JP2011505122A - 平衡転座切断点のｄｎａマイクロアレイベースの同定とマッピング - Google Patents

Abstract

比較ゲノムハイブリダイゼーションを使用して、種々の疾患に関連する染色体再編成を検出およびマッピングする方法を開示する。公知のゲノム遺伝子座の転座パートナーを同定する方法、および転座切断点を決定する方法が含まれる。本発明の方法は、染色体再編成を伴う疾患の予後、診断、および素因の決定に使用され得る。本発明の方法の別の実施形態では、公知のゲノム遺伝子座が特定の疾患または疾患状態に関連する遺伝子座に対応する。ある実施形態では、疾患が癌である。特定の実施形態では、癌は、骨髄性白血病などの白血病である。

Description

（関連出願に対する相互参照）
該当なし
（連邦政府による援助を受けた研究開発の下で成された発明に対する権利に関する陳述）
本発明は、ＮＣＩ助成金番号５Ｐ３０ＣＡ０１５７０４の下で政府の援助を受けて成された。政府は本発明における特定の権利を有する。

（コンパクトディスクにて提出された「配列表」、表、またはコンピュータプログラムの補遺に対する参照）
該当なし

平衡再編成（転座および逆位）およびゲノム不均衡（欠失、重複、および増幅）を含む大規模ゲノム異常は、癌において一般的であり、腫瘍形成に中心的な役割を果たす。ゲノム欠失は、典型的には、腫瘍抑制遺伝子機能の喪失、プロトオンコジーンの過剰発現を伴う増幅、および新規な腫瘍形成遺伝子融合の生成または調節解除されたオンコジーン発現を伴う転座と関連している。歴史的に、平衡転座および遺伝子融合は、肉腫、白血病、およびリンパ腫を含む血液腫瘍および間葉腫瘍に圧倒的に多く見られ（非特許文献１）、カルシノーマなどの上皮性腫瘍ではあまり見られない。より最近では、腫瘍形成性遺伝子融合は、前立腺（非特許文献２）、甲状腺（非特許文献３；非特許文献４）、および肺（非特許文献５）において同定されており、腫瘍形成性遺伝子融合は、恐らくはこれらの腫瘍が細胞遺伝学的に複雑であるためまたは他の技術的な理由のため、これまでに理解されていたよりもカルシノーマに一般的であることが示唆されている（非特許文献６）。

大規模異常の解析は、新規なプロトオンコジーン、腫瘍抑制遺伝子、および腫瘍形成性遺伝子融合を同定することによって、腫瘍形成に関する我々の理解を一変させた。マイクロアレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイ−ＣＧＨ／ａＣＧＨ）技術の進歩は、癌におけるゲノム不均衡に関するデータの指数関数的な蓄積をもたらしており、かつてないほど高い分解能でそれらをマッピングすることができる。少数の転座は、アレイＣＧＨにより同定することができる一方のまたは両方の切断点に小さな欠失を有している。しかしながら、そのような不均衡は通常は検出可能ではなく、存在したとしても、別のパートナー遺伝子の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示さない。

今では、構造的変異はヒト集団にわたる遺伝子多型の重要な供給源と認められている（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。染色体欠失またはセグメント重複のようなコピー数多型（ＣＮＶ）は、これまで報告されている最も一般的な構造的多型を表しており、ヒト疾患または疾病素因に関連している（非特許文献１１；非特許文献１２）。平衡染色体再編成を識別するための方法は、ＣＮＶを検出するための方法より遅れているが、染色体逆位およびより複雑な再編成は、構造的および機能的多型の重要な供給源としてますます認められており、ヒト疾患とも関連している（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。

ゲノム不均衡の検出に利用できる方法と比較すると、現在のところ、平衡再編成を検出するように設計された方法は限定されている。従来の細胞遺伝学的解析および多色（またはスペクトル）核型分析は、大規模ゲノム異常を同定するための強力な全ゲノム技術であるが、これらの方法は、多大の労力を要し、培養中に細胞の増殖が必要であり、分解能が限られている（約５００万ｂｐ）。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、少数のゲノム遺伝子座をより高い分解能（典型的には１００〜１０００ｋｂ）で解析することができるが、ＦＩＳＨは、容易に拡張可能ではなく、融合パートナーに関する予備的知識が必要である。アレイペインティングでは（非特許文献１８）、フロー分類された異常染色体からＤＮＡが増幅され、ＣＧＨアレイにハイブリダイズされ、転座切断点を高分解能でマッピングすることが可能になる（非特許文献１９）。しかしながら、この技術は広く利用可能ではなく、培養中に増殖することができる細胞に限定されている。

染色体転座の同定および特徴付けをさらに複雑にするのは、転座に関与する遺伝子が、異なる転座および異なるタイプの腫瘍において様々なパートナー遺伝子に融合していることが見出される場合があるという点で「乱交雑である」と認識されることが多くなっているという事実である（非特許文献２０）。顕著な例には、混合系統白血病（ＭＬＬ）遺伝子（非特許文献２１）、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座（非特許文献２２、およびＥＴＶ６（非特許文献２３）が含まれており、それらの各々は、種々の転座における２０以上の異なるゲノム遺伝子座とパートナーになることが可能である。結果的に、様々な分子的方法が開発され、パートナーの１つが判明しているかまたは推測できる場合、平衡転座における未知の融合パートナー遺伝子が同定されている。これらの技術には、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）（非特許文献２４）、長距離インバース（ＬＤＩ）ＰＣＲ（非特許文献２５；非特許文献２６）、およびアレイに基づく融合転写の検出（非特許文献２７；非特許文献２８）が含まれる。繰り返しになるが、これらの技術は、全て多大の労力を要し、スループットに制限があリ、臨床試料の日常分析には適さない。

Ｒａｂｂｉｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ ３７２巻（６５０２号）：１４３頁（１９９４年） Ｔｏｍｌｉｎｓ、Ｒｈｏｄｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０巻（５７４８号）：６４４〜６４８頁（２００５年） Ｂｏｎｇａｒｚｏｎｅ、Ｂｕｔｔｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４巻（１１号）：２９７９〜２９８５頁（１９９４年） Ｋｒｏｌｌ、Ｓａｒｒａｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９巻（５４８３号）：１３５７〜１３６０頁（２０００年） Ｓｏｄａ、Ｃｈｏｉら、Ｎａｔｕｒｅ ４４８巻（７１５３号）：５６１頁（２００７年） Ｍｉｔｅｌｍａｎ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３６巻（４号）：３３１頁（２００４年） Ｂａｎｓａｌ、Ｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７巻（２号）：２１９〜２３０頁（２００７年） Ｋｏｒｂｅｌ、Ｕｒｂａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻（５８４９号）：４２０〜４２６頁（２００７年） Ｈｕｒｌｅｓ、Ｄｅｒｍｉｔｚａｋｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４巻（５号）：２３８〜２４５頁（２００８） Ｋｉｄｄ、Ｃｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４５３巻（７１９１号：５６〜６４頁（２００８年） Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｋｕｌｋａｒｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０巻（５７１４号）：１４３４〜１４４０頁（２００５年） Ｈｏｌｌｏｘ、Ｈｕｆｆｍｅｉｅｒら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４０巻（１号）：２３頁（２００８年） Ｆｅｕｋ、ＭａｃＤｏｎａｌｄら、ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １巻）（４号）：ｅ５６頁（２００５年） Ｔｕｒｎｅｒ、Ｓｈｅｎｄｕｒｅら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈ ３巻（６号）：４３９頁（２００６年） Ｂａｎｓａｌ、Ｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７巻（２号）：２１９〜２３０頁（２００７年） Ｆｌｏｒｅｓ、Ｍｏｒａｌｅｓら、ＰＮＡＳ １０４巻（１５号）：６０９９〜６１０６頁（２００７年） Ｋｉｄｄ、Ｃｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４５３巻（７１９１号：５６〜６４頁（２００８年） Ｆｉｅｇｌｅｒ、Ｇｒｉｂｂｌｅら、Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４０巻（９号）：６６４〜６７０頁（２００３年） Ｇｒｉｂｂｌｅ、Ｋａｌａｉｔｚｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４４巻（１号）：５１〜５８頁（２００７年） Ｃｌｅａｒｙ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２９巻（１３号）：９５８〜９５９頁（１９９３年） Ｍｅｙｅｒ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０巻（５号）：７７７頁（２００６年） ＷｉｌｌｉｓおよびＤｙｅｒ、Ｂｌｏｏｄ ９６巻（３号）：８０８〜８２２頁（２０００年） Ｂｏｈｌａｎｄｅｒ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５巻（３号）：１６２〜１７４頁（２００５年） Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｄｕｓｈら、ＰＮＡＳ ８５巻（２３号）：８９９８〜９００２頁（１９８８年） Ｏｃｈｍａｎ、Ｇｅｒｂｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２０巻（３号）：６２１〜６２３頁（１９８８年） Ｗｉｌｌｉｓ、Ｊａｄａｙｅｌら、Ｂｌｏｏｄ ９０巻（６号）：２４５６〜２４６４頁（１９９７年） Ｎａｓｅｄｋｉｎａ、Ｄｏｍｅｒら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８７巻（４号）：３６３〜７２頁（２００２年） Ｍａｒｏｃ、Ｍｏｒｅｌら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １８巻（９号）：１５２２〜３０頁（２００４年）

したがって、染色体異常、特に平衡転座の日常検出を可能にする改良方法が必要とされている。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たす。

比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）法は、染色体不均衡を強力に検出することが証明されているが、これまでのＣＧＨ方法は、一般的には、他の腫瘍のなかでもリンパ腫および白血病を含む種々の癌の病因および診断に顕著な役割を果たす相互転座のような平衡ゲノム再編成を検出することが不可能である。これまでのＣＧＨ法が平衡転座を検出できないのは、これらの方法が検査試料と参照試料との間の相対的差異の検出に依存するのに対し、平衡転座は染色体物質の純減少または増加に帰着せず、したがって同じ相対量が維持されるという事実に、少なくとも部分的には起因する。

これらの制限を克服し、検出することができる染色体異常の範囲を拡張するために、本発明者らは、転座ＣＧＨ（ｔＣＧＨ）、超高分解能で平衡転座切断点を同定することができる方法を開発した。本発明は、部分的には、公知のゲノム遺伝子座および転座パートナーの配列に及ぶプローブを生成する線形増幅反応において、公知のゲノム遺伝子座の配列に特異的なプライマーを使用することに基づく。検査試料から生成されたプローブのハイブリダイゼーションのパターンおよび程度を、参照試料に由来する類似プローブのハイブリダイゼーションと比較することにより、公知のゲノム遺伝子座の転座パートナーの同定が可能になる。タイリング密度マイクロアレイ（ｔｉｌｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）などの高密度マイクロアレイの使用は、転座の切断点の高分解能マッピングを可能にする。

下記でより詳細に記述されているように、本発明者らは、連結（Ｊ_Ｈ）セグメントおよび反復スイッチ組換え（Ｓ_Ｈ）領域内に生じるものを含む、最も一般的なタイプのＩｇＨ転座を検出するｔＣＧＨの能力を実証する。公知の転座切断点は、分析された各細胞系で同定されており、それらには、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）、およびＭＹＣ転座、ならびにこれらの遺伝子座を伴う複雑で潜在的なＩｇＨ再編成が含まれていた。ｔＣＧＨの有用性は、５つのマントル細胞リンパ腫および前リンパ球性リンパ腫において、新規なＣＣＮＤ１切断点、現在までに報告されている最も大きなそのような系統をマッピングおよびクローニングすることによりさらに実証される。さらに、多重ｔＣＧＨ解析を使用して、種々の骨髄性白血病に関連している幾つかの共通した転座が検出される。

したがって、１つの実施形態では、本発明は、検査試料の公知のゲノム遺伝子座での染色体再編成を決定する方法であって、（ａ）検査試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離すること、（ｂ）公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第１の検出可能な標識を含む増幅された検査ＤＮＡ産物を生成すること、および公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第２のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第２の検出可能な標識を含む増幅された参照ＤＮＡ産物を生成すること、（ｃ）増幅された検査ＤＮＡ産物および参照ＤＮＡ産物を、ゲノムＤＮＡ配列を含むＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせること、ならびに（ｄ）ＤＮＡマイクロアレイへの、増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションのパターンおよび程度を、増幅された参照ＤＮＡ産物と比較することによる方法であり、公知のゲノム遺伝子座のＤＮＡマイクロアレイエレメントとは異なるＤＮＡマイクロアレイエレメントへの、線形増幅された検査試料ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、線形増幅された参照試料ＤＮＡ産物を上回ることが、細胞における、公知のゲノム遺伝子座の、第２のゲノム遺伝子座との再編成を示す方法を提供する。

第２の実施形態では、本発明は、検査試料の公知のゲノム遺伝子座の染色体再編成パートナーを同定する方法であって、（ａ）検査試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離すること、（ｂ）公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第１の検出可能な標識を含む増幅された検査ＤＮＡ産物を生成すること、および公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第２のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第２の検出可能な標識を含む増幅された参照ＤＮＡ産物を生成すること、（ｃ）標識および増幅された検査ＤＮＡ産物および参照ＤＮＡ産物を、ゲノムＤＮＡ配列を含むＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせること、ならびに（ｄ）ＤＮＡマイクロアレイへの、増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションのパターンおよび程度を、増幅された参照ＤＮＡ産物と比較することによる方法であり、公知のゲノム遺伝子座のＤＮＡマイクロアレイエレメントとは異なるＤＮＡマイクロアレイエレメントへの、線形増幅された検査試料ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、線形増幅された参照試料ＤＮＡ産物を上回ることが、ＤＮＡマイクロアレイのそのエレメントを公知のゲノム遺伝子座の再編成パートナーとして同定する方法を提供する。

第３の実施形態では、本発明は、検査試料の公知の遺伝子座における、染色体再編成ならびに染色体転座を同時に決定する方法であって、（ａ）検査試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離すること、（ｂ）公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅を実施して、検査ゲノムＤＮＡおよびプライマー特異的な増幅された検査ＤＮＡ産物の混合物を生成すること、および同じ前記公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第２のゲノムＤＮＡの線形増幅を実施して、参照ゲノムＤＮＡおよびプライマー特異的な増幅された参照ＤＮＡ産物の混合物を生成すること、（ｃ）検査試料混合物および参照試料混合物を、オリゴヌクレオチドでプライミングされたポリメラーゼ媒介性の伸長によって、さらに増幅および標識化すること、（ｄ）標識および増幅された検査ＤＮＡ産物および参照ＤＮＡ産物を、ゲノムＤＮＡ配列を含むＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせること、ならびに（ｅ）ＤＮＡマイクロアレイへの、増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションのパターンおよび程度を、増幅された参照ＤＮＡ産物と比較することによる方法であり、（ｉ）ＤＮＡマイクロアレイのエレメントに、増幅された検査ＤＮＡ産物および増幅された参照ＤＮＡ産物の両方がハイブリダイズする場合、エレメントへの、増幅された参照ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションの程度と比較して、ＤＮＡマイクロアレイのエレメントへの、増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションの程度がより大きいことが、マイクロアレイのエレメントによって表される検査試料中のＤＮＡ配列の増幅を示し、（ｉｉ）ＤＮＡマイクロアレイのエレメントへの、増幅された参照ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、ＤＮＡマイクロアレイのエレメントへの、増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションを上回ることが、マイクロアレイのエレメントによって表される検査試料のＤＮＡ配列の欠失を示し、（ｉｉｉ）公知のゲノム遺伝子座のＤＮＡマイクロアレイエレメントとは異なるＤＮＡアレイのエレメントへの、増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、ＤＮＡアレイエレメントへの、増幅された参照ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションを上回ることが、細胞における、公知のゲノム遺伝子座の、第２のゲノム遺伝子座との転座を示す方法を提供する。

上記の実施形態の態様では、上記方法は、増幅されたＤＮＡ産物にハイブリダイズする、公知のゲノム遺伝子座の線形配列に対応する一連のエレメントのうちの最後のエレメントを決定し、それによって、公知のゲノム遺伝子座の再編成切断点のおおよその位置を同定する、さらなるステップを含む。

上記の実施形態の別の態様では、上記方法は、増幅されたＤＮＡ産物にハイブリダイズする、公知のゲノム遺伝子座の線形配列とは異なる第２のゲノム遺伝子座の線形配列に対応する一連のエレメントの最初のエレメントを決定し、それによって転座パートナーの再編成切断点のおおよその位置を同定する、さらなるステップを含む。

上記の実施形態の追加的な態様では、検査および参照試料は同じゲノムＤＮＡを含み、参照試料ではなく検査試料がパート（ｂ）部分の線形増幅ステップに供される。

上記の実施形態のさらに追加的な態様では、第１および第２の検出可能な標識が同じであり、増幅された検査ＤＮＡ産物および参照ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、別々であるが同じ種類のマイクロアレイへのもの、または逐次的に同じマイクロアレイへのものである。

さらに別の特定の実施形態では、本発明の方法は、第１の試料ＤＮＡのみの増幅および検出を含み、その後、所定の参照読取りまたは検出と比較される。

第４の実施形態では、本発明は、検査試料中の染色体再編成を決定する方法であって、（ａ）検査試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離すること、（ｂ）公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅を実施して、増幅された検査ＤＮＡ産物（Ｔ＋）を生成すること、公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第２のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、増幅された参照ＤＮＡ産物（Ｎ＋）を生成すること、公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを除外することによって、第１のゲノムＤＮＡ試料の擬似線形増幅を実施して、擬似検査ＤＮＡ産物（Ｔ−）を生成すること、および公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを除外することによって、第２のゲノムＤＮＡ試料の擬似線形増幅を実施して、擬似参照ＤＮＡ産物（Ｎ−）を生成すること、（ｃ）ランダムプライマーを使用するプライマー伸長によって、Ｔ＋、Ｎ＋、Ｔ−、およびＮ−を、異なる検出可能な標識で標識すること、（ｄ）Ｔ＋およびＮ＋を、ゲノムＤＮＡ配列を含む第１のＤＮＡマイクロアレイに共ハイブリダイズさせること、（ｅ）Ｔ−およびＮ−を、ゲノムＤＮＡ配列を含む第２のＤＮＡマイクロアレイに共ハイブリダイズさせること、（ｆ）第１のＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルのパターンおよび程度を、第２のＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルのパターンおよび程度と比較することによる方法であり、第２のマイクロアレイからの類似パターンがない場合、第１のマイクロアレイからの染色体位置に対してプロットされたハイブリダイゼーションシグナルの散布図における直角三角形パターンのハイブリダイゼーションシグナルが、染色体転座を示し、垂直辺（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｌｅｇ）が染色体転座切断点を標示し、第１のマイクロアレイおよび第２のマイクロアレイからの同位置の染色体位置に対してプロットされたハイブリダイゼーションシグナルの散布図における長方形パターンのハイブリダイゼーションシグナルが、染色体重複または欠失を示し、垂直辺が重複または欠失したゲノム領域の２つの末端点を標示し、それによって検査試料中の染色体再編成の決定を提供する方法を提供する。

第５の実施形態では、本発明は、検査試料中の染色体再編成を決定する方法であって、（ａ）検査試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離すること、（ｂ）公知のゲノムの遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅を実施して、増幅された検査ＤＮＡ産物（Ｔ＋）を生成し、公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第２のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施し、増幅された参照ＤＮＡ産物（Ｎ＋）を生成すること、公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを除外することによって、第１のゲノムＤＮＡ試料の擬似線形増幅を実施して、擬似検査ＤＮＡ産物（Ｔ−）を生成すること、公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを除外することによって、第２のゲノムＤＮＡ試料の擬似線形増幅を実施して、擬似参照ＤＮＡ産物（Ｎ−）を生成すること、（ｃ）ランダムプライマーを使用するプライマー伸長によって、Ｔ＋、Ｎ＋、Ｔ−、およびＮ−を、異なる検出可能な標識で標識すること、（ｄ）ゲノムＤＮＡ配列を含む第１のＤＮＡマイクロアレイに、Ｔ＋およびＴ−を共ハイブリダイズさせること、（ｅ）ゲノムＤＮＡ配列を含む第２のＤＮＡマイクロアレイに、Ｎ＋およびＮ−を共ハイブリダイズさせること、（ｆ）第１のＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルのパターンおよび程度を、第２のＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルのパターンおよび程度と比較することによる方法であり、第２のマイクロアレイからの類似パターンがない場合、第１のマイクロアレイからの染色体位置に対してプロットされたハイブリダイゼーションシグナルの散布図における直角三角形パターンのハイブリダイゼーションシグナルが、染色体転座を示し、垂直辺が染色体転座切断点を標示し、第１のマイクロアレイおよび第２のマイクロアレイの両方に共通の染色体位置に対してプロットされたハイブリダイゼーションシグナルの散布図におけるハイブリダイゼーションシグナルのパターンが擬似切断点を示し、それによって、検査試料中の染色体再編成の決定を提供する方法を提供する。

第６の実施形態では、本発明は、被験体における疾患を診断する方法であって、その疾患が染色体再編成に起因し、（ａ）被験体から生体試料を取得すること、（ｂ）生体試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離すること、（ｃ）上記疾患に関連する公知のゲノムの遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第１の検出可能な標識を含む増幅された検査ＤＮＡ産物を生成し、公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、第２のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第２の検出可能な標識を含む増幅された参照ＤＮＡ産物を生成すること、（ｄ）増幅された検査ＤＮＡ産物および参照ＤＮＡ産物を、ゲノムＤＮＡ配列を含むＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせること、ならびに（ｅ）ＤＮＡマイクロアレイへの、増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションのパターンおよび程度を、増幅された参照ＤＮＡ産物と比較することによる方法であり、公知のゲノムの遺伝子座のＤＮＡマイクロアレイエレメントとは異なるＤＮＡマイクロアレイエレメントへの、線形増幅された検査試料ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、線形増幅された参照試料ＤＮＡ産物を上回ることが、ＤＮＡマイクロアレイのエレメントを公知のゲノム遺伝子座の再編成パートナーとして同定し、再編成パートナーの同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が、被験体における疾患の診断を提供する方法を提供する。

上記の実施形態の一部の態様では、染色体再編成が転座である。上記の実施形態の他の態様では、染色体再編成が、染色体逆位、または１つの染色体遺伝子座に由来するＤＮＡ断片の、第２の異なる染色体遺伝子座への挿入である。本発明の他の実施形態では、上記方法は、欠失、重複、増幅、および逆位から選択される染色体異常を検出することをさらに含む。ある実施形態では、複数のタイプの染色体異常の検出が同時に実施される。他の実施形態では、複数のタイプの染色体異常の検出が逐次的に実施される。

上記の実施形態の他の態様では、第１および第２の検出可能な標識が、増幅中に組み込まれるか、またはそうでなければ増幅後に組み込まれる。

上記の実施形態の他の態様では、第１および第２の検出可能な標識は、Ｃｙ３およびＣｙ５が含まれ得る蛍光標識である。

上記の実施形態のさらなる態様では、ＤＮＡマイクロアレイがタイリング密度ＤＮＡマイクロアレイである。

上記の実施形態の別の態様では、公知のゲノム遺伝子座は免疫グロブリン遺伝子に対応する。

本発明の方法の別の実施形態では、公知のゲノム遺伝子座が特定の疾患または疾患状態に関連する遺伝子座に対応する。ある実施形態では、疾患が癌である。特定の実施形態では、癌は、骨髄性白血病などの白血病である。

上記の実施形態の一部の態様では、検査試料の細胞が腫瘍細胞であり、参照試料の細胞が正常細胞であり、腫瘍細胞はリンパ腫または白血病細胞である。

上記の実施形態の一部の態様では、検査試料の細胞が一個体に由来する正常または異常細胞であり、参照試料が第２の個体に由来する正常または異常細胞であり、染色体再編成は、検査試料中に存在するが参照試料には存在しないか、または参照試料中に存在するが検査試料には存在しない転座、逆位、欠失、重複、挿入、または他の複雑な再編成である。

（ａ）Ｊ_Ｈおよびスイッチ反復領域を示すＩｇＨ遺伝子座；（ｂ）Ｊ_Ｈプライマーを使用した線形増幅；（ｃ）Ｓ_５（Ｓ_γαε）プライマーを使用した線形増幅；（ｄ）典型的な転座ＣＧＨ（ｔＣＧＨ）実験の概略を例示する図である。 公知のＩｇＨ転座切断点を有する細胞系のｔＣＧＨデータを例示する図である。（ａ）ＤＨＬ１６細胞系のＪ_Ｈ−ＢＣＬ２切断点（マイナークラスター領域）；（ｂ）ＭＣ１１６細胞系のＪ_Ｈ−ＭＹＣ切断点；（ｃ）Ｕ２６６細胞系のＳ_α−ＣＣＮＤ１切断点；（ｄ）ＯＣＩ−Ｌｙ８細胞系のＳ_γ−ＢＣＬ６切断点。 （ａ）ＲＬ７細胞系のＪ_Ｈ−ＢＣＬ２切断点およびＢＣＬ２欠失の解析を例示する図である。（ｉ）ＲＬ７＋Ｊ_Ｈ（Ｃｙ３）／正常＋Ｊ_Ｈ（Ｃｙ５）−切断点および欠失；（ｉｉ）ＲＬ７−Ｊ_Ｈ（Ｃｙ３）／正常−Ｊ_Ｈ（Ｃｙ５）−欠失のみ；（ｉｉｉ）ＲＬ７＋_ＪＨ（Ｃｙ３）／ＲＬ７−Ｊ_Ｈ（Ｃｙ５）−切断点のみ。パート（ｂ）部分は、上記の３つ全ての実験について、ＲＬ７／ＢＣＬ２アレイデータのオーバーレイを例示する。パート（ｃ）は、ＭＯ２０５８細胞系のＪ_Ｈ−ＣＣＮＤ１切断点およびＣＣＮＤ１重複／欠失の解析を例示する：（ｉ）ＭＯ２０５８＋Ｊ_Ｈ（Ｃｙ３）／正常＋Ｊ_Ｈ（Ｃｙ５）−切断点および重複／欠失；（ｉｉ）ＭＯ２０５８−Ｊ_Ｈ（Ｃｙ３）／正常−Ｊ_Ｈ（Ｃｙ５）−重複／欠失のみ；（ｉｉｉ）ＭＯ２０５８＋Ｊ_Ｈ（Ｃｙ３）／Ｇｒａｎｔａ−Ｊ_Ｈ（Ｃｙ５）−切断点のみ。パート（ｄ）は、上記の３つ全ての実験について、ＭＯ２０５８／ＣＣＮＤ１アレイデータのオーバーレイを例示する。 ＯＣＩ−Ｌｙ８細胞系で同定された複数のＩｇＨ切断点を例示する図である。（ａ）Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２−「ｄｅｒ（１４）」切断点；（ｂ）Ｓ_γＲプライマーを使用して同定されたＳ_γ３−ＢＣＬ６−「ｄｅｒ（３）」切断点；（ｃ）Ｓ_γＲプライマーを使用して同定されたＳ_γ−ＭＹＣ−「ｄｅｒ（８）」切断点；（ｄ）Ｓ_γＦプライマーを使用して同定されたＳ_γ−ＢＣＬ６−「ｄｅｒ（１４）」切断点。 ６分間（薄線）対１０分間（濃線）の線形増幅伸長時間が切断点プロファイルに与える影響を例示する図である。パート（ａ）は、ＯＣＩ−Ｌｙ８細胞系のＳ_γ−ＢＣＬ６切断点を例示し、パート（ｂ）部分は、ＯＣＩ−Ｌｙ８細胞系のＳ_γ−ＢＣＬ６切断点を例示する。 異なるＪ_Ｈ−ＣＣＮＤ１切断点を示す５つの原発性マントル細胞リンパ腫のｔＣＧＨ解析を例示する図である。 典型的な転座ＣＧＨ（ｔＣＧＨ）実験の概要を提供する図である。 ｔＣＧＨ系を確立および検証するためにモデル系として使用された種々のＢ細胞リンパ腫および形質細胞骨髄腫におけるパートナー遺伝子座を伴う典型的なＩｇＨ転座の概要を提供する図である。 ｄｅｒ（１４）染色体におけるＩｇＨ切断点および多数のＤ_Ｈセグメントにおける相互切断点を有するＶＤＪ関連転座のｔＣＧＨ検出用の設定を例示する図である。 ＢＣＬ２マイナー転座クラスターに位置する相互Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２（ａ）およびＢＣＬ２−Ｄ_Ｈ（ｂ）融合、ＯＣＩ−Ｌｙ８リンパ腫細胞系に見出された両相互Ｓ_γ３−ＢＣＬ６融合（ｃおよびｄ）、逆位に配向された非ＩｇＨ ＢＣＬ６エキソン１再編成（ｅ）、バーキットリンパ腫細胞系ＭＣ１１６のＩｇＨ−ＭＹＣ融合（ｆ）、および逆位に配向された非ＩｇＨ ＭＹＣ再編成（ｉ）を含む他の幾つかのＭＹＣ再編成（ｇ〜ｉ）のｔＣＧＨ解析を例示する図である。 ＢＣＬ２マイナー転座クラスターに位置する相互Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２（ａ）およびＢＣＬ２−Ｄ_Ｈ（ｂ）融合、ＯＣＩ−Ｌｙ８リンパ腫細胞系に見出された両相互Ｓ_γ３−ＢＣＬ６融合（ｃおよびｄ）、逆位に配向された非ＩｇＨ ＢＣＬ６エキソン１再編成（ｅ）、バーキットリンパ腫細胞系ＭＣ１１６のＩｇＨ−ＭＹＣ融合（ｆ）、および逆位に配向された非ＩｇＨ ＭＹＣ再編成（ｉ）を含む他の幾つかのＭＹＣ再編成（ｇ〜ｉ）のｔＣＧＨ解析を例示する図である。 ＢＣＬ２マイナー転座クラスターに位置する相互Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２（ａ）およびＢＣＬ２−Ｄ_Ｈ（ｂ）融合、ＯＣＩ−Ｌｙ８リンパ腫細胞系に見出された両相互Ｓ_γ３−ＢＣＬ６融合（ｃおよびｄ）、逆位に配向された非ＩｇＨ ＢＣＬ６エキソン１再編成（ｅ）、バーキットリンパ腫細胞系ＭＣ１１６のＩｇＨ−ＭＹＣ融合（ｆ）、および逆位に配向された非ＩｇＨ ＭＹＣ再編成（ｉ）を含む他の幾つかのＭＹＣ再編成（ｇ〜ｉ）のｔＣＧＨ解析を例示する図である。 ＢＣＬ２マイナー転座クラスターに位置する相互Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２（ａ）およびＢＣＬ２−Ｄ_Ｈ（ｂ）融合、ＯＣＩ−Ｌｙ８リンパ腫細胞系に見出された両相互Ｓ_γ３−ＢＣＬ６融合（ｃおよびｄ）、逆位に配向された非ＩｇＨ ＢＣＬ６エキソン１再編成（ｅ）、バーキットリンパ腫細胞系ＭＣ１１６のＩｇＨ−ＭＹＣ融合（ｆ）、および逆位に配向された非ＩｇＨ ＭＹＣ再編成（ｉ）を含む他の幾つかのＭＹＣ再編成（ｇ〜ｉ）のｔＣＧＨ解析を例示する図である。 多数の異なる線形増幅スキーム（ａ〜ｅ）を使用した、ＢＣＬ２の大規模（１９０ｋｂ）イントロン内の新規な１６７ｋｂの中間部欠失におけるコピー数変化のｔＣＧＨ解析を例示する図である。 多数の異なる線形増幅スキーム（ａ〜ｅ）を使用した、ＢＣＬ２の大規模（１９０ｋｂ）イントロン内の新規な１６７ｋｂの中間部欠失におけるコピー数変化のｔＣＧＨ解析を例示する図である。 非ＭＴＣ切断点を有する５件の原発性ＭＣＬ症例（ａ〜ｅ）から、原発性リンパ腫における新規なＣＣＤＮ１切断点を、ｔＣＧＨ解析により同定したことを例示する図である。 非ＭＴＣ切断点を有する５件の原発性ＭＣＬ症例（ａ〜ｅ）から、原発性リンパ腫における新規なＣＣＤＮ１切断点を、ｔＣＧＨ解析により同定したことを例示する図である。 ＣＣＮＤ１遺伝子に及び、ＭＯ２０５８（ａ〜ｃ）およびＧｒａｎｔａ（ｄ〜ｆ）細胞系の両方でそれぞれのＪＨ−ＣＣＮＤ１切断点接合部へと正確に伸長する重複を、ｔＣＧＨ解析により同定したことを例示する図である。 ＣＣＮＤ１遺伝子に及び、ＭＯ２０５８（ａ〜ｃ）およびＧｒａｎｔａ（ｄ〜ｆ）細胞系の両方でそれぞれのＪＨ−ＣＣＮＤ１切断点接合部へと正確に伸長する重複を、ｔＣＧＨ解析により同定したことを例示する図である。 ＯＣＩ−Ｌｙ８リンパ腫細胞系のＩｇＨ−ＢＣＬ２切断点におけるおよそ６ｋｂの欠失を、ｔＣＧＨ解析により同定したことを例示する図である。 ＯＣＩ−Ｌｙ８リンパ腫細胞系のＩｇＨ−ＢＣＬ２切断点におけるおよそ６ｋｂの欠失を、ｔＣＧＨ解析により同定したことを例示する図である。 Ｓ_α１からＳ_γ４まで伸長し、３’α１エンハンサーを包含する約１００ｋｂのＩｇＨ定常領域セグメントの、ＣＣＮＤ１遺伝子座への新規な潜在的挿入を、Ｓ_γＲ（ａ）およびＳ_γＦ（ｂ）の両プライマーによる線形増幅を使用したｔＣＧＨ解析により同定したことを例示する図である。擬似増幅された腫瘍ＤＮＡをハイブリダイゼーション対照として使用する場合（ｃ）の、および正常ゲノムＤＮＡを解析する場合（ｄ）の、予測転座切断点から離れた配列のオフターゲット増幅が例示されている。 Ｓ_α１からＳ_γ４まで伸長し、３’α１エンハンサーを包含する約１００ｋｂのＩｇＨ定常領域セグメントの、ＣＣＮＤ１遺伝子座への新規な潜在的挿入を、Ｓ_γＲ（ａ）およびＳ_γＦ（ｂ）の両プライマーによる線形増幅を使用したｔＣＧＨ解析により同定したことを例示する図である。擬似増幅された腫瘍ＤＮＡをハイブリダイゼーション対照として使用する場合（ｃ）の、および正常ゲノムＤＮＡを解析する場合（ｄ）の、予測転座切断点から離れた配列のオフターゲット増幅が例示されている。 擬似増幅された腫瘍ＤＮＡをハイブリダイゼーション対照として使用する場合の、ＭＯ２０５８（ａ）およびＧｒａｎｔａ（ｂ）細胞系のおける予測転座切断点から離れた配列のオフターゲット増幅を例示する図である。正常ゲノムＤＮＡを分析すると、同様の結果が見られる（ｃ〜ｆ）。 擬似増幅された腫瘍ＤＮＡをハイブリダイゼーション対照として使用する場合の、ＭＯ２０５８（ａ）およびＧｒａｎｔａ（ｂ）細胞系のおける予測転座切断点から離れた配列のオフターゲット増幅を例示する図である。正常ゲノムＤＮＡを分析すると、同様の結果が見られる（ｃ〜ｆ）。 等量のＤＨＬ１６、ＲＬ７、およびＧｒａｎｔａ５１９ゲノムＤＮＡ（「３３％希釈」と称する）を混合することによる、ｔＣＧＨ解析の分析感度の決定を例示する図であり、２０％および１５％希釈試料は、正常ゲノムＤＮＡを混合することにより生成した。その後、Ｊ_Ｈプライマーを使用して１２または２０サイクルで試料を増幅し、同様に増幅された正常ゲノムＤＮＡに共ハイブリダイズさせた。 等量のＤＨＬ１６、ＲＬ７、およびＧｒａｎｔａ５１９ゲノムＤＮＡ（「３３％希釈」と称する）を混合することによる、ｔＣＧＨ解析の分析感度の決定を例示する図であり、２０％および１５％希釈試料は、正常ゲノムＤＮＡを混合することにより生成した。その後、Ｊ_Ｈプライマーを使用して１２または２０サイクルで試料を増幅し、同様に増幅された正常ゲノムＤＮＡに共ハイブリダイズさせた。 ＢＣＲ−ＡＢＬ平衡転座ｔ（２２；９）によって特徴付けられる３つの慢性骨髄性白血病細胞系を、骨髄性プライマー混合物（ＭＰＭ）およびＡＭＬパイロットアレイを使用して、多重線形増幅およびｔＣＧＨ解析した結果を例示する図である。 ＢＣＲ−ＡＢＬ平衡転座ｔ（２２；９）によって特徴付けられる３つの慢性骨髄性白血病細胞系を、骨髄性プライマー混合物（ＭＰＭ）およびＡＭＬパイロットアレイを使用して、多重線形増幅およびｔＣＧＨ解析した結果を例示する図である。 ＢＣＲ−ＡＢＬ平衡転座ｔ（２２；９）によって特徴付けられる３つの慢性骨髄性白血病細胞系を、骨髄性プライマー混合物（ＭＰＭ）およびＡＭＬパイロットアレイを使用して、多重線形増幅およびｔＣＧＨ解析した結果を例示する図である。 ＰＭＬ−ＲＡＲＡ平衡転座ｔ（１５；２１）によって特徴付けられる２つの急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）細胞系（上段パネル）、および染色体逆位ｉｎｖ（１６）によって引き起こされるＭＹＨ１１−ＣＢＦＢ融合によって特徴付けられる２つの急性骨髄単球性白血病／好酸球増多症細胞系（下段パネル）を、骨髄性プライマー混合物（ＭＰＭ）およびＡＭＬパイロットアレイを使用して、多重線形増幅およびｔＣＧＨ解析した結果を例示する図である。 ＰＭＬ−ＲＡＲＡ平衡転座ｔ（１５；２１）によって特徴付けられる２つの急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）細胞系（上段パネル）、および染色体逆位ｉｎｖ（１６）によって引き起こされるＭＹＨ１１−ＣＢＦＢ融合によって特徴付けられる２つの急性骨髄単球性白血病／好酸球増多症細胞系（下段パネル）を、骨髄性プライマー混合物（ＭＰＭ）およびＡＭＬパイロットアレイを使用して、多重線形増幅およびｔＣＧＨ解析した結果を例示する図である。 ＡＦ９−ＭＬＬ平衡転座ｔ（９；１１）によって特徴付けられるＭＬＬ白血病細胞系を、Ｐ１／Ｐ７プライマー混合物（ＭＰＭ）およびＡＭＬパイロットアレイを使用して多重線形増幅およびｔＣＧＨ解析した結果（上段パネル）、およびＥＴＯ−ＡＭＬ１平衡転座ｔ（８；２１）によって特徴付けられるＫａｓｕｍｉ急性骨髄性白血病細胞系を、８２１プライマー混合物（ＭＰＭ）およびＡＭＬパイロットアレイを使用して多重線形増幅およびｔＣＧＨ解析した結果（下段パネル）を例示する図である。

アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は、染色体不均衡に関する研究に革新を起こしたが、一般的には、リンパ腫、白血病、および他の腫瘍の病因および診断に中心的な役割を果たす相互転座のような平衡ゲノム再編成を検出することが不可能である。免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）転座パートナーの正確な同定は、例えば、Ｂ細胞リンパ腫の分類、および多発性骨髄腫のような形質細胞新生物の予後の予測にとって不可欠である。

ＩｇＨ転座を平衡ゲノム再編成のモデルとして使用して、本発明者らは、ＩｇＨ転座パートナーの迅速な同定、およびかつてないほどの分解能での転座関連切断点の正確なマッピングを可能にする、本発明者らが転座ＣＧＨ（ｔＣＧＨ）と呼ぶアレイＣＧＨ法を開発した。下記でより詳細に記述されているように、ＣＧＨアレイでＩｇＨ転座を検出可能にするために、検査および参照試料に由来するゲノムＤＮＡは、単一ＩｇＨ連結（Ｊ_Ｈ）またはスイッチ（Ｓμ／Ｓα／Ｓε）領域プライマーを使用する酵素線形増幅反応において、アレイハイブリダイゼーションの前に修飾されており、その結果としてＩｇＨプライマーの下流に挿入される場合がある（転座または他の再編成によって）任意の融合パートナー配列の特異的増幅がもたらされる。ＭＹＣ、ＢＣＬ２、およびＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）のような共通のＩｇＨパートナー遺伝子座を表す単一のタイリング密度オリゴヌクレオチドアレイを使用して、ｔＣＧＨは、ＭＯ２０５８およびＧｒａｎｔａ５１９細胞系（マントル細胞リンパ腫）のＪ_Ｈ−ＣＣＮＤ１切断点、Ｕ２６６（骨髄腫）の細胞遺伝学的に潜在的なＳα−ＣＣＮＤ１融合、ＭＣ１１６およびＲａｊｉ（バーキットリンパ腫）のＪ_Ｈ−ＭＹＣおよびＳμ−ＭＹＣ切断点、ならびにＤＨＬ１６（大細胞リンパ腫；マイナークラスター領域）のＪ_Ｈ−ＢＣＬ２切断点を含む種々の細胞系および原発性リンパ腫における、ならびに濾胞性リンパ腫（主要切断点領域）の報告症例における公知のＩｇＨ融合切断点の組み合わせを同定し、約１００ｂｐ分解能にまでマッピングすることに成功した。

その後、本発明者らはｔＣＧＨを使用して、それらの全てがＣＣＮＤ１主要転座クラスター（ＭＴＣ）にＰＣＲ検出可能な転座切断点を欠如していた、マントル細胞リンパ腫の４つの報告症例およびＢ細胞前リンパ球性白血病の１つのｔ（１１；１４）陽性症例を分析した。５つの新規なＣＣＮＤ１転座切断点が同定され、約１００ｂｐ分解能にマッピングされ、予測切断点を増幅、配列決定、および確認するための患者特異的ＰＣＲプライマーの迅速設計が可能になった。１つの切断点がＭＴＣの５００ｂｐ内にマッピングされたが、他の４つは、ＭＴＣを隣接する約１５０ｋｂ領域にわたって散在していた。本発明者らの知る限りでは、これは、現在まで報告されている最も大規模な一連の非ＭＴＣマントル細胞リンパ腫切断点配列を表す。これらの結果は、ｔＣＧＨがどのようにして、非常に大きなゲノム領域に分散しているこれまで未確認のＩｇＨ転座切断点の迅速クローニングを容易にすることができるのかについても例示する。ｔＣＧＨは、ゲノムＤＮＡを必要とするだけであり、平衡ＩｇＨ転座およびゲノム不均衡の両方を超高分解能で同時に同じアレイ上で検出することができるため、Ｂ細胞および形質細胞新生物の臨床検査用の分子細胞遺伝学的方法（例えば、ＦＩＳＨ）に対する有用な代替法であり得る。ｔＣＧＨは、微小残存病変を検出するための高感度な切断点特異的ＰＣＲアッセイの開発も容易にするであろう。最後に、線形増幅反応で使用されるプライマーは完全に特別注文で作ることが可能であるため、ｔＣＧＨは、融合パートナーのうちの１つが公知であれば、非ＩｇＨ遺伝子座を伴う他の平衡転座（または、より複雑なゲノム融合）を同定およびマッピングするように、容易に適合させることができる。

１つの実施形態では、本発明は、染色体再編成を検出する方法であって、（ａ）標的ゲノム遺伝子座を増幅するステップと、（ｂ）前記増幅産物を核酸アレイにハイブリダイズさせるステップと、（ｃ）前記ハイブリダイゼーションパターンを参照と比較するステップとを含み、前記増幅が線形増幅であり、増幅されたゲノム遺伝子座のハイブリダイゼーションが参照と比較して異なることが、ゲノム再編成の存在を示す方法を提供する。ある実施形態では、ゲノム再編成は、平衡転座または逆位などの平衡再編成である。

１つの実施形態では、本発明は、平衡染色体転座を検出する方法を提供する。ある実施形態では、本発明の方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座を増幅するステップと、（ｂ）前記増幅産物を核酸アレイにハイブリダイズさせるステップと、（ｃ）前記ハイブリダイゼーションパターンを参照と比較するステップとを含み、前記増幅が線形増幅であり、直角三角形のハイブリダイゼーションパターンの存在が平衡染色体転座の存在を示す方法を提供する。本発明のある実施形態では、前記直角三角形のハイブリダイゼーションパターンは、非対称ハイブリダイゼーションパターンを含む。ある実施形態では、本発明の方法は、染色体転座に関与する両パートナー遺伝子座における切断点の検出および／またはマッピングを含むことができる。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、平衡転座以外の染色体再編成の検出を含む。

上記で提供された方法のある実施形態では、多重線形増幅を使用して複数のアンプリコンを増幅する。特定の実施形態では、前記方法は、複数のゲノム遺伝子座の同時調査を含む。

特定の実施形態では、複数の増幅プライマーが、本発明の方法に使用される。前記複数の増幅プライマーは、疾患に関連する平衡転座に関与する遺伝子座の増幅用プライマーを含んでいてもよい。平衡染色体転座に関連する任意の疾患を、本発明の方法によって検出することができる。本発明の特定の実施形態では、疾患は、リンパ腫または白血病などの癌である。本発明の具体的な実施形態では、ＭＰＭ混合物、８２１混合物、Ｐ１／Ｐ７混合物、および複数のＤ_Ｈプライマーから選択される複数のプライマーを、本明細書中で提供された方法で使用することができる。

本発明のある実施形態では、線形増幅の産物を検出するために使用されるアレイは、マイクロアレイまたは高密度タイルアレイ（ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｔｉｌｅｄ ａｒｒａｙ）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、前記アレイは、複数のゲノム遺伝子座のプローブを含んでいてもよい。ある実施形態では、本発明のアレイ上のプローブに対応する少なくとも１つのゲノム遺伝子座は、疾患に関連していてもよい。特定の実施形態では、疾患は、リンパ腫または白血病などの癌であってもよい。具体的な実施形態では、前記アレイはＡＭＬパイロットアレイを含んでいてもよい。

別の実施形態では、本発明の方法は、重複、増幅、欠失、逆位、平衡転座、および不平衡転座（ｕｎｂａｌａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）から選択される第２の染色体再編成の検出をさらに含んでいてもよい。ある実施形態では、第１の再編成および第２の再編成の検出は、逐次的でもよくまたは同時であってもよい。特定の実施形態では、本発明の方法は、平衡再編成および不平衡再編成の両方の同時検出を含む。前記平衡および不平衡再編成は、同一ゲノム遺伝子座に存在してもよく、または異なる遺伝子座に存在してもよい。

さらに他の実施形態では、本発明は、平衡染色体転座の検出に使用される新規なキットを提供する。ある実施形態では、本発明のキットは、転座に関与する遺伝子座の線形増幅用プライマーを含む。他の実施形態では、本発明のキットは、転座に関与する遺伝子座に由来する線形増幅産物の検出用アレイを含んでいてもよい。本発明のある実施形態では、キットは、転座に関与する遺伝子座を増幅するための複数のプライマーを含んでいてもよい。さらに他の実施形態では、本発明のキットは、染色体転座に関連する疾患の診断または予後に使用を見出すことができる。具体的な実施形態では、疾患は、リンパ腫または白血病などの癌であってもよい。

１．定義
「染色体再編成」または「染色体異常」という用語は、一般的に、野生型または正常細胞に見出されない様式での、染色体物質のセグメントの異常な連結を指す。染色体再編成の例には、欠失、増幅、逆位、または転座が含まれる。染色体再編成は、自然発生的切断が染色体に生じた後で発生する場合がある。切断（複数可）が染色体の一部分の喪失に帰着する場合、欠失が生じる。染色体のセグメントが切断され、逆向きにされ（反転され）、その元の位置に再挿入される場合に、逆位が生じる。１つの染色体の一部分が別の染色体に由来する一部分と交換される場合、転座が生じる。増幅は、染色体の特定領域の複数コピーに帰着する。染色体再編成は、上記の組み合わせも包含することができる。

「転座」または「染色体転座」という用語は、一般的に、等量または非等量の同一または異なる染色体間での染色体物質の交換を指す。交換は、非相同染色体間で生じることが多い。

「平衡」転座は、一般的に、遺伝物質の純減少または増加のない染色体物質の交換を指す。

「不平衡」転座は、一般的に、染色体物質の追加または欠落に帰着する染色体物質の非等量交換を指す。

「核酸アレイ」または「核酸マイクロアレイ」は、複数の核酸エレメントであり、各々は、プローブ核酸がハイブリダイズされている固体表面に固定化された１つまたは複数の標的核酸分子を含む。そのような固体支持体上に固定することができる核酸分子には、これらに限定されないが、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡが含まれる。本発明の状況では、ゲノム核酸の異なるセグメントに対応する配列を含有するマイクロアレイが使用される。マイクロアレイのゲノムエレメントは、ある生物の全ゲノムを表すか、またはそうでなければゲノムの規定された領域、例えば特定の染色体またはその近接セグメントを再現していてもよい。

ゲノムタイリングマイクロアレイは、目的ゲノム領域全体の完全な、またはほぼ完全な再現を提供するように設計された重複オリゴヌクレオチドを含む。

比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は、一般的に、所与の被験体のＤＮＡのＤＮＡ含量および多くの場合腫瘍細胞におけるコピー数変化（増加／減少）を解析するための分子細胞遺伝学的方法を指す。癌の状況では、上記方法は、標識腫瘍ＤＮＡ（蛍光標識を有することが多い）および正常ＤＮＡ（第２の異なる蛍光標識を有することが多い）を、正常なヒト分裂中期調製物にハイブリダイゼーションさせることに基づく。落射蛍光顕微鏡および定量的画像解析を使用して、増加／減少対対照ＤＮＡの蛍光比率の領域差を検出し、ゲノムの異常領域の同定に使用することができる。ＣＧＨは、一般的に不平衡染色体変化のみを検出するであろう。平衡相互転座または逆位などの構造的染色体異常は、コピー数を変更しないため検出することができない。例えば、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８巻：８１８〜８２１頁（１９９２年）を参照されたい。

「染色体マイクロアレイ解析（ＣＭＡ）」または「アレイＣＧＨ」と称する変化型のＣＧＨでは、被験体組織および正常対照組織（参照）に由来するＤＮＡは、異なって標識化される（例えば、異なる蛍光標識を用いて）。反復ＤＮＡ配列を抑制するために被験体および参照ＤＮＡを非標識ヒトｃｏｔ１ＤＮＡと共に混合した後、混合物を、一般的には正常参照細胞に由来する複数の規定ＤＮＡプローブを含有するスライドにハイブリダイズさせる。例えば、米国特許第５，８３０，６４５号明細書、第６，５６２，５６５号明細書を参照されたい。オリゴヌクレオチドをマイクロアレイ上のエレメントとして使用する場合、１００ｋｂの分解能を可能にするＢＡＣアレイを使用した場合と比べて、典型的には２０〜８０塩基対の分解能を取得することができる。アレイのエレメントに沿った（蛍光）色比率を使用して、被験体試料におけるＤＮＡ増加または減少の領域を評価する。

「直角三角形パターンのハイブリダイゼーション」または「直角三角形ハイブリダイゼーションパターン」という用語は、一般的に、（ｉ）再編成切断点を標示する単一個別境界、および（ｉｉ）ハイブリダイゼーションシグナル（または、その比率もしくは対数比率）がセントロメアまたはテロメアのいずれかの方向で基線に向かって徐々に復帰することによって特徴付けられ、個別的でない第２の境界に帰着する任意の非対称ハイブリダイゼーションシグナルパターンを含む、ハイブリダイゼーションシグナル対染色体位置の（または、ハイブリダイゼーションシグナル比率もしくはその対数の）プロットにおける非対称パターンを指す。

「増幅」または「増幅反応」は、酵素反応を含む任意の化学反応を指し、テンプレート核酸配列のコピー増加に帰着する。増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および第４，６８３，２０２号明細書、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓら編、１９９０年）を参照）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０巻（７号）：１６９１頁（１９９２年）；Ｗａｌｋｅｒ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ３巻（１号）：１頁（１９９３年））、転写媒介性増幅（Ｐｈｙｆｆｅｒら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３４巻：８３４頁（１９９６年）；Ｖｕｏｒｉｎｅｎら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３３巻：１８５６頁（１９９５年））、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｃｏｍｐｔｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３５０巻（６３１３号）：９１頁（１９９１年））、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｓｂｙ、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２巻（１号）：７５頁（１９９９年））；Ｈａｔｃｈら、Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． １５巻（２号）：３５頁（１９９９年））、および分岐ＤＮＡシグナル増幅（ｂＤＮＡ）（例えば、Ｉｑｂａｌら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ １３巻（４号）：３１５頁（１９９９年）を参照）が含まれる。

線形増幅とは、ＤＮＡの指数関数的増幅に帰着しない増幅反応を指す。ＤＮＡの線形増幅の例には、本明細書中に記述されているように、単一プライマーのみが使用される場合、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅が含まれる。Ｌｉｕ， Ｃ． Ｌ．、Ｓ． Ｌ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４： Ａｒｔ． Ｎｏ． １９、２００３年５月９日も参照されたい。他の例には、なかでも鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０巻（７号）：１６９１頁（１９９２年）；Ｗａｌｋｅｒ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ３巻（１号）：１頁（１９９３年）などの等温増幅反応が含まれる。

増幅反応に使用される試薬には、例えば、オリゴヌクレオチドプライマー；ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、バルビタール、トリスなどに基づく緩衝液（米国特許第５，５０８，１７８号明細書を参照）；塩化カリウムまたは塩化ナトリウムなどの塩；マグネシウム；デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）；Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼ；ならびにＤＭＳＯ；ならびにゼラチン、ウシ血清アルブミン、および非イオン性界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ−２０）などの安定化剤が含まれる。

「プローブ」とは、一般的に、特定の目的核酸配列に相補的な核酸を指す。

「プライマー」という用語は、増幅反応におけるポリヌクレオチドの合成を準備する核酸配列を指す。典型的には、プライマーは、約１００個未満のヌクレオチドを含み、好ましくは約３０個未満のヌクレオチドを含む。例示的なプライマーは、約５個から約２５個までのヌクレオチドに及ぶ。

「標的」または「標的配列」とは、増幅反応において増幅されることが求められている一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド配列を指す。

「核酸」または「ポリヌクレオチド」という語句は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。この用語は、合成、天然、および非天然であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または連結を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例には、これらに限定されないが、ホスホロチオエートおよびホスホロアミノ酸塩、メチルホスホン酸塩、キラルメチルホスホン酸塩、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。

２つの核酸配列またはポリペプチドは、下記に記述されているように最大一致でアラインした際に、この２つの配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列がそれぞれ同じであれば、「同じである」と言う。「〜に相補的な」という用語は、本明細書中で使用される場合、第１の配列の全てが、参照ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であることを意味する。

「〜に選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、その配列が複合混合物中に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、分子が、特定ヌクレオチド配列のみに対して結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズすることを指す。

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、典型的には核酸の複合混合物中で、プローブがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしないであろう条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境では異なることになろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ − Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３年）に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨにおける特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有されている）温度（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下における）である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０個のヌクレオチド）の場合は少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０個を超えるヌクレオチド）の場合は少なくとも約６０℃である条件になるであろう。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加でも達成することができる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、少なくとも背景信号の２倍、好ましくは背景ハイブリダイゼーションの１０倍である。当業者であれば、代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使用して、同様のストリンジェンシー条件を提供することができることを容易に認識するであろう。

ＰＣＲの場合、アニーリング温度はプライマー長に依存して約３２℃から４８℃の間で変動する場合があるが、低ストリンジェンシー増幅では、約３６℃の温度が典型的である。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅の場合、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマー長および特異性に依存して約５０℃から約６５℃までに及ぶ場合があるが、約６２℃の温度が典型的である。高および低ストリンジェンシー増幅の典型的なサイクル条件には、３０秒〜２分間の９０℃〜９５℃の変性段階、３０秒〜２分間続くアニーリング段階、および１〜２分間の約７２℃の伸長段階が含まれる。

２．転座ＣＧＨ（ｔＣＧＨ）の概要
上記方法は、染色体異常、特に染色体転座を検出およびマッピングするために使用することができる。１つの実施形態では、本発明の方法は、患者試料などの検査試料から得られたゲノム核酸の第１の集団、および参照試料から得られたゲノム核酸の第２の集団を使用する。参照試料は、いかなる遺伝子異常も含有していない、つまり全染色体の正常な遺伝子構成要素を有する個体または任意の細胞培養もしくは組織培養から得られた、本明細書中で提供されているような任意の細胞、組織、または液体であってもよい。本発明は、転座パートナーの配列に伸長して、転座対の両方のメンバーを含むプローブ分子を生成する、ゲノム遺伝子座により包含された配列の線形増幅を実施するために、特定のゲノム遺伝子座に特異的なプライマーの使用を利用する。同時に、参照プローブも、参照細胞に由来するゲノムＤＮＡの線形増幅を使用して、検査試料について記述されている様式で生成される。検査および参照プローブは、異なって標識化されており、例えばＣｙ３およびＣｙ５が用いられているが、多数の好適な蛍光標識対が当技術分野において公知である。その後、異なって標識されたプローブは、ゲノムＤＮＡを含むマイクロアレイにハイブリダイズされる。一般的に、マイクロアレイのゲノムＤＮＡ配列は、特定の生物のデータベース配列、例えばヒト、マウス、またはラットゲノムの完全データベースなどの参照供給源に由来する。参照試料に由来する類似プローブのハイブリダイゼーションと比較した、検査試料プローブのハイブリダイゼーションのパターンおよび程度は、公知のゲノム遺伝子座の転座パートナーの同定を可能にする。タイリング密度マイクロアレイなどの高密度マイクロアレイの使用は、転座の切断点の高分解能マッピングを可能にする。

したがって、目的のゲノム遺伝子座に転座が存在する場合、参照細胞に由来するゲノムＤＮＡ配列を含むマイクロアレイへの、検査プローブのハイブリダイゼーションは、公知のゲノム遺伝子座に対応するエレメントに関連するシグナル、ならびに別のゲノム遺伝子座に関連するマイクロアレイのエレメントと関連するシグナルに帰着するであろう。他のゲノム遺伝子座に関連するシグナルは、その遺伝子座を、公知のゲノム遺伝子座の転座パートナーとして同定する。対照的に、参照プローブとマイクロアレイのハイブリダイゼーションは、公知の遺伝子座に対応するマイクロアレイエレメントと排他的に関連するハイブリダイゼーションに帰着し、検査プローブで観察されるような別のゲノム遺伝子座に関連するハイブリダイゼーションシグナルはないであろう。

高密度タイリングマイクロアレイを使用する場合、転座の切断点は、ハイブリダイゼーションが、ゲノムＤＮＡの近接セグメントを構成する一連のマイクロアレイエレメントのどこで始まりどこで終わるかを決定することによって確認することができる。したがって、検査プローブを使用すると、公知のゲノム遺伝子座に対応する一連のエレメントに沿った特定の地点でハイブリダイゼーションが停止し、参照プローブを使用すると、ハイブリダイゼーションが上記一連に沿って継続することは、ハイブリダイゼーションが停止する地点を、公知のゲノム遺伝子座の転座切断点として同定する。同様に、検査プローブによるハイブリダイゼーションが、公知のゲノム遺伝子座とは異なる遺伝子座に対応する一連のエレメントで始まり、参照プローブによるハイブリダイゼーションが陰性である地点は、ハイブリダイゼーションが生じる最初のエレメントが、公知のゲノム遺伝子座の転座パートナーの切断点であることを示す。

特に、本発明の方法の２つの一般的な実施形態を下記に記述する。実施形態の各々は、以下の４つの線形増幅（ＬＡ）反応の実施を伴う：
（１）「Ｔ＋」：ＬＡプライマー（目的のゲノム遺伝子座内の公知の配列に対するプライマー）を使用して、検査（例えば腫瘍）ＤＮＡを増幅すること、
（２）「Ｎ＋」：ＬＡプライマーを使用して、正常ＤＮＡを増幅すること、
（３）「Ｔ−」：検査（例えば腫瘍）ＤＮＡを擬似増幅すること（つまり、プライマーが存在しない）、
（４）「Ｎ−」：正常ＤＮＡを擬似増幅すること（つまり、プライマーが存在しない）。

各実施形態（下記でタイプＡおよびタイプＢ実験と表示されている）では、同じ４つの反応を、異なる対の組み合わせで２つの別々の２色アレイに共ハイブリダイズさせる（標識後に）。下記に記述されているように、２つの（２色）アレイの比較は染色体再編成情報をもたらすが、得られた情報は実験タイプに依存して異なり、タイプＡおよびＢの両方は転座切断点を示すが、タイプＡ実験はゲノム不均衡も示す。

タイプＡ実験：
ステップ１：Ｔ＋およびＮ＋試料を１つのアレイに共ハイブリダイズさせる（「Ｔ＋／Ｎ＋アレイ」）。このアレイは、転座切断点およびゲノム不均衡の両方を検出するであろう。

ステップ２：Ｔ−およびＮ−試料を第２のアレイに共ハイブリダイズさせる（「Ｔ−／Ｎ−アレイ」）。このアレイは、ゲノム不均衡を検出するが、転座切断点は検出しないであろう。

ステップ３：Ｔ＋／Ｎ＋およびＴ−／Ｎ−アレイの結果を、以下のように解析および比較する：
ａ）転座切断点は、Ｔ＋／Ｎ＋アレイで見られるが、Ｔ−／Ｎ−アレイでは見られない。典型的には、転座切断点は直角三角形のように見え、垂直辺は切断点の位置を標示し、水平脚部は切断点から遠ざかる方向を指す。

ｂ）ゲノム不均衡は、Ｔ＋／Ｎ＋およびＴ−／Ｎ−アレイの両方で見られる。典型的には、不均衡は長方形のように見え、垂直辺は、重複または欠失ゲノム領域の２つの末端を標示する。

タイプＢ実験：
ステップ１：Ｔ＋およびＴ−試料を１つのアレイに共ハイブリダイズさせる（「Ｔ＋／Ｔ−アレイ」）。Ｔ＋／Ｔ−アレイは、真正の転座切断点および「偽切断点」を検出するが、ゲノム不均衡は検出しないであろう。偽切断点は、ゲノム全体にわたる複数部位での、恐らくはプライマー配列に対するそれらの相同性に基づく「非特異的な」プライマー結合に起因する。偽切断点も、形状が直角三角形である。

ステップ２：Ｎ＋およびＮ−試料を第２のアレイに共ハイブリダイズさせる（「Ｎ＋／Ｎ−アレイ」）。Ｎ＋／Ｎ−アレイは、「偽切断点」のみを検出するが、Ｎ＋およびＮ−試料の両方が正常ＤＮＡで開始するため、真正の転座切断点もゲノム不均衡も検出しない。

ステップ３：Ｔ＋／Ｔ−およびＮ＋／Ｎ−アレイの結果を、以下のように解析および比較する：
ａ）転座切断点は、Ｔ＋／Ｔ−アレイで見られるが、Ｎ＋／Ｎ−アレイでは見られない。

ｂ）偽切断点は、Ｔ＋／Ｔ−およびＮ＋／Ｎ−アレイの両方で見られ、無視される。

３．生体試料
１つの態様では、本発明の方法は、検査試料の染色体異常を検出するために使用することができる。一般的に、検査試料は患者から取得される。検査試料は、染色体または遺伝子異常に関連した病態または状態を有すると推測される患者から得られた細胞、組織、または液体を含有することができる。診断または予後の目的では、病態または状態は、一般的には、遺伝子欠損、例えばゲノム核酸塩基置換、増幅、欠失、および／または転座と関連している。検査試料は、癌細胞またはそのような細胞に由来する核を含有していることが推測されてもよい。試料には、これらに限定されないが、羊水、生検、血液、血液細胞、骨髄、脳脊髄液、糞便試料、細針生検試料、腹水、血漿、胸膜液、唾液、精液、血清、痰、涙、組織または組織ホモジェネート、組織培養培地、および尿などが含まれていてもよい。また、試料は、組織の切り出し、分画、精製、または細胞器官分離などの処理をされていてもよい。

細胞、組織、または液体試料を単離する方法は、当業者に周知であり、これらに限定されないが、吸引、組織切片、血液または他の液体の採取、および外科または針生検などが含まれる。患者に由来する試料には、組織学的目的のために採取された凍結切片またはパラフィン切片が含まれていてもよい。また、試料は、上清（細胞培養の）、細胞の溶解産物、組織培養からの細胞に由来するものでもよく、その中で染色体異常を含むモザイク性のレベルおよびコピー数を検出するのが望ましい場合がある。

１つの実施形態では、癌性細胞を含有していると推測される試料は、ヒト患者から取得される。試料は、静脈穿刺、腰椎穿刺、唾液または尿などの液体試料、組織、または針生検などのような周知の技術を使用して、患者から取り出すことができる。癌性細胞を含有する腫瘍を有していると推測される患者では、試料は、例えば、腫瘍生検、細針吸引物、または切除された腫瘍に由来する切片を含む、腫瘍の生検または外科標本を含んでいてもよい。洗浄標本は、例えば頸部、気管支、膀胱などの場合、任意の目的領域を生理食塩水で洗浄することで調製することができる。患者試料は、呼気分析器を用いて採取されるような、または咳もしくはくしゃみから得られるような呼気試料を含むこともできる。生体試料は、組織および／または血液が保管されている細胞バンクもしくは血液バンクから、または細胞培養などのｉｎ ｖｉｔｒｏ供給源から取得することもできる。試料供給源として使用するための細胞培養を確立するための技術は、当業者に周知である。

種々の疾患に関与していることが公知である転座の例には、これらの限定されないが、ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）−未分化大細胞リンパ腫；ｔ（８；１４）−バーキットリンパ腫（ｃ−ｍｙｃ）；ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）−フィラデルフィア染色体、ＣＭＬ、ＡＬＬ；ｔ（１１；１４）−マントル細胞リンパ腫（Ｂｃｌ−１）；ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１１．２〜１２）−ユーイング肉腫；ｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）−濾胞性リンパ腫（Ｂｃｌ−２）；ｔ（１７；２２）−隆起性皮膚線維肉腫；ｔ（１５；１７）−急性前骨髄球性白血病；ｔ（１；１２）（ｑ２１；ｐ１３）−急性骨髄性白血病；ｔ（９；１２）（ｐ２４；ｐ１３）−ＣＭＬ、ＡＬＬ（ＴＥＬ−ＪＡＫ２）；ｔ（Ｘ；１８）（ｐ１１．２；ｑ１１．２）−滑膜肉腫；ｔ（１；１１）（ｑ４２．１；ｑ１４．３）−統合失調症；ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）−（ＴＥＬ−ＴｒｋＣ）；急性骨髄性白血病、先天性線維肉腫、分泌性乳癌が含まれる。

したがって、本発明は、染色体転座の存在を検出し、転座パートナーの同一性を決定することにより、染色体再編成、特に染色体転座によって引き起こされる疾患を予測、診断、または予後を提供する方法も提供する。例えば、バーキットリンパ腫の診断が所望の場合、適切な免疫グロブリン調節遺伝子座を線形増幅するためのプライマーを使用して、ヒトマイクロアレイへの、ハイブリダイゼーション用のプローブが生成されるであろう。本発明の方法を使用して、免疫グロブリン遺伝子座の転座パートナーがＭＹＣの遺伝子であると同定される場合、バーキットリンパ腫の診断が示されるであろう。１つの実施形態では、本発明の方法は、平衡染色体転座に関連する癌の診断または予後に特に良好に好適である。

「癌」という用語は、ヒト癌および癌腫、白血病、肉腫、腺癌、リンパ腫、固形およびリンパ系癌などを指す。様々なタイプの癌の例には、これらに限定されないが、単球性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、および急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、乳癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、甲状腺癌、肺癌、前立腺癌、子宮癌、精巣癌、神経芽腫、頭部、頸部、子宮頸部、および膣の扁平上皮癌、多発性骨髄腫、軟部組織および骨原性肉腫、結腸直腸癌、肝臓癌（つまり肝細胞癌）、腎癌（つまり腎細胞癌）、胸膜癌、膵臓癌、子宮頸癌、肛門癌、胆管癌、消化管カルチノイド腫瘍、食道癌、胆嚢癌、小腸癌、中枢神経系の癌、皮膚癌、絨毛癌；骨原性肉腫、線維肉腫、神経膠腫、黒色腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小細胞型リンパ腫、ならびに大細胞型リンパ腫などが含まれる。

別の実施形態では、本発明の方法は、胎児の染色体または遺伝子異常を検出するために使用することができる。例えば、胎児の出生前診断は、染色体または遺伝子異常を有する胎児を妊娠するリスクが増加している女性のために行うことができる。リスク因子は当技術分野で周知であり、例えば、高齢母体、出生前スクリーニングにおける異常な母体血清マーカー、これまでの子供の染色体異常、これまでの子供が身体的奇形および未知の染色体状態を有すること、親の染色体異常、ならびに再発性自然流産が含まれる。

本発明の方法は、任意のタイプの胚性細胞または胎児細胞を使用した、出生前診断を実施するために使用することができる。胎児細胞は、妊娠している女性から、または胚の試料から取得することができる。したがって、胎児細胞は、羊水穿刺によって得られる羊水、注射器によって吸引された絨毛膜絨毛、経皮的臍帯血、胎児の皮膚生検、４細胞期から８細胞期までの胚に由来する卵割球（着床前）、または胚盤胞に由来する栄養外胚葉試料（着床前または子宮洗浄による）に存在する。十分な量のゲノム核酸を有する体液も使用することができる。

１つの実施形態では、本発明のｔＣＧＨ法は、染色体転座に関与する両パートナー遺伝子の切断点を検出およびマッピングすることを含む（例えば、図７の遺伝子ＡおよびＢを参照）。転座の両パートナー遺伝子を検出する場合、遺伝子Ａ、例えばプライマーによって標的とされた遺伝子の線形増幅によって産生されたアンプリコンは、「逆」直角三角形パターンのハイブリダイゼーションに帰着するであろう（例えば、それぞれＢＣＬ６およびＭＹＣアンプリコンの逆ハイブリダイゼーションパターンを示す図１０ｅおよび１０ｉを参照）。

第２の実施形態では、本発明は、複数の遺伝子座の染色体再編成を同時に検出するための多重線形増幅を含むｔＣＧＨ解析方法を提供する。１つの実施形態では、多重増幅は、線形増幅プライマーの混合物を使用して実施される。１つの例では、７つのＤ_Ｈプライマーの混合物（表３を参照）を使用して、複数のＤ_Ｈ再編成を網羅することができる（ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ、Ｌａｎｇｅｒａｋら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７巻（１２号）：２２５７〜３１７頁（２００３年））。別の実施形態では、骨髄性白血病に関連する遺伝子座の線形増幅用の５つのプライマーの混合物（ＭＰＭ混合物、表５を参照）を使用して、３つの異なる骨髄性白血病転座：（１）ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）のＢＣＲ−ＡＢＬ融合＝ｔ（９；２２）、（２）急性前骨髄球性白血病中のＰＭＬ−ＲＡＲＡ融合＝ｔ（１５；１７）、および（３）ｉｎｖ（１６）／ｔ（１６；１６）を有する急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を増幅することができる。さらに他の実施形態では、８２１プライマー混合物またはＰ１／Ｐ７プライマー混合物（表５）を使用して、平衡転座のｔＣＧＨ解析と共に多重線形増幅をすることができる。

第３の実施形態では、本発明により提供される方法は、平衡転座以外の染色体再編成を検出することを含む。ある実施形態では、この染色体再編成は、欠失、重複、増幅、逆位、または不平衡転座を含んでいてもよい。例えば、図１１ｅは、ｔＣＧＨ解析が、欠失切断点を横断する増幅により、イントロン性中間部ＢＣＬ２欠失を検出したことを示す。同様に、図１９は、ｔＣＧＨ解析によって、ＭＹＨ１１およびＣＢＦＢ遺伝子ｉｎｖ（１６）を融合する染色体逆位が検出されたことを示す（下段パネル）。

第４の実施形態では、本発明は、平衡再編成および不均衡染色体異常の両方の同時検出を含んでいてもよい。ある実施形態では、本発明の方法は、不均衡の切断点が平衡再編成の切断点と一致する場合に、同時検出を可能にする。例えば、図１３は、ＭＯ２０５８およびＧｒａｎｔａ５１９細胞系の両方の平衡転座および染色体重複が、ＩｇＨ−ＣＣＮＤ１転座切断点で同時に検出されたことを示す。

第５の実施形態では、本発明は、染色体再編成を検出することにより、個体の疾患を診断またはその予後を提供する方法を提供する。１つの実施形態では、本発明は、個体のリンパ腫を診断する方法であって、表２に見出されるものから選択される新規の切断点を、前記個体からの試料中に検出することを含む方法を提供する。ある実施形態では、上記方法は、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、および濾胞中心リンパ腫（ＦＣＬ）から選択される疾患の検出を含む。ある実施形態では、検出は、ＰＣＲ解析、配列決定、質量分析、ハイブリダイゼーションまたはｔＣＧＨ解析による。表２に列挙されている新規な転座のＰＣＲ解析または配列決定に好適なプライマーには、これらに限定されないが、配列番号２７、２８、３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６３、６４、およびそれらの機能的な等価物が含まれる。

１つの具体的な実施形態では、本発明は、個体に由来する生体試料中にＩｇＨ−ＣＣＮＤ１転座を検出することにより、個体のＢ細胞リンパ腫またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）を診断またはその予後を提供し、ＣＣＮＤ１切断点が、ｃｈｒ１１：６９，０５５，９９６、ｃｈｒ１１：６９，１００，５０９、ｃｈｒ１１：６９，１３１，１３０、ｃｈｒ１１：６９，０５６，４６０、６８，９８９，８３１、ｃｈｒ１１：６９，０８２，８５４、ｃｈｒ１１：６９，０５９，１９９、およびｃｈｒ１８：５８，９４４，４２１からなる群から選択される方法を提供する。第２の具体的な実施形態では、本発明は、個体に由来する生体試料中にＩｇＨ−ＣＣＮＤ１転座検出することにより、個体の骨髄腫を診断またはその予後を提供し、ＣＣＮＤ１切断点が、ｃｈｒ１１：６９，１５３，０４５またはｃｈｒ１１：６９，１５３，０１９である方法を提供する。第３の具体的な実施形態では、本発明は、個体に由来する生体試料中にＩｇＨ−ＢＣＬ２転座を検出することにより、個体のＤＬＢＣＬを診断またはその予後を提供し、ＢＣＬ２切断点が、ｃｈｒ１８：５８，９４４，４８９、ｃｈｒ１８：５８，９１４，８９０、ｃｈｒ１８：５８，９４４，４７５、およびｃｈｒ１８：５８，９３８，２５２から選択される方法を提供する。第４の具体的な実施形態では、本発明は、個体に由来する生体試料中にＩｇＨ−ＢＣＬ６転座を検出することにより、個体のＤＬＢＣＬを診断またはその予後を提供し、ＢＣＬ２切断点が、ｃｈｒ３：１８８，９４５，６７０またはｃｈｒ３：１８８，９４５，６９９である方法を提供する。第５の具体的な実施形態では、本発明は、個体に由来する生体試料中にＩｇＨ−ＭＹＣ転座を検出することにより、個体のＢ細胞リンパ腫を診断またはその予後を提供し、ＭＹＣ切断点が、ｃｈｒ８：１２８，８１８，５９６、ｃｈｒ８：１２８，８１７，５８１、またはｃｈｒ８，１２８，８１６，１０４である方法を提供する。

４．平衡転座検出用プローブの産生
転座の検出には、転座の潜在的部位に及ぶＤＮＡの線形増幅に帰着する任意の方法を使用することができる。本発明の実施に使用することができる線形増幅法の例には、単一プライマーを使用するＰＣＲ増幅が含まれる。Ｌｉｕ， Ｃ． Ｌ．、Ｓ． Ｌ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４巻： Ａｒｔ． Ｎｏ． １９、２００３年５月９日を参照されたい。

例示的な一組の線形増幅条件には、１μｇのゲノムＤＮＡ、２００ｍＭのｄＮＴＰ、および１５０ｎＭの線形増幅プライマーを含有する５０μｌ容積中の反応が含まれる。増幅は、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ ＰＣＲ酵素系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を以下のように使用して実施することができる：９５℃で５分間の変性、その後（９５℃／１５秒、６０℃／１５秒、および６８℃／６分）の１２サイクル。

プローブは、線形増幅過程の間または増幅が生じた後で標識することができる。下記で概説されている具体的な例では、標識は、ＤＮＡポリメラーゼを用いたオリゴヌクレオチド（ランダム六量体）媒介性プライマー伸長による線形増幅後の別のステップにおいて組み込まれる。このプロトコールでは、元のゲノムＤＮＡ試料および線形増幅産物の両方が、シグナルを発生する標識プローブを生じさせるであろう。ハイブリダイゼーション後、その結果生じたデータは、正常なａＣＧＨで見られるようなゲノムＤＮＡシグナルとの違いから両染色体異常に関する情報をもたらすだけでなく、線形増幅産物から発生するシグナルの違いからもたらされる染色体再編成も明らかにするであろう。標識ｄＮＴＰが線形増幅ステップで含まれていれば起るであろうように、標識が単に線形増幅産物に組み込まれていれば、転座だけが明らかにされ、増幅および欠失のような染色体異常は明らかにならないであろう。有用な標識には、例えば、蛍光染料（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタミドリン光体（ｌａｎｔｈａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ）、テキサスレッド）、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、高電子密度剤（例えば、金）、例えばＥＬＩＳＡで一般的に使用されるような酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、比色標識（例えば、コロイド金）、磁気標識（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄ）、ビオチン、ジオキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、または抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能であるハプテンおよびタンパク質が含まれる。標識は、検出される核酸に直接組み込むことができ、または検出される核酸にハイブリダイズまたは結合するプローブ（例えば、オリゴヌクレオチド）または抗体に結合させることができる。検出可能な標識は、核酸に組み込まれていてもよく、結合されていてもよく、またはコンジュゲートされていてもよい。核酸と検出可能な標識との間の結合は、共有結合であってもよく、または非共有結合であってもよい。標識は、潜在的な立体障害、または他の有用なもしくは所望の特性への影響を低減するために、種々の長さのスペーサーアームによって結合されていてもよい。

５．マイクロアレイ
以下に開示されているものなどの、任意の公知のマイクロアレイおよび／またはマイクロアレイを作製および使用する方法が、本発明の実施に使用できる：例えば、米国特許第６，２７７，６２８号明細書、第６，２７７，４８９号明細書、第６，２６１，７７６号明細書、第６，２５８，６０６号明細書、第６，０５４，２７０号明細書、第６，０４８，６９５号明細書、第６，０４５，９９６号明細書、第６，０２２，９６３号明細書、第６，０１３，４４０号明細書、第５，９６５，４５２号明細書、第５，９５９，０９８号明細書、第５，８５６，１７４号明細書、第５，８３０，６４５号明細書、第５，７７０，４５６号明細書、第５，６３２，９５７号明細書、第５，５５６，７５２号明細書、第５，１４３，８５４号明細書、第５，８０７，５２２号明細書、第５，８００，９９２号明細書、第５，７４４，３０５号明細書、第５，７００，６３７号明細書、第５，５５６，７５２号明細書、第５，４３４，０４９号明細書。例えば、国際公開第９９／５１７７３号パンフレット、国際公開第９９／０９２１７号パンフレット、国際公開第９７／４６３１３号パンフレット、国際公開第９６／１７９５８号パンフレットも参照されたい。例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ８巻：Ｒ１７１〜Ｒ１７４頁、１９９８年；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３巻：１０８７〜１０９２頁、１９９７年；Ｋｅｒｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３巻：１２０〜１２４頁、１９９７年；Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ、Ｇｅｎｅｓ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ ２０巻：３９９〜４０７頁、１９９７年；Ｂｏｗｔｅｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐ． ２１巻：２５〜３２、１９９９年も参照されたい。米国特許出願公開第２００１００１８６４２号明細書、第２００１００１９８２７号明細書、第２００１００１６３２２号明細書、第２００１００１４４４９号明細書、第２００１００１４４４８号明細書、第２００１００１２５３７号明細書、第２００１０００８７６５号明細書も参照されたい。

本発明のｔＣＧＨ法は、様々な市販のＣＧＨアレイ、ならびに商業的に作製できる特注設計のアレイを使用して実施することができる。市販の高密度アレイおよびキットの例には、ヒト、マウス、およびラットゲノム解析用にＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能なもの（例えば、Ｇ４４１１ＢおよびＧ４４１２Ａ）、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ社（Ｒｏｃｈｅ社）によって製造されている特注タイリングアレイ、およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社によって作製されている全ゲノムタイリングアレイが含まれる。

１つの実施形態では、本発明は、白血病に関連する平衡転座を検出するための新規な高密度アレイを提供する。ある実施形態では、本発明の高密度アレイは、骨髄性白血病またはリンパ腫などの白血病の診断、予後の提供、および遺伝子型同定に有用である。特定の実施形態では、本発明は、表１、表２、および／または表４に見出される遺伝子座を検出するためのアレイを提供する。ある実施形態では、本発明のアレイは、表２に見出される新規な切断点の検出を可能にする。ある実施形態では、本発明のアレイは、ｔＣＧＨ解析の場合、転座の両パートナー遺伝子の検出を可能にする。特定の実施形態では、本発明は、表４に概説されているようなＡＭＬ高密度アレイを提供する。

さらに別の実施形態では、本発明は、癌などの疾患に関連する平衡転座の検出に有用なプライマー混合物を提供する。特定の実施形態では、癌は、白血病または骨髄性白血病である。ある実施形態では、本発明により提供されるプライマー混合物は、疾患に罹患している個体の平衡転座に通常は関与しているゲノム遺伝子座の線形増幅に有用である。一部の実施形態では、本発明のプライマー混合物は、多重線形増幅および多重ｔＣＧＨ解析に有用である。本発明の具体的な実施形態では、プライマー混合物は、骨髄性プライマー混合物（ＭＰＭ）、８２１混合物、およびＰ１／Ｐ７混合物から選択される。

アレイに基づくＣＧＨの分解能は、主として、全ゲノム範囲に及ぶことが可能であるアレイ内の核酸エレメントの数、サイズ、およびマップ位置に依存する。本発明の特に有利な実施形態では、オリゴヌクレオチド核酸エレメントを使用して、タイリング密度のマイクロアレイを形成する。例えば、Ｍｏｃｋｌｅｒ， Ｔ． Ｃ．およびＪ． Ｒ． Ｅｃｋｅｒ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８５巻：１頁（２００５年）；Ｂｅｒｔｏｎｅ， Ｐ．、Ｍ． Ｇｅｒｓｔｅｉｎら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３巻：２５９頁（２００５年）を参照されたい。

６．マイクロアレイのハイブリダイゼーション
以下に記述されているものなどの、比較ゲノムハイブリダイゼーションを実行するためのこれまで記述されている任意の多数の方法が、本発明の実施に使用することができる：米国特許第６，１９７，５０１号明細書；第６，１５９，６８５号明細書；第５，９７６，７９０号明細書；第５，９６５，３６２号明細書；第５，８５６，０９７号明細書；第５，８３０，６４５号明細書；第５，７２１，０９８号明細書；第５，６６５，５４９号明細書；第５，６３５，３５１号明細書；Ｄｉａｇｏ、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．、１５８巻：１６２３〜１６３１頁、２００１年；Ｔｈｅｉｌｌｅｔ、Ｂｕｌｌ． Ｃａｎｃｅｒ、８８巻：２６１〜２６８頁、２００１年；Ｗｅｒｎｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ、２巻：２５〜３６頁、２００１年；Ｊａｉｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ、１巻：２８９〜３０７頁、２０００年。

一部の場合では、目的の特異的プローブをハイブリダイゼーションさせる前に、反復配列を阻止することが望ましい。反復配列に対するハイブリダイゼーションを除去および／または阻止するための方法は、数多く公知である（例えば、国際公開第９３／１８１８６号パンフレットを参照）。例としては、Ａｌｕ配列などの高度に繰り返された配列に対するハイブリダイゼーションを阻止することが望ましい場合がある。これを達成する１つの方法は、相補的配列のハイブリダイゼーション速度が、それらの濃度の増加と共に増加するという事実を利用する。したがって、一般的には高濃度で存在する反復配列は、ハイブリダイゼーション条件下で変性およびインキュベーションされた後、他よりも迅速に二本鎖になるであろう。その後、二本鎖核酸を取り除き、残りをハイブリダイゼーションに使用する。二本鎖配列から一本鎖を分離する方法には、ヒドロキシアパタイトまたは固体支持体などに結合されている固定化相補性核酸を使用することが含まれる。あるいは、部分的にハイブリダイズされた混合物を使用することができ、二本鎖配列は、標的にハイブリダイズすることができないであろう。

また、阻止しようとする配列に相補的な未標識配列を、ハイブリダイゼーション混合物に添加してもよい。この方法は、反復配列ならびに他の配列のハイブリダイゼーションを阻害するために使用することができる。例えば、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを使用して、試料中の反復配列のハイブリダイゼーションを選択的に阻害することができる。Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを調製するためには、ＤＮＡを抽出、煎断、変性、および再生させる。高度な反復配列はより速く再アニーリングするため、その結果生じたハイブリッドは、これらの配列が高度に濃縮されている。残りの一本鎖ＤＮＡ（つまり、単一コピー配列）はＳ１ヌクレアーゼで消化され、二本鎖Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、精製され、試料中の反復配列のハイブリダイゼーションを阻止するために使用される。Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、上述のように調製することができるが、商業的にも入手可能である（ＢＲＬ社）。

本発明の方法における核酸のハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で周知である。ハイブリダイゼーション条件は、高度なストリンジェンシー条件でもよく、中程度のストリンジェンシー条件でもよく、または低ストリンジェンシー条件であってもよい。理想的には、核酸は、相補的核酸にのみハイブリダイズし、試料中の非相補的核酸にはハイブリダイズしないであろう。ハイブリダイゼーション条件を変動させて、ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーの程度を変更し、当技術分野で公知であるように、背景シグナルを低減することができる。例えば、ハイブリダイゼーション条件が高度なストリンジェンシー条件であれば、核酸は、非常に高度な相補性を有する核酸ターゲット配列にのみ結合するであろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、ある程度の配列多様性を有する配列のハイブリダイゼーションを可能にするであろう。ハイブリダイゼーション条件は、生体試料ならびに核酸のタイプおよび配列に依存して変動するであろう。当業者であれば、本発明の方法を実施するためにハイブリダイゼーション条件を最適化する方法がわかるであろう。

例示的なハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである。高度なストリンジェンシーとは、一般的に、０．０１８ＭのＮａＣｌ中６５℃で安定したハイブリッドを形成する核酸配列に対してのみハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。高度なストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム生理食塩水）、０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中４２℃でハイブリダイゼーションさせ、その後６５℃において０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄することにより提供することができる。中程度のストリンジェンシーは、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中４２℃でのハイブリダイゼーション、その後６５℃において０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳでの洗浄と等しい条件を指す。低ストリンジェンシーは、１０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、その後５０℃において１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳでの洗浄と等しい条件を指す。

ｔＣＧＨアッセイの読取りおよび解釈
公知の遺伝子座の転座パートナーの同定および転座切断点の決定は、マイクロアレイの１つまたは複数の核酸エレメントへの、標識プローブのハイブリダイゼーションのパターンおよび強度の決定に基づく。典型的には、試料または検査プローブおよび参照プローブに結合された検出可能な標識によって生成される、アレイ上のハイブリダイゼーションシグナルの位置、ハイブリダイゼーションシグナル強度、および強度の比率が決定される。試料または検査プローブにハイブリダイズするが参照プローブにはハイブリダイズしないエレメントを決定することにより、そのエレメント内に含有されている配列が、公知の遺伝子座の転座パートナーとして同定される。検査プローブと参照プローブとの間でハイブリダイゼーションパターンが同じであることは、検査された試料が、公知の遺伝子座に転座を含有していないことを示す。タイリング密度マイクロアレイを使用する場合、ハイブリダイゼーションが、近接ゲノムセグメントを表す一連のマイクロアレイエレメントのどこで始まりどこで終わるかを確認することによって、転座切断点を決定することができる。したがって、平衡転座の場合は、ハイブリダイゼーションは、公知のゲノム遺伝子座とは異なる遺伝子内の特定ＤＮＡ配列で始まるであろう。異なる遺伝子の近接配列にある最初のエレメントによって例示される配列は、その配列を、第２の遺伝子内の切断点を表すとして同定する。反対に、公知のゲノム遺伝子座に関して、ハイブリダイゼーションが終了する近接配列内のエレメントは、そのエレメントを、公知のゲノム遺伝子座内の転座切断点を表すとして標示する。

さらに、典型的には、標的核酸セグメントのシグナル強度の比率が強ければ強いほど、そのエレメントに結合する２つの試料中の配列のコピー数比率は大きくなる。したがって、標的核酸セグメント中のシグナル強度比率を比較することにより、２つの試料中のゲノム核酸における異なる配列のコピー数比率の比較が可能になる。

一般的に、アレイに固定された核酸セグメントに結合している核酸に結合した測定可能な標識を検出するために使用することができる任意の装置または方法を、本発明の実施に使用することができる。複数の蛍光体を検出するためのデバイスおよび方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，５３９，５１７号明細書、第６，０４９，３８０号明細書、第６，０５４，２７９号明細書、第６，０５５，３２５号明細書、および第６，２９４，３３１号明細書を参照されたい。任意の公知のデバイスもしくは方法またはその変形型を使用または適合させて、本発明の方法を実行することができ、それらには、多色蛍光画像の走査および解析などのアレイの読取りまたは「走査」デバイスが含まれ、例えば、米国特許第６，２９４，３３１号明細書、第６，２６１，７７６号明細書、第６，２５２，６６４号明細書、第６，１９１，４２５号明細書、第６，１４３，４９５号明細書、第６，１４０，０４４号明細書、第６，０６６，４５９号明細書、第５，９４３，１２９号明細書、第５，９２２，６１７号明細書、第５，８８０，４７３号明細書、第５，８４６，７０８号明細書、第５，７９０，７２７号明細書、および本明細書中のアレイの考察で引用された特許を参照されたい。米国特許出願公開第２００１００１８５１４号明細書、第２００１０００７７４７号明細書、および国際特許出願公開第０１４６４６７Ａ号パンフレット、第９９６０１６３Ａ号パンフレット、第０００９６５０Ａ号パンフレット、第００２６４１２Ａ号パンフレット、第００４２２２２Ａ号パンフレット、第００４７６００Ａ号パンフレット、および第０１０１１４４Ａ号パンフレットも参照されたい。

７．本発明のキット
本発明は、本明細書中で提供されたｔＣＧＨ法を容易にするおよび／または標準化するためのキットも提供する。本発明の種々の方法を実行するための物質および試薬をキットに提供して、これらの方法を容易にすることができる。本明細書中で使用される場合、「キット」という用語は、工程、アッセイ、解析、診断、予後、または操作を容易にする物品の組み合わせを指す。

１つの実施形態では、本発明によって提供されるキットは、平衡転座に関与するゲノム遺伝子座を線形増幅するための核酸プライマーを含んでいてもよい。ある実施形態では、キットは、複数のゲノム遺伝子座を多重線形増幅するためのプライマー混合物を含んでいてもよい。他の実施形態では、本発明のキットは、平衡染色体転座のｔＣＧＨ解析に使用するための高密度タイリングアレイを含んでいてもよい。ある実施形態では、本発明は、平衡転座によって特徴付けられる疾患の診断または予後に有用なキットを提供する。特定の実施形態では、疾患は、リンパ腫または白血病などの癌である。

特定の実施形態では、本発明は、骨髄性白血病に関連する平衡転座を検出するための高密度タイリングアレイを含むキットを提供する。本発明のキットは、骨髄性白血病に関連する平衡転座に関与するゲノム遺伝子座を多重線形増幅するためのプライマー混合物をさらに含んでいてもよい。具体的な実施形態では、タイリングアレイはＡＭＬパイロットアレイであってもよく、プライマー混合物は、ＭＰＭ混合物、８２１混合物、またはＰ１／Ｐ７混合物から選択されてもよい。

以下の例は、例示のために提供されているが、請求された発明を限定するものではない。

（実施例１）
Ｊ_Ｈ関連転座切断点の同定
アレイＣＧＨは、ゲノム不均衡を検出するが平衡ゲノム再編成は検出しないように設計されている。したがって、本発明者らは、合成ゲノム不均衡を生成して、標準的ＣＧＨアレイ上で平衡転座の部位を標示するための手段を追究した。リンパ腫細胞系の平衡免疫グロブリン転座をモデル系として使用して、本発明者らは、蛍光標識化およびマイクロアレイハイブリダイゼーションに先立つ標的線形増幅ステップにおいてゲノムＤＮＡを単に修飾することにより、平衡転座をアレイＣＧＨによって検出可能にする酵素的線形増幅反応を開発した。図１に概説されているように、Ｊ_Ｈ関連転座切断点を、Ｊ_Ｈコンセンサスプライマー（ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ、２００３年）を使用して酵素的に増幅し、その結果として切断点接合部を横断して転座パートナー遺伝子座へと至る線形増幅がもたらされる。単一プライマーの使用により、ＩｇＨパートナー遺伝子の同一性にかかわらず、Ｊ_Ｈ関連転座の増幅が可能になる。

典型的なｔＣＧＨ実験では、リンパ腫に由来するゲノムＤＮＡおよび正常対照に由来するゲノムＤＮＡを、Ｃｙ３（リンパ腫）またはＣｙ５（対照）を用いた線形増幅および蛍光標識化にかけ、その後、一般的ＩｇＨ融合パートナー遺伝子座を表すタイリング密度の特注オリゴヌクレオチドアレイと混合およびハイブリダイズさせる（図１）。ＢＣＬ２およびＭＹＣ遺伝子座を伴うＪ_Ｈ関連転座を、図２ａおよび２ｂに例示する。切断点は、それらの特徴的な直角三角形の形状によりｔＣＧＨアレイ上で同定され、垂直辺は非ＩｇＨ遺伝子座における切断点のゲノム位置を標示する。垂直辺の高さは、Ｊ_Ｈ関連線形増幅の程度を示す。この三角形の形状は、線形増幅ステップが様々なサイズのＤＮＡ断片を産生すること、およびＪ_Ｈプライマーからの距離が増加すると共に増幅強度が徐々に減衰して行くことと一致する。この切断点プロファイルの形状は増幅条件に依存し、伸長時間が増加すると共にｔＣＧＨアレイ上でのより幅広いプロファイルに帰着する（図６）。

ハイブリダイゼーション対照として正常ゲノムＤＮＡを使用することにより、平衡転座および染色体不均衡の両方を同一アレイ上で検出することが可能になる。例えば、ＲＬ７（Ｌｉｐｆｏｒｄ、１９８７年）（図３ａ、最上段パネル）およびＯＣＩ−Ｌｙ８（Ｔｗｅｅｄｄａｌｅ、１９８７年）細胞系（図４ａ）は、両方ともＪ_Ｈ−ＢＣＬ２転座およびＢＣＬ２イントロン２における大規模欠失を有することが見出された。ＯＣＩ−Ｌｙ８におけるＪ_Ｈ−ＢＣＬ２切断点に隣接している小規模欠失は、その転座に関連して発生した可能性が高い。ＭＯ２０５８マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）系統（Ｍｅｅｋｅｒ、１９９１年）（図３ｃ）では、ＣＣＮＤ１ ３’ＵＴＲ内のＪ_Ｈ切断点および小規模欠失に対してテロメア側にＣＣＮＤ１遺伝子座の重複がある。平衡転座に関連するアレイプロファイルの非対称的形状により、一般的に、これらとゲノム不均衡をｔＣＧＨアレイ上で容易に区別することが可能になる。これは、ｔＣＧＨの結果を、典型的なアレイＣＧＨのように、ゲノム不均衡だけが同定される擬似増幅実験と比較することによって例示される（図３ａおよび３ｃ、中段パネル）。また、ｔＣＧＨを使用して、線形的に増幅された正常ＤＮＡの代わりに擬似的に増幅された検査ＤＮＡを対照標本として使用することにより、単離した平衡転座を同定することができる（ゲノム不均衡を検出せずに）（図３ａおよび３ｃ、最下段パネル）。この様式で実施されるｔＣＧＨ実験は、複数の位置における「偽切断点」（補足データ、非表示）、典型的なｔＣＧＨ実験では、増幅された正常ＤＮＡを使用することにより最小限に抑えられるアーチファクトを示す。

（実施例２）
ＩｇＨスイッチ（Ｓ_Ｈ）関連転座切断点の同定
その後、線形増幅プライマーを、ＩｇＨスイッチ（Ｓ_Ｈ）領域を伴う転座を同定するように設計した。ヒトＳ_Ｈ領域は、特徴的な反復配列ユニットの複数タンデム反復を含有しており、Ｓ_μ、Ｓ_α、およびＳ_ε Ｅ領域では、反復単位は縮重五量体配列Ｇ（Ａ／Ｇ）ＧＣＴであるが、Ｓ_γ領域では、反復単位は８０〜９０ｎｔの長さであり、より複雑である（Ｍａｘ、１９８２年；Ｍｉｌｌｓ、１９９０年；Ｍｉｌｌｓ、１９９５年）。Ｓ_Ｈ関連転座切断点は、これらの反復領域全体に分布している。そのような多様な切断点の検出を容易するために、これらの反復単位を認識し、Ｓ_μ／Ｓ_α／Ｓ_ε領域（Ｓ_５プライマー）またはＳ_γ反復領域（Ｓ_γプライマー）内の複数位置において合成を準備するように、線形増幅プライマーを設計した。Ｊ_Ｈの代わりにＳ_５プライマーを使用して実施したｔＣＧＨを使用して、バーキットリンパ腫細胞系ＲａｊｉのＳ_μ−ＭＹＣ転座（Ｄｙｓｏｎ、１９８５年）（非表示）、および多発性骨髄腫系Ｕ−２６６の潜在的Ｓ_α−ＣＣＮＤ１融合（Ｇａｂｒｅａ、１９９９年）を同定した（図２ｃ）。

大細胞型リンパ腫細胞系ＯＣＩ−Ｌｙ８（Ｔｗｅｅｄｄａｌｅ、Ｌｉｍら、Ｂｌｏｏｄ ６９巻（５号）：１３０７〜１３１４頁（１９８７年））は、Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２およびＳ_γ３−ＢＣＬ６融合に加えてＭＹＣ再編成を有することが公知である（Ｆａｒｒｕｇｉａ、Ｄｕａｎら、Ｂｌｏｏｄ ８３巻（１号）：１９１〜１９８頁（１９９４年）；Ｃｈａｎｇ、Ｂｌｏｎｄａｌら、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９巻（１〜２号）：１６５〜７１頁（１９９５年）；Ｙｅ、Ｃｈａｇａｎｔｉら、ＥＭＢＯ １４巻（２４号）：６２０９〜１７頁（１９９５年））。分子細胞遺伝学的研究は、染色体３、８、１４、および１８の複雑な再編成の存在を確認したが（Ｃｈａｎｇａｎｔｉ、Ｒａｏら、Ｇｅｎｅｓ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ ２３巻（４号）：３２８〜３３６頁（１９９８年）；Ｍｅｈｒａ、Ｍｅｓｓｎｅｒら、Ｇｅｎｅｓ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ ３３巻（３号）：２２５〜２３４頁（２００２年）；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ、Ｂｕｃｈｏｎｎｅｔら、Ｂｌｏｏｄ １０１巻（１１号）：４５３９〜４５４６頁（２００３年））、ＭＹＣ再編成の詳細は、完全には確立されていない。Ｊ_Ｈプライマーを用いたｔＣＧＨを使用して、本発明者らは、Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２融合を確認した。興味深いことには、ＲＬ７細胞系で同定されたもの類似したＢＣＬ２イントロンの大規模欠失が、小規模切断点関連欠失と同様に付随的に同定された。その後、本発明者らは、本発明者らがＳ_γＲと名付け、Ｒが「逆」配向を意味し、プライマーの３’末端が１４ｑセントロメアの方向を指すこと示す、全Ｓ_γ反復を認識するコンセンサス線形増幅プライマーを設計した（図９）。Ｓ_γＲプライマーを使用して実施したｔＣＧＨは、Ｓ_γ３−ＢＣＬ６融合の同定に成功し（図４ｂ）、ＭＹＣ遺伝子の５’末端を伴うこれまで未同定のＳ_γ−ＭＹＣ融合を付随的に検出した（図４ｃ）。Ｓ_γＦ線形増幅プライマーを使用したｔＣＧＨ（Ｆは「順」配向を意味し、３’末端が１４ｑテロメアの方向を指すことを示す）は、相互Ｓ_γ−ＢＣＬ６融合の同定に成功した（図４ｄ）。しかしながら、相互Ｓ_γ−ＭＹＣ融合は、Ｓ_γＦ、Ｓ_ｐＦ、Ｓ_ｐＲ、Ｊ_Ｈ、またはＤ_Ｈ線形増幅プライマーを用いて実施したｔＣＧＨでは同定することができなかった。

（実施例３）
未知の転座切断点の同定
ｔＣＧＨが原発性腫瘍の新規な切断点を同定することが可能であることを実証するために、本発明者らは、Ｊ_Ｈ−ＣＣＮＤ１転座を有すると推定される一連のリンパ腫を研究した。マントル細胞リンパ腫は（ＭＣＬ、（Ｊａｒｅｓ、２００７年）に概説されており、ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）、Ｊ_Ｈ−ＣＣＮＤ１遺伝子融合およびＣＣＮＤ１タンパク質の過剰発現に帰着する転座によって特徴付けられる成熟Ｂ細胞リンパ腫である。ＭＯ２０５８細胞系（図３ｃ）を含むＭＣＬ症例の約４０〜５０％が、主要転座クラスター（ＭＴＣ）にクラスター化している切断点を有する一方で、ほとんどのＭＣＬ切断点は、ＣＣＮＤ１と、ＣＣＮＤ１に対して約４００ｋｂセントロメア側に位置しているＭＹＥＯＶ遺伝子との間の大規模遺伝子間領域全体にわたって散在している。ｔＣＧＨがまだ未同定の転座切断点を検出することができることを実証するために、本発明者らはｔＣＧＨを使用して、ＭＴＣ関連切断点を有していなかったＭＣＬ症例においてＪ_Ｈ−ＣＣＮＤ１転座を同定およびマッピングした。図６は、Ｊ_Ｈプライマーを使用して、４件のそのようなＭＣＬ症例および１つのｔ（１１；１４）陽性Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ−ＰＬＬ）を研究したｔＣＧＨ結果を示す。各々の場合において、増幅用のＰＣＲプライマーを直ちに設計すること、および固有のＪ_Ｈ−ＣＣＮＤ１融合を配列決定することを可能にするのに十分な分解能で、固有の切断点が予測された。切断点は、ＭＴＣのすぐ外側に切断点を有する１つの場合（Ｂ−ＰＬＬ）を含み、ＣＣＮＤ１切断点領域の約１４０ｋｂセグメントにわたって散在している（Ｖａａｎｄｒａｇｅｒ、１９９６年）。

（実施例４）
方法および物質
ゲノムＤＮＡ調製およびハイブリダイゼーション：検査および参照ＤＮＡの各々を、ＩｇＨ遺伝子座を標的とする１つもしくは複数のＪ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、もしくはＳ_Ｈプライマー、これらの遺伝子座再編成を標的とするＭＹＣ、ＢＣＬ２、もしくはＢＣＬ６プライマー、またはＢＣＲ、ＭＹＨ１１、ＭＬＬ、ＰＭＬ、もしくはＡＭＬ／ＲＵＮＸ１遺伝子座を伴う再編成を標的とする１つもしくは複数のプライマーを使用して線形増幅した（表３および５を参照）。増幅されたＤＮＡを超音波処理によって断片化し、下記の［０１２５］に記述されているように、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製ゲノムＤＮＡ標識キット）を用いて異なる標識化を行った。本質的に製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ社出版番号Ｇ４４１０−９００１０およびＧ４４２７−９００１０）により推奨されているように、標識検査ＤＮＡ試料および標識参照ＤＮＡ試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ社製特注ＨＤ−ＣＧＨ ８×１５Ｋマイクロアレイ（製品番号Ｇ４４２７Ａ）に共ハイブリダイズさせた。アレイデータを、Ａｇｉｌｅｎｔ社製Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒソフトウェア（バージョン９）およびＡｇｉｌｅｎｔ社製ＣＧＨＡｎａｌｙｔｉｃｓソフトウェア（バージョン３．４または３．５）を使用して解析した。

直鎖増幅：０．５μｇ〜２μｇゲノムＤＮＡ、２００ｍＭ ｄＮＴＰ、および１５０ｎＭ線形増幅プライマーを含有する線形増幅反応物（５０μｌ）を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ酵素系を使用して増幅した。多重反応物には、７５ｎＭの各個々の線形増幅プライマーが含有されていた。典型的な反応条件は以下のとおりだった：９５℃で５分間の変性、その後９５℃／１５秒間の変性、６０℃／１５秒間のアニーリング、および６８℃／６分間の伸長の１２サイクルであったが、２分から１８分間にまで及ぶ伸長時間を使用することにも成功しており、２０回までの増幅サイクルを幾つかの実験で実施した（例えば、図１７を参照）。線形増幅の後、その結果生じたＤＮＡ混合物を、４００μｌのＴＥ ｐＨ８．０中で３分間、氷上で、Ｍｉｓｏｎｉｘ社製４３１Ａカップホーンを備えたＦｉｓｈｅｒ社製５５０型Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを用いた超音波処理によって断片化し、その後３２μｌの最終容積に濃縮した（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ Ｙ３０）。蛍光標識化およびハイブリダイゼーションは、制限消化も全ゲノム増幅もいずれも実施されなかったこと以外は本質的に製造業者によって推奨されているように、Ａｇｉｌｅｎｔ社製ゲノムＤＮＡ標識キットＰＬＵＳ（Ｃａｔ＃ ５１８８−５３０９）を使用して実施した。一般的には、標識化を、標識ｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼを使用したランダムプライマー媒介性伸長によって実施した。これにより、結果として線形増幅産物ならびに試料中のゲノムＤＮＡの両方の標識化がもたらされる。しかしながら、増幅反応に標識ｄＮＴＰが含まれていることにより、線形増幅反応の産物をもっぱら標識化することができる。対照ヒトゲノムＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ社（Ｃａｔ＃ Ｇ１４７１（男性）およびＧ１５２１（女性））から取得した。

アレイの設計：ＩｇＨまたは骨髄性白血病（ＡＭＬ）切断点関連ゲノム領域を、プローブの長さ、予測融解温度、ならびにプローブの間隔および密度などのパラメーターを最適化するために設計されたアルゴリズムを使用して選択された特注オリゴヌクレオチドプローブにより、Ａｇｉｌｅｎｔ社製ＤＮＡマイクロアレイ（Ｇ４４２７Ａ）上にタイリング密度で再現した。特注プローブにより高密度に表すために選択されたゲノム領域を、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＡｎｎｏｔａｔｉｏｎＲｅｑｕｅｓｔ）を使用して最初にフィルタリングし、高度に保存された反復配列エレメントをマスクした。固有のオリゴヌクレオチドプローブをこれらの領域で同定できる場合があるため、高度に分岐した反復（＞１５％分岐）をマスクせず、ゲノム適用範囲を最大限にした。反復をマスクしたゲノムセグメントの各々にわたるプローブの均一空間分布を、プログラムＴｉｌｅを使用して生成した（下記を参照）。ＩｇＨ転座アレイは、ＩｇＨ転座に一般的に代表的な５つのゲノム遺伝子座：ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＣＮＤ１、ＭＬＴ１、およびＭＹＣを表す合計１１，８５２のプローブを含有していた（下記の表１を参照）。加えて、より低密度でさらに２３個のゲノム遺伝子座を表す２４１０個の対照プローブを、Ａｇｉｌｅｎｔ社のプローブライブラリー（ｈｔｔｐ：／／ｅａｒｒａｙ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｅａｒｒａｙ／）から選択した。ＡＭＬアレイ（下記の表４を参照）は、以下のゲノム遺伝子座：ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＥＴＯ（ＲＵＮＸ１Ｔ１）、ＡＭＬ１、ＲＡＲＡ、ＰＭＬ、ＣＢＦＢ、ＭＹＨ１１、ＭＬＬ、ＡＦ９、ＩＫＺＦ１（Ｉｋａｒｏｓ）を表す合計１４，２６２個のプローブを含有していた。

Ｔｉｌｅ（Ｎ． ＨｏｆｆｍａｎおよびＨ． Ｇｒｅｉｓｍａｎ、未発表）は、単純なアルゴリズムを使用して、指定されたパラメーターにできるだけ近い融解温度（Ｔｍ）を有するヌクレオチド、ＧＣ含量、およびヌクレオチドの長さの均一空間分布を生成する。入力は、オリゴヌクレオチド配列の一覧であり、各々は、目的のゲノムセグメントの開始および終了位置ならびに融解温度に関連付けされている。これらの実験で使用されたアレイの場合、オリゴヌクレオチド候補は、目的領域に及ぶ全ての考え得るＮ量体を含んでおり、Ｎは、２５から６０まで（ＩｇＨアレイの場合）または３５から６０まで（ＡＭＬアレイ）に及んでいた。オリゴヌクレオチド選択基準に使用されるパラメーターは以下のように定義される：
Ｄ_ｍａｘ、Ｄ_ｍｉｎ、Ｄ_ｏｐｔ − 開始位置からの最大、最小、最適距離
Ｔｍ_ｍａｘ、Ｔｍ_ｍｉｎ、Ｔｍ_ｏｐｔ − 最大、最小、および最適Ｔｍ
Ｔｍ_ｍａｘ、Ｔｍ_ｍｉｎ、Ｔｍ_ｏｐｔ − 最大、最小、および最適Ｔｍ
オリゴヌクレオチド選択アルゴリズムは、配列領域のヌクレオチド位置Ｐ_０から開始して、以下のように反復して進行する：
１．ヌクレオチド位置Ｐ_０＋Ｄ_ｍｉｎからＰ_０＋Ｄ_ｍａｘの間のオリゴヌクレオチドのセットをグループと見なす。
２．範囲［Ｔｍ_ｍａｘ、Ｔｍ_ｍｉｎ］外側のＴｍを有するオリゴヌクレオチドを取り除く。
３．位置Ｐ_ｉの各オリゴヌクレオチドｉについて、以下の値を計算する：
ａ．Ｄ_ｉ＝｜Ｐ_０＋Ｄ_ｏｐｔ−Ｐ_ｉ｜
したがって、より小さな値は、配列領域に最適な距離により近い位置に相当する。Ｄ_ｉは、最も近いＤ_ｂｉｎヌクレオチドに四捨五入してもよい（典型的には、値は５が使用される）
ｂ．ｄＴｍ_ｉ＝｜Ｔｍ_ｉ−Ｔｍ_ｏｐｔ｜
したがって、より小さな値のｄＴｍ_ｉは、最適Ｔｍにより近い融解温度に相当する。ｄＴｍ_ｉは、最も近いｄＴｍ_{ｒｏｕｎｄ}温度に四捨五入してもよい（典型的には、値は１度が使用される）
ｃ．−Ｌ_ｉ＝−１＊（オリゴ長）
したがって、より小さい数は、より長いオリゴヌクレオチドに相当する
ｄ．ＧＣ_ｉ＝１００＊（Ｇ＋Ｃ）／長さ
したがって、より小さい数は、より低いＧ＋Ｃ含量に相当する。ＧＣ_ｉは、最も近いパーセントに四捨五入された
４．各オリゴヌクレオチドｉについて、Ｄ_ｉ、ｄＴｍ_ｉ、−Ｌ_ｉ、および、ＧＣ_ｉの幾つかまたは全てから構成されるタプルの一覧を生成する。
５．この一覧の値を昇順に分類する。タプル中のＤ_ｉ、ｄＴｍ_ｉ、−Ｌ_ｉ、およびＧＣ_ｉの各々の相対的な位置は、そのパラメーターの相対的な重みを決定する（つまり、Ｄ_ｉがＧＣ_ｉに先行する場合、オリゴヌクレオチド長には、ＧＣ含量より大きな重みが与えられる）。
６．分類された一覧の最初のタプルに対応する位置Ｘのオリゴヌクレオチドを選択する。
７．Ｐ_０をＰ_Ｘに再設定し、上記工程を繰り返す。

このアルゴリズムは、目的配列上のオリゴヌクレオチド候補の適用範囲にある不連続領域にも取り組む。範囲［Ｐ_０＋Ｄ_ｍｉｎ、Ｐ_０＋Ｄ_ｍａｘ］に及ぶ配列領域、および範囲［Ｐ_{ｇａｐｓｔａｒｔ}、Ｐ_{ｇａｐｓｔｏｐ}］に及ぶ「ギャップ」（すなわち、オリゴヌクレオチド候補を含有しない配列領域）を考慮する。Ｐ_{ｇａｐｓｔａｒｔ}＜Ｐ_０＋Ｄ_ｍａｘであれば、この反復では、オリゴヌクレオチドは、範囲［Ｐ_０＋Ｄ_ｍｉｎ、Ｐ_{ｇａｐｓｔａｒｔ}］から選択されるであろう。次の反復では、オリゴヌクレオチド選択は、ギャップの後から開始することになり、Ｐ_０を（Ｐ_{ｇａｐｓｔｏｐ}−Ｄ_ｏｐｔ）に設定して、オリゴヌクレオチド候補の適用範囲が再開する地点により近いオリゴヌクレオチドの検討を強制する。

最適プローブ長は６０塩基であり、プローブ間の最適距離は５０から１００塩基の間であり、許容されるＧＣ含量は２０％〜８０％であり、最適Ｔｍは７４．５℃であり、それらはＥＭＢＯＳＳソフトウェアスイート（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）からのプログラムＤａｎを使用して計算した。

新規切断点の確認
５件全てのＭＣＬ症例におけるＪ_Ｈ−ＣＣＮＤ１融合、１件の濾胞性リンパ腫（ＦＣＬ）症例およびＤＨＬ１６におけるＪ_Ｈ−ＢＣＬ２融合、ならびにＯＣＩ−Ｌｙ８における４つ全ての新規なＩｇＨ融合（Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２、Ｄ_Ｈ−ＢＣＬ２、Ｓ_γ２−ＭＹＣ、およびＳ_γ３−ＢＣＬ６）を含む、新規の転座および欠失切断点は全て、ＰＣＲ増幅およびサンガー配列決定法によって確認した。パートナー切断点を表２に提供し、配列を下記に提供する。加えて、ＲＬ７（ｃｈｒ１８：５８，９５４，７２９〜５９，１２２，２０８）およびＯＣＩ−Ｌｙ８（ｃｈｒ１８：５８，９９８，６０４〜５９，１３３，９５４）における新規なイントロン性ＢＣＬ２欠失は各々、各欠失を隣接する特異的ＢＣＬ２プライマーを使用して増幅および配列決定した。以下を参照されたい。

ＭＣＬ１ Ｊ_Ｈ−ＣＣＮＤ１融合のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＭＣＬ２ Ｊ_Ｈ−ＣＣＮＤ１融合のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＭＣＬ３ Ｊ_Ｈ−ＣＣＮＤ１融合のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＭＣＬ４ Ｊ_Ｈ−ＣＣＮＤ１融合のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＭＣＬ５ Ｊ_Ｈ−ＣＣＮＤ１融合のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＦＣＬ Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２融合のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＤＨＬ１６ Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２融合のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＯＣＩ−Ｌｙ８ Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２融合のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＯＣＩ−Ｌｙ８ Ｄ_Ｈ−ＢＣＬ２融合のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＯＣＩ−Ｌｙ８ Ｓγ２−ＭＹＣ融合のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＯＣＩ−Ｌｙ８ Ｓγ２−ＢＣＬ６（ＳγＦ）融合のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＯＣＩ−Ｌｙ８イントロン性ＢＣＬ２欠失のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

ＲＬ７イントロン性ＢＣＬ２欠失のＰＣＲ／配列決定プライマーおよび切断点配列：

（実施例５）
免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）転座の同定
平衡再編成をオリゴヌクレオチドアレイ上で検出可能にするために、切断点関連ゲノムＤＮＡ配列を、ＤＮＡ標識化およびアレイハイブリダイゼーションの前に酵素的に増幅する。この線形増幅ステップでは、単一のオリゴプライマーを使用して、あるゲノム遺伝子座から始まり、転座切断点を横断してパートナー遺伝子座へと伸長するハイブリッドＤＮＡ断片の合成を非対称的に準備する（図７）。パートナー遺伝子座を表すように設計されているタイリング密度オリゴアレイへの、増幅された標識ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションは、転座パートナーを同定すること、およびゲノム切断点を高分解能にマッピングすることを可能にする（図７）。パートナー遺伝子座を標的とする第２のプライマーが増幅に必要とされないため、ｔＣＧＨは、大規模なゲノム領域にわたっておよび複数のパートナー遺伝子座に散在した転座切断点を、単一のアレイを使用して検出することができる。増幅された正常ゲノムＤＮＡを、参照試料としてアレイハイブリダイゼーションに使用するため、ｔＣＧＨは、ゲノム不均衡および平衡転座を同一アレイ上で検出することができる。

本例では、種々のＢ細胞リンパ腫および形質細胞骨髄腫において様々なパートナー遺伝子座を伴う場合がある免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）の転座をモデル系として研究し、ｔＣＧＨを開発および検証した。特定のリンパ腫または骨髄腫における特異的ＩｇＨパートナー遺伝子座の同定は、正確な診断および分類、ならびに臨床転帰および予後の予測にとって不可欠である。ＩｇＨ転座は、異常ＶＤＪまたはクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の副産物として生じ、典型的にはオンコジーンの全コード領域を、保存されたＩｇＨ調節領域に融合させると考えられるため、ＩｇＨ遺伝子座内の切断点は、保存された連結（Ｊ_Ｈ）セグメント、多様性（Ｄ_Ｈ）セグメント、またはスイッチ（Ｓ_Ｈ）セグメントに位置する傾向があるが（図８）、種々のＩｇＨパートナー遺伝子座の切断点は、数百キロベースのゲノム配列にわたって散在する場合がある。ＩｇＨ転座のこれらの特徴が、保存されたＩｇＨ切断点領域を全て検出可能な小セットの線形増幅プライマーを設計することによって、および複数のＩｇＨパートナー遺伝子座をタイリング密度で再現している高分解能特注オリゴヌクレオチドアレイを設計することによって利用される。本明細書中に記述されているパイロットアレイは、ＣＣＮＤ１およびＢＣＬ２切断点領域ならびにＭＹＣおよびＢＣＬ６切断点領域の一部を含む合計約１Ｍｂのゲノム配列を表す。ＩｇＨ遺伝子座は、最近の遺伝子重複によって特徴付けられており（Ｒａｖｅｔｃｈ、Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ ２７巻（３号、第２部）：５８３〜５９１頁；Ｍａｔｓｕｄａ、Ｉｓｈｉｉら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８巻（１１号）２１５１〜２１６２頁（１９９８年））、したがってこのパイロットアレイ上には再現されていなかった。

ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＭＹＣ、およびＣＣＮＤ１遺伝子座を伴う、よく特徴付けられているＩｇＨ転座を有する８つのリンパ腫および骨髄腫細胞系の一団を使用して、ｔＣＧＨを試験および検証した。９つの公知のＩｇＨ転座は、全て同定および高分解能でマッピングされ、同様にこれまで知られていなかったＩｇＨ−ＭＹＣ再編成およびＩｇＨパートナー遺伝子座における複数のコピー数異常が同定および高分解能でマッピングされた。ＶＤＪ関連転座では、ｄｅｒ（１４）染色体のＩｇＨ切断点は、典型的には６つのＪ_Ｈセグメントのうちの１つに位置するが、相互染色体上の切断点は、２７個のＤ_Ｈセグメントのうちの１つに位置する（ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ、Ｌａｎｇｅｒａｋら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７巻（１２号）：２２５７〜３１７頁（２００３年））。Ｊ_Ｈ切断点およびそれらの相互Ｄ_Ｈ対応点を、単一のコンセンサスＪ_Ｈプライマー、または７つのコンセンサスＤ_Ｈプライマーの等モル混合物のいずれかを使用して、線形増幅によって独立して同定した（図９）。例えば、リンパ腫細胞系ＤＨＬ１６（Ｈｅｃｈｔ、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １４巻（３〜４号）：２０５頁（１９８５年））における典型的な平衡ＩｇＨ−ＢＣＬ２転座のｔＣＧＨ解析は、相互Ｊ_Ｈ−ＢＣＬ２およびＢＣＬ２−Ｄ_Ｈ融合（それぞれ、図１０ａおよび１０ｂ）が、ＢＣＬ２マイナー転座クラスターに位置することを示す（ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ、Ｌａｎｇｅｒａｋら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７巻（１２号）：２２５７〜３１７頁（２００３年））。Ｊ_ＨおよびＤ_Ｈ融合は、転座切断点を正確で高分解能に標示する単一の明確な境界を有する非対称的な擬似アンプリコンとして蛍光対数比プロットに出現する。このアンプリコンの振幅は、切断点からのゲノム距離が増加すると共に徐々に減少し、数キロベースの範囲で基線に戻る。各アンプリコンの配向は増幅の方向に依存し、Ｊ_Ｈプライマーの場合はテロメアに向かっており（図１０ｂ）、Ｄ_Ｈプライマーの場合はセントロメアに向かう（図１０ｂ）。対照的に、個々のアンプリコンの振幅、幅、および形状は、線形増幅プライマー、増幅条件、および恐らくは局所的ゲノム配列を含む外因的パラメーターに応じて変動すると考えられる。

Ｊ_ＨおよびＤ_Ｈプライマーを、バーキットリンパ腫細胞系ＭＣ１１６のＩｇＨ−ＭＹＣ融合（図１０ｆ）、ならびにマントル細胞リンパ腫系ＭＯ２０５８およびＧｒａｎｔａ５１９のＩｇＨ−ＣＣＮＤ１融合（図１３ａ、１３ｄ）をマッピングするためにも使用した。ｔＣＧＨの解析感度を、等量のＤＨＬ１６、ＲＬ７、およびＧｒａｎｔａ５１９ゲノムＤＮＡを混合することにより決定し（「３３％希釈」と呼ばれる）、正常ゲノムＤＮＡと混合することにより２０％および１５％希釈試料を生成した。これらの希釈物を、Ｊ_Ｈプライマーを使用して１２または２０サイクルで増幅し、同様に増幅された正常ゲノムＤＮＡに共ハイブリダイズさせた。図１７に示されているように、１２サイクルで増幅した際の１５％希釈物のシグナルは、２０サイクルより弱かったが、３つの切断点は全て各試料において検出可能だった。

Ｓ_Ｈ関連転座を同定するために、Ｓ_μ、Ｓ_α、およびＳ_ε反復を標的とするように相互Ｓ_ＰＦおよびＳ_ＰＲ増幅プライマーを設計し、それらは全て、５量体配列（ＧＲＧＣＴ）_ｎ（Ｍｉｌｌｓ、Ｂｒｏｏｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８巻（２４号）：７３０５〜１６頁（１９９０年））、ならびに４つの密接に関連するＳ_γ反復を標的とする相互Ｓ_γＦおよびＳ_γＲプライマー（Ｍｉｌｌｓ， Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５巻（６号）：３０２１〜３０３６頁（１９９５年））を含有していた（表３）。Ｓ_γＦまたはＳ_γＲプライマーによるＯＣＩ−Ｌｙ８リンパ腫細胞系（Ｔｗｅｅｄｄａｌｅ、Ｌｉｍら、Ｂｌｏｏｄ ６９巻（５号）：１３０７〜１３１４頁（１９８７年））の線形増幅は、相互Ｓ_γ３−ＢＣＬ６融合を両方とも同定し（図１０ｃおよび１０ｄ）、そのうちの１つだけが以前に同定およびクローニングされていた（Ｙｅ、Ｃｈａｇａｎｔｉら、ＥＭＢＯ Ｊ． １４巻（２４号）６２０７〜１７（１９９５年））。同様に、Ｓ_ｐＦおよびＳ_γＲプライマーによる骨髄腫細胞系Ｕ２６６の線形増幅（図１５）は、Ｓ_α１からＳ_γ４まで伸長し３’α１エンハンサーを包含する約１００ｋｂのＩｇＨ定常領域セグメントのＣＣＮＤ１遺伝子座への潜在的挿入を同定した（Ｇａｂｒｅａ、Ｂｅｒｇｓａｇｅｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ２巻（１号）：１１９頁（１９９９年））。Ｊ_Ｈプライマーによるアンプリコンのように、Ｓ_ｐＦまたはＳ_γＦを使用して増幅されたものは、テロメアに向かって配向されており、ｄｅｒ（１４）コード化融合に対応するが、Ｓ_ｐＲ、Ｓ_γＲ、またはＤ_Ｈプライマーによる線形増幅は、相互誘導染色体での融合に対応するセントロメア側に配向されたアンプリコンを産出する（図９）。

ＯＣＩ−Ｌｙ８における公知のＳ_γ３−ＢＣＬ６転座の同定に加えて、Ｓ_γＲプライマーによる増幅は、意外にもこれまで未同定のＳ_γ２−ＭＹＣ融合も明らかにした（図１１ｅ）。ＯＣＩ−Ｌｙ８に関するこれまでの細胞遺伝学的および分子的な研究により、染色体３、８、１４、および１８上のＢＣＬ６、ＭＹＣ、ＩｇＨ、およびＢＣＬ２遺伝子座を伴う複雑な再編成が示されているが（Ｆａｒｒｕｇｉａ、Ｄｕａｎら、Ｂｌｏｏｄ ８３巻（１号）：１９１〜１９８頁（１９９４年）；Ｃｈａｎｇ、Ｂｌｏｎｄａｌら、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９巻（１〜２号）：１６５〜７１頁（１９９５年）；Ｙｅ、Ｃｈａｇａｎｔｉら、ＥＭＢＯ Ｊ． １４巻（２４号）６２０７〜１７頁（１９９５年）；Ｃｈａｎｇａｎｔｉ、Ｒａｏら、Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ ２３巻（４号）：３２８〜３３６頁（１９９８年）；およびＳａｎｃｈｅｚ−Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ、Ｓｉｅｂｅｒｔら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １５巻（９号）：１４７５〜８４頁（２００１年））、これら６つの潜在的なＩｇＨ融合産物のうちの１つだけがクローニングおよび配列決定されている（Ｙｅ、Ｃｈａｇａｎｔｉら、ＥＭＢＯ Ｊ． １４巻（２４号）６２０７〜１７頁（１９９５年））。ｔＣＧＨは、ＯＣＩ−Ｌｙ８において合計５つのＩｇＨ融合を同定し、それらには、平衡Ｓ_γ３−ＢＣＬ６転座（図１０）およびＪ_Ｈ／Ｄ_Ｈ−ＢＣＬ２転座（下記および図１０を参照）ならびに見かけ上平衡なＳ_γ２−ＭＹＣ再編成（図１１ｅ）の両相互融合産物が含まれる。興味深いことには、例外的に大規模な、約６ｋｂの、ＩｇＨ−ＢＣＬ２切断点における欠失（図１４）、およびＳ_γ３スイッチ反復領域の外部にあり、接合部のマイクロホモロジーを示すＩｇＨ−ＭＹＣ切断点を含む、ＯＣＩ−Ｌｙ８の転座切断点配列に関する幾つかの例外的な特徴は、非従来的な機序がこれらの再編成の根底にあることを示唆する（Ｊａｇｅｒ、Ｂｏｃｓｋｏｒら、Ｂｌｏｏｄ ９５巻（１１号）：３５２０〜３５２９頁（２０００年）；Ｓｈｏｕ、Ｍａｒｔｅｌｌｉら、ＰＮＡＳ ９７巻（１号）：２２８〜２３３頁（２０００年）；Ｃｏｒｎｅｏ、Ｗｅｎｄｌａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ ４４９巻（７１６１号）：４８３〜４８６頁（２００７年）；およびＹａｎ、Ｂｏｂｏｉｌａら、Ｎａｔｕｒｅ ４４９巻（７１６１号）４７８〜４８２頁（２００７年））。実際、Ｊ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、またはＳ_Ｈ線形増幅プライマーを使用して相互ＩｇＨ−ＭＹＣ融合を同定するその後の試みは成功せず、非標準的ＩｇＨ切断点、または非ＩｇＨパートナー遺伝子座を伴うより複雑な再編成のいずれかを示唆した（Ｃｈａｎｇａｎｔｉ、Ｒａｏら、Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ ２３巻（４号）：３２８〜３３６頁（１９９８年））。

ＭＹＣまたはＢＣＬ６遺伝子再編成のサブセットは、ＩｇＨを伴わないが、その代わりに免疫グロブリンカッパおよびラムダ軽鎖遺伝子座または種々の他の非ＩｇＨ遺伝子座を伴う（Ａｋａｓａｋａ、Ａｋａｓａｋａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０巻（９号）：２３３５〜２３４１頁（２０００年）；Ｓｈｏｕ、Ｍａｒｔｅｌｌｉら、ＰＮＡＳ ９７巻（１号）：２２８〜２３３頁（２０００年））。ｔＣＧＨがこれらの遺伝子座で非ＩｇＨ再編成を検出可能であることを実証するために、ＭＹＣおよびＢＣＬ６エキソン１付近に位置する転座切断点ホットスポットを標的とするように設計された線形増幅プライマーを使用した（Ａｋａｓａｋａ、Ａｋａｓａｋａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０巻（９号）：２３３５〜２３４１頁（２０００年）；Ｂｕｓｃｈ、Ｋｅｌｌｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２１巻（８号）：１７３９頁（２００７年）。対数比率プロットには、これらの再編成が（図１０ｅ、１０ｉ）、それらの「逆」配向、線形増幅プライマーと同じ遺伝子座内のｔＣＧＨにより同定された切断点の予測される特徴を除いて、上述のＩｇＨ再編成と同じように出現する（図７の「遺伝子Ａ」）。これらの実験は、ｔＣＧＨが、ＭＹＣおよびＢＣＬ６再編成を検出可能であり、それらの再編成パートナーが公知でないかまたはアレイ上に再現されていなくとも、これらの遺伝子座内の切断点を同定可能であることを確立する。

（実施例６）
新規な染色体重複および欠失の同定
腫瘍および正常ゲノムＤＮＡは、線形増幅および標識化後で同一アレイに共ハイブリダイズされるため（図７）、ｔＣＧＨは、平衡再編成に加えてコピー数変化を検出するであろうことが予測された。実際、同じ遺伝子座におけるＩｇＨ転座と関連して、ＢＣＬ２およびＣＣＮＤ１遺伝子座における、これまで認識されていない欠失および重複を幾つか同定した。例えば、公知のＪ_Ｈ−ＢＣＬ２転座を有するＲＬ７リンパ腫細胞系では、ＢＣＬ２の大規模（１９０ｋｂ）イントロン内の新規な１６７ｋｂ中間部欠失を同定した（図１１ａ）。同様の１３５ｋｂイントロン性ＢＣＬ２欠失がＯＣＩ−Ｌｙ８において同定され、同様にＪ_Ｈ−ＢＣＬ２切断点接合部の明確な６．２ｋｂ欠失が同定された（図１３）。これらの異常を、各々ＰＣＲ増幅および配列決定により確認した。ＭＯ２０５８およびＧｒａｎｔａ５１９の両方で、ＣＣＮＤ１遺伝子に及び、それぞれのＪ_Ｈ−ＣＣＮＤ１切断点接合部に正確に伸長する重複が同定され、各重複事象がｄｅｒ（１４）ｔ（１１；１４）染色体に生じたことが示唆された。（図１３）。ＣＣＮＤ１ ３’非翻訳領域における公知の１８５２ｎｔ欠失（Ｗｉｔｈｅｒｓ、Ｈａｒｖｅｙら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１巻（１０号）：４８４６〜４８５３頁（１９９１年））も、ＭＯ２０５８において同定された（図１３ａ）。最後に、新規な５６２ｎｔ欠失多型が、ＣＣＮＤ１遺伝子の約５５ｋｂ上流に同定および特徴付けられた（図１２ｂ）。コピー数変化のｔＣＧＨ検出は、使用された特定の線形増幅に依存しなかった（図１１ａ〜ｃおよび図１４）。中間部欠失の切断点も、欠失切断点を横断する線形増幅によってマッピングすることができる（図１１パネルａ、ｄ、ｅ）。

上述のｔＣＧＨ実験では、線形的に増幅された腫瘍ＤＮＡを、同様に増幅された正常ゲノムＤＮＡと共ハイブリダイズさせた（図７）。増幅された正常ＤＮＡではなく擬似増幅された腫瘍ＤＮＡをハイブリダイゼーション対照として使用する場合、ｔＣＧＨは、平衡再編成を検出することが予期されるが、コピー数変化は検出しないだろう（図１１ｄならび図１６ａおよび１６ｂ）。しかしながら、これらの条件下では、予期された転座切断点から離れている「オフターゲット」増幅も、正常ゲノムＤＮＡについてでさえ観察された。オフターゲット増幅シグナルの数およびパターンは線形増幅プライマーに依存し、反復スイッチ配列を標的とするＳ_Ｈプライマーの場合はより複雑であると考えられるが、オフターゲットシグナルのパターンは、任意の所与のプライマーで際立って再現性がある（図１５および１６）。同じプライマーを使用して腫瘍および正常ＤＮＡを増幅し、従来のｔＣＧＨでのように共ハイブリダイズさせる場合（図７）、２つの試料のオフターゲットシグナルは完全に一致し、それにより効果的に互いをマスクし、標的とされた転座切断点のみを明らかにした。

ｔ（１１；１４）および関連Ｊ_Ｈ−ＣＣＮＤ１融合は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）に特徴的である。ＭＣＬ症例の約４０％で、ＣＣＮＤ１切断点は、約１００ｎｔの主要転座クラスター（ＭＴＣ）内に位置するが（ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ、Ｌａｎｇｅｒａｋら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７巻（１２号）：２２５７〜３１７頁（２００３年））、ＭＣＬ症例の他の約６０％は、ＭＴＣを隣接する約４００ｋｂ領域にわたって散在する非ＭＴＣ切断点を有する（Ｖａａｎｄｒａｇｅｒ、Ｓｃｈｕｕｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ８８巻（４号）：１１７７〜１１８２頁（１９９６年））。容易にクローニングおよび分析されるＭＴＣ切断点とは対照的に（Ｗｅｔｚｅｌ、Ｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１巻（４号）：１６２９〜１６３６頁（２００１年））、非ＭＴＣ切断点は、クローニングがより難しいことが判明しており、稀な例だけが配列決定されている（Ｍｅｅｋｅｒ、Ｇｒｉｍａｌｄｉら、Ｂｌｏｏｄ ７４巻（５号）：１８０１〜１８０６頁（１９８９年）；Ｍｅｅｋｅｒ、Ｓｅｌｌｅｒｓら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ５巻（９号）：７３３〜７頁（１９９１年）；Ｗｉｌｌｉｓ、Ｊａｄａｙｅｌら、Ｂｌｏｏｄ ９０巻（６号）：２４５６〜２４６４頁（１９９７年））。ｔＣＧＨが原発性リンパ腫試料中の新規な切断点を同定可能であるかどうかを決定するために、本発明者らは、非ＭＴＣ切断点を有する５件の原発性ＭＣＬ症例を分析した。新規なＣＣＮＤ１切断点を各々１００ｎｔ分解能にマッピングし（図１２）、切断点接合部の迅速な確認および配列決定を可能にした。切断点は、ＭＴＣからわずか約２００ｂｐ離れて位置していたものを含むＣＣＮＤ１遺伝子に対してセントロメア側の約１５０ｋｂの領域にわたって散在していた。

（実施例６）
骨髄性白血病の平衡転座の検出用ｔＣＧＨアレイの確立および検証
本例は、骨髄性白血病に一般的な平衡転座、染色体欠失、染色体重複、および染色体逆位などの染色体異常の検出に有用なｔＣＧＨアレイの確立を例示する。転座および大規模欠失などの染色体異常によって一般的に分断されている１１個の遺伝子を包含し、８３ｎｔの平均間隔で１．１Ｍｂｐを包含する１４，２６２個のプローブ配列を含有するマイクロアレイを構築した（表４）。その後、プライマー混合物（表５）を、種々の骨髄性白血病細胞系から単離された染色体ＤＮＡの多重線形増幅に使用した。表４に概要が示されているＡＭＬパイロットアレイにハイブリダイゼーションさせることにより、増幅された染色体配列に対してｔＣＧＨ解析を実施した。

図１８は、ＭＰＭプライマーセットと共に、３つの慢性骨髄性白血病細胞系、ＣＭＬ１、ＣＭＬ２、およびＫ５６２のＡＭＬパイロットアレイを使用した多重ｔＣＧＨ解析の結果を示す。転座切断点は、この解析で明瞭に捉えられる。ＣＭＬ１白血病細胞系のｉｋａｒｏｓ遺伝子における大規模染色体欠失も、解析によって例示される。この例は、多重ｔＣＧＨ解析が、慢性骨髄性白血病に関連する平衡ＢＣＲ−ＡＢＬ転座の遺伝子型、ならびに関連染色体欠失および増幅を同時に決定することができることを実証する。

図１９は、ＲＡＲＡ遺伝子において異なる転座切断点を有するＰＭＬ−ＲＡＲＡ平衡転座ｔ（１５；２１）によって特徴付けられる２つの急性前骨髄球白血病細胞系（ＡＰＬ１およびＡＰＬ２）の、ＡＭＬパイロットアレイを使用した多重ｔＣＧＨ解析の結果、および染色体逆位ｉｎｖ（１６）／ｔ（１６：１６）により引き起こされるＭＹＨ１１−ＣＢＦＢ融合によって特徴付けられる２つの急性骨髄単球性白血病／好酸球増多症細胞系（Ｍ４Ｅｏ１およびＭ４Ｅｏ２）の、骨髄性プライマー混合物（ＭＰＭ）およびＡＭＬパイロットアレイを使用した多重ｔＣＧＨ解析の結果を示す。本例で見ることができるように、多重ｔＣＧＨ解析は、平衡転座および染色体逆位などの種々の染色体異常の遺伝子型を同時に決定することができる。

図２０は、ＡＦ９−ＭＬＬ平衡転座ｔ（９；１１）によって特徴付けられるＭＬＬ白血病細胞系の、Ｐ１／Ｐ７プライマー混合物（ＭＰＭ）およびＡＭＬパイロットアレイを使用した多重ｔＣＧＨ解析の結果、およびＥＴＯ−ＡＭＬ１平衡転座ｔ（８；２１）によって特徴付けられるＫａｓｕｍｉ急性骨髄性白血病細胞系の、８２１プライマー混合物（ＭＰＭ）およびＡＭＬパイロットアレイを使用した多重ｔＣＧＨ解析の結果を示す。本例は、多重ｔＣＧＨが、平衡転座、染色体欠失、染色体重複、染色体逆位を含む広範囲の染色体異常の遺伝子型決定に使用するために受け入れられることを実証する。

本明細書中に記述された例および実施形態は、例示目的のためだけのものであり、種々の改変または変更は、それらに照らして当業者に示唆されることになり、本出願の趣旨および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書中に引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、これによってあらゆる目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。

Claims (89)

1. 検査試料中の公知のゲノム遺伝子座における染色体再編成を決定する方法であって、
   （ａ）検査試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離することと、
   （ｂ）前記公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、前記第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第１の検出可能な標識を含む増幅された検査ＤＮＡ産物を生成すること、および前記公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、前記第２のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第２の検出可能な標識を含む増幅された参照ＤＮＡ産物を生成することと、
   （ｃ）前記増幅された検査ＤＮＡ産物および参照ＤＮＡ産物を、ゲノムＤＮＡ配列を含むＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせることと、
   （ｄ）前記ＤＮＡマイクロアレイへの、前記増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションのパターンおよび程度を、前記増幅された参照ＤＮＡ産物と比較することとを含み、
   前記公知のゲノム遺伝子座のＤＮＡマイクロアレイエレメントとは異なるＤＮＡマイクロアレイエレメントへの、前記線形増幅された検査試料ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、前記線形増幅された参照試料ＤＮＡ産物を上回ることが、前記細胞における、前記公知のゲノム遺伝子座の、第２のゲノム遺伝子座との再編成を示す方法。
2. 前記再編成が染色体転座である、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１および第２の検出可能な標識が増幅中に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１および第２の検出可能な標識が増幅後に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
5. 前記第１および第２の検出可能な標識が蛍光標識である、請求項１に記載の方法。
6. 前記蛍光標識がＣｙ３およびＣｙ５である、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＤＮＡマイクロアレイがタイリング密度ＤＮＡマイクロアレイである、請求項１に記載の方法。
8. 前記公知のゲノム遺伝子座が免疫グロブリン遺伝子に対応する、請求項１に記載の方法。
9. 前記検査試料の前記細胞が腫瘍細胞であり、前記参照細胞が正常細胞である、請求項１に記載の方法。
10. 前記腫瘍細胞が、リンパ腫または白血病細胞である、請求項９に記載の方法。
11. 検査試料中の公知のゲノム遺伝子座の染色体再編成パートナーを同定する方法であって、
    （ａ）検査試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離することと、
    （ｂ）公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、前記第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第１の検出可能な標識を含む増幅された検査ＤＮＡ産物を生成すること、および前記公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、前記第２のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第２の検出可能な標識を含む増幅された参照ＤＮＡ産物を生成することと、
    （ｃ）前記標識および増幅された検査ＤＮＡ産物および参照ＤＮＡ産物を、ゲノムＤＮＡ配列を含むＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせることと、
    （ｄ）前記ＤＮＡマイクロアレイへの、前記増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションのパターンおよび程度を、前記増幅された参照ＤＮＡ産物と比較することとを含み、
    前記公知のゲノム遺伝子座のＤＮＡマイクロアレイエレメントとは異なるＤＮＡマイクロアレイエレメントへの、前記線形増幅された検査試料ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、前記線形増幅された参照試料ＤＮＡ産物を上回ることが、前記ＤＮＡマイクロアレイの前記エレメントを、前記公知のゲノム遺伝子座の再編成パートナーとして同定する方法。
12. 前記再編成が染色体転座である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記増幅されたＤＮＡ産物にハイブリダイズする、前記公知のゲノム遺伝子座の線形配列に対応する一連のエレメントの最後のエレメントを決定し、それによって前記公知のゲノム遺伝子座の再編成切断点のおおよその位置を同定するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
14. 前記増幅されたＤＮＡ産物にハイブリダイズする、前記公知のゲノム遺伝子座の線形配列とは異なる第２のゲノム遺伝子座の線形配列に対応する一連のエレメントの最初のエレメントを決定し、それによって前記再編成パートナーの再編成切断点のおおよその位置を同定するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
15. 前記第１および第２の検出可能な標識が増幅中に組み込まれる、請求項１１に記載の方法。
16. 前記第１および第２の検出可能な標識が増幅後に組み込まれる、請求項１１に記載の方法。
17. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項１１に記載の方法。
18. 前記蛍光標識がＣｙ３およびＣｙ５である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ＤＮＡマイクロアレイがタイリング密度ＤＮＡマイクロアレイである、請求項１１に記載の方法。
20. 前記公知のゲノム遺伝子座が免疫グロブリン遺伝子に対応する、請求項１１に記載の方法。
21. 前記検査試料の前記細胞が腫瘍細胞であり、前記参照細胞が正常細胞である、請求項１１に記載の方法。
22. 前記腫瘍細胞が、リンパ腫または白血病細胞である、請求項２１に記載の方法。
23. 検査試料の公知のゲノム遺伝子座における、染色体転座を含めた、複数の染色体再編成を同時に決定する方法であって、
    （ａ）検査試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離することと、
    （ｂ）公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、前記第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅を実施して、検査ゲノムＤＮＡおよびプライマー特異的な増幅された検査ＤＮＡ産物の混合物を生成すること、および同じ前記公知のゲノム遺伝子座試料内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、前記第２のゲノムＤＮＡの線形増幅を実施して、参照ゲノムＤＮＡおよびプライマー特異的な増幅された参照ＤＮＡ産物の混合物を生成することと、
    （ｃ）前記検査試料混合物および参照試料混合物を、オリゴヌクレオチドでプライミングされたポリメラーゼ媒介性伸長によって、さらに増幅および標識化することと、
    （ｄ）前記標識および増幅された検査ＤＮＡ産物および参照ＤＮＡ産物を、ゲノムＤＮＡ配列を含むＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせることと、
    （ｅ）前記ＤＮＡマイクロアレイへの、前記増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションのパターンおよび程度を、前記増幅された参照ＤＮＡ産物と比較することとを含み、
    （ｉ）前記ＤＮＡマイクロアレイのエレメントに、前記増幅された検査ＤＮＡ産物および増幅された参照ＤＮＡ産物の両方がハイブリダイズする場合、前記エレメントへの、前記増幅された参照ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションの程度と比較して、前記ＤＮＡマイクロアレイの前記エレメントへの、増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションの程度がより大きいことが、前記マイクロアレイの前記エレメントによって表される前記検査試料中のＤＮＡ配列の増幅を示し、
    （ｉｉ）前記ＤＮＡマイクロアレイのエレメントへの、前記増幅された参照ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、前記ＤＮＡマイクロアレイの前記エレメントへの、前記増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションを上回ることが、前記マイクロアレイの前記エレメントによって表される前記検査試料中のＤＮＡ配列の欠失を示し、
    （ｉｉｉ）前記公知のゲノム遺伝子座のＤＮＡマイクロアレイエレメントとは異なるＤＮＡアレイエレメントへの、前記増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、前記ＤＮＡアレイエレメントへの、前記増幅された参照ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションを上回ることが、前記細胞における、前記公知のゲノム遺伝子座の、第２のゲノム遺伝子座との転座を示す方法。
24. 前記第１および第２の検出可能な標識が増幅中に組み込まれる、請求項２３に記載の方法。
25. 前記第１および第２の検出可能な標識が増幅後に組み込まれる、請求項２３に記載の方法。
26. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項２３に記載の方法。
27. 前記蛍光標識がＣｙ３およびＣｙ５である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ＤＮＡマイクロアレイがタイリング密度ＤＮＡマイクロアレイである、請求項２３に記載の方法。
29. 前記公知のゲノム遺伝子座が免疫グロブリン遺伝子に対応する、請求項２３に記載の方法。
30. 前記検査試料の前記細胞が腫瘍細胞であり、前記参照細胞が正常細胞である、請求項２３に記載の方法。
31. 前記腫瘍細胞が、リンパ腫または白血病細胞である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記検査試料および参照試料が同じゲノムＤＮＡを含み、前記参照試料ではなく前記検査試料が前記（ｂ）部分の線形増幅ステップに供される、請求項２３に記載の方法。
33. 前記第１および第２の検出可能な標識が同じであり、前記増幅された検査ＤＮＡ産物および参照ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、別々であるが同じ種類のマイクロアレイへのもの、または逐次的に同じマイクロアレイへのものである、請求項１、１１、または２３のいずれか一項に記載の方法。
34. 検査試料中の染色体再編成を決定する方法であって、
    （ａ）検査試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離することと、
    （ｂ）公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、前記第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅を実施して、増幅された検査ＤＮＡ産物（Ｔ＋）を生成すること、前記公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的な前記プライマーを使用し、前記第２のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、増幅された参照ＤＮＡ産物（Ｎ＋）を生成すること、前記公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを除外することによって、前記第１のゲノムＤＮＡ試料の擬似線形増幅を実施して、擬似増幅された検査ＤＮＡ産物（Ｔ−）を生成すること、および前記公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを除外することによって、前記第２のゲノムＤＮＡ試料の擬似線形増幅を実施して、擬似増幅された参照ＤＮＡ産物（Ｎ−）を生成することと、
    （ｃ）ランダムプライマーを使用するプライマー伸長によって、Ｔ＋、Ｎ＋、Ｔ−、およびＮ−の各々を、異なる検出可能な標識で標識することと、
    （ｄ）Ｔ＋およびＮ＋を、ゲノムＤＮＡ配列を含む第１のＤＮＡマイクロアレイに共ハイブリダイズさせることと、
    （ｅ）Ｔ−およびＮ−を、ゲノムＤＮＡ配列を含む第２のＤＮＡマイクロアレイに共ハイブリダイズさせることと、
    （ｆ）前記第１のＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルのパターンおよび程度を、前記第２のＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルのパターンおよび程度と比較することとを含み、
    前記第２のマイクロアレイからの類似パターンがない場合、前記第１のマイクロアレイからの染色体位置に対してプロットされたハイブリダイゼーションシグナルの散布図における直角三角形パターンのハイブリダイゼーションシグナルが、染色体転座を示し、垂直辺の染色体位置が、染色体転座切断点を標示し、
    前記第１のマイクロアレイおよび前記第２のマイクロアレイからの同位置の染色体位置に対してプロットされたハイブリダイゼーションシグナルの散布図における長方形パターンのハイブリダイゼーションシグナルが、染色体重複または欠失を示し、垂直辺の染色体位置が、重複または欠失したゲノム領域の２つの末端点を標示し、
    それによって、前記検査試料中の染色体再編成の決定を提供する方法。
35. Ｔ−およびＮ−を生成する前記擬似増幅が増幅を含まない、請求項３４に記載の方法。
36. 前記染色体再編成が染色体転座である、請求項３４に記載の方法。
37. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項３４に記載の方法。
38. 前記ＤＮＡマイクロアレイがタイリング密度ＤＮＡマイクロアレイである、請求項３４に記載の方法。
39. 前記公知のゲノム遺伝子座が免疫グロブリン遺伝子に対応する、請求項３４に記載の方法。
40. 前記検査試料の前記細胞が腫瘍細胞であり、前記参照細胞が正常細胞である、請求項３４に記載の方法。
41. 前記腫瘍細胞が、リンパ腫または白血病細胞である、請求項４０に記載の方法。
42. 検査試料中の染色体再編成を決定する方法であって、
    （ａ）検査試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離することと、
    （ｂ）公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、前記第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅を実施して、増幅された検査ＤＮＡ産物（Ｔ＋）を生成すること、前記公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的な前記プライマーを使用し、前記第２のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、増幅された参照ＤＮＡ産物（Ｎ＋）を生成すること、前記公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを除外することによって、前記第１のゲノムＤＮＡ試料の擬似線形増幅を実施して、擬似増幅された検査ＤＮＡ産物（Ｔ−）を生成すること、および前記公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを除外することによって、前記第２のゲノムＤＮＡ試料の擬似線形増幅を実施して、擬似増幅された参照ＤＮＡ産物（Ｎ−）を生成することと、
    （ｃ）ランダムプライマーを使用するプライマー伸長によって、Ｔ＋、Ｎ＋、Ｔ−、およびＮ−の各々を、異なる検出可能な標識で標識することと、
    （ｄ）Ｔ＋およびＴ−を、ゲノムＤＮＡ配列を含む第１のＤＮＡマイクロアレイに共ハイブリダイズさせることと、
    （ｅ）Ｎ＋およびＮ−を、ゲノムＤＮＡ配列を含む第２のＤＮＡマイクロアレイに共ハイブリダイズさせることと、
    （ｆ）前記第１のＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルのパターンおよび程度を、前記第２のＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルのパターンおよび程度と比較することとを含み、
    前記第２のマイクロアレイからの類似パターンがない場合、前記第１のマイクロアレイからの染色体位置に対してプロットされたハイブリダイゼーションシグナルの散布図における直角三角形パターンのハイブリダイゼーションシグナルが、染色体転座を示し、垂直辺の染色体位置が、染色体転座切断点を標示し、
    前記第１のマイクロアレイおよび前記第２のマイクロアレイの両方に共通の染色体位置に対してプロットされたハイブリダイゼーションシグナルの散布図におけるハイブリダイゼーションシグナルのパターンが偽切断点を示し、
    それによって、前記検査試料中の染色体再編成の決定を提供する方法。
43. 前記再編成が転座である、請求項４２に記載の方法。
44. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項４２に記載の方法。
45. 前記ＤＮＡマイクロアレイがタイリング密度ＤＮＡマイクロアレイである、請求項４２に記載の方法。
46. 前記公知のゲノム遺伝子座が免疫グロブリン遺伝子に対応する、請求項４２に記載の方法。
47. 前記検査試料の前記細胞が腫瘍細胞であり、前記参照細胞が正常細胞である、請求項４２に記載の方法。
48. 前記腫瘍細胞が、リンパ腫または白血病細胞である、請求項４７に記載の方法。
49. 被験体における疾患を診断する方法であって、前記疾患が染色体再編成に起因し、
    （ａ）前記被験体から生体試料を取得するステップと、
    （ｂ）前記生体試料の細胞から第１のゲノムＤＮＡを単離し、参照試料の細胞から第２のゲノムＤＮＡを単離するステップと、
    （ｃ）前記疾患に関連する公知のゲノムの遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用し、前記第１のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第１の検出可能な標識を含む増幅された検査ＤＮＡ産物を生成し、前記公知のゲノム遺伝子座内の公知のＤＮＡ配列に特異的な前記プライマーを使用し、前記第２のゲノムＤＮＡ試料の線形増幅および標識化を実施して、第２の検出可能な標識を含む増幅された参照ＤＮＡ産物を生成するステップと、
    （ｄ）前記増幅された検査ＤＮＡ産物および参照ＤＮＡ産物を、ゲノムＤＮＡ配列を含むＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせるステップと、
    （ｅ）前記ＤＮＡマイクロアレイへの、前記増幅された検査ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションのパターンおよび程度を、前記増幅された参照ＤＮＡ産物と比較するステップとを含み、
    前記公知のゲノムの遺伝子座のＤＮＡマイクロアレイエレメントとは異なるＤＮＡマイクロアレイエレメントへの、前記線形増幅された検査試料ＤＮＡ産物のハイブリダイゼーションが、前記線形増幅された参照試料ＤＮＡ産物を上回ることが、前記ＤＮＡマイクロアレイの前記エレメントを前記公知のゲノム遺伝子座の再編成パートナーとして同定し、前記再編成パートナーの同一性が、前記被験体における前記疾患の診断を提供する方法。
50. 前記再編成が転座である、請求項４９に記載の方法。
51. 前記疾患が癌である、請求項４９に記載の方法。
52. 前記癌が、リンパ腫または白血病である、請求項５１に記載の方法。
53. 前記公知のゲノム遺伝子座が免疫グロブリン遺伝子である、請求項５０に記載の方法。
54. 前記再編成パートナーがＭＹＣである、請求項５０に記載の方法。
55. 前記リンパ腫がバーキットリンパ腫である、請求項５２に記載の方法。
56. 染色体再編成を検出する方法であって、
    （ａ）標的ゲノム遺伝子座を増幅するステップと、
    （ｂ）前記増幅産物を核酸アレイにハイブリダイズさせるステップと、
    （ｃ）前記ハイブリダイゼーションパターンを参照と比較するステップとを含み、
    前記増幅が線形増幅であり、前記増幅されたゲノム遺伝子座のハイブリダイゼーションが前記参照と比較して異なることが、ゲノム再編成の存在を示す方法。
57. 前記染色体再編成が平衡染色体再編成である、請求項５６に記載の方法。
58. 平衡染色体転座を検出する方法であって、
    （ａ）標的ゲノム遺伝子座を増幅するステップと、
    （ｂ）前記増幅産物を核酸アレイにハイブリダイズさせるステップと、
    （ｃ）前記ハイブリダイゼーションパターンを参照と比較するステップとを含み、
    前記増幅が線形増幅であり、直角三角形ハイブリダイゼーションパターンの存在が、平衡染色体転座の存在を示す方法。
59. 前記方法が多重線形増幅を含む、請求項５６に記載の方法。
60. 複数のゲノム遺伝子座が、単一のアッセイで調査される、請求項５６または５９のいずれか一項に記載の方法。
61. 複数の線形増幅プライマーが使用される、請求項５６から６０のいずれか一項に記載の方法。
62. 前記複数の増幅プライマーが、疾患に関連する平衡転座に関与する遺伝子座の増幅用プライマーを含む、請求項６１に記載の方法。
63. 前記疾患が癌である、請求項６２に記載の方法。
64. 前記癌が、リンパ腫または白血病である、請求項６２に記載の方法。
65. 前記複数のプライマーが、ＭＰＭ混合物、８２１混合物、Ｐ１／Ｐ７混合物、および複数のＤ_Ｈプライマーから選択される、請求項６１に記載の方法。
66. 前記核酸アレイが、複数のゲノム遺伝子座に対するプローブを含む高密度タイルアレイである、請求項５６から６５のいずれか一項に記載の方法。
67. 前記複数のゲノム遺伝子座の少なくとも１つが、疾患に関連する遺伝子座である、請求項６６に記載の方法。
68. 前記疾患が癌である、請求項６７に記載の方法。
69. 前記癌が、リンパ腫または白血病である、請求項６８に記載の方法。
70. 前記アレイがＡＭＬパイロットアレイである、請求項５６から６９のいずれか一項に記載の方法。
71. 前記方法が、第２の染色体再編成の検出をさらに含む、請求項５６から７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記第２の染色体再編成が、重複、増幅、欠失、逆位、平衡転座、および不平衡転座からなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
73. 前記方法が、転座の両パートナー遺伝子座の検出を含む、請求項５６から７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 個体のリンパ腫の予後を診断または提供する方法であって、前記個体からの生体試料中で、ＩｇＨ転座を検出することを含み、ＩｇＨパートナー染色体切断点が、表２に列挙されているものから選択される方法。
75. 前記転座が平衡転座である、請求項７４に記載の方法。
76. 前記検出が、ＰＣＲ、配列決定、質量分析、ハイブリダイゼーション、またはｔＣＧＨ解析による、請求項７４または７５に記載の方法。
77. 平衡染色体転座の検出に使用するためのキットであって、
    （ａ）転座に関与するゲノム遺伝子座の線形増幅用のプライマーと、
    （ｂ）前記プライマーにより増幅された産物を検出するためのアレイとを含むキット。
78. 転座に関与する遺伝子座の線形増幅用の複数のプライマーを含む、請求項７７に記載のキット。
79. 前記ゲノム遺伝子座が、疾患に関連する、請求項７７または７８に記載のキット。
80. 前記疾患が癌である、請求項７９に記載のキット。
81. 前記癌が、リンパ腫または白血病である、請求項８０に記載のキット。
82. 疾患に関連する染色体再編成をｔＣＧＨ解析するためのアレイ。
83. 前記アレイが、少なくとも２つの遺伝子座に特異的な複数のプローブを含み、前記遺伝子座が、疾患に関連する染色体再編成に関与している、請求項８２に記載のアレイ。
84. 疾患に関連する少なくとも１つの再編成が平衡転座である、請求項８２または８３に記載のアレイ。
85. 前記疾患が、リンパ腫または白血病である、請求項８２から８４のいずれか一項に記載のアレイ。
86. 前記アレイによって検出される少なくとも１つの遺伝子座が、表２および表４に見出されるものから選択される、請求項８２から８５のいずれか一項に記載のアレイ。
87. 前記アレイが、表２に見出される遺伝子座に対するプローブを含む、請求項８６に記載のアレイ。
88. 前記アレイが、表４に見出される遺伝子座に対するプローブを含む、請求項８６に記載のアレイ。
89. コンピュータプログラムＴｉｌｅに使用されているようなオリゴヌクレオチド選択アルゴリズム。

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