JP2011518008A - 生体適合性インプラント - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
持続的放出特性を有する好適な膜となり得る、多くの合成生分解性ポリマーがある。これらのポリマーの説明は、例えば、Lichun et al.、Polymeric Delivery Vehicles for Bone Growth Factors in“Controlled Drug Delivery −Designing Technologies for the Future”、Park and Musny eds.、American Chemical Society, Washington, DC (2000)、Gunatillake P.A. and Adhikari R., Europ. Cells and Materials, 5, 1−16, 2003; Holland T.A. and Mikos A.G., Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 102, 161−85, 2006; Nair L.S. and Laurencin C.T., Adv Biochem Eng Biotechnol. 102, 47−90, 2006に見つけることができ、これらを全体として参照することにより本明細書に援用する。
これらのポリマーの例としては、これらに限定されないが、コラーゲン、ヒアルロン酸、セルロース等の生分解性及び非生分解性ポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸等の分解可能なポリエステル、ポリ(3−ヒドロキシブタノアート)、ポリ(3−ヒドロキシバレラート)、ポリ(4−ヒドロキシブタノアート)、ポリ(ε−カプロラクトン)、ポリ(バレロラクトン)、ポリオルトエステル、ポリカルボキシレート、ポリカーボネート、ポリアンヒドリド、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化エチレンプロピレン等のパーフルオロポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、シリコーン、ポリサルフォン、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアミド、及び上記物質の共重合体、ブロック共重合体及び混合物が挙げられ、好ましくは、コラーゲン、ヒアルロン酸、等の生分解性ポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸等の加水分解性ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリカルボキシレート、ポリカーボネート、ポリカプロラクトン、ポリアンヒドリド、ポリウレタン(ポリ(エステル−ウレタン)、ポリ(エーテル−ウレタン)、ポリ(ウレタン−尿素)、ポリ(エステル−ウレタン−尿素)、ポリ(エステル−チオウレタン)を含む)、好ましくは、加水分解性ポリエステル及びポリウレタン、より好ましくはポリ乳酸及びポリウレタン、最も好ましくはポリウレタンである。
画像化:
Faxitron X−ray社のキャビネット型(43855A型)及びStructurix AGFA フィルムを用いて、コンタクトラジオグラフィーで撮像した。
内皮細胞を、例えば伏在静脈を取り除き内皮細胞を培養することによって、最終的な移植者から採取した。好ましくは前駆細胞を用い、前駆細胞は骨髄生検から得る又は循環血液から単離して、体外で培養することができる。MSCは、移植者の骨髄サンプルからのもので、必要な細胞数に達するまで(通常2〜4週間)、体外で増幅させた。
培養方法は、再移植の目的で、ヒト細胞の培養に対し特別な用心をもっての、標準的な培養技術であった。
治療を必要とする被験者から得た血液吸引物を、CPDAキュベット(キットに装備)から、15mLのFalconチューブ(キットに装備)に移して、室温で30分間、200gにて遠心分離機にかけた。結果として生じた血漿上澄みを貯めて、新しい15mLのFalconチューブに移し、室温で5分間、2,000gにて遠心分離機にかけ、血小板沈殿物を得た。そこから、残っている血漿上澄みに得られた沈殿物を再懸濁させることによって、PRPを作製した(最初の血液量の10分の1)。PRPは、PRP活性化効率の試験管内評価のために又は生体内で(補完物を任意に付加する際)直ぐに用いるか、あるいは利用まで−20℃で保存した。
PRPを、凍結融解サイクルを経て活性化した。PRPを、利用まで−20℃で最低30分間凍結した。その後、サンプルを37℃の水浴で30〜60分間培養することによって融解させた。異なるパーセンテージのトロンビン(10〜30% vol/volの50U/mL貯蔵液)をPRPに加えて、必要なゲル組織及びゼリー化の遅延を達成した。
上述の方法の血小板活性化効率を評価するために、PDGF−AB、−BB及びVEGFの放出を、ELISAアッセイによって測定した。サンプルを18,000gで2分間遠心分離し、残屑(debris)を沈殿させた(pellet)。生じた上澄みを、0.1%BSAを含むPBSに1:50で薄め、ヒトVEGF、PDGF−AB及び−BBタンパク質含有量を、Perkin Elmer Bio Assay Reader HTS 7000に、R&DシステムのDuoset ELISA Development System(PDGF−AB:DY222、PDGF−BB:DY220、VEGF:DY293B)を用いて測定した。図4から、異なる活性化モードが同じ成長因子の放出効率を示すことがわかる。
総細胞数は、サンプル当たり100,000〜2,000,000と様々であった。PRPゼリー化は、トロンビン付加によって開始された。必要なゲル特性(例えばゼリー化時間、ゲル剛性)を得るために、様々なパーセンテージ(vol/vol)の50U/mLトロンビン溶液を加えた(10〜30%)。
上述のように、PRPを作製し活性化させた。様々な量の無機ナノ粒子をPRP/細胞調合液と混合させた。異なるPRP/トロンビン比率についてテストし、ゲル生成並びにゲル組織の最適な条件を決定した:10,15,20,25及び30%(vol/vol)トロンビン(50U/mL貯蔵液)をPRP(この実験では総体積300μL)に混ぜた。最も適切なトロンビンのパーセンテージは、15〜20%の間であった。
上述のように、15%トロンビン及び2,6又は10mg/gel(6,20,33mg/mL)いずれかのHAPナノ粒子を用いて、PRP/HAPゲルを作製した。細胞をトリプシン処理して、選んだ数の細胞を収集しPRP/HAPとともに混ぜた。細胞型は、単独でPRP/HAPに混合させる、すなわち1細胞型単独か、あるいは他の細胞型とともに混合させる、つまり2以上の細胞型の混合物(例えばMSC/内皮細胞、MSC/EPC)であった。後者の場合、異なる細胞型を異なる割合で用いた。総細胞数は、サンプル当たり100,000〜2,000,000と様々であった。PRPゼリー化はトロンビンを付加すると直ぐに始まった。異なるパーセンテージ(vol/vol)の50U/mLトロンビン溶液を加えた(10〜30%)。図7は、15%トロンビンを調合液に加えたときの、HUVEC、BMSC、又はHUVEC及びBMSC両細胞型の50/50%混合物のいずれかを含むPRP/HAPゲル(2,6又は10mg/gel=6,20,33mg/mL)の、FaxitronX線像を示す。図7は、細胞の存在下でさえ、満足できる均一なゲル内ナノ粒子再配合に達することが可能なことを示す。
生体吸収性ポリウレタン膜(D 100μm、S 50μm、T 0.05mm、L 15cm、H 20cm)を、1,6−ヘキサメチレンジイソシアネート、ポリ(ε−カプロラクトン)ジオール(MW 530g/mol)、イソソルビド(ポリオールに対する鎖延長剤のモル比=0.5:1)から構成されるポリウレタンから作製した。ポリウレタン10g(MW 250,000g/mol)をN,N−ジメチルホルムアミド200mlに溶かし、20×35cmのトレイに注いだ。室温にて5日間溶媒をゆっくりと蒸発させた後、透明な膜(50ミクロン厚)を得、エタノールで洗浄し、さらに真空下で24時間40℃にて乾燥させた。続いて、30W空冷、コンピュータ制御のCO2レーザーカッター(FB400シリーズ、CadCam Technology Ltd.、ノッティンガム、イギリス; レーザービーム分解能:25μm)を用いて、100μmサイズのミクロ細孔を膜に作った。レーザーの位置制御、ラスター/ベクトル速度及び出力は、所有権を主張できるソフトウェア(ApS−Ethos)を用いて達成した(図9)。
ポリ(L/DL−ラクチド)80/20wt%(Mn 300000g/mol)をPURACから購入した。5.15gのポリ(L/DL−ラクチド)80/20を266mLのテトラヒドロフランに解かした。その後、アセトン27ml及び水4mlをゆっくりと加えて透明で均一な溶液を得た。最後に、ジメチルスルホキシド50mlにクエン酸39gを溶かした溶液4mlを滴下して加えた。この溶液226mlを大きなガラストレイ(20×35cm)に注ぎ、多孔質ポリエチレンシートで覆って、溶媒の蒸発を制御した。室温23〜25℃、湿度45%〜55%で6日間、溶液をゆっくり蒸発させた。得られたミクロ及びナノ多孔質膜(D 2〜40μm、S 200〜20μm、T 0.3mm、L 15cm、H 20cm)を、エタノールを用いてプレートから引き上げ、40℃にて24時間乾燥させた(図9)。
Claims (27)
- 骨欠損の修復のための生体適合性インプラントであって、
(a)囲まれた空所を作り出すために、前記骨欠損の周囲に取り付けられる内側及び外側表面を有する生体適合性材料を含む可撓性の膜、及び
(b)前記膜によって作られる空所内に含まれる多血小板血漿ゲル組成物を含む生体適合性インプラント。 - 前記多血小板血漿ゲル組成物がさらに、1つの型の自家細胞、又は少なくとも2つの型を混合した自家細胞を含む、請求項1の生体適合性インプラント。
- 前記自家細胞の総量が、多血小板血漿ゲル組成物1mL当たり300,000〜6,000,000細胞である、請求項2の生体適合性インプラント。
- 前記多血小板血漿ゲル組成物がさらに、ヒドロキシアパタイト、サンゴ藻ヒドロキシアパタイト、炭酸ヒドロキシアパタイト、生体活性ガラス及びセラミック、リン酸カルシウムセラミック、焼成骨、リン酸三カルシウム、及び類似の材料からなる群から選択されるナノ粒子無機物を含む、好ましくはヒドロキシアパタイトを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
- 前記ナノ粒子無機物が、1nm〜5μmの平均粒径を有する、請求項4の生体適合性インプラント。
- 前記ナノ粒子無機物が、前記多血小板血漿ゲル組成物の体積の0.01%〜60%を構成する、請求項4の生体適合性インプラント。
- 前記多血小板血漿ゲル組成物がさらに、カルシウム塩、トロンビン、バトロキソビン、コラーゲン、ADP及びセロトニン等の活性化剤を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
- 前記活性化剤が、前記多血小板血漿ゲル組成物の体積の5〜50%を構成する、請求項6の生体適合性インプラント。
- 前記多血小板血漿ゲル組成物が支持構造物内に包含される、請求項1〜8のいずれかの生体適合性インプラント。
- 前記多血小板血漿ゲル組成物が、前記支持構造物が前記骨欠損内に配置される前又は後に供給される、請求項9の生体適合性インプラント。
- 前記支持構造物が多孔質である、請求項9の生体適合性インプラント。
- 前記支持構造物が吸収可能及び/又は生分解性である、請求項9の生体適合性インプラント。
- 前記支持構造物が、スポンジ、泡、ゲル又は繊維網の形状である、請求項9の生体適合性インプラント。
- 前記支持構造物が、骨欠損の形に形成されるか、又は骨欠損内に圧入される(press−fitted)、請求項9の生体適合性インプラント。
- 前記生体適合性材料が生分解性である、請求項1〜14のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
- 前記生体適合性材料の分解速度が4〜36ヶ月である、請求項1〜15のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
- 前記生体適合性材料が、コラーゲン、ヒアルロン酸、セルロース等のポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸等の分解可能なポリエステル、ポリ(3−ヒドロキシブタノアート)、ポリ(3−ヒドロキシバレラート)、ポリ(4−ヒドロキシブタノアート);ポリ(ε−カプロラクトン)、ポリ(バレロラクトン)、ポリオルトエステル、ポリカルボキシレート、ポリカーボネート、ポリアンヒドリド、ポリウレタン、{ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化エチレンプロピレン等のパーフルオロポリマー;ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、シリコーン、ポリサルフォン、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアミド}及びこれらの共重合体、ブロック共重合体及び混合物から選択される、請求項1〜16のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
- 前記膜が、任意に、片面又は両面に、全骨髄、細胞、多血小板血漿ゲル組成物、及びセラミック粒子から選択される1以上を播種される、請求項1〜17のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
- 前記膜が、5μm〜1000μmのミクロ細孔(microporosity)、及び100nm〜5μmの任意のナノ細孔(nanoporosity)を有する、請求項1〜18のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
- 前記膜が、0.05mm〜5mmの厚み、10cm〜25cmの長さ、10cm〜25cmの高さを有する、請求項1〜19のいずれかに記載の生体適合性インプラント。
- 被験者内の骨成長、及びインプラントの新しい血管新生を誘導するための、前記請求項1〜20に記載の生体適合性インプラント。
- 被験者内の骨成長を誘導する方法であって、
(a)内側及び外側表面を有する生体適合性材料を含む可撓性の膜を骨欠損に掛けて(spanning)、及び任意に前記膜の端部を固定して、空所を作り、及び
(b)多血小板血漿ゲル組成物を前記空所に注入して骨成長が起こるようにすることを含む方法。 - 被験者内の骨成長を誘導する方法であって、
(a)生体適合性支持構造物を骨欠損内に配置し、
(b)前記生体適合性支持構造物内にPRPゲル組成物を供給し、及び
(c)前記骨欠損に可撓性膜を掛けて前記支持構造物を囲み、前記骨欠損内に支持構造物を保持して、骨成長が起こるようにすることを含む方法。 - 被験者内の骨成長を誘導する方法であって、
(a)生体適合性支持構造物内にPRPゲル組成物を供給し、
(b)前記PRPゲル組成物を含む生体適合性支持構造物を骨欠損内に配置し、及び
(c)前記骨欠損に可撓性膜を掛けて前記支持構造物を囲み、前記骨欠損内に支持構造物を保持して、骨成長が起こるようにすることを含む方法。 - 前記膜が、任意に、片面又は両面に、全骨髄、細胞、多血小板血漿ゲル組成物、及びセラミック粒子から選択される1以上を播種される、請求項22〜24のいずれかに記載の方法。
- 前記被験者が、動物又はヒト等の哺乳類である、請求項22〜25のいずれかに記載の方法。
- PRPゲル組成物を原位置で作製するための少なくとも1つのコンパートメント、及び可撓性の滅菌膜を含むさらなるコンパートメントを含むキット。
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