JP2011201943A - Fretを利用した酵素活性測定基質及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
本発明は、FRETの蛍光ドナーが結合している重合性化合物、FRETの蛍光アクセプターが結合している重合性化合物、並びに、FRETの蛍光ドナー及びFRETの蛍光アクセプターのいずれも結合していない重合性化合物を共重合させてポリマー形態の酵素基質を製造する方法であって、FRETの蛍光ドナー又はFRETの蛍光アクセプターのいずれか1つの結合が酵素基質部分を介する結合である、ポリマー形態の酵素基質の製造方法である。また、該製造方法によって合成される酵素基質である。
【選択図】図1
Description
これまでに、FRETを利用した酵素活性の測定方法、並びに酵素基質に関する報告は数多く知られている(特許文献1、特許文献2、非特許文献1及び非特許文献2など)。このようなFRETを利用した酵素基質及び酵素活性測定方法は、比較的検出感度が高いなどの利点を有する反面、基質の製造及び精製段階が煩雑であり、コストの面においても負担が大きいなど、改善すべき点も多く指摘されている。
以上のようにFRETは酵素活性の基質に応用する技術として、極めて優れた技術ではあるが、検出可能なFRETを惹起する基質を簡易にしかも低コストで製造する実用的な方法は、これまでの所知られていない。
そこで、本発明は、FRETを利用したポリマー形態の酵素基質、及び、その製造方法の提供を目的とするものである。
FRETの蛍光ドナーと蛍光アクセプターを担持させたモノマーを使用し、ラジカル重合反応などを利用すると、1つの工程で短時間のうちにFRET感受性ポリマーを調製することが可能である。ここで調製されたポリマーには、酵素の認識部分を介して蛍光ドナー又はアクセプターが結合するモノマーが構成要素として含まれている。該ポリマーを基質として酵素活性を測定すると、非常に良好なFRET効果を確認することができた。
(式(I)中、A、B又はCのいずれか1つにFRETの蛍光ドナーが結合しており、他の2つのいずれか1つにFRETの蛍光アクセプターが結合しており、該蛍光ドナー又は該蛍光アクセプターのいずれか1つは、酵素の基質部分を介して結合しており、x、y及びzは1以上の整数である。ただし、蛍光ドナー及び蛍光アクセプターのいずれも結合していないA、B又はCに対応するx、y又はzは、0もしくは1以上の整数である。)
さらに、本発明は、FRETの蛍光ドナーが結合している重合性化合物、FRETの蛍光アクセプターが結合している重合性化合物、並びに、FRETの蛍光ドナー及びFRETの蛍光アクセプターのいずれも結合していない重合性化合物を共重合させてポリマー形態の酵素基質を1工程で、一気に製造する方法であって、蛍光ドナー又は蛍光アクセプターのいずれか1つの結合が酵素基質部分を介する結合である、ポリマー形態の酵素基質の製造方法である。
これらの重合性化合物をモノマーとして共重合させる場合、当業者によって容易に選択される重合方法であれば、いかなるものであってもよいが、重合反応を可能な限り短時間で、一気に進行させることができる重合方法が望ましい。重合方法として、例えば、付加重合反応(ラジカル重合反応、イオン重合反応)、開環重合反応、重縮合反応、重付加反応、付加縮合反応などが挙げられ、特に、ラジカル重合反応が簡便で好ましい方法である。また、本発明において使用される重合性化合物は、重合可能な官能基がモノマー内に存在し、溶媒に可溶であれば、いかなる化合物であってもよく、このような化合物は当業者により容易に選択可能なものを、目的に応じて適宜選択することができる。特に限定はしないが、本発明のモノマーとして例を挙げるとすれば、例えば、スチレンなどの芳香族ビニル系モノマー、アクリルアミドなどのアクリル系モノマー、メタクリル系モノマー、アクリロニトリル、酢酸ビニルなどを挙げることができる。モノマーとして脂溶性のもの、例えば、スチレンなどを使用すると脂溶性の高いポリマーへの誘導が可能になるため、このように製造された酵素基質は、プラスチックなどの支持体に対して疎水性相互作用により、予め固定することも可能であり、酵素活性の測定キットなどの作製にも利用できる。
ここでFRETの蛍光ドナー及び蛍光アクセプターは、FRETを生じさせる蛍光分子ペアであれば如何なる組合せの蛍光分子ペアであってもよく、例えば、ドナー・アクセプターのペアとして、ナフチル基とダンシル基、EDANS基とDABCYL基などを挙げることができる。より詳細には、例えば、Analytical Biochemistry 218,1−13(1994)などを参照のこと。
(式(IV)中、R1、R2及びR3が同一又は異なる、水素、塩素、フッ素、メチル基、アセチル基、カルボキシル基、カルボキメチル基、シアノ基であり、R4は、酵素認識部分を介して、又は介さず結合する蛍光ドナーである)
また、本発明で使用される蛍光アクセプターを結合した重合性化合物を、より具体的に示すと、例えば、以下の式(V)のようなビニル化合物を挙げることができる。
(式(V)中、R5、R6及びR7が同一又は異なる、水素、塩素、フッ素、メチル基、アセチル基、カルボキシル基、カルボキメチル基、シアノ基であり、R8は、酵素認識部分を介して、又は介さず結合する蛍光ドナーである)
以上のように、本発明のポリマー形態の酵素基質を使用すれば、観測される蛍光の発光波長の変化を指標にして酵素活性を検出、測定することができる。
本発明の酵素基質は、例えば、以下の式(I)のポリマー形態の化合物として示すことができる。
(式(I)中、A、B又はCのいずれか1つにFRETの蛍光ドナーが結合しており、他の2つのいずれか1つにFRETの蛍光アクセプターが結合しており、該蛍光ドナー又は該蛍光アクセプターのいずれか1つは、酵素の基質部分を介して結合しており、x、y及びzは1以上の整数である。ただし、蛍光ドナー及び蛍光アクセプターのいずれも結合していないA、B又はCに対応するx、y又はzは、0もしくは1以上の整数である)
1−1. マルトテトラオース誘導体(ドナー)の合成
マルトテトラオース(1)を完全アセチル化した後、BF3・Et2Oをプロモータして4−ペンテン−1−オールとのグリコシル化により、ペンテニル基をアノマー位に導入した。Zemplen(ツェンプレン)条件下、脱アセチル化し、非還元末端の4位と6位をナフチリデン保護してから、残った水酸基を完全アセチル化した。さらに、Me3N・BH3とAlCl3を用いて選択的還元開裂させ、Zemplen条件下で脱アセチル化した。UV照射下、2−アミノエタンチオールとラジカル付加反応をした後、アクリロイル化、精製のため完全アセチル化、さらに脱アセチル化して重合性蛍光ドナー(2)の合成を達成した(スキーム1)。
ダンシルクロライド(3)により、エチレンジアミンをダンシル化しアミン4へと誘導後、アクリロイル化して重合性蛍光アクセプター(5)を合成した(スキーム2)。
蛍光ドナー(2)、蛍光アクセプター(5)、およびアクリルアミドをAPS−TEMEDによるラジカル共重合反応によりポリマー(6)へと誘導した(スキーム3)。
上記のように合成した基質を100μlのDMSOに溶解させた後、10μlの溶液を6mlのHEPESバッファー(pH7.0)に拡散したものを基質溶液とし、活性測定には、そのうち3ml使用した。また、酵素溶液は、0.1mgのアミラーゼを1mlのHEPESに溶解させたものを10μl使用した。基質溶液と酵素溶液を混合したのち、37℃にて、経時的に蛍光スペクトルを測定した。その結果、時間の変化と共に520nmの蛍光アクセプター由来の蛍光が減少し、340nm付近の蛍光ドナー由来の蛍光が増加することが明らかとなった。また、この蛍光スペクトルの変化は、370nm付近に等発光点が観測されたことから、単なる蛍光消光や希釈による現象ではないことも確かめられた(図2)。
Claims (9)
- 以下の式(I)のポリマー形態の酵素基質。
(式(I)中、A、B又はCのいずれか1つにFRETの蛍光ドナーが結合しており、他の2つのいずれか1つにFRETの蛍光アクセプターが結合しており、該蛍光ドナー又は該蛍光アクセプターのいずれか1つは、酵素の基質部分を介して結合しており、x、y及びzは1以上の整数である。ただし、蛍光ドナー及び蛍光アクセプターのいずれも結合していないA、B又はCに対応するx、y又はzは、0もしくは1以上の整数である) - 前記酵素が加水分解酵素である請求項1に記載の基質。
- 前記酵素がエステル加水分解酵素、リン酸エステル加水分解酵素、糖加水分解酵素又はペプチド結合加水分解酵素のいずれかである請求項2に記載の基質。
- 前記酵素がアミラーゼである請求項2に記載の基質。
- 前記Aに対応する重合性化合物が式(II)の化合物であり、前記Cに対応する重合性化合物が式(III)の化合物であり、前記Bに対応する重合性化合物がアクリルアミドであることを特徴とする請求項4に記載の基質。
- 請求項1乃至5のいずれかに記載の基質を含む酵素活性測定用キット。
- FRETの蛍光ドナーが結合している重合性化合物、FRETの蛍光アクセプターが結合している重合性化合物、並びに、FRETの蛍光ドナー及びFRETの蛍光アクセプターのいずれも結合していない重合性化合物を共重合させてポリマー形態の酵素基質を1工程で製造する方法であって、FRETの蛍光ドナー又はFRETの蛍光アクセプターのいずれか1つの結合が酵素基質部分を介する結合である、ポリマー形態の酵素基質の製造方法。
- 前記共重合が、ラジカル重合であることを特徴とする請求項7に記載の製造方法。
- FRETの蛍光ドナーが結合している重合性化合物が式(IV)の化合物であり、FRETの蛍光アクセプターが結合している重合性化合物が式(V)の化合物であり、FRETの蛍光ドナー及びFRETの蛍光アクセプターのいずれも結合していない重合性化合物がアクリルアミドであることを特徴とする請求項7又は8に記載の製造方法。
(式(IV)中、R1、R2及びR3が同一又は異なる、水素、塩素、フッ素、メチル基、アセチル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、シアノ基であり、R4は、酵素認識部分を介して、又は介さず結合する蛍光ドナーである)
(式(V)中、R5、R6及びR7が同一又は異なる、水素、塩素、フッ素、メチル基、アセチル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、シアノ基であり、R8は、酵素認識部分を介して、又は介さず結合する蛍光アクセプターである)
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Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09124740A (ja) * | 1995-08-31 | 1997-05-13 | Nippon Oil & Fats Co Ltd | 免疫学的活性物質・酵素共重合体および免疫学的活性物質測定試薬 |
JP2002507434A (ja) * | 1998-03-24 | 2002-03-12 | ボストン プロビス、インコーポレイテッド | 検出複合体に関する方法、キットおよび組成物 |
US20040241782A1 (en) * | 2001-01-26 | 2004-12-02 | Eloisa Lopez-Calle | Methods and means for detecting enzymatic cleavage and linkage reactions |
JP2005527212A (ja) * | 2002-04-19 | 2005-09-15 | アマシャム バイオサイエンス ユーケイ リミテッド | 酵素活性測定方法 |
US20070264667A1 (en) * | 2003-09-03 | 2007-11-15 | Robert Gellibolian | Method and system for assaying transferase activity |
JP2008067694A (ja) * | 2006-08-14 | 2008-03-27 | Sony Corp | 物質の検出等に有用な核酸鎖とその方法 |
US20080193956A1 (en) * | 2005-04-27 | 2008-08-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nanostructure Enhanced Luminescence |
WO2008095493A1 (en) * | 2007-02-06 | 2008-08-14 | Atonomics A/S | Reporter unit for detection of target molecules using polymerisable substrate |
US20090305291A1 (en) * | 2006-12-14 | 2009-12-10 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche- Infm Istituton Azionale Per La Fisica Della Ma | method and a microdevice for the identification and/or quantification of an analyte in a biological sample |
-
2010
- 2010-03-24 JP JP2010068027A patent/JP5697129B2/ja active Active
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09124740A (ja) * | 1995-08-31 | 1997-05-13 | Nippon Oil & Fats Co Ltd | 免疫学的活性物質・酵素共重合体および免疫学的活性物質測定試薬 |
JP2002507434A (ja) * | 1998-03-24 | 2002-03-12 | ボストン プロビス、インコーポレイテッド | 検出複合体に関する方法、キットおよび組成物 |
US20040241782A1 (en) * | 2001-01-26 | 2004-12-02 | Eloisa Lopez-Calle | Methods and means for detecting enzymatic cleavage and linkage reactions |
JP2005527212A (ja) * | 2002-04-19 | 2005-09-15 | アマシャム バイオサイエンス ユーケイ リミテッド | 酵素活性測定方法 |
US20070264667A1 (en) * | 2003-09-03 | 2007-11-15 | Robert Gellibolian | Method and system for assaying transferase activity |
US20080193956A1 (en) * | 2005-04-27 | 2008-08-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nanostructure Enhanced Luminescence |
JP2008067694A (ja) * | 2006-08-14 | 2008-03-27 | Sony Corp | 物質の検出等に有用な核酸鎖とその方法 |
US20090305291A1 (en) * | 2006-12-14 | 2009-12-10 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche- Infm Istituton Azionale Per La Fisica Della Ma | method and a microdevice for the identification and/or quantification of an analyte in a biological sample |
WO2008095493A1 (en) * | 2007-02-06 | 2008-08-14 | Atonomics A/S | Reporter unit for detection of target molecules using polymerisable substrate |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
JPN6014031522; Santoso et al: PNAS Vol. 107, No. 2, 20100112, p. 715-720 * |
JPN6014031525; Seitz et al: Chem. Eur. J. Vol. 7, No. 18, 2001, p. 3911-3925 * |
JPN6014031527; Bobkov et al: J. Mol. Biol. Vol. 323, 2002, p. 739-750 * |
JPN6014031529; Sun et al: Biopolymers Vol. 88, No. 2, 2007, p. 141-149 * |
JPN6014031531; 荒井 他: 日本化学会第91回春季年会 講演要旨集IV , 20110311, p. 1152, 2 A2-27 * |
JPN6014031533; Li et al: J. Phys. Chem. Vol. 112, 2008, p. 13263-13272 * |
JPN6014031535; An et al: Journal of Materials Chemistry Vol. 17, 2007, p. 4147-4152 * |
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Publication number | Publication date |
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