JP2011512834A - 非遺伝毒性発癌物質に関するスクリーニング - Google Patents

Abstract

本発明は、非遺伝毒性発癌物質を動物モデルにおける作用に関してスクリーニングするための方法に関する。また、本発明は、このような方法に用いるのに適した動物モデル、及びインビトロスクリーニング目的のためのこのような動物由来の細胞株にも関する。より詳細には、本発明は、核内転写因子ＣＡＲ、ＰＸＲ及びＰＰＡＲαに関してヒト化されており、その内在性等価遺伝子が機能しないようにされているトランスジェニックげっ歯動物に関する。

Description

本発明は、非遺伝毒性発癌物質の動物モデルにおける作用についてのスクリーニング方法に関する。また、本発明は、このような方法に用いるのに適した動物モデル、及びインビトロスクリーニング目的のためのこのような動物由来の細胞株にも関する。

治療薬候補はそのかなりの割合が、治験時に見出された有害な代謝や毒性のために市場向けの薬物とはなり得ない。このような失敗は、多額の開発費が無駄になっていることを示しており、よって、候補薬のヒトにおける代謝特性や毒物学的特性を前臨床開発段階で、より確実に、迅速に且つ経済的に予測できる新しい技術が必要である。現在、候補薬の前臨床代謝試験や毒性試験の多くは、実験動物やヒト及び／又は哺乳動物の培養細胞株及び／又は組織を利用している。しかし、これらの方法はいずれも、被験者における代謝や毒性を予測する上で完全に信頼できるものではない。動物から得た代謝データや毒物学的データは、生化学的機序に関する種間差のため、被験者から得たものとは大きく異なる。また、インビトロでのヒト細胞培養物や単離ヒト組織の研究から得たデータの解釈は、このような系が全ての器官や組織について利用できるとは限らず、また、インビボで有するのと同じ代謝特性を保持できないため問題となり得る。

我々が曝露される薬物や他の化学剤の安全性の評価に関連する主な因子は、該剤が肝成長の誘導によって後成的発癌を誘導する能力があることである。このように作用する剤の能力は、現在、実験用ラットやマウスにおいて試験されているが、このような試験が必ずしもヒトの状態を反映しないことが分かっている。

先行技術においては、多くの薬物の代謝、分布及び毒性は、互いに明瞭に区別される次の４種類の主要タンパク質クラスと該薬物との相互作用に依存することが知られている。４種類のタンパク質クラスとは、即ち、第１相薬物代謝酵素（例えば、シトクロムＰ４５０）、第２相薬物代謝酵素（例えば、トランスフェラーゼ、特に、グルクロニルトランスフェラーゼやグルタチオントランスフェラーゼ、スルホニルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ）、薬物輸送タンパク質（例えば、ＡＴＰ結合カセットタンパク質）、そして最後に、転写因子（例えば、先のクラスのタンパク質（特に、シトクロムＰ４５０）をコードする遺伝子の転写を調節する、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）や構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ））である。

特定の転写因子に関してヒト化したマウス株に関する報告は数多く存在する（Xie et al, Nature Vol 406, 435-9, 2000; or Zhang et al, Science Vol 298, 422-4, 2002参照）。このようなモデルの不利な点は、ＰＸＲ遺伝子やＣＡＲ遺伝子自身が異種組織特異的プロモーター（アルブミンプロモーター）によって促進される導入遺伝子であるため、ヒトの場合と同様には調節されないことである。従って、異種遺伝子の過剰発現が生じ、その結果、正常な代謝経路が迂回される。また、ＰＸＲ及びＣＡＲ導入遺伝子はゲノムクローンではなくｃＤＮＡに由来するため、トランスジェニック非ヒト動物においては、ＰＸＲやＣＡＲ発現の全ての転写調節及び転写後調節を正しく再現するのに必要な配列が欠如し、その発現は肝臓に限定され、生理学的レベルにはなり得ない。また、このようなモデルはヒト遺伝子のスプライスバリアントをコードしない。

本発明者ら自身のグループは、内在性発現のヌルバックグラウンドに対し、ＣＡＲ及びＰＸＲに関して二重ヒト化したマウスを得た。しかし、２種を超えるこのような受容体に関してヒト化され、特に内在性核内受容体が欠失したマウス株は未だ得られていない。本発明者らが知る限りでは、非遺伝毒性発癌物質のヒト安全性評価や危険性評価への関連性を解明する上でのこのようなマウスの有用性や、このような株に従ってより複雑なモデルが作出可能であることは提案されていない。

本発明は、その第１の様相において、核内転写因子ＣＡＲ、ＰＸＲ及びＰＰＡＲαに関してヒト化され、その内在性等価遺伝子（endogenous equivalent genes）が機能しないようにされている（rendered inoperable）トランスジェニックげっ歯動物を提供する。このような動物は、非遺伝毒性発癌物質をスクリーニングする上で大きな可能性があると考えられる。

一般に肝臓で生じる化学剤の過形成作用や肥大作用を仲介する多数の転写因子が確認されている。本発明者らは、このような転写因子の内、核内受容体ＰＰＡＲα、ＣＡＲ及びＰＸＲが非遺伝毒性発癌物質による細胞周期や細胞増殖の調節において特に重要であると考えている。従って、本発明のこの様相は、これら３種類の受容体全てに関してヒト化され、その内在性宿主動物遺伝子が付随して機能しないようにされているトランスジェニック動物の作出に基づく。

本発明は、単一動物モデルにおいて、開発中の薬物や他の化学物質の潜在的に不利な点を評価するための予測アプローチを提供するが、これは、先行技術に記載のモデルに比べて多くの利益をもたらす。本発明に係る動物株の作出によって、ヒトにおける薬物応答や化学物質応答を決定する因子についての理解が顕著に高まる。このようなモデルは、多数の異なるスクリーニングシナリオ（例えば、有効性スクリーニングやＰＫ／ＰＤモデリング、薬物や化学物質の安全性試験等）に適用することができる。

発癌物質は遺伝毒性又は非遺伝毒性に分類することができる。遺伝毒性物質は、ＤＮＡに直接（親分子又は親分子の代謝物）結合して不可逆的な遺伝損傷や変異を生じさせる（即ち、一般にこのような化合物の安全と考えられる全身的レベルは存在しない）。これに対し、非遺伝毒性物質は、ＤＮＡを直接損傷するのではなく、別の方法で作用して増殖を促進する。このような毒素は細胞毒性又は非細胞毒性（細胞壊死が生じない）に分類される。非遺伝毒性物質の例としては、ホルモンや一部の有機化合物が挙げられる。このような化合物全てにおいては、ヒトが危険を伴わずに接触することが可能な曝露閾値が存在する。

現在の動物モデルは、非遺伝毒性発癌物質のスクリーニングについては理想から程遠いが、それは、このような化合物によって調節されるげっ歯類受容体が示すリガンド特異性が、マウスや他のげっ歯動物とヒトとの間で明確に異なるからである。従って、ある化合物がマウスにおいて毒性を示し得る場合でも、その等価な作用がヒトにおいては良性又は無関係となるであろう。例えば、最近のエビデンスによって、ネズミ及びヒトＣＡＲタンパク質のリガンド結合ドメインは他の核内ホルモン受容体に比べて分岐しており、これによって生体異物応答における種特異的差異がもたらされるという主張が支持されている（Huang et al., 2004, Molecular endocrinology 18(10):2402-2408）。この論文で報告された結果から、げっ歯動物及びヒトにおけるオルソロガスな受容体経由の相対する生体異物応答が単一の化合物によって誘導され得ることが分かる。同様な差異がハムスターとモルモットに存在する。

このような薬物の一例は、現在市場に出回っているフェノバルビタールである。ラットやマウスで試験した場合、過形成作用と肥大作用の両方が数日以内に見られ、約２年後には肝腫瘍が明らかになる。過形成とは、通常見られる増殖を超えた器官や組織内での細胞増殖として定義される。また、肥大は、器官サイズや組織面積の増大も伴うが、細胞の数を保ったままでそのサイズの増大を伴う。疫学的研究から、フェノバルビタールがヒトにおいては癌を引き起こさないことが分かっているが、ある規制当局では、他の製品の安全性を評価する際、遡及的疫学研究によってその安全性を実証するには時期尚早であるとしてげっ歯類発癌性データを無視しようとしない。その結果、ある薬物をヒトに実際に投与せずには該薬物に呼応する過形成を正確に試験することができないため、マウスにおいて過形成作用を示す薬物や他の化学物質を開発しようとしないのは当然である。この場合、薬物が安全であることが分かっていなければ、明らかに許容され得ない。

他の例は、核内受容体であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）の作動薬として機能する脂質低下性フィブラート系薬物である。ＰＰＡＲαの持続活性化によって、ラットやマウスにおいて肝腫瘍が発生する（Cattley et al, 1998, 2004）。しかし、ヒトはペルオキシソーム増殖の誘導やフィブラート系薬物に呼応する肝臓癌の発生には耐性を示すように思われる。

更なる例としては、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）のファミリーが挙げられるが、これに対しては過去、種々の薬物が脂質低下剤として開発された。これらの薬物はマウス及び、多くの場合ラットモデルにおいて非遺伝毒性（後成的とも称する）発癌物質であることが確認されたため、その開発は中止された。当初、このような差異は発現レベルの差に起因すると考えられた。しかし、理由は不明であるが、ヒト受容体は、リガンド結合の際にマウス受容体と同様には細胞増殖機構を活性化しないことが分かった。

異種間の差異に伴う問題を克服するため、インビトロスクリーニングではヒト細胞を用いることが多い。しかし、インビトロ系では薬物代謝状況のごく一部しか組み込むことができず、全体的な視野が提示されない。従って、実際のインビボ作用は隠されることがある。例えば、インビトロでは有毒副産物が生成するために有害と思われる薬物が、インビボではその有毒副産物を代謝する二次酵素を活性化するため有害ではないように見えるというようなよくある状況を考えてみよう。殆どの化合物がある程度は特定の標的と相互作用することも真実であるが、薬物の安全性に関する重要な問題は、この相互作用が、組織が曝露されるであろう濃度において生理学的に関係するかどうかである。インビトロシナリオに特有の限界によって、この問題は適切に解決されない。

ヒトにおいては過形成応答が薬物曝露に呼応して生じないことを実証することができれば、非常に有用であろう。本発明者らは、非遺伝毒性発癌物質の安全性について忠実な試験を行うために有効な一方法は、非遺伝毒性発癌物質が主に相互作用する転写因子に関してヒト化したげっ歯動物を用いることであると結論づけた。同時に、導入されたヒトタンパク質の機能への非ヒト代謝経路からの干渉を確実に大幅に低下させるため、等価な内在性げっ歯類転写因子遺伝子の発現を無効化することも必須である。

本発明者らは、一般に、非遺伝毒性発癌物質であって、げっ歯動物において肝腫瘍を引き起こす化合物がＰＸＲ、ＣＡＲ及びＰＰＡＲαリガンドであることに注目した。これらは、細胞増殖を刺激するか又はアポトーシスを阻害することによって、或いはその両方によって過形成を引き起こす。更に、滑面小胞体や酵素の誘導によってオルガネラ（例えば、滑面小胞体やペルオキシソーム）の増殖を刺激して肥大を引き起こす。バルビツール酸塩は主にＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｂを誘導し、ステロイド類は主にＣＹＰ３Ａを誘導し、ペルオキシソーム増殖因子は主にＣＹＰ４Ａを誘導する。一部の化学物質は複数の受容体と実質的に相互作用して複数のシトクロムＰ４５０を誘導する。図１は、薬物化合物がどのように核内受容体と相互作用するか、そして、その後の薬物代謝、細胞周期調節及び増殖に関与する代謝経路について本発明者らが表したものである。

ＣＡＲ、ＰＸＲ又はＰＰＡＲαに関して個々にヒト化したマウスは現在存在する。実際、Cheungらは２００４年に、種々の生理学的作用（野生型及びＰＰＡＲαノックアウトマウスにおける薬物に曝露した際の肝臓体重の増加等）をモニターし、この応答とヒト化マウスにおいて見られる応答とを比較した。ヒト化マウスにおいては肝臓体重の増加は抑制され、複製ＤＮＡ合成の増大（即ち、過形成のマーカー）は見られなかった。

しかし、同じ遺伝子ファミリーのメンバー間での機能的冗長性のため、本発明の多重ヒト化モデルは個々の転写因子の欠失に比べて大きな利益をもたらす。

本発明者らは、３種類の受容体全てを同時にヒト化した動物が現在の単一ヒト化モデルの適用に比べて大きな改善をもたらすのには多くの理由があると考える。
第１の例においては、非遺伝毒性発癌物質によって調節される過形成を主に仲介する転写因子が全てヒト化されているため、上述のリガンド特異性の差異に伴う問題が解決される。従って、ヒト化モデルの一利点は、リガンド特異性の問題を無くすることである。ＰＰＡＲα、ＣＡＲ及びＰＸＲの全ては、遺伝子発現をトランス活性化する外因性リガンドと相互作用し、これによって、本発明者らが非遺伝毒性発癌物質の代謝において潜在的に有害であると考えている経路を仲介する。

また、特定の薬物によって生じるタンパク質レベルの割合も非常に重要である。例えば、マウスＰＸＲの作用によって、ヒトＰＸＲの作用に比べて種々のタンパク質の発現が異なるレベルで刺激される。特定の薬物やその代謝物のレベルは、どのような薬物代謝酵素や輸送体が発現しているかに大きく依存するが、このことからも、本発明者らは、試験動物由来の内在性転写因子ではなく、ヒト転写因子を用いることが非常に重要であると考える。

毒物学的観点からもヒト転写因子を用いることが重要である。例えば、ＰＸＲは胆汁酸や他の生理学的化合物によって自然に調節され、胆管壊死や胆汁うっ帯等の中毒症状は特定の薬物への曝露によって生じ得る。従って、ヒトと試験動物との薬物代謝の差異によって、ヒトの場合には明らかでなかった毒性作用が試験動物では顕著に見られることがあり得る。

三重ヌルバックグラウンドに関するこのような三重ヒト化動物の主な一利点は、一化学剤が複数の受容体と相互作用し得るため、これらの転写因子間で化学物質に対する応答において冗長性が高いことである。従って、これらの受容体の１種のみに関してヒト化したマウスによってもたらされる応答の大きさは正確ではないであろう。

また、非遺伝毒性発癌物質の代謝に関与する異なる核内受容体間で複数のクロストーク経路が生じ得る。第１は、分子レベルでの受容体間のクロストークである。第２は、例えば、交差反応二次代謝物の生成や薬物の性質の変化による代謝インターフェイスでのクロストークである。第３は、核内受容体同士がクロストークし、互いの発現レベルや機能を調節し得ることである。特定のレベルの薬物が遺伝子を活性化し、その遺伝子が他の遺伝子をトランス活性化し得るため、複雑さのレベルが更に高まる。

従って、ヒト化受容体の複合パネルを有することによってのみ、ヒトにおいて予測される真実の応答が得られるであろう。このようなクロストークは、原理的には多少の質的レベルで予測することが可能であるが、如何なるフィードバック機構の作用や程度の大きさも本質的に予測不可能であるため、生理学的に関連するレベルで必要な要素全てを組み込んでいない如何なる系の価値も低くする。

これらの受容体間のクロストークが最終結果を決める上で重要な鍵となり得る一例は、ＣＡＲ、ＰＸＲ及びＰＰＡＲα転写因子が、その外因性リガンドによる活性化に加えて、脂肪酸ホメオスタシスの攪乱によって調節されるという事実である。従って、これらの受容体全てを同時にヒト化したマウスを有することは有利であろう。

また、３種類の遺伝子座全てにおいて動物を同時ヒト化することによって、個々のヒト化動物について複数の実験を行う必要が無くなるため、ある化学剤が過形成を誘導できるかどうか明確に立証するのに必要な動物の数が劇的に減少する。

本発明者らは、プロモーターが酵素発現を誘導する能力が各種組織において異なることに注目した。これによって、宿主動物由来の内在性転写因子ではなく、ヒト転写因子を用いるべきであるという主張の重要性が大きく増す。従って、転写因子の調節配列やそれによって調節される遺伝子は、できるだけ天然の生理学的状態に酷似する必要がある。

本発明に係る動物は、如何なる非ヒト種であってもよく、例えば、ラットやハムスター、モルモット等の他のげっ歯動物や、サルやブタ、ウサギ、イヌ、ネコ等の他種、或いはヒツジやヤギ、ウマ、ウシ等の有蹄動物であってもよく、非哺乳動物種であってもよい。より好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物（哺乳動物）及び組織又は細胞はげっ歯動物（より好ましくはマウス）に由来する。

トランスジェニック動物の使用には倫理的な問題があるが、本明細書に記載した種類の研究から得られるヒトにとっての利益は、トランスジェニック動物の作出や試験に課せられるであろう如何なる苦労をも大きく上回ると考えられる。当業者には明らかなように、薬物療法の場合、ヒトにおいて治験を始める前に、現在の規制の下、現在入手可能なモデル系を用いて動物実験を行う必要があり、動物実験なしで済ますことはできない。いずれの新薬も少なくとも２種類の生きた哺乳動物に対して試験を行う必要があり、その内の１種類は大型の非げっ歯動物でなければならない。体内で非常に特異的に作用する現在開発中の新しいクラスの薬物の場合、今後においてより多くの動物を用い、また、より多くの霊長類を用いることになるであろうと専門家は考えている。例えば、「高齢者（greying population）」を悩ます神経疾患に科学が取り組もうとするに従って、次世代薬物の安全性や有効性を試験するためのサルを安定供給する必要があると考えられる。即ち、本明細書に記載のようなトランスジェニックモデルから得られるヒトにとっての利益は、一般には決してマウスやげっ歯動物に限られるものではなく、霊長類を含む他の哺乳動物をも網羅する。このような新規な薬物が特異的に作用するということは、脳構造が我々と非常に類似している点から霊長類のみが実験に適した動物となり得ることを意味する。

本発明は、創薬における消耗（attrition）の程度を減少させることを目的としている。薬物が試験後期で失敗に終わる場合には、動物実験全てがある意味で無駄になる。よって、薬物の失敗を阻止することは実験動物の命を救うことになる。従って、本発明はトランスジェニック動物に関するものであるが、このような動物を用いれば、薬物試験プログラムで用いるのに必要な動物の数を減少させることになるであろう。

転写因子の発現を支配する調節配列はヒトに由来するのが好ましいが、標的動物種（例えば、マウス）に由来してもよい。導入されたヒトタンパク質の発現の調節は、ヒトにおける発現パターンが再現されるように維持する必要がある。

本発明の更なる利点は（特にヒト遺伝子が内在性遺伝子座に導入される場合）、遺伝子発現の予測パターンが維持されることである。従来、この分野の多くの研究者は、例えば、ＢＡＣ遺伝子組換えを用いて標的遺伝子を宿主ゲノムにランダムに組み込んできた。この戦略の場合、置換遺伝子の上流又は下流に離れて位置するため、その遺伝子発現パターンに影響を及ぼし得るエンハンサー要素を同時に導入しないという制限がある。また、導入遺伝子の発現に対する位置効果が見られることも多い。従って、導入された因子の発現が真ではなくなり、この動物を用いたいずれの実験においても誤った結果がもたらされる。

本発明は、下流エンハンサーの作用が現れたままである内在性遺伝子座内に転写因子をノックするという利点も示す。

動物の「内在性等価遺伝子」とは、作動しないようにする機能を機能的に置換することが可能な遺伝子又は遺伝子クラスター（即ち、一又は複数の遺伝子であって、その発現産物がヒトカウンターパート遺伝子と同様、類似或いは同一の機能を保持する遺伝子）を包含することを意図する。

例えば、ＰＸＲ（ＮＲ１Ｉ２核内受容体サブファミリー１、グループＩ、メンバー２）として知られているヒト転写因子遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ：８８５６）は、名称が同じでそのＥｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤが１８１７１であるマウスカウンターパートを有する。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、その由来源の生物内において等価な機能を有する。従って、他の生物内で認められたオルソロガスなカウンターパートが例として挙げられる。ラットオルソログはＥｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ ８４３８５を有する。

本明細書でＣＡＲと記載されているヒト転写因子はＮＲ１Ｉ３（核内受容体サブファミリー１、グループＩ、メンバー３）としても知られており、Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ ９９７０を有する。ラット遺伝子はＮｒ１ｉ３として知られており、Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ ６５０３５を有する。マウス遺伝子もＮｒ１ｉ３として知られており、Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ １２３５５を有する。

本明細書でＰＰＡＲαと記載されているヒト転写因子はＥｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ ５４６５を有する。マウスオルソログはＥｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ １９０１３を有する。ラットオルソログはＥｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ ２５７４７を有する。

本発明のモデルは、核内受容体ＡｈＲに関してヒト化されているのも好ましい。同様に、その内在性等価遺伝子を機能しないようにする必要がある。従って、本発明のこの様相の一実施形態によると、少なくとも核内転写因子ＣＡＲ、ＰＸＲ及びＡｈＲに関してヒト化され、その内在性等価遺伝子が機能しないようにされているトランスジェニックげっ歯動物が提供される。このような動物は、非遺伝毒性発癌物質をスクリーニングする上で大きな可能性があると考える。本発明のこの実施形態における動物の作出に関するエビデンスを本明細書に記載する。このような動物はＰＰＡＲαに関してもトランスジェニックであり得る。

ＡｈＲは、上述の他の３種類の核内転写因子とは構造が異なるタンパク質を含むＰＡＳドメインであり、核内受容体との配列相同性は限られているか又は全く無い。リガンド応答性について大きな種差があり、マウス内においても多型が存在し、表現型の違いと成っている。ＡｈＲタンパク質は、前駆型変異原を変異原に変換する活性化電位を有する酵素の活性化を誘導する。例えば、ヒトの場合、そのＡｈＲ転写因子によってダイオキシンに対する感受性がかなり低い。厳重な規則として、製薬会社は、毒性を探し求める際に明らかな如何なる見掛けの毒性をも回避するため、ＡｈＲと相互作用するいずれの化合物をも十分に排除する。

ＡｈＲも上述の他の核内受容体と同様にクロストークに関与する。例えば、受容体ＡｈＲとＮＲＦ２との相互作用は明らかである。理想的には、適切な条件下でこの両方の要素を系に組み込む必要がある。

本明細書でＡｈＲと記載されているヒト転写因子はＥｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ １９６を有する。マウスオルソログはＥｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ １１６２２を有する。ラットオルソログはＥｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ ２５６９０を有する。

本発明の動物においてヒト化し、内在性遺伝子をノックアウトし得る転写因子の他の例としてはＨＮＦ１及びＨＮＦ４が挙げられる。

一般に、核内転写因子のヒト及びマウスオルソログの例は当業者に知られている。

一般に、導入された転写因子遺伝子は、それと等価の内在性遺伝子とある程度の相同性を有する。好ましくは、その相同度（the degree of homology）は３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は９５％超である。

本発明では、可能な場合には置換遺伝子の全体を提供することによってインビボでの状態を反映することを試みる。これは、スプライシング現象が自然の状態と全く同様に起こり得るように、イントロン−エクソン接合を自然系同様に保持することを意味する。遺伝子の長さによって、その遺伝子全体をトランスジェニック系に組み込むことが容易でない場合には、本発明は、スプライシングイベントの大部分が生じる重要なイントロン−エクソン境界が保持されるようにｃＤＮＡとゲノムＤＮＡとの組合せをその構築物として用いようとするものである。

従って、本発明によると、ある特定のイントロン内でのスプライシング変異によってスプライスバリアントの大部分が生じることが分かれば、このイントロンを構築物内にゲノムＤＮＡとして組み込むことが好ましい一方で、影響力の小さいイントロン配列は保持しない。この結果、機能性ｍＲＮＡ及び機能性タンパク質のレベルが、特定の薬物又は薬物カクテルへの曝露に呼応してインビボで見出されるレベルを反映する。これが、生理学的関連モデルにとって理想的に必要なものである。

従って、ｃＤＮＡ配列を用いてもよいが、この配列よりも好ましいものとして、本発明ではヒト化される遺伝子由来のｃＤＮＡとゲノム配列との組合せを用いることができる。例えば、ヒトＰＸＲ遺伝子を発現するトランスジェニック動物の場合、ヒトＰＸＲ遺伝子のサイズが３５ｋｂ超と大きいため、エクソン４とエクソン６との間のイントロン−エクソン構造を保持するのが好ましい（ＷＯ２００６／０６４１９７参照）が、それは、このゲノム領域がリガンド結合ドメイン内に位置するために、このゲノム領域で多くのスプライスバリアントが見られるからである。これによって、多くのスプライスバリアントが見られ、都合よくリガンド結合ドメイン内に位置する配列が有利に保持される。同様に、ＰＰＡＲαの場合、コードＤＮＡ配列はヒトＰＰＡＲα遺伝子のイントロン５とイントロン６の少なくとも一部を含む（図４参照）。ＰＰＡＲαに関してヒト化したホモ接合体マウスを作出したが、それを本明細書に記載する。野生型の予測コード配列に加え、２種類のスプライスバリアント（ＳＶ１及びＳＶ２）が得られることが分かる。バリアントＳＶ１は公表されているが、これはヒト特異的な選択的スプライスバリアントである（Gervois et al, 1999）。バリアントＳＶ２は、エクソン５の３’末端において４ｂｐ（ＧＴＡＧ）のアウト・オブ・フレームインサートが付加され、中途終止コドンとなった新しい型の転写物である。ヒト化マウスにおける切断型ＰＰＡＲαタンパク質の潜在的機能は不明である。

全ゲノムＤＮＡ配列を用いるのが好ましい。例えば、ヒトＣＡＲ遺伝子を発現するトランスジェニック動物の場合、ヒトＣＡＲのサイズは比較的小さい（エクソン２〜９由来の約７ｋｂ）ため、ターゲティングベクター内で全ゲノム構造を保持することが容易となる。構築物は、エクソン２とエクソン９との間のイントロン−エクソン構造を保持するのが好ましい（ＷＯ２００６／０６４１９７参照）。これによって、ターゲティングベクター内で全ゲノム構造が有利に保持され、ヒトＣＡＲの全てのスプライスバリアントをカバーすることができる。ゲノムヒトＣＡＲ配列はマウスＣＡＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合するのが好ましい。その際、ヒトＣＡＲ配列はエクソン１〜９の全てのゲノム配列を含む。５’及び３’ＵＴＲはヒトであってもよく、マウスゲノムから保持されていてもよい。マウスＣＡＲ遺伝子のコード配列の他の全ての部分を欠失させることができる。

本発明者らは、非遺伝毒性発癌物質をスクリーニングする際には、関連機能を有するタンパク質をコードする内在性遺伝子を試験動物においてできるだけ多く機能しないようにすることが非常に重要であると考える。この一理由としては、薬物代謝遺伝子（例えば、本発明が関係する種類の転写因子）間での冗長性の度合いが高いことが挙げられる。

「機能しないようにする」とは、遺伝子又は遺伝子機能を無効化又は欠失させることを意味する。従って、この用語は、宿主動物の内在性等価遺伝子が（少なくとも薬物代謝プロセスに必要な如何なるレベルにおいても）遺伝子産物を発現できないように行う発現抑制、欠失又は非活性化を包含することを意図する。例えば、無効化した遺伝子の発現レベルは、野生型発現レベルの２０％未満になり得るが、１０％未満が好ましく、５％未満がより好ましく、２％未満がより好ましく、１％以下が更により好ましい。機能しないようにした遺伝子の発現は、検出不可能なポイントまで抑制されているのが好ましい。

本発明の動物の全組織において内在性転写因子の機能性が欠失しているのが好ましい。肝臓が薬物代謝に関して真に重要な唯一の組織であるという間違った考えが広く受け入れられている。真実はこれとは程遠く、実際、転写因子の機能は、肝臓以外の種々の組織（特に、消化管や血液脳関門等が挙げられる）で発現される。従って、全組織での機能の完全抑止は、内在性遺伝子ノックアウトの作用を明らかにするために必要である。

従って、本発明のモデルは、特定の転写因子系が（例えば、肝臓における条件的ノックアウトによって）不活性化された他の多くのモデルよりも利益をもたらす。これに対し、本発明のモデルにおいては、転写因子の欠失が全組織で生じるのが好ましい。

本発明の動物モデルの有用性に関する非常に良い一理由は、従来用いられているマウスの場合、一般にＰ４５０代謝速度が遅いため、多くの薬物をヒトよりも遥かに速く（ほぼ１０倍速く）代謝することである。従って、等価な薬物の半減期がヒトにおいて数時間である場合には、このような酵素を活性化するマウスでは半減期は恐らく３０分間となるであろう。当然のことながら、マウスでは正常な処分経路がマスクされるという作用が得られるが、これは、該経路が実施される機会が無いためである。従って、非遺伝毒性薬物の代謝を支配する優性転写因子を欠失させることによって、このような薬物処分経路を論点から排除する効果が得られる。このようなノックアウトマウスを等価なヒト転写因子に関してヒト化することによって、ヒト薬物代謝経路を内在性マウス酵素からの干渉無しに評価することができる。

標的動物において内在性等価遺伝子を機能しないようにするための方法の例はＷＯ２００６／０６４１９７に記載されている。即ち、当業者には明らかなように、内在性宿主遺伝子は、多くの種々の手段によって機能しないようにすることができる。例えば、これは、遺伝子のコード配列を宿主動物ゲノムから完全に欠失させることによって行うことができる。或いは、コード配列を他の配列の挿入、欠失又は置換によって変異させて欠失させることができる。例えば、一以上の変異（フレームシフト変異等）は、得られるＲＮＡ転写産物が非機能性タンパク質又は切断型タンパク質をコードするように生じさせることができる。或いは、染色体配列に挿入を行ってアミノ酸コードを分断することができる。

同様に、欠失対象の転写因子配列をある配列（例えば、成功した欠失体をスクリーニングするための基準として用いることができる選択配列やマーカー配列）と交換することができる。このような一戦略はWallaceら（Cell 128, 197-209 2007）によって考案されており、遺伝子交換のコンテクスト内ではあるが、本発明の方法に適用可能である。この方法では、ベクターを用いた置換配列が内在性ゲノムマウス配列に取って代わるのに２種の分子間相同組換えイベントが必要となるような、マウス染色体とＢＡＣ又はＹＡＣベクターとの間での配列の交換が想定されている。

好ましい一システムにおいては、相同組換えのメカニズムを用いて遺伝子をその遺伝子が存在しない他の配列と交換する。このような方法は、次の段階、即ち、ａ）置換対象の標的遺伝子が各々の端で組換え部位と隣接するように相同組換えによって宿主動物染色体に一対の部位特異的組換え部位を組込むことと、ｂ）部位特異的組換え部位間で組換えを行い、標的遺伝子が染色体から除去され、残存部位特異的組換え部位で置換されるようにすることとを含むのが好ましい。

相同組換えを行うための方法は当該技術分野では公知であり、外部から供給されたＤＮＡ分子と標的染色体との間で相同領域を用いてＲＴ部位を導入する。この方法においては、置換配列内の５’及び３’相同アームによって置換配列と標的との間の組換えが促進され、遺伝子が欠失されるようになる。この戦略を用いた方法は、本出願人による２００７年９月１４日出願の同時係属特許出願第ＧＢ０７１８０２９．２号「発明の名称：二段階のクラスター欠失及びヒト化」及びＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３０８４（発明の名称は同じ）に報告されている。この戦略は本発明の方法に完全に適用可能である。

この構成においては、置換配列の各々は、５’相同アームと３’相同アームとの間に選択マーカー及び少なくとも１種のリコンビナーゼ標的（ＲＴ）部位（例えば、ｌｏｘＰやｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、Ｆ３）があるように設計する。このように、両方の置換核酸をうまく組込んで、欠失対象遺伝子に隣接するように選択することが可能である。置換ヒト転写因子遺伝子配列がＲＴ部位の外側にあるようにフランキング配列の１種を設計することできる。ＲＴ部位を認識する適切な部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）に細胞を曝露することによって遺伝子を除去するのは技術的に容易である。これによって、宿主動物転写因子遺伝子が完全に欠失すると同時に、該遺伝子がヒト等価物で置換される。上述の組換え段階は、当該技術分野でよく知られている方法に従って胚性幹細胞内で行うのが好ましい。

トランスジェニック株を作出するための好ましい戦略においては先ず、変化した胚性幹細胞の作出を行う。その後、変化した胚性幹細胞を胚盤胞に挿入することができる。従来、胚盤胞は雌性マウスから交配の約３日後に単離している。最大２０個の変化した胚性幹細胞（好ましくは、約１６個）をそのような胚盤胞に同時に挿入することができる。変化した胚性幹細胞を胚盤胞に挿入することにより、好ましくは、妊娠動物の特性を反映するように誘導された偽妊娠動物（例えば、マウス）に移植することによって、胚性幹細胞は発育初期胚に組込まれるようになる。この方法によると、変化した胚性幹細胞を含む胚盤胞は偽妊娠動物の子宮壁内に移植され、妊娠期間が終了するまで該動物内で発育し続ける。変化した胚性幹細胞は増殖し、分裂して発育トランスジェニック動物の全組織（生殖系列を含む）に定着するようになる。

本発明の方法の一様相においては、作出したトランスジェニック動物は、各体細胞組織及び生殖系列内に変化した細胞と未変化の細胞を含むキメラとなり得る。

大きいＤＮＡ断片（２００ｋｂ〜数メガベース）の欠失に適したＣｒｅ／ｌｏｘ介在欠失を仲介するための方法は以下の論文に記載されている（Li ZW, Stark G, Gotz J, Rulicke T, Gschwind M, Huber G, Muller U, Weissmann C. Generation of mice with a 200-kb amyloid precursor protein gene deletion by Cre recombinase-mediated site-specific recombination in embryonic stem cells Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Jun 11;93(12):6158-62. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Oct 15;93(21):12052; in Su H, Wang X, Bradley A. Nested chromosomal deletions induced with retroviral vectors in mice. Nat Genet. 2000 Jan;24(l):92-5）; Call LM, Moore CS, Stetten G, Gearhart JD. A cre-lox recombination system for the targeted integration of circular yeast artificial chromosomes into embryonic stem cells. Hum Mol Genet. 2000 Jul 22;9(12):1745-51）。

最終的には、上述の方法によって作出した２種のヘテロ接合体動物を交雑させて、着目遺伝子のヒト対立遺伝子に対してホモ接合性のトランスジェニック動物を作出することができる。２種のヘテロ接合体トランスジェニック動物の交雑によって、欠失に対してホモ接合性の後代の一部が産生するであろう。

本発明の更なる実施形態においては、次に開示の方法によって、トランスジェニック非ヒト動物を上述の特徴を全て有するように新しく作出する。

本発明の他の実施形態においては、本発明のマウスを交雑によって作出する。例えば、特定のクラスターの遺伝子の一部が欠失した部分欠失体を他の部分欠失体と交雑させて、特定のクラスター内の遺伝子機能が全て欠失した動物を作出することができるであろう。

ヒトＣＡＲに関するトランスジェニックマウスを作出したが、それについてはＷＯ２００６／０６４１９７及びＷＯ２００８／１４９０８０の実施例に記載されている。ＣＡＲヒト化マウス及びノックアウトマウスにおける薬物代謝経路の誘導についての詳細な検討を行った。種々の実験的アプローチによって、ＣＡＲに関してヒト化した（或いは、如何なるＣＡＲも発現しない（ノックアウト））非ヒトトランスジェニック動物が、本明細書に記載の方法及び戦略を用いて容易に得られることが確認された。

また、ヒトＰＸＲに関するトランスジェニックマウスも作出したが、それについてもＷＯ２００６／０６４１９７及びＷＯ２００８／１４９０８０の実施例に記載されている。ヒトＰＸＲは、予想されたように、内在性マウス遺伝子と等価なレベルでマウスの肝臓及びＧＩ管の両方で発現することが分かる。こうして、この種の従来技術が直面する典型的な問題（過剰発現や低発現等）が回避される。このようなモデルにおいては、この経路による遺伝子発現を誘導することが知られている化合物（リファンピシンやデキサメタゾン等）にマウスが応答するため、ＰＸＲタンパク質が機能的であることも示されている。野生型とヒト化マウスとの系統差が示された。例えば、ヒト化マウスは、ｈＰＸＲに対する活性が高いことが知られている化合物（リファンピシン等）に対して高い応答性を示す。このように、ヒト化ＰＸＲ動物においては、野生型に比べてリファンピシンに対する感受性が変化したことが分かる。

また、野生型マウスとヒト化ＰＸＲマウスとの間には、テストステロンの１６−β−ヒドロキシル化及び７−ベンジルオキシキノリンの脱ベンジル化から得られたバックグラウンドＰ４５０酵素活性について、一方が他方より明らかに高い活性が見られた。

本発明に係るトランスジェニック動物（マウス等）及び細胞は、上述の及び本明細書の実施例に記載の機能特性を示すのが好ましい。例えば、このような細胞及び動物は、リファンピシンに応じたＣｙｐ２ｂ１０活性の誘導を示さないのが好ましい。しかし、このような細胞及び動物は、リファンピシンだけでなくＴＣＰＯＢＯＰにも応じてＣｙｐ３ａ１１に対する誘導作用を示す。

また、ヒトＰＸＲ及びヒトＣＡＲの両方に関するトランスジェニックマウスも作出したが、それについては本明細書の実施例にて説明する。これらの転写因子の組合せの活性について予備研究を行ったが、この活性はバルビツール酸塩誘導睡眠時間を測定することによって求めた。長年、睡眠時間は肝シトクロムＰ４５０活性に正比例することが知られており、この活性は、ＣＡＲ及びＰＸＲの機能によって決まる肝臓内のＰ４５０レベルに少なくとも一部起因し得る。麻酔量のペントバルビトンを投与した野生型マウスの睡眠時間は２１分間であったが、ＣＡＲ及びＰＸＲに関して二重ヒト化したマウスの睡眠時間は３４分間であった。従って、二重ヒト化マウスは野生型対照に対して有意差を示したが、この結果から、二重ヒト化マウスは野生型動物に比べて薬物に対する応答が顕著に異なることが分かる。

ＰＸＲ及びＣＡＲの二重ヒト化マウス及び二重ノックアウトマウスにおける薬物代謝経路の誘導についての詳細な検討を行った。種々の実験的アプローチによって、ＰＸＲ及びＣＡＲの両方に関してヒト化した（或いは、如何なるＰＸＲもＣＡＲも発現しない（二重ノックアウト））非ヒトトランスジェニック動物が、本明細書に記載の方法及び戦略を用いて容易に得られることが確認された。

本明細書に記載の結果を考慮すれば、ＰＰＡＲαに関してもトランスジェニックな動物の作出を妨げる技術的な障壁は無い。関連する構築物は既に作出され、本明細書に記載されている。ＰＰＡＲα及びＡｈ受容体のノックイン（ヒト化）及びノックアウトに適したターゲティング戦略については本明細書により詳細に記載する（図４及び５参照）。本明細書を書いている時点で、ＣＡＲ及びＰＰＡＲαに関してホモ接合性であると共にＰＸＲに関してヘテロ接合性のマウスが作出されたが、間もなく三重ホモ接合性マウスも得られ得るであろう。また、ヒト化ＰＸＲ、ＣＡＲ及びＡｈＲに関してホモ接合性のマウスは既に得られており、それについては本明細書の実施例にて説明する。

最終的には、本発明の動物モデルをバックグラウンドとして用い、げっ歯類酵素の機能に取って代わり得るヒト遺伝子を同一の染色体領域に直接組込む（即ち、内在性遺伝子の置換）か、又は他の部位に組込むことによって該遺伝子の導入を行うことができる。ヒト遺伝子を同一の染色体領域に組込むのが好ましいが、これは、染色体の完全性が保持されるため、発現や組織分布の生理学的パターンが同様に保持される可能性が高いからである。

従って、上述の細胞や動物の調製に関する本発明の実施形態においては、該細胞や動物を更なる遺伝子組換えに付すことができるが、該遺伝子組換えは更なる遺伝子又はタンパク質コード核酸配列の導入である。該遺伝子組換えは、細胞又は細胞株の一過性又は安定トランスフェクション、細胞又は細胞株におけるエピソーム発現系、又は、前核マイクロインジェクションや非胚性幹（ＥＳ）細胞における組換えイベント、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞におけるランダムな遺伝子組換え、又は核移植クローニング手続きにおいてドナー核として用いる核を有する細胞のトランスフェクションによるトランスジェニック非ヒト動物の調製であり得る。

特に、本発明に係る動物は、一以上のヒト遺伝子（例えば、薬物輸送体や転写因子、第Ｉ相薬物代謝酵素、第ＩＩ相薬物代謝酵素等）に関してヒト化され得ることが予想される。

例えば、このような動物は、第１相薬物代謝酵素（即ち、Ｐ４５０酵素）に関してヒト化することができる。Ｐ４５０酵素の好ましい例としては、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ８及びＣＹＰ２Ｂ６の１種、２種、３種又はそれ以上が挙げられる。動物は遺伝子クラスター全体（例えば、ＣＹＰ３Ａクラスター、ＣＹＰ２Ｄクラスター及び／又はＣＹＰ２Ｃクラスター）に関してヒト化することができる。

また、本発明に係る動物を第２相薬物代謝酵素に関してヒト化することもできる。このような酵素の例としては、グルクロニルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ１Ａ遺伝子又は遺伝子クラスター）やグルタチオントランスフェラーゼ（例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）（ＧＳＴ−ｍ１及び／又はｔ１クラスターを含む））、スルホニルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼが挙げられる。

また、ＷＯ２００６／０６４１９７に記載のように、内在性等価マウス遺伝子が無効化されたものも好ましい。薬物代謝酵素遺伝子の場合、遺伝子間の等価性（equivalence）は、基質特異性、調節様式（例えば、転写因子や外因性薬物による）、配列相同性及び組織分布の組合せによって評価することができる。正確に等価な遺伝子もあり、そのような遺伝子の例としては、ＣＹＰ２Ｅ１やＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２が挙げられる。ＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｄは、ヒトには１種類の遺伝子しか存在しないが、マウスには多数の等価な遺伝子が存在する例である。ヒトには４種類のＣＹＰ２Ｃ遺伝子が存在し、マウスには多数の等価な遺伝子が存在する。このような状況で、好ましくは、等価なマウス遺伝子の少なくとも１種、より好ましくは２種、３種、４種、５種以上、或いはその全てを無効化する。ＣＹＰ３Ａ４はマウスにおいて明らかなオルソログが存在しない例であるが、Ｃｙｐ３ａ１１は、その肝発現、調節様式及び配列相同性から、少なくとも１種の等価なマウス遺伝子と考えることができる。

また、本発明に係る動物を薬物輸送タンパク質に関してヒト化することもできるが、その例としては、多剤耐性タンパク質（例えば、ｍｄｒ１やｍｄｒ３）や多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）（例えば、ＭＲＰ１及び／又はＭＲＰ２及び／又はＭＲＰ６）、有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）由来のものが挙げられる。また、内在性等価マウス遺伝子が無効化されたものも好ましい。

本発明の他の様相は、本発明の上述のいずれか一様相における特性を有するように改変された細胞に関する。本発明に係る好ましい細胞型は肝細胞及び神経細胞である。該細胞は、げっ歯類細胞（特にマウス細胞）であり得る。

本発明のこの様相における細胞は、本発明の知見を十分体得した当業者には明らかなように、本発明に係るトランスジェニックマウスから標準的な技法を用いて作出することができる。好適な方法は多くの標準的な実験マニュアル、例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Third Edition (2000); Ausubel et al., 1991 [supra]; Spector, Goldman & Leinwald, 1998）に記載されている。

このような細胞を作出する好ましい一方法は、上述のようにヒト化マウスをＳＶ４０不死化マウス（例えば、不死マウス（タコニック））と交雑させることである。次に、当該技術分野でよく知られた技法によってこのような動物から細胞を単離することができる。肝臓でのみ活性であるため肝細胞しか産生することができないアルブミンプロモーターを用いる先行技術のトランスジェニック系とは対照的に、本発明において作出されるトランスジェニック動物由来の細胞は、薬物動態解析にかなり重要な細胞（例えば、肝細胞や神経細胞）等の種々の細胞型から選択することができる。

上述の特性を有する、本発明に係るトランスジェニック動物から単離された幹細胞も本発明の有用な様相である。このような細胞は多能性であってもよく、部分的に分化していてもよい。幹細胞は成体幹細胞であってもよく、胚性幹細胞であってもよい。より一般には、用いる幹細胞は後胚発達段階（例えば、胎生期や新生期、幼若期、成体期）で得られることができる。このように単離された幹細胞を用いて特定の細胞型（例えば、肝細胞や神経細胞）を作出することができる。このような細胞も本発明の一様相を構成する。

本発明の方法によって作出した細胞又は動物をモデル系として用いて、他の生体（特にヒト）における薬物や他の生体異物化合物の代謝を確認することができる。

本発明の更なる様相においては、本発明に係るアッセイは、ヒトにおける安全性に関して非遺伝毒性発癌物質をスクリーニングするための方法であって、非ヒト動物を非遺伝毒性発癌物質に曝露することと、生理学的作用をモニターすることとを含む方法において、該動物はＰＸＲ、ＣＡＲ及びＰＰＡＲαから成る群、又はＰＸＲ、ＣＡＲ、ＡｈＲ及びＰＰＡＲαから成る群から選択される少なくとも２種の核内転写因子に関してヒト化され、その内在性等価遺伝子は機能しないようにされている方法を用いる。上で詳述した本発明の条件に従い、該動物は、ＰＸＲ及びＣＡＲ、ＰＸＲ及びＰＰＡＲα、ＣＡＲ及びＰＰＡＲα、ＰＸＲ及びＡＨＲ、ＰＰＡＲα及びＡＨＲ、ＣＡＲ及びＡＨＲ、又はこれらの核内受容体の３種又は４種全て（例えば、ＰＸＲ、ＣＡＲ及びＰＰＡＲα、又はＰＸＲ、ＣＡＲ及びＡｈＲ）に関してヒト化することができる。

本発明に係るアッセイは、上述の動物よりも幅広い種類の動物に対して実施することができる。本発明者らの知る限り、この開示の前には、ヒトにおける安全使用について非遺伝毒性発癌物質をスクリーニングするために核内転写因子に関して二重ヒト化したマウスを用いる概念は提案されていない。このような二重ヒト化モデルは、単一遺伝子（ＰＸＲ又はＣＡＲの一方）のみを組み込んでいるモデルに比べて有利であるが、それは、多くの薬物代謝酵素や薬物輸送体が、ＣＡＲ及びＰＸＲの両方の結合に応答する要素を有するからである。また、ＰＸＲ応答性要素の数はＣＡＲ応答性要素の数と異なることが多いため、両方の転写因子による調節が一般に重要である。従って、両方の因子の作用を考慮したモデルは好ましく、インビボでの生理学的状態をより詳細に反映する。ヒトＰＸＲ及びヒトＣＡＲの両方に関するトランスジェニックマウスを作出したが、それについては本明細書の実施例にて説明する。種々の実験的アプローチによって、ＰＸＲ及びＣＡＲの両方に関してヒト化した（或いは、如何なるＰＸＲもＣＡＲも発現しない（二重ノックアウト））非ヒトトランスジェニック動物が、本明細書に記載の方法及び戦略を用いて容易に得られることが確認された。マウスモデルはヒト化遺伝子についてホモ接合性であるのが好ましい。

本発明の動物、組織及び細胞を用いて、薬物化合物がどのように代謝されるか確認することができる。上述の本発明の様相に係る動物株の作出によって、ヒトにおける薬物応答や化学応答を決める因子、更にはこのような遺伝子と化学毒性の関連性についての我々の理解が顕著に増すであろう。このようなモデルは、有効性スクリーニングやＰＫ／ＰＤモデリング、薬物の安全性試験に適用することができる。

動物における表現型の変化（例えば、生理学的作用）を測定することができる。このような生理学的作用としては、例えば、病態（胆管壊死等）や中毒性副作用を挙げることができる。好ましい表現型の変化としては、過形成、肝腫、Ｐ４５０誘導及び／又は肝細胞増殖が挙げられる。

薬物化合物の代謝速度を調べることができる。この代謝速度は、該化合物の投与によって仲介される毒性や活性を測定するか、該化合物の半減期を測定するか、又は転写因子や薬物代謝酵素のレベルを測定することによって求めることができる。例えば、該化合物の代謝速度は、酸化生成物の生成速度や酸化中間体から次に産生される生成物の生成速度として測定することができる。或いは、この代謝速度は、最初の化合物の半減期や消失速度として、又は最初の化合物や最初の化合物から産生される代謝物の毒性や活性の変化として表わすことができる。半減期は、種々の時点で採取したサンプルに存在する薬物化合物の量を求めることによって測定することができる。薬物化合物の量は、標準的な方法（例えば、高速液体クロマトグラフィーや質量分析、化合物特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析、他の適切な方法）によって測定することができる。

また、薬物化合物が特定の状況下で毒性代謝物や発癌性代謝物に代謝されるかどうかを、例えば、該化合物の組織やタンパク質、ＤＮＡへの共有結合を測定するか、又はグルタチオンの欠乏を測定することによって調べることもできる。

上述の種類の測定は、薬物化合物投与後、１を越える時点、３時点、５時点又は１０以上の時点で行うのが好ましい。

従って、本発明の更なる様相は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の活性や発現レベルに対する薬物化合物の作用を確認するために提供されるスクリーニング方法に関する。このような方法は、本発明の上述のいずれか一様相におけるトランスジェニック動物、又は該動物由来の組織又は細胞に薬物化合物を投与することを含む。

スクリーニング段階は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質をコードする遺伝子の誘導を測定することを含み得る。また、スクリーニング段階は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現のレベル、又はこのような発現の持続期間を測定することを含み得る。また、スクリーニング段階は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現の分布を測定することを含み得る。

薬物化合物の存在下及び非存在下でアッセイを行って、分布や代謝、毒性の差を確認することができる。種々のトランスジェニック動物や細胞、組織に対する薬物化合物の作用を評価することによって、特定の遺伝子の存在下及び非存在下における薬物化合物の作用を確認することができる。

従って、更なる様相において、本発明は、本明細書に記載の生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、本明細書に記載の非ヒト動物、組織又は細胞の２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上又は１０種以上に対して薬物化合物を投与することを含む方法を提供する。このような方法は、種々の非ヒト動物、組織又は細胞に関して得られた実験結果を比較する段階を更に含むのが好ましい。

一を超える薬物化合物を投与することができる。例えば、ある薬物化合物がＣＡＲ遺伝子の誘導を仲介する場合、該化合物はＣＡＲ転写因子を活性化すると考えられる。また、対照としてのヒトＣＡＲ受容体を発現する動物にＣＡＲ受容体インバースアゴニスト（例えば、クロトリマゾール）を投与することもできる。

本発明の更なる様相におけるアッセイによって、第１の薬物化合物の代謝が第２の薬物化合物で調節されるかどうか確認するためのスクリーニング方法を提供することができる。この方法は、第２の化合物の存在下及び非存在下で第１の化合物を本発明の上述のいずれか一様相におけるトランスジェニック動物、又は該動物由来の組織又は細胞に投与することと、表現型効果をモニターすることとを含む。或いは、上述のように、スクリーニング段階は、遺伝子の誘導、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現のレベルや持続期間、分布を測定することを含み得る。第２の化合物がこれらの試験因子のいずれか一因子の変化をもたらす場合、第２の化合物は第１の化合物の代謝を調節することが確認される。例えば、第１の化合物の投与によって仲介される毒性や活性を測定するか、又は第１の薬物化合物の半減期を測定することによって生理学的作用をアッセイすることができる。

このように、特定のタンパク質の発現を活性化又は誘導する能力が低いか又は検出できないために、副作用が少ないか又はインビボでの半減期が長いことが期待される薬物化合物の類似体を、アッセイを用いて容易に同定することができる。

以下、本発明の種々の様相や実施形態を実施例によって更に詳細に説明する。本発明の範囲を逸脱することなく詳細な変更を実施し得ることは理解されよう。

図１は、細胞内の代謝経路における核内受容体の役割を示す。 図２は、非遺伝毒性発癌物質の代謝におけるＰＸＲ／ＣＡＲの役割を示す。 図３は、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ二重ヒト化マウス、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＰＸＲ及びＣＡＲｍＲＮＡのレベルを示す。二重ヒト化マウスではヒトＰＸＲ及びＣＡＲｍＲＮＡの発現が維持される。 図４は、二重ヒト化ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるリファンピシン及びフェノバルビタール処理の作用を示すと共に、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａ１１タンパク質の基礎レベルを示す。 図５は、マウスにおけるＰＰＡＲαヒト化及びノックアウト（遺伝子型ｈｕＰＰＡＲα及びｋｏＰＰＡＲαのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。 図６は、マウスにおけるＡｈＲヒト化及びノックアウト（遺伝子型ｈｕＡｈＲ及びｋｏＡｈＲのマウスの作出）のための可能なターゲティング戦略を示す。 図７は、ヒト化マウス、ノックアウトマウス及び野生型マウスをＰＢ処理に曝露する実験の結果を示す。モニターする生理学的作用としては、肝腫、Ｐ４５０誘導及び肝細胞増殖が挙げられる。 図８は、ＷＴマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス及びＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスにおける肝臓／身体重量比を示す。値は平均±ＳＤ（％平均自身対照（mean own control）±％ＳＤ）（ｎ＝３）で表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定（両側）を行った（＊及び＊＊はそれぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１で対照マウスとは統計的に有意差があることを示す）。 図９は、ＰＢ処理マウスにおける肝臓Ｓ期標識指数を示す。ＢｒｄＵ（１５ｍｇ／ｍＬ／ＰＢＳ）を含有する浸透圧ポンプをＷＴマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス及びＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスに埋め込んだ後、ＰＢ処理を行った（８０ｍｇ／ｋｇ／４日／ＩＰ）。Ｂｒｄｕ抗体（ダコ）を用いて肝臓切片を標識した。顕微鏡像は全て×４０の倍率で得た。データは、Ｐａｔ−００１３−００１４に従い、細胞（約１８万個）／マウス群を含む葉（２）当り１０個の像のランダムサンプリングを表す。値は平均±ＳＤ（ｎ＝９〜１０（対照マウス）、ｎ＝８〜９（ＰＢ処理マウス））で表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定（両側）を行った（＊＊＊はｐ＜０．０１で対照マウスとは統計的に有意差があることを示す）。 図１０は、ＰＢ処理マウスにおける肝アポトーシス指数を示す。ＴＵＮＥＬｉｎ ｓｉｔｕ細胞検出キット（ロシュ）を用いて肝臓切片を標識した。顕微鏡像は全て×４０の倍率で得た。データは、細胞（約３８万個）／マウス群を含む葉（２）当り２０個の像のランダムサンプリングを表す。値は平均±ＳＤ（ｎ＝９〜１０（対照マウス）、ｎ＝８〜９（ＰＢ処理マウス））で表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定（両側）を行ったが、統計的な有意差は見出されなかった。 図１１は、対照マウス、及びＰＢで処理したＷＴマウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス及びＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスから得た肝臓切片に対するＨ＆Ｅ染色を示す。門脈（Ｐ）及び中心静脈（Ｃ）を標識する。×２０の対物レンズを用いて像を得た。 図１２は、ａ）ＭＲＯＤアッセイ、ｂ）ＥＲＯＤアッセイ、ｃ）ＢＱアッセイ、ｄ）ＰＲＯＤアッセイ及びｅ）ＢＲＯＤアッセイによる酵素活性測定値を示す。各アッセイは、個々の肝ミクロソームに対して行った。値は平均±ＳＤ（ｎ＝９／１０）で表す。結果についてＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定（両側）を行った（＊、＊＊及び＊＊＊はそれぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ０．００１で自身対照マウスとは統計的な差がある）。 図１３は、肝臓Ｃｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａ１１タンパク質の発現に対するＰＢの作用を示す。野生型マウス、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス及びＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスの各々から得た肝ミクロソーム（０．３ｕｇ）をプールし（ｎ＝９／１０）、Ｃｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａ１１に関する特徴付けにはそれぞれ、ウサギポリクローナルＣＨ４（１：２０００希釈）及びＣＨ３２抗体（１：２０００希釈）（C. Henderson, University of Dundee, UK）を用いたイムノブロッティングを行った。＋ｖｅ（対照）としては、精製組換えｈｉｓタグＣｙｐ３ａ１１膜（０．１ｐｍｏｌ／ｕ．Ｌ）又は精製組換えｈｉｓタグＣｙｐ２ｂ１０膜（０．０１ｐｍｏｌ／ｕ．Ｌ）を用いた。ブロットはＥＣＬを用いて展開し、３０秒間曝露した。 図１４は、フェノバルビタールに対する過形成応答におけるＰＸＲ／ＣＡＲ依存的種差を示す。 図１５は、クロルデンに対する過形成応答におけるＰＸＲ／ＣＡＲ依存的種差を示す。 図１６は、対照マウス、及びクロルデンで処理したＷＴマウス、ｈＰＸＲ＿ｏｌｄ／ｈＣＡＲマウス及びＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスから得た肝臓切片に対するＨ＆Ｅ染色を示す。×２０の対物レンズを用いて像を得た。この図から、クロルデンへ曝露した際にＷＴマウス及びｈＰＸＲ＿ｏｌｄ／ｈＣＡＲマウスでは肥大が生じるが、ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスでは生じないことが分かる。 図１７は、イムノブロッティングによるマウスＣｙｐ４ａタンパク質の検出を示す。ａ）媒体処理マウス、Ｗｙ−１４，６４３処理ＷＴマウス、及びｈＰＰＡＲαマウスから得た個々の肝ミクロソーム（１μｇタンパク質ロード）のＣｙｐ４ａに関する特徴付けには、ポリクローナルヤギ抗ＣＹＰ４Ａ抗体（Dr. C. Henderson, University of Dundee, UK）を用いたイムノブロッティングを行った。標準物質にはＡＰＦＯ誘導ＷＴラット肝ミクロソーム（１μｇタンパク質ロード）を用いた。 図１８は、ＷＴマウス及びｈＰＰＡＲαマウスにおけるシアン化物非感受性ｐＣｏＡ酸化を示す。粗ミトコンドリア画分におけるシアン化物非感受性ｐＣｏＡ酸化の測定は記載のように行った。値は、個々のマウスから得た還元ＮＡＤ＋（ｐｍｏｌ／分／ｍｇ）を表す（ｈＰＰＡＲａ＝ｈＰＰＡＲα、Ｗｙ＝Ｗｙ−１４，６４３処理、Ｃｏｎ＝媒体処理）。 図１９は、ＷＴマウス及びｈＰＰＡＲαマウスにおけるラウリン酸ヒドロキシル化を示す。ラウリン酸ヒドロキシル化活性の測定は肝ミクロソームにおいて行った。値は、個々のマウスにおける（ａ）１２−ＯＨラウリン酸又は（ｂ）１１−ＯＨラウリン酸の生成値（ｍｍｏｌ／分／ｍｇ）を表す（ｈＰＰＡＲα＝ｈＰＰＡＲα、Ｗｙ＝Ｗｙ−１４，６４３処理、Ｃｏｎ＝媒体処理）。 図２０は、ｈＰＰＡＲαｍＲＮＡの構造とプライマーの位置を示す（Ｍ：マウスエクソン、Ｈ：ヒトエクソン、ｐＡ：ポリＡモチーフ）。 図２１は、ＲＴ−ＰＣＲによるｈＰＰＡＲαマウスにおけるヒトＰＰＡＲαの存在を示す。媒体処理ＷＴマウスと媒体処理ｈＰＰＡＲαマウスから肝ＲＮＡを単離し、プライマー対ＰＰＡＲα−Ｆ及びＰＰＡＲα−Ｒを用いたＲＴ−ＰＣＲによって解析した。ＷＴマウス由来のＲＴ−ＰＣＲ産物を１個のウェル内にロードし（レーン１）、ｈＰＰＡＲαマウス由来のＲＴ−ＰＣＲ産物を２個のウェル内にロードした（レーン２〜３）。ｈＰＰＡＲαマウスにおいては１．４ｋｂと１．２ｋｂに２種のバンドが検出された（Ｍ＝分子量マーカー、Ｎ．Ｂ．各サンプルにおける低いバンドは非特異的である）。 図２２は、ｈＰＰＡＲαマウスにおいて検出されたヒトＰＰＡＲαの野生型転写物、スプライスバリアント１（ＳＶ１）転写物及びスプライスバリアント２（ＳＶ２）転写物を示す。ＳＶ１は、エクソン６が欠失してフレームシフトが中途終止コドンを導入した転写物である。ＳＶ２は、選択的イントロン３’スプライス部位を用いることによってエクソン５の３’末端に４ｂｐ（ＧＴＡＧ）のアウト・オブ・フレーム挿入が付加され、中途終止コドンとなった転写物である。 図２３は、ヒトＰＰＡＲαタンパク質の報告された全長、スプライスバリアント１（ＳＶ１）及びスプライスバリアント２（ＳＶ２）を示す。選択的にスプライスされたバリアントＳＶ１及びＳＶ２はそれぞれ、１７４個のアミノ酸及び１８０個のアミノ酸を含む切断型ＰＰＡＲαタンパク質をコードする。切断はリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）内で生じる。両方の切断型タンパク質においてＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は変化しないままである。 図２４は、三重ホモ接合ＰＸＲ／ＣＡＲ／ＡｈＲヒト化マウスのＰＣＲ確認を示す。ＩＤがｆ２４１９９８、ｆ２４２００１及びｆ２４２００４のマウスは、ＰＸＲ、ＣＡＲ及びＡＨＲに関して三重ホモ接合ヒト化されている。 図２５は、二重ホモ接合ＣＡＲ／ＰＰＡＲα及びヘテロ接合ＰＸＲヒト化マウスのＰＣＲ確認を示す。ＩＤがｍ２４５２１８、ｆ２４５２２１、ｆ２４５２２６及びｆ２４５２２７のマウスは、ＣＡＲに関してホモ接合ヒト化され、ＰＸＲに関してヘテロ接合ヒト化されている。 図２６は、ＣＡＲノックアウトマウスの肝臓又は小腸においてＣＡＲｍＲＮＡが発現されないことを示す。 図２７は、ＣＡＲ機能をモニターする方法を示すと共に、各方法の種特異性を示す。 図２８は、ＴＣＰＯＢＯＰ（マウスにおいて最も活性が高い）を用いて測定したＣＡＲノックアウトマウスにおけるＣＡＲ機能の喪失を示す。 図２９は、ＣＩＴＣＯ（ヒトにおいて最も活性が高い）を用いて測定したＣＡＲノックアウトマウスにおけるＣＡＲ機能の喪失を示す。 図３０は、ＣＡＲヒト化マウスにおけるＣＡＲｍＲＮＡの発現を示す。ＣＡＲヒト化マウスにおいては、マウスＣＡＲ転写物は発現されるが、ヒトＣＡＲ転写物は発現されない。ＣＡＲヒト化マウスにおいては、ＣＡＲの全長及び全てのヒトスプライスバリアントが発現される。 図３１は、ヒトＣＡＲの他のスプライシングパターンを示す。２種のリガンド結合ドメインアイソフォームは新しい機能特性を示す。ＳＶ３は異なってトランス活性化された標的遺伝子プロモーターを有し、ＳＶ２はコアクチベーターとの構成的相互作用ではなくリガンド依存性を示す。選択的スプライシングはＣＡＲの発現及び機能の調節には非常に重要であると思われる。 図３２は、野生型マウス及びＣＡＲヒト化マウスにおけるＴＣＰＯＢＯＰ（マウスにおいて最も活性が高い）によるマウスＣＡＲ依存的Ｐ４５０誘導を示す。 図３３は、野生型マウス及びＣＡＲヒト化マウスにおけるＴＣＰＯＢＯＰ（ヒトにおいて最も活性が高い）によるヒトＣＡＲ依存的Ｐ４５０誘導を示す。 図３４は、野生型マウスに比べて正常な血漿臨床化学を有するＣＡＲノックアウトマウス及びＣＡＲヒト化マウスを示す。 図３５は、ＰＸＲ／ＣＡＲノックアウト及びヒト化マウスのパネルにおけるフェノバルビタールの誘導作用を示す。フェノバルビタールはインビトロではＰＸＲアクチベーターとして説明されているが、インビボでのＣｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ２ｂ１０のフェノバルビタール介在活性化は主にＣＡＲ依存的である。 図３６は、ヒトＣＡＲがフェノバルビタールに対する過形成応答ではなく、肥大応答を支持することを示す。Ａ）ＢｒＤｕ肝細胞標識、Ｂ）肝臓切片についてのＨ＆Ｅ解析。これによって、非遺伝毒性げっ歯類肝成長発癌物質のヒトに対する真の危険性を評価する上でのヒト化及びノックアウトＰＸＲ／ＣＡＲマウスの有用性が強調される。

実施例
ヌルバックグラウンド上でＰＸＲ及びＣＡＲの両方に関してヒト化したマウスを作出するのに適した技法の説明はＷＯ２００６／０６４１９７に見出すことができる（実施例３及び４と対応する図面参照）。

実施例１：二重ホモ接合ＰＸＲ／ＣＡＲヒト化マウスにおいてマウスＰＸＲ遺伝子がヒトカウンターパートと交換されたことのＰＣＲ確認
ＰＸＲ及びＣＡＲに関してヒト化したマウス（「ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ」）の作出の際には、ヒト化ＰＸＲを含むマウスを用い、このマウスをヒト化ＣＡＲを含むマウスと交雑し、ヒト化ＰＸＲ及びヒト化ＣＡＲの両方を含むマウスを作出した。該マウスは目視検査の結果、表現型が正常である。ＰＣＲを用いて該マウスをタイピングした（ＷＯ２００６／０６４１９７の図２８参照）が、ＰＸＲ及びＣＡＲに関してホモ接合的にヒト化されている。その例としては、「４２７４９」及び「４２７５２」と称されるマウスが挙げられる。

ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいてＰＸＲｍＲＮＡ及びＣＡＲｍＲＮＡの転写はＲＴ−ＰＣＲによって定量し、野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスにおける対応するｍＲＮＡ発現の相対レベルと比較した（図２）。これによって、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスは、単一遺伝子に関してヒト化したマウスで見られるヒトＰＸＲ及びヒトＣＡＲの発現のレベルを維持することが確認された。

野生型マウス、ｈｕＰＸＲマウス及びｈｕＣＡＲマウスと同様に、二重ヒト化ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスを誘導剤リファンピシン及び／又はフェノバルビタールで処理した。これらの誘導剤処理マウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａ１１の発現は、対応する非処理マウスと同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くウェスタンブロッティングによって可視化し、比較した（図３）。図３においては、ｈｕＰＸＲマウス、ｈｕＣＡＲマウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０とＣｙｐ３ａ１１の基礎レベルを、野生型マウスで見られる基礎レベルと比較する。この相対的定量から、基礎Ｃｙｐ２ｂ１０レベルは、ｈｕＰＸＲ→ｈｕＣＡＲ→ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲの順で増加することが分かる。しかし、基礎Ｃｙｐ３ａ１１レベルはｈｕＣＡＲマウスではあまり顕著に増加しなかった。Ｃｙｐ３ａ１１レベルはｈｕＰＸＲマウス及び二重ヒト化ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスの両方においてほぼ同程度（２倍超）に増加した。

ヒト特異的誘導剤リファンピシンによる処理によって、全てのマウスでＣｙｐ３ａ１１のレベルが増加した。リファンピシンとフェノバルビタールを併用投与した場合、野生型マウスでは付加的作用は見られなかったが、ｈｕＰＸＲマウスではＣｙｐ３ａ１１が多少強く誘導された。

実施例２：二重ホモ接合ＰＸＲ／ＣＡＲヒト化マウスにおけるペントバルビトン睡眠試験
この実験においては、バルビツール酸塩誘導睡眠時間を測定することによってこれらの転写因子の組合せの活性を求めた。長年、睡眠時間は肝シトクロムＰ４５０活性に正比例することが知られており、この活性は、ＣＡＲ及びＰＸＲの機能によって決まる肝臓内のＰ４５０レベルに少なくとも一部起因し得る。

マウスに対して、ナルコレン（ペントバルビトンナトリウム；ドイツ、メリアル社で販売、獣医コンサルタント経由で購入）を腹腔内単回投与した（２５ｍｇ／ｋｇ体重）。マウスが正向反射を消失した後、回復するまでの時間を測定した。結果は下の表１に示す。

麻酔量のペントバルビトンを投与した野生型マウスの睡眠時間は２１分間であったが、ＣＡＲ及びＰＸＲに関する二重ヒト化マウスの睡眠時間は３４分間であった。従って、二重ヒト化マウスは野生型対照に対して有意差を示したが、この結果から、二重ヒト化マウスは野生型マウスに比べて薬物に対する応答が顕著に異なることが分かる。

上述の実施例１及び２における研究の概要
ヒトＰＸＲが内在性遺伝子と等価なレベルで予測通りにマウスの肝臓及びＧＩ管の両方において発現するモデルを開発した。この経路によって遺伝子発現を誘導することが知られている化合物にマウスが応答するため、ＰＸＲタンパク質は機能的であることが示された。

また、ＣＡＲ遺伝子に関して等価なヒト化も成された（ｈｕＣＡＲマウス）。野生型マウスとヒト化マウスとの系統差が示され、ヒト化マウスは、マウスよりもヒトにおいて高い活性を示す（即ち、マウスＰＸＲやマウスＣＡＲよりもヒトＰＸＲやヒトＣＡＲに対する活性の高い）ことが知られている化合物に対する応答性が高いことが示された。ノックアウト株の構築はＰＸＲ遺伝子及びＣＡＲ遺伝子の両方についても確認された（ｋｏＰＸＲ及びｋｏＣＡＲ）。

更に、ヒト化ＰＸＲを含んだマウスをヒト化ＣＡＲを含んだマウスと交雑させて、ヒト化ＰＸＲ及びヒト化ＣＡＲの両方を含むマウスを作出した。

実施例３：ｈｕＰＰＡＲα及びｋｏＰＰＡＲα
図４に示すように、ヒトＰＰＡＲαをコードするＤＮＡ配列をマウスＰＰＡＲα遺伝子座に挿入して、マウスＰＰＡＲαプロモーターの制御下でヒトＰＰＡＲαを発現させることができる。ヒトＰＰＡＲαをコードするＤＮＡ配列は、ヒトＰＰＡＲα遺伝子のイントロン５及びイントロン６の少なくとも一部を含む（図４）。ターゲティングベクターは、Ｃｒｅ介在ＰＰＡＲαノックアウトによってｋｏＰＰＡＲαの産生を可能とする配列要素を含む（図４）。

実施例４：ｈｕＰＰＡＲα及びｋｏＰＰＡＲαヒト化マウスの特徴付け
６匹の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをハーラン（英国）から入手した。タコニック・アルテミス（ドイツ）により本明細書に記載のプロトコルに従って３匹の雄性ホモ接合ｈＰＰＡＲαマウスを作出した。マウスは全て性的に成熟していた。ＭＳＲＵに到着時には、マウスは底の硬いポリプロピレンケージ内のおがくず上に収容されていた。処理時には環境性を高める材料は用いなかった。

動物飼育室においては、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス株及びトランスジェニックマウス株に適した条件がもたらされるように環境を管理した。温度は１９〜２３℃の範囲内に維持し、相対湿度は４０〜７０％の範囲内に維持した。計画通りに１時間当り１４〜１５回換気を行った。１２時間の点灯と１２時間の消灯とを繰り返した。この研究においては、特別なケージ構成は用いなかった。試験施設に到着後最低５日間はマウスを環境に慣れさせた。

ＲＭ１ペレット飼料（スペシャルダイエットサービスリミテッド（英国エセックス州、ウィザム、ステップフィールド）より供給）を用いた。飼料の仕様はＭＳＲＵ（ダンディー）が保持する。飲料水は現地で調達し、ボトルで提供した。ペレット飼料と飲料水は研究前及び研究中に自由に与えた。

体重及び肝臓重量
表２に示すように、マウスの処理はＷｙ−１４，６４３／コーン油（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与）の４日間投与又はコーン油のみの投与によって行った。最終投与から約２４時間後、ＣＯ₂濃度を上昇させて全てのマウスを殺した。肝臓及び血漿を採取して解析を行った。

Ｗｙ−１４，６４３又は媒体（コーン油）で処理した後、マウスを殺し、肝臓を除去して計量した。全てのマウスの体重、肝臓重量及び肝臓／身体重量比を算出した（表３〜５）。

投与溶液の調製は投与日に行い、必要量の誘導剤にコーン油を添加し撹拌して微細懸濁液（fine suspension）を得た。誘導剤の濃度は供給化学物質のものとし、純度の補正は行わなかった。表２に示すように、媒体又は誘導剤をマウスに経口投与した。投与量は１０ｍＬ／ｋｇ体重であった。この投与経路は、既に公表された研究と一致するように選択した。

終了日にマウスを計量し、体重を記録した後、検視に適した部屋へ移された。処理から約２４時間後、濃度を上昇させたＣＯ₂にマウスを曝露して殺す。

媒体処理ＷＴマウスとｈＰＰＡＲαマウスとの間で絶対肝臓重量及び相対肝臓重量は同等であり、Ｗｙ−１４，６４３による処理の後、両方の株において有意な増加が検出された。Ｗｙ−１４，６４３による処理後の絶対肝臓重量に関しては、媒体処理マウスと比べて、ＷＴマウスでは〜３９％増加し、２匹のトランスジェニックマウスでは２０％及び２９％増加した。

血漿臨床化学
死亡したマウスから心穿刺によって血液をリチウム／ヘパリンコートチューブ内に採取して血漿を処理した。血漿調製に適したチューブ内に取り除いた後、心穿刺によって得た最終血液サンプルをローラーにて１０分間混合した後、氷上で冷却した。遠心分離（２０００〜３０００ｒｐｍ、１０分間、８〜１０℃）によって赤血球を除去した。遠心分離直後に上清（血漿）をエッペンドルフに採取し、湿氷上で維持した。血漿を臨床化学用のクライオバイアル内に移し、直ちに液体窒素にて急速冷凍した後、約−７０℃で保存した。

COBAS Integra400+（ロシュ）を用いてマウス血漿中で測定する臨床化学アナライトは全て、製造業者の指示に従ってヒト血漿サンプル用に最適化した。臨床化学アナライトについての広範囲な歴史的データベースが作成されており、これを用いてCOBAS Integra400+によってアッセイしたマウスサンプルを確認した。

Ｗｙ−１４，６４３処理に起因する潜在的な肝毒性を調べるため、ＷＴマウス及びｈＰＰＡＲαマウスにおいて肝障害のマーカー、即ち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を測定した（表６〜８）。また、ＷＴマウスに対するｈＰＰＡＲαマウスの基礎肝機能の特徴付けを行うため、得られる血漿サンプル全てにおいて肝臓関連血漿バイオマーカー、即ち、アルブミン（ＡＬＢ）、抱合型ビリルビン及び総ビリルビン（それぞれＢＩＬ−Ｄ及びＢＩＬ−Ｔ）、コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ−Ｃ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ−Ｃ）及びトリグリセリドについても調べた（表９〜１５）。

肝毒性の血漿マーカーに関しては、Ｗｙ−１４，６４３による処理の後、両方のマウス株においてＡＬＴ、ＡＳＴ及びＡＬＰの濃度は変化しないように思われた。しかし、少数の処理グループ内でばらついたため、Ｗｙ−１４，６４３介在による肝毒性に関する明確な結論を出すことはできなかった。

Ｗｙ−１４，６４３による処理の後、両方のマウス株において血漿アルブミンレベルは変化しなかった。解析に利用できるマウスの数は限られているが、検出可能なビリルビン濃度はマウス間及び処理グループ間でばらついた。血漿ＬＤＬレベル、血漿ＨＤＬレベル及び血漿コレステロールレベルは、処理とは関係なく、ＷＴマウスと比べてｈＰＰＡＲαマウスでは変化しなかった。しかし、Ｗｙ−１４，６４３による処理の後、トリグリセリド濃度は、対応する対照マウスで見られるレベルと比べて、ＷＴマウスでは有意に〜５０％低下し（ｐ＜０．０５）、２匹のｈＰＰＡＲαマウスでは有意に２５％及び２９％低下した。興味深いことには、単一媒体処理トランスジェニックマウスにおけるトリグリセリドレベルは媒体処理ＷＴマウス（ｎ＝３）の場合に比べて８０％高かった。

肝臓の除去及び処理
肝臓は次のように処理した。胆嚢を除去した後、肝臓を取り除いて計量した。３個の肝臓小片（５ｍｍ³）を取り除いて別々のクライオバイアル内に入れた後、液体窒素にて約−７０℃で急速冷凍し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）解析及びＤＮＡ配列決定に用いた。

２個の肝臓サンプル（約２ｍｍの細片）を、一方は左葉から、もう一方は中葉から採取した。２０ｍＬの１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を含む同一のシンチレーションバイアル内にこれらのサンプルを入れて組織学解析に用いた。

肝臓を再度計量した後、氷冷１．１５％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ内に入れ、その後、均質化及び細胞成分分画を行った。

新しく計量した肝臓をCXR Laboratory Method Sheet (LMS) Cent-001の修正バージョンに従って処理し、ホモジネート、核画分、ミトコンドリア画分（重ペレット）、細胞質画分及びミクロソーム画分を得た。この方法は核画分を採取することができるように修正した。新しい肝臓サンプルをCent-001に従って処理して１０％（ｖ／ｖ）ホモジネートを得た。ホモジネートを１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに入れ、５０ｇ、４℃で５分間遠心分離を行い、細胞片を除去した。残った上清を１０ｍＬの遠心管内に移し、ペレットを廃棄した。上清に氷冷ＳＥＴバッファーを注ぎ足して１０ｍＬとした後、７００ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行った。得られた上清を保持し、ミトコンドリア画分、細胞質画分及びミクロソーム画分に対する更なる分画を行った。

ペレット（未洗浄の粗核膜）を１０ｍＬの氷冷ＳＥＴバッファーで再懸濁させ、２〜３回通過させて均質化した後、７００ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行った。得られた上清を廃棄し、ペレット（洗浄済粗核膜）を１ｍＬ／ｇの原組織氷冷ＳＥＴバッファーで再懸濁させ、２回通過によって均質化した。全ての画分を約−７０℃で保存した後、解析を行った。

固定化後、各マウスから得た両方の肝臓切片を処理した後、パラフィン包埋した。ワックスブロックは室温で保存する。

Ｃｙｐ４ａタンパク質発現のイムノブロット解析
ＰＰＡＲα活性化の下流作用を調べるため、ＷＴマウス及びｈＰＰＡＲαマウス由来の肝ミクロソームにおけるイムノブロット解析によってＣｙｐ４ａタンパク質の発現を評価した。

個々の肝ミクロソームサンプルは、Ｃｙｐ４ａに関するイムノブロッティングによって解析した。タンパク質濃度はＣＸＲマイクロローリー法（microlowry method）を用いて測定した。マウス肝ミクロソームにおけるＣｙｐ４ａタンパク質の定量を行った。マウスｈｉｓタグＣｙｐ４ａ組換え標準品をＮＵ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。結果を図１７に示す。正の対照サンプル（パーフルオロオクタン酸アンモニウム（ＡＰＦＯ）誘導ラット肝ミクロソーム）の約５０ｋＤにおけるシグナルの存在から、用いた抗体が正しい分子量のタンパク質を認識したことが分かった。

媒体処理ＷＴマウス及びｈＰＰＡＲαマウスの両方において、Ｃｙｐ４ａに特異的な免疫反応性バンドが５０ｋＤで検出可能であった。Ｗｙ−１４，６４３による処理後、ＷＴマウスにおいて顕著な誘導が見られたが、これはＣｙｐ４ａタンパク質発現のアップレギュレーションと一致する。同様の作用がｈＰＰＡＲαマウスにおいても見られた。これは、ヒトＰＰＡＲαとマウスＰＰＡＲαがＷｙ−１４，６４３に対して同様の親和性を有するという仮説と一致する。

マウス肝臓におけるシアン化物非感受性パルミトイルＣｏＡ酸化の確認
利用可能なマウス肝臓の各々から得た重ペレット画分（粗ミトコンドリア）において、ＰＰＡＲαで調節されることが知られているペルオキシソーム酵素活性のマーカーとしてシアン化物非感受性パルミトイルＣｏＡ酸化に対するＷｙ−１４，６４３投与の作用を調べた。このアッセイを用いて、ＷＴマウス及びｈＰＰＡＲαマウスにおける機能性ＰＰＡＲα遺伝子の存在を確認した。Ｗｙ−１４，６４３は、両方のマウス株由来の粗ミトコンドリア画分においてシアン化物非感受性ｐＣｏＡ酸化を誘導したが、媒体対照と比べて約３倍の誘導を示した（図１８、表１６）。

ラウリン酸ヒドロキシル化
利用可能なマウスの各々から得た肝ミクロソームのＣｙｐ４ａ活性は、ラウリン酸ヒドロキシル化を測定することによって評価した（図１９、表１７〜１８）。Ｗｙ−１４，６４３による処理後、両方の代謝物（１２−ヒドロキシ（１２−ＯＨ）及び１１−ヒドロキシ（１１−ＯＨ））の生成における同様の増加が両方の株で見られた。興味深いことには、媒体処理ｈＰＰＡＲαマウスにおける１２−ＯＨラウリン酸ヒドロキシル化活性は、ＷＴマウスで見られる活性と比べて低かった。

ｈＰＰＡＲαマウスモデルについての転写物の特徴付け
１匹の媒体処理ＷＴマウス及び１匹のｈＰＰＡＲαマウスから得た肝臓サンプルについてＲＴ−ＰＣＲを行い、全長ヒトＰＰＡＲα転写物がｈＰＰＡＲαマウスに存在するかどうか評価した。

１個の対照ＷＴマウス肝臓組織サンプル及び１個のｈＰＰＡＲαマウス肝臓組織サンプルから全ＲＮＡを調製し、これらのＲＮＡサンプルをＲＮｅａｓｙキット（キアゲン、カタログ番号：７４１０４）を用いて精製した。Superscript III One-Step RT-PCR Platinum Taq HiFi Kit（インビトロジェン社、カタログ番号：１２５７４−０３０）を用い、製造業者のプロトコルに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、アガロースゲル上の電気泳動によって分離した。

ヒトＰＰＡＲα転写物が正しい翻訳開始部位を有することを確認するため、図２０に示すように、プライマー（ＰＰＡＲα−Ｆ及びＰＰＡＲα−Ｒ）をＲＴ−ＰＣＲで用いた。分子量が１．４ｋｂの予測されたＲＴ−ＰＣＲ産物が検出された（図２１）。得られたｃＤＮＡをクローン化し、配列解析によって特徴付けを行った。

ターゲティングベクターの設計は、ヒトＰＰＡＲαのエクソン３〜５、イントロン５、エクソン６、イントロン６及びエクソン７〜８から成るゲノム及びｃＤＮＡのキメラ構築物がマウスゲノム内に導入され、マウスＰＰＡＲα遺伝子のエクソン３のコード領域に取って代わるように行った。この構築物は、転写物がポリＡモチーフによって終結するように設計した。ターゲティングベクターは、ヒトイントロン５内に挿入されたＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性カセットを有するが、これはＦＬＰ介在組換えによって除去され、ヒト化ＰＰＡＲα対立遺伝子が産生するであろう。従って、構築物のポリＡ領域をアニールするようにプライマーを設計した。用いたプライマーは次の通りである。

順方向プライマー：PPARα_F cgc tct gtg gcc tgc ctg gcc ac
逆方向プライマー：PPARα_R ccg cgc ctg gat ctc agg aat tcc

用いたプライマーの特異性は正しい分子量において検出可能なバンドが無いことによって確認したが、これは予想通り、解析したＷＴマウスにヒトＰＰＡＲαｍＲＮＡが存在しないことを示す（図２１）。ＲＴ−ＰＣＲデータによって、ｈＰＰＡＲαマウス肝臓ＲＮＡからは少なくとも２種の産物（１．２ｋｂ及び１．４ｋｂ）が得られたが、ＷＴマウスＲＮＡからは得られなかったことが分かった。両方の断片の発現は低かったが、続いて行ったクローニングと配列決定解析によって、後述するように３種の異なる転写物が示された。

Superscript III One-Step RT-PCR Platinum Taq High Fidelity Kit（インビトロジェン社、カタログ番号：１０５７４−０３０）を用い、製造業者のプロトコルに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。媒体処理ｈＰＰＡＲαマウス及び媒体処理ＷＴマウスから全ＲＮＡ（１μｇ）を調製し、プライマー対（ＰＰＡＲα−Ｆ及びＰＰＡＲα−Ｒ）を使用するＲＴ−ＰＣＲに直接用いた。

複製５０μＬ合成反応は各々について設定し、次の条件下で行った。
ｃＤＮＡ合成：
５４℃、３０分間、及び
９４℃、２分間
を１サイクル
ＰＣＲ増幅：
９４℃、２０秒間、
５８℃、３０秒間、及び
６８℃、２分間
を４０サイクル
最終伸長：
６８℃、５分間
を１サイクル

クローンの制限解析
同定された変異ヒトＰＰＡＲαｍＲＮＡ種がある（Gervois et al, 1999）。配列解析から、この変異体は２０３ｂｐの欠失を含み、欠失断片はエクソン６の境界に正確に局在していることが示されたが、これはエクソン６をスキップした選択的スプライシングイベントによって生じることが分かる。この結果、中途終止コドンを導入するフレームシフトが生じた。短い転写物は、ヒンジ領域の一部とリガンド結合ドメインの全部が欠如した切断型ｈＰＰＡＲαタンパク質の産生をもたらすことが予測された。ＲＮＡアーゼ保護解析から、変異ヒトＰＰＡＲαｍＲＮＡは数種のヒト組織及び細胞において発現したことが分かったが、これは全ＰＰＡＲαｍＲＮＡの２０〜５０％である。一方、変異ＰＰＡＲαはげっ歯類組織では検出できなかった。こうして、ＰＰＡＲα変異転写物はヒトにおいて特異的に発現するように思われた。

ｈＰＰＡＲαマウス肝臓ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ後に見られた１．２ｋｂの産物が報告されているヒトＰＰＡＲαの選択的スプライスバリアントであることを確認するため、キアゲンゲル精製キットを用いたアガロースゲル電気泳動によってＲＴ−ＰＣＲ産物を分離した。１．２〜１．４ｋｂの範囲の断片をゲルから抽出、精製し、配列決定用ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社、カタログ番号：Ｋ４５７５−０１）を用いてｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターのＴ／Ａ部位内に連結させ、ＴＯＰ１０ウルトラコンピテント細胞に形質転換した。制限酵素ＢｇｌＩＩを用いた消化によってコロニーをスクリーニングして、ベクター内のインサートの存在を確認した。１．２ｋｂのインサートを含む１個のクローン（クローン＃１）及び１．４ｋｂのインサートを含む６個のクローン（クローン＃２、６、７、９、２４及び３６）の配列を決定した。連結ＤＮＡはＤＨ５αウルトラコンピテント細胞（アドバンテージ、ダンディー）に形質転換し、アンピシリンプレート上に置いて陽性クローンを選択した。

クローンの配列解析
各陽性クローンのプラスミドＤＮＡは、Qiaprep Spin Miniprepキット（キアゲン、カタログ番号：２７１６０）を用い、製造業者のプロトコルに従って調製し、５０μＬの溶出バッファーに溶出させた。

約３００ｎｇのプラスミドＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化し、ベクター骨格からインサートを遊離させた。消化物を１％アガロースＴＡＥゲル上にロードした。

形質転換プレートから得たコロニーを採取し、２０μＬのＰＣＲミックス：
２μＬの１０×バッファー（ＮＥＢ）
０．４μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
０．４μＬのＭ１３Ｆセンスプライマー（１０μＭ）
０．４μＬのＭ１３Ｒアンチセンスプライマー（１０μＭ）
０．１μＬのＴａｑ（ＮＥＢ）
１６．７μＬのｄＨ₂Ｏ
に直接添加し、次の条件下で行った。
９５℃、２分間を１サイクル
９５℃、２０秒間及び５６℃、３０秒間を４０サイクル
７２℃、１００秒間を１サイクル

配列解析は、Lark Technologies社、A Genaissance社（エセックス州、テイクリー、ホープエンドＣＭ２２ ６ＴＡ）によって行った。アラインメントは、VectorNTI 8ソフトウェアを用い、Contig Express、Align-Xモジュール及びT-COFFEEアラインメントソフトウェア（http://www.ch.embnet.org/software/TCoffee.html）を利用して行った。

配列比較によって、クローン＃１の１．２ｋｂのインサートはエクソン６が欠如したヒトＰＰＡＲαのスプライスバリアントであることが確認された（ＳＶ１、図２２参照）。１．４ｋｂのインサートは２種類の転写物、即ち、正常スプライスバージョン（クローン＃２、７、９及び２４）とスプライスバリアントＳＶ２を示す。バリアントＳＶ２は、選択的イントロン３’スプライス部位を用いることによってエクソン５の３’末端に４ｂｐ（ＧＴＡＧ）のアウト・オブ・フレームが挿入されて中途終止コドンとなった、これまでに公表されていない転写物である（図２２）。アガロースゲル電気泳動に基づき、１．２ｋｂ転写物に対する１．４ｋｂ転写物の比は約１：１であると思われた。しかし、選択的スプライスバリアントＳＶ１及びＳＶ２に対する正常スプライス転写物の比は、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて求めることができなかった。

選択的スプライスバリアントＳＶ１及びＳＶ２はそれぞれ、１７４個のアミノ酸及び１８０個のアミノ酸を含む切断型ＰＰＡＲαタンパク質をコードする。両方の切断型タンパク質においては、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の大きい領域は欠如しているが、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）はまだ含まれている（図２３）。これらの２種の選択的スプライス転写物がｈＰＰＡＲαマウスに形質転換されて切断型タンパク質を生成し得るかどうか、また、これらがＰＰＲＥ含有ＤＮＡ断片に結合し得るかどうかはまだ分からない。ゲル遅延度アッセイにおいて切断型ＰＰＡＲα（ＰＰＡＲαｔｒ）はＰＰＲＥ要素に結合し得なかったが、核内ｈＰＰＡＲαｔｒは強力なリプレッサーであり、インビトロにおいて全長ｈＰＰＡＲαタンパク質の転写活性に影響を及ぼし得ることが報告されている（Gervois et al, 1999）。

要約すると、ヒト化マウスに特異的な全長ヒトＰＰＡＲα転写物が検出され、クローン化され、配列決定によって確認された。２種の選択的スプライスバリアント（ＳＶ１及びＳＶ２）が本研究によって同定された。バリアントＳＶ１は公表されているが、これはヒト特異的な選択的スプライスバリアントである（Gervois et al, 1999）。バリアントＳＶ２は、エクソン５の３’末端において４ｂｐ（ＧＴＡＧ）のアウト・オブ・フレームインサートが付加され、中途終止コドンとなった新しい型の転写物である。ヒト化マウスにおける切断型ＰＰＡＲαタンパク質の潜在的機能は不明である。

ｍＰＰＡＲα及びｈＰＰＡＲαｍＲＮＡ発現のＴａｑＭａｎ（登録商標）解析
マウス肝臓サンプルを液体窒素にて急速冷凍してＲＮＡの完全性を保持した。ＲＮｅａｓｙミニキットを用い、媒体処理ｈＰＰＡＲαマウス及び媒体処理ＷＴマウスからＴａｑｍａｎ（登録商標）定量ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ単離を行った。

マウスＰＰＡＲα及びヒトＰＰＡＲαに特異的なプライマー（アッセイ・オン・デマンド、カタログ番号はそれぞれ、Ｍｍ００４４０９３９＿ｍ１及びＨｓ００９４７５３９＿ｍｌ、アプライド・バイオシステムズ）を用い、ＷＴマウス及びｈＰＰＡＲαマウス由来のマウス肝臓におけるＰＰＡＲα発現のＴａｑＭａｎ（登録商標）解析を行った。マウスＰＰＡＲαプライマーはマウスＰＰＡＲα配列のエクソン７とエクソン８との間にアニールするように設計し、ヒトＰＰＡＲαプライマーはマウス配列のエクソン７〜９を増幅するように設計した。

マウス及びヒトＰＰＡＲαｍＲＮＡレベルの定量は、ＷＴマウス及びｈＰＰＡＲαマウスの通常ＰＰＡＲα発現部位（肝臓）における定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって行った（表１９）。ＲＮＡはマウス肝臓から抽出した。ｃＤＮＡは利用可能なＲＮＡサンプル全てから合成し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）解析は、マウスＰＰＡＲα及びヒトＰＰＡＲα（アッセイ・オン・デマンドキット、アプライド・バイオシステムズ）に特異的なプライマーを用いて利用可能なサンプル全てにおいて行った。マウスα−アクチンを内部標準品として用いた（アッセイ・オン・デマンドキット、カタログ番号：４３Ｓ２９３３Ｅ、アプライド・バイオシステムズ）。

ヒトＰＰＡＲα転写物はｈＰＰＡＲαマウスでは見出されたが、ＷＴマウスでは見出されなかった。マウスＰＰＡＲαはＷＴマウスでは確認されたが、ｈＰＰＡＲαマウスでは確認されなかった。検出されたＰＰＡＲαｍＲＮＡのレベルは両方のモデルにおいて同等であった。

ヒトＣＡＲ及びＰＰＡＲαに関して二重ホモ接合性であり、ヒトＰＸＲに関してヘテロ接合性であるマウスを作出した。図２５は、このような二重ホモ接合ＣＡＲ／ＰＰＡＲα及びヘテロ接合ＰＸＲヒト化マウスのＰＣＲ確認を示す。ＩＤがｍ２４５２１８、ｆ２４５２２１、ｆ２４５２２６及びｆ２４５２２７のマウスはＣＡＲに関してホモ接合ヒト化され、ＰＸＲに関してヘテロ接合ヒト化されている。三重ヒト化ＰＸＲ／ＣＡＲ／ＰＰＡＲαマウスは、TaconicArtemisの既存の繁殖プログラムで設定されたプロトコルに従って間もなく得られるであろう。

実施例５：ｈｕＡｈＲ及びｋｏＡｈＲ
図５に示すように、ヒトＡｈＲをコードするＤＮＡ配列をマウスＡｈＲ遺伝子座に挿入して（ノックイン）、マウスＡｈＲプロモーターの制御下でヒトＡｈＲを発現させることができる。ヒトＡｈＲをコードするＤＮＡ配列は、ヒトＡｈＲ遺伝子のエクソン３〜１１を含む（図５）。ターゲティングベクターは、Ｃｒｅ介在によるＡｈＲノックアウトによってｋｏＡｈＲの産生を可能とする配列要素を含む（図５）。

ＰＸＲ、ＣＡＲ及びＡＨＲに関して三重ホモ接合ヒト化したマウスを作出した。図２４は、三重ホモ接合ＰＸＲ／ＣＡＲ／ＡｈＲヒト化マウスのＰＣＲ確認を示す。ＩＤがｆ２４１９９８、ｆ２４２００１及びｆ２４２００４のマウスはＰＸＲ、ＣＡＲ及びＡＨＲに関して三重ホモ接合ヒト化されている。このようなマウスは、本明細書に記載のアッセイにおいて非常に重要である。

実施例６：概念の証明：げっ歯動物における非遺伝毒性発癌物質（ＰＢ）の作用
フェノバルビタール（以下「ＰＢ」とする）は、マウスやラットにおいて肝臓癌を引き起こすことが知られているが、ヒトにおいてはそのようなことはない。ＰＢに対して長期間処理を行った後、げっ歯動物では肝腫瘍が発生する。まず、ＰＢによって過形成応答や細胞複製が引き起こされ、処理の最初の２週間で肝臓重量が増加する。しかし、約２年後、処理動物においては肝腫瘍が明らかになる。この種の解析から、ＰＢをヒトにおいて用いるのは危険だと考えられるだろう。しかし、実際にはＰＢは安全であり、長年に亘って販売されており、処理患者において肝腫瘍が発生した記録も無い。このことは、ヒトにおける薬物の安全性を試験する上で現在の動物モデルが不十分であることを示しており、また、安全性試験プロセスのこの段階で不必要に薬物を削減していることを意味する。製薬会社が試験段階のできるだけ早期に答えるべき問題は、動物において見られる化学薬品に対する過形成応答が実際にヒトと関連するのか？ということである。

転写因子ＣＡＲは、ＰＢ様の誘導剤に対する応答に必須であることが知られている。Weiらは２０００年（Nature）に、野生型マウスにおいて、細胞肥大や過形成応答を反映する肝臓質量がＣＡＲアクチベーターによって増加したことを示した。これに対し、ＣＡＲ ＫＯマウスにおいては、ＣＡＲアクチベーター処理後も肝臓質量の増加が見られなかった。また、ＣＡＲ ＫＯマウスにおいては、野生型マウスでＢｒｄＵ取り込みの増加によって確認されるＤＮＡ合成の誘導も見られなかった。同様に、Cheungらは２００４年に、野生型マウスにおいて種々の薬物による処理で生じる肝臓重量の増加が、マウスのＰＰＡＲαに関するヒト化によって抑制されたことを示した。また、ヒト化マウスにおいては、野生型マウスで見られるような複製ＤＮＡ合成の増加も欠如していることが分かった。

ヒトにおけるＰＢに対する応答をヒト化ＰＸＲ／ＣＡＲマウスが模倣するかどうか評価するため、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスモデルとＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスモデルを用いた。変異マウス株はアルテミスから入手した。野生型（ＷＴ）マウス株Ｃ５７ＢＬ／６Ｊはハーラン（英国）から入手した。マウスは全て１０〜１６週齢であった。次のパラメータについて研究した。
・肝臓／身体重量比
・細胞増殖の基準として解析したＢｒｄＵ取り込み
・ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）肝臓病理組織学
・肝ミクロソームにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによるＰ４５０類の発現及び活性
・肝臓においてＴＵＮＥＬアッセイで解析されたアポトーシス指数

研究には６グループのマウス（１０匹のＷＴマウス／グループ、９〜１０匹のＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウス／グループ、及び９匹のｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス／グループ）を用いた（表１９）。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、１５ｍｇ／ｍＬリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］溶液、ｐＨ７．４）を含む浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ ２００１）を全てのマウスに埋め込み（１日目）、５日後、全てのマウスについて埋め込みを終了させた。施術後、どのマウスにも異常は見られなかった。表１９に詳述するように、埋め込み１日後から全てのマウスに８０ｍｇ／ｋｇのＰＢ／生理食塩水又は生理食塩水のみを腹腔内注射によって４日間投与した。

ＰＢによるＰＸＲ／ＣＡＲ依存的肝腫
ＰＢ又は媒体によって処理した後、マウスを殺し、その肝臓を取り出して重量を測った。ＰＢ処理に呼応してＷＴマウス及び「ヒト化」マウスの両方で肝腫が見られた（肝臓／身体重量比がそれぞれ１１８％及び１２２％増加したことによって分かる）が、ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスでは見られなかった（表２０、図７）。

肝細胞増殖
全てのマウスの肝臓切片及び十二指腸切片に対し、細胞増殖の基準としてのＢｒｄＵ取り込みについて解析した。方法としては間接ＢｒｄＵ標識アッセイを用いた。ＷＴマウスではＰＢによって肝細胞標識指数（Ｓ期）が約５倍増加したが、ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスやＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスでは細胞増殖に対するＰＢの作用が見られなかった（図８、表２１）。

肝臓ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死
非遺伝毒性発癌物質による肝細胞アポトーシスの５０％抑制については、ラットでは既に一貫して示されている。しかし、マウスではそのような一貫性が見られない。間接ＴＵＮＥＬ標識アッセイを用いて、肝臓ｉｎ ｓｉｔｕ死を解析した（図９／表２１）。本研究によって、マウス肝臓におけるアポトーシス指数のマーカー変化（marker variation）が分かった。このように、低バックグラウンドにおける低い（例えば５０％）化合物誘導による抑制は容易に実証できなかった。

Ｈ＆Ｅ解析
２個の肝臓サンプル（一方は葉から、もう一方は中葉から）と１個の小腸サンプルを取り出し、４％中性緩衝ホルムアルデヒド（ＮＢＦ）中で保存した。全グループの全てのマウスの保存肝臓サンプルを整え、処理し、パラフィンに包埋した。パラフィン包埋サンプルをProgenix社（英国、Inverkeithing）に送付した。そこでは、サンプルを約５ａｅｍの公称厚さで切断した後、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。各臓器サンプルの一切片は、Ortwin Vogel博士（顧問病理学者、ドイツ、キール）によって調べられた。Ｈ＆Ｅで染色した全てのマウス肝臓及び小腸を病理組織学的に解析した後、Vogel博士は次の知見を報告した。

微視的には、ＰＢで処理したｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス及びＷＴマウスにおいて軽度から中程度の小葉中心性肝細胞肥大が認められた（図１０）。この知見はＰＢ処理と関連すると考えられる。これに対し、ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスにおいては、ＰＢ処理後に肝細胞肥大の明らかなエビデンスは認められなかった。更に、肝細胞増殖を示す有糸分裂の様子がＰＢ処理のＷＴマウスで主に認められたが、「ヒト化」マウスやヌルマウス株でも頻度は低いが認められた。

肝臓において記録された他の全ての微視的知見からはＰＢ処理マウスと対照マウスを有意に区別できず、これらの差はランダムな事象とみなされた。これらの知見は全て、本来自発的なものであり、マウスにおいて通常見られる正常なバックグラウンド病理学の範囲内であると考えられる。小腸においては微視的な知見は記録されなかった。この研究の条件下では、ＰＢ（８０ｍｇ／ｋｇ／４日／ＩＰ）により、ＷＴ株マウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ株マウスにおいて肝細胞肥大／過形成の病理学的エビデンスがもたらされた。ＰＢ処理のＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯ株マウスにおいては肝細胞過形成のエビデンスが見出された。

肝Ｐ４５０誘導
肝ミクロソーム部分におけるＰ４５０の触媒活性を定量した。マウスＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａ１１の活性を定量化するために、ペントキシレゾフリン（ＰＲＯＤ）の脱アルキル化活性及びベンジルオキシキノリン（ＢＱ）の脱ベンジル化活性をそれぞれ求めた。更に、ベンジルオキシレゾルフィン−Ｏ−デメチラーゼ（ＢＲＯＤ）活性、メトキシレゾルフィン−Ｏ−デメチラーゼ（ＭＲＯＤ）活性及び７−エトキシレゾルフィン−）−デエチラーゼ（ＥＲＯＤ）活性も測定し、評価した（図１１参照）。

ＥＲＯＤ活性はマウスにおいてはＣｙｐ１ａ１／１ａ２及びＣｙｐ１ｂ１を示すが、ＭＲＯＤはＣｙｐ１ａ２の基質である。しかし、測定した活性に他のアイソフォームが寄与する場合もある。２種類の酵素アッセイから得た結果は、互いにある程度良く一致する（図１１ａ〜ｂ）。Ｃｙｐ１ａ２遺伝子は構成的に発現するため、これによって、両方の活性アッセイにおいて見られる活性の基礎レベルを説明することができる。Ｃｙｐ１ａ１はマウスにおいて誘導後にのみ発現し（Ikeya et al, 1989）、フェノバルビタールはこのＰ４５０をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで誘導しないことが報告されている（Sakuma et al, 1999）。ＭＲＯＤデータ及びＥＲＯＤデータから、酵素活性はＷＴマウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいてＰＢ処理によって増加することが分かった。両方のアッセイにおいて、ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯ系におけるＰＢ処理による増加は見られなかった。他のデータはこのような初期の知見と一致するが、ＰＸＲ／ＣＡＲマウスパネルを用いた初期のデータから、ＰＢ（４０ｍｇ／ｋｇ／４日）がＣＡＲ介在経路によってＣｙｏ１ａ２を活性化し得ることが分かった。

ＰＢで処理したｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスではＢＱ活性の５倍増加が見られたが、ＷＴマウスでは僅かな増加が認められた（図１１ｃ）。これらのデータからマウス株間の明らかな種差が分かるが、これによって、ヒトレポーターはそのマウスカウンターパートと比べてＰＢに対する感受性が高いことが示される。更に、ＰＢで処理したＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスではＣｙｐ３ａ１１の誘導が無いことからも実証されるように、このメカニズムはレポーターの存在に依存すると思われる。

ＢＲＯＤ及びＰＲＯＤはマウスにおけるＣｙｐ２ｂ１０活性のマーカーである。ＷＴマウス株及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス株の両方においては、ＰＢで処理した後に同等レベルでマーカーＣｙｐ２ｂ１０誘導が見られた（図１１ｄ〜ｅ）。しかし、ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスにおいては、ＰＢに曝露した際、ＰＲＯＤ活性やＢＲＯＤ活性は変化しなかった。概して、ＷＴマウス株やｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウス株ではＰＢはＰ４５０触媒活性を誘導したが、このようなレセプターを欠いたマウスでは誘導しなかった。これによって、ＰＢ介在によるＰ４５０誘導がＣＡＲ／ＰＸＲ依存的であることがはっきりと分かる。

Ｐ４５０活性データによると、プールされたマウス肝ミクロソーム中のＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ３ａ１１タンパク質のウェスタンブロッティングによる定量から、両方のＰ４５０がＷＴマウス株やヒト化マウス株ではＰＢで誘導されるが、ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスでは誘導されないことが分かった（図１２）。更に、Ｃｙｐ３ａ１１誘導の種差がタンパク質レベルで確認されるが、これによって、ＰＢのヒト受容体に対する感受性がそのマウス等価物に比べて高いことが示唆される。

結論として、肝腫はＷＴマウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいてのみ生じたということができる。ＫＯ ＰＸＲ／ＫＯ ＣＡＲでは作用が見られなかった。同じパターンがＰ４５０誘導についても見られた。しかし、最も印象的な結果は、肝細胞増殖（ＤＮＡ前駆体であるＢｒｄＵの取り込みによって確認）についてマウスを試験した際に見出された。即ち、ＷＴマウスにおいてのみ肝細胞増殖が示されることが見出された。ＫＯマウス及びヒト化マウスの両方においては何の増殖作用も見られなかった。

従って、重要な結論は次の通りである。
・ＷＴマウスにおいては、ＰＢは肥大や過形成を誘導した。
・ＰＸＲＫＯ／ＣＡＲＫＯマウスにおいては、ＰＢは肝腫を誘導しなかった（肥大も過形成も誘導しなかった）。
・ｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲマウスにおいては、ＰＢは肥大を誘導したが、過形成を誘導しなかった。

これらのマウス及びｈｕＰＸＲ／ｈｕＣＡＲ／ｈｕＰＰＡＲａは、ヒトに対する非遺伝毒性げっ歯類の「肝成長発癌物質」の真の危険性を評価する上で価値が高いであろう。また、これらは、生体異物誘導による肝成長や該成長における種差の複雑さを解明する上で有用なツールも提供するであろう。

参考文献
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Claims (36)

1. ヒトにおける安全性に関して非遺伝毒性発癌物質をスクリーニングするための方法であって、非遺伝毒性発癌物質に細胞の調製物を曝露することと、生理学的作用をモニターすることとを含む方法において、その動物は、ＰＸＲ、ＣＡＲ、ＰＰＡＲα及びＡＨＲから成る群から選択される少なくとも２種の核内転写因子に関してヒト化されており、その動物におけるその内在性等価遺伝子は機能しないようにされている方法。
2. 動物は、少なくともＰＸＲ及びＣＡＲ、ＰＸＲ及びＰＰＡＲα、ＣＡＲ及びＰＰＡＲα、ＰＸＲ及びＡＨＲ、ＰＰＡＲα及びＡＨＲ、又はＣＡＲ及びＡＨＲに関してヒト化されている、請求項１に記載の方法。
3. 前記動物は、核内転写因子ＣＡＲ、ＰＸＲ及びＰＰＡＲαに関してヒト化されており、その内在性等価遺伝子が機能しないようにされているトランスジェニック非ヒト動物である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記動物はＡＨＲ受容体に関して更にヒト化されており、その内在性等価遺伝子は機能しないようにされている、請求項３に記載の方法。
5. 前記動物は、核内転写因子ＣＡＲ、ＰＸＲ及びＡＨＲに関してヒト化されており、その内在性等価遺伝子が機能しないようにされているトランスジェニック非ヒト動物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記動物の全ての内在性等価遺伝子は全ての組織において機能しないようにされている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記動物において機能しないようにされた遺伝子の発現レベルは野生型の発現レベルの１０％未満である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. ヒト転写因子遺伝子配列は宿主動物染色体内の内在性等価標的遺伝子が自然に生じる位置において挿入されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. ヒト転写因子遺伝子は宿主動物染色体内の内在性等価標的遺伝子が自然に生じる位置において挿入され、宿主染色体内の内在性等価標的遺伝子に取って代わっている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記動物における前記ヒト転写因子遺伝子の転写は宿主動物の一以上の内在性調節配列の制御下にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記動物における前記ヒト置換遺伝子配列の転写は内在性ヒト調節配列の制御下にある、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記動物はＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｄ６の内の１種、２種又は３種全てに関して更にヒト化されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記動物はＭＤＲ及び／又はＭＲＰに関して更にヒト化されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記動物はＵＧＴ１Ａに関して更にヒト化されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記動物はげっ歯動物、より好ましくはマウスである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 有効性スクリーニング、ＰＫ／ＰＤモデリング又は薬物の安全性試験に用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 非遺伝毒性発癌物質はＰＸＲ、ＣＡＲ又はＰＰＡＲαの少なくとも１種のリガンドである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記生理学的作用は非遺伝毒性発癌物質の代謝である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記生理学的作用は肝腫、Ｐ４５０誘導又は肝細胞増殖である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. ヒトにおける安全性に関して非遺伝毒性発癌物質をスクリーニングするための方法であって、インビトロで非遺伝毒性発癌物質に細胞の調製物を曝露することと、生理学的作用をモニターすることとを含む方法において、細胞は、ＰＸＲ、ＣＡＲ、ＰＰＡＲα及びＡＨＲから成る群から選択される少なくとも２種の核内転写因子に関してヒト化された動物に由来し、動物におけるその内在性等価遺伝子は機能しないようにされている方法。
21. 核内転写因子ＣＡＲ、ＰＸＲ及びＰＰＡＲαに関してヒト化されており、その内在性等価遺伝子が機能しないようにされているトランスジェニック非ヒト動物。
22. 核内転写因子ＣＡＲ、ＰＸＲ及びＡＨＲに関してヒト化されており、その内在性等価遺伝子が機能しないようにされているトランスジェニック非ヒト動物。
23. ＡＨＲ受容体に関して更にヒト化されており、その内在性等価遺伝子が機能しないようにされている、請求項２１に記載の動物。
24. 全ての内在性等価遺伝子は全ての組織において機能しないようにされている、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の動物。
25. 機能しないようにされた遺伝子の発現レベルは野生型の発現レベルの１０％未満である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の動物。
26. ヒト転写因子遺伝子配列は宿主動物染色体内の内在性等価標的遺伝子が自然に生じる位置において挿入されている、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の動物。
27. ヒト転写因子遺伝子は宿主動物染色体内の内在性等価標的遺伝子が自然に生じる位置において挿入され、宿主染色体内の内在性等価標的遺伝子に取って代わっている、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の動物。
28. 前記ヒト転写因子遺伝子の転写は宿主動物の一以上の内在性調節配列の制御下にある、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の動物。
29. 前記ヒト置換遺伝子配列の転写は内在性ヒト調節配列の制御下にある、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の動物。
30. ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｄ６の内の１種、２種又は３種全てに関して更にヒト化されている、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の動物。
31. ＭＤＲ及び／又はＭＲＰに関して更にヒト化されている、請求項２１〜３０のいずれか１項に記載の動物。
32. ＵＧＴ１Ａに関して更にヒト化されている、請求項２１〜３１のいずれか１項に記載の動物。
33. げっ歯動物、より好ましくはマウスである、請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の動物。
34. 請求項２１〜３３のいずれか１項に記載の動物から単離された細胞。
35. 幹細胞である、請求項３４に記載の細胞。
36. 胚性幹細胞である、請求項３５に記載の細胞。