JP2011518320A5

JP2011518320A5 -

Info

Publication number: JP2011518320A5
Application number: JP2011503120A
Authority: JP
Filing date: 2009-04-01
Publication date: 2014-03-13
Anticipated expiration: 2029-04-01

Description

Repeated staining of biological samples

多重化用途では、タンパク質発現又は空間分布を定量的又は定性的に調べるために、組織試料又は組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を複数の分子プローブで染色する必要がある。染色プロセスは一般に、誤差を生じやすい時間のかかる技術を用いて実施される。染色プロセスで使用される試薬は、多くの場合、高価であり、保管期限が限られており、そのため特別な取扱い技術が必要とされる。 For multiplexed applications, it is necessary to stain a tissue sample or tissue microarray (TMA) with multiple molecular probes to quantitatively or qualitatively examine protein expression or spatial distribution. The dyeing process is generally performed using time consuming techniques that are prone to errors. The reagents used in the dyeing process, in many cases, are expensive, have a limited shelf life, Ru is that for special handling techniques are required.

顕微鏡フローセルを組織試料の反応チャンバとして或いは流動条件下での細胞の活動をモニタするために利用する自動化システムが存在する。しかし、かかるシステムは、組織試料の処理に使用するのには十分に適合しておらず、フローセル内部での試料の環境制御が欠けており、手作業を必要とする。 Microscopic flow cell there is an automated system that utilizes to monitor the activities of cells in or flow conditions as a reaction chamber of a tissue sample. However, such systems are not well suited for use in the processing of tissue samples, lack the environmental control of the sample within the flow cell, and requires the manual.

フローセルを通る試薬（例えば、発光試薬）の流体速度は、流体が小容積チャンバ内部で乱流を生じたり、試料を押し出したり、損傷するおそれがあるので、制御が困難である。また、周辺の外部加熱（例えば、加熱された顕微鏡ステージによるもの）によって、封入された試料の不均一な加熱を生じるおそれもある。そのため、試料に温度変化が生じる。さらに、試薬の調製、試料の除去及び画像取得のためのステージへの置換の繰返しによって、試料の再位置合わせが必要になり、再現性が低下する。 Reagent through the flow cell (e.g., luminescent reagent) fluid velocity is, or turbulence within the fluid small volume chamber, or extruded sample, since there is a risk of damage is difficult to control. The peripheral external heating (e.g., by the heated microscope stage) to Thus, a possibility also cause uneven heating of the encapsulated sample. Therefore , a temperature change occurs in the sample. Furthermore, preparation of reagents, the repeated replacement of the stage for the removal and image acquisition of the sample, re-positioning of the sample is required, reproducibility is lowered.

米国特許出願公開第２００８／００３８７３８号明細書US Patent Application Publication No. 2008/0038738

本発明は一般に、イメージング用途からの生体試料の反復染色を容易にする自動化された方法及びデバイスに関する。 The present invention relates generally to automated methods and devices that facilitate repeated staining of biological samples from imaging applications.

いくつかの実施形態では、方法は、生体試料を含む小容積フローセルを用意する段階と、生体試料に染色剤を添加する段階と、活性化脱染色剤を形成するための２種以上の前駆体試薬を混合する段階であって、活性化脱染色剤の分解速度が脱染色反応速度と同じかそれよりも大きい段階と、脱染色剤を生体試料の上に活性化脱染色剤の分解速度よりも大きい流速で流す段階とを含む。染色、混合、流すプロセスは、逐次繰返すことができる。 In some embodiments, the method includes the steps of providing a small volume flow cell containing a biological sample, comprising the steps of: adding dye to a biological sample, two or more precursors to form an activated leaving stain a stage you mixed reagent, decomposition rate of degradation of the activation de stain is equal to or larger steps than the de-staining reaction rate, activation de stain de stain on the biological sample Flowing at a flow rate greater than the velocity. Staining, mixing, flow process can be repeated sequentially.

いくつかの実施形態では、生体試料の反復染色のためのデバイスを提供するが、本デバイスは、プレミキサーと流体連通したフローセルを備えており、プレミキサーの容積容量はフローセルの容積容量の約５倍よりも小さい。 In some embodiments, provides a device for repeated staining a biological sample, the device comprises a pre-mixer in fluid communication with the flow cell, the volume capacity of the premixer is from about volume capacity of the flow cell 5 smaller than doubled.

いくつかの実施形態では、フローセルは、組織試料を受けるように構成された基部と、熱電素子と、基部と熱電素子との間のガスケット位置と、プレミキサーと流体連通した入口ポートと、出口ポートとを備えており、基部及び熱電素子の一方又は両方が画像取得ウインドウを含む。フローセルはさらに、脱気装置及び圧電素子を含むことができる。 In some embodiments, the flow cell, and a base configured to receive a tissue sample, a thermoelectric element, a gasket position between the base and the thermoelectric element, and the pre-mixer in fluid communication with the inlet port, an outlet port It includes bets, one or both of the base and the thermoelectric element includes an image acquisition window. The flow cell can further include a deaerator and a piezoelectric element.

代表的なフローセルデバイスを示す図である。1 is a diagram illustrating a representative flow cell device. FIG. フローセルデバイスで使用するための脱気装置を示す図である。It is a figure which shows the deaeration apparatus for using with a flow cell device. プレミキサーとして圧電素子を使用し、脱色剤の反応時間の改善を示す図である。It is a figure which shows the improvement of the reaction time of a decoloring agent using a piezoelectric element as a premixer.

以下の詳細な説明は例示的であり、本発明の用途及び使用を限定するものではない。さらに、以下の図面の詳細な説明の従来の発明の背景技術に記載されたいかなる理論によっても限定されるものではない。 The following detailed description is exemplary and is not intended to limit the application and use of the invention. Further, the present invention is not limited by any theory described in the background art of the prior invention in the detailed description of the following drawings.

本発明で特許請求する主題をより明確かつ簡潔に説明し指摘するために、以下の説明及び添付の特許請求の範囲で使用される、特定の用語を以下の通り定義する。 In order to more clearly and concisely point out and point out the claimed subject matter of the present invention, specific terms used in the following description and appended claims are defined as follows.

単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、他に特段の記載がない限り、複数形を含む。本明細書及び特許請求の範囲を通して使用される場合、類似の用語は、関連する基本的機能を変えることなく、許容範囲内で変化することができる定量的表現を修正するために適用することができる。したがって、「約」などの用語で修飾された値は、正確な指定値に制限されない。他に特段の記載がない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される、分子量、反応条件等の、成分の量、特性を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、特に反対の記載がない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、本発明によって取得しようとする所望の特性に応じて変化することができる近似値である。最下位の各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め方法を適用して、解釈されるべきである。 The singular forms “a”, “an”, and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. As used throughout the specification and claims, similar terms may be applied to modify quantitative expressions that may vary within acceptable limits without changing the associated basic function. it can. Thus, a value modified with a term such as “about” is not limited to the exact specified value. Unless otherwise stated, all numbers used in the specification and claims to express the amounts of ingredients, properties, such as molecular weight, reaction conditions, etc., are in all cases referred to by the term “about”. It should be understood as being modified. Accordingly, unless stated to the contrary, the numerical parameters set forth in the following specification and appended claims are approximations that can vary depending on the desired properties sought to be obtained by the present invention. is there. Each lowest numerical parameter should be interpreted at least in light of the number of significant digits reported and applying normal rounding methods.

本明細書で用いる「生体試料」という用語は、生体内又は生体外で得られた生体組織又は流体由来の試料を始めとする、生体から得られた試料をいう。かかる試料は、限定はされないが、ヒトを含む哺乳類から単離された組織、画分及び細胞とすることができる。 The term "biological sample", as used herein, including sample of biological tissue or fluid origin obtained et the in vivo or in vitro, refers to a sample obtained from the raw body. Such samples include, but are not limited to, isolated tissue from a mammal, including humans, can be a fraction and cells.

本明細書で用いる「ルミフォア」という用語は、化学発光、生物発光、リン光及びフォトルミネセンスを始めとする発光を呈する化合物をいう。代表的な例には、限定はされないが、ルミノール、ルシゲニン、アクリダン、アクリジニウムエステル及びジオキセタン、並びにフルオロフォアが含まれる。 The term "lumiphores" as used herein, chemiluminescence refers to a bioluminescent compound emits light including a phosphorescent 及 beauty photoluminescence. Typically examples include, but are not limited to, luminol, lucigenin, acridan, acridinium ester 及 beauty dioxetane, as well as fluorophore-containing Murrell.

本明細書で用いる「オキシダント」又は「酸化剤」という用語は、実質的にルミフォアを不活性化する脱色剤をいう。代表的な酸化剤には、活性酸素種、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素、過酸化水素、或いは過酸化水素、過マンガン酸カリウム、二クロム酸ナトリウム、臭素水溶液、ヨウ素−ヨウ化カリウム又はｔ−ブチルヒドロペルオキシドのようなオゾンが含まれる。 As used herein, the term “oxidant” or “oxidant” refers to a decolorizing agent that substantially inactivates the lumiphore. Representative oxidizing agents, reactive oxygen species, hydroxyl radicals, potassium singlet oxygen, hydrogen peroxide, walk hydrogen peroxide, permanganate, sodium dichromate, aqueous bromine, iodine - potassium iodide or t - ozone, such as butyl hydroperoxide including Murrell.

本発明は、試料（例えばフローセル内部のスライド上の試料）の移送の必要性をなくすことにより、オペレータの最小限の介入で動作する、自動化システム及び方法に関する。開示されたシステム及び方法はさらに、染色部品とイメージング部品との間で試料を移動させる必要がなくなる。 The present invention, by eliminating the need for transfer of the sample (e.g., sample on the flow cell inside the slide), operates with minimal operator intervention, to automated systems and methods. The disclosed systems and methods further, there is no need to move the sample between the stained parts and imaging components.

染色部品の自動化によって、試薬の容積とシステム内での試薬滞留時間とが最小限になり、蛍光標識抗体などの高価な試薬が節約され、試薬の分解又は副反応が最小限になる。また、試薬測定値のバラツキが減少し、試薬間の相互汚染の発生を低減することができる。イメージング部品の自動化によって、画像の位置合わせ及び染色後の試料の再装着に伴う段階が排除又は減る。画像登録の改良によって、正確な合成画像の形成が容易になる。 By automated staining components, it minimizes the reagent residence time in the reagent volume and system, saves expensive reagents, such as fluorescent labeled antibody, ing to minimize the decomposition or side reaction of the reagents. In addition, variation in reagent measurement values is reduced, and the occurrence of cross-contamination between reagents can be reduced. By automated imaging components, steps associated with the re-attachment of the alignment and sample after staining images exclusion or Ru reduced. Improvements in image registration facilitate the formation of accurate composite images.

自動化は、染色剤及び酸化剤の添加など、逐次染色に係るプロセス段階の１つ以上をコンピュータ制御することによって達成することができる。フローセルシステムが、試料処理及び画像取得統合システムに組み込まれている場合、画像取得部品（例えば、顕微鏡又はカメラ）は、ＬａｂＶＩＥＷ又はＣで書かれたプログラムのようなソフトウェアによって制御することもできる。 Automation, such as the addition of dye and oxidizing agents, one or more of the process steps according to the sequential staining can be achieved by computer control. Flow cell system, when incorporated in specimen processing and image acquisition integrated system, the image acquisition components (e.g., microscope or camera) may also be controlled by software, such as programs written in LabVIEW or C.

デバイス
本明細書では、開示された方法を実施するためのデバイスを提供する。例えば、本明細書では、フローセル並びにフローセル及びプレミキサーを含むシステムを提供する。 Devices Provided herein are devices for performing the disclosed methods. For example , the present specification provides a flow cell and a system including a flow cell and a premixer.

図１に示す１つの実施形態では、フローセルは、組織試料上に位置するように構成された、閉鎖フローチャンバを含むことができる。フローセルは、固体支持体−受け部材１０、スライド１２上に配置された組織試料を受けるように構成された中央開口を有するガスケット１１、蓋１４、入口ポート１５及び出口ポート１６を含むことができ、スライドをスライド受け部材に配置して、ガスケットをスライドと蓋との間に挟み込むと、フローセルは閉鎖チャンバを画成する。フローチャンバはフローセル内部に閉じ込められるので、流体の蒸発、及び試薬の損失が最小限になる。また、閉じられた構成によって温度制御が改善される。 In one embodiment shown in FIG. 1, the flow cell was constructed so that to position on the tissue sample may include a closed flow chamber. Flow cell, the solid support - receiving member 10, a gasket 11 having a configured central aperture to receive a tissue sample disposed on the slide 12, the lid 14 can include an inlet port 15 及 beauty outlet port 16 When the slide is placed on the slide receiving member and the gasket is sandwiched between the slide and the lid, the flow cell defines a closed chamber. Since the flow chamber is confined within the flow cell, the evaporation of the fluid, and loss of reagents ing to a minimum. The closed configuration also improves temperature control.

フローセルは、標準的な顕微鏡ステージ上に嵌め込むように適合されたモジュラー式ユニットとすることができる。或いは、フローセルは、顕微鏡ステージを含む一体型ユニットとすることもできる。いくつかの実施形態では、フローセルは、イメージングプロセスのために顕微鏡ステージ上に固定することができる。これにより、手作業を介さずに、試料を完全な一連の試薬に曝露させることができ、それにより、画像取得又は登録のための顕微鏡ステージ上での試料の再位置合わせをなくすことができる。各染色段階後に取得される画像は、合成画像を形成するために重ね合わせることができるので、これは特に多重染色及びイメージングにとって有用である。 The flow cell can be a modular unit adapted to fit on a standard microscope stage. Alternatively, the flow cell can be an integrated unit that includes a microscope stage. In some embodiments, the flow cell can be fixed on a microscope stage for the imaging process. Thus, without using the manual, it is possible to expose the sample to complete a series of reagents, whereby it is Succoth to eliminate the re-alignment of the sample on the microscope stage for image acquisition or registered The This is particularly useful for multiple staining and imaging, as the images acquired after each staining stage can be overlaid to form a composite image.

フローセルは、フローセルのチャンバ内部の流体の送液及び溶液温度を制御するための流体及び温度制御サブシステムを含むシステムで使用することができる。１つの実施形態では、流体制御システムはさらに、フローセルに注入する前に１種以上の試薬を調製するための容器、フローセンサー、混合チャンバ及び脱気装置を含むことができる。かかるシステムの利点は、安定性又は保管期限が限られていることがある試薬を、予混合し保存する必要性がなくなることである。流体制御システムは、流体の入口ポート及び出口ポートと流体連通している。 The flow cell can be used in a system including a fluid and temperature control subsystem for controlling the feeding and solution temperature of the fluid inside the chamber in the flow cell. In one embodiment, the fluid control system may further include container for preparing one or more reagents prior to injection into the flow cell, flow sensors, mixing chambers 及 beauty degasser. The advantage of such a system is that it eliminates the need to premix and store reagents that may have limited stability or shelf life . The fluid control system is in fluid communication with the fluid inlet and outlet ports.

スライド受け部材
いくつかの実施形態では、フローセルは、ガラススライドなどの固体支持体上に配置された組織試料を受けるように構成されたスライド受け部材を含むことができる。スライド保持器は、ある範囲の化学及び温度変動に対して適合性がある。１つの実施形態では、スライド保持器は、基部及びスライドをチャンバ内に固定するためのピン又はタブシステムからなることができる。 Slide receiving member In some embodiments, the flow cell can include a slide receiving member configured to receive a tissue sample disposed on a solid support, such as a glass slide. Slide holder is compatible with respect to chemical and temperature variations in the range. In one embodiment, the slide holder may consist of a pin or tab system for securing the base and slide within the chamber.

ガスケット
フローセルは、スライド上に配置された組織試料を受けるように構成された中央開口を有するガスケットを含む。ガスケットは、フローチャンバに加えられた液体を保持する変形可能で化学的に不活性なゴム又はプラスチックから形成することができる。ガスケットは、任意で、入口及び出口ポートのための開口を含んでいてもよい。ガスケットの中央開口は、画像取得ウインドウの視野を最大限にするサイズとすることができる。フローセル内に配置されたときのガスケットの幅、長さ及び深さは、それぞれ、フローセルの所定の内部容積を達成するように変更できる。いくつかの実施形態では、ガスケットの幅及び長さは、標準的な組織切片スライド又はマイクロアレイ基板に適合するサイズとすることができる。例えば、１つの実施形態では、ガスケットの中央開口は、幅２０ｍｍ及び長さ３０ｍｍの組織マイクロアレイに適合させることができる。 The gasket flow cell includes a gasket having a central opening configured to receive a tissue sample disposed on a slide. The gasket can be formed from a deformation possible chemically inert rubber or plastic to hold the liquid applied to the flow chamber. Gasket, optionally, the opening for the inlet and outlet ports may be free Ndei. The central opening of the gasket can be sized to maximize the field of view of the image acquisition window. The gasket when positioned into the flow cell width, length 及 beauty depth, respectively, can be varied to achieve a predetermined internal volume of the flow cell. In some embodiments, the width and length of the gasket may be sized to fit a standard tissue section slide or microarray substrate. For example, in one embodiment, the central opening of the gasket can be adapted to a tissue microarray that is 20 mm wide and 30 mm long.

入口及び出口ポート
入口及び出口ポートは、好ましくは、画像取得ウインドウから離れて置かれている。例えば、入口及び出口ポートは、ガスケット内又は蓋の上に配置することができる。入口及び出口ポートは一般に、流入速度及び流出速度が協調して試料で流体の所望の速度が達成されるように、サイズが一致している。 Inlet and outlet ports The inlet and outlet ports are preferably located away from the image acquisition window. For example , the inlet and outlet ports can be located in the gasket or on the lid. The inlet and outlet ports are generally, as the desired speed of the inflow rate and fluid outflow velocity cooperate sample is achieved, and size match.

温度制御
図１をさらに参照すると、温度制御ユニットはさらに、温度制御のための熱電気ステージ１７及び温度測定のためのＲＴＤ／サーミスタを含むことができる。温度制御ユニットの底面が流体に直接接触する構成では、接触面１８は、ステンレス鋼又はチタンなど、耐薬品性材料から形成することができる。温度制御ユニットの部品を配置するためにフレーム１９を使用することもできる。 Temperature Control With further reference to FIG. 1, the temperature control unit may further include a thermoelectric stage 17 for temperature control and an RTD / thermistor for temperature measurement. In configurations where the bottom surface of the temperature control unit is in direct contact with the fluid, the contact surface 18 can be formed from a chemically resistant material such as stainless steel or titanium. A frame 19 can also be used to arrange the components of the temperature control unit.

いくつかの実施形態では、温度制御ユニット（例えば、Ｐｅｌｔｉｅｒスタック）とスライドとの間に形成された内部チャンバが、組織スライドを通してではなく、温度制御ユニットによって直接加熱されるように、温度制御ユニットが蓋に組み込まれている。この構成によって、イメージングのための組織スライドの後面が解放される。 In some embodiments, the temperature control unit is such that the internal chamber formed between the temperature control unit (eg, Peltier stack) and the slide is heated directly by the temperature control unit rather than through the tissue slide. Built in the lid. This configuration frees the rear surface of the tissue slide for imaging.

脱気装置
いくつかの実施形態では、本発明はさらに、フローセルからの気体の除去を助けるための方法を含む。図２に示すように、非晶質フルオロポリマー又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のような気体透過性フィルム２０を使用して、通気路２１と試料２３を含む流体チャンバ２２とを分離してもよい。かかる構成では、逆圧又は真空にすることによってシステムを通気し、チャンバ内の過剰な気体を除去する。 Deaerator In some embodiments, the present invention further includes a method to assist in the removal of gas from the flow cell. As shown in FIG. 2, a gas permeable film 20 such as an amorphous fluoropolymer or polydimethylsiloxane (PDMS) may be used to separate the air passage 21 and the fluid chamber 22 containing the sample 23. . In such a configuration, the system is vented by reverse pressure or vacuum to remove excess gas in the chamber.

攪拌
いくつかの実施形態では、本発明はさらに、フローチャンバに連結され、低電圧電気信号を音響エネルギーへと変換することによってフローチャンバ内部で振動を生じさせることができる圧電素子を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、圧電素子は、セラミック、石英（ＳｉＯ₂）又はチタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ₃）から構成することができる。圧電素子の構成は超音波攪拌をもたらし、流体チャンバを通る試薬の流動プロファイルに影響を及ぼす。これは、所望の染色反応が拡散律速であってフローセルの形状のため従来の機械的混合ができない場合に、特に有利である。
コンピュータ処理ユニット
コンピュータは、例えば、熱制御ユニット、プレミキサー、振動ユニット及びポンプを含めて、フローセルシステムの様々な部品を制御することができる。フローセルシステムが、試料処理及び画像取得統合システムに組み込まれている場合、画像取得部品（例えば、顕微鏡又はカメラ）を、コンピュータによって制御することもできる。 In stirring some embodiments, the present invention further is connected to the flow chamber, Nde piezoelectric element a low voltage electrical signal can Rukoto not live difference vibrations within the flow chamber by converting into acoustic energy including May be . In a preferred embodiment, the piezoelectric element can be composed of ceramic, quartz (SiO ₂ ) or barium titanate (BaTiO ₃ ). The configuration of the piezoelectric element provides ultrasonic agitation and affects the flow profile of the reagent through the fluid chamber. This is because when the desired staining reaction can not conventional mechanical mixing due to the shape of the flow cell I diffusion control der, is particularly advantageous.
Computer processing unit computer, for example, including a thermal control unit, the premixer, the vibration unit 及 beauty pump, it is possible to control the various components of the flow cell system. Flow cell system, when incorporated in specimen processing and image acquisition integrated system, the image acquisition components (e.g., microscope or camera) may also be controlled by a computer.

方法
本明細書ではまた、固体支持体に付着した生体試料（例えば、顕微鏡スライドに固定された組織切片）から画像を処理し取得する方法を提供する。本方法は、具体的用途に合わせて選択されたデバイスの様々な代替実施形態を使用する段階を含む。生体試料の反復処理の代表的な方法は、本願出願人の米国特許出願公開第２００８−０１１８９４４号に記載されており、本願に援用する。 Methods This specification also provides a method for processing and acquiring images from a biological sample attached to a solid support (eg, a tissue section fixed to a microscope slide). The method includes the use of various alternative embodiments of the device selected to suit the particular application. Representative methods iteration of biological samples is described in the Applicant U.S. Patent Application Publication No. 2008-0118944, incorporated herein by reference.

１つの代表的な方法は、（ａ）生体試料（顕微鏡スライド上の組織切片など）をフローセル内に配置する段階と、（ｂ）ルミフォアと試料との十分な接触時間（典型的には、使用する標識の濃度及びタイプに応じて３０〜６０分間）が得られるように蛍光標識又はルミフォアを試料に添加する段階と、（ｃ）結合していない蛍光標識又はルミフォアを洗い流すための洗浄液（例えば適切な緩衝液など）を添加する段階と、（ｄ）標識試料の画像を取得する段階と、（ｅ）ルミフォアを実質的に不活性化する酸化剤を添加することによって段階（ｂ）のルミフォアを破壊するための化学試薬を添加する段階であって、酸化剤溶液を、連続流プロセスを用いて試料に添加して、フローセル内の非層流及び滞留時間を最小限にして平均滞留時間が１〜５分間となるようにする段階と、（ｆ）任意で試料の画像を取得する段階と、（ｇ）段階（ｂ）〜（ｆ）を１回以上繰返す段階とを含む。 One exemplary method comprises the steps of (a) BIOLOGICAL samples (such as tissue sections on a microscope slide) is disposed within the flow cell, (b) Le Mifoa sufficient contact time of the sample (typically , cleaning liquid to wash the steps of a fluorescent label or lumiphores as 30-60 minutes) is obtained according to the concentration and type of label used is added to the sample, a fluorescent label or lumiphores unbound (c) ( for example the step of adding a suitable buffer such as), (d) a step of acquiring an image of the labeled specimen, (e) lumiphores steps by substantially adding an oxidizing agent to inactivate the (b) a step of adding a chemical reagent to destroy the lumiphores, the oxidizing agent solution was added to the sample using a continuous flow process, the mean residence with a minimum of non-laminar flow and the residence time in the flow cell time is 1 Comprising the steps of such a 5 minutes, the steps of acquiring an image of the sample at (f) optionally, a step of repeating one or more times a step (g) (b) ~ (f).

添加段階はそれぞれ、特定の試薬を含む溶液をフローセル内部に配置された生体試料上に流すことによって達成することができる。反応性を高めて試薬の消費量を減らすために以下のパラメータ：（１）フローセルの内部容積、（２）フローセルの内部温度、（３）酸化溶液の成分（例えば、過酸化水素及び重炭酸ナトリウム）の混合のタイミング、（４）試料を通過するときの溶液の攪拌の程度及び（５）フローセルの脱泡又は脱気を制御することができる。これらのパラメータを適切に調整すると、試料の劣化を低減することができ、単一の試料でより多くのデータを得ることができる。 Each of the addition steps can be accomplished by flowing a solution containing a specific reagent over a biological sample placed inside the flow cell. To increase the reactive reagents the following parameters in order to reduce the consumption of: (1) the internal volume of the flow cell, (2) the internal temperature of the flow cell, (3) the constituents of the oxidative solution (e.g., hydrogen peroxide and sodium bicarbonate mixing timing), it is possible to control the (4) solution extent 及 beauty (5) defoaming or degassing of the flow cell of stirring when passing through the sample. If these parameters appropriately adjusting, it is possible to reduce degradation of the sample, Ru can Rukoto get more data on a single sample.

自動化された脱染色段階によって、操作者がオリジナルの登録を維持しながら単一の試料をリプローブすることが可能になる。酸化剤を追加すると、ルミフォアによって生成された信号がほとんど除去されるため、生体試料が脱染色される。ルミフォアの化学変化によって、又は除去によって、脱染色が完了すると、８０％以上、好ましくは９０％超の信号の低下が起きる。この信号の低下は、背景信号の同時低下又は脱染色段階による自己蛍光を調整するための、染色された生体試料の当初の絶対強度に対する特定の波長での染色後の強度として測定することができる。 An automated destaining step allows the operator to reprobe a single sample while maintaining the original registration. Adding the oxidant removes most of the signal generated by the lumiphore, thus destaining the biological sample. When destaining is complete, either by chemical change of the lumiphore or by removal, a signal drop of 80% or more, preferably more than 90%, occurs. This reduction in signal can be measured as the intensity after staining at a specific wavelength relative to the original absolute intensity of the stained biological sample to adjust for autofluorescence due to simultaneous reduction of the background signal or the destaining step. .

フローセルの内部チャンバ容積
小容積フローセルは高価な試薬を保存する。試薬の拡散が律速段階である場合、フローは内部チャンバ容積と相互関連するはずである。例えば、チャンバを急速に完全に洗浄することができるように、フローセルへの流体の送り込みをチャンバの容積容量に基づいて調整することができる。 The internal volume of the flow cell The small volume flow cell stores expensive reagents. If reagent diffusion is the rate limiting step, the flow should correlate with the internal chamber volume. For example, the fluid delivery to the flow cell can be adjusted based on the volumetric capacity of the chamber so that the chamber can be quickly and thoroughly cleaned.

フローセルは、試験の試料のための固体支持体を提供する。フローセルの寸法は使用される固体支持体に基づいて制限される。フローセルの高さは試料の厚さに基づいている。試料が組織切片であるとき、その厚さは約５μｍ〜約１００μｍとなり得る。組織切片は、２０ｍｍ×３０ｍｍの面積を占め得る。これにより、１０μＬ〜１０００μＬ、好ましくは５０μＬ〜２００μＬの小さい内部チャンバ容積となる。 The flow cell provides a solid support for the test sample. The size of the flow cell is limited based on the solid support used. The height of the flow cell is based on the thickness of the sample. When the sample is a tissue section, its thickness can be from about 5 μm to about 100 μm. The tissue section may occupy an area of 20 mm x 30 mm. This results in a small internal chamber volume of 10 μL to 1000 μL, preferably 50 μL to 200 μL.

分解は、試薬がフローセルから実質的に除去される前に起きる可能性がある。フローチャンバ内での乱流によって表面反応性が改善され、試薬の副産物（例えば、酸素ガス）の除去が容易になる。したがって、いくつかの実施形態では、チャンバは、乱流を生成する攪拌要素（例えば、音響圧電部品）を含むことができる。 Degradation can occur before the reagent is substantially removed from the flow cell. Turbulence in the flow chamber improves surface reactivity and facilitates removal of reagent byproducts (eg, oxygen gas). Thus, in some embodiments, the chamber can include a stirring element (eg, an acoustic piezoelectric component ) that generates turbulence.

内部チャンバ温度
多くのマイクロアレイ染色プロセスは２００℃〜１０００℃で行うが、いくつかのシステムは、狭い許容差で、著しく高い、又は低い温度を必要とする場合がある。染色に関連する吸着及び脱着プロセスは温度依存性であり、したがって、いくつかの実施形態では、化学的相互作用が起きる試料表面にわたって温度の均一性がもたらされる。 Internal chamber temperature Many microarray staining processes are performed at 200 ° C. to 1000 ° C., but some systems may require significantly higher or lower temperatures with narrow tolerances. The adsorption and desorption processes associated with staining are temperature dependent, and thus in some embodiments provide temperature uniformity across the sample surface where chemical interaction occurs.

例えば、積層された熱電素子を、チャンバ内又はチャンバ上へと導入することができ、素子を通って流れる電流が、チャンバ内部での流体の放射加熱によって、チャンバ温度を指定の温度範囲内で調節することができる。いくつかのシステムは、＋／−５℃の温度許容差を必要とすることがあり、他のシステムは、著しく狭い、又はより厳しくない温度許容差を有することがある。いくつかの実施形態では、熱電素子は、温度調節を容易にするように、熱を吸収し放散するヒートシンクを任意で含むことができる。 For example, stacked thermoelectric elements can be introduced into or onto the chamber, and the current flowing through the element regulates the chamber temperature within a specified temperature range by radiant heating of the fluid inside the chamber. can do. Some systems may require a temperature tolerance of +/− 5 ° C. and other systems may have a temperature tolerance that is significantly narrower or less severe. In some embodiments, the thermoelectric element can optionally include a heat sink that absorbs and dissipates heat to facilitate temperature regulation.

プレミキサー及び混合タイミング
多重染色で使用される試薬は保管期限が限られていることがあり、試薬の有効性が時間の経過とともに減少する。これは、化学反応を起こさせる２つ又はそれ以上の溶液の混合によって生成された試薬の一部が分解又は沈降し得るときに起きる。これにより、気体及び他の望ましくない副産物の形成につながる。いくつかの実施形態では、試薬をフローセルへと導入する直前に、反応物質を散在させるように、プレミキサーを使用して溶液を分子レベルで完全に混合する。混合時間は、試薬を生成するのに十分な長さであり、かつ分解を防ぐのに十分に限られた長さとする。 Reagents used in premixers and mixed timing multiple staining may have a limited shelf life, reducing reagent effectiveness over time. This occurs when a portion of the reagent produced by the mixing of two or more solutions that cause a chemical reaction can degrade or settle. This leads to the formation of gases and other undesirable by-products. In some embodiments, the premixer is used to thoroughly mix the solution at the molecular level so that the reactants are interspersed just prior to introducing the reagents into the flow cell. The mixing time should be long enough to produce the reagents and long enough to prevent degradation.

フローセルの上流に配置されたプレミキサーは、チャンバ設計又は管設計に基づくことができる。チャンバ設計は、入口及び出口ポートを備え、機械的ミキサーを含む小容器を含むことができる。管設計は、所定の流速で化学試薬が駆動されるＹアダプタを含むことができる。或いは、管設計は、物理的障害（例えば、管内部に配置されるマイクロメッシュ又は球状膜）又は乱流を生成するノズルを含むことができる。 The premixer located upstream of the flow cell can be based on a chamber design or a tube design. The chamber design can include a small container with an inlet and outlet port and containing a mechanical mixer. The tube design can include a Y adapter where the chemical reagent is driven at a predetermined flow rate. Alternatively, the tube design can include a nozzle that creates a physical obstruction (eg, a micromesh or spherical membrane placed inside the tube) or turbulence.

プレミキサーは、フローセルに導入する前に化学試薬の混合を可能にする。フローセルの容積容量は、化学試薬の分解速度及び化学試薬の所望の流速又はフローチャンバを通るそれらの反応生成物に基づいて決定される。 The premixer allows mixing of chemical reagents before introduction into the flow cell. The volume capacity of the flow cell is determined based on the degradation rate of the chemical reagent and the desired flow rate of the chemical reagent or their reaction products through the flow chamber.

所定の温度での過酸化物溶液の分解速度は−ｄＣ／ｄｔ＝ｋＣと等しく、Ｃは過酸化物の濃度、ｔは時間、ｋは一次速度定数である。一次反応の半減期は、初期濃度とは関係なく、ｔ_1/2＝ｌｎ（２）／ｋとして計算される。ｎ次反応の半減期はまた、ｔ_1/2＝２^n-1−１／（ｎ−１）ｋ［Ａ₀］^n-1として決定し表すことができる。 The decomposition rate of the peroxide solution at a given temperature is equal to -dC / dt = kC, where C is the concentration of peroxide, t is time and k is the first order rate constant. The half-life of the first order reaction is calculated as t _1/2 = ln (2) / k regardless of the initial concentration. The half-life of the n-th order reaction can also be determined and expressed as t _1/2 = 2 ⁿ⁻¹ −1 / (n−1) k [A ₀ ] ⁿ⁻¹ .

フローセル内部での滞留時間は、試薬の半減期よりも短いように制限される。したがって、フローセルの容積容量は次の通り決定される：Ｖｐ＜（Ｖ／ｔ）（ｔ_1/2）。ここで（Ｖｐ）はフローセルの容積容量、（Ｖ／ｔ）は流速である。 The residence time inside the flow cell is restricted to be shorter than the half-life of the reagents. Accordingly, the volume capacity of the flow cell is determined as follows: Vp <(V / t) (t _1/2 ). Here, (Vp) is the volume capacity of the flow cell, and (V / t) is the flow velocity.

ヒドロペルオキシドアニオンを生成する過酸化水素溶液などの酸化剤は、調整後５分間以内に分解し酸素ガスを発生する。一般に、フローセルの容積容量は、１〜１０００μＬ、好ましくは５０μＬ〜５００μＬとすることができる。フローセル内の試薬の平均滞留時間を確実に５分未満にするために、流速は好ましくは５０μＬ／分〜５００μＬ／分である。Ｖｐ＜（Ｖ／ｔ）（ｔ_1/2）を適用するとき、プレミキサーの容積容量は５〜５０００μＬ、好ましくは２５０μＬ〜２５００μＬに制限される。 An oxidizing agent such as a hydrogen peroxide solution that generates hydroperoxide anions decomposes within 5 minutes after the preparation to generate oxygen gas. In general, the volume capacity of the flow cell can be 1-1000 μL, preferably 50-500 μL. In order to ensure that the average residence time of the reagents in the flow cell is less than 5 minutes, the flow rate is preferably 50 μL / min to 500 μL / min. When applying Vp <(V / t) (t _1/2 ), the volume capacity of the premixer is limited to 5 to 5000 μL, preferably 250 μL to 2500 μL.

試薬容器
プレミキサーは１つ以上の試薬容器と流体連通している。試薬容器は、プレミキサーへ送り込む前の試薬の保存デバイスとして働く。フロー制御装置によって、計量された量の試薬をプレミキサーへと移すことが可能になる。複数の試薬の送り込みは連続的順序で又は平行して行うことができ、試薬の正確な計量及び試薬の相互汚染の低減が可能になる。
画像取得ウインドウ
開示された方法は、画像取得ウインドウを通して試料へのアクセスを高めることができるように構成されたフローセルを含む、システムで実施することができる。画像取得ウインドウは、試料をセットする基板（例えば、顕微鏡スライド）によって画成することができ、又は、スライド受け部材の下側に光透過性材料を含むことができる。 The reagent container premixer is in fluid communication with one or more reagent containers. The reagent container serves as a storage device for the reagent before it is fed into the premixer. The flow control device allows a metered amount of reagent to be transferred to the premixer. Multiple reagent feeds can be performed in sequential order or in parallel, allowing accurate metering of reagents and reduction of reagent cross-contamination.
Image Acquisition Window The disclosed method can be implemented in a system that includes a flow cell configured to enhance access to a sample through an image acquisition window. The image acquisition window can be defined by a substrate (eg, a microscope slide) on which the sample is set, or can include a light transmissive material on the underside of the slide receiving member.

したがって、本発明の方法は、処理の様々な段階中、カメラに接続された顕微鏡が試料の画像を取得することができる画像取得ウインドウから離れたところに加熱要素又は攪拌要素（例えば、音響圧電部品）などの付属デバイスが配置された、フローセルを使用して実施することができる。 Accordingly, the method of the present invention provides a heating or stirring element (eg, an acoustic piezoelectric component) away from an image acquisition window where a microscope connected to the camera can acquire an image of the sample during various stages of processing. ) Etc. can be implemented using a flow cell in which an attached device is arranged.

反応速度の制御
１つの実施形態では、３ｍｌの過酸化水素緩衝液（３％Ｈ₂Ｏ₂、ｐＨ１０）をプレミキサー内で調製する。プレミキサーは、連続流を使用して、新しく調整された過酸化物緩衝液がフローチャンバへと導入され、チャンバ内の滞留時間は５分未満であるように、フローセルと物理的に連通するように設計されている。一般的な流速は２５０μＬ／分であり、フローチャンバの容積は２５０μＬ未満である。チャンバはさらに圧電素子を含む。 Reaction Rate Control In one embodiment, 3 ml of hydrogen peroxide buffer (3% H ₂ O ₂ , pH 10) is prepared in a premixer. The premixer uses continuous flow so that freshly conditioned peroxide buffer is introduced into the flow chamber and the residence time in the chamber is less than 5 minutes so that it is in physical communication with the flow cell. Designed to. A typical flow rate is 250 μL / min and the flow chamber volume is less than 250 μL. The chamber further includes a piezoelectric element.

図３に示すように、これらの条件によって、試料をコンテナ内で処理し、滞留時間５分ごとに約１０秒間攪拌する手動の脱染色プロセスと比較して、反応時間が約３倍短縮される。反応性の増加は、活性化脱染色剤の新鮮な（より分解の少ない）調製及び平衡反応における副産物の連続除去に起因し得る。インライン予混合及び最適な流速によって、塩基性溶液で過酸化水素の分解を通してその場で生成される酸素気泡の量が低減される。 As shown in FIG. 3, these conditions reduce the reaction time by a factor of about 3 compared to a manual destaining process where the sample is processed in a container and stirred for about 10 seconds every 5 minutes of residence time. . Increased reactivity (with less decomposition) fresh activated destaining agent may be due to the continuous removal of by-products in the preparation and equilibrium reaction. In-line premixing and optimal flow rates reduce the amount of oxygen bubbles generated in situ through the decomposition of hydrogen peroxide in a basic solution.

以上、本発明を特定の実施形態に関して説明したが、当業者には明らかであるように、添付の特許請求の範囲に記載されている趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明には多くの修正及び変形を行うことが可能である。 While the invention has been described in terms of particular embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that many changes may be made to the invention without departing from the spirit and scope described in the appended claims. Modifications and variations can be made.

１０受け部材
１１ガスケット
１２スライド
１４蓋
１５入口ポート
１６出口ポート
１７熱電気ステージ
１８接触面
１９フレーム
２０気体透過性フィルム
２１通気路
２３試料 10 receiving member 11 gasket 12 slide 14 lid 15 inlet port 16 outlet port 17 thermoelectric stage 18 contact surface 19 frame 20 gas permeable film 21 air passage 23 sample

Claims

An automated method for repeated staining of biological samples,
(A) providing a small volume flow cell containing a biological sample;
(B) adding a staining agent;
(C) a you mixing stage of two or more precursor reagents for forming an activated leaving stain degradation rate of the activation de stain than or equal to the de-staining reaction rate Big stage,
And (d) before SL steps of flowing the de-stain in greater flow rate than the degradation rate of the activated leaving stain on the biological sample,
(E) optionally including repeating steps (b)-(d) one or more times.

Comprising the steps of observing a signal generated by the stained biometric sample through the image acquisition window, association and measuring the value of the intensity of the generated signal optionally, the signal and specific labeling of biomarkers The method of claim 1, further comprising:

Comprising the activation de stain oxidant, the process of claim 1.

4. A process according to claim 3, wherein the oxidant is selected from hydrogen peroxide, aqueous bromine solution , iodine- potassium iodide and t-butyl hydroperoxide buffer.

One precursor reagents are Nde contains hydrogen peroxide, other precursor reagent is sodium hydroxide, the process of claim 1.

The activation de staining agent, the formed flow cell in fluid communication with the mixing chamber, the method of claim 1.

The activation de staining agent, the precursor reagent fluid stream is combined with through the flow cell in fluid communication with flow paths formed by Rukoto, the flow path of mixed fluid flow of each precursor reagent physical disorders, including in any method of claim 1, wherein for increasing.

The method of claim 1, wherein the stain is a lumiphor.

Mixture further comprises the step of flow cell Ru was vibrated to facilitate the method of claim 1, wherein.

The vibration is applied by using a piezoelectric element attached to the flow cell, the electrical energy Ru is converted into acoustic energy, The method of claim 9, wherein.

The method of claim 1, further comprising raising the internal temperature of the flow cell above ambient temperature to facilitate dyeing or destaining.

The evacuation of the flow cell, further comprising the step of reducing the formation of bubbles within the flow cell, the process of claim 1.

The precursor reagents of activated leaving stain Te further including Ndei the step of transferring from one or more reagent containers to flop Remikisa, the precursor reagent is transported to said premixer at a predetermined concentration, claim 1 The method described.

Step (b) ~ 1 than on the (e) is controlled by a processor, the process of claim 1.

Comprising a premixer in fluid communication with the flow cell, a automated device for repeated staining a biological sample, the volume capacity of the premixer is smaller than about five times the volume capacity of the flow cell, the device.

The device according to claim 15, wherein the volume capacity of the flow cell is 1 μL to 1000 μL, and the volume capacity of the premixer is smaller than 5 μL to 5000 μL.

The device according to claim 15, wherein the volume capacity of the flow cell is 50 μL to 500 μL, and the volume capacity of the premixer is smaller than 250 μL to 2500 μL.

16. The device of claim 15, wherein the premixer further comprises a pump and a turbulence generator for increasing mixing of two or more precursor reagents.

The turbulence generator mixing nozzle, a porous filter, spherical obstacle or a micromesh claim 18, wherein the device.

Said flow cell, and configured based unit to receive a tissue sample, a thermoelectric element, and a gasket positioned between said base and said thermoelectric element, an inlet port in fluid communication with the premixer and an outlet port The device of claim 15, wherein one or both of the base and the thermoelectric element includes an image acquisition window.

21. The device of claim 20, further comprising a degasser for removing gas present within the flow cell.

Further comprising, the piezoelectric element can produce a conversion result vibrations within the flow cell to the acoustic energy of electrical energy, according to claim 20, wherein the device the piezoelectric element attached to the flow cell.

Further comprising, according to claim 15, wherein the device the premixer fluid communication with the reagent container.

24. The device of claim 23, further comprising a premixer controller and a reagent flow controller.

The premixer controller, the reagent flow control device, and the and the temperature controller attached to the thermoelectric element is integral to the processor optionally, so that said processor controls the operation parameters on one or more of the devices 25. The device of claim 24, wherein the device is configured as follows .