記載されているような当該分野で良く知られている技術を用いて、抗Ｈｈｉｐ１抗体を生成するために用いることが可能である。
ここで同定されるＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
Ｈｈｉｐ１ポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に搬送するために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害性薬、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤のようなその機能を高める薬剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
実施例において参照される市販の試薬は、特に明記しない限り製造業者の指示に従って用いた。
実施例１ Ｈｈｉｐ１β１２変異体のクローニングと発現
Ａ．ヒトＨｉｐの配列分析
ドメインフォールドおよび境界を示すのを助ける基本的な構造パターンを識別するために、繰り返しＰＳＩＢＬＡＳＴ実行(Schaffer et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29: 2994-3005によってＧｅｎｂａｎｋから入手した配列から、MUSCLE (Edgar, R.C. (2004) Nucleic Acids Res. 32: 1792-1797)によって進化論的に多様なアラインメントのＨｈｉｐ１ホモログを構築した。次にアラインした配列の二次構造予想をＰＳＩＰＲＥＤ(McGuffin et al. (2000) Bioinformatics 16:404-405)によって行った。配列と構造のデータベースの両方を目的としたＨｈｉｐ１配列プロファイルとＨＭＭは、Ｎ末端Ｃｙｓリッチモジュール(予測されるαヘリックス中に豊富)と推定Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメインとの間、同様に、Ｈｈｉｐ１の中央のβ鎖リッチセクションとβ-プロペラドメインとの間の連結を識別することができる。これらの関係は、ＨＨＰｒｅｄ (Soding, J. (2005) Bioinformatics 21:951-960)のようなフォールド認識プログラム(配列と構造の両方のレベルでのプロファイル−プロファイル一致に依存)からの回帰によって裏付けられた。Ｈｈｉｐ１-プロペラドメインの比較モデルは、MODELLER (Sali and Blundell, 1993) J. Mol. Biol. 234:779-815にて構築した。修飾部位残基の付随する予測によって、膜貫通ヘリックスよりむしろＨｈｉｐ１のＣ末端ＧＰＩ−アンカー配列の存在が、ビッグ-ＰＩサーバ(mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server) (Eisenhaber et al. (1999) J. Mol. Biol. 292:741-758)によって検出された。
高感度構造予測およびフォールド認識ツールを用いたＨｈｉｐ１β１２ＥＣＤ配列の計算分析により、推定Ｆｒｉｚｚｌｅｄ(Ｆｚ)フォールドを有するシステインリッチＮ末端ドメイン、中央の６ブレードβプロペラおよび２つのＣ末端ＥＧＦリピートといった４つの異なる球状ドメインの存在が明らかになった(図３Ａ)。さらに、Ｈｈｉｐ１について既に予測されている単一Ｃ末端膜貫通ヘリックス(Chuang and McMahon, 1999)の代わりに、我々は、推定グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)-アンカー付着部位(Eisenhaber et al. (1999) J. Mol. Biol. 292:741-758)と一致したモチーフを発見する。
ヒトＨｈｉｐ１をコードするｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列のアラインメントを図１Ａ−Ｃに示す。図１Ｂは、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ結合に重要である残基と推定プロペラ領域のＬ２ループ(影を付けて示す)を示す。これらには、Ｄ３７８、Ｅ３８０、Ｅ３８１、Ｍ３８２、Ｄ３８３及びＤ３８７が含まれる。アスタリスク(＊)を付した残基は、Ｓｈｈ結合に基本的に重要であるアミノ酸を示す。矢印(↑)を付した残基は、Ｓｈｈ結合に僅か又は中程度に重要であるアミノ酸を示す。
最初のアミノ酸配列を、推定領域に一般の用語でさらに記載してよい。これを図２Ａに示す。図は、配列番号：２のアミノ酸１−１９からの推定リーダー配列(配列番号：３)；配列番号：２のアミノ酸２０−１９２からの推定ｆｒｉｚｚｅｄドメイン(配列番号：４)；配列番号：２のアミノ酸１８６−１９２間の推定リンカー領域(配列番号：５)；配列番号：２のアミノ酸１９３−６０７からの推定β-プロペラドメイン(配列番号：６)(アミノ酸３７６−３８８(影付きで示す)のＬ２ループ(配列番号：７)を含む)；配列番号：２のアミノ酸６０８−６３７からのＥＧＦ１ドメイン(配列番号：８)；配列番号：２のアミノ酸６３８−６６７からのＥＧＦ２ドメイン(配列番号：９)；そして、配列番号：２のアミノ酸６６８−７００からの推定ＧＰＩシグナル配列(配列番号：１０)を示す。これらのドメインの絶対的な縁は、１、２、３、４又はさらに５のアミノ酸を含む２、３のアミノ酸によって置換されてよい。図２Ａに示す描写は参考のために示す。
また、これらのドメインを、本明細書中に示す試験のために生産されたコンストラクトに関して検討する。コンストラクトＨｈｉｐ１ＥＣＤ(Ｈｈｉｐ１β１２細胞外ドメイン)(配列番号：１１)は、配列番号：２の残基２０−６６７を包含し、コンストラクトＨｈｉｐ１Ｆｚβ(Ｆｚ-β-プロペラ)(配列番号：１５)は配列番号：２の残基２０−６０７を包含し、コンストラクトＨｈｉｐ１Ｆｚ(Ｆｚ-ドメイン)(配列番号：１６)は、配列番号：２の残基２０−１８９を包含し、コンストラクトＨｉｐβ１２(β-プロペラ-ＥＧＦ１-ＥＧＦ２)(配列番号：１２)は、配列番号：２の残基１９３−６６７を包含し、コンストラクトＨｉｐβ１(β-プロペラ-ＥＧＦ１)(配列番号：１３)は、配列番号：２の残基１９３−６３７を包含し、コンストラクトＨｉｐβ(β-プロペラ)(配列番号：１４)は配列番号：２の残基１９３−６０７を包含する。
ヒトＨｈｉｐ１β１２(配列番号：７)のＬ２ループの分析は、ヒトＰｔｃｈ(配列番号：１７)、マウスＰｔｃｈ(配列番号：１８)、ヒヨコＰｔｃｈ(配列番号：１９)、ゼブラフィッシュＰｔｃｈ(配列番号：２０)、ショウジョウバエＰｔｃｈ(配列番号：２１)、虫Ｐｔｃｈ(配列番号：２２)、ヒトＰｔｃｈ２(配列番号：２３)およびマウスＰｔｃｈ２(配列番号：２４)の類似の領域に相同性を示す。これらの配列は図５Ｂに示される。
Ｂ．昆虫細胞からのＨｈｉｐ１β１２変異体の発現および精製
Ｓｈｈとの相互作用を媒介し、細胞シグナル伝達を阻害するドメインを同定するために、Ｈｈｉｐ１β１２の完全長および切断型を、昆虫細胞において発現させた。
よって、配列番号：２に示すアミノ酸と関連して、Ｈ末端Ｈｉｓ６タグ付加Ｈｈｉｐ１ＥＣＤ(残基２０−６６７)、Ｈｉｐβ１２(残基１９３−６６７)、Ｈｉｐβ１(残基１９３−６３７)及びＣ末端Ｈｉｓ６タグを含むＨｉｐβ(残基１９３−６０７)を、ハチミツのメリチン分泌シグナルを含むゲートウェイベクターｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ(Invitrogen)にクローニングし、Ｂａｃ-ｔｏ-Ｂａｃシステム(Invitrogen)により組み換えバキュロウイルスを生成した。ＥＳＦ９２１培地(Expression Systems)のＴｎｉ昆虫細胞(１ｍｌにつき１×１０６)に、３のＭ.Ｏ.Ｉ.の組み換えバキュロウイルスを感染させた。７２時間インキュベートした後、Ｈｈｉｐ１β１２タンパク質をＮｉ-親和性(Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフロー、Qiagen)とサイズ排斥クロマトグラフィによって培地から精製した。セレノメチオニン標識Ｈｉｐβ１２(Ｓｅ-Ｍｅｔ Ｈｉｐβ１２)の発現および精製は、ＥＳＦ９２１メチオニンフリー培地(Expression Systems)を使用して、上記の通りに行った。培地は、ウイルス感染の１２および３６時間後に、１００ ｍｇ／Ｌのセレノメチオニン(Sigma Aldrich)を添加した。タンパク質は均一になるまで精製した。推定β-プロペラドメイン単独(Ｈｉｐβ)(配列番号：６)のみを発現するＨｈｉｐ１β１２コンストラクトは発現しなかった。
Ｃ．ヒトＳｈｈのクローニングおよび発現
ヒトＤｈｈ(残基２４−１９８)、Ｉｈｈ(残基２９−２０２)、ＳｈｈＮ-Ｃｙｓ(残基２４−１９７)、Ｓｈｈ(残基２５−１９７)およびＳｈｈ-Ｆｌａｇ(Ｃ末端Ｆｌａｇタグを有する残基２５−１９７)を、Ｎ末端Ｈｉｓ６-タグにて製造業者のプロトコールに従って、ｐＥＴ１０１／Ｄ-ＴＯＰＯ(Invitrogen)にクローニングした。Ｓｈｈコンストラクトは、１ｍＭのＩＰＴＧにて誘導した後、２５℃で２０時間、ＬＢ培地中のロゼッタ２大腸菌細胞(Novagen)において発現させた。１５Ｎ標識Ｓｈｈの発現のために、細胞を最少培地中で生育した。回収した細胞を溶解し、Ｎｉ-親和性及びサイズ排斥クロマトグラフィによって細胞質ゾル分画からＳｈｈを精製した。結晶化及びＮＭＲ研究のために、ＳｈｈをＰＢＳ中１ｍｇのＳｈｈにつき１０単位のトロンビン(Calbiochem)と共に２３℃で終夜インキュベートし、Ｈｉｓ６タグを欠くＳｈｈ(残基２９−１９７)を回収した。最後に、Ｓｈｈは、Ｍｏｎｏ Ｓ５／５ＧＬカラム(GE Healthcare)を使用して精製し、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．２中０〜１ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配によって溶出した。ＳｈｈＮ−Ｃｙｓのための精製バッファには、Ｎｉ-親和性クロマトグラフィの間に５ｍＭ β-メルカプトエタノール、サイズ排斥クロマトグラフィ及びカチオン交換クロマトグラフィの間に０．５ｍＭ ＤＴＴを含めた。ＳｈｈＮ-Ｃｙｓは、製造業者のプロトコールに従ってＥＺ-結合マレイミドＰＥＯ２-ビオチン(Pierce)とコンジュゲートし、ビオチン化ＳｈｈＮ−Ｃｙｓを得た。ＳｈｈＣ−Ｃｙｓは、製造業者のプロトコールに従って、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９マレイミド(Pierce)とコンジュゲートし、蛍光Ｓｈｈ(Ｓｈｈ６４９)を得た。発現したタンパク質を後述する実験に用いた。
実施例２：Ｈｈｉｐ１β１２変異体に結合するＨｅｄｇｅｈｏｇ
Ｈｈｉｐ１β１２断片とＨｈｉｐ１β１２変異体の結合動態を、Ｏｃｔｅｔ(Fortebio)にて１０ｍＭ ＥＤＴＡの有無の下でバイオ層インターフェロメトリーによって測定した。ストレプトアビジン高結合ＦＡバイオセンサは、ビオチン化ＳｈｈＮ−Ｃｙｓを含む動態バッファ(Fortebio)をロードした。ロードしたバイオセンサを洗浄し、１．２、１．０、０．８および０．６μＭの濃度のＨｈｉｐ１β１２タンパク質を含む動態バッファを含むウェルに移した。Ｈｈｉｐ１β１２の会合と解離は、それぞれ３０分間および２０分間測定した。動態パラメーター(Ｋｏｎ及びＫｏｆｆ)と親和性(ＫＤ)は、Ｏｃｔソフトウェアを用いてＨｈｉｐ１β１２とＳｈｈとの間の１：１結合モデルに基づいたデータの非線形フィットから算出した。複数の独立した測定を行った。
完全長Ｈｈｉｐ１ＥＣＤ、推定Ｆｚドメイン(Ｈｉｐβ１２)を欠く切断型、及びβ-プロペラとＥＧＦ１ドメイン(Ｈｉｐβ１)のみを含むＨｈｉｐ１β１２に結合するＳｈｈのＫＤ値は、バイオ層インターフェロメトリーによって測定したところそれぞれ、６７ｎＭ、２２０ｎＭ及び１５０ｎＭであった(表６)。また、競合体を使用したときの３つすべての哺乳類のホモログに対する結合を、ＥＬＩＳＡによって評価した(実施例３を参照)。
表６ Ｓｈｈに対するＨｈｉｐ１β１２変異体の結合動態。
Figure 2011524742
ａすべてのＨｈｉｐ１β１２アラニン変異体は、Ｈｈｉｐ１β１２コンストラクトにおいて作製した。
ｂn.d.は結合の検出がなかったことを表す。
ｃＨｈｉｐ１β１２のループ残基は以下の通りである：
実施例３：
Ａ．Ｇｌｉルシフェラーゼシグナル伝達同時培養アッセイ及びＨｉｐ−Ｆｃアッセイ
ＳｈｈのＮ末端及びＣ末端脂質修飾が欠如し、他の細胞性成分がないため、インビトロアッセイは細胞環境で生じるＨｉｐ−Ｓｈｈ相互作用を完全には繰り返さない場合がある。従って、Ｇｌｉルシフェラーゼレポーター遺伝子が安定に形質移入されたマウスＳ１２線維芽細胞（Frank-Kamenetsky等(2002) J. Biol. 1:10）と十分に脂質修飾されたＳｈｈを分泌するヒト結腸直腸腺癌ＨＴ２９細胞（Yauch等(2008) Nature 455:406）とからなる同時培養アッセイを使用して、Ｈｈｉｐ１β１２のどの細胞外ドメインが哺乳動物細胞におけるＳｈｈシグナル伝達の阻害を媒介するかを決定した。
簡潔に述べると、ルシフェラーゼレポーターに融合された８×Ｇｌｉ結合部位が安定に形質移入された１０Ｔ１／２線維芽細胞であるＳ１２細胞（Frank-Kamenetsky等(2002) J. Biol. 1:10）を、通常の増殖培地（ＨＧ−ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１％グルタミン）中で４８時間、白色の壁部と透明な底部を持つ９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３６１０）に１００００細胞／ウェルで蒔いた。２４時間後、培地を除去し、２００００細胞／ウェルでＳｈｈ産生ＨＴ２９細胞を蒔き、同時培養物を通常の培地で増殖させた。２４時間後、培地を０．５％の血清のＨＧ−ＤＭＥＭ±Ｈｈｉｐ１β１２断片に交換し、シグナル伝達を刺激するために更に２４時間インキュベートした。Ｇｌｉ−ルシフェラーゼ活性を、ＨＴＳ−Ｓｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅルシフェラーゼ検出キット（Perkin Elmer）を使用して測定した；複数のアッセイを、それぞれ３通り、実施した。データを４−パラメータシグモイド式にフィットさせ、それからＩＣ５０を、カレイダグラフ（Synergy Software）を使用して誘導した。結果を図３Ｂに示す。
Ｈｈｉｐ１ＥＣＤ及びＨｈｉｐ１β１２はＨｈシグナル伝達の等しく強力な阻害剤であり、それぞれ５．３ｎＭ及び５．０ｎＭのＩＣ５０値を有するが、Ｈｉｐβ１はＨｈｉｐ１ＥＣＤより約４倍だけ高い２０．３ｎＭのＩＣ５０を有していた（図３Ｂ）。
推定Ｆｚドメイン（Ｈｈｉｐ１Ｆｚ）がこのアッセイにおける阻害には不要であることを確認すべく、我々はＦｃ融合タンパク質（Ｈｈｉｐ１Ｆｚ−Ｆｃ）としてそれを発現させ精製した。簡潔に述べると、ヒトＨｈｉｐ１β１２（２０−１９３）を、Ｎ末端ｇＤ分泌シグナル（ＭＧＧＡＡＡＲＬＧＡＶＩＬＦＶＶＩＶＧＬＨＧＶＲＧ）（配列番号：４１）及びＣ末端ヒトＦｃ断片（ＩｇＧ１）を持つ発現ベクターｐＲＫ５（Genentech）中にクローニングした。そのコンストラクトを、ＦｕＧＥＮＥ６（Roche）を使用する一過性トランスフェクションによって２９３細胞中で発現させ、５日間のインキュベーション後に、プロテインＡ樹脂（GE Healthcare）と続くサイズ排除クロマトグラフィー（S-200カラム, GE Healthcare）を使用して精製した。上のデータと一致し、Ｆｃ融合コンストラクトは如何なる阻害活性も欠いていた（図３Ｂ）。総括すると、これらのデータは、３種全ての哺乳動物Ｈｅｄｇｅｈｏｇを結合し、その完全なアンタゴニスト効果を媒介するために必要とされるＨｈｉｐ１β１２ＥＣＤの最小領域がβプロペラ及びＥＧＦドメイン内に含まれており、ＥＧＦ２ドメインはそれ程重要ではない役割だけを果たしていることを明らかにしている。
Ｂ．ペプチド競合ＥＬＩＳＡ
競合を使用する３種全ての哺乳動物Ｈｈホモログへの結合をまたＥＬＩＳＡによって評価した。簡潔に述べると、９６ウェルＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Nalge Nunc International）を、４℃で一晩、５０ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍｌにて１００μｌのＨｈｉｐ１β１２で被覆した。プレート振盪機上で、プレートを、１００μＬのブロッキングバッファー（０．５％のＢＳＡ及び１５ＰＰＭのＰｒｏｃｌｉｎを含むＰＢＳ）を用いて室温で１時間ブロックした。ブロッキングバッファーを取り除き、１００μＬの最終容量で５ｎＭのビオチン化ＳｈｈＮ−Ｃｙｓを含むＤｈｈ、Ｉｈｈ、又はＳｈｈの何れかの連続希釈物（１０μＭで開始，１：４希釈）をウェルに加え、固定化Ｈｈｉｐ１への結合について競合させた。プレート振盪機上での室温で１時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．２，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．１％のＴｗｅｅｎ）で洗浄し、ブロッキングバッファー中で製造者のプロトコルに従ってストレプトアビジン−ＨＲＰ（Pierce）と共に１時間インキュベートした。その後、プレートを再び洗浄バッファーで洗浄し、溶液が淡青色に変わるまで１００μＬのＢＤ ＯｐｔＥＩＡ試薬ミックス（１：１比，BD Bioscience）と共にインキュベートした。ついで、１００μＬの酸（１ＭのＨ３ＰＯ３）を添加して反応を消光させ、４５０ｎｍ（ＯＤ４５０）での光学密度をＳｐｅｃｔｒａＭＡＸプレートリーダー（Molecular Devices）で測定した。ＯＤ４５０をＩｈｈ、Ｄｈｈ及びＳｈｈの濃度に対してプロットし、曲線のＩＣ５０を、カレイダグラフ（Synergy Software）を使用し、４−パラメータシグモイド式にフィットさせて３通り決定した。結果を図８Ａに示す。
Ｉｈｈ（ＩＣ５０＝８７ｎＭ）、Ｄｈｈ（ＩＣ５０＝４０ｎＭ）又はＳｈｈ（ＩＣ５０＝５３ｎＭ）に対するＨｉｐβ１２の親和性（図８Ａ）は、完全長Ｈｈｉｐ１について過去に発表されている結果（Chuang及びMcMahon (1999) Nature 397:617-621；Pathi, S.等(2001) Mech. Dev. 106:107-117）と一致している。
Ｃ．ＨｈｉｐによるＰｔｃｈ１へのＳｈｈ結合の競合
そのＣ末端がＤｙｌｉｇｈｔ６４９（Pierce）に結合しているＳｈｈ６４９（上記参照）を、様々なＨｈｉｐ又はコントロールタンパク質と共に氷上で１時間、０．３３又は１ｎＭでインキュベートした後、氷上で１時間、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中３％のＦＢＳ）中でＨＥＫ−２９３細胞（２９３）又は完全長ヒトＰａｔｃｈｅｄ−１を発現する２９３細胞（Ｐｔｃｈ１−２９３クローン１０）（Carpenter D.等(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13630-13634）と共にインキュベートした。ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄後、生存細胞（ヨウ化プロピジウム除外により選別）を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）を使用してＡＰＣチャネルでのフローサイトメトリーによって分析した。コントロールタンパク質は、Ｈｉｓ６−Ｓｈｈ、Ｈｉｓ６−Ｉｈｈ、ＨＧＦβ−Ｈｉｓ６３９、Ｈｈｉｐ１β１２−Ｆｃに対するヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールとしてのトラスツズマブ（Genentech社）及び抗Ｓｈｈ５Ｅ１Ｍａｂ３４に対するマウスＭａｂコントロールとしてのｍＩｇＧ１（分子プローブＺ２５１０５）を含んでいた。結果を図１４Ｃに示す。
Ｄ．５Ｅ１エピトープマッピング
アガロースビーズに結合した５Ｅ１をＳｈｈと共にインキュベートし、部分的にトリプシンで消化させた後、未消化のペプチドを溶離させ、過去に記載されているようにして（Kiselyov, A.S.等(2007) Expert Opin. Ther. Targets 11:1087-1101）、質量分析により同定した。これは、Ｓ１７７残基を包含する過去のデータ（Fuse N.等(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96:10992-10999；Pepinsky, R.B.等(2000) J. Biol. Chem. 5:154-156）と一致したペプチド１５８−１７８（図８ｂ）を明らかにした。エピトープは、Ｄｈｈに対する低親和性（下記参照）を説明するＳｈｈ／Ｉｈｈ及びＤｈｈ間で異なる残基を包含するＫ１７８のトリプシン切断部位を越えて延びているようである。
Ｅ．表面プラズモン共鳴法によるＳｈｈへの５Ｅ１の結合親和性
５Ｅ１へのヒトＳｈｈ（２５−１９７）、Ｄｈｈ、又はＩｈｈの親和性の決定を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００を使用する表面プラズモン共鳴法によって実施した。ＩｇＧ（８８２から９９１ＲＵ）をＣＭ５センサーチップ上の１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．８中に固定し、ＰＢＳＴ中のＳｈｈ（０．３−１０００ｎＭ）の様々な形態の連続３倍希釈物を３０μｌ／分の流量で注入した。各試料を４分結合時間及び１０分解離時間で分析した。各注入後、チップを、ｐＨ１．７の１０ｍＭのグリシンを使用して再生した。結合応答は、コントロールＩｇＧフローセル１を５Ｅ１フローセルから引くことによって修正した。ｋｏｎ及びｋｏｆｆの連立フィッティングの１：１のラングミュアモデルを動態解析に使用した。５Ｅ１はＳｈｈ及びＩｈｈに同様の親和性（〜３ｎＭ）をもって結合したが、Ｄｈｈに対しては有意に低い親和性であった。
実施例４：結晶化、データ収集及び構造解析
Ａ．結晶の形成と特徴付け
Ｓｈｈ結合及びシグナル伝達阻害に必須であるとＨｉｐβ１２ドメインを定めたので、我々は、Ｈｈｉｐ１及びＨｉｐ−Ｓｈｈ複合体の構造を決定することによってこの活性に対する分子的基礎を探求した。
ａｐｏＨｉｐβ１２の結晶を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．２及び３ＭのＮａＣｌのリザーバ溶液５００ｍｌにタンパク質試料（０．３−２μｌ）を配することにより、１９℃での非定型ハンギングドロップ蒸気拡散によって成長させた。矩形の結晶が４８時間以内に現れ、一週間成長させたところ、最も長い寸法が０．８ｍｍを越えた。最良の回折結晶（典型的には０．２５×０．２５×０．１０ｍｍ３）を２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）及び３ＭのＮａＣｌの２μｌの液滴に移し、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）及び５ＭのＮａＣｌの５００μｌリザーバ溶液に配した。１６−２４時間の脱水後、結晶を、液体窒素でのフラッシュ冷却前に２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、５ＭのＮａＣｌ中に３０秒間浸漬した。三波長Ｓｅ−ＭｅｔベースのＭＡＤをスタンフォードシンクロトロン放射線研究室（ＳＳＲＬ）９−２ビームラインに１００Ｋで集めた。結晶学的統計値を表７にまとめる。
異なった形態のａｐｏＨｉｐ１β１２結晶を、１．５μｌのリザーバ溶液（０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０．２Ｍの硫酸アンモニウム、２２−２４％のＰＥＧ４０００及び１−２％のジオキサン）とタンパク質の１．５μｌを組合わせることにより、１９℃でのハンギングドロップ蒸気拡散によって成長させた。結晶が一週間以内に現れ、７−１４日間でフルサイズまで成長した。液体窒素中でのフラッシュ冷却の前に、結晶を、段階的な形（５％、１０％、１５％及び２０％のｖ／ｖグリセロール最終濃度）でグリセロールを補充したリザーバ溶液中で凍結保護した。そのままのデータをＡｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）５．０．２ビームラインに１００Ｋで集めた。
Ｈｉｐβ１２−Ｓｈｈ複合体の最初の結晶は、１μｌのタンパク質試料と１μｌのリザーバ溶液（０．１Ｍのビス−トリスプロパン（ｐＨ７．０）及び２．８−３．０Ｍのギ酸ナトリウム）を組合わせることにより１９℃でのハンギングドロップ蒸気拡散によって成長させた。それらは４日後に現れ、０．３ｍｍを越える最長寸法まで大きく成長した。これらの結晶は非常に貧弱な品質であり、一連のマイクロシーディング及びマクロシーディング工程がデータ収集に適した結晶には必要であった。前もって平衡にした（４８時間）タンパク質液滴中への連続したストリークシーディングは、マクロシーディングが実行可能なように結晶品質を改善した。約０．０２ｍｍの寸法の小さい結晶を洗浄し、０．１Ｍのビス−トリスプロパン（ｐＨ７．０）及び２．２Ｍのギ酸ナトリウムを含むリザーバ溶液の前もって平衡化した液滴中に移した。ゆっくりとした成長が結晶をＸ線回折に適したものにするのに必須であるので、ＮｅＸｔａｌねじ口２４ウェルプレートを使用して複雑で長い多段階手順を実行した。典型的には、結晶を４−７日かけてリザーバ溶液でインキュベートした後、ギ酸濃度を０．１Ｍだけ上昇させた条件に移した。このプロセスを、０．１Ｍびビス−トリスプロパン（ｐＨ７．０）及び２．５Ｍのギ酸ナトリウムを含む最終リザーバを用いて４回繰り返した。０．０９×０．０９×０．０５ｍｍ３の寸法の最良の品質の結晶が４−６週間の期間で製造された。異方性の生データをＳＳＲＬ１１−１ビームラインで収集した。
全てのデータセットを、ＨＫＬ２０００（Otwinowski及びMinor (1997) Methods Enzymol. 276: 307-325）を使用して処理した。９つのセレン部位が見つけられ、Ｐ３１２１空間群において結晶化されたａｐｏＨｉｐβ１２に対して相の精密化をａｕｔｏＳＨＡＲＰで実施した（Bricogne, G.等(2003) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 59: 2023-30）。６６％の溶媒含有量での溶媒平坦化が実験マップの品質を有意に改善した。実験的電子密度へのマニュアルでの原子モデル構築はＣｏｏｔ（Emsley及びCowtan (2004) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60: 2126-2132）においてなされている。Ｃ２２２１空間群におけるａｐｏＨｈｉｐ１β１２及びＨｈｉｐ１β１２−Ｓｈｈ複合体の構造は、Ｈｈｉｐ１β１２及びＳｈｈ結晶構造に対する探索モデルとしてＰ３１２１結晶形態の精密化座標を使用し（ＰＤＢコード１ＶＨＨ）、Ｐｈａｓｅｒ（McCoy, A. J.等(2005) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61: 458-464）での分子置換によって解析した。全構造の精密化は、Ｒｅｆｍａｃ（Winn, M. D.等(2001) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 57: 122-133）を用いて行った。結晶学的統計値を表７にまとめる。
精製されたＨｈｉｐ１β１２は三方晶（空間群Ｐ３１２１）及び斜方晶（空間群Ｃ２２２１）系の双方で結晶化し、最終モデルはそれぞれ３．１Å及び２．９Åの分解能まで精密化した（構造統計値を表７にまとめる）。ａｐｏＨｈｉｐ１β１２構造に対する次の考察は、それによって強調される二形態間のあらゆる差異と共に三方晶からの観察結果に基づいている。
Ｈｉｐβ１２及びＳｈｈ間の高親和性により、１：１の化学量論の安定な複合体の単離が可能になり、サイズ排除クロマトグラフィーで単離した。驚いたことに、複合体は略同一の単位胞パラメータを持つａｐｏ結晶のものと同じ三方晶空間群で結晶化し、３．０Åの分解能で回折した（表７）。非対称胞は、ａｐｏ形態と同じ配向の二つのＨｈｉｐ１β１２分子と、１：１のヘテロ二量体複合体をそれぞれがつくり出す二つのＳｈｈ分子を含んでいた。しかしながら、Ｓｈｈ分子の一つの密度は、安定化結晶充填相互作用がないため極めて乏しく；このＳｈｈのコピーは最終モデルには含めなかった。
表７ 結晶学的統計
Figure 2011524742
ａ括弧内の数は最も高い分解能シェルを示す。
ｂＲｓｙｍ＝Σ｜Ｉ−＜Ｉ＞｜／ΣＩ。＜Ｉ＞は独特の反射の対称関連観測の平均強度である。
ｃＲ＝Σ｜Ｆｏ−Ｆｃ｜／ΣＦｏ。
ｄラマチャンドランプロットの最良の領域、追加的に許容される領域、寛大に許容される領域、許容されない領域中の残基の割合。
我々の結晶構造中に存在するＨｈｉｐ１β１２断片は、限界の６ブレードのβプロペラドメインと二つのＥＧＦドメインを含み、全体の構造はロリポップに類似している（図３Ｃ）。βプロペラドメインはロリポップの頭部（６５×５０×５０Å３）を表し、二つのＥＧＦドメインが柄をつくる（４０×１５×１５Å３）。四つのドメイン内ジスルフィド結合がβプロペラ内に存在し、三つが各ＥＧＦドメイン中に存在する。Ｓｈｈ及びＨｈｉｐ１β１２のβ−プロペラコアの構造は複合体形成時には大きくは変化しないままであるが（Ｓｈｈ ｒｍｓｄ＝０．３８Å（残基４０−１８７）；（Ｈｈｉｐ１β１２ ｒｍｓｄ＝０．３９Å（残基２１５−６０６）、例外は複合体中で一般によりよく定まっているＨｈｉｐ１β１２中の周辺Ｓｈｈ結合ループである。
ＳＳＭプログラム（Krissinel及びHenrick, 2004）を用いたプロテインデータバンク（ＰＤＢ）の探索により、Ｈｈｉｐ１ βプロペラドメインは細菌及び古細菌由来の可溶性キノプロテイングルコースデヒドロゲナーゼのＸ線構造（ＰＤＢコード２ＩＳＭ，２Ｇ８Ｓ及び１ＣＲＵ）に最も良く重なり、ｒｍｓｄｓは２７１−２８４の２３％の配列同一性でアラインされたＣα位置にわたって２．２−２．４Åの範囲であることが明らかになった。これらのタンパク質は、その６ブレードのβプロペラフォールド（Oubrie, 2003）の中央キャビティに結合する高度に反応性のピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を特に利用する細菌及び古細菌酵素の大ファミリーのメンバーである。Ｈｈｉｐ１及びこれらの選択デヒドロゲナーゼの重なったβプロペラの十分な検査によって、Ｈｈｉｐ１がＰＱＱ−座標残基を欠き、対応する結合ポケットがより小さく、かつより溶媒暴露されていることが明らかになる。細菌ＰＱＱ依存性酵素の一族とのＨｈｉｐ１の観察された構造的関連性は、哺乳動物Ｈｈｉｐ１ファミリーが、酵素機能を失ったが新しいタンパク質相互作用の役割を獲得した非常に多岐にわたるブランチであるかどうかという興味深い疑問を生じせしめる。
全ての構造図は、ｐｙｍｏｌ．ｃｏｍのＵＲＬアドレスのワールドワイドウェブで見出すことができるＰｙｍｏｌ（DeLano, W. L. (2002) The PyMOL Molecular Graphics System, Palo Alto, CA, USA, DeLano Scientific）を使用して作成した。
Ｂ．ＥＧＦ１ドメインは密接にβプロペラに結合する
Ｈｈｉｐ１の５つの結晶学的に独立した構造では、ａｐｏに対して３つが形成され、２つがＳｈｈに結合し、βプロペラとＥＧＦ１ドメインがよく重なり、それらが強固なユニットを形成することを示唆している（図３Ｄ）。ＥＧＦ１は、βプロペラのブレード２及び３との密接な相互作用によって空間的に保持されている。２つのドメイン間に生じた界面は性質が親水性並びに疎水性であり、βプロペラのブレード３中のＣ４０２とＥＧＦ１のＣ６２４の間にはジスルフィド結合が形成されている（図３Ｅ）。この相互作用の密接な性質はＥＧＦ１ドメインを欠くＨｉｐβコンストラクトの不安定性を説明する（図９）。ＨｈｉｐβプロペラとＥＧＦ１ドメイン間の密接な相互作用は、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）の６ブレードのβプロペラドメインの第二及び第三ブレード及びそのＣ末端ＥＧＦドメイン（Jeon等, 2001）間に形成された接触に類似する。特に、界面は疎水性側鎖が優勢であるＬＤＬＲの場合にかなり大きい。ＥＧＦ１とは異なり、βプロペラに対するＥＧＦ２の配向は、おそらくは２つのＥＧＦドメイン間にあるリンカーの本来的な柔軟性のために、有意なバリエーションを示している（図３Ｄ）。ここでのまた最も可能なＥＧＦ２ドメインと膜間の柔軟性は、細胞膜に対するＨｈｉｐ１β１２ＥＣＤにある程度の立体構造の自由度があることを意味する。
Ｃ．Ｈｈｉｐ１β１２は３つのループを介してＳｈｈと相互作用する
Ｓｈｈ結合部位は、ＥＧＦ柄から遠いＨｈｉｐ１β１２ βプロペラドメインの周辺に局在化している（図４Ａ及びＢ）。Ｈｈｉｐ１β１２の第二及び第三ブレードからの３つのループ（Ｌ１：３０９−３１４，Ｌ２：３７６−３８８及びＬ３：４１７−４２２）はＺｎ２＋含有溝に中心を置くＳｈｈの領域に接触している（図４Ａ−Ｃ）。Ｌ１及びＬ２ループはａｐｏＨｈｉｐ１β１２構造中における複数の立体構造の証拠を示しており、Ｓｈｈへの結合がその立体構造を制限することを示している。界面は大きく、それぞれ８７０Å２及び７８０Å２の埋められた溶媒露出面積を説明する２３のＨｈｉｐ１残基及び２９のＳｈｈ残基を含んでいる。その位置及び相互作用の度合いは、結合のための最小領域がβプロペラ及びＥＧＦ１を包含するタンパク質断片内に存在することを示す我々のインビトロ結合データと一致している（表６）。ＥＧＦ１ドメインはＳｈｈに接触しないが、にもかかわらずそれはβプロペラを安定化させるので（上記参照）、必要とされる。興味深いことに、インビボで脂質修飾されたＳｈｈのＮ末端及びＣ末端、並びにＨｈｉｐ１β１２のＣ末端は全て複合体の同じ側に存在し、両成分が同じ細胞膜に固定されうることを示唆している。
Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループはＳｈｈのＺｎ２＋含有溝中に深く入り、相互作用の中核を構成する。Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２表面のおよそ５００Å２がＳｈｈと直接接触しており、これが、全Ｈｈｉｐ１β１２表面の〜６０％がＳｈｈと接触することを説明している。Ｓｈｈ及びＨｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ間の広範な側鎖相互作用が、幾つかの主鎖−側鎖相互作用に加えて存在する。興味深いことに、Ｈｈｉｐ１β１２のＬ２ループ中のＤ３８３がＳｈｈ中のＺｎ２＋カチオンと直接相互作用し、四面体配位を生じる（図４Ｄ）。高分解能のａｐｏマウスＳｈｈ構造（Hall, T.M.等(1995) Nature 378:212-216）では、水分子がＤ３８３に置換され、Ｓｈｈ中のＺｎ２＋含有残基Ｈ１４１、Ｄ１４８、及びＨ１８３（ヒトＳｈｈ中のＨ１４０，Ｄ１４７，Ｈ１８２）が、結合及びａｐｏ構造において同一である（図４Ｄ及び８Ｂ）。Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループにより生成される広範な相互作用とは対照的に、Ｌ１及びＬ３ループの接触がより表在性であるように思われ、結合部位の周辺の顕著に小さい表面積を含む（図４Ｃ）。特に、Ｓｈｈ上のＨｈｉｐ結合部位は、残基Ｅ１７６−Ｋ１７８を含み、その検出は小頭症及び部分的な脳梁に関連している（Dubourg等, 2004）。
ここで証明されたＨｅｄｇｅｈｏｇとのＨｈｉｐ１β１２の相互作用は、天然Ｈｈｉｐ１及びＨｅｄｇｅｈｏｇ間で生じるものと同じ相互作用であると思われる。
実施例５：
Ａ．Ｚｎ２＋及びＨｉｐ−Ｓｈｈ相互作用
Ｈｉｐ−Ｓｈｈ相互作用の媒介におけるＺｎ２＋カチオンの重要性を特徴付けるために、我々はＥＤＴＡの存在下で結合実験を実施した。１５Ｎ標識Ｓｈｈを、１５ＮＨ４Ｃｌ補充Ｍ９培地を用いて天然タンパク質と同じようにして調製した（実施例１Ｄを参照）。１５Ｎ，１Ｈ−ＨＳＱＣスペクトルを、５ｍｍのインバース三重共鳴凍結プローブを装備したＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ６００ ＭＨＺスペクトロメータで、３２℃にて１０％（ｖ／ｖ）のＤ２Ｏを補充したＰＢＳバッファー中の９０ｍＭの１５Ｎ−Ｓｈｈについて記録した。１５Ｎ−標識ＳｈｈのＺｎ２＋実験を１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下又は不在下で実施した。
ＳｈｈとのＨｉｐβ１の相互作用がＺｎ２＋に依存性であるという考えと一致し、ＥＤＴＡの存在下では結合は完全に消失していた（図１０Ａ）。重要なことに、ＥＤＴＡの不存在又は存在下で実質的に同一のＮＭＲスペクトルによって示されるように（図１０Ｂ）、Ｚｎ２＋カチオンの喪失はＳｈｈ構造又は安定性に有意な影響を持たない。重要でないスペクトルの差はＺｎ２＋の置換時の亜鉛結合残基の局所的変化に一致している。更に、Ｓｈｈの三次構造はショウジョウバエＨｈのものと略同一であり（McLellan, J. S.等(2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:17208-17213）、溝残基の差のために相同部位でＺｎ２＋を結合することができない（図１０Ｃ及びＤ）。ＥＤＴＡはまた他の二価カチオンを隔離できるが（以下のＣａ２＋部位を参照）、Ｚｎ２＋がＨｈｉｐ１と直接相互作用する唯一のＳｈｈ結合二価カチオンであるので、我々はＺｎ２＋相互作用が複合体アセンブリーに重要であると考える。
Ｂ．Ｈｅｄｇｅｈｏｇ結合におけるＬ１、Ｌ２及びＬ３の役割
Ｓｈｈへの結合に対するＨｈｉｐ１ Ｌ１、Ｌ２及びＬ３ループ中の残基の寄与を評価するために、一連の単一アラニンＨｉｐβ１２変異体を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＤＮＡ変異誘発キット（Stratagene）を使用し製造者のプロトコルを使用して作製し、Ｓｈｈに対するその親和性を（実施例２Ｂに記載されたような）バイオレイヤーインターフェロメトリーによって測定した。これらの変異は、Ｈｈｉｐ１β１２変異体Ｉ３１２Ａ、Ｅ３８１Ａ、Ｍ３８２Ａ、Ｄ３８３Ａ、Ｄ３７８Ａ、Ｔ４１８Ａ、Ｑ４２０Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｄ３８７Ａ及びＤＬ２を含んでいた。
結果を表６及び図４Ｅ及び４Ｆに示す。予想されたように、全Ｌ２ループ（Ｈｈｉｐ１？Ｌ２）の検出はＳｈｈへの結合を抑止した。Ｈｈｉｐ１β１２及びＳｈｈ間の相互作用を架け渡すためのＺｎ２＋カチオンの重要性がまたＳｈｈにＤ３８３Ａ Ｌ２及びＤ３８３Ｒ Ｈｈｉｐ Ｌ２変異体が結合できないことによって更に強調された。Ｌ２残基Ｅ３８０、Ｍ３８２、及びＤ３８７でのアラニン置換がまたＳｈｈへの結合性を消失させた。残基Ｅ３８０及びＤ３８７はＳｈｈと直接の相互作用を有しているが、Ｍ３８２はＳｈｈに接触せず、結合に対して競合するＬ２ループを立体構造において安定化させることにより機能するようである。Ｌ２中の二つの他の変異であるＤ３７８Ａ及びＥ３８０Ａは、Ｓｈｈ結合には少ないかないしは中程度の効果を有していた（表６，図４Ｅ）。Ｌ２ループ中の変化と異なり、Ｌ１（Ｉ３１２Ａ）又はＬ３（Ｔ４１８Ａ，Ｑ４２０Ａ）ループ中の単一アラニン変異は、Ｓｈｈに殆ど効果がなく、ＷＴ Ｈｈｉｐ１β１２に匹敵するＫＤ値で結合する（表６，図４Ｆ）。アラニン変異体の親和性データは、Ｌ２ループがＳｈｈ結合に対する主要なエネルギー的な決定要因であるという仮説と一致している。
些か意外にも、Ｄ３８３Ａ変異体は、より複雑で生理学的に関連しているＧｌｉ−ルシフェラーゼ同時培養アッセイ（プロトコルについては実施例３Ａを参照）における活性を保持しており、野生型Ｈｉｐβ１２に対して観察されたものより２倍だけ高い〜１０ｎＭのＩＣ５０を有している。しかしながら、阻害は飽和条件で不完全（〜８５％）であった（図４Ｆ）。
この位置（Ｄ３８３Ｒ）での有害な立体及び電荷効果により、〜１３倍の減少したＩＣ５０（５７ｎＭ）と〜５０％だけの最大阻害となった。予想されたように、ＨｈｉｐΔＬ２変異体では阻害活性は観察されなかった（図４Ｆ）。更なる二価金属イオンがタンパク質結合アッセイにおいて加えられなかったので、飽和以下の濃度が細胞ベースアッセイで見出される差異を説明しうる；更なるＨｈｉｐ−Ｓｈｈ結合研究が二価金属イオンへの依存性をよりよく明らかにするために必要とされる。細胞ベースアッセイにおけるＨｈｉｐ−Ｓｈｈ相互作用の複雑性は、例えばＳｈｈへの脂質修飾のように結合アッセイにはない相互作用からまた生じうる。更に、Ｈｈｉｐ−Ｓｈｈ複合体の表面上での高度に保存された酸性領域の存在は、更なる調節因子のための潜在的な相互作用を示唆する（図１２）。
野生型Ｈｈｉｐ１β１２と同様にＳｈｈに結合した他の変異体Ｉ３１２Ａ（表６）は、細胞ベース活性において野生型Ｈｈｉｐ１β１２と本質的に同一であった（図４Ｆ）。細胞ベースアッセイにおけるＨｉｐ−Ｓｈｈ相互作用の複雑さは、未修飾の組換えＳｈｈを使用する結合アッセイに存在しない更なる又は代償性相互作用を含みうる。細胞ベースアッセイに存在するＳｈｈのＮ末端パルミトイル及びＣ末端コレステロール修飾はＳｈｈを細胞膜に結合させる可能性があり、その移動性を制限し、Ｈｈｉｐ１β１２結合に対してそれをプライミングする。更に、Ｈｈｉｐ１ ＥＧＦ２ドメインは、たとえ結晶構造中においてＳｈｈには直接接触せず、またインビトロで結合に寄与しないようであっても、同時培養アッセイで阻害について僅かな効果を有しているので、更なる相互作用を媒介しうる（図３Ｂ，表６）。
実施例６：複合体はＡ１型短指症Ｉｈｈ遺伝子変異に対する理論的根拠を示唆する
Ｈｈ及び他のＨｈファミリーメンバーに対する遺伝子データはＳｈｈ疑似活性部位溝及びＣａ２＋結合部位の重要性を強調する。これら変異は、それがＰｔｃｈ１及び／又は調節性レセプターとの損なわれた相互作用のためであるかどうかは殆どのそれらには不明瞭であるが、著明な効果を有しうる。例えば、疑似活性部位溝の一つの壁に寄与するＥ１７６−Ｋ１７８の検出は小頭症及び部分的な脳梁に関連している。また、幾つかのＩｈｈ変異（それぞれのＳｈｈ残基Ｅ９０、Ｄ９５、Ｒ１２３、Ｔ１２５、Ｅ１２６及びＴ１４９に対応するＥ９５Ｇ／Ｋ、Ｄ１００Ｅ／Ｎ、Ｒ１２８Ｑ、Ｔ１３０Ｎ、Ｅ１３１Ｋ及びＴ１５４Ｉ；図８Ｂ）は、中指骨が短いことによって特徴付けられる常染色体性優性遺伝性疾患４３，４４，４５，４７，４８，４９であるＡ１型短指症に関連している。これらの変異はＳｈｈ中の２つの部位にマッピングする：疑似活性部位（Ｒ１２３，Ｔ１２５，Ｔ１４９）及び隣接のＣａ２＋結合部位（Ｅ９０，Ｄ９５，Ｅ１２６）（図４Ｄ）。Ｚｎ２＋結合溝に、Ｔ１２５及びＴ１４９の両方がＲ１２３に対して充填され、溝の表面に寄与する。また、Ｒ１２３がＨｈｉｐ中の残基Ｅ３８０に対して相補的電荷を提供する（図４Ｄ）。Ｉｈｈ変異Ｔ１５４Ｉ、Ｒ１２８Ｑ、Ｔ１３０Ｎは全て溶媒暴露されており、Ｒ１２８Ｑ変異は結合対との静電的相互作用を減少させるるが、Ｉｈｈフォールドを変えることはない。これら３つのヘテロ接合性変異の相対的に良性の性質は、Ｉｈｈノックアウトマウス５０での胚性致死と対照をなす。
Ｉｈｈにおける他のＡ１型短指症関連変異（Ｅ９５Ｇ／Ｋ、Ｄ１００Ｅ／Ｎ及びＥ１３１Ｋ（Gao B.等(2001) Nat. Genet. 28:386-388；Kirkpatrick T.J.等(2003) J. Med. Genet. 40:42-44；McCready等(2002) Hum. Genet. 111:368-375））はＺｎ２＋結合溝に隣接してＳｈｈ中に新規な二価カチオン結合部位の一部を形成する。上記のＩｈｈ残基に対応するＳｈｈ側鎖Ｅ９０、Ｄ９５及びＥ１２６とＷ１２８の骨格カルボニルは推定Ｃａ２＋カチオンを配位させる（図４Ｇ）。これらの酸性側鎖の何れかの改変はＳｈｈ又はＩｈｈへ結合する二価カチオンに悪影響を及ぼしそうである。カチオン配位側鎖とこの遺伝性疾患の間の進化的関連性は、この部位がＨｈシグナル伝達に機能的に重要であることを示唆している。
実施例７：Ｈｉｐ−Ｓｈｈ相互作用は阻害剤−メタロプロテアーゼ相互作用に似ている
Ｚｎ２＋カチオン配位の幾何及び全体のＳｈｈフォールドの双方がメタロプロテアーゼのＭＤ一族に位相幾何学的に類似しているが（Bochtler, M.等(2004) Protein Sci. 13:854-861；Bussiere, D. E.等(1998) Mol. Cell 2:75-84；Hall, T. M.等(1995) Nature 378:212-216；Rawlings, N. D.等(2008) Nucl. Acids Res. 36:D320-325）、酵素活性はＳｈｈに対して報告されている（Fuse, N.等(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10992-10999）。疑似活性部位における重要な残基の変異が、ＳｈｈがＰｔｃｈに対するリガンドとして機能し、プロテアーゼとしてでないことが報告されている（Fuse, N.等(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10992-10999）。よって、我々のＨｉｐ−Ｓｈｈ複合体構造は、Ｈｈ経路を調節するためにそのメタロプロテアーゼ様フォールドを利用するＳｈｈの最初の例である。ＳｈｈのＺｎ２＋含有溝は、プロテアーゼ基質／阻害結合間隙に類似しているが、Ｚｎ２＋を配位するＤ３８３を含むＨｈｉｐ１β１２のＬ２ループに占められている。この相互作用の機序は、ＭＭＰ３活性部位溝がその阻害剤ＴＩＭＰ１からの連続ループに占められているＴＩＭＰ１−ＭＭＰ３複合体のもの（Gomis-Ruth, F. X.等(1997) Nature 389:77-81）に類似している。ＴＩＭＰ−ＭＭＰ３構造では、Ｈｉｐ−Ｓｈｈ複合体におけるように、阻害剤はＺｎ２＋配位圏と競合する。Ｈｉｐ−Ｓｈｈ構造は、Ｓｈｈが、経路活性を調節するためにプロテアーゼ・阻害剤結合機序のある側面を保持しながら、そのタンパク分解活性を失った触媒的にコンピテントな先祖から進化したものであろうことを示唆している。結合対としての非触媒的プロテアーゼの関与は他の重要なシグナル伝達経路において観察されている。例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）はプラスミノーゲン様α／β−ヘテロに量体増殖因子及びＭｅｔのリガンドのレセプターチロシンキナーゼである（Birchmeier, C.等(2003) Nature Rev. Mol. Cell Biol. 4:915-92５）。ＨＧＦβ鎖セリンプロテアーゼ様ドメインはその疑似活性部位を介してＭｅｔレセプターのβプロペラと相互作用するが、ＨＧＦは如何なる触媒活性も欠く（Kirchhofer, D.等(2004) J. Biol. Chem. 279:39915-39924；Stamos, J.等(2004) EMBO J. 23:2325-2335）。
ＨｈｉｐがＳｈｈに対してデコイレセプターとして作用し、それがＰｔｃｈ１に結合しそれによってシグナル伝達を阻害することを防止するならば、Ｈｈｉｐ１及びＰｔｃｈ１はＳｈｈと競合しなければならない。従って、我々は、可溶性Ｈｈｉｐ１β１２が、ＦＡＣＳによるＰｔｃｈ１発現２９３細胞への結合からＳｈｈと競合しうるかどうかを調べた。蛍光Ｓｈｈ６４９は〜２ｎＭ（データは示さず）のＥＣ５０でＰｔｃｈ１−２９３細胞に特異的に結合し、用量依存的な形で未標識Ｓｈｈと競合し得た (図15J)。
確かに、Ｈｈｉｐ１β１２及びＨｈｉｐ１β１２−Ｆｃの双方が、Ｐｔｃｈ１特異的Ｓｈｈ細胞結合を用量依存的な形で阻害する（図１５Ｉ及び１５Ｊ）。これに対して、Ｓｈｈに結合しない変異体（表６）、例えばＨｈｉｐΔＬ２又はＨｈｉｐβ１２ Ｄ３８３Ｒ、及びＨｉｓ６−又はＦｃ−タグコントロールは阻害を示さない（図１５Ｊ）。高親和性の中和抗Ｓｈｈモノクローナル抗体５Ｅ１３４がまたＰｔｃｈ１（図１５Ｉ及び１５Ｊ）並びにＨｈｉｐ１β１２（図１５）に対するＳｈｈ結合と競合する。更に、Ｓｈｈ上の５Ｅ１エピトープはＨｈｉｐ結合部位と部分的にオーバーラップする（図１４）。よって、Ｈｈｉｐ１β１２、Ｐｔｃｈ１及び５Ｅ１結合部位がオーバーラップするので、これはＰｔｃｈ１及びＨｈｉｐがＳｈｈについて競合することを更に裏付け、それらが共通の結合部位を共有するか又は立体障害が競合を生じるように近接した結合部位を有していることを示している。
実施例８：ＳｈｈへのＨｈｉｐ１β１２結合性はショウジョウバエＨｈとのＩｈｏｇ相互作用とは異なる
Ｈｈｉｐ１β１２及びＳｈｈ間に観察される相互作用は、ショウジョウバエＨｈ及びＩｈｏｇ間のもの（McLellan, J. S.等(2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:17208-17213）とは異なり、唯一の他のＨｈ−レセプター複合体構造が今日利用できる。二つの複合体はその分子間相互作用のタイプ及び位置において双方異なる。Ｉｈｏｇ−Ｈｈ複合体はヘパリンを必要とし、これが二つの結合対を架橋させるばかりでなくＩｈｏｇ二量体化を容易にする。これに対して、Ｈｉｐ−Ｓｈｈ相互作用はヘパリン依存性であり、ヘパリンの存在が、少なくともインビトロではより高次のＨｈｉｐ１β１２オリゴマーの形成に至らしめない（データは示さず）。
ショウジョウバエＨｈ及びＳｈｈ間の構造的相同性にもかかわらず、Ｉｈｏｇ及びＨｈｉｐ１β１２はこれらのリガンドの異なった表面に結合する。Ｈｈｉｐ１β１２はＳｈｈのその疑似活性部位に結合する一方、Ｉｈｏｇは第二ヘリックスの回りの分子の側に局在化した表面に結合する（図５Ａ）。更に、リガンド結合の原因となるＩｈｏｇ及びＨｈｉｐ１β１２の構造的エレメントが基本的に異なっている。ＩｈｏｇはショウジョウバエＨｈに結合するためにそのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）ドメインの一つを使用するが、Ｈｈｉｐ１β１２ βプロペラはＳｈｈとの相互作用を媒介する。Ｉｈｏｇの二つの哺乳動物ホモログであるＣｄｏｎ及びＢｏｃｏｆは、Ｚｎ２＋含有溝を含まず、よってこの表面をＨｈｉｐ１との相互作用に利用できるように残すＩｈｏｇ様の形式で（Yao, S.等(2006) Cell 125:343-357）Ｓｈｈに結合することが示唆されている。Ｈｈｉｐ１及びＩｈｏｇはそれぞれＳｈｈ及びＨｈ上に区別できる結合部位を有しているが（図５Ａ）、二つの複合体の重ね合わせは、結合部位から離れて生じるＨｈｉｐ１とのＦＮＩＩＩドメインの有害な立体的相互作用を明らかにする。これから、Ｈｈｉｐ１及びＣｄｏｎ／Ｂｏｃの何れもＳｈｈには同時には結合できないか、又はできる場合には、Ｃｄｏｎ／ＢｏｃはＩｈｏｇ様の形式（上記参照）ではＳｈｈには結合しないことが示唆される。
発生、疾患及び癌におけるＨｈシグナル伝達の重要な役割は、密接な調節の必要性を明確に例証する。多くの細胞膜付随レセプターがＨｈシグナルのリレーに関与している。Ｈｈｉｐ１がＳｈｈシグナル伝達を阻害する機序をより良く理解するために、我々は、Ｈｈｉｐ１β１２及びＳｈｈ間の複合体の構造を決定し、これが幾つかの重要で予期されない知見に至った。先ず、Ｓｈｈの疑似活性部位中のＺｎ２＋含有溝は確かに重要な生化学的及び生物学的役割を果たしている。Ｈｈｉｐ１はこの部位をＳｈｈの生物学的活性を調節するために利用している。第二に、Ｈｈｉｐ１ Ｌ２ループに相同のＰｔｃｈペプチドへのＳｈｈの結合は、Ｈｈｉｐ１及びＰｔｃｈがＨｈホモログに対する共通の結合機序を共有することを示唆し、Ｈｈｉｐ１がＰｔｃｈに対して競合的デコイレセプターとして作用するという考えを補強する。最後に、他のＳｈｈレセプター、例えばＣｄｏｎ／ＢｏｃはＨｉｐ−Ｓｈｈ複合体に結合することができ、これが、これらのタンパク質の生物学的機能を構造的構成に置き換え始めることを可能にする。我々は、Ｃｄｏｎ／ＢｏｃがＳｈｈのコレセプターとして作用し、これが経路のシグナル伝達又は阻害に導く。
ここで、我々は、Ｓｈｈに強固に結合するＨｈｉｐ１の可溶性断片（Ｈｉｐｂ１２）がＨｈシグナル伝達の強力な阻害剤であることを示す。殆どの報告されているＨｈシグナル伝達阻害剤はＳｍｏに結合する小分子であるが（Kiselyov等(2007) Expert Opin. Ther. Targets 11:1087-1101）、モノクローナル抗体５Ｅ１はＨｈリガンドに結合する唯一の強力な経路阻害剤のままである（Ericson等(1996) Cell 87:661-663）。Ｓｈｈ疑似活性部位とのＨｈｉｐ１の重要な相互作用は、そのＬ２ループから由来するペプチド並びにＰｔｃｈ由来のペプチドによって獲得されうる。よって、Ｓｈｈ疑似活性部位と高親和性をもって結合する抗体、ペプチド又は小分子は全てＨｈシグナル伝達を阻害すべきである。Ｐｔｃｈ上のＳｈｈ結合部位に対する抗体も同じ作用をしうる。これは、細胞生物学及び治療領域において使用するためのＨｈシグナル伝達の新規アンタゴニストを設計するための幾つかの新規な機会を開く。
実施例９：ＳｈｈへのＰｔｃｈの結合
Ｓｈｈ及びショウジョウバエＨｈ上のＨｈｉｐ１β１２及びＩｈｏｇ結合部位のマッピングは、表面レセプター及びＨｈホモログ間に少なくとも二つの区別できる結合部位があることを示している（図５Ａ）。ＳｈｈとのＰｔｃｈの相互作用はＳｈｈ表面変異体の親和性及び活性によって定まる（Fuse, N.等(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 10992-10999; Pepinsky, R. B.等(2000) J. Biol. Chem. 275:10995-11001）（図５Ａ，右側パネル）。Ｃｄｏｎ／ＢｏｃはＳｈｈに直接結合し、Ｐｔｃｈを介したシグナル伝達を亢進させるので（Tenzen, T.等(2006) Dev. Cell 10: 647-56; Yao, S.等(2006) Cell 125:343-357）、Ｃｄｏｎ／Ｂｏｃ結合を抑制するＳｈｈ変異体は、ＳｈｈとのＰｔｃｈ相互作用及び下流のシグナル伝達に対して間接的な影響を有しうる。Ｓｈｈに接触するかも知れないＰｔｃｈの候補領域を決定するために、我々はＰｔｃｈ及びＨｈｉｐ１間、並びにＰｔｃｈ及びＩｈｏｇ間の配列類似性を調べた。この分析は、Ｐｔｃｈの第二外部ドメイン中で、膜貫通ヘリックス７及び８間に、Ｈｈｉｐ１β１２ Ｌ２ループと顕著な配列類似性を有していた残基の伸展を同定したが、それによってＰｔｃｈ中に類似するループが存在していることが示唆される（図５Ｂ）。Ｓｅｒが見出される線虫の場合を除いて、Ａｓｐ又はＧｌｕ残基が０位を占める。全ての場合、Ｇｌｙが１位に見出され、Ｔｈｒが−８位の優勢な残基である。更に、−７、−４、−１及び２位における疎水性残基の圧倒的な存在は、Ｌ２様ループの安定化における役割と一致している。我々の分析と一致して、Ｐｔｃｈの膜貫通ヘリックス７及び８間の全細胞外ドメインの除去は、Ｓｍｏを抑圧する能力を保存しながら、Ｓｈｈ結合の消失を生じる（Briscoe等(2001) Mol. Cell 7:1279-1291；Taipale等(2002) Nature 418:892-897）。
更に探求するために、我々は、Ｈｈｉｐ１β１２及びＰｔｃｈ Ｌ２ループに対応するジスルフィド含有環状ペプチドを合成し、ＮＭＲスペクトル法を使用してＳｈｈとのその相互作用を特徴付けした。簡潔に述べると、１５Ｎ標識Ｓｈｈを、１５ＮＨ４Ｃｌ補充Ｍ９培地を用いて天然タンパク質と同じようにして調製した。１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを、５ｍｍのインバース三重共鳴凍結プローブを装備したＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ６００ ＭＨＺスペクトロメータで、３２℃にて１０％（ｖ／ｖ）のＤ２Ｏを補充したＰＢＳバッファー中の９０μＭの１５Ｎ−Ｓｈｈについて記録した。ペプチド実験を、双方とも２ｍＭで未標識で、Ｐｔｃｈ Ｌ２（ＧＣＱＬＴＫＱＲＬＶＤＡＤＧＩＩＮＰＣＧ）（配列番号：５３）及びＨｈｉｐ１β１２ Ｌ２（ＧＣＧＭＩＴＬＤＤＭＥＥＭＤＧＬＳＤＦＣＧ）（配列番号：５４）ペプチドに対してジスルフィド含有環状ペプチドの存在下で行った。
何れのペプチドの添加もＳｈｈの１５Ｎ，１Ｈ ＨＳＱＣスペクトルに、ペプチド結合を示す有意な変化をもたらした（図５Ｄ及びＥ）。２つの複合体間のＨＳＱＣフィンガープリントの類似性は、Ｐｔｃｈ Ｌ２ペプチドが確かにＨｈｉｐ１β１２ Ｌ２ペプチドのものと類似した形でＳｈｈに結合することを示唆している。
競合アッセイにおいて、Ｈｈｉｐ１β１２ Ｌ２ループから由来するペプチドは、Ｓｈｈ結合についてＨｉｐβ１と競合した。簡潔に述べると、９６ウェルのＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Nalge Nunc International）に５０ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）中に５μｇ／ｍｌで１００μｌの抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Sigma）を用いて４℃で一晩被覆した。プレートをブロックし、Ｓｈｈ競合ＥＬＩＳＡに対して記載されたようにして洗浄した後、５０μｇ／ｍｌでの１００μＬのＳｈｈ−Ｆｌａｇと共に１時間インキュベートした。プレート洗浄後、１００μＬの最終容量中に８００ｎＭのＨｈｉｐ１β１２を含む１．２ｍＭ（１：３希釈）で始まるＨｉｐ−Ｌ２ペプチド（ＧＤＧＭＩＴＬＤＤＭＥＥＭＤＧＬＳＤＦＴＧ）（配列番号：４６）の連続希釈物を、Ｓｈｈ−Ｆｌａｇへの結合について競合させるためにウェルに加えた。１時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、ブロッキングバッファー中の抗ヒス−ＨＲＰコンジュゲート（Qiagen, １：２０００希釈）と共にインキュベートした。プレートを展開し、データを４−パラメータ式にフィットさせ、上述のようにしてＩＣ５０を計算した；アッセイは三通り実施した。
Ｈｈｉｐ１β１２ Ｌ２ループから由来するペプチドは、ペプチドがＨｈｉｐ１と同じＳｈｈ上の領域に結合するという知見と一致して、１５０μＭのＩＣ５０でＳｈｈ結合に対してＨｉｐβ１と競合した（図５Ｃ）。Ｐｔｃｈ Ｌ２由来ペプチドは低親和性のものであり、よって、Ｓｈｈ結合に対してＨｉｐβ１と競合することができなかった。これらのペプチドの親和性及び溶解性が限定されるため、我々は、細胞ベースＧｌｉ−ルシフェラーゼアッセイにおけるＳｈｈシグナル伝達についてのその効果を試験することができなかった。まとめると、（ｉ）Ｈｈｉｐ１β１２ Ｌ２及びＰｔｃｈペプチド間の配列類似性、（ｉｉ）Ｓｈｈ結合に対してＨｉｐβ１と競合するＨｈｉｐ１β１２ Ｌ２ペプチドの能力、及び（ｉｉｉ）両ペプチドの存在下でのＳｈｈ ＨＳＱＣスペクトルの類似性は、ＰｔｃｈがＳｈｈのその疑似活性部位に結合し得、よって「Ｐａｔｃｈｅｄに対するパッチ」をもたらすことを示唆している。我々は、Ｈｈリガンドに対する阻害性構造デコイレセプターとしてのＨｈシグナル伝達におけるＨｈｉｐ１の主要な役割を提案する（図１２）。
実施例１０：ＳｈｈとのＨｈｉｐ１β１２相互作用におけるＣｄｏｎの役割
最近の研究では、Ｃｄｏｎ／ＢｏｃがＰｔｃｈを介してＳｈｈシグナル伝達を亢進させることが示され、Ｈｈホモログ、Ｃｄｏｎ／Ｂｏｃ（又はショウジョウバエのＩｈｏｇ）及びＰｔｃｈ（Tenzen, T.等(2006) Dev. Cell 10:647-56；Yao, S.等(2006) Cell 125: 343-57）間における多成分複合体の存在の可能性が示唆されている。Ｓｈｈに対するＣｄｏｎ／Ｂｏｃ上の結合部位は、ヒト及びマウスタンパク質間で９８．０％の配列同一性を共有する第三（近位膜）ＦＮＩＩＩドメイン内に存在する（Tenzen等(2006) Dev. Cell 10:647-56）。Ｃｄｏｎ／ＢｏｃがＳｈｈ及びＨｈｉｐ１と重要でない役割を果たすのかどうかを評価するために、我々は、Ｓｈｈ−Ｈｈｉｐ１β１２複合体と相互作用する組換えＣｄｏｎの能力を調べた。競合結合アッセイから、チオレドキシンに融合したその３つのＦＮＩＩＩドメインを含むマウスＣｄｏｎの断片（ｍＣｄｏｎＦＮ１−３）がＳｈｈへの結合に対してＨｈｉｐ１と競合しないことが明らかになった（データは図示せず）。
Ｃｄｏｎ／Ｂｏｃに対する可能な結合部位（又は他のインビボ相互作用）を見出すために、我々はＳｈｈ及びＨｈｉｐ１オルソログ間の配列保存性をマッピングした。配列解析は、Ｓｈｈ−Ｈｈｉｐ１β１２複合体の表面上の高度に保存された酸性領域を明らかにした（図１２Ｂ）。我々は、この領域が、Ｃｄｏｎ／Ｂｏｃのような更なるシグナル伝達結合対に対する潜在的相互作用部位を含んでいることを提案する。
上で検討された我々の構造及び結合データに基づき、我々は、Ｈｈ経路のＨｉｐ／Ｐｔｃｈ調節に対して次の簡単なモデルを提案する（図６及び７）。細胞膜にアンカーされた脂質修飾Ｓｈｈが最初にＣｄｏｎ／Ｂｏｃに結合する細胞環境に応じて、Ｓｈｈ−Ｃｄｏｎ／Ｂｏｃ複合体はついでＰｔｃｈ又はＨｈｉｐ１の何れかと更に相互作用しうる。ＰｔｃｈとのＳｈｈの複合体形成はＨｈシグナル伝達を刺激する一方（図６）、Ｈｈｉｐ１との複合体形成はＳｈｈを隔離し、経路を阻害するのであろう（図７）。これは、Ｐｔｃｈに対する阻害性構造デコイレセプターとしてのＨｈシグナル伝達におけるＨｈｉｐ１の主要な役割を示唆している。
Ｈｈ及び他のＨｈファミリーメンバーに対する遺伝子データはＳｈｈ疑似活性部位溝及びＣａ２＋結合部位の重要性を強調する。これらの変異は著明な効果を有しうるが、しかしこれがＰｔｃｈ１及び／又は調節性レセプターとの相互作用が損なわれているためであるかどうかはその殆どに対して不明である。例えば、疑似活性部位溝の一つの壁部に寄与するＥ１７６−Ｋ１７８の欠失は小頭症及び部分的な脳梁に関連している。
理論的実施例
実施例１１：大腸菌中でのＨｈｉｐ１β１２の発現
この実施例は、大腸菌中での組換え発現によるＨｈｉｐ１β１２の非グリコシル化形態の調製を例証する。
Ｈｈｉｐ１β１２をコードするＤＮＡ配列を、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含んでいなければならない。様々な発現ベクターを用いることができる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Bolivar等, (1977) Gene, 2:95参照）で、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸化される。ついで、ＰＣＲ増幅配列がベクターに結合せしめられる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、Ｈｈｉｐ１β１２コード領域、ラムダ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、ついで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いて選択された大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで増殖する能力によって同定され、ついで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析及びＤＮＡ配列決定によって確認する。
選択されたクローンは、抗生物質を補充したＬＢブロス等の液体培地で一晩増殖させることができる。一晩の培養は、続いて大規模培養物の播種に用いられる。次に細胞を所望の光学密度まで増殖させ、その間に発現プロモーターが作動せしめられる。
更なる数時間の細胞培養の後、細胞を遠心分離により集めることができる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、当該分野で知られた様々な試薬を用いて可溶化され得、ついで可溶化されたＨｈｉｐ１β１２タンパク質を、タンパク質の堅牢な結合を可能にする条件下で金属キレート化カラムを用いて精製することができる。
次の手法を用いて、ポリ-Ｈｉｓタグ形態でＨｈｉｐ１β１２を大腸菌中で発現させることができる。Ｈｈｉｐ１β１２をコードするＤＮＡを、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅させる。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位と、効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレート化カラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去をもたらす他の有用な配列を含む。ついで、ＰＣＲ増幅されたポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクター中に結合させ、これを株５２（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ）ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用する。形質転換体は、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ中で、３０℃で振盪しながら３−５のＯＤ６００に達するまで増殖させる。ついで培地をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍｌ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４を混合して調製）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間増殖させる。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞をペレット化する。細胞ペレットを精製及びリフォールディングまで凍結させる。
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中に１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させる。固体亜硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で一晩撹拌する。この工程により、全てのシステイン残基が亜硫酸化によりブロックされた変性タンパク質が得られる。溶液をＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で４００００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化する。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに充填する。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄する。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含むバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含む画分をプール化し、４℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍでのその吸光度により推定される。
試料を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製される再生バッファー中にゆっくりと希釈することにより、タンパク質をリフォールディングする。リフォールディング容量は、最終のタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択される。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌する。リフォールディング反応はＴＦＡを最終濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させる。タンパク質の更なる精製の前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％まで添加する。リフォールディングしたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフィー処理する。Ａ２８０吸光度を持つ画分の一定分量をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同なリフォールディングタンパク質を含む画分をプール化する。一般に、殆どの正しく再び折り畳まれたタンパク質種は、その種が最も緻密であり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されるので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って折り畳まれたタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンをまた除去する。
所望の折り畳みＨｈｉｐ１β１２ポリペプチドを含む画分をプール化し、穏やかな窒素流を溶液に向けてアセトニトリルを除去する。透析又は処方バッファーで平衡化したＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８中にタンパク質を処方する。
実施例１２：哺乳動物細胞中でのＨｈｉｐ１β１２の発現
この実施例は、哺乳動物細胞中における組換え発現によるＨｈｉｐ１β１２の潜在的なグリコシル化形態の調製を例示する。
発現ベクターとしてｐＲＫ５（１９８９年３月１５日公開の欧州特許出願公開第３０７２４７号を参照）を用いる。場合によっては、Ｈｈｉｐ１β１２ＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５中に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を使用して、Ｈｈｉｐ１β１２ＤＮＡの挿入を可能にする。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞でありうる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては栄養成分及び／又は抗生物質を補充したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて増殖させて集密化する。約１０μｇのｐＲＫ５−Ｈｈｉｐ１β１２ ＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードする約１μｇのＤＮＡと混合し（Thimmappaya等, (1982) Cell, 31:543）、５００μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ２に溶解させる。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を滴下添加し、２５℃で１０分間沈殿物を形成させる。沈殿物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させる。培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中の２０％グリセロールを３０秒間添加する。２９３細胞をついで無血清培地で洗浄し、新鮮培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートする。
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（単独）又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換する。１２時間のインキュベーション後、条件培地を集め、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加する。処理したゲルを乾燥させ、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドの存在を現すとして選択された時間にわたってフィルムに暴露する。形質転換した細胞を含む培養物に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地中で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
これに換わる技術では、Ｈｈｉｐ１β１２コンストラクトを、Somparyrac等, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575に記載された硫酸デキストラン法を用いて２９３細胞に一過的に導入されうる。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで増殖させ、７００μｇのｐＲＫ５−Ｈｈｉｐ１β１２ＤＮＡを添加する。細胞は、先ずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコ中に再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。ついで、発現されたＨｈｉｐ１β１２を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製する。
他の実施態様では、Ｈｈｉｐ１β１２をＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−Ｈｈｉｐ１β１２は、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの既知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドの存在を判定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、ついで条件培地を収集する。ついで、発現されたＨｈｉｐ１β１２を含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
また、エピトープタグＨｈｉｐ１β１２は、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。Ｈｈｉｐ１β１２は、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングされうる。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグと読み枠を一致させて融合できる。ポリ-ｈｉｓタグＨｈｉｐ１β１２挿入物を、ついで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクター中にサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０駆動ベクターで（上述のようにして）形質移入した。発現を確認するために、上記のようにして、標識化を実施することができる。発現されたポリＨｉｓタグＨｈｉｐ１β１２を含む培養培地をついで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
また、Ｈｈｉｐ１β１２は、一過性発現手順によってＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞中で、あるいは他の安定な発現手順によってＣＨＯ細胞中で発現させることもできる。
ＣＨＯ細胞中での安定な発現は、次の手順を用いて実施される。タンパク質を、各タンパク質の可溶形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したＩｇＧコンストラクト（イムノアドヘシン）及び／又はポリＨｉｓタグ形態として発現させる。
ＰＣＲ増幅後に、各ＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.１6, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクター中にサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの簡便なシャトル化を可能にするように作製される。ＣＨＯ細胞中での発現に使用されるベクターは、Lucas等 (1996) Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779に記載された通りであり、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の駆動にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Quiagen）、Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）及びＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Boehringer Mannheim）を用いておよそ一千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上掲のＬｕｃａｓ等に記載されているようにして増殖させる。約３×１０７細胞を、以下に記載される更なる増殖及び生産のためにアンプル中で凍結させる。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水浴に配して解凍し、ボルテックスにより混合する。内容物を１０ｍｌの培地を含む遠心管にピペットで入れ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を吸引して細胞を１０ｍｌの選択培地（０．２μｍの濾過ＰＳ２０、５％の０．２μｍの透析濾過ウシ胎仔血清を添加）中に懸濁させる。ついで、細胞を９０ｍｌの選択培地を含む１００ｍｌのスピナーに分ける。１−２日後、細胞を１５０ｍｌの選択増殖培地を満たした２５０ｍｌのスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。更に２−３日後、２５０ｍｌ、５００ｍｌ及び２０００ｍｌのスピナーに３×１０５細胞／ｍｌで播種する。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させる。任意の適切なＣＨＯ培地を用いることができるが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５１２２４６９号に記載された生産培地を実際には使用できる。３Ｌの生産スピナーに１．２×１０６細胞／ｍｌで播種する。０日目に、細胞数とｐＨを測定する。１日目に、スピナーをサンプリングし、濾過空気での散布を実施する。２日目に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃に変え、５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍｌの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の３０ｍｌとする。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に必要により調節して維持する。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μｍフィルターを通して濾過する。濾過物を４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填する。
ポリＨｉｓタグコンストラクトについては、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いて精製する。精製前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加する。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流量で４℃においてポンプ移送する。充填後、カラムを更に平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離する。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール、ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵する。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）コンストラクトを以下のようにして条件培地から精製する。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）にポンプ供給する。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５で溶離する。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μＬの１Ｍトリスバッファー、ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化する。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリＨｉｓタグタンパク質について上述した貯蔵バッファー中で脱塩する。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで評価し、エドマン分解によりＮ末端アミノ酸配列決定した。
実施例１３：酵母中でのＨｈｉｐ１β１２の発現
次の方法は、酵母中でのＨｈｉｐ１β１２コンストラクトの組換え発現を記述する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＨｈｉｐ１β１２の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターが構築される。Ｈｈｉｐ１β１２をコードするＤＮＡ及びプロモーターを、選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＨｈｉｐ１β１２の細胞内発現を仕向ける。分泌のために、Ｈｈｉｐ１β１２をコードするＤＮＡを、選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然Ｈｈｉｐ１β１２シグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又は転化酵素分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）Ｈｉｐの発現のためのリンカー配列と共にクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌を、ついで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％のトリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離と、続くクマシーブルー染色でゲルの染色により、分析することができる。
続いて組換えＨｈｉｐ１β１２は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、ついで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。Ｈｈｉｐ１β１２を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いて更に精製することができる。
実施例１４：Ｈｈｉｐ１β１２に結合する抗体の調製
この実施例は、Ｈｉｐに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例証する。
モノクローナル抗体を生産するための技術は、当該分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。使用することができる免疫原には、精製Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドを含む融合タンパク質、及び細胞表面上に組換えＨｈｉｐ１β１２を発現する細胞が含まれる。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなく、なすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＨｈｉｐ１β１２免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入する。ついで、免疫化したマウスを、１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスを更なる免疫化注射で追加免疫する。抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体を検出するＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血により血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、Ｈｈｉｐ１の最終の静脈内注射で注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。ついで、脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウスミエローマ株化細胞に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、これをついでＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、ミエローマハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害することができる。
ハイブリドーマ細胞は、Ｈｈｉｐ１に対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。Ｈｈｉｐ１β１２に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗Ｈｈｉｐ１β１２モノクローナル抗体を含む腹水を産生させることができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトル中で増殖させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降と、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて達成することができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
実施例１５：Ｈｈｉｐ１β１２に結合する毒素コンジュゲート抗体の調製
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療において腫瘍細胞を殺すか又は阻害するための薬剤の局所デリバリーに抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）、つまり免疫複合体を用いると（Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212；Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz及びSpringer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第４９７５２７８号）、腫瘍への薬剤成分の標的とするデリバリーとそこでの細胞内集積が可能となり、これら非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる（Baldwin等, (1986) Lancet (Mar. 15, 1986):pp603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」 MONOCLONAL ANTIBODIES ‘84: BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS, Pinchera等(編), pp. 475-506）。これによって、最小限の毒性で最大限の効果が求められる。ＡＤＣを設定して精密化するために、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の選択性並びに薬剤結合特性及び薬剤放出特性に注目した。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は共にこれらの方策に有用であると報告されている（Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87）。これらの方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキセート及びビンデジンが含まれる（Rowland等, (1986) 上掲）。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン(Mandler等(2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler等(2000) Bioorganic &amp; Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler等(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791）、メイタンシノイド（EP1391213；Liu等、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623）、及びカリケアマイシン（Lode等 (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等 (1993) Cancer Res. 53:3336-3342）などの小分子毒素が含まれる。
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)を、リンカー(Ｌ)を介して、一又は複数の薬剤部分(Ｄ)、例えば抗体につき約１から約２０の薬剤部分にコンジュゲートさせる。式：Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐを有するＡＤＣを、（１）共有結合を介してＡｂ−Ｌを形成する二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応と、続く薬剤部分Ｄとの反応；及び（２）共有結合を介してＤ−Ｌを形成する二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応と、続く抗体の求核基との反応を含む、当業者に知られている有機化学反応、条件及び試薬を用い、幾つかの手段によって調製することができる。ＡＤＣを調製するための更なる方法はここに記載される。
リンカーは、一又は複数のリンカー成分から構成されうる。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-ヨード-アセチル)アミノベンゾエート(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分が当該分野で知られ、幾つかがここに記載される。
ある実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドが含まれる。例示的なジペプチドには、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)、アラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)が含まれる。例示的なトリペプチドには、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)が含まれる。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに少ないアミノ酸及び非天然アミノ酸アナログ、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設計でき、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
抗体上の求核基には、限定するものでないが、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖ヒドロキシル又はアミノ基。アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基は、求核性であり、反応して、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸エステル、及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を含む、リンカー試薬及びリンカー部分上の求電子基と共有結合を形成することができる。所定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）での処理によって、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にできる。よって、各システイン架橋は、理論的には、２つの反応性チオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２−イミノチオラン（トラウトの試薬）を用いてリジンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性チオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する（例えば、一又は複数の非天然システインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する）ことによって抗体（又はその断片）に導入されうる。
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応することができる求電子性の部分を導入することによって製造されうる。グリコシル化された抗体の糖を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応しうるアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基性基が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させる水素化ホウ素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はメタ過ヨウ素酸ナトリウムの何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤（Hermanson, Bioconjugate Techniques）上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質をメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生産せしめる（Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第５３６２８５２号）。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応せしめうる。
別法として、抗体及び細胞傷害剤を含有する融合タンパク質を、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製することができる。所定長さのＤＮＡは、コンジュゲートの所望される性質を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間されているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含みうる。
また別の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために「レセプター」（例えばストレプトアビジン）に抗体をコンジュゲートさせ得、ここで抗体-レセプターコンジュゲートが患者に投与され、続いて除去剤を使用して循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞傷害剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートした「リガンド」(例えばアビジン)が投与される。
毒素を精製抗体に連結することによって抗体-薬剤コンジュゲートを生産するための技術はよく知られており、当該分野で常套的に用いられている。例えば、毒素ＤＭ１への精製モノクローナル抗体のコンジュゲーションは、次のようにして達成されうる。精製された抗体が、ジチオピリジル基を導入するために、Ｎ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノエートで誘導体化される。ＮａＣｌ(５０ｍＭ)及びＥＤＴＡ(１ｍＭ)を含む４４．７ｍｌの５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー(ｐＨ６．５)中の抗体(３７６．０ｍｇ、８ｍｇ／ｍｌ)を、ＳＰＰ(２．３ｍｌのエタノール中に５．３モル当量)で処理する。室温、アルゴン下で９０分間インキュベートした後、反応混合物を、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムでゲル濾過する。抗体含有分画をプール化して、アッセイする。抗体-ＳＰＰ-Ｐｙ(３３７．０ｍｇ、放出可能な２-チオピリジン基を有する)を上記の３５ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５で希釈して、２．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度にする。ついで、ＤＭ１(１．７当量、１６．１モル)を含む３．０ｍＭのジメチルアセトアミド(ＤＭＡ、最終反応混合物中３％ｖ／ｖ)を抗体溶液に添加する。反応は、２０時間、室温でアルゴン下にて進行させられる。反応物を、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５にて平衡化したセファクリルＳ３００ゲル濾過カラム(５．０ｃｍ×９０．０ｃｍ、１．７７Ｌ)に充填する。流量は５．０ｍｌ／分であり、６５の画分(各々２０．０ｍｌ)が回収される。画分をプール化し、アッセイし、ここで、抗体分子当たりに結合したＤＭ１薬剤分子の数（ｐ’）が２５２ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度を測定することにより決定される。
また、例示として、毒素ＤＭ１への精製モノクローナル抗体のコンジュゲーションは、以下の通りに達成されうる。精製抗体は、(スクシンイミジル４(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート(ＳＭＣＣ、Pierce Biotechnology, Inc)で誘導体化され、ＳＭＣＣリンカーを導入する。抗体を、５０ｍＭのリン酸カリウム／５０ｍＭの塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中で、７．５モル当量のＳＭＣＣ(ＤＭＳＯ中に２０ｍＭ、６．７ｍｇ／ｍｌ)中で２０ｍｇ／ｍｌで処理する。室温のアルゴン下で２時間撹拌した後に、反応混合物を、５０ｍＭのリン酸カリウム／５０ｍＭの塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５にて平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムで濾過する。抗体を含有する画分をプール化して、アッセイする。ついで、抗体−ＳＭＣＣを、５０ｍＭのリン酸カリウム／５０ｍＭの塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５で希釈して、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌとし、１０ｍＭのＤＭ１を含むジメチルアセトアミド溶液(１．７当量、５ＳＭＣＣ／抗体と推定、７．３７ｍｇ／ｍｌ)と反応させる。反応物を１６．５時間、室温、アルゴン下で撹拌する。ついで、コンジュゲーション反応混合物を、ｐＨ６．５の１×ＰＢＳを用いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲル濾過カラム(１．５×４．９ｃｍ)で濾過する。ついで、ＤＭ１／抗体比（ｐ）を２５２ｎｍと２８０ｎｍの吸光度にて測定する。
更に、選択した抗体の遊離システインを、ビスマレイミド試薬ＢＭ(ＰＥＯ)４(Pierce Chemical)にて修飾して、抗体の表面上の未反応マレイミド基を除去する。これは、ＢＭ(ＰＥＯ)４を５０％のエタノール／水混合物に１０ｍＭの濃度になるまで溶解して、およそ１．６ｍｇ／ｍｌ(１０マイクロモル)の濃度でリン酸緩衝食塩水に抗体を含む溶液に１０倍のモル過剰量を加え、１時間反応させることによって達成される。過剰なＢＭ(ＰＥＯ)４は、３０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６と１５０ｍＭのＮａＣｌバッファーによるゲル濾過によって除去する。およそ１０倍のモル過剰ＤＭ１を、ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)に溶解して、抗体-ＢＭＰＥＯ中間体に加える。また、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)を用いて薬剤成分試薬を溶解させてもよい。反応混合物を一晩反応させて、ＰＢＳ中へのゲル濾過ないし透析を行って未反応薬剤を取り除く。ＰＢＳ中のＳ２００カラムによるゲル濾過を用いて、高分子量の凝集物を取り除き、精製された抗体-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１コンジュゲートを得る。
典型的には、細胞毒性剤は、抗体のしばしば多数のリジン残基により抗体にコンジュゲートされている。対象の抗体中に存在するか操作したチオール基によるコンジュゲーションがまた達成される。例えば、システイン残基が遺伝子工学技術によってタンパク質内に導入され、リガンドに対する共有結合部位を形成する(Better等 (1994) J. Biol. Chem. 13:9644 9650；Bernhard等 (1994) Bioconjugate Chem. 5:126 132；Greenwood等 (1994) Therapeutic Immunology 1:247 255；Tu等 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862 4867；Kanno等 (2000) J. of Biotechnology, 76:207 214；Chmura等 (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15): 8480 8484；米国特許第６２４８５６４号)。一旦遊離システイン残基が対象の抗体の中に存在すると、毒素はその部位に連結されうる。一例として、薬剤リンカー試薬であるマレイミドカプロイル-モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)、すなわちＭＣ-ＭＭＡＥ、マレイミドカプロイル-モノメチルアウリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)、すなわちＭＣ-ＭＭＡＦ、ＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥ又はＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦをＤＭＳＯに溶解し、既知濃度でアセトニトリルと水で希釈し、冷やしたシステイン誘導体化抗体を含むリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)に添加する。約１時間後に、過剰量のマレイミドを添加して反応を停止させ、未反応抗体チオール基を覆う。反応混合物を遠心限外濾過によって濃縮し、毒素コンジュゲート抗体を精製して、ＰＢＳ中のＧ２５樹脂による溶出によって脱塩し、無菌条件下で０．２ｍのフィルターで濾過して、保存のために凍結する。
更に、本発明の抗Ｈｈｉｐ１β１２抗体は、以下の技術を用いてアウリスタチン及びドロスタチン毒素(例えばＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ)にコンジュゲートされうる。抗体は、ｐＨ８．０の５００ｍＭのホウ酸ナトリウムと５００ｍＭの塩化ナトリウムに溶解して、過剰量の１００ｍＭのジチオトレイトール(ＤＴＴ)で処理する。３７℃で約３０分インキュベートした後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂で溶出することによってバッファー交換し、１ｍＭのＤＴＰＡを含むＰＢＳで溶出させる。溶液の２８０ｎｍの吸光度とＤＴＮＢ (Aldrich, Milwaukee, WI)と反応させて４１２ｎｍの吸光度の測定によるチオール濃度から、還元した抗体濃度を決定することによって、チオール／Ａｂ値を調べる。ＰＢＳに溶解した還元抗体を氷上で冷やす。
薬剤リンカー試薬である(１)マレイミドカプロイル-モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)、すなわちＭＣ-ＭＭＡＥ、(２)ＭＣ-ＭＭＡＦ、(３)ＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥ又は(４)ＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦをＤＭＳＯに溶解して、既知濃度でアセトニトリルと水に希釈し、ＰＢＳ中の冷やした還元抗体に添加する。約１時間後に、過剰量のマレイミドを添加して反応を停止させ、未反応の抗体チオール基を覆う。反応混合物を遠心限外濾過によって濃縮し、コンジュゲートした抗体を精製し、ＰＢＳ中のＧ２５樹脂による溶出によって脱塩し、無菌条件下で０．２ｍのフィルターで濾過し、保存のために凍結する。
実施例１６：特異的抗体を用いたＨｈｉｐ１ポリペプチドの精製
天然又は組換えＨｈｉｐ１ポリペプチドは、この分野の様々な標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド、成熟Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド、又はプレ-Ｈｈｉｐ１ポリペプチドが、対象のＨｈｉｐ１ポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗Ｈｈｉｐ１ポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて構築される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製の何れかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ活性化セファロースTM(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有的に結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＨｈｉｐ１ポリペプチドを含む細胞からの画分を調製することによるＨｈｉｐ１ポリペプチドの精製に利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野でよく知られた他の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶性Ｈｈｉｐ１ポリペプチドは、細胞が増殖される培地中に有用な量で分泌されうる。
可溶性Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチド含有調製物を免疫親和性カラムに通し、カラムをＨｈｉｐ１ポリペプチドの優先的な吸光を可能にする条件下(例えば、洗浄剤存在下での高イオン強度バッファー)で洗浄する。ついで、カラムを、抗体／Ｈｈｉｐ１ポリペプチド結合を破壊する条件下(例えば、およそ２−３のような低ｐＨバッファー、又は高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離させ、Ｈｈｉｐ１β１２ポリペプチドが収集する。
前記の文書による明細書は当業者に発明を実施させるのに十分であると考えられる。本発明は、ここに開示された特定の例証によって範囲が制限されるものではない。実際、ここに示され説明されたものに加えて本発明の様々な変更が前記記載から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲に入る。

Claims (25)

  1. 配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６の何れか一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列、又はその相補鎖を有する単離された核酸。
  2. 配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６の何れか一に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又はその相補鎖を有する単離された核酸。
  3. 請求項１又は２に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
  4. 請求項３に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
  5. ポリペプチドの製造方法において、請求項４に記載の宿主細胞を上記ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、上記ポリペプチドを細胞培養物から回収することを含んでなる方法。
  6. 配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６の何れか一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
  7. 配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６の何れか一のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
  8. 異種ポリペプチドに融合せしめられた請求項６又は７に記載のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド。
  9. 配列番号：７、１７、１９−２５、３８、５３−５５、及び７２−８２の何れか一のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する単離されたオリゴペプチド。
  10. 配列番号：３９のアミノ酸配列を有するペプチドを含んでなり、Ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドに結合するＨｈｉｐ１ Ｌ２ループ模倣オリゴペプチド。
  11. Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈタンパク質のＬ２ループに結合する化合物を含んでなる有機小分子であり、Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈへのＨｈポリペプチドの結合を阻害する有機小分子。
  12. Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈタンパク質のＬ２ループを模倣する化合物を含んでなる有機小分子であり、Ｈｈポリペプチドポリペプチドに結合し、Ｈｈシグナル伝達を阻害する有機小分子。
  13. Ｐｔｃｈタンパク質のＬ２ループに結合し、Ｈｈシグナル伝達をアンタゴナイズする化合物を含んでなる有機小分子。
  14. （ａ）請求項６のポリペプチド；
    （ｂ）請求項７のポリペプチド；
    （ｃ）請求項８のキメラポリペプチド；
    （ｆ）請求項９のオリゴポリペプチド；
    （ｇ）請求項１０のオリゴポリペプチド；
    （ｈ）請求項１１の有機分子；又は
    （ｉ）請求項１２の有機分子
    を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含有する物質の組成物。
  15. （ａ）容器と
    （ｂ）該容器に収容された請求項１４に記載の物質の組成物
    を含んでなる製造品。
  16. Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈを発現する細胞の増殖を阻害する方法において、該Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈに結合するオリゴペプチド又は有機分子と上記細胞を接触させることを含み、該Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈへの上記オリゴペプチド又は有機分子の結合が上記細胞の増殖の阻害を引き起こす方法。
  17. Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈタンパク質を発現する細胞を含む癌性腫瘍を持つ哺乳動物を治療的に処置する方法において、そのような処置を必要とする被検体に、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合抗体、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ抗イディオタイプ抗体、Ｈｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２結合有機分子、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣オリゴペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣有機分子の有効量を投与し、それによって上記哺乳動物を効果的に処置することを含む方法。
  18. Ｈｈｉｐ１又はＰｔｃｈタンパク質を発現する細胞における細胞増殖を治療又は予防する方法において、そのような処置を必要とする被検体に、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ結合抗体、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ抗イディオタイプ抗体、Ｈｈｉｐ１β１２結合オリゴペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２結合有機分子、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣オリゴペプチド、Ｈｈｉｐ１β１２Ｌ２ループ模倣有機分子の有効量を投与し、それによって上記細胞増殖性疾患を効果的に治療又は予防することを含む方法。
  19. 抗Ｈｉｐ Ｌ２ループ抗体。
  20. 抗イディオタイプＨｈｉｐ１ Ｌ２ループ抗体。
  21. 抗Ｐｔｃｈ Ｌ２ループ抗体。
  22. 抗イディオタイプＰｔｃｈ Ｌ２ループ抗体。
  23. 細胞におけるＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達を阻害する方法において、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ産生細胞又はＨｅｄｇｅｈｏｇ応答組織に、配列番号：１７−４４の何れか一のアミノ酸配列を含む少なくとも８から１５のアミノ酸長のオリゴペプチドを投与することを含む方法。
  24. オリゴペプチドが配列番号：３９−４４の何れか一のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 配列番号：１７−４４の何れか一のアミノ酸配列を含む少なくとも８から１５のアミノ酸長のオリゴペプチドと薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物。
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