JP2011516846A - 頻拍性不整脈イベントのリスクの予測のためのプロ−エンドセリン−１レベル - Google Patents

Abstract

本発明は、心不全として心疾患を患う患者の、予後及びリスク層別化のためのインビトロにおける方法に関する。本発明はさらに、かかる方法の使用に関する。

Description

本発明は、心疾患、例えば心不全を患う患者のための、装置の植え込み及び／又は抗不整脈ハイブリッド療法の指標のための、インビトロにおけるリスクの層別化方法に関する。本発明はさらに、かかる方法の使用に関する。

植え込み型除細動器（ＩＣＤ）は、悪性心室性不整脈を効果的に停止させ、突然死を回避する。しかし、ＩＣＤの植え込みは高価であり、侵襲性であり、且つ副作用、例えば好適ではないショック、心理社会学的問題、リードの問題、及び感染の問題と関連する（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２００７；１４７：２５１−６２； Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９８；９８：６６３−７０；Ｓａｎｄｅｒｓ ＧＤ ｅｔ ａｌ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００５；３５３：１４７１−８０）。３分の２までの患者が、事前のＩＣＤ療法を受けることなく死亡するため（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２００７；１４７：２５１−６２）、興味深いことに、ＩＣＤの予防的埋め込みの費用有効性は疑問視されている（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００５；３５３：１５１３−５）。一貫して、装置の植え込み、及び／又は抗不整脈ハイブリッド療法は必須である（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２００７；１４７：２５１−６２）。

神経体液系の活性化は、左心室（ＬＶ）収縮機能不全の患者における、悪性頻拍性不整脈（速い心室頻拍、又は心室細動）のリスクの増大と関連している。実際、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、突然心臓死のリスクの増大を示す（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００２；１０５：２３９２−７；Ｂｒｕｒｍｅｒ−Ｌａ Ｒｏｃｃａ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ ２００１；２２：１１３６−４３）。しかし、ＢＮＰは、心不全の重症度の定量的マーカーであり、そして死亡リスクの増大を示唆するが（Ｄａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００１；３７：３７９−８５）、それはＩＣＤ療法を必要とする頻拍性不整脈イベントを前もって正確に予測するために有用ではない。

血清のエンドセリン、及びビッグ−エンドセリンレベルの増大が、心室頻脈を患っている、又は患った患者において観察されている（Ｓｚｕｃｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００４，４４：Ｓ４０２−６）。

短期間の実験に基づいて、ＥＴ及びビッグ−ＥＴは、ウサギの不整脈原性のメディエーターとして作用し得ることがさらに推測されている（Ａｌｅｘｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＣＣ １９９８，３２：１７７３−８）。

ＵＳ２００５／０１７７１９６Ａｌは、心室性頻拍性不整脈を患う患者のリスクを評価するためのバイオマーカーの使用について議論している。しかし当該特許出願は、当該明細書中に特定のバイオマーカーを提供していない。

したがって、心疾患、例えば慢性心不全を患う患者における頻拍性不整脈イベントを予測するマーカーを見出すことが本発明の目的である。

驚くべきことに、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１レベルの増大は、装置療法を必要とする、第一の悪性心室性頻拍性不整脈イベントの発生を予測し得ることが明らかとなった。ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１レベルの増大は、心不全を患う、及びＬＶ−ＥＦの減少したＩＣＤ患者における悪性頻拍性不整脈の将来的な発生を単独で予測する。さらに、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１レベルの測定は、不整脈による突然死の第一次予防のためにＩＣＤを必要とする患者のリスクの層別化に非常に有用であり得る。

したがって本発明の課題は、心疾患を患う患者のための、ＩＣＤ装置の植え込み及び／又は抗不整脈ハイブリッド療法の指標のための、インビトロにおけるリスク層別化方法であって：
・患者から得られた試料中における、プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片のレベルを決定すること
を含む、前記方法である。

心不全患者は、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１及びＢＮＰレベルに従って２つの群へと層別化され、そしてＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ分析が行われた。Ａ）悪性頻拍性不整脈イベントをエンドポイントと見なした場合、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１血漿レベル＞７３ｐｍｏｌ／Ｌ（中央値）である患者は、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１値がこのカットポイント未満である患者よりも、有意に悪い結果を有した（ｌｏｇｒａｎｋ検定）。Ｂ）ＢＮＰ血漿レベル≧１８３ｐｇ／ｍＬ（中央値）の患者は、このカットポイント未満である患者よりも、高い悪性心室性頻拍性不整脈イベント率を有しなかった（ｌｏｇｒａｎｋ検定）。各々のＲＯＣ曲線分析は挿入図において示される。 図２は、１２３人の植え込み型除細動器を有する心不全患者における、ＬＶ駆出分画、及びＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１レベルの直線回帰分析を示す。

ＰｒｏＥＴ−１断片のレベルが決定される場合、これらの断片は、少なくとも１２個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸を含み、好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸であった。エンドセリン（ＥＴ）−１は、強力な内皮由来の内因性血管収縮因子である（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｍ，Ｋｕｒｉｈａｒａ Ｈ，Ｋｉｍｕｒａ Ｓ，Ｇｏｔｏ Ｋ，Ｍａｓａｋｉ Ｔ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ，ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ，ｉｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ Ｓｕｐｐｌ １９８８；６：Ｓ１８８−９１）。ＥＴ−１は、細胞内カルシウムの増大を引き起こす、平滑筋細胞上のＥＴ（Ａ）及びＥＴ（Ｂ）の活性化によってその血管作用を発揮する（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ Ｓｕｐｐｌ １９８８；６：Ｓ１８８−９１）。成熟エンドセリン−１は、プロ−エンドセリン−１と呼ばれる、より大きな前駆体に由来する。プロ−エンドセリン−１は、タンパク質分解されて、記載されたような種々の断片となり得る（Ｓｔｒｕｃｋ Ｊ，Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ ＮＧ，Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ａ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２００５ Ｄｅｃ；２６（１２）：２４８２−６）。これらの断片は、血液循環においてタンパク質分解を受け、そしてそれは速やかに又はゆっくりと起こり得、そしてそれは、断片の種類、並びに当該循環中に存在するプロテアーゼの種類、及び濃度／活性に依存する。これらの断片の一例は、Ｃ末端プロ−エンドセリン−１（ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１）であり、そしてそれはサンドイッチ免疫測定法によって測定され得る（Ｐａｐａｓｓｏｔｉｒｉｏｕ Ｊ， Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ ＮＧ，Ｓｔｒｕｃｋ Ｊ，Ａｌｏｎｓｏ Ｃ，Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ａ．Ｉｍｍｕｎｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００６ Ｊｕｎ；５２（６）：１１４４−５１）。

連続型変数は、示される通り、平均±標準偏差（ＳＤ）として表現されるか、又は中央値（範囲）及び点推定（９５％信頼区間）として表現される。本目的は、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１が、第一の悪性心室性頻拍性不整脈イベントへの時間の予測に寄与するか否かを調べることである。悪性頻拍性不整脈は、サイクル長≦２５０ｎｍ（心拍数≧２４０ｂｐｍ）であり、装置によって停止されなければ恐らく死亡の原因となる、速い心室性頻拍性不整脈（ＶＴ又はＶＦ）として定義された（Ｂｏｃｋｅｒ Ｄ，Ｂｌｏｃｋ Ｍ，Ｉｓｂｒｕｃｈ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｄｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｄｅｆｉｂｒｉｌｌａｔｏｒ ｌｉｖｅ ｌｏｎｇｅｒ？ Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９３；２１：１６３８−４４．）。一変量及び多変量のＣｏｘ比例ハザードモデルが、結果の測定値間の関連性を評価するために使用された。

本発明の方法の一つの実施形態において、プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）、又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片の前記レベルは、第一の悪性頻拍性不整脈のリスクと相関性がある。

前記方法の目的は、植え込み型除細動器（ＩＣＤ）、及び／又は抗不整脈性ハイブリッド療法の必要性に従った、患者の層別化である。

本発明の好ましい実施形態に従って、前記相関性ステップは、プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）、又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片の前記レベルと閾値とを比較することを含み、そしてそれにより、プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）、又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片の前記レベルが、前記閾値レベルを超えているとき、前記患者は頻拍性不整脈の高リスク状態にある。

ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１又はＢＮＰレベルに従って、ＩＣＤ患者は２つの群へと層別化され、そしてＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ分析が行われた。頻拍性不整脈のリスクは、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１血漿レベル＞７３ｐｍｏｌ／Ｌ（中央値）の患者において、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１値がこのカットポイント未満である患者よりも有意に高かった（ｌｏｇｒａｎｋ検定、ｐ＜０．００１、図１Ａ）。エンドポイントとして悪性頻拍性不整脈を使用して、ＢＮＰ血漿レベル≦８３ｐｇ／ｍＬ（中央値）の、又は＞１８３ｐｇ／ｍＬの患者において有意な差異は見られなかった（ｌｏｇｒａｎｋ検定、ｐ＝０．１０、図１Ｂ）。ＬＶ駆出分画、及びＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１レベルに有意な関連性は見られなかった（図２）。

第一の悪性頻拍性不整脈の発生を予測するために、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１レベルを使用したＲＯＣ曲線下面積は、０．６９であった（図１Ａ、挿入図）。陽性及び陰性予測精度の計算のための、ＲＯＣ曲線から得られるＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１の最適濃度は、７５．５ｐｍｏｌ／Ｌであった（感受性８０．８％、特異性６４．４％、陰性予測値９２．１％、陽性予測値３９．６％、及び２．２７の陽性尤度比）。

ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１レベルは、第一の悪性頻拍性不整脈のリスクを予測する多変量Ｃｏｘ回帰モデルに、有意に寄与した。リスク比は、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１レベルのｐｍｏｌ／Ｌ増加で計算された（表２）。統計分析においてｌｏｇ（ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１）の使用は、得られた結果を変化させなかった。ベータ遮断薬を用いた治療が好ましい予後を示すことを、多変量Ｃｏｘ回帰分析は明らかにした（表２）。

したがって、本発明の好ましい実施形態において、前記閾値は約７３＋／−２０％ｐｍｏｌ／Ｌである。

好ましい実施形態にしたがって、心疾患とは、ＩＣＤの植え込みが潜在的に示唆され、虚血性又は非虚血性病因のいずれかの心不全を含む、任意の疾患である。好ましい実施形態に従って、患者はＬＶ駆出分画≦４５％を有する。

患者から得られる試料は、好ましくは、血液試料、血清試料、及び血漿試料を含む群から選択される試料である。

さらに、本発明の課題は、プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）、又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片の前記レベルを、１つ以上の追加の予後マーカー、パラメーター、又は因子のレベル／条件と組み合わせることをさらに含む方法であり、それにより、プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）、又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片と、１つ以上の追加の予後マーカー、パラメーター、又は因子の前記レベル／条件との組み合わせが、前記方法のリスクに関する予測値を増加させる。

好ましい実施形態において、追加の予後マーカー、パラメーター、又は因子は、表２に列挙された全てのパラメーターを含む群から選択され、そしてそれは一変量又は多変量分析においてｐ＜０．０５を示し、それによりＢＮＰは、ｐｒｏＢＮＰ又は、ＢＮＰ若しくはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含む、少なくとも１２個のアミノ酸のその断片に関する一例に過ぎない。

好ましくは、プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片の前記レベルは、サンドイッチ免疫測定法を用いて測定される。好ましくは、エンドセリン系の活性を間接的に評価する、Ｃ末端ＥＴ−１前駆体断片（ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１）が測定される。好ましい実施形態において、２つの抗体がこのアッセイにおいて使用され、好ましくはポリクローナル抗体が使用される。好ましい実施形態において、抗体はｐｒｅ−ｐｒｏＥＴ−１の１６８〜２１２番アミノ酸を対象とする。この方法は、市販のサンドイッチ免疫測定法（ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１ ＬＩＡ，Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＡＧ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｂｅｒｌｉｎ）を用いて行われる。本アッセイ（標準参照範囲：中央値：４４．３、範囲：１０．５〜７７．４ｐｍｏｌ／Ｌ）は、０．４ｐｍｏｌ／Ｌの分析検出限界を有し、そして値＞１０ｐｍｏｌ／Ｌに関してアッセイ内（ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ）ＣＶ＜１０％であった（Ｐａｐａｓｓｏｔｉｒｉｏｕ Ｊ，Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ ＮＧ，Ｓｔｒｕｃｋ Ｊ，Ａｌｏｎｓｏ Ｃ，Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ａ．Ｉｍｍｕｎｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００６；５２：１１４４−５１．）。

本発明に関して、「心疾患」は、心臓系、例えば患者の心臓及び／又は血管に関連する病理状態である。かかる心疾患は、例えば、先天性心臓欠陥、冠動脈疾患、心不全、及び／又は弁膜心疾患であり得る。

本発明において、用語「第一次予防」は、他の健全な又は少なくとも無症候性の個人における疾患の発症を回避することを意味する。

本発明に関して、悪性頻拍性不整脈は好ましくは、サイクル長＜２５０ｍ（心拍数＞２４０ｂｐｍ）である、速い心室頻脈（ＶＴ又はＶＦ）として定義される。

本発明において、用語「リスク層別化」は、個人が特定の副作用イベントを経験する可能性の値の割り当てを意味する。本明細書において、個人は好ましくは特定のリスク分類を占め、ここで分類は、例えば高リスク対低リスクを含み、又は例えばリスク分類１、２、３などのように、数値に基づくリスク分類を含む。

本発明に関して、用語「予測値」は、特定の決定された測定結果の統計的有意性のことである。したがって、本発明に関する予測値又は予測力の増大は、試料中の特定のマーカーのレベルの測定から決定された特定の値に基づく、正確な診断、予後診断、層別化、などの可能性が増大することを意味する。

本明細書において言及される、「アッセイ」又は「診断アッセイ」は、診断の分野において適用される任意のタイプのものであり得、限定されないが、酵素反応、発光、蛍光、又は放射化学を基礎としたアッセイ方法を含む。好ましい検出方法は、ストリップ試験、放射免疫測定、化学発光及び蛍光発光免疫測定、免疫ブロットアッセイ、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）、Ｌｕｍｉｎｅｘ系ビーズアッセイ、及びタンパク質マイクロアレイアッセイを含む。アッセイタイプはさらに、マイクロタイタープレート系、チップ系、ビーズ系であり得、ここでマーカーは、当該表面に付着され得るか、又は溶液中に存在し得る。当該アッセイは、均一系若しくは不均一系アッセイ、サンドイッチアッセイ、競合的又は非競合的アッセイであり得る。特に好ましい実施形態において、アッセイはサンドイッチアッセイの形態であり得、そしてそれは非競合的免疫測定であり、ここで検出、及び／又は定量されるべき分子は第一抗体へと結合され、そして第二抗体へ結合される。第一抗体は固相、例えばビーズ、ウェル若しくは他の容器の表面、チップ、又はストリップへと結合され得、そして第二抗体は、例えば色素、放射性同位体、又は反応性若しくは触媒活性成分で標識される抗体である。当該領域上における標識された抗体の量はその後、好適な方法によって測定される。「サンドイッチアッセイ」に関連する一般的組成物及び手順は、十分に確立されており、そして当業者に既知である（Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｅｄ．Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＬＴＤ，Ｏｘｆｏｒｄ；第３版（２００５年５月），ＩＳＢＮ−１３：９７８−００８０４４５２６７；Ｈｕｌｔｓｃｈｉｇ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００６年２月；１０（１）：４−１０．ＰＭＩＤ：１６３７６１３４、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。

特に好ましい実施形態において、アッセイは、２つの捕獲分子、好ましくは液体反応混合物中で分散体として両方とも存在する抗体を含み、ここで第一マーキング成分は、第一捕獲分子と結合され、ここで前記第一捕獲分子は、蛍光若しくは化学発光の消光又は増幅に基づくマーキング系の一部であり、そして前記マーキング系の第二マーキング成分は、第二捕獲分子と結合され、その結果、両方の捕獲分子が前記プロテアーゼ又は前記内因性阻害剤、又はプロテアーゼと内因性阻害剤との前記複合体へと結合するときに、試料を含む溶液中において形成されたサンドイッチ複合体の検出を可能とする、測定可能なシグナルが発生する。

さらにより好ましくは、前記マーキング系は、蛍光性色素又は化学発光色素、特にシアニンタイプの色素と一緒になった、希土類元素のクリプタート、又は希土類元素のキレートを含む。

本発明に関して、蛍光系アッセイは色素の使用を含み、そしてそれは例えば、ＦＡＭ（５−若しくは６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、Ｃｙ７のようなシアニン色素、キサンテン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲのようなＢＯＤＩＰＹ色素、オレゴングリーン、ウンベリフェロンのようなクマリン、ヘキスト３３２５８のようなベンズイミド；テキサスレッドのようなフェナントリジン、ヤキマイエロー（ＹａｋｉｍａＹｅｌｌｏｗ）、アレクサフルオロ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）、ＰＥＴ、臭化エチジウム、アクリジウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素などを含む群から選択され得る。

本発明に関して、化学発光系アッセイは色素の使用を含み、そしてそれは、ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第４版，ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ ｅｄｉｔｏｒ，Ｊ． Ｉ． Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ；ｅｄｉｔｏｒ，Ｍ．Ｈｏｗｅ−Ｇｒａｎｔ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９３，ｖｏｌ．１５，５１８〜５６２ページに記載されている物理的原理に基づいており、５１１〜５６２ページの引用を含めて、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書において使用される用語、「ハイブリッド療法」は、薬物療法、及び装置療法が一人の患者において併用される併用療法のことである。

本発明の意味における「患者」は、他において言及されない限り、病理学的変化を示すか否かに関係なく、全てのヒト又は動物であると理解される。本発明の意味において、細胞、組織、器官、有機体などから回収された任意の試料は、診断されるべき患者の試料であり得る。好ましい実施形態において、本発明の患者はヒトである。

タンパク質又はペプチドに関して本明細書に言及されるように、用語「断片」は、より大きなタンパク質又はペプチドに由来する、より小さなタンパク質又はペプチドのことであり、したがってそれは、より大きなタンパク質又はペプチドの部分的配列を含む。前記断片は、１個以上のそのペプチド結合のけん化によってより大きなタンパク質又はペプチドから誘導され得る。

本発明に関して、「プロテアーゼレベル」、「分析物レベル」、及び同様の表現中における用語「レベル」は、各々の文脈中において言及された、実在する分子の量のことである。

本明細書において使用される、「マーカー」、「予後マーカー（単数又は複数）、パラメーター（単数又は複数）、又は因子（単数又は複数）」のような用語は、置き換え可能に使用され、そして測定可能且つ定量可能な生物学的パラメーター（たとえば、特異的酵素の濃度、特異的ホルモンの濃度、個体群中における特異的遺伝子のフェノタイプの分布、生体物質の存在）に関し、そしてそれは、健康関連性及び生理学関連性評価のための、例えば疾患リスク、精神障害、環境における曝露及びその効果、疾患の診断、代謝過程、薬物乱用、妊娠、細胞株の発達、疫学的試験などのためのインデックスとして有用である。さらにバイオマーカーは、正常な生物学的過程、発病過程、又は治療的介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定され、かつ評価される特性として定義される。バイオマーカーは、（例えば血液、尿、又は組織試験として）生体試料において測定され得、それはヒトから得られる記録（血圧、ＥＣＧ、又はＨｏｌｔｅｒ）であり得、或いはそれは画像検査（心エコー図、又はＣＴスキャン）であり得る（Ｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１３：２３３５−２３６２）。

バイオマーカーは、環境因子への曝露のレベル若しくはタイプ、遺伝的感受性、曝露に対する遺伝的応答、無症候性又は臨床性疾患のバイオマーカー、又は治療に対する応答の指標を含む、種々の健康又は疾患特性を示す。したがって、バイオマーカーを考慮する単純化した方法は、疾患特性（リスク要因若しくはリスクバイオマーカー）、疾患状態（前臨床若しくは臨床）、又は罹患率（進行）の指標としてである。したがってバイオマーカーは、（疾患の発症リスクを同定する）先行（ａｎｔｅｃｅｄｅｎｔ）バイオマーカーとして、（無症候性疾患をスクリーニングする）スクリーニングバイオマーカーとして、（顕在的な疾患を認識する）診断バイオマーカーとして、（疾患の重症度を分類する）病期分類バイオマーカーとして、又は（再発及び治療に対する応答を含む将来的な疾患経過を予測し、そして治療の有効性を測定する）予後バイオマーカーとして分類され得る。バイオマーカーはまた、代替エンドポイントとして有用であり得る。代替エンドポイントは、対象の真実の結果の測定の代わりに、治療法の安全性及び有効性を評価するために、臨床試験における結果として使用され得るものである。基本原理は、当該代替エンドポイントへの変更が、対象の結果における変化を密接に追跡することである。代替エンドポイントは、評価のために多くの臨床試験を必要とする、罹患率及び死亡率のようなエンドポイントよりも、短い時間枠で、且つ少ない経費で収集され得るという利点を有する。

代替エンドポイントの追加の値は、それらが対象の曝露／介在とより密接であり、そしてより遠い臨床イベントよりも原因において関連付けが容易であり得る。代替エンドポイントの重大な不利点は、対象の臨床転帰が（代替エンドポイントに加えて）多くの因子によって影響される場合、残りの交絡は代替エンドポイントの有効性を減少させ得る。対象の結果における曝露又は介在の少なくとも５０％の効果を代替エンドポイントが説明することができる場合、それの有効性がより大きいと示唆された。例えばバイオマーカーは、タンパク質、ペプチド、又は核酸分子であり得る。

方法
患者、試験計画
当該試験群は、２００２年６月〜２００３年９月において、Ｍａｒｂｕｒｇ大学の除細動器外来診察室において将来を見越して募集された、虚血性又は非虚血性病因である心不全に罹患している１２３人の除細動器を有する患者から成った。（Ｃｈｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ ２００７；９：２７２−９）。本試験は、優良臨床試験基準、及びヘルシンキ宣言の原則に従って行われ、そして患者には本試験への登録前に、インフォームド・コンセントがなされた（Ｃｈｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ ２００７；９：２７２−９）。

心電図検査及び心エコー検査
標準化された１２リード心電図（ＥＣＧ）が、各々の患者から、５０ｍｍ／秒の紙速度で記録され、そして結果を隠された１人の熟練の研究員によって解釈された。５０％超の拍動がＥＣＧ記録の間に測定された場合、ペースメーカー調律を有するように患者が分類された。Ｖｉｎｇｍｅｄ Ｖｉｖｉｄ Ｆｉｖｅ ｍａｃｈｉｎｅ（ＧＥ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＳｏＨｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び標準的手順を使用して、呼気期間の最後に、心臓の二次元心エコー画像を得た（Ｃｈｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ ２００７；９：２７２−９）。

検査法
一晩の絶食後、８：３０〜１０：３０の間に、モノベット（ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ）（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用して、肘正中静脈へと挿入された２１ゲージのカニューレを通じて、静脈血試料を採取した。仰臥体位で少なくとも１５分間、患者を横たわらせた。ＥＤＴＡ血液試料を速やかに氷上に移動させ、遠心分離を用いて血漿を分離し、そして血漿を分析まで−８０℃で貯蔵した。化学発光免疫測定（Ｂａｙｅｒ ＡＧ，Ｆｅｒｎｗａｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＢＮＰレベルを決定した。アッセイの分析検出限界は２ｐｇ／ｍＬであった。アッセイ内変動係数（ＣＶ）は、ＢＮＰ２９．４〜１７６３ｐｇ／ｍＬにおいて１．８〜４．３％であり、そしてアッセイ間ＣＶはＢＮＰ２９．４〜１７３６ｐｇ／ｍＬにおいて２．３〜４．７％であった（Ｃｈｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ ２００７；９：２７２−９）。不安定性及び受容体結合のために、エンドセリン−１は測定が困難である。エンドエリン系の活性を間接的に推定する、ｐｒｅ−ｐｒｏＥＴ−１の１６８〜２１２番目のアミノ酸を対象とする２つのポリクローナル抗体を使用する、新規サンドイッチ免疫測定法（ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１ ＬＩＡ，Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＡＧ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｐａｐａｓｓｏｔｉｒｉｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００６；５２：１１４４−５１）を用いて、Ｃ末端ＥＴ−１前駆体断片（ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１）を想定した。アッセイ（正常基準範囲：中央値：４４．３，範囲：１０．５〜７７．４ｐｍｏｌ／Ｌ）は、０．４ｐｍｏｌ／Ｌの分析検出限界を有し、そしてアッセイ内ＣＶは、値＞１０ｐｍｏｌ／Ｌに関して、＜１０％であった（Ｐａｐａｓｓｏｔｉｒｉｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００６；５２：１１４４−５１）。

除細動器の植え込み及び装置プログラミング
非開胸リード系、及び最大ショックエネルギー２７〜３４Ｊの２相系ショック波形を有するＩＣＤのみが使用された。使用される全てのＩＣＤシステムは、装置の動作を引き起こすエピソードの拍動間隔に加えて、蓄積される心内電位図を提供した（Ｇｕｉｄａｎｔ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ；Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）。ＶＦ検出の時間間隔は、Ｇｕｉｄａｎｔ装置において１〜３秒の範囲であり；Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ装置は、ＶＦゾーンに帯電する蓄電器を起動するために、プログラムされた検出サイクル長（範囲２４０〜２８０ｎｍ）未満で、２４拍中１８拍を必要とするようにプログラムされた。より遅い心室性頻拍性不整脈が検出され、そして抗頻脈バーストペーシングをし、その後４回までの電気的除細動ショックによって１個又は２個の分離したＶＴ層で処理された（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００２；３９：７８０−７）。

経過観察
心機能評価及び植え込みデータの結果を含む、ベースライン臨床特性の全てのデータは、Ｍａｒｂｕｒｇ除細動器データベースに将来的に収集された（Ｃｈｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ ２００７；９：２７２−９，Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００２；３９：７８０−７）。バイオマーカー測定時において開始された、本試験における経過観察は６０か月までであり、そして登録された患者の全てにおいて完了することができた。装置の照合及び蓄積された心電図の検索のために、自発的ＩＣＤショック後、３〜６か月間隔で、又はできる限り早く、患者は最初に、我々の除細動器外来診察室へ行った。熟達した電気生理学者が、ＩＣＤ療法を始動させる、又は先に記載された基準を使用するのは好適ではないエピソードの、全ての蓄積された心電図を分類した（Ｃｈｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ ２００７；９：２７２−９；Ｍａｒｃｈｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｐａｃｉｎｇ Ｃｌｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ １９９３；１６：５２７−３４）。

統計分析
連続型変数は、平均±標準偏差（ＳＤ）として表現されるか、又は示される通り、中央値（範囲）及び点推定（９５％信頼区間）として表現される。第一の目的は、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１又はＢＮＰを含むバイオマーカーのレベルが、第一悪性頻拍性不整脈イベントへの時間を予測することに寄与するか否かを調べることであった。悪性頻拍性不整脈は、当該装置によって停止されなければ恐らく死をもたらす、サイクル長≦２５０ｍｓ（心拍数≧２４０ｂｐｍ）である、速い心室性頻拍性不整脈（ＶＴ又はＶＦ）として定義された（Ｂｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９３；２１：１６３８−４４）。結果測定間の関連性を評価するために、一変量及び多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルが使用された。

第一Ｃｏｘ回帰モデルを構築するために、我々は、０．０５のエントリーレベルを用いて段階的手法を使用した。当該モデル中に留まるためのｐ値は、０．０５に設定された。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用いてイベントの可能性が推定され、そして曲線の比較のためにｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を用いた。調査、説明及び解釈のために、追加の統計分析が使用された。ｔ−検定、Ｕ−検定、カイ二乗検定によって、規定通りに群間の比較がなされた。報告された全てのｐ値が両面性であり、ｐ−値＜０．０５が有意であると考えられた。

各々のエンドポイントを検出する濃度を通じてバイオマーカーの感受性及び特異性を評価するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が作成された。全ての統計的計算は、ＳＰＳＳ統計ソフトウェアパッケージ（ｖｅｒｓｉｏｎ １４．０；ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して行われた。

結果
全試験コホートの人口学的特性を表１に示す。登録後６０か月（中央値５１か月）までの最大経過観察の間、２７人の患者が第一悪性頻拍性不整脈イベントを発症し、第一悪性頻拍性不整脈イベントを患わない患者（中央値：６７ｐｍｏｌ／Ｌ；ｐ＝０．００３）と比較して、第一悪性頻拍性不整脈イベントを患う患者においてＣＴ−ｐｒｏＥＴ１レベルが有意に増大した（中央値：９０ｐｍｏｌ／Ｌ）。対照的に、ＢＮＰ群間において違いは見られなかった（ｐ＝０．５５）（表１）。

第一悪性頻拍性不整脈イベントの予測因子
悪性頻拍性不整脈は、試験登録後１８か月の中央値で生じた（ＩＱＲ：８〜４１か月）。ＣＴ−ｐｒｏ−ＥＴ−１レベル、ＮＹＨＡクラス、頸静脈圧の増加、及びベータ遮断薬を用いた治療は、第一エンドポイントを予測する一変量Ｃｏｘ回帰モデルに有意に寄与した。ＢＮＰ、収縮期血圧、ＬＶ拡張終期径、ＬＶ−ＥＦ、及び左脚ブロック（ＬＢＢＢ）の存在のいずれも、ＩＣＤ療法を必要とする悪性頻拍性不整脈のリスクを予測しなかった（表２）。ＩＣＤ患者は、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１又はＢＮＰレベルに従って、２つの群に層別化され、そしてＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ分析が行われた。頻拍性不整脈のリスクは、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１血漿レベル＞７３ｐｍｏｌ／Ｌ（中央値）の患者が、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１値がこのカットポイント未満である患者よりも有意に高かった（ｌｏｇｒａｎｋ検定，ｐ＜０．００１，図１Ａ）。エンドポイントとして悪性頻拍性不整脈を使用したとき、ＢＮＰ血漿レベル≦８３ｐｇ／ｍＬ（中央値）又は＞１８３ｐｇ／ｍＬの患者において違いは見られなかった（ｌｏｇｒａｎｋ検定，ｐ＝０．１０ｐ，図１Ｂ）。ＬＶ駆出分画とＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１レベルとの有意な関連性は見られなかった（図２）。

第一悪性頻拍性不整脈の発症を予測するためにＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１レベルを使用するＲＯＣ曲線下面積は０．６９であった（図１Ａ、挿入図）。ＲＯＣ曲線から得られる、陽性及び陰性予測精度の計算のためのＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１最適濃度は７５．５ｐｍｏｌ／Ｌであった（感受性８０．８％、特異性６４．４％、陰性予測値９２．１％、陽性予測値３９．６％、及び陽性尤度比２．２７）。

ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１血漿レベルは、第一悪性頻拍性不整脈のリスクを予測する多変量Ｃｏｘ回帰モデルに有意に寄与した。リスク比が、ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１レベルのｐｍｏｌ／Ｌ増加によって計算された（表２）。統計分析におけるｌｏｇ（ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１）の使用は、得られる結果を変化させなかった。多変量Ｃｏｘ回帰分析は、ベータ遮断薬を用いた治療が好ましい予後を示すことを明らかにした（表２）。

Claims (12)

1. 心疾患を患う患者のための、悪性頻拍性不整脈の発症のインビトロにおけるリスク層別化方法であって：
   ・患者から得られた試料中における、プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片のレベルを決定すること
   を含む、前記方法。
2. プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）、又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片の前記レベルが、植え込み型除細動器（ＩＣＤ）、及び／又は抗不整脈性ハイブリッド療法を必要とする悪性頻拍性不整脈のリスクと相関性がある、請求項１に記載のインビトロにおける方法。
3. 不整脈による突然死の第一次予防のための、請求項２に記載のインビトロにおける方法。
4. 前記相関性ステップが、プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）、又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片の前記レベルと閾値とを比較することを含み、そしてそれにより、プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）、又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片、又はそれらの断片の前記レベルが、前記閾値レベルを超えているとき、前記患者は頻拍性不整脈の高リスク状態にある、請求項２又は３に記載の方法。
5. ＣＴ−ｐｒｏＥＴ−１がプロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）断片として使用される場合、前記閾値が約７３＋／−２０％ｐｍｏｌ／Ｌである、請求項４に記載の方法。
6. 前記心疾患が、虚血性又は非虚血性病因のいずれかの心不全である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記患者がＬＶ駆出分画≦４５％を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記試料が血液試料、血清試料、及び血漿試料を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）、又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片の前記レベルを、１つ以上の追加の予後マーカー、パラメーター、又は因子のレベル／条件と組み合わせることをさらに含み、それにより、プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）、又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片と、追加の予後マーカー（単数又は複数）、パラメーター（単数又は複数）、又は因子（単数又は複数）の前記レベル／条件との組み合わせが、前記方法のリスクに関する予測値を増加させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記追加の予後マーカー、パラメーター、又は因子が、表２に列挙された全てのパラメーターを含む群から選択され、そしてそれは一変量又は多変量分析においてｐ＜０．０５を示し、それによりＢＮＰは、ｐｒｏＢＮＰ又は、ＢＮＰ若しくはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含む、少なくとも１２個のアミノ酸のその断片に関する一例に過ぎない、請求項９に記載の方法。
11. プロ−エンドセリン−１（ＰｒｏＥＴ−１）又は少なくとも１２個のアミノ酸のその断片の前記レベルが、サンドイッチ免疫測定法を用いて測定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記プロ−エンドセリン−１の断片がＣＴ−ｐｒｏ−ＥＴ−１である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

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