JP2011182677A - セルラーゼ複合体及びその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】非セルロソーム生産微生物由来のセルラーゼを複数保持した人工セルロソームを構築することにより、セルラーゼ分解活性の良好なセルラーゼ複合体を提供する。
【解決手段】非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第１のキメラタンパク質と、非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第２のキメラタンパク質と、非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼ（ＥＧ）の活性ドメインとドックリンドメインとの第３のキメラタンパク質と、前記第１、第２及び第３のキメラタンパク質の前記ドックリンドメインと結合する１又は２以上コヘシンドメインを有するコヘシンタンパク質と、を備え、前記コヘシンタンパク質上に前記第１、第２及び第３のキメラタンパク質をコヘシン−ドックリン結合によって保持する、セルラーゼ複合体とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、バイオマスに含まれるセルロースを有効利用するためのセルラーゼ複合体及びその利用に関する。

近年、有限である石油資源を代替するものとして、植物の光合成作用に由来するバイオマスへの期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。なかでも、セルロースの利用が期待されている。セルロースは、糖であるグルコースがβ−１，４グリコシド結合によって縮合した高分子化合物であり、分子間水素結合により強固な結晶構造を構成している。セルロースを分解し、さらに、グルコースに糖化し発酵原料として用いるには、セルロースを効率よく単糖まで分解（糖化）するには、少なくとも３つのタイプのセルロース分解酵素（セルラーゼ）が必要である。セルロースの効率的な分解・糖化は、これらのセルラーゼが協働して作用することによって初めて可能になると考えられている（以下、こうした効果を相乗効果という。）。

バイオマスの実用的な利用には、単糖まで分解する糖化工程のコストが大きなボトルネックとなっている。そこで、各種検討が行われてきている。自然界には、セルロースを強力に分解するセルラーゼを分泌する糸状菌としてトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）が存在している。セルロースを分解するひとつの手法は、こうしたカビ由来のセルラーゼの酵素製剤を用いることである。また、自然界には、セルロースを効率的に分解するクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）等のある種の細菌は、その表層にこれらセルラーゼの複合体であるセルロソームを有している。セルロソームは、セルラーゼを保持するための骨格タンパク質であるスキャホールディンタンパク質を細胞表層に保持し、このスキャホールディンタンパク質にセルラーゼが結合されることにより構成されている。スキャホールディンタンパク質は、セルラーゼ結合ドメインであるコヘシンドメインを有しており、セルロソームを構成するセルラーゼは、コヘシンドメインに水素結合等の非共有結合で結合するドックリンドメインを有している。こうしたセルロソームのセルロースの工業的な糖化利用への試みがなされている。例えば、セルロソームを人工的に構築しようとする試みがいくつかなされている。例えば、セルロソーム生産微生物であるC. thermocellumのスキャホールディンタンパク質を利用しこれにセルラーゼを結合させた人工酵素複合体を構築しようとする試みがある（特許文献）。また、酵母においてスキャホールディンタンパク質を発現させて、このスキャホールディンタンパク質に対してセルラーゼを集積化できることも開示されている（特許文献１、非特許文献１）。

特開２００９−１４２２６０

・APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol.73, No.12, p3822-3832, 2007

しかしながら、上記した先行技術をもってしても、依然としてこの問題は解決されていない。すなわち、T. reesei等の培養上清から得られる酵素製剤は強力なセルロース分解活性を有するものの、この酵素製剤を用いてセルロースを分解することはコスト的に見合わず、この酵素製剤の効率的な製造方法も見出されていないし、さらなる活性の向上も困難であった。また、上記非特許文献１に記載のように、セルロソームを模倣して酵素複合体を構築できるものの、その協働作用による相乗効果は容易には得られなかった。

セルロソーム生産微生物のセルロソームを構成するセルラーゼは、それ自体の活性は、カビなどのセルロソーム生産微生物以外の微生物（非セルロソーム生産微生物）由来のセルラーゼよりも低い。しかしながら、カビの培養上清のセルロース分解活性は、セルロソームに及ばない。一方、人工的にタンパク質を大量生産する場合には宿主として酵母が用いられるが、セルロソーム構成セルラーゼは酵母で発現可能なものが少なく、天然のセルロソームを模倣してセルロソーム由来のセルラーゼを多数保持したセルロソームを人工的に構築することは困難であった。

そこで、本明細書の開示は、非セルロソーム生産微生物由来のセルラーゼを複数保持した人工セルロソームを構築することにより、セルロース分解活性の良好なセルラーゼ複合体及びその利用を提供することを目的とする。

本発明者らは、人工セルロソームに適した非セルロソーム生産微生物由来のいくつかのセルラーゼにセルロソーム生産微生物由来のドックリンドメインを付加してキメラタンパク質とし、このキメラタンパク質とコヘシンドメインを有するコヘシンタンパク質とからセルラーゼ複合体を構築することで、高いセルロース分解活性を有する人工セルロソームを構築できることを見出した。本明細書の開示は、これらの知見に基づいて提供される。

本明細書の開示によれば、セルラーゼの複合体であって、非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第１のキメラタンパク質と、非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第２のキメラタンパク質と、非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼ（ＥＧ）の活性ドメインとドックリンドメインとの第３のキメラタンパク質と、前記第１、第２及び第３のキメラタンパク質の前記ドックリンドメインと結合する１又は２以上コヘシンドメインを有するコヘシンタンパク質と、を備え、前記コヘシンタンパク質上に前記第１、第２及び第３のキメラタンパク質をコヘシン−ドックリン結合によって保持する、複合体が提供される。

前記第１のキメラタンパク質及び前記第３のキメラタンパク質のいずれかあるいは双方は、さらに、そのＮ末端に、前記セロビオヒドロラーゼ又は前記エンドグルカナーゼにおいて前記活性ドメインのＮ末端側に備えられるセルロース結合ドメインとの間のリンカードメインの少なくとも一部のアミノ酸配列を備えることができる。前記ドックリンドメインは、Clostridium thermocellumのエンドグルカナーゼ由来のドックリンドメインとすることができる。

また、前記ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼは、Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼであってもよく、前記ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼは、Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼであってもよく、前記ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼであってもよい。

本明細書の開示によれば、本明細書に開示されるセルラーゼ複合体を細胞表層に提示する真核微生物が提供される。前記真核微生物は、非セルラーゼ生産微生物であってもよい。

本明細書の開示によれば、セルラーゼを生産する真核微生物であって、非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第１のキメラタンパク質をコードする第１のＤＮＡと、非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第２のキメラタンパク質をコードする第２のＤＮＡと、非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第３のキメラタンパク質をコードする第３のＤＮＡと、を備え、前記第１、第２及び第３のキメラタンパク質を細胞外に分泌発現する、真核微生物が提供される。

前記真核微生物は、前記第１のキメラタンパク質上の前記ドックリンドメイン、前記第２のキメラタンパク質上の前記ドックリンドメイン及び前記第３のキメラタンパク質上の前記ドックリンドメインと結合する１又は２以上のコヘシンドメインを備えるコヘシンタンパク質をコードするＤＮＡを備え、前記コヘシンタンパク質を細胞表層に提示するものであってもよい。また、細胞表層に提示した前記コヘシンタンパク質上に、前記第１、第２及び第３のキメラタンパク質をコヘシン−ドックリン結合により保持するものであってもよい。

本明細書の開示によれば、非セルロソーム生産微生物に由来し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼの活性ドメインと、ドックリンドメインと、を有し、前記ドックリンドメインを前記活性ドメインのＣ末端に有するとともに、
前記活性ドメインと前記セロビオヒドロラーゼ又は前記エンドグルカナーゼにおいてそのＮ末端側に備えられるセルロース結合ドメインとの間のリンカードメイン中の少なくとも一部のアミノ酸配列を前記活性ドメインのＮ末端に備える、キメラタンパク質が提供される。こうしたキメラタンパク質をコードするＤＮＡも提供される。

本明細書の開示によれば、微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、発酵のための真核微生物の細胞外又は細胞表層に本明細書に開示されるセルラーゼの複合体を存在させた状態で前記真核微生物により、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備える、方法が提供される。前記生産工程は、前記真核微生物の細胞外又は細胞表層に、β−グルコシダーゼを存在させて行う工程とすることができる。

各種ドックリンを付加した各種キメラ酵素の構造と活性測定結果とを示す図である。 カビ由来の全長型キメラ酵素による集積化効果を示す図である。 カビ由来のＣＤ型キメラ酵素による集積化効果を示す図である。 セルロソーム生産微生物由来セルラーゼであるClostridium thermocellum由来cbhAとcelKについての集積化効果を示す図である。 cbhAとcelKに３種類の全長型キメラ酵素の組み合わせ（TE2,PC2,7C）を添加した場合と、３種類のＣＤ型キメラ酵素の組み合わせ（TE2-CD,PC2-CD,7C-CD）を添加した場合の、それぞれの集積化効果を示す図である。 各種キメラ酵素を集積化しない状態での相乗効果を示す図である。 酵母による各種酵素の活性型での生産結果を示す図である。

本明細書の開示は、バイオマスに含まれるセルロースを有効利用するための効果の高いキメラタンパク質の組み合わせを備えるセルラーゼ複合体及びその利用に関する。本明細書に開示されるキメラタンパク質の組み合わせは、相乗効果の高いセルラーゼの組み合わせであると同時に、コヘシン−ドックリン結合を利用してコヘシンタンパク質上に集積化させたときの相乗効果（集積効果）が高いセルラーゼの組み合わせでもある。したがって、このキメラタンパク質をコヘシンタンパク質上に保持させることで、セルロースの分解能力の良好な人工セルロソームを提供できる。また、この人工セルロソームによれば、効率的にセルロースを分解できる。また、こうした人工セルロソームを、セルロースを炭素源として含有する培地を含む発酵系に存在させることにより、直接セルロースを炭素源として利用して有用物質を発酵生産するＣＢＰも効率的に実現できるようになる。

以下、本明細書の開示に含まれる種々の実施形態について詳細に説明する。なお、本明細書において用いる「ＧＨＦ（Glycoside Hydrolase Family）」とは、ＣＡＺｙ（Carbohydrate active Enzymes）のホームページ（http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html）において提供される、グリコシド加水分解酵素の分類である。

（セルラーゼの複合体）
本明細書に開示される非セルロソーム生産微生物由来のセルラーゼの複合体（以下、本セルラーゼ複合体）は、第１のキメラタンパク質、第２のキメラタンパク質及び第３のキメラタンパク質を有し、第３のキメラタンパク質の３種類のセルラーゼを、コヘシン−ドックリン結合によりコヘシンタンパク質上に備えている。

（第１のキメラタンパク質）
第１のキメラタンパク質は、非セルロソーム生産微生物由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）の活性ドメインとドックリンドメインとを少なくとも有するキメラタンパク質である。ＧＨＦ６に属するＣＢＨは、一般に、セルロースをその非還元末端から切断してセロビオースを生成するII型（ＣＢＨ II）であるとされている。ＧＨＦ６に属するＣＢＨ IIとしては、各種微生物に由来するものが知られている（http://www.cazy.org/fam/GH6.html）。第１のキメラタンパク質の活性ドメインが由来するＣＢＨとしては、例えば、P. chrysosporium、A. oryzae及びT. reeseiに由来しＧＨＦ６に属するＣＢＨ IIが挙げられる。

本明細書において、例えば、「P. chrysosporiumに由来するＣＢＨ」とは、P. chrysosporiumに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい。）が生産するＣＢＨ又は当該微生物の生産するタンパク質をコードする遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られたＣＢＨをいう。したがって、P. chrysosporiumから取得したＣＢＨをコードする遺伝子（又はその改変遺伝子）を導入した形質転換体によって生産された組換体タンパク質であるＣＢＨも、P. chrysosporiumに由来するＣＢＨに該当する。したがって、「P. chrysosporiumに由来するＣＢＨ」には、P. chrysosporiumと同属で異種の菌株や同種で他の菌株からそれぞれ取得されるＣＢＨが含まれる。同様のことが「A. oryzaeに由来するＣＢＨ」に適用される。また、本明細書に開示される同様の表現についても上記と同様に定義される。

第１のキメラタンパク質の活性ドメインの取得源となるＣＢＨ IIは、例えば、P. chrysosporiumに由来する配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるPcCBH2が挙げられる。また、A. oryzaeに由来する配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるAoCBH2Aが挙げられる。さらに、第１のキメラタンパク質の活性ドメインの取得源となるＣＢＨ IIとしては、こうした公知の配列情報に基づいて取得できる他の態様のＣＢＨ IIを含めることができる。かかるＣＢＨ IIについては後段で説明する。好ましくは、P. chrysosporiumに由来するＣＢＨ IIが挙げられる。第１のキメラタンパク質における活性ドメインは、以上の各種のＣＢＨIIから選択されるいずれかに由来することができる。なお、本セルラーゼ複合体は、異なる活性ドメイン及び／又はドックリンドメインを有する２以上の第１のキメラタンパク質を備えていてもよい。

（活性ドメイン）
第１のキメラタンパク質における活性ドメインは、公知のデータベースに基づいて、ドックリンリンとキメラ化した第１のキメラタンパク質としてＣＢＨ II活性を発揮できるアミノ酸配列配列を含むように選択される。活性ドメインはデータベースに応じて異なる場合がある。したがって、同じＣＢＨについて一つのデータベースにより特定される活性ドメインが第１のキメラタンパク質の活性ドメインとして用いることができる場合もあるが、他のデータベースにより特定される活性ドメインでは第１のキメラタンパク質の活性ドメインとして用いることができない場合がある。

例えば、ＣＢＨ IIにおいて、各種データベースにおいて決定されている活性ドメインのＮ末端側にセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を有するとき、ＣＢＤと活性ドメインとの間のリンカードメインの少なくとも一部、例えば、リンカードメインのうち活性ドメイン（ＣＢＤ）に隣接するＣ末端側のアミノ酸配列を適当な長さ含むようにしてもよい。こうすることで、第１のキメラタンパク質においてＣＢＨ活性を発揮できる機能的な活性ドメインを取得できる場合がある。すなわち、このような構造を取るＣＢＨ IIの場合、活性ドメインのＮ末端側のアミノ酸配列は当該活性ドメインによる固有の活性に影響を及ぼす場合があるからである。P. chrysosporium由来のＣＢＨ IIは、そうした酵素構造を取る。したがって、例えば、P. chrysosporium由来のＣＢＨ IIに関しては、活性ドメインは配列番号３で表されるアミノ酸配列とすることができる。このアミノ酸配列は、あるデータベースにおける活性ドメインにさらにＮ末端側のＣＢＤとのリンカードメインのうち活性ドメインに隣接するＣ末端側のアミノ酸配列を加えた配列でもある。また、例えば、P. chrysosporium由来のＣＢＨ IIに関し、配列番号４で表されるアミノ酸配列のように、活性ドメインとそのＮ末端側のリンカードメインの全ての配列とからなるアミノ酸配列を活性ドメインとしてもよい。また、ＣＢＤ、リンカードメイン及び活性ドメインからなる、配列番号１で表されるアミノ酸配列を活性ドメインとしてもよい。

（ドックリンドメイン）
第１のキメラタンパク質は、ドックリンドメインを有している。ドックリンドメインは、コヘシン−ドックリン結合により後述するコヘシンタンパク質に第１のキメラタンパク質を結合させる部位である。ドックリンドメインは、例えば、表１に示すセルロソーム生産微生物のセルロソームを構成するセルラーゼの一部に備えられている。本セルラーゼ複合体に用いるドックリンドメインとしては、表１に示す各種のセルロソーム生産微生物のセルラーゼのドックリンドメインから選択される。好ましくは、C. thermocellumのエンドグルカナーゼのドックリンドメインを含むアミノ酸配列が挙げられる。より具体的には、C. thermocellumのcelＡのドックリンドメイン（配列番号５）を含むアミノ酸配列が挙げられる。このドックリンドメインは、前記CelＡの活性ドメインのＣ末端側に配置されており、その活性ドメインとのリンカー領域が、３０アミノ酸残基程度のアミノ酸配列（配列番号６）となっている。こうしたリンカー配列は、セルラーゼ由来の天然であってもよいし、人工的であってもよいが、活性ドメインの活性確保及びドックリンドメインにおけるコヘシンドメインとの結合性を確保するために適宜備えられる。

ドックリンリンドメインは、活性ドメインのＮ末端側及びＣ末端側のいずれの側にあってもよいが、好ましくは、Ｃ末端側に配置される。

第１のキメラタンパク質は、セルロース結合ドメインを備えていてもよいが必ずしも備えていなくてもよい。例えば、P. chrysosporium由来のＣＢＨの場合、ＣＢＤが成熟タンパク質のＮ末端側に配置されている。

こうした第１のキメラタンパク質としては、例えば、配列番号７（成熟タンパク質（ＣＢＤ＋リンカードメイン＋活性ドメイン＋ドックリン），配列番号８（活性ドメイン（リンカードメインのＣ末端側含む）＋ドックリン）及び配列番号９（活性ドメイン（全リンカードメイン含む）+ドックリン）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。

（第２のキメラタンパク質）
第２のキメラタンパク質は、ＧＨＦ７に属するＣＢＨの活性ドメインとドックリンドメインとを有するキメラタンパク質である。ＧＨＦ７に属するＣＢＨは、一般に、セルロースをその還元末端から切断してセロビオースを生成するI型（ＣＢＨ I）であるとされている。ＧＨＦ７に属するＣＢＨとしては、各種微生物に由来するものが知られている（http://www.cazy.org/fam/GH7.html）。なかでも、A. niger、A. aculeatus、P. chrysosporium及びT. reeseiに由来するＣＢＨから選択される１又は２以上とすることができる。さらに、ＧＨＦ７に属するＣＢＨ Iとしては、A. nigerに由来する配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるAncbhA、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるAncbhBが挙げられる。また、A. aculeatusに由来する配列番号１２表されるアミノ酸配列からなるAaCBHIが挙げられる。また、P. chrysosporiumに由来する配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるPcCBH7Cが挙げられる。なかでも、P. chrysosporiumに由来するＣＢＨ Iを好ましく用いることができる。さらに、ＧＨＦ７に属するＣＢＨ Iとしては、こうした公知の配列情報に基づいて取得できる他の態様のＣＢＨを含めることができる。かかるＣＢＨ Iについては後段で説明する。ＧＨＦ７に属するＣＢＨ Iは、以上の各種のＣＢＨ Iのなかから１又は２以上を組み合わせて用いることができる。第２のキメラタンパク質における活性ドメインは、以上の各種のＣＢＨ Iから選択されるいずれかに由来することができる。なお、本セルラーゼ複合体は、異なる活性ドメイン及び／又はドックリンドメインを有する２以上の第１のキメラタンパク質を備えていてもよい。

ＧＨＦ６に属するＣＢＨ Iの活性ドメインは、ＧＨＦ７に属するＣＢＨ Iの活性ドメインと同様、各種のデータベースから取得することができ、本明細書の開示に従ってキメラ化するにあたり、適切な領域が適宜選択される。例えば、P. chrysosporium由来のＣＢＨ Ｉに関しては、活性ドメインは配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。

第２のキメラタンパク質もドックリンドメインを有している。第２のキメラタンパク質におけるドックリンドメインは、第１のキメラタンパク質におけるドックリンドメインと同様、セルロソーム生産微生物のセルロソームを構成するセルラーゼのドックリンドメインから選択される。第２のキメラタンパク質のドックリンドメインは、第１のキメラタンパク質のドックリンドメインと同一であっても異なっていてもよい。コヘシンタンパク質の構成をシンプルにするには、第１のキメラタンパク質のドックリンと共通するドックリンドメインを用いることが好ましい。例えば、すでに例示したC. thermocellumのcelＡのドックリンドメインが挙げられる。第２のキメラタンパク質においても、ドックリンドメインは、活性ドメインのＮ末端及びＣ末端のいずれにあってもよいが、好ましくは、Ｃ末端に備えられる。

第２のキメラタンパク質は、セルロース結合ドメインを備えていてもよいが必ずしも備えていなくてもよい。例えば、P. chrysosporium由来のＣＢＨ Ｉの場合、ＣＢＤが成熟タンパク質のＣ末端側に配置されている。

こうした第２のキメラタンパク質としては、例えば、配列番号１５（成熟タンパク質（活性ドメイン＋リンカードメイン＋ＣＢＤ＋ドックリン），配列番号１６（活性ドメイン＋ドックリン）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。

（第３のキメラタンパク質）
第３のキメラタンパク質は、ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼ（ＥＧ）の活性ドメインとドックリンドメインとを有するキメラタンパク質である。ＧＨＦ５に属するＥＧは、各種微生物に由来するものが知られている（http://www.cazy.org/fam/GH5.html）。なかでも、T. reesei及びA. oryzaeに由来するＥＧから選択される１又は２以上とすることができる。さらに、ＧＨＦ５に属するＥＧとしては、例えば、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるA. oryzaeに由来するAocelE及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるT. reeseiに由来するTrEG IIが挙げられる。さらに、ＧＨＦ５に属するＥＧとしては、こうした公知の配列情報に基づいて取得できる他の態様のＥＧを含めることができる。かかるＥＧについては後段で説明する。ＧＨＦ５に属するＥＧは、以上の各種のＥＧのなかから１又は２以上を組み合わせて用いることができる。

ＧＨＦ５に属するＥＧの活性ドメインは、ＧＨＦ７に属するＣＢＨの活性ドメインと同様、各種のデータベースから取得することができ、本明細書の開示に従ってキメラ化するにあたり、適切な領域が適宜選択される。T. reesei由来のＥＧは、P. chrysosporium由来のＣＢＨ IIのような酵素構造（活性ドメインのＮ末端側にＣＢＤを備える構造）を採る。したがって、例えば、T. reesei由来のＥＧの活性ドメインは、既述のP. chrysosporium由来のＣＢＨ IIの活性ドメインに準じた構成で、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。

第３のキメラタンパク質もドックリンドメインを有している。第３のキメラタンパク質におけるドックリンドメインは、第１及び第２のキメラタンパク質におけるドックリンドメインと同様、セルロソーム生産微生物のセルロソームを構成するセルラーゼのドックリンドメインから選択される。第３のキメラタンパク質のドックリンドメインは、第１のキメラタンパク質や第２のキメラタンパク質のそれぞれのドックリンドメインと同一であっても異なっていてもよい。コヘシンタンパク質の構成をシンプルにするには、第１のキメラタンパク質及び／又は第２のキメラタンパク質のドックリンと共通するドックリンドメインを用いることが好ましい。例えば、すでに例示したC. thermocellumのcelＡのドックリンドメインが挙げられる。第３のキメラタンパク質においても、ドックリンドメインは、活性ドメインのＮ末端及びＣ末端のいずれにあってもよいが、好ましくは、Ｃ末端に備えられる。

第３のキメラタンパク質は、セルロース結合ドメインを備えていてもよいが必ずしも備えていなくてもよい。例えば、T. reesei由来のＥＧの場合、ＣＢＤが成熟タンパク質のＮ末端側に配置されている。

こうした第３のキメラタンパク質としては、例えば、配列番号２１（成熟タンパク質（ＣＢＤ＋リンカードメイン＋活性ドメイン＋ドックリン），配列番号２２（活性ドメイン（リンカードメインのＣ末端側含む）＋ドックリン）及び配列番号２３（活性ドメイン（全リンカードメイン含む）+ドックリン）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。

（コヘシンタンパク質）
コヘシンタンパク質は、第１〜第３のキメラタンパク質が有するドックリンドメインを結合する１又は２以上のコヘシンドメインを有している。これにより、コヘシンタンパク質は、第１〜第３のキメラタンパク質をコヘシン−ドックリン結合で保持でき、本セルラーゼ複合体の骨格として機能する。また、本セルラーゼ複合体は、異なるコヘシンドメインの組み合わせあるいは配列を有する２以上のコヘシンタンパク質を備えていてもよい。

（コヘシンドメイン）
コヘシンタンパク質が備える、１又は２以上のコヘシンドメインは、セルロソームのスキャホールディンタンパク質が備えるコヘシンドメインに由来している。セルロソームは、すでに説明したように、細菌の細胞表層に形成されるセルラーゼとそのセルラーゼが結合する骨格タンパク質（スキャホールディンタンパク質）との複合体である。

コヘシンドメインは、セルロソーム生産微生物の形成するセルロソームにおけるタイプＩ〜III骨格タンパク質に備えられる触媒活性のあるセルラーゼ等を非共有結合で結合するドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50、Demain, A. L., et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69(1), 124-54(2005), Doi, R. H., et al., J. Bacterol., 185(20), 5907-5914(2003)等）。すなわち、コヘシンドメインとしては、セルロソームのタイプＩ骨格タンパク質上のタイプＩコヘシンドメイン、同タイプII骨格タンパク質上のタイプIIコヘシンドメイン及びタイプIII骨格タンパク質上のタイプIIIコヘシンドメインが挙げられる。こうした各種タイプのコヘシンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプのコヘシンのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。

コヘシンドメインは、こうしたコヘシンドメインに由来するドメインであって、キメラタンパク質のドックリンドメインと結合することができる。セルラーゼの活性ドメインへのドックリンドメインのキメラ化は活性ドメインの活性が意図せずに低下することなどにより困難な場合があることから、キメラタンパク質のドックリンドメインに応じてコヘシンドメインを選択することができる。また、コヘシン−ドックリン結合の強度等も考慮してコヘシンドメインを選択することができる。

本セルラーゼ複合体にあっては、例えば、キメラタンパク質のドックリンドメインが例えば、C. thermocellumのcelＡのドックリンドメインに対して、C. thermocellumのスキャホールディンタンパク質のコヘシンドメイン（配列番号２４）が挙げられる。

コヘシンドメインは、セルロソーム生産微生物に由来する天然のコヘシンドメイン又は対応するドッケリドメインに対する結合性を有する限りそのコヘシンのアミノ酸配列において１又は２以上の変異（付加、挿入、欠失及び置換）を導入した改変コヘシンドメインであってもよい。

コヘシンタンパク質には、１又は２以上のコヘシンドメインを備えている。コヘシンドメインの種類は、第１のキメラタンパク質〜第３のキメラタンパク質が備えるドックリンドメインよっても異なるが、本セルラーゼ複合体に共通に１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。２以上のコヘシンドメインを備える場合、２以上のコヘシンドメインは、１つのコヘシンタンパク質にタンデム状に備えられていてもよいし、２又はそれ以上のコヘシンタンパク質に分散して備えられていてもよい。コヘシンタンパク質上における２以上のコヘシンドメインは、ドックリンドメインを有するタンパク質の結合を妨げない程度のインターバルを置いて配置される。コヘシンタンパク質におけるコヘシンドメイン以外のアミノ酸配列は、天然のセルロソームの骨格タンパク質のアミノ酸配列を適宜参考にして決定することができる。

コヘシンタンパク質は、コヘシンドメイン以外に、タイプＩ〜IIIから選択される骨格タンパク質のセルロース結合ドメイン（CBD）を有していることが好ましい。CBDは、各種骨格タンパク質において基質であるセルロースに結合するドメインとして知られている（前述粟冠ら）。セルロース結合ドメインは、１又は２以上有していてもよい。各種のセルロソーム生産微生物のセルロソームにおけるCBDのアミノ酸配列及びDNA配列の多くが決定されている。これらの各種のCBDのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。

本セルラーゼ複合体は、第１〜第３のキメラタンパク質のほか、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性を有するタンパク質をコヘシンタンパク質上に保持していてもよい。ＢＧＬは、セロビオース等を分解してグルコースを生成する。当該タンパク質は、ＢＧＬの活性ドメインとともにドックリンドメインを有して、コヘシン−ドックリン結合によってコヘシンタンパク質のコヘシンドメインに結合されたコヘシンタンパク質に保持されていることが好ましい。ＢＧＬは、セルロソーム生産微生物のほか、セルロース分解微生物が保持しており、これらのＢＧＬのアミノ酸配列及びDNA配列の多くが決定されており、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。

なお、本セルラーゼ複合体に用いるのに好ましい第１〜第３のキメラタンパク質の活性ドメインやドックリンドメイン、コヘシンドメイン等は、当該ドメインについて公知の配列情報と一定の関係を有しかつ固有の活性や能力を有するドメインであってもよい。

こうしたドメインの一態様としては、例えばあるドメインについて開示される特定のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、固有の活性（能力）を有するドメインが挙げられる。各アミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、すなわち、欠失、置換若しくは付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、好ましくは、１個以上１０個以下程度である。より好ましくは、１個以上５個以下である。アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。

他の一態様としては、あるドメインについて開示される特定のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ固有の活性（能力）を有するドメインが挙げられる。同一性は好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは、９０％以上であり、一層好ましくは９５％以上である。最も好ましくは、９８％以上である。

本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。

さらに他の一態様として、あるドメインについて開示される特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、固有の活性（能力）を有するドメインが挙げられる。ストリンジェントな条件とは、たとえば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち、所定の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましく９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。なお、以上のことから、さらなる他の一態様として、所定の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましく９５％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによってコードされ、固有の活性（能力）を有するタンパク質が挙げられる。

本セルラーゼ複合体は、タンパク質の複合体として、それ自体独立した形態であってもよいし、適当なキャリアに固定化ないし保持されていてもよい。また、後述するように、酵母等の微生物の表層に提示された状態であってもよい。本セルラーゼ複合体は、例えば、それぞれのタンパク質を公知のタンパク質製造方法により取得し、これらのタンパク質を接触させる条件下において、コヘシンタンパク質に対してキメラタンパク質を自己集合させることにより、本セルラーゼ複合体を取得できる。

また、本セルラーゼ複合体は、その構成タンパク質のうち１又は２以上を分泌発現する微生物の培養上清又はそのタンパク質精製物を混合してすべての構成タンパク質を接触させて自己集合させることによって取得できる。なお、構成タンパク質のすべてが微生物によって分泌発現されなくてもよく、必要に応じ微生物によって生産されない構成タンパク質を別途製造して混合してもよい。また、構成タンパク質のすべてを分泌発現する微生物の場合、この微生物の培養上清に、これらタンパク質が自己集合可能な状態で含まれるため、その培養上清に、本セルラーゼ複合体を取得できる。

（セルラーゼ複合体を表層提示する真核微生物）
本セルラーゼ複合体を表層提示する真核微生物は、コヘシンタンパク質が細胞表層に結合させて保持させ（提示させた）コヘシンタンパク質のコヘシンドメインに、キメラタンパク質を結合させて保持することができる。本セルラーゼ複合体のこうした細胞表層提示形態によれば、本セルラーゼ複合体を表層提示する微生物が本セルラーゼ複合体によるセルロースの分解物であるグルコース等を利用して増殖、発酵が可能である場合に有利である。すなわち、ＣＢＰに好適である。また、当該微生物に本セルラーゼ複合体の構成タンパク質の一部又は全部を自己生産させることにより、構成タンパク質の取得工程を簡略化してセルロースの利用コストを低減することができる。

真核微生物は、特に限定しないが、例えば、公知の各種酵母を利用できる。後述するエタノール発酵等を考慮すると、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。また、真核微生物は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus soya）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）等の麹菌であってもよい。異種タンパク質を大量に発現させるには、セルラーゼ非生産菌がより好ましい。

本セルラーゼ複合体を表層提示する真核微生物は、コヘシンタンパク質をコードするＤＮＡを、当該タンパク質を自己生産可能に保持していることが好ましい。コヘシンタンパク質をコードするコード化ＤＮＡは、真核微生物内において当該タンパク質を発現可能に保持されていればよく、その保持形態は特に限定されない。例えば、宿主微生物で作動可能なプロモーターの制御下に連結されるとともに適切なターミネーターをその下流に有した状態で保持されている。プロモーターは、構成的プロモーターであっても誘導的プロモーターであってもよい。このような状態のＤＮＡは、宿主染色体内に組み込まれた形態であってもよいし、宿主核内に保持される２μプラスミドや核外に保持されるプラスミドのような形態であってもよい。一般には、こうした外来ＤＮＡの導入に伴って、宿主において利用可能な選択マーカー遺伝子も同時に保持されている。

コヘシンタンパク質は、真核微生物において細胞表層に提示（保持）されることが好ましい。コヘシンタンパク質に細胞表層提示性を付与するには、公知の分泌シグナルや表層提示用のシステムを用いることができる。例えば、分泌シグナルや凝集性タンパク質又はその一部のアミノ酸配列が付与される。分泌シグナルとしては、例えば、Rhizopus oryzaeやC. albicansのグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーなどが挙げられる。また、凝集性タンパク質としては、α−アグルチニンをコードするSAG1遺伝子の５’領域の３２０アミノ酸残基からなるペプチドが挙げられる。また、所望のタンパク質を細胞表層に提示するためのポリペプチドや手法は、ＷＯ０１／７９４８３号公報や、特開２００３−２３５５７９号公報、ＷＯ２００２／０４２４８３号パンフレット、ＷＯ２００３／０１６５２５号パンフレット、特開２００６−１３６２２３号公報、藤田らの文献（藤田ら，2004. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212および藤田ら, 2002. Appl Environ Microbiol 68:5136-5141.）、村井ら, 1998. Appl Environ Microbiol 64:4857-4861.に開示されている。

キメラタンパク質は、好ましくは、コヘシンタンパク質を自己生産し表層提示する真核微生物において自己生産される。第１〜第３のキメラタンパク質のうち、少なくとも１以上、好ましくは２以上、より好ましくはすべてのキメラタンパク質が自己生産される。コヘシンタンパク質を表層提示される真核微生物ですべてのキメラタンパク質が生産されない場合には、残りのキメラタンパク質を外部から供給するか、残りのキメラタンパク質を分泌発現する真核微生物とコヘシンタンパク質表層提示微生物と共培養される。

キメラタンパク質を自己生産する真核微生物は、キメラタンパク質をコードするＤＮＡを、当該タンパク質を自己生産可能に保持していることが好ましい。キメラタンパク質をコードするコード化ＤＮＡは、コヘシンタンパク質のコード化ＤＮＡと同様、真核微生物内において当該タンパク質を発現可能に保持されていればよく、その保持形態は特に限定されない。キメラタンパク質は、細胞外に分泌される。こうすることで、真核微生物は増殖と同時に、細胞表層にコヘシンタンパク質を提示し、同時にキメラタンパク質が細胞外に分泌されて、キメラタンパク質はコヘシンタンパク質に結合され、結果として、本セルラーゼ複合体が細胞表層に提示される。セルラーゼなどの酵素は、本来的に細胞外分泌のためのシグナルを有していることが多い。ドックリンタンパク質に細胞外分泌性を付与するには、公知の分泌シグナルを用いることができる。分泌シグナルは、すでに説明したように、用いる真核微生物の種類に応じて適宜選択される。

キメラタンパク質は、コヘシンタンパク質を表層提示する真核微生物に対して外部から供給されてもよい。すなわち、酵母や大腸菌などを用いて得られるキメラタンパク質や無細胞合成系を用いて得られるキメラタンパク質であってもよい。表層提示用微生物とドックリンドメインを有するタンパク質の接触させる方法は特に限定しない。真核微生物が生存でき、タンパク質が変成しないｐＨ、塩濃度、温度の液体中において、両者を混合等させればよい。適宜、撹拌により接触確率を向上させてもよい。

好適な真核微生物としては、第１のキメラタンパク質のコード化ＤＮＡ、第２のキメラタンパク質のコード化ＤＮＡ及び第３のキメラタンパク質のコード化ＤＮＡから選択される１又は２以上のコード化ＤＮＡを備え、これらキメラタンパク質を細胞外に分泌発現する、真核微生物が提供される。この真核微生物によれば、第１〜第３のキメラタンパク質を容易に取得できる。また、この真核微生物とコヘシンタンパク質を細胞表層に提示する真核微生物と共培養するか、キメラタンパク質を分泌発現する真核微生物の培養上清とコヘシンタンパク質を表層提示する微生物に供給することで、容易に細胞表層に本セルラーゼ複合体を表層提示する真核微生物を得ることができる。

本セルラーゼ複合体を細胞表層提示する真核微生物は、ＢＧＬを分泌発現することが好ましい。こうすることで、ＢＧＬを外部添加することなく本微生物によりセルロースをグルコースにまで糖化できる。真核微生物は、ＢＧＬを分泌発現するように外来性のＢＧＬのコード化ＤＮＡを導入したものであることが好ましい。ＢＧＬは、さらに真核微生物の細胞表層に保持されるようにすることが好ましい。その場合、本セルラーゼ複合体のコヘシンタンパク質に保持させるようにしてもよいし、別個に細胞表層に提示させるようにしてもよい。

以上説明した本明細書に開示される真核微生物及びタンパク質を細胞表層提示した真核微生物は、いずれも、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて作製することができる。真核微生物の形質転換のためのベクター及びその構築方法は、当業者において周知であって、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に開示されている。また、コヘシンタンパク質やドックリンドメインを有するタンパク質を真核微生物において発現させるためのベクター及びその構築方法も、同様に、当業者において周知である。なお、ベクターの形態は、使用形態に応じて様々な形態を採ることができる。例えば、ＤＮＡ断片の形態を採ることができるほか、２マイクロプラスミドなどの適当な酵母用ベクターの形態を採ることもできる。

このようなベクターで真核微生物を形質転換することによって本明細書に開示される真核微生物を得ることができる。形質転換にあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることができる。

本明細書に開示される本セルラーゼ複合体及び当該複合体を表層提示する微生物は、これらのキメラタンパク質によるセルロースの分解のための相乗効果がコヘシンタンパク質への集積化によってより増強されている。したがって、セルロースの効率的分解に有用である。セルロースとしては、その誘導体も包含する。また、セルロースのグルコースの重合度は特に限定しない。誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。また、セルロースは、その部分分解物を含むものであってもよい。さらに、セルロースは、配糖体であるβ−グルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体であってもよい。セルロースは、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよい。セルロースの由来も特に限定しないで、天然由来のものでも、人為的に合成したものでもよい。

セルロースは、通常、セルロースの他に併存成分を含むセルロース含有材料として分解に供される。セルロース含有材料は、少なくともセルロースを含んでいれば足り、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲ワラ、籾殻、木材チップなどのリグノセルロース系の農産廃棄物などのいわゆる実バイオマスであってもよいし、その前処理物であってもよい。また、セルロースは、前処理されたセルロース又はセルロース含有材料であってもよい。前処理とは、例えば、セルロースとともにリグニンやヘミセルロースが併存する状態の材料に対して、それらの複合状態を緩和するあるいは解除するような処理又は結晶性セルロースの結晶性を低下させるような処理が挙げられる。このような処理としては、例えば、水熱処理やイオン液体により処理が挙げられる。水熱処理としては、例えば、１８０℃〜２４０℃の温度で、３０分から９０分程度処理することが挙げられる。また、イオン液体による処理としては、６０℃〜１５０℃で３０分から２時間程度、疎水性又は親水性イオン液体に浸漬するなどの処理等が挙げられる。

本セルラーゼ複合体及び当該複合体を細胞表層に提示する真核微生物は、その増強された相乗効果により、セルロースの分解、糖化、及び糖化と発酵とを同時進行させるＣＢＰ（連結バイオプロセス（糖化発酵同時進行））において、セルロースの分解効率を高めて、セルロースの効率的利用を具現化することができる。

なお、本明細書の開示によれば、本セルラーゼ複合体を構成する第１〜第３のキメラタンパク質及び当該キメラタンパク質をコードするＤＮＡも提供される。

（キメラタンパク質及び当該キメラタンパク質をコードするＤＮＡ）
本明細書の開示によれば、キメラタンパク質であって、非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼの活性ドメインと、ドックリンドメインと、を有し、ドックリンドメインを活性ドメインのＣ末端に有するとともに、セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼにおいてそのＮ末端側に備えられるセルロース結合ドメインとその活性ドメインとの間のリンカードメイン中の少なくとも一部のアミノ酸配列を前記活性ドメインのＮ末端に備える、キメラタンパク質が提供される。このキメラタンパク質によれば、非セルロソーム生産微生物のセルラーゼをセルロソーム生産微生物由来のコヘシンドメインを有するコヘシンタンパク質に結合させて、そのセルラーゼ固有の活性又は能力をコヘシンタンパク質上で発現させることができる。ドックリンリンドメインは、C. thermocellumのエンドグルカナーゼ由来のドックリンリンドメインとしてもよい。

（有用物質生産方法）
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、発酵のための真核微生物の細胞外又は細胞表層に本セルラーゼ複合体を存在させた状態で前記真核微生物により、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備えることができる。本生産方法によれば、セルロース分解活性に大きな相乗効果を有するセルラーゼの組み合わせが、コヘシンタンパク質へ集積化されることにより、一層相乗効果がより増強される。この結果、効率的にセルロースを分解して、発酵のための真核微生物がセルロース由来の炭素源を供給できる。このため、効率的なＣＢＰが可能となる。なお、細胞表層に本セルラーゼ複合体を存在させて行うとき、発酵のための真核微生物は、本明細書に開示される複合体表層提示微生物である。

前記生産工程では、真核微生物の細胞外又は細胞表層に、ＢＧＬを存在させて行う工程としてもよい。第１〜第３のキメラタンパク質を保持する本セルラーゼ複合体のセルロース分解産物はセロビオースであるため、グルコースまでの糖化にはＢＧＬが必要となるからである。好ましくは、発酵用微生物がＢＧＬを細胞外に分泌するか又は細胞表層に提示することが好ましい。

発酵用の真核微生物は、酵母などのエタノール生産微生物や麹菌等、すでに説明した複合体表層提示微生物を好ましく用いることができる。真核微生物は、人工的に取得された微生物であってもよい。例えば、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して得られる本来の代謝物でない化合物を産生可能に遺伝子工学的に改変したものであってもよい。このような微生物を用いることで、例えば、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリンの生産、プラスチック・化成品原料を生産するなどのバイオリファイナリー技術に適用できる。有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましく、上記したように、バイオリファイナリー技術全般にわたる物質を対象とすることができる。

なお、本セルラーゼ複合体及び複合体表層提示微生物は、ＣＢＰのみならず、セルロースの低分子化及び糖化にも有用である。すなわち、本明細書の開示によれば、本セルラーゼ複合体又は複合体表層提示微生物を用い、必要に応じてＢＧＬを共存させて、セルロースを低分子化するセルロース分解工程を備える、セルロースの低分子化方法も提供される。本方法によれば、効率的にセルロースを低分子化し、セルロースオリゴマー又はグルコースを生産できる。ＢＧＬは、複合体表層提示微生物に表層提示又は分泌発現されるものであることが好ましい。

なお、この分解工程において、セルロースを効率的にセルロースオリゴマーにまで分解するには、ＢＧＬの実質的な非存在下でセルロースを分解し、その後、ＢＧＬでグルコースまで分解することが好ましい場合もある。ＢＧＬによる生産物阻害の影響を回避又は抑制できるからである。なお、「ＢＧＬの実質的な非存在下」とは、ＢＧＬが存在しないほか、ＢＧＬによる生産物阻害を回避又は抑制できる範囲でＢＧＬが存在していてもよい、ことを意味している。

以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作は既出のMolecular Cloningに従い行った。

（各種カビ由来セルラーゼへのドックリン配列の付加）
P. chrysosporium由来のＧHF6のCBH（以下、PcCBH2）、P. chrysosporium由来GHF7のCBH（以下、PcCBH7C）、T. reesei由来GHF5のEG（以下、TrEG2）の酵素の各アミノ酸配列（配列番号１，１３，１８）C末端の終始コドンを削除し、C. thermocellum由来のcelA由来であって、その活性ドメインへのリンカーを含むドックリン配列（配列番号２５）を付加したキメラ遺伝子（以下、PC2、7C、TE2、配列番号７，１５、２１）を作製した。意図したキメラ酵素の構造を図１に示す。図１中、最上段に天然の成熟型の酵素を示し、２段目に、本実施例で作製したキメラ酵素（以下、TEG2、PC2、7C）を示す。本実施例のキメラ酵素は、いずれもセルロース結合ドメイン（CBD）を備えている。

（触媒ドメイン酵素の作製とドックリン配列の付加）
実施例１で作製したキメラ酵素には、セルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤ）と触媒ドメイン（以下、ＣＤ）があることから、PC2、7C及びTE2につき、それぞれＣＢＤを削除し、CDのみの酵素（ＣＤ）（配列番号２６，１４，２７）及びこれらのＣＤに実施例１と同様のドックリン配列を付加したキメラ酵素（ＣＤ+doc）（配列番号２８，１６，２９）を作製した。また、ＰＣ２とＴＥ２に関しては、それぞれＣＤに関するデータベースにおいて最も広範囲な配列を持つCD部分（pCD）にドックリン配列を付加したキメラ酵素（pCD+doc）（配列番号８，２２）を作製した。更に、これらの酵素については、各ＣＤのＮ末側のリンカー配列をすべて付加したＣＤにドックリン配列を付加したキメラ酵素（Linker+CD+doc）（配列番号９，２３）を作製した。図１に、構築したこれらの酵素の概要を示す。

（大腸菌由来無細胞合成系による各種酵素の活性型での生産）
実施例１及び２で作製したこれらのキメラの酵素を以下に示す大腸菌無細胞合成系によって取得し、CMCに対する活性は、以下のようにして測定した。すなわち、０．５％ＣＭＣを含有する寒天プレートに無細胞合成液各１μｌをスポットし、４０℃で２４時間反応後に、染色液（コンゴーレッド）を滴下重層して染色し、セルラーゼが反応して反応して脱色されたハロの大きさを測定し、相対活性とした。結果を合わせて図１に示す。なお、野生型において得られた活性を１００として各キメラ酵素の活性を相対活性で表した。

各キメラ酵素の上流側に、開始コドン、T7 promoter、rbs（リボソーム結合部位）をPCRにより連結した。下流側には、T7 terminatorをPCRにより連結した。全長のPCR産物をエタノール沈殿したものを、転写翻訳反応の鋳型として用いた。シャペロン（大腸菌由来のDnaK/DnaJ, GrpE, GroEL/GroES）を高発現した大腸菌を破砕後、S30画分を還元剤(ジチオスレイトール；DTT）未添加で調製したものを無細胞合成の抽出液として用いた。大腸菌抽出液に、上記の鋳型DNA、56.4mM Tris-acetate,pH7.4、1.2mM ATP、1mM GTP、1mM CTP、1mM UTP、40mMクレアチンフォスフェート、0.7mM 20アミノ酸ミックス、4.1％(w/w)ポリエチレングリコール6000、35μg/ml フォリン酸、0.2mg/ml大腸菌tRNA、36mM酢酸アンモニウム、0.15mg/mlクレアチンキナーゼ、10mM 酢酸マグネシウム、100mM酢酸カリウム、10μg/mlリファンピシン、7.7μg/ml T7 RNAポリメラーゼ及びカビ由来PDI（特開平06-038752)と1mM GSH/0.1mM GSSGを加え、26℃、1〜3時間、転写翻訳共役反応を行なった。

図１に示すように、7Cにおいては、CDのみの酵素（CD）、及びCDのみの酵素にドックリンを付加したキメラ酵素（CD+doc）も野生型等と同様の活性を示した。一方、TE2とPC2ではCD＋docに活性が認められなかった。さらに、pCD＋docとしたとき、活性が認められた。さらにまた、各CDのＮ末端側にリンカー配列を付加し、Ｃ末端にドックリン配列を付加した（linker+CD+doc）でも活性を認めた。これらのことから、コヘシンドメインを有するコヘシンタンパク質へのセルラーゼの集積化には、各セルラーゼについての全長型キメラ酵素（野生型＋doc）を用いるとともに、CD型キメラ酵素としては、PcCBH7Cについては、キメラ酵素（CD＋doc：以下、7C-CD）、PcCBH2については、キメラ酵素（linker+CD+doc：以下、PC2-CD）、TrEG2については、キメラ酵素（pCD＋doc：TE2-CD）を用いることとした。

（酵母によるコヘシンの発現と表層への固定化）
特開2009-142260に開示されるコヘシンタンパク質（コヘシンドメイン４個とCBD3とaga2）（配列番号３０）を分泌発現する酵母を用いて、コヘシンタンパク質（4個のコヘシン＋CBD3＋aga2）を発現させた。コヘシンタンパク質は、酵母表層に提示させたaga１タンパク質と結合することにより、酵母表層に提示した。ネガティブコントロール株として、aga１タンパク質（配列番号３１）のみを発現した酵母を用いた。

（足場タンパク質発現酵母へのドックリン付加キメラ酵素の結合）
実施例４の酵母660nmのODが5.0の酵母懸濁液100μlに、実施例３で生産した無細胞合成による結合させようとするキメラ酵素と1mMCaCl₂を含む50mM酢酸バッファーpH5.0を合わせて300μlとなるように添加し、4℃で1〜5時間、放置した。その間、30分に1回程度、混合した。その後、1mMCaCl₂を含む50mM酢酸バッファーpH5.0で菌体を2回洗浄し、100μlの50mM酢酸バッファーpH5.0に懸濁した。ネガティブコントロール株の酵母に無細胞合成酵素を添加したものでも同様に実施した。また、C. thermocellum由来のcelK及びcbhAについても、同様にして集積化させた。

（集積化効果の評価）
実施例５でキメラ酵素を表層に結合した酵母100μlに、１％PSC(リン酸膨潤アビセル) 100μlを加えて、40℃で反応し、0時間と4時間後の分解活性を測定した。分解活性は、還元糖量をTZアッセイ法を用いて測定することにより実施した。結果を図２〜図５に示す。縦軸の還元糖量は、キメラ酵素を表層提示した酵母の4時間後の活性から、キメラ酵素を表層提示した酵母の０時間の活性とネガティブコントロール株の酵母を用いた場合の活性を引いた値を示す。

図２に、カビ由来のドックリンを付加した全長型キメラ酵素による集積化効果を示す。図の左から、TE2・7C・PC2；それぞれ単独酵素の場合の活性、全長型キメラ酵素の２種の組み合わせ（TE2,7C）；TE2と7Cを同時に添加結合した場合の活性について、単独での活性を相加した予測値と実測値、全長型キメラ酵素の３種の組み合わせ（TE2,PC2,7C）；3種類を同時に添加結合した場合の活性について、単独での活性を相加した予測値と実測値を示す。図３には、図２と同様に、CDのみにドックリンを付加したＣＤ型キメラ酵素を用いた実験結果を示す。

図２に示すように、全長型キメラ酵素の組み合わせについての集積化効果（実測値／相加予測値）は、２種類の全長型キメラ酵素の組み合わせ(TE2,7C)では3.5倍、3種類の全長型キメラ酵素の組み合わせ（TE2,PC2,7C）では6.4倍であった。また、図３に示すように、CD型キメラ酵素の集積化効果は、２種類のＣＤ型キメラ酵素の組み合わせ(TE2-CD,7C-CD)では3.5倍、3種類のCD型キメラ酵素の組み合わせ（TE2-CD,PC2-CD,7C-CD）では6.5倍に向上していた。これらの結果から、これらの組み合わせ、すなわち、２種類及び３種類の非セルロソーム生産微生物由来のセルラーゼ活性を有するキメラタンパク質のコヘシン−ドックリン結合を介したコヘシンタンパク質への集積化が、有効であることがわかった。

また、図４には、セルロソーム生産微生物由来のセルラーゼであるClostridium thermocellum由来cbhAとcelKについての集積化効果の測定結果を示す。図４に示すように、コヘシンタンパク質への集積化効果は1.7倍であった。図５には、cbhAとcelKに３種類の全長型キメラ酵素の組み合わせ（TE2,PC2,7C）を添加した場合と、３種類のＣＤ型キメラ酵素の組み合わせ（TE2-CD,PC2-CD,7C-CD）を添加した場合の、それぞれの実測値と相加予測値を示した。集積化効果は、それぞれ、1.6倍と1.3倍であった。

以上のことから、非セルロソーム生産微生物由来のセルラーゼ活性を有するキメラタンパク質（キメラ酵素）は、C. thermocellumなどのセルロソーム生産微生物由来のセルラーゼよりも、コヘシンへの集積効果が予想を超えて高いことがわかった。

（未集積化での相乗効果の評価）
実施例７においてキメラ酵素に認められた活性が、酵素の組み合わせによる相乗効果のみでなく、コヘシン上に集積化したことによる集積化効果が寄与していることを確認するために、全長型キメラ酵素（TE2、PC2、7Cの3種類）と、ＣＤ型キメラ酵素（TrEG2-CD、PC2-CD、7C-CDの3種類）を用いて、コヘシンと結合させない状態（集積化させない状態）で単に混合した状態での活性を評価した。結果を図６に示す。

図６に示すように、全長型キメラ酵素(TE2,PC2,7C)の相乗効果では、各酵素単独の活性を相加した相加予測値と比較して、約1.3倍の相乗効果が認められた。ＣＤ型キメラ酵素(TE2-CD,PC2-CD,7C-CD)では、各酵素単独の活性を相加した相加予測値と比較して、約1.4倍の相乗効果が認められた。実施例７におけるコヘシンへ集積化した場合の活性の方が、実施例8における集積化していない場合の活性よりも明らかに高いことから、実施例７で認められた活性は、コヘシン上でのこれらのキメラ酵素の集積化効果が大きく寄与していることを確認できた。

以上のことから、本明細書に開示されるキメラタンパク質の組み合わせは、これらをコヘシンタンパク質に集積化させるのに極めて有効な組み合わせであることがわかった。また、本来的に相乗効果がある非セルロソーム生産微生物由来のセルラーゼ活性を有するキメラタンパク質を集積化することにより、更に相乗効果を高められることがわかった。

（酵母による各種酵素の活性型での生産）
全長型キメラ酵素（TE2、PC2、7Cの3種類）をPCRで増幅し、酵母分泌発現ベクターであるpRS436GAPSSRGにサブクローニングした。pRS436GAPSSRG はTDH3プロモーター下流に、分泌シグナルを持ち菌体外に酵素を分泌する事が可能である。本ベクターを酵母（BJ5465株）に形質転換し、SD-URA寒天培地（yeast nitrogen base without amino acids without ammonium sulfate 1.7g、カザミノ酸5g、アミノ酸mix、グルコース20g、寒天20g、脱イオン水1000ml）で30℃、3日間培養した。生育したコロニーを各4クローンずつSD-URA液体培地（yeast nitrogen base without amino acids without ammonium sulfate 1.7g、カザミノ酸5g、-URAアミノ酸mix 0.77g、グルコース20g、脱イオン水1000ml）に植菌し、30℃、20時間、前培養し、1/100量を同培地に植菌して本培養とした。培養上清を回収し、限外ろ過フィルターで10倍に濃縮し、CMCプレートへ1μlスポットした。22時間反応後にコンゴレッド染色し、脱色した。ハロの面積を算出し、相対活性で示した結果を、図７に示す。図７に示すように、ドックリン配列を付加した各種酵素は、酵母において活性型で発現できることがわかった。

Claims (17)

1. セルラーゼの複合体であって、
   非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第１のキメラタンパク質と、
   非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第２のキメラタンパク質と、
   非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼ（ＥＧ）の活性ドメインとドックリンドメインとの第３のキメラタンパク質と、
   前記第１、第２及び第３のキメラタンパク質の前記ドックリンドメインと結合する１又は２以上コヘシンドメインを有するコヘシンタンパク質と、
   を備え、
   前記コヘシンタンパク質上に前記第１、第２及び第３のキメラタンパク質をコヘシン−ドックリン結合によって保持する、複合体。
2. 前記第１のキメラタンパク質及び前記第３のキメラタンパク質のいずれかあるいは双方は、さらに、そのＮ末端に、前記セロビオヒドロラーゼ又は前記エンドグルカナーゼにおいて前記活性ドメインのＮ末端側に備えられるセルロース結合ドメインとの間のリンカードメイン中の少なくとも一部のアミノ酸配列を備える、請求項１に記載の複合体。
3. 前記ドックリンドメインは、Clostridium thermocellumのエンドグルカナーゼ由来のドックリンドメインである、請求項１又は２に記載の複合体。
4. 前記ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼは、Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼである、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
5. 前記ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼは、Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼである、請求項１〜４のいずれかに記載の複合体。
6. 前記ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼである、請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の複合体を細胞表層に提示する真核微生物。
8. 前記真核微生物は、非セルラーゼ生産微生物である、請求項７に記載の真核微生物。
9. セルラーゼを生産する真核微生物であって、
   非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第１のキメラタンパク質をコードする第１のＤＮＡと、
   非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第２のキメラタンパク質をコードする第２のＤＮＡと、
   非セルロソーム生産微生物に由来しＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼの活性ドメインとドックリンドメインとを有する第３のキメラタンパク質をコードする第３のＤＮＡと、
   を備え、
   前記第１、第２及び第３のキメラタンパク質を細胞外に分泌発現する、真核微生物。
10. 前記第１のキメラタンパク質上の前記ドックリンドメイン、前記第２のキメラタンパク質上の前記ドックリンドメイン及び前記第３のキメラタンパク質上の前記ドックリンドメインと結合する１又は２以上のコヘシンドメインを備えるコヘシンタンパク質をコードするＤＮＡを備え、
    前記コヘシンタンパク質を細胞表層に提示する、請求項９に記載の真核微生物。
11. 細胞表層に提示した前記コヘシンタンパク質上に、前記第１、第２及び第３のキメラタンパク質をコヘシン−ドックリン結合により保持する、請求項１０に記載の真核微生物。
12. 前記ドックリンドメインは、Clostridium thermocellumのエンドグルカナーゼ由来のドックリンドメインである、請求項９〜１１のいずれかに記載の真核微生物。
13. キメラタンパク質であって、
    非セルロソーム生産微生物に由来し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼの活性ドメインと、
    ドックリンドメインと、
    を有し、
    前記ドックリンドメインを前記活性ドメインのＣ末端に有するとともに、
    前記セロビオヒドロラーゼ又は前記エンドグルカナーゼにおいてそのＮ末端側に備えられるセルロース結合ドメインとその活性ドメインとの間のリンカードメイン中の少なくとも一部のアミノ酸配列を前記活性ドメインのＮ末端に備える、キメラタンパク質。
14. 前記少なくとも一部のアミノ酸配列は、前記リンカードメインのうちその活性ドメインに隣接するＣ末端側の適当長の長さのアミノ酸配列である、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
15. 請求項１３又は１４に記載のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ。
16. 微生物の発酵により有用物質を生産する方法であって、
    発酵のための真核微生物の細胞外又は細胞表層に請求項１〜６のいずれかにセルラーゼの複合体を存在させた状態で前記真核微生物により、セルロースを少なくとも含む炭素源を発酵して前記有用物質を生産する工程、を備える、方法。
17. 前記生産工程は、前記真核微生物の細胞外又は細胞表層に、β−グルコシダーゼを存在させて行う工程である、請求項１６に記載の方法。