JP2011509931A - 癌を処置するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤、および、式(１):

の化合物であるＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤の組み合わせ剤を提供する。本発明の組み合わせ剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬに関連することが知られている癌を処置するために用いられ得る。

Description

関連出願の相互引用
本出願は、米国仮特許出願第61/021,008号(2008年1月14日出願)の利益を主張しており、当該出願は、言及することによって、その全体が本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、全般的に、腫瘍細胞増殖を阻害する方法および癌を処置するための組み合わせ治療剤および方法に関する。

背景技術
ＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子は、フィラデルフィア染色体(Ｐｈ) 22qの産物であり、構成的活性化されたＡＢＬチロシンキナーゼ活性を有するキメラＢＣＲ−ＡＢＬ蛋白質をコードする(Lugo et al., Science 247:1079-1082 (1990))。ＢＣＲ−ＡＢＬは、慢性骨髄性白血病の根源的な原因である。ＣＭＬを有する患者では、２１０kDaのＢＣＲ−ＡＢＬ蛋白質が発現されるのに対して、Ｐｈ陽性(Ｐｈ^＋)急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)を有する患者では、ＢＣＲ遺伝子中の別の開裂点に起因する１９０kDaのＢＣＲ−ＡＢＬ蛋白質が発現される(Bartram et al., Nature 306:277-280 (1983); Chan et al., Nature 325:635-637 (1987))。ＢＣＲ−ＡＢＬは、関連づけられた骨髄系またはリンパ系前駆細胞または３Ｔ３線維芽細胞において、種々のメカニズムを介して、増殖および抗アポトーシスを誘発することが示されている(Pendergast et al., Cell 75:175-85 (1993); Ilaria et al., J. Biol. Chem. 271:31704-10 (1996); Chai et al., J. Immunol. 159:4720-8 (1997); and Skorski et al., EMBO J. 16:6151-61 (1997))。

本発明の開示
本発明は、腫瘍細胞増殖の阻害および種々の癌の処置に有用であり得る組成物、特に組み合わせ治療剤を提供する。

一つの局面において、本発明は、ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤およびＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を含む組成物であって、
該ＡＴＰ競合的阻害剤が、イマチニブ (STI571)、ニロチニブ (AMN107)、ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン化合物 (例えばダサチニブ)、ボスチニブ、３位置換ベンズアミド誘導体(例えばINNO-406)、AZD-0530、MK-0457、PHA-739358、AP24534 (Ariad)、JNJ-26483327 (Johnson & Johnson)、HPK-61 (SuperGen)、SKS-927 (Wyeth)、AT-9283 (Astex Pharmaceuticals)、EXEL-2280 (Exelisis)、およびTG-100572 (Targegen)からなる群から選択され；
当該ＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、式(１)：

[式中、
Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は、それぞれＣＨであるか；あるいは、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４のうちの１つがＮであって、それ以外がＣＨであり；
Ｒ^１は、ＯＣＦ_３またはＣＦ_３であり；
Ｒ^２は、Ｃ_１−６アルキルであり；
Ｒ^３は、ＮＲ(ＣＨ_２)_２ＮＲ^４Ｒ^５または５〜７員のヘテロ環式環であるか；あるいは、Ｒ^３は、アリールまたは５〜７員のヘテロアリールであり、それぞれは、所望により１〜２個のＲ^６基で置換されているか、または、所望によりアリールまたはヘテロアリール(それぞれは、所望により１〜２個のＲ^６ａ基で置換されている。)で置換されており；
ここで、Ｒ^６およびＲ^６ａは、独立して、ＣＯＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＯＲ^７、ＣＯＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^４Ｒ^５、ＣＯＮＲ^４Ｒ^５、ＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＯＲ^７、ＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^４Ｒ^５、ＳＯ_２ＮＲＲ^７、ＮＲ^４Ｒ^５またはＳＯ_２Ｒ^８であり；
Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
あるいは、Ｒ^４およびＲ^５は、ＮＲ^４Ｒ^５におけるＮと一体となって、５〜７員の環を形成してもよく；
ＲおよびＲ^７は、独立して、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
Ｒ^８は、Ｃ_１−６アルキルであり；
ｍは、０〜１であり；
ｎは、１〜４である。]
の化合物またはその薬学的に許容される塩
である組成物を提供する；ただし、当該ＡＴＰ非競合的阻害剤が、

であるとき、当該ＡＴＰ競合的阻害剤は、イマチニブではない。

一つの態様において、該ＡＴＰ非競合的阻害剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬのミリステート結合部位に結合する。幾つかの態様において、該ＡＴＰ非競合的阻害剤は、式(２)：

[式中、Ｒ^９は、メタ位またはパラ位であり、カルボキサミド、ＣＯＮＨ(ＣＨ_２)_２ＯＨ、スルホン(ＳＯ_２ＣＨ_３)またはスルホンアミド(ＳＯ_２ＮＨＲ)から選択される。]
の化合物である。

幾つかの例において、式(１)におけるＸ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は、それぞれＣＨである。他の例において、式(１)におけるＲ^１は、ＯＣＦ_３である。

他の態様において、式(１)におけるＲ^３は、モルホリニル、イミダゾリルまたはピリジルであり、当該ピリジルは、所望により１個のＲ^６ａ基で置換されており；Ｒ^６ａは、式(１)で定義した通りである。他の例において、Ｒ^３はフェニルであって、所望によりメタ位またはパラ位で、式(１)で定義した１個のＲ^６基で置換されている。また、他の例において、式(１)におけるＲ^３はＮＲ(ＣＨ_２)_２ＮＲ^４Ｒ^５であり、Ｒ^４およびＲ^５は、Ｎと一体となってモルホリニルを形成する。

特定の態様において、本発明は、イマチニブ、ニロチニブおよびダサチニブから選択されるＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤；ならびに

から選択されるＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を含む組成物を提供する。

他の態様において、本発明は、ニロチニブ、ならびに

から選択されるＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を含む組成物を提供する。

他の局面において、本発明は、癌、特にＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病を処置する方法であって、系または対象に、上記のＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤およびＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を含む治療的に有効な量の組成物を投与し、それによって、当該ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病を処置することを含む方法を提供する。例えば、本発明の組成物は、慢性骨髄性白血病または急性リンパ球性白血病を処置するために使用され得る。

さらに、本発明は、細胞増殖性障害、特にＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病の処置用医薬の製造における、上記のＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤およびＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を含む治療的に有効な量の組成物の使用を提供する。

上記の組成物および本発明の組成物を用いる方法において、本発明の組成物は、細胞または組織を含む系に投与され得る。幾つかの態様において、本発明の組成物は、ヒトまたは動物の対象に投与され得る。

図１は、出現するＢａ／Ｆ３.ＢＣＲ−ＡＢＬ耐性クローン数に対する種々の濃度のＧＮＦ−２、イマチニブまたは両者の組み合わせの効果を示す。 図２は、それぞれ５mg/kgおよび２０mg/kgの静脈内投与および経口投与後の時間(時)に対するＧＮＦ−５血漿濃度(ｎＭ)を示す。 図３Ａは、ビークル、ＧＮＦ−５ ５０mg/kgおよび１００mg/kgで、１日２回処置後５日目および７日目の、野生型ルシフェラーゼ発現Ba/F3.p210細胞における腫瘍／コントロールの定量化を示す。 図３Ｂは、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ発現Ba/F3細胞の増殖に対するＧＮＦ−５、ニロチニブ、および、ニロチニブと組み合わせた種々の濃度のＧＮＦ−５(０.３〜１０μＭ)の効果を示す。 図３Ｃは、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬおよびT315I/E505K ＢＣＲ−ＡＢＬ発現Ba/F3細胞の増殖に対するニロチニブと組み合わせた種々の濃度のＧＮＦ−５(０.６〜２０μＭ)の効果を示す。 図４Ａは、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ骨髄移植有効性試験における、ビークルおよび５０mg/kgのニロチニブで１日２回または７５mg/kgのＧＮＦ−５で１日２回または組み合わせ(５０mg/kgのニロチニブを１日２回＋７５mg/kgのＧＮＦ−５を１日２回)の処置における平均白血球細胞数を示す。 図４Ｂは、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ骨髄移植有効性試験における、ビークルおよび５０mg/kgのニロチニブを１日２回または７５mg/kgのＧＮＦ−５を１日２回または組み合わせ(５０mg/kgのニロチニブを１日２回＋７５mg/kgのＧＮＦ−５を１日２回)の処置における脾臓重量を示す。 図４Ｃは、ＧＮＦ−５およびニロチニブの組み合わせを１回投与した後のＳｔａｔ５リン酸化阻害の時間経過を示す。 図４Ｄは、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ形質導入骨髄を移植し、ビークル(実線)、７５mg/kgのＧＮＦ−５を１日２回(点線)、５０mg/kgのニロチニブを１日２回(点および破線)、または、７５mg/kgのＧＮＦ−５を１日２回＋５０mg/kgのニロチニブを１日２回の組み合わせ(破線)で処置したマウス(１グループ当たりｎ＝５匹のマウス)の生存を示すカプラン・マイヤー曲線を示す。化合物の投与は、移植後１１日目に開始し、５０日目に中止した(矢印によって示されている)。

定義
別に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。下記の参考文献は、本発明で用いられる多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (eds.), John Wiley & Sons (3P^rdP ed., 2002); および A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4P^thP ed., 2000)。さらに、下記の定義は、本発明の実施において、読み手を助けるために提供される。

用語“薬物”または“試験薬”は、何らかの物質、分子、元素、化合物、物質またはその組み合わせを含む。それは、例えば蛋白質、ポリペプチド、有機小分子、多糖、ポリヌクレオチドなどを含み、これらに限定されない。特記しない限り、用語“薬物”、“物質”および“化合物”は、相互に交換可能で用いられる。

用語“アナログ”は、対照分子に構造的に類似しているが、対照分子の特定の置換基を別の置換基に置き換えることによって、目標とされたおよび制御された方法で修飾されている分子を言うために、本明細書で用いられる。対照分子と比較して、当業者は、アナログが、同一の、類似した、または改善された有用性を示すと予測する。改善された特色(例えば標的分子に対する結合親和性がより高いもの)を有する既知化合物の変形を同定するためのアナログの合成およびスクリーニングは、薬化学で周知のアプローチである。

本明細書で用いられるとき、“接触”は、その通常の意味を有し、２種以上の分子(例えば有機小分子化合物およびポリペプチド)を合わせること、あるいは、分子および細胞(例えば１種の化合物および細胞)を合わせることを言う。接触は、in vitroで、例えば試験管中または他の容器中で、２種以上の薬物を合わせて、または、１種の化合物および細胞または細胞ライセートを合わせて起こり得る。また、接触は、細胞中、またはイン・サイチュで、例えば２種のポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを有する細胞中で共発現することによって細胞中で、または細胞ライセート中で、２種のポリペプチドを接触させて起こり得る。

用語“阻害する”または“阻害”は、腫瘍の増殖または腫瘍細胞増殖の内容において、原発性または続発性腫瘍の出現を遅らせること、原発性または続発性腫瘍の発達を遅らせること、原発性または続発性腫瘍の発生を減少させること、疾患の二次的影響の重症化を遅らせるまたは重症度を減少させること、あるいは、腫瘍の増殖を阻止することおよび腫瘍を退縮させることを言う。用語“予防すること”または“予防”は、原発性または続発性腫瘍の発達または疾患の何らかの二次的影響を完全に阻止することを言う。酵素活性の調節の内容において、阻止は、競合的、不競合的および非競合的阻害を含む、酵素活性の可逆的抑制または減少に関する。これは、ミカエリス・メンテン速度式の観点で分析され得る酵素の反応速度に対する阻害剤の効果によって、実験的に分類され得る。競合的阻害は、通常の基質と活性部位での結合について競合するように、阻害剤が遊離の酵素と結合し得るときに起こる。競合的阻害剤は、酵素と可逆的に反応して、酵素−基質複合体と類似する酵素−阻害剤複合体[ＥＩ]を形成する。

対照蛋白質またはそのフラグメントの生物学的活性に関して、用語“調節する”は、該蛋白質の発現量または他の生物学的活性を変化させることを言う。例えば、調節は、対照蛋白質の発現量の増大または減少、該蛋白質の酵素による修飾(例えばリン酸化)、結合特性(例えば他の分子への結合)、または、対照蛋白質の何らかの他の生物学的(例えば酵素による)、機能的または免疫学的性質の向上または減退を引き起こし得る。活性の変化は、例えば、対照蛋白質をコードする１種以上の遺伝子の発現、該蛋白質をコードするｍＲＮＡの安定性、翻訳効率の上昇または減少、または対照蛋白質の他の生物学的活性における変化により生じる。また、変化は、対照蛋白質を調節する他の分子(例えば対照蛋白質をリン酸化するキナーゼ)の活性によるものであってもよい。対照蛋白質の調節は、上方制御(すなわち活性化または刺激)であっても下方制御(すなわち阻害または抑制)であってもよい。対照蛋白質のモジュレーターの作用方法は、例えば蛋白質または蛋白質をコードする遺伝子に結合することによって、直接的であっても、あるいは、対照蛋白質を他の方法で調節する他の分子に結合すること、および／またはそれを修飾(例えば酵素によって)することによって、間接的であってもよい。

用語“対象”は、哺乳動物、特にヒトを含む。それはまた、他の非ヒト動物、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルを包含する。

用語“処置する”または“処置”は、腫瘍の増殖の阻止、および、腫瘍の部分的または完全な退縮を言う。用語“処置すること”は、疾患(例えば白血病)の症状、合併症または生化学的徴候の発現を予防または遅らせる、該疾患、状態または障害の症状を緩和する、または、さらなる進行を阻止または阻害する化合物または薬物の投与を含む。処置は予防(疾患の発症を予防または遅らせること、またはその臨床的または潜在的症状の顕在化を予防すること)であっても、疾患の顕在化後に症状の治療的抑制または緩和であってもよい。

本発明を実施するための形態
本発明は、細胞増殖の阻害および種々の癌の処置に有用であり得る組成物を提供する。

一つの局面において、本発明は、ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤およびＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を含む組成物であって、
該ＡＴＰ競合的阻害剤が、イマチニブ (STI571)、ニロチニブ (AMN107)、ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン化合物 (例えばダサチニブ)、ボスチニブ、３位置換ベンズアミド誘導体(例えばINNO-406)、AZD-0530、MK-0457、PHA-739358、AP24534 (Ariad)、JNJ-26483327(Johnson & Johnson)、HPK-61 (SuperGen)、SKS-927 (Wyeth)、AT-9283 (Astex Pharmaceuticals)、EXEL-2280 (Exelisis)、およびTG-100572 (Targegen)からなる群から選択され；
当該ＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、式(１)：

[式中、
Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４はそれぞれＣＨであるか；あるいは、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４のうちの１つがＮであって、それ以外がＣＨであり；
Ｒ^１は、ＯＣＦ_３またはＣＦ_３であり；
Ｒ^２は、Ｃ_１−６アルキルであり；
Ｒ^３は、ＮＲ(ＣＨ_２)_２ＮＲ^４Ｒ^５または５〜７員のヘテロ環式環であるか；あるいは、Ｒ^３は、アリールまたは５〜７員のヘテロアリールであり、それぞれは、所望により１〜２個のＲ^６基で置換されているか、あるいは所望によりアリールまたはヘテロアリール(それぞれは、所望により１〜２個のＲ^６ａ基で置換されている。)で置換されており；
ここで、Ｒ^６およびＲ^６ａは、独立して、ＣＯＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＯＲ^７、ＣＯＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^４Ｒ^５、ＣＯＮＲ^４Ｒ^５、ＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＯＲ^７、ＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^４Ｒ^５、ＳＯ_２ＮＲＲ^７、ＮＲ^４Ｒ^５またはＳＯ_２Ｒ^８であり；
Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
あるいは、Ｒ^４およびＲ^５は、ＮＲ^４Ｒ^５におけるＮと一体となって、５〜７員の環を形成してもよく；
ＲおよびＲ^７は、独立して、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
Ｒ^８は、Ｃ_１−６アルキルであり；
ｍは、０〜１であり；
ｎは、１〜４である。]
の化合物またはその薬学的に許容される塩
である組成物を提供する；ただし、当該ＡＴＰ非競合的阻害剤が、

であるとき、ＡＴＰ競合的阻害剤はイマチニブではない。

本発明はまた、癌、特にＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病を処置する方法であって、系または対象に、治療的に有効な量の上記のＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤およびＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を含む組成物を投与し、それによって、当該ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病を処置することを含む方法を提供する。例えば、本発明の組成物は、慢性骨髄性白血病または急性リンパ球性白血病を処置するために用いられ得る。

慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)は、脱制御されたチロシンキナーゼ活性を有する融合蛋白質ＢＣＲ−ＡＢＬを生じる染色体再配列によって引き起こされる血液学的障害である。イマチニブは、小分子ＡＢＬキナーゼ阻害剤であり、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合蛋白質の発現による構成的に活性なＡＢＬキナーゼ活性を有する初期の骨髄性白血病(ＣＭＬ)において非常に効果的な治療である。しかし、薬物耐性を起こすＡＢＬキナーゼドメインでの変異の発生のために、進行期および急性転化期の患者では、再発率が高い。

イマチニブ耐性を起こす変異は、通常、機能的ＡＢＬチロシンキナーゼドメインを有するＢＣＲ−ＡＢＬ蛋白質を生じるが、薬物の結合を抑制するまたは損なう変異である。ＢＣＲ−ＡＢＬにおける点変異は、直接的または間接的メカニズムの何れかによって、イマチニブの蛋白質への結合を減少させる。直接的なメカニズムの場合では、変異が、ＡＴＰの結合部位と一部重複しているイマチニブ結合部位周辺に集中しており、アミノ酸側鎖の変化の結果として、またはイマチニブ結合を立体的に妨げる構造的変化の結果として、イマチニブ結合を減少させる。変異したときにイマチニブ結合を阻害する残基の例は、Thr315およびPhe317である(Weisberg et al., Nat. Rev. Cancer 7:345-56 (2007))。

間接的メカニズムによってイマチニブ結合を阻害する変異は、薬物の標的蛋白質への特定の結合様式を利用するものである。イマチニブは、高度に保存されたAsp-Phe-Gly (DFG) の３組が活性なキナーゼのコンホメーションでの通常位置からはじき出されるＡＢＬキナーゼドメインの触媒的に不活性なコンホメーション(しばしば「ＤＦＧ−ｏｕｔ」コンホメーションと称される)に結合する。これにより、イマチニブのピペラジニル置換ベンズアミド部分により占拠される補助的結合部位を開口するThr315ゲートキーパー残基以外にチャネルが形成される(Weisberg et al., Nat. Rev. Cancer (2007), 上掲)。

ＣＭＬの臨床的な寛解は、ＡＴＰ部位を標的とする薬物であるイマチニブで達成されるが、多くの患者は、ＢＣＲ−ＡＢＬの阻害剤耐性型を発現するクローンの出現により再発する。耐性変異を克服する１つの戦略は、別の結合様式から効果および選択性を得る新規のＡＴＰ競合的阻害剤を設計することである。このアプローチは、T315Iを除く全ての既知の変異を回避することができるダサチニブおよびニロチニブの開発によって臨床的に確認された。T315I ＢＣＲ−ＡＢＬを標的とする化合物が開発されたが、ゲートキーパーの位置がキナーゼ阻害剤における最も重要な選択性決定因子の一つであるために、それらについて、適度なレベルの選択性を保持することは極めて難しい。例えば、２つの強力なＡＴＰ部位指向性薬物が臨床試験まで進んでいる：ニロチニブ (AMN107)およびダサチニブ (BMS-354825)。これらの化合物は共に、イマチニブへの耐性を誘発する変異の大部分を阻害するが、何れもＡＴＰ結合溝(binding cleft)の中央部に位置する“ゲートキーパー”T315Iの変異を阻害することはできない (Gorre et al., Science 293:876-880 (2001); O'Hare et al., Cancer Res. 65:4500-4505 (2005))。

他の戦略は、アロステリックにキナーゼ活性を制御し得る結合部位を利用するＡＴＰ非競合的阻害剤を見出すことである。それらは、ＡＴＰ競合的阻害剤ほど容易に見つけられず、そして特徴づけられないが、アロステリック阻害剤は、ｍＴｏｒ^１９、Ｍｅｋ^２０、Ａｋｔ^２１、ＩＫＫ^２２およびＣＡＭＫなどのキナーゼについて見出された。ＡＴＰ非競合的キナーゼ阻害剤の大きな利点は、それらが、非保存的キナーゼ制御メカニズムを利用できるために、特定のキナーゼについて非常に選択性であり得ることである。ＧＮＦ−２(Adrian et al., Nature Chem. Biol. 2:95-102 (2006))は、ＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換細胞に対して排他的細胞活性を示し(ＩＣ_５０＝１４０ｎＭ)、細胞アッセイにおいて他の４０種のチロシンキナーゼの活性を阻害せず、また８０種のキナーゼのパネルの生化学的活性を阻害しなかった。さらに、ＧＮＦ−２が独立の結合部位を占拠するため、ＡＴＰ競合的化合物と相乗的に作用する可能性がある。

ＧＮＦ−２が細胞のＢＣＲ−ＡＢＬを標的とすることが、細胞抽出物から、固定化された本阻害剤を用いたアフィニティー・クロマトグラフィーによりＢＣＲ−ＡＢＬを精製することによって、細胞のＢＣＲ−ＡＢＬ自己リン酸化および下流のＳｔａｔ５リン酸化の阻害を実証することによって、およびＢＣＲ−ＡＢＬのＡＴＰ部位に位置する変異(T315I)またはミリステート結合部位に位置する変異(A337NおよびA344L)が本化合物に対する耐性を誘発し得る能力によって示されている。ＧＮＦ−２がＢＣＲ−ＡＢＬ依存性細胞増殖を阻害する分子メカニズムをさらに解明するための第１段階として、我々は、ＮＭＲを用いて、ＧＮＦ−２のＡｂｌへの結合部位を確証し、特徴付けした。ミリストイル模倣剤およびＡＴＰ競合的阻害剤をＢＣＲ−ＡＢＬに同時に結合させることで、耐性付与変異の発生を減少させ、in vivoでの野生型およびT315I変異体ＢＣＲ−ＡＢＬ駆動細胞増殖の阻害をもたらす。

ＢＣＲ−ＡＢＬへのＧＮＦ−２結合におけるコンホメーション再配列および／または別の細胞補因子の動員が解明されていないが、ＧＮＦ−２は、ｃ−Ａｂｌでは正常に機能しているがＢＣＲ−ＡＢＬにおいてはＢｃｒドメインが融合しているために喪失している制御メカニズムを利用できるようである。下記の通り、ＡＴＰ競合的阻害剤およびミリステート標的阻害剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬに同時に結合することができ、このキナーゼの“閉じた”不活性なコンホメーションを協同的に安定化するようである。ＡＴＰ非競合的阻害剤はまた、点変異による阻害剤耐性の対象となるが、ＡＴＰ競合的阻害剤およびＡＴＰ非競合的阻害剤の組み合わせ適用が、単剤への継続した曝露に対する応答として生じる耐性クローンの数を減少させる。さらに、ＧＮＦ−５をニロチニブと組み合わせた処置は、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ変異体マウス骨髄移植モデルにおいて、疾患の完全寛解というin vivo での効果をもたらした。

Ａ. ＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤
ＡＴＰ結合部位から離れた部位を標的とすることによってＢＣＲ−ＡＢＬを阻害することが当技術分野で知られている種々のＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を、本発明を実施するために使用してよい。特定の態様において、本発明に使用するためのＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬのミリステート結合部位に結合する。本発明に使用するためのＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤の例は、WO 04/089286 (言及することによってその全体が本明細書に組み込まれる)に記載された化合物；および式(１)：

[式中、
Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は、それぞれＣＨであるか；またはＸ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４のうちの１つがＮであって、それ以外がＣＨであり；
Ｒ^１は、ＯＣＦ_３またはＣＦ_３であり；
Ｒ^２は、Ｃ_１−６アルキルであり；
Ｒ^３は、ＮＲ(ＣＨ_２)_２ＮＲ^４Ｒ^５または５〜７員のヘテロ環式環であるか；あるいは、Ｒ^３は、アリールまたは５〜７員のヘテロアリールであり、それぞれは、所望により１〜２個のＲ^６基で置換されているか、または、所望によりアリールまたはヘテロアリール(それぞれは、所望により１〜２個のＲ^６ａ基で置換されている。)で置換されており；
ここで、Ｒ^６およびＲ^６ａは、独立して、ＣＯＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＯＲ^７、ＣＯＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^４Ｒ^５、ＣＯＮＲ^４Ｒ^５、ＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＯＲ^７、ＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^４Ｒ^５、ＳＯ_２ＮＲＲ^７、ＮＲ^４Ｒ^５またはＳＯ_２Ｒ^８であり；
Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
あるいは、Ｒ^４およびＲ^５は、ＮＲ^４Ｒ^５におけるＮと一体となって、５〜７員の環を形成してもよく；
ＲおよびＲ^７は、独立して、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
Ｒ^８は、Ｃ_１−６アルキルであり；
ｍは、０〜１であり；
ｎは、１〜４である。]
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を含み、これらに限定されない。

表１は、ＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤として用いられ得る、式(１)を有する化合物の例を示す。
表１

Ｂ. ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤
ＡＢＬ阻害剤、ＡＢＬおよびＳｒｃファミリーのキナーゼの双方の阻害剤、および、オーロラキナーゼ阻害剤を含み、これらに限定されない、ＡＴＰ結合部位を標的とすることによってＢＣＲ−ＡＢＬを阻害することが当技術分野で知られている種々のＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を、本発明を実施するために使用してよい。

チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーは、細胞増殖、分化、移動および生存に関与する多数の細胞内シグナル伝達経路を調節し、その多くが、腫瘍形成、腫瘍転移および血管新生に関与している(Weisberg et al., Nat. Rev. Cancer 7:345-356 (2007))。Ｓｒｃファミリーの多くのキナーゼが、造血細胞で発現される (Blk、Fgr、Fyn、Hck、Lck、Lyn、c-SrcおよびYes)。さらに、ＢＣＲ−ＡＢＬは、Ｓｒｃキナーゼを、リン酸化によって、および単にＳｒｃ蛋白質を結合させることによって、活性化できることが示されている。さらに、イマチニブ耐性患者由来の細胞ライセートは、Ｌｙｎキナーゼを過剰発現することが見出されており、イマチニブ耐性について選択され、さらにＬｙｎを過剰発現するヒトの CML K562 細胞の増殖は、Ａｂｌ／Ｓｒｃ阻害剤であるPD180970によって阻害される。Ｓｒｃファミリーキナーゼは、ＢＣＲ−ＡＢＬシグナル伝達カスケードの下流の成分を制御するため、これらの酵素の阻害は、従って、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害と相乗作用を提供し、ＣＭＬ細胞がＢＣＲ−ＡＢＬ阻害に対抗して利用し得る別の生存経路の利用可能性を、潜在的に相殺するはずである。ＢＣＲ−ＡＢＬおよびＳｒｃファミリーキナーゼ阻害剤の組み合わせによる治療もまた、従って、ＣＭＬおよび／またはＡＬＬにおいて、薬物耐性変異型ＢＣＲ−ＡＢＬの発癌能を相殺するはずである (Manley et al., Biochim. Biophys. Acta 1754:3-13 (2005))。ダサチニブ (BMS-354825)、ボスチニブ (SKI-606)、INNO-404 (NS-187) および AZD05030は、デュアルＡＢＬ−Ｓｒｃ阻害剤の例である。

セリン／トレオニンキナーゼのオーロラファミリーは、有糸分裂の進行に重要である。オーロラ−Ａは種々のヒトの癌で過剰発現し、その過剰発現が、培養されたヒトおよび齧歯類の細胞において、異数性、中心体複製、および腫瘍の形質転換を誘発することが報告されている (Zhang et al., Oncogene 2004, 23:8720-30)。MK-0457 (Merck; 最初Vertex PharmaceuticalsによってVX-680として開発された)は、ナノモーラー範囲で３種全てのオーロラキナーゼおよびＦＬＴ３の強力な阻害剤であり、一定範囲の骨髄増殖性障害に関連する標的であるＡＢＬおよびＪＡＫ２の中程度から強力な阻害剤である。MK-0457はまた、マイクロモーラー未満の濃度で細胞増殖を阻害するが、形質転換したBa/F3細胞において、T315I変異ＢＣＲ−ＡＢＬの自己リン酸化を阻害し、約５μＭのＩＣ_５０を有する。

表２は、本発明を実施するために用いられ得るＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤の例を示し、イマチニブ (STI571)、ニロチニブ (AMN107)、ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン化合物(例えばダサチニブ)、ボスチニブ、３位置換ベンズアミド誘導体(例えばINNO-406)、AZD-0530、MK-0457、PHA-739358、AP24534 (Ariad)、JNJ-26483327(Johnson & Johnson)、HPK-61 (SuperGen)、SKS-927 (Wyeth)、AT-9283 (Astex Pharmaceuticals)、EXEL-2280 (Exelisis)およびTG-100572 (Targegen)を含む(例えば Weisberg et al., Nat. Rev. Cancer (2007), 上掲; Das et al., J. Med. Chem. 49:6819-6832 (2006); Puttini et al., Cancer Res. 66:11314-11322 (2006); Kimura et al., Blood 106:3948-3954 (2005); Hennequin et al., J. Med. Chem. 49:6465-6488 (2006)を参照のこと；それぞれは、言及することによって本明細書に組み込まれる。)。

表２

AT-9283 (Astex Therapeutics)、EXEL-2280 (Exelisis)、およびTG-100572 (TargeGen)。

Ｃ. 処置される疾患および状態
本発明の組み合わせ剤は、多様な癌を処置するために用いられ得る。一つの態様において、本発明は、白血病、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫(hairy cell lymphoma)、組織球性リンパ腫、およびバーキットリンパ腫を含む、リンパ系の造血性腫瘍；ならびに急性および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、および前骨髄球性白血病を含む骨髄系の造血性腫瘍の成長および増殖を阻害するためのＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤と組み合わせたＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を提供する。本発明の組み合わせ剤はまた、ＢＣＲ−ＡＢＬに関連することが知られている癌を処置するのに有用である。特定の態様において、本発明の組み合わせ剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性ＣＭＬおよびＡＬＬを処置するのに用いられ得る。

慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)は、主に骨髄中の骨髄細胞の増加し、そして未制御なクローン増殖によって特徴付けられる骨髄の癌である。その１年当たりの発生率は、１００,０００人に１〜２人であり、女性よりも男性の方が僅かに多く罹患する。ＣＭＬは、西洋において成人の白血病の全症例の約１５〜２０％を示し、米国またはヨーロッパにおいて、１年当たり約４,５００の新規症例がある(Faderl et al., N. Engl. J. Med. 341: 164-72 (1999))。

ＣＭＬは、フィラデルフィア転座ｔ(9/22)を有する１箇所形質転換された造血幹細胞(ＨＳＣ)または多能性前駆細胞(ＭＰＰ)から生じるクローン疾患である。この転座の遺伝子生成物である融合腫瘍遺伝子ＢＣＲ−ＡＢＬの発現は、白血病幹細胞(ＬＳＣ)プールおよび派生物を含む悪性造血の拡大、および、非悪性造血の抑制を引き起こす分子の変化を誘発する(Stam et al., Mol Cell Biol. 7:1955-60 (1987))。疾患の経過において、白血病幹細胞プールは拡大し、最終段階の急性転化では、ほぼ全てのＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞がフィラデルフィア転座を有する。

メシル酸イマチニブ (STI571, GLEEVEC(登録商標))は、ＣＭＬのための標準治療となりつつあり、９６％より高い応答率を有し、ＢＣＲ−ＡＢＬの活性を阻害することによって作用する。しかし、初期の成功にもかかわらず、ＢＣＲ−ＡＢＬの点変異獲得によって、患者は、最終的にメシル酸イマチニブに対する耐性を生じる。メシル酸イマチニブの限界の観点から、ＣＭＬを処置する改善された方法に対する要請がある。

さらに、本発明の組み合わせ剤は、膀胱癌(進行性および転移性膀胱癌を含む)、乳癌、大腸癌(結腸直腸癌を含む)、腎臓癌、肝臓癌、肺癌(小細胞肺癌および非細胞肺癌および肺腺癌を含む)、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、尿生殖器の癌、リンパ系の癌、直腸癌、喉頭癌、膵臓癌(膵外分泌腫瘍を含む)、食道癌、胃癌、胆嚢癌、子宮頚癌、甲状腺癌および皮膚癌(扁平上皮細胞癌を含む)を含む癌腫；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫およびシュワン腫を含む中枢神経系および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間葉系由来の腫瘍；ならびに、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形腫を含む他の腫瘍を処置するために用いられ得ることを意図している。本発明の組み合わせ剤は、肥満細胞症、胚細胞性腫瘍、小児肉腫、および他の癌を処置するために用いられ得ることも意図している。

本明細書に記載された治療法は、他の癌治療と組み合わせて用いてよい。例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤と組み合わせたＨｈアンタゴニストは、化学療法、放射線および／または手術などの任意の処置モダリティーに付属的に投与されてよい。例えば、それらは、１種以上の化学療法剤または免疫療法剤と組み合わせて用いられてもよく；そして他の処置レジメ(複数を含む)を終えた後に、用いられてもよい。本発明の組成物および方法で用いられ得る化学療法剤の例は、アントラサイクリン類、アルキル化剤 (例えばマイトマイシンＣ)、スルホン酸アルキル類、アジリジン類、エチレンイミン類、メチルメラミン類、ナイトロジェンマスタード類、ニトロソウレア類、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸アナログ(例えばジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、例えばメトトレキサート)、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、酵素、ポドフィロトキシン類、白金含有薬、インターフェロン類およびインターロイキン類を含み、これらに限定されない。

本発明の組成物および方法に用いられ得る既知の化学療法剤の特定の例は、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン(piposulfan)、ベンゾデパ(benzodepa)、カルボコン、メツレデパ(meturedepa)、ウレデパ(uredepa)、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、トリメチロロメラミン(trimethylolomelamine)、クロラムブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミン オキシド 塩酸塩、メルファラン、ノベンビキン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、アクラシノマイシン類、アクチノマイシンＦ(１)、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カルビシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノマイシン、６−ジアゾ−５−オキソ−１−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、デノプテリン(denopterin)、メトトレキサート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキサート、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン(thiamiprine)、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、テガフール、Ｌ−アスパラギナーゼ、パルモザイム、アセグラトン、アルドホスファミド グリコシド(aldophosphamide glycoside)、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル(bestrabucil)、ビサントレン(bisantrene)、カルボプラチン、シスプラチン、デホファミド(defofamide)、デメコルチン、ジアジクオン(diaziquone)、エフロルニチン(elfornithine)、酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)、エトグルシド、エトポシド、フルタミド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、レンチナン、ロニダミン、プレドニゾン、デキサメタゾン、ロイコボリン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット(phenamet)、ピラルビシン、ポドフィリン酸(podophyllinic acid)、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム(spirogermanium)、パクリタキセル、タモキシフェン、テニポシド、テヌアゾン酸、トリアジコン、２,２',２''−トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、および、ビンデシンを含み、これらに限定されない。

本方法は、原発型、再発型、形質転換型、または不応型の癌を処置するために用いられ得る。癌が再発した患者は、しばしば、化学療法、放射線療法、骨髄移植、ホルモン療法、手術などを含む１種以上の処置を受けている。このような処置に応答する患者は、安定、部分応答(すなわち、少なくとも５０％まで腫瘍または癌マーカーレベルが減少する)、または、完全応答(すなわち、腫瘍およびマーカーが検出できなくなる)を示し得る。これらのシナリオの何れでも、癌はその後、癌の再発を意味する再出現し得る。

Ｄ. 医薬組成物および投与
本発明の組成物は、滅菌処理された条件下で、処置が必要な対象に、単独で投与され得る。特定の態様において、それは、医薬組成物の有効成分として投与される。本発明の医薬組成物は、１種以上の許容される担体と共に、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤と組み合わせて、有効量のヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含み得る。本組成物はまた、上記の第３の治療薬、例えば化学療法剤または他の抗癌剤を含んでもよい。

薬学的な担体は、組成物を向上させるまたは安定化させるか、あるいは、本組成物の製造を容易にする。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物(例えば核酸、蛋白質または他のタイプの化合物)によって、ならびに、本組成物の投与に用いられる特定の方法によって、一部決定される。それらはまた、他の成分と融和性であって、対象に有害でないという意味で、薬学的かつ生理学的に許容されるべきである。それらは、投与、例えば経口、舌下、直腸、鼻腔または非経腸投与に望ましい製剤の形態に依存して、多様な形態をとり得る。例えば、抗腫瘍化合物は、投与前に、安定性または薬理学的性質を向上させるために、担体蛋白質、例えばオボアルブミンまたは血清アルブミンと複合体を形成させてもよい。

本発明の医薬組成物の多様な適切な製剤がある(例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20^th ed., 2000を参照のこと。)。限定しないが、薬学的に許容される担体は、特に、糖蜜、水、等張性食塩水、５％ブドウ糖水溶液または緩衝酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウム溶液、油脂、グリセリン、アルコール類、風味剤、保存料、着色料、澱粉、糖類、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、および結合剤を含む。担体はまた、徐放性物質、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを単独でまたは蝋と共に含み得る。

医薬組成物は、種々の形態、例えば顆粒剤、錠剤、丸薬、坐剤、カプセル剤、懸濁液、軟膏、外用水薬などで製造され得る。製剤中の治療的に活性な化合物の濃度は、約０.１〜１００重量％で変化し得る。治療用製剤は、製薬業界で周知の何れかの方法によって製造される。例えばGilman et al., eds., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20^th ed., 2000; Avis et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, published by Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1993; Lieberman et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, published by Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1990; および Lieberman et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, published by Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1990を参照のこと。

治療用製剤は、処置に用いられ得る任意の有効な手段によって送達され得る。投与される特定の抗腫瘍剤に依存して、適切な手段は、経口、鼻腔、肺投与、または、血流への非経腸注入(皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む)を含む。非経腸投与において、本発明の抗腫瘍剤は、多様な方法で製剤化され得る。モジュレーターの水溶液は、ポリマービーズ、リポソーム、ナノ粒子または当業者に既知の他の注射可能なデポー製剤中に封入され得る。さらに、本発明の化合物はまた、リポソーム中に封入され得る。組成物は、その溶解度に依存して、水相および油相の双方に存在してもよく、一般的にリポソーム懸濁液と称されるものの中に存在してもよい。疎水層は、一般的に、しかし排他的ではなく、リン脂質、例えばレシチンおよびスフィンゴミエリン、ステロイド、例えばコレステロール、多かれ少なかれイオン性の界面活性剤、例えばジアセチルホスフェート、ステアリルアミン、またはホスファチジン酸および／または疎水性の他の物質を含む。

治療用製剤は、簡便には、単位投与形で提供されてもよく、適当な治療投与量で投与されてもよい。適当な治療投与量は、何れかの周知の方法、例えば最大耐容性投与量を決定するための哺乳動物での臨床試験および平常なヒトの対象での安全投与量を決定するための臨床試験によって決定されてもよい。より高い投与量が必要とされる特定の状況を除いて、本発明の抗腫瘍剤の投与量は、通常、約０.００１から約１０００mgの範囲であり、より一般的には、約０.０１から約５００mg/日である。抗腫瘍剤の投与量および投与方法は、処置医によって個々に精査され得る要因、例えば処置される１種または複数種の状態、特定の抗腫瘍剤を含む投与されるべき組成物の選択、対象の年齢、体重および応答、対象の症状の重症度、および選択された投与経路に依存して、患者毎に変わり得る。一般的なルールとして、投与される抗腫瘍剤の量は、有効かつ確実に対象の状態を予防または最小化する最少投与量である。従って、上記の投与量範囲は、一般的な指針を提供し、かつ本明細書における教示を支持することを意図しているが、本発明の範囲を限定することを意図しない。

実施例
下記の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、本発明を限定するものではない。全ての動物実験は、the US National Institutes of Health Statement of Compliance with Standards for Humane Care and Use of Laboratory Animalsに従っている。全てのＮＭＲ測定は、２９６Ｋで、Bruker AV600 NMR spectrometerで、プロトン共鳴振動数 ６００MHzで、Strauss et al., J. Biomol. NMR 31:343-349 (2005)に記載された通りに行う。

実施例１
一般的な物質および方法
Ａｂｌ結晶学
結晶は、Nagar et al. (Cancer Res 62, 4236-43 (2002))に記載された通りに、表３Ａに記載した条件を用いて成長させた。７日間４℃で過剰量のＧＮＦ−２に浸漬した後、beamline PXII (Swiss Light Source)で、単結晶からデータを集めた。

最終モデルにおけるリガンド−蛋白質相互作用の統計の精密化および明細を、表３Ｂおよび３Ｃに列挙する。表３Ｃは、蛋白質とリガンドの間の距離が３.８Å以下であることを示す。３.８Åより長い距離のものは列挙していない。

野生型および変異体ＢＣＲ−ＡＢＬ Ba/F3細胞増殖アッセイ
種々の濃度の単剤または組み合わせ剤で４８時間処置した後の野生型および変異体ＢＣＲ−ＡＢＬ発現Ba/F3細胞の生存能力を、AlamarBlue(登録商標)(TREK Diagnostic Systems)還元法によって決定した。組み合わせ指数(ＣＩ)を、Chou および Talalay¹⁵ の方法に従って、the Calcusyn softwareを用いて計算した。

ＧＮＦ−２およびイマチニブに耐性のクローンの選択
化合物耐性Ba/F3.p210クローンの出現を、von Bubnoff, N. et al., Blood 105, 1652-9 (2005)に記載された通りに評価した。化合物濃度または組み合わせ毎に１つの９６ウェル・プレートを用い、３〜４日毎に培地を入れ替えた。プレートを２１日間インキュベートし、明らかに細胞増殖が見られたウェルの数を、９日目および２１日目に記録した。

マウスにおける薬物動態学的パラメーター
オスのBalb/c マウスに、ＧＮＦ−５を、ＰＥＧ４００／食塩水(１：１)中、５mg/kgの静脈内投与で、または２０mg/kgの経口投与で投与した。任意の時点での化合物の血漿濃度を、液体クロマトグラフィー／質量分析(ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ)によって決定した。薬物動態学的パラメーターを、非コンパートメント回帰分析によって、Winnonlin 4.0 software (Pharsight, Mountain View, CA, USA)を用いて計算した。

Ba/F3.p210異種移植片モデルにおけるin vivoでの有効性
６〜８週齢のメスのＳＣＩＤベージュマウス(ＧＮＦ−５処置群またはビークル・コントロール群それぞれについてｎ＝５)の尾の静脈に、１×１０^６個のBa/F3細胞共発現ＢＣＲ−ＡＢＬ p210およびルシフェラーゼを注射した。注射後３日目に、マウスに、経口で、１日２回、５０または１００mg/kg ＧＮＦ−５を７日間投与した。５日目および７日目に、バイオルミネセンスを、ルシフェリンおよびIVIS imaging system (Xenogen Corp., Alameda, CA)を用いて定量した。

骨髄形質導入／移植モデルにおけるin vivoでの有効性
５−ＦＵを注射した６〜８週齢のオスのBalb/cマウスから採取した骨髄細胞を、pMSCV ＢＣＲ−ＡＢＬ野生型または T315I ＢＣＲ−ＡＢＬレトロウイルス構築物と共に形質導入し、放射線照射されたレシピエントのメスのBalb/cマウス(６〜８週齢)に移植した。ＧＮＦ−５、ニロチニブまたはビークル・コントロールでの処置は、移植後７日目(野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ)または１５日目(T315I)に開始し、７日間行った(処置群あたり１０匹(野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ)または４匹(T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ))。血液細胞数および脾臓サイズを処置７日目に測定した。骨髄細胞を単離し、固定化し、透過処理し、抗ｐＳｔａｔ５および抗ルシフェラーゼ抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。

生存試験において、ビークル、ＧＮＦ−５、ニロチニブまたは両者の組み合わせでの処置(１群当たりｎ＝５匹のマウス)を、移植後１１日目に開始し、移植後５０日目まで、または、マウスを瀕死になったために屠殺するまでの長期に及ぶ。総生存数および再発までの時間をカプラン・マイヤー法によって決定した。統計学的有意性を、カプラン・マイヤー生存率分析を用いて、分散推定値で標準化した比率の正規分布の仮定の下に評価した(α＝0.05, 両側)。

実施例２
３−[６−(４−トリフルオロメトキシ−フェニルアミノ)−ピリミジン−４−イル]−ベンズアミド(ＧＮＦ−２)

４,６−ジクロロピリミジン(１ｇ, ６.７mmol)を、ｐ−トリフルオロメトキシアニリン(１.２ｇ, ６.７mmol)と共に、１５mlのエタノール中に溶解し、次いで１.７５mlのＤＩＥＡ(１０mmol)を加える。反応を、還流下で２時間行い、室温まで冷却する。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(ＥＡ／ヘキサン＝３：７)によって精製し、(６−クロロ−ピリミジン−４−イル)−(４−トリフルオロメトキシ−フェニル)−アミンを白色の固体として得る。

０.４Ｍ 炭酸ナトリウム水溶液(１.３ml)およびアセトニトリル(１.３ml)中の、(６−クロロピリミジン−４−イル)−(４−トリフルオロメトキシフェニル)−アミン(７３mg, ０.２５mmol)および(３−アミノカルボニルフェニル)−ボロン酸(４２mg, ０.２５mmol)の脱気した溶液に、ＰＰｈ_３(１５mg, ０.０１mmol)を加える。約９０℃で、Ｎ_２下、１２時間撹拌した後、該反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ_３と、ＣＨＣｌ_３／２−プロパノール(４：１)の層間に分配する。水層を、さらなるＣＨＣｌ_３／２−プロパノール(４：１)で抽出し、合わせた有機層を、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた黄色がかった油状物を、カラムクロマトグラフィー(ＳｉＯ_２, 酢酸エチル)によって精製し、３−[６−(４−トリフルオロメトキシフェニル−アミノ)−ピリミジン−４−イル]−ベンズアミドを、白色の固体として得る。
MS m/z 375.10(M+1).

ＧＮＦ−２はＡｂｌのＣ末端ミリステートポケットに結合する
ＧＮＦ−２が、Ａｂｌのカルボキシ末端に位置するミリステート結合ポケットに結合するという提案の支持として、ｃ−Ａｂｌ １ｂのＮ末端アミノ酸２−１６に対応するＮ−ミリストイル化ペプチドは、ＧＮＦ−２アフィニティーマトリックスからＡｂｌを外すことが、以前に実証されている。ミルストイル裂け目の入口(A337N)および背面(A344L)に位置する残基への変異導入は、ＧＮＦ−２耐性を付与するがイマチニブ耐性を付与しないことも実証されている(Adrian et al., Nat. Chem Biol. 2:95-102 (2006))。

独立の生物物理学的方法によってＧＮＦ−２のＡｂｌへの結合部位を確かめるために、核磁気共鳴スペクトル(ＮＭＲ)を用いて、ＧＮＦ−２のＡｂｌ／イマチニブ複合体の結合を調べた。リガンド結合は、結合ポケットの近接部分での化学シフトの変動を引き起こす。非標識イマチニブと複合体形成した^１５Ｎ標識Ａｂｌにより得られた、完全に割り当てられたＨＳＱＣスペクトルを用いて、ＧＮＦ−２は、ミリステート結合ポケット付近に集中して化学シフト摂動を誘発することが示された。ＡＴＰポケットにおいては、有意な化学シフト摂動が観察されなかった。このことは、ＧＮＦ−２が、ＡＴＰ部位での結合においてイマチニブを妨害しないことを示している。ミリスチン酸は、質的に同じパターンの化学シフト摂動を誘発することが見出されており、このことは、ＧＮＦ−２およびミリステートが、同じ結合部位を共有するというさらなる証拠を提供する。

ＧＮＦ−２をＡｂｌにタイトレートしたときに、該タンパク質のミリステートポケット近くのメチル基の化学シフトを追跡するＮＭＲ試験により、ＧＮＦ−２におけるイマチニブ／Ａｂｌ複合体への解離定数が、全長触媒ドメイン(残基２２９−５１５；Ａｂｌ １ａナンバリング)を用いたならば０.５±０.１μＭであり、へリックスＩを含まないＡｂｌのＣ末端切断型イマチニブ／Ａｂｌ複合体(残基２２９−５００)を用いたならば、７.４±１.５μＭであることが示された。後者の構築物への親和性の低下は、おそらくミリステートポケットと一列に並ぶ、ＧＮＦ−２との相互作用に関与しているヘリックスＩによるものである。従って、ＧＮＦ−２のＡｂｌへの結合部位は、ミリステートポケットであることが示されている。

ＧＮＦ−２はT315I Ａｂｌに結合する
ＢＣＲ−ＡＢＬのＡＴＰ結合溝に位置するT315I ゲートキーパー変異は、細胞アッセイでＧＮＦ−２に対する耐性を付与するが、この変異は、ＧＮＦ−２のミリステートポケットへの結合をブロックしないと予測される。我々は、T315I Ａｂｌ(残基２２９−５００, へリックスＩを含まず)でのＮＭＲをベースとする滴定試験を行い、１３.５±１.８μＭという２倍減少した親和性を有するにもかかわらず、ＧＮＦ−２が、このＡｂｌ変異体に結合することを実証した。

ＧＮＦ−２の、Ａｂｌのミリストイル・ポケットへの結合は、さらに、結晶学によって確認された。Ａｂｌ／イマチニブ／ＧＮＦ−２複合体の構造は、過剰のＧＮＦ−２中に、Nagar et al. (Cell 112, 859-71 (2003))に記載された通りに得たＡｂｌ／イマチニブ／ミリステートの結晶を浸漬することによって得られる。電子密度の形状に基づいて、ＧＮＦ−２は、結晶中で、ミリストイル化ペプチドを置き換える。非対称ユニットに２つの分子が存在し、一方のミリステート部位は完全に占有され、他方では部分的に占有されている。

ＧＮＦ−２は、ミリステートポケット中にトリフルオロメチル基がミリステートリガンドの末端の２個の炭素と同じ深さで埋まっている、広がったコンホメーションで結合する。１個のフッ素原子とL340の主鎖の間の、好ましいがおそらく弱い極性の相互作用が存在し(ニロチニブとＡｂｌのAsp381の間で観察されるものと同様)、水が介在する水素結合が存在するが、蛋白質との直接的水素結合は存在しない。水分子は、アニリンのＮＨと、結晶中の完全におよび部分的に占有された両方のミリステート結合部位のA433およびE462の主鎖のカルボニルの間に水素結合架橋を形成する。予測される通り、ＧＮＦ−２と該蛋白質の間の相互作用の大部分は疎水的である。ポケットの基部でＧＮＦ−２と接触する残基は、αＥのL341とA344、αＦのI432、αＨのV468、αＩのF493およびαＩ'のI502である。ポケットの中心部分の表面は、αＥのA337、αＨの開始部のC464とP465、αＦのA433およびαＩ'のV506によって形成される。ポケットの開口部(αＦのY435, αＨの前のループのE462およびαＩ'の末端のL510)での相互作用は、より小さく、これは弱い電子密度に、従って、ＧＮＦ−２のベンズアミド部分の動きやすさに反映される。これらの残基のうち３つの変異(C464Y、P465SおよびV506L)は、おそらく立体的な理由のために、ＧＮＦ−２の結合に対する抵抗性を引き起こすことが見出されている。この領域で見出された他の２つの変異(F497LおよびE505K)は、結合部位を形成する残基の第２のシェル中にあり、間接的に好ましくない立体効果を有する可能性がある。

Ａｂｌキナーゼドメインの全体構造は、４ÅまでシフトしているF497とS501の間の残基の位置を除いて、ミリステート複合体の構造と類似している。これは、該構造のこの部分と結晶中の近傍分子の間の結晶の接触による。ミリステート結合部位への影響は全くないが、ＳＨ２ドメインのへリックスαＡとぶつかるようにＳＨ２ドッキング表面は変化する。また、Ｃ末端ローブに対してキナーゼのＮ末端ローブが非常に小さく回転しているが、これは、ミリストイル化ペプチドの置き換えによる、結晶充填の僅かな変化によるものであろう。Ａｂｌ／イマチニブ複合体をＡｂｌ／イマチニブ／ミリステート複合体と比較したとき、これらのローブの相対的配向にはほとんど差異はない。また、これらの構造の何れにもＡＴＰ部位に変化はなく、その全てイマチニブが結合している。

さらに、細胞性ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤としての活性を与える構造的特徴の系統的な調査を、ミリステート結合部位への結合との関連で調べた。これらの試験により、ピリミジン Ｃ４は多様な置換基を許容し、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤としての細胞性抗力は、メタ位またはパラ位置換フェニルの何れかで、例えばメタ−カルボキサミド(３−ＣＯＮＨ_２(ＧＮＦ−２)、３−ＣＯＮＨ(ＣＨ_２)_２ＯＨ (ＧＮＦ−５)、スルホン(ＳＯ_２ＣＨ_３)およびスルホンアミド(ＳＯ_２ＮＨＲ)で得られることが明らかとなった。

活性のためのメカニズムは本発明を実施するためには必要ではないが、１つの興味深い観察は、中心のピリミジンについての４,６位置換の必要性が、ＡＴＰ競合的キナーゼ阻害剤の必要性と異なっていることであり、ＡＴＰ競合的キナーゼ阻害剤では、一般的に２,４−ピリミジンがキナーゼヒンジ領域に結合するモチーフとして好ましい。このことは、２,４−ピリミジンがＮＨ−Ｃ２結合に対してｃｉｓ位のコンホメーションをとることができ、そして、このコンホメーションがキナーゼヒンジ領域に二座で水素結合を形成することができる結果であると考えられている。ＧＮＦ−２シリーズの化合物がＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤ではなかったことを考えると、４,６−ピリミジンの重要性は、活性のためにはｔｒａｎｓ配置という結果であろう。この仮説を調べるために、４−トリフルオロメトキシアニリン環のオルト位とｃｉｓ配置のピリミジン−Ｃ５の間の立体的相互作用の可能性から、ｃｉｓ配置またはｔｒａｎｓ配置に対する異なる優先性を示す一連の構造類似化合物を製造した。これらの化合物のＢＣＲ−ＡＢＬ活性の評価は、トランス位のコンホメーションに優先性であるもののみが活性であったことを実証した(表４)。トランス位のコンホメーションはまた、続いて決定された共結晶構造と一致しており、このことは、このコンホメーションが、狭い疎水性ミリステート結合部位にリガンドを適合させるために必要とされることを実証している。

表４

ＧＮＦ−２およびイマチニブの組み合わせは、クローン発現薬物耐性変異型ＢＣＲ−ＡＢＬの出現を減少させる
ＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換Ba/F3細胞(Ba/F3.p210)は、活性部位に対するイマチニブの親和性を減少させ、臨床的に観察される多くの変異を再現する点変異の結果として、イマチニブ耐性を獲得できる。ＧＮＦ−２およびイマチニブがＢＣＲ−ＡＢＬに同時に結合する能力と一致して、当該２種の化合物の組み合わせがＢＣＲ−ＡＢＬ依存性増殖を相乗的に阻害し得ることが以前に実証された。我々は、ＢＣＲ−ＡＢＬ依存性Ba/F3細胞がＧＮＦ−２とイマチニブの組み合わせに耐性となる頻度をそれぞれの化合物単独と比較して調べた。Ba/F3.p210細胞を１μＭ イマチニブ、または、５もしくは１０μＭ ＧＮＦ−２と共にインキュベーションして、９日目に耐性クローンが出現した(図１)。１μＭ イマチニブに耐性があるクローンの数は、それぞれ５および１０μＭのＧＮＦ−２と組み合わせた場合に、９日目で９８および１００％、２１日目で９０〜９２％減少した。これらの結果は、ＧＮＦ−２とイマチニブの組み合わせが、協同的に耐性変異の出現を抑制し得ることを実証している。

組み合わせ処置から出現する変異を同定するために、我々は、耐性クローン中のＢＣＲ−ＡＢＬについてｃＤＮＡコーディングを一部配列決定した(キナーゼフラグメントQ108-D325およびW430-R564)。配列決定分析により、ＧＮＦ−２／イマチニブ組み合わせに対する耐性クローンの５９％に別の単一点変異が存在することが明らかとなった。これらのうち、F317L置換およびQ252H置換は、イマチニブに対する耐性を付与することが以前に報告されている。しかし、ミリステート結合ポケットに位置するP465S、E505KおよびF497Lもまた同定され、これらは、ＧＮＦ−２のこの部位への結合を立体的に妨げると考えられる。

実施例３
Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)−３−(６−(４−(トリフルオロメトキシ)フェニルアミノ)ピリミジン−４−イル)ベンズアミド (ＧＮＦ−５)
ＤＭＦ(０.５ml)中の、３−[６−(４−トリフルオロメトキシ−フェニルアミノ)−ピリミジン−４−イル]−安息香酸(８１mg, ０.２２mmol)、エタノールアミン(１６mg, ０.２６mmol)およびジ−イソプロピルエチルアミン(８４mg, ０.６５mmol)の溶液に、２−(１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウラニウム(ＨＡＴＵ)(９９mg, ０.２６mmol)を、室温で加える。該反応混合物を室温で４時間撹拌し、フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー(ＳｉＯ_２, ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ(v/v)＝２０／１)によって精製し、Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)−３−(６−(４−(トリフルオロメトキシ)フェニルアミノ)ピリミジン−４−イル)ベンズアミドを白色の固体として得る。
MS m/z 419.2 (M+1).

マウスにおけるＧＮＦ−５薬物動態学的パラメーター
Balb-Cマウスへ２０mg/kg経口投与した後、ＧＮＦ−５は、血液循環に素早く現れ、０.５時間で４.４±１.３μＭの最大濃度に達し、７時間後に０.６３±０.１２μＭまで減少し、最終的な半減期は２.３時間であり(図２)；経口バイオアベイラビリティーは４４.８±７.５％であった。異種移植片モデルにおける有効性試験に用いたＳＣＩＤマウスにおいて、血漿における薬物動態学的プロフィールは、正常なマウスで観察されるものと類似していた。

表５に薬物動態学的パラメーターを示す：ＡＵＣ＝曲線下面積(曝露測定)、Ｃ_ｍａｘ＝最大血漿濃度、Ｔ_ｍａｘ＝最大血漿濃度時間、Ｃ_ｌａｓｔ＝最終測定時間点での濃度、Ｔ_1/2＝血漿濃度が最高濃度の半分に達するのに必要な時間、Ｖ_ｓｓ＝分配体積、Ｆ＝経口バイオアベイラビリティーの百分率。
表５

ＣＭＬのマウス異種移植片モデルにおいてＧＮＦ−５はin vivoでの効果を示す
我々は、マウスの骨髄増殖性疾患モデルにおいて、in vivoでのＧＮＦ−５の抗腫瘍活性を評価した。疾患は、ＳＣＩＤベージュマウスにおいて、、疾患の負荷を、ルシフェリン注射後に、非侵襲性造影によって、Xenogen IVIS(商標) systemを用いて評価できるように野生型p210 ＢＣＲ−ＡＢＬおよび蛍ルシフェラーゼを発現させたBa/F3細胞の接種によって確立した。予測された通り、薬物処置を受けていないコントロール群の動物では、腫瘍負荷は増大し続けた。対照的に、５０または１００mg/kgの何れかのＧＮＦ−５の１日２回経口投与処置は、第１週以内に腫瘍の負荷の実質的な用量応答減少をもたらした。５０または１００mg/kgの１日２回のＧＮＦ−５による処置後５日目に、応答は均衡状態に近づき、それぞれ１６および７％の腫瘍／コントロール(Ｔ／Ｃ)に達した。応答は、１００mg/kgの群(Ｔ／Ｃ＝１７％)では７日目まで維持されたが、５０mg/kg、１日２回のレジメでは、初期応答に続いて、再発が起こった(６６％のＴ／Ｃ)(図３Ａ)。

in vivoでの標的調節を調べるために、Ba/F3.p210を有するマウスを、ＧＮＦ−５(１００mg/kg)またはビークルの１回投与で処置した。骨髄を、３時間後、７時間後および２４時間後に採取し、ホスホ−Ｓｔａｔ５の量について、特異的なホスホ-Y694抗体を用いるフローサイトメトリーで分析した。ｐＳｔａｔ５量の有意な減少は、ＧＮＦ−５の１回用量の送達後７時間以内に観察された。Ｓｔａｔ５のホスホリル化は著しく阻害され、下流のＢＣＲ−ＡＢＬシグナル伝達の遮断を示した。これらの結果は、ＢＣＲ−ＡＢＬ依存性細胞増殖の阻害はin vivoにおいて良好な耐容性を示す用量で達成され得るが、残りの細胞集団は、処置で生き残ることを実証している。

ＧＮＦ−５とニロチニブの組み合わせはT315I ＢＣＲ−ＡＢＬ依存性増殖を阻害し得る
ＧＮＦ−５は、E255Vに対する細胞有効性(ＩＣ_５０＝３８０ｎＭ)およびM351T変異体に対する細胞有効性(ＩＣ_５０＝９３０ｎＭ)を維持しているが、G250E変異体に対する活性(ＩＣ_５０＝４．５２μＭ)、F317L変異体に対する活性(ＩＣ_５０＞１０μＭ)およびT315I変異体に対する活性(ＩＣ_５０＞５μＭ)は有意に低い。ニロチニブは、T315I(ＩＣ_５０＞１０μＭ)⁵を除いて、これらの全ての変異体に強力な活性を示す。ＧＮＦ−２およびイマチニブが野生型およびT315I Ａｂｌに同時に結合し得ることが証明されたＮＭＲおよび等温熱量測定試験(データ示さず)を励みとし、我々は、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ依存性細胞増殖に対するＧＮＦ−５とニロチニブの併用効果、および、下流の基質Ｓｔａｔ５のホスホリル化の阻害を蛍光活性化細胞分別(ＦＡＣｓ)によって試験した。増殖アッセイは、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ依存性細胞増殖の５０％以上の阻害が、ＧＮＦ−５とニロチニブの濃度範囲で達成されることを実証し、組み合わせ指数¹⁵(ＣＩ)は０.６と計算され、これは中程度の相乗作用を示す(図３Ｂ)。例えば、ニロチニブ濃度を２０μＭに固定したとき、ＧＮＦ−５は、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ依存性増殖を０．７６μＭのＩＣ_５０で阻害する。

我々はまた、フローサイトメトリー分析によって、ＧＮＦ−５とニロチニブが、Ｓｔａｔ５ホスホリル化阻害に相加的に作用することも実証した。例えば、１０μＭ ニロチニブのみまたは１μＭ ＧＮＦ−５のみは、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ介在Ｓｔａｔ５ホスホリル化に対して全く効果がなく、一方、２つの化合物の組み合わせは、Ｓｔａｔ５ホスホリル化の有意な阻害をもたらし、これはＩＬ−３を培地に添加することによってレスキューされ得る。我々は、ＧＮＦ−５とニロチニブの間で観察される協同性が、ＡＴＰ部位のT315Iおよびミリステート部位のE505Kの二重変異の両阻害剤の組み合わせに対する完全な耐性を付与する能力に基づき、ＢＣＲ−ＡＢＬの阻害によって直接的に媒介されることを確認した(図３Ｃ)。

ＧＮＦ−５とニロチニブの組み合わせはT315I ＢＣＲ−ＡＢＬに対してin vivoでの効果を示す
ヒトのＣＭＬ疾患をより厳密に模倣する骨髄形質導入／移植マウスモデルを用いて、野生型およびT315I ＢＣＲ−ＡＢＬに対するＧＮＦ−５の in vivoでの効果を実証した(Roumiantsev et al., Proc Natl Acad Sci U S A 99, 10700-5 (2002)を参照のこと。)。最初の実験において、予め５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)で処置したドナーのマウス由来の骨髄細胞を、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬレトロウイルスベクターで形質導入し、放射線照射したレシピエントのマウスに移植した。移植後７日目に、５０mg/kgのＧＮＦ−５を１日２回またはビークルからなる投与レジメで、７日間投与を行った。処置の最終日に測定した末梢血細胞数は高く、ビークル処置マウスで９５％の好中球または芽細胞であり、ＣＭＬ様疾患の発症と一致していた。対照的に、ＧＮＦ−５処置マウスは、正常な血液細胞数を示した。ビークル群の脾臓サイズは、正常なマウスのものと比較して、３から４倍まで増大し(正常脾臓重量：８０〜９０mg)、一方、ＧＮＦ−５処置マウスの脾臓重量は正常であった。

ＧＮＦ−５とニロチニブの組み合わせがT315I ＢＣＲ−ＡＢＬ変異体(ルシフェラーゼ)骨髄移植モデルに効果を有するか否かを評価するために、移植後１５日目に、ニロチニブ ５０mg/kgのみ、ＧＮＦ−５ ７５mg/kgのみ、または組み合わせの１日２回の投与レジメで、処置を開始した。処置開始後７日目に、種々の投与群の脾臓サイズと血液細胞数を測定した。ニロチニブのみまたはＧＮＦ−５のみの何れかで処置したマウスはビークル群と比較して、有意な応答を示さず、健康なマウスより２〜３倍大きい細胞数および４倍大きい脾臓サイズを有した。両化合物の組み合わせは、毒性の徴候なしで、血液細胞数および脾臓サイズを正常化し(図４Ａおよび４Ｂ)、このことは、該化合物の組み合わせ処置における相加的効果を示唆している。

効果／薬物動態学的応答相関関係を確立するために、種々のマウス群由来の骨髄細胞を有効性試験の最後に単離し、抗ｐ−Ｓｔａｔ５および抗ルシフェラーゼ特異的抗体で染色した。ルシフェラーゼ・ゲート内のｐ−Ｓｔａｔ５陽性細胞の数を、フローサイトメトリーで定量した。ｐ−Ｓｔａｔ５陽性ＢＣＲ−ＡＢＬ発現骨髄細胞のパーセンテージは、ビークル処置群、ＧＮＦ５処置群およびニロチニブ処置群で類似していた(約２５％)。組み合わせ群では、ｐ−Ｓｔａｔ５陽性細胞のパーセンテージは、約６％であり、腫瘍増殖阻害とＢＣＲ−ＡＢＬシグナル伝達遮断の間の相関関係を反映した。阻害の程度を決定するために、組み合わせ(５０mg/kgのニロチニブ＋７５mg/kgのＧＮＦ−５)またはビークルの１回投与でマウスを処置し、投与後３時間、７時間、１６時間および２４時間で、骨髄細胞を集め、抗ルシフェラーゼおよび抗ｐＳｔａｔ５抗体で二重染色した。ビークル群において、約８０％のルシフェラーゼ陽性細胞がホスホリル化Ｓｔａｔ５を有していた。投与３時間後、Ｓｔａｔ５のホスホリル化は８０％から２５％まで減少し、７から２４時間の間ｐＳｔａｔ５陽性細胞の数が１０％以下に維持され、このことは、ＧＮＦ−５／ニロチニブ組み合わせ投与後のＢＣＲ−ＡＢＬ介在シグナル伝達の強力かつ継続的阻害を実証している(図４Ｃ)。

第３の実験において、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ形質導入骨髄を移植し、そしてＧＮＦ−５、ニロチニブまたは両化合物の組み合わせで処置したマウスの生存をモニターした。T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ形質導入骨髄を移植し、そしてビークル・コントロールで処置したマウスは、移植後２４日目までに死亡し、生存期間中央値は２２日であった(図４Ｄ)。ＧＮＦ−５(７５mg/kg、１日２回)は、ビークル処置コントロールと比較して、有意に生存日数を延長した(中央値 ２８日)(Ｐ＝０.０２３)。ニロチニブ(５０mg/kg、１日２回)のみで処置したマウスもまた、ビークルで処置されたものより長く生存した(中央値 ３２日)(Ｐ＝０.０２３)。ＧＮＦ−５＋ニロチニブで処置したマウスの全生存は、ＧＮＦ−５のみ(Ｐ＝０.００２)またはニロチニブのみ(Ｐ＝０.００２)の何れかで処置したものと比較して改善され、移植後５０日目まで全マウスが生存し、その後処置を中止した。組み合わせ処置終了４６日後、生存していた５匹のマウスのうち４匹が疾患の徴候を示さなかった。累積的に、これらの結果は、ＡＴＰ競合的阻害剤とアロステリック阻害剤の組み合わせは、T315I ＢＣＲ−ＡＢＬ変異体を標的とするために治療的に適切な戦略であることを示唆している。

本明細書に記載された実施例および態様は、例示の目的のためのみであって、これらを踏まえた種々の修正または変更は、当業者に示唆されており、かつ、本明細書および添附された請求の範囲の精神および範囲内に含まれると理解される。本明細書で引用された全ての公報、特許、特許明細書、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列受入番号および他の文献は、言及することによって、その全体が、全ての目的について、これらの文献のそれぞれが個別にそのように示されているのと同程度で、本明細書に組み込まれる。

Claims (22)

1. ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤およびＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤の組み合わせを含む組成物であって、
   当該ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、
   

   

   

   AT-9283 (Astex Therapeutics)、EXEL-2280 (Exelisis)、または、TG-100572 (TargeGen)であり；
   当該ＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、遊離形または薬学的に許容される塩形の式(１)：
   

   

   [式中、
   Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４はそれぞれＣＨであるか；あるいは、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４のうちの１つがＮであって、それ以外がＣＨであり；
   Ｒ^１は、ＯＣＦ_３またはＣＦ_３であり；
   Ｒ^２は、Ｃ_１−６アルキルであり；
   Ｒ^３は、ＮＲ(ＣＨ_２)_２ＮＲ^４Ｒ^５または５〜７員のヘテロ環式環であるか；あるいは、Ｒ^３は、アリールまたは５〜７員のヘテロアリールであり、それぞれは、所望により１〜２個のＲ^６基で置換されているか、または、所望によりアリールまたはヘテロアリール(それぞれは、所望により１〜２個のＲ^６ａ基で置換されている。)で置換されており；
   ここで、Ｒ^６およびＲ^６ａは、独立して、ＣＯＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＯＲ^７、ＣＯＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^４Ｒ^５、ＣＯＮＲ^４Ｒ^５、ＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＯＲ^７、ＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^４Ｒ^５、ＳＯ_２ＮＲＲ^７、ＮＲ^４Ｒ^５またはＳＯ_２Ｒ^８であり；
   Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
   Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
   あるいは、Ｒ^４およびＲ^５は、ＮＲ^４Ｒ^５におけるＮと一体となって、５〜７員の環を形成してもよく；
   ＲおよびＲ^７は、独立して、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
   Ｒ^８は、Ｃ_１−６アルキルであり；
   ｍは、０〜１であり；
   ｎは、１〜４である。]
   の化合物
   である組成物；ただし、当該ＡＴＰ非競合的阻害剤が、
   

   

   であるとき、当該ＡＴＰ競合的阻害剤はイマチニブではない。
2. ＡＴＰ非競合的阻害剤が、ＢＣＲ−ＡＢＬのミリステート結合部位に結合する、請求項１に記載された組成物。
3. ＡＴＰ非競合的阻害剤が、式(２)：
   

   

   [式中、Ｒ^９が、メタ位またはパラ位に存在し、カルボキサミド、ＣＯＮＨ(ＣＨ_２)_２ＯＨ、スルホン(ＳＯ_２ＣＨ_３)、または、スルホンアミド(ＳＯ_２ＮＨＲ)である。]
   の化合物である、請求項１に記載された組成物。
4. 式(１)におけるＸ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４が、それぞれＣＨである、請求項１に記載された組成物。
5. 式(１)におけるＲ^１がＯＣＦ_３である、請求項１に記載された組成物。
6. 式(１)におけるＲ^３が、モルホリニル、イミダゾリルまたはピリジルであり、そして当該ピリジルが、所望により１個のＲ^６ａ基で置換されており、Ｒ^６ａが請求項１で定義した通りである、請求項１に記載された組成物。
7. Ｒ^３がフェニルであって、所望によりメタ位またはパラ位で１個のＲ^６基で置換されており；Ｒ^６が請求項１で定義した通りである、請求項１に記載された組成物。
8. 式(１)におけるＲ^３がＮＲ(ＣＨ_２)_２ＮＲ^４Ｒ^５であり、Ｒ^４およびＲ^５が、Ｎと一体となって、モルホリニルを形成する、請求項１に記載された組成物。
9. 式(１)の化合物が、
   

   

   

   

   からなる群から選択される、請求項１に記載された組成物。
10. 式(１)の化合物が、
    

    

    である、請求項９に記載された組成物。
11. ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、イマチニブ、ニロチニブまたはダサチニブである、請求項１に記載された組成物。
12. ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤がニロチニブであり、式(１)の化合物が、
    

    

    である、請求項１に記載された組成物。
13. 細胞または対象に、ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤およびＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を含む治療的に有効な量の組成物を投与することを含む、ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病を処置する方法であって、
    当該ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、
    

    

    

    AT-9283 (Astex Therapeutics)、EXEL-2280 (Exelisis)、または、TG-100572 (TargeGen)であり；
    当該ＡＴＰ非競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、遊離形または薬学的に許容される塩形の式(１)：
    

    

    [式中、
    Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は、それぞれＣＨであるか；あるいは、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４のうちの１つがＮであって、それ以外がＣＨであり；
    Ｒ^１は、ＯＣＦ_３またはＣＦ_３であり；
    Ｒ^２は、Ｃ_１−６アルキルであり；
    Ｒ^３は、ＮＲ(ＣＨ_２)_２ＮＲ^４Ｒ^５または５〜７員のヘテロ環式環であるか；あるいは、Ｒ^３は、アリールまたは５〜７員のヘテロアリールであり、それぞれは、所望により１〜２個のＲ^６基で置換されているか、または、所望によりアリールまたはヘテロアリール(それぞれは、所望により１〜２個のＲ^６ａ基で置換されている。)で置換されており；
    ここで、Ｒ^６およびＲ^６ａは、独立して、ＣＯＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＯＲ^７、ＣＯＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^４Ｒ^５、ＣＯＮＲ^４Ｒ^５、ＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＯＲ^７、ＮＲ(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^４Ｒ^５、ＳＯ_２ＮＲＲ^７、ＮＲ^４Ｒ^５またはＳＯ_２Ｒ^８であり；
    Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
    Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
    あるいは、Ｒ^４およびＲ^５は、ＮＲ^４Ｒ^５におけるＮと一体となって、５〜７員の環を形成してもよく；
    ＲおよびＲ^７は、独立して、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
    Ｒ^８は、Ｃ_１−６アルキルであり；
    ｍは、０〜１であり；
    ｎは、１〜４である。]
    の化合物
    である方法；ただし、当該ＡＴＰ非競合的阻害剤が、
    

    

    であるとき、当該ＡＴＰ競合的阻害剤はイマチニブではない。
14. ＡＴＰ競合的阻害剤およびＡＴＰ非競合的阻害剤が相乗効果を示す、請求項１３に記載された方法。
15. ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病が、慢性骨髄性白血病または急性リンパ球性白血病である、請求項１３に記載された方法。
16. ＡＴＰ非競合的阻害剤が、ＢＣＲ−ＡＢＬのミリステート結合部位に結合する、請求項１３に記載された方法。
17. 式(１)の化合物が、
    

    

    

    

    からなる群から選択される、請求項１３に記載された方法。
18. 式(１)の化合物が、
    

    

    である、請求項１７に記載された方法。
19. ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、イマチニブ、ニロチニブまたはダサチニブである、請求項１３に記載された方法。
20. ＡＴＰ競合的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤がニロチニブであり、当該式(１)の化合物が、
    

    

    である、請求項１３に記載された方法。
21. ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病を処置する医薬の製造における、請求項１〜１２の何れか１項に記載された組成物の使用。
22. ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病が、慢性骨髄性白血病、または、急性リンパ球性白血病である、請求項２１に記載された使用。

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