JP2011188821A - 改変蛍光蛋白質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】蛍光蛋白質の円順列変異体とβヘアピン構造を形成できる2つのペプチド(N−β)及び(C−β)とが、N末端側から(N−β)−(円順列変異体)−(C−β)の順で融合されている改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる改変蛋白質。
【選択図】なし
Description
本発明において使用されうる蛍光蛋白質は、蛍光を発することができる円順列変異体の作製が可能なものであれば特に制限されず、例えば、クラゲ(オワンクラゲ)由来のGFP及び該GFPに由来するYFP、CFP、EGFP、EYFP、ECFPその他の変異体が挙げられ、市販のものであってもよい。さらに、蛍光を発することができる範囲で欠失、付加、又は置換が行われた変異体の蛍光蛋白質であってもよい。
本明細書において、円順列変異(circular permutation)とは、ある蛋白質の内部に新たにN末とC末を作製し(すなわち、該蛋白質を内部で2分し)、オリジナルのC末とN末とを適当なリンカー配列により繋ぐ変異をいう。蛍光蛋白質における円順列変異は、従来から行われており、例えば、前述の文献Baird et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol96, pp11241-11246 1999)等を参照できる。本明細書において、円順列変異体とは、円順列変異により得られた変異体をいう。
本発明におけるペプチド(N−β)及び(C−β)は、本発明の改変蛋白質において、それぞれ、本発明における蛍光蛋白質円順列変異体のN末及びC末に結合するペプチドである。ペプチド(N−β)及び(C−β)は、この順で繋がった場合にβヘアピン構造を形成できる配列である。なお、本明細書において、βヘアピン構造は、基本的に、2つのβシートが逆平行に配列し、該βシートが2〜5アミノ酸残基のループで繋がったものをいう。したがって、本発明におけるペプチド(N−β)及び(C−β)は、本発明の改変蛋白質が力を感知する観点から、それぞれ、該2つのβシートの一方及び他方に該当する部分のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
図1に示す、緑色蛍光蛋白質(以下、GFPと表記)の円順列変異を行った。全238位のアミノ酸残基からなる蛍光蛋白質の145位から238位までのアミノ酸残基を新しい1位から93位のアミノ酸残基として、新しい94位から99位のアミノ酸残基をセリン、グリシン、グリシン、スレオニン、グリシン、グリシンとし、蛍光蛋白質の1位から144位までのアミノ酸残基を新しい100位から243位のアミノ酸残基とする(図1;cpGFP)。上記のセリン、グリシン、グリシン、スレオニン、グリシン、グリシンから成るペプチドは、グリシンを含む事が重要であり、それ以外に制限はない。本実施例では、1位から144位及び145位から238位のアミノ酸残基による円順列変異を用いたが、上記の他にも、蛍光発光を保持できるアミノ酸の組み合わせが存在することが、文献Baird et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol96, pp11241-11246 1999)に記されている。上記の円順列変異を行ったGFPを、以後、cpGFPと表記する。
図2に、pH8.0の溶媒中における、GFP及びcpGFPの、吸光波長と(上図)、波長488ナノメートル(以下、nmと記述する)のレーザーで励起した時の蛍光波長(下図)を示す。GFPの吸光波長には、波長485nmの位置に最大吸光が確認された。cpGFPの吸光波長には、波長485nmの位置の最大吸光の他に、波長390nmの位置にも最大吸光が確認された。上記した波長390nmに位置する最大吸光の出現は、円順列変異を行うことで、蛍光蛋白質内にある発光団へのプロトンの配置が変化するためとされている。蛍光波長において、GFPとcpGFPとには、差が見られなかった。すなわち、GFPにおいて、円順列変異による蛍光波長は、変化しない。
上記と同様に、黄色蛍光蛋白質(以下、YFPと表記する。アミノ酸配列は、配列表の配列番号3)の円順列変異を行った(図1)。得られた円順列変異体をcpYFPと表記する。cpYFPのアミノ酸配列は、配列表の配列番号4である。図3に、cpYFPの吸光波長(上図)、及び、波長488nmのレーザーで励起した時の蛍光波長を示す(下図)。YFPの吸光波長には、波長513nmの位置に最大吸光が確認された。cpYFPの吸光波長には、513nmの位置の最大吸光は確認できず、波長501nmの位置及び407nmの位置に、最大吸光が確認された。YFPの蛍光波長には、波長527nmの位置に最大蛍光が確認された。cpYFPの蛍光波長には、波長521nmの位置に最大蛍光が確認された。YFPにおいては、円順列変異を行うことにより、吸光波長と蛍光波長の両方ともにおいて、その特性が変化した。
蛍光蛋白質に円順列変異を行うことにより変化した吸光波長特性を、βヘアピン構造を成すペプチドを当該円順列変異蛍光蛋白質に付加することによって、円順列変異を行う前の吸光波長特性に戻した。以下、YFPにおける実施例を用いて説明する。
上記の証明をさらに強固にするために、以下に記す実験を行った。cpYFP−β1にて、cpYFPのN末端に付加したアミノ酸のうち、cpYFPに最も接近して位置するアラニンの隣にグリシンを挿入し、当該cpYFPのC末端に付加したアミノ酸のうち最もcpYFPに接近して位置するスレオニンの隣にグリシンを挿入した(図1参照)。上記の変異は、グリシン、グルタミン酸、トリプトファン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン酸、アラニン、スレオニン、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、スレオニン、バリン、スレオニン、グルタミン酸から構成されるβヘアピン構造と当該cpYFPの構造の間を柔らかい構造で結合させる。従って、上記の置換は、当該βヘアピンに係る微弱な外力、あるいは、微小な立体構造の変化を模倣する。上記の置換を行ったcpYFP−β1を、以下、cpYFP−β2と記載する。図5にcpYFP−β2の吸光波長を示す。cpYFP−β1において確認できなかった波長407nmに位置する最大吸光が、cpYFP−β2の吸光波長のグラフにおいて確認できた。従って、cpYFP−β1のβヘアピン構造に微弱な外力が係る、あるいは、βヘアピン構造に歪みが与えられたら、cpYFP−β1の吸収波長には、波長407nmに位置する最大吸光が出現すると示唆される。
cpYFP−β1にてcpYFPのN末端に付加したアミノ酸のうち、cpYFPに最も接近して位置するアスパラギン酸、アラニンを、それぞれ、プロリン、トリプトファンに置換し、当該cpYFPのC末端に付加したアミノ酸のうち最もcpYFPに接近して位置するスレオニン、リジンを、それぞれ、ロイシン、グルタミン酸に置換した(図1参照)。上記の置換を行ったcpYFP−β1を、以下、cpYFP−β3と記載する。アミノ酸のプロリンへの置換は、置換された蛋白質の立体構造を大きく歪ませる効果があり、cpYFP−β3は、cpYFP−β2と比べて、さらに、該βヘアピン構造に歪みを与える。図6にcpYFP−β3の吸光波長を示す。cpYFP−β1において確認できなかった波長407nmに位置する最大吸光が、cpYFP−β3の吸光波長のグラフにおいて確認できた。cpYFP−β3における波長407nmに位置する最大吸光の強度は、cpYFP−β2の波長407nmに位置する最大吸光の強度に比べて、大きい。また、cpYFP−β1において確認された波長501nmに位置する最大吸光の強度が、cpYFP−β3において、減少した。cpYFP−β3のβヘアピン構造とcpYFPとの結合は、cpYFP−β2のβヘアピン構造とcpYFPとの結合よりも、大きく歪みが与えられており、上記の歪みの大きさが、吸収波長の特性に影響を与えている。上記の実験結果は、cpYFP−β1の吸収波長特性は、cpYFPとβヘアピン構造の結合の歪みによって、変化することを示している。さらに詳しくは、cpYFP−β1のβヘアピン構造に微弱な外力が係る、あるいは、βヘアピン構造に歪みが与えられたら、その歪みの大きさに依存して、cpYFP−β1の吸収波長には、波長407nmに位置する最大吸光の強度が増加し、波長501nmに位置する最大吸光の強度が減少することを示している。
配列番号2: βヘアピンのC末端側のペプチド。配列番号1のペプチドとともにβヘアピン構造を形成しうる。
配列番号3: YFP(黄色蛍光蛋白質)
配列番号4: YFPの円順列変異体の一例
配列番号5: 本発明の改変蛋白質の一例
Claims (8)
- 蛍光蛋白質の円順列変異体とβヘアピン構造を形成できる2つのペプチド(N−β)及び(C−β)とが、N末端側から(N−β)−(円順列変異体)−(C−β)の順で融合されている改変蛋白質であって、該蛋白質に加えられる力を感知するために用いられる、改変蛋白質。
- 前記蛍光蛋白質円順列変異体は、前記蛍光蛋白質の(1)N末端からn位までのアミノ酸配列及び(2)n+1位からC末端までのアミノ酸配列、並びに(3)グリシンを含む2〜20残基長のリンカー配列を含み、N末端側から(2)(3)(1)の順で結合したアミノ酸配列の変異体である、請求項1記載の改変蛋白質。
- 前記2つのペプチド(N−β)及び(C−β)の合計のアミノ酸配列が、10〜30残基長である、請求項1又は2に記載の改変蛋白質。
- 前記(N−β)が、配列表の配列番号1のアミノ酸配列で表されるペプチドであり、前記(C−β)が、配列表の配列番号2のアミノ酸配列で表されるペプチドである、請求項1から3のいずれかに記載の改変蛋白質。
- 前記円順列変異体が、前記蛍光蛋白質とは異なる吸収波長及び/又は蛍光波長を示す、請求項1から4のいずれかに記載の改変蛋白質。
- 前記円順列変異体が、配列表の配列番号3のアミノ酸配列で表される蛋白質である、請求項1から5のいずれかに記載の改変蛋白質。
- 請求項1から6のいずれかに記載の改変蛋白質をコードするベクター。
- 請求項1から6のいずれかに記載の改変蛋白質の吸収波長及び/又は蛍光波長を検出することを含む、前記改変蛋白質に加えられた力を検出する方法。
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