JP2011147446A - ポリケチドおよびそれらの合成法 - Google Patents

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Abstract

【課題】マクロライド化合物、特に少なくともグリコシレーションによって天然の化合物とは異なる化合物の調製および単離のためのプロセスおよび物質を提供する。
【解決手段】O-ミカミノシル基またはO-アンゴロサミニル基を有するマクロライド、特にエリスロマイシンおよびアジスロマイシンが、適切な株のバックグラウンド中において、ミカミノースまたはアンゴロサミンの合成を方向付けること、およびアグリコンまたはシュードアグリコンへの引き続いての移入を方向付けることが可能である、遺伝子の組み合わせを含む遺伝子カセット、および前記遺伝子カセットで形質転換した菌株を培養してＣ５位にミカノースを含むエリスロマイシンまたはアジスロマイシンを産生するためのプロセス。
【選択図】なし

Description

本発明は、マクロライド化合物、特に少なくともグリコシレーションによって天然の化合物とは異なる化合物の調製および単離のためのプロセスおよび物質（組換え株を含む）に関する。これは特に、5位の天然の糖が置換されているエリスロマイシンおよびアジスロマイシンの類似体に関する。本発明は、新規なマクロライド抗生物質を生成するために遺伝子カセットが発現される組換え細胞の使用を含む。
放線菌細菌によって産生されるマクロライド抗生物質への生合成経路は、アグリコン構造の集合、続いて水酸化または酸化的段階、メチル化およびグリコシル化のいずれかまたはすべてを含んでもよい特異的修飾を一般的に含む。14員環マクロライドであるエリスロマイシンAの場合において、これらの修飾は、EryFにより触媒される6-デオキシエリスロノリドBのエリスロライドBへの特異的水酸化、それに続くマクロシルトランスフェラーゼEryBVによって触媒されるC3位でのヒドロキシル基を介するdTDP-1の連続的結合からなる（StauntonおよびWilkinson, 1997）。EryCIIIによって触媒される、次いで、C5位でのヒドロキシ基を介するdTDP-D-デソサミンの結合は、抗生物質活性を有する最初の中間体であるエリスロマイシンDの産生を生じる。エリスロマイシンDは、引き続いて、C12における水酸化（EryK）およびミカロシル基上でのO-メチル化（EryG）によってエリスロマイシンAに転換され、この順番が好ましい（StauntonおよびWilkinson, 1997）。dTDP-L-ミカロースおよびdTDP-D-デソサミンの生合成は詳細に研究されている（Gaisserら、1997；Summersら、1997；Gaisserら、1998；Salah-Beyら、1998）。
最近、マクロライドとのリボソームの3.1Å解像度Ｘ線研究（Schlunzenら、2001、Hansenら、2002）は、マクロライド鋳型が、化学的アプローチまたは生物学的アプローチによって、リボソームの結合および阻害の増加のため、ならびに耐性生物に対する有効性の改善のために適合される可能性がある方法に、直接的な洞察を与える鍵となる相互作用を明らかにした。特に、リボソーム結合のためのマクロ環のC5ヒドロキシルにおける糖置換基の重要性についての以前の指摘は、構造的分析によって完全に支持された。この置換基は、ペプチジルトランスフェラーゼ中心に向けて伸び、C5にジサッカリドを有する16員マクロライドの場合においては、ペプチジルトランスフェラーゼ中心にさらに到達し、従って、16員環マクロライドが単一のペプチド結合さえを形成するリボソームの能力を阻害する観察のための分子的基盤を提供する（Poulsenら、2000）。このことは、C5における代替的な置換を有するエリスロマイシン、例えば、ミカミノシルおよびアンゴロサミニルエリスロマイシン、ならびに特にミカミノシルおよび4'-O置換ミカミノシルエリスロマイシンが、潜在的な抗菌剤として高度に望ましいことを示唆する。
ポリケチドシンターゼ後修飾はしばしば生物学的活性のために決定的であるので（LiuおよびThorson、1994；Kanekoら、2000）、潜在的に改善された活性を有する多様な新規なハイブリッドマクロライドの生合成を操作するために含まれる酵素のメカニズムおよび特異性を理解することについての関心はますます増加している。最近の研究は、糖生合成遺伝子の操作が、新規なマクロライド系抗生物質を単離するための強力なアプローチであることを実証した。最近実証されたグリコシルトランスフェラーゼの緩和された特異性は、このアプローチのために決定的である（MendezおよびSalas、2001ならびにその中の引用文献を参照されたい）。エリスロマイシンAおよびメチルマイシン/ネオメチルマイシンに至る経路において、ハイブリッドマクロライドの産生は、デオキシヘキソースの生合成に関与する特定の遺伝子の不活性化後に（Gaisserら、1997；Summersら、1997；Gaisserら、1998；Salah-Beyら、1998；Zhaoら、1998a；Zhaoら、1998b）または異なる生合成遺伝子クラスターからの遺伝子の発現後に（Zhaoら、1999）観察されてきた。糖基質に対する緩和された特異性もまた、バンコマイシン（Solenbergら、1997）、エローラマイシン（Wohlertら、1998）、オレアンドマイシン（Doumithら、1999；Gaisserら、2000）、ピクロマイシン（TangおよびMcDaniel、2001）、エピルビシン（Madduriら、1998a）、アベルメクチン（Wohlertら、2001）およびスピノシン（Gaisserら、2002）に至る経路からのグリコシルトランスフェラーゼを含む、異種株において発現されるグリコシルトランスフェラーゼについて報告されてきた。これまでに報告された成功した変化の大部分は、活性化された糖部分に対する緩和された特異性を含んでいたが、なお唯一の単離された例としては、グリコシルトランスフェラーゼが、代替的なアグリコン基質にそのデオキシ糖を標的とする場合である（Spagnoliら、1983；Trefzerら、1999）。WO97/23630およびWO99/05283の両方は、特異的糖生合成遺伝子の検出による培養上清中のグリコシル化パターンの変化を伴うエリスロマイシンの産生を記載している。このようにして、WO99/05283は、S.エリスラエア（S. erythraea）のeryCIVノックアウト株の培養上清中の、低いが検出可能であるレベルの5-O-デデソサミニル（dedesosaminyl）-5-O-ミカミノシル（mycaminosyl）エリスロマイシンDを記載する。WO01/79520に記載されている遺伝子カセット技術の使用が、S.エリスラエアの変異株中での遺伝子の組み合わせを発現することによる、新規なマクロライド系抗生物質を単離するための強力でありかつ潜在的に一般的なアプローチであることもまた実証された（Gaisserら、2002b）。WO01/79520もまた、3-O-ミカロシルエリスロノリドBを供給した、S.エリスラエア株SGQ2pSGCIIIおよびSGQ2p（ミカミノース）CIIIの培養上清中での5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAの検出を記載している。しかし、低レベルの5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAは、これを、大スケールでこの価値ある物質を産生するための最適な方法することはなく、同様の問題は、化学的な方法を使用する5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAの合成でも直面した（Jonesら、1969）。EP1024145は、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシンおよび3''-デスメチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシンなどのミカミノシル残基を有するアジスロマイシン類似体の単離を言及している。しかし、この領域において与えられる唯一の実施例は「予言的な実施例」であり、実際に実施することができたという証拠は存在しない。
それゆえに、本発明は、C5位に非天然糖を有するエリスロマイシンおよびアジスロマイシン、特にミカミノースおよびアンゴロサミンの有意な量を製造するための効率的かつ高度に有効な方法の最初の実証を提供する。特定の局面において、本発明は、遺伝子カセット中の糖生合成遺伝子の特定の組み合わせを使用する、ミカミノースおよびアンゴロサミンの合成を提供する。
国際公開第９７／２３６３０号パンフレット 国際公開第９９／０５２８３号パンフレット 国際公開第０１／７９５２０号パンフレット 欧州特許第１０２４１４５号明細書
（発明の概要）
本発明は、対応する天然に存在する化合物とC5位のグリコシル化が異なる、エリスロマイシンおよびアジスロマイシンの調製および単離のためのプロセスおよび組換え株に関する。特定の局面において、本発明は、C5位にアンゴロサミンまたはミカミノースを取り込むエリスロマイシンおよびアジスロマイシンの調製および単離のためのプロセスおよび組換え株に関する。特に、本発明は、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンまたは5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルエリスロマイシンおよび5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシンまたは5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルアジスロマイシン、特に、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンおよび5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシン、および具体的には、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンB、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンC、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンD、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンA、および5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシンの調製および単離のためのプロセスおよび組換え株に関する。本発明はさらに、それによって産生される、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシル、アンゴロサミニルエリスロマイシンおよびアジスロマイシンに関する。
5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンA、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンBおよび5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンCの構造である。 5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシンの構造である。 遺伝子カセットクローニングストラテジーに対する図式的概観である。ベクターpSG144はベクターpSG142から誘導された（Gaisserら、2000）。略号は以下の通り：dam-：dam-バックグラウンドから単離されたDNA、Xbamet、Damメチル化に感受性であるXbaI部位、eryRHS：以前に記載されたeryクラスターの右手側のDNA断片（Gaisserら、2000）。 公開されたTylA1の配列（下、SEQ ID NO:1）および本明細書において記載される配列決定から検出されたアミノ酸配列（上、SEQ ID NO:2）のアミノ酸比較である。アミノ酸配列の変化に下線を付している。 公開されたTylAIIの配列（下、SEQ ID NO:3）および本明細書において記載される配列決定から検出されたアミノ酸配列（上、SEQ ID NO:4）のアミノ酸比較である。アミノ酸配列の変化に下線を付している。 5-O-アンゴロサミニルチラクトンの構造である。 アンゴラマイシンポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターの概観を示す。 アンゴラマイシン遺伝子クラスターからのorf14およびorf15（angB）を含むDNA配列である（SEQ ID NO:5）。 図7-1からの続きである。 アンゴラマイシン遺伝子クラスターからのorf2（angAI）、orf3（angAII）およびorf4を含むDNA配列である（SEQ ID NO:6）。 図8-1からの続きである。 図8-2からの続きである。 アンゴラマイシン遺伝子クラスターからのorf1*（angMIII）、orf2*（angMII）およびorf3*（angMI）を含むDNA配列である（SEQ ID NO:7）。 図9-1からの続きである。 図9-2からの続きである。 orf2（angAI、SEQ ID NO:8）に対応するアミノ酸配列である。 orf3（angAII、SEQ ID NO:9）に対応するアミノ酸配列である。 orf4（SEQ ID NO:10）に対応するアミノ酸配列である。 orf14（SEQ ID NO:11）に対応するアミノ酸配列である。 orf15（angB、SEQ ID NO:12）に対応するアミノ酸配列である。 orf1*（angMIII、SEQ ID NO:13）に対応するアミノ酸配列である。 orf2*（angMII、SEQ ID NO:14）に対応するアミノ酸配列である。 orf3*（angMI、SEQ ID NO:15）に対応するアミノ酸配列である。
（発明の詳細な説明）
本発明は、天然に存在する化合物とC5位のグリコシル化が異なる、エリスロマイシンおよびアジスロマイシンの調製および単離のためのプロセスおよび組換え株に関する。これらは、本明細書において「本発明の化合物」と呼ばれ、文脈が他を指示しない限り、このような言及は以下を含む：5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシン、5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルエリスロマイシン、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシン、および5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルアジスロマイシン、具体的には5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンA、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンC、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンB、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンD、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシン、5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルエリスロマイシンA、5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルエリスロマイシンB、5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルエリスロマイシンC、5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルエリスロマイシンD、5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルアジスロマイシン、およびC3位でさらにグリコシル化が変化し（WO01/79520を参照されたい）、かつアグリコンバックボーンもまた変化していてもよい、これらの類似体（WO98/01571、EP1024145、WO93/13663、WO98/49315を参照されたい）。本発明は、本発明の化合物の調製および単離のためのプロセスおよび組換え株に関する。特に、本発明は、天然に存在する化合物とC5位のグリコシル化が異なる、エリスロマイシンおよびアジスロマイシンの調製および単離のためのプロセスおよび組換え株を提供し、このプロセスは、本明細書に記載されるような遺伝子カセットで菌株を形質転換する段階、およびこのエリスロマイシンまたはアジスロマイシンの産生のための適切な条件下でこの株を培養する段階を含む。好ましい態様において、この菌株は放線菌、シュードモナス、粘液細菌（myxobacterium）、または大腸菌である。代替的な好ましい態様において、この宿主株は、S.エリスラエア（S. erythraea）からのermE遺伝子でさらに形質転換される。より高度に好ましい態様において、宿主株は放線菌である。より高度に好ましい態様において、宿主株は、S.エリスラエア（S. erythraea）、ストレプトマイセス・グリセオフスカス（Streptomyces griseofuscus）、ストレプトマイセス・シナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）、ストレプトマイセス・アルバス（Streptomyces albus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス種（Streptomyces hygroscopicus sp.）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス種変異株アスコマイセティカス（Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus）、ストレプトマイセス・ロンギスポロフラバス（Streptomyces longisporoflavus）、サッカロポリスポラ・スピノサ（Saccharopolyspora spinosa）、ストレプトマイセス・ツクバエンシス（Streptomyces tsukubaensis）、ストレプトマイセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・フラジエ（Streptomyces fradiae）、ストレプトマイセス・リモサス（Streptomyces rimosus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・ユーリサーマス（Streptomyces eurythermus）、ストレプトマイセス・ベネズエレ（Streptomyces venezuelae）、およびアミコラトプシス・メジテラネイ（Amycolatopsis mediterranei）から選択される。特定の態様において、宿主株はS.エリスラエアである。代替的な特定の態様において、宿主細胞は、S.エリスラエアのSGQ2、Q42/1または18A1から選択される。
本発明はさらに、それによって産生される、新規な5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルエリスロマイシンおよび5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルアジスロマイシンに関する（図1）。この方法論は、部分的には、実施例3および6に記載されるようなS.エリスラエア変異株SGQ2（これは、eryA、eryCIII、eryBVおよびeryCIVにゲノム変異を有する（WO01/79520））およびS.エリスラエアQ42/1（BIOT-2166）（実施例1〜4）およびS.エリスラエア18A1（BIOT-2634）（実施例6）中での遺伝子カセットの発現を含む。詳細な説明は実施例1〜11に与えられる。
本発明は、糖部分の生合成およびアグリコンまたはシュードアグリコンへのその引き続く移動を指向することが可能である遺伝子の組み合わせを含む発現プラスミドを用いる、SGQ2（WO01/79520を参照されたい）またはQ42/1または18A1などのS.エリスラエアの株（その調製は以下に記載される）を含むがこれらに限定されない放線菌の形質転換を含むプロセスに関する。
特定の態様において、本発明は、適切な菌株バックグラウンドにおけるミカミノースまたはアンゴロサミンの合成を指向することが可能である遺伝子の組み合わせを含む遺伝子カセットに関する。
特定の態様において、本発明は、適切な菌株バックグラウンドにおけるミカミノースの合成を指向することが可能である遺伝子の組み合わせを含む遺伝子カセットに関する。この遺伝子カセットは、以下から選択されるがこれらに限定されない遺伝子を含んでもよい：angorf14、tylMIII、tylMI、tylB、tylAI、tylAII、tylIa、angAI、angAII、angMIII、angB、angMI、eryG、eryK、ならびに、tylMII、angMII、desVII、eryCIII、eryBV、spnP、およびmidIからなる群より選択されるがこれらに限定されないグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子。好ましい態様において、この遺伝子カセットは、ミカミノースの合成を指向することが可能である1つまたは複数の遺伝子を組み合わせたtylIaを含む。好ましい態様において、この遺伝子カセットは、ミカミノースの合成を指向することが可能である1つまたは複数の遺伝子を組み合わせたangorf14を含む。より好ましい態様において、この遺伝子カセットは、例えば、eryCIII、tylMII、angMIIであるがこれらに限定されない１種または複数のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子と組み合わせた、angAI、angAII、angorf14、angMIII、angB、angMIを含む。代替的な態様において、この遺伝子カセットは、例えば、eryCIII、tylMII、およびangMIIであるがこれらに限定されないグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせた、tylAI、tylAII、tylMIII、tylB、tylIa、tylMIを含む。好ましい態様において、この菌株はS.エリスラエア株である。
特定の態様において、本発明は、angMIII、angMI、angB、angAI、angAII、angorf14、angorf4、tylMIII、tylMI、tylB、tylAI、tylAII、eryCVI、spnO、eryBVI、およびeryKを含むがこれらに限定されないアンゴロサミンの合成を指向することが可能である遺伝子、ならびにeryCIII、tylMII、angMII、desVII、eryBV、spnPおよびmidIを含むがこれらに限定されない1種または複数のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む遺伝子カセットに関する。好ましい態様において、この遺伝子カセットは、例えば、angMII、tylMII、またはeryCIIIであるがこれらに限定されないグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子と組み合わせた、angMIII、angMI、angB、angAI、angAII、angorf14、spnOを含む。代替的な好ましい態様において、この遺伝子カセットは、angMII、tylMII、およびeryCIIIからなる群より選択される1種または複数のグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせた、angMIII、angMI、angB、angAI、angAII、angorf4、angorf14を含む。好ましい態様において、この菌株はS.エリスラエア株である。
1つの態様において、本発明のプロセスはさらに、組換え株へのアグリコンおよび/またはシュードアグリコン基質（以下の定義を参照されたい）の、形質転換された放線菌株の培養への供給、本発明の化合物への基質の転換、および任意でこの化合物単離を含み、このアグリコンまたはシュードアグリコンは、3-O-ミカロシルエリスロノリドB、エリスロノリドB、6-デオキシエリスロノリドB、3-O-ミカロシル-6-デオキシエリスロノリドB、チラクトン（tylactone）、スピノシン(spinosyn)シュードアグリコン、3-O-ラムノシルエリスロノリドB、3-O-ラムノシル-6-デオキシエリスロノリドB、3-O-アンゴロサミニルエリスロノリドB、15-ヒドロキシ-3-O-ミカロシルエリスロノリドB、15-ヒドロキシエリスロノリドB、15-ヒドロキシ-6-デオキシエリスロノリドB、15-ヒドロキシ-3-O-ミカロシル-6-デオキシエリスロノリドB、15-ヒドロキシ-3-O-ラムノシルエリスロノリドB、15-ヒドロキシ-3-O-ラムノシル-6-デオキシエリスロノリドB、15-ヒドロキシ-3-0-アンゴロサミニルエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-3-O-ミカロシルエリスロノリドB、14-ヒドロキシエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-6-デオキシエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-3-O-ミカロシル-6-デオキシエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-3-O-ラムノシルエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-3-O-ラムノシル-6-デオキシエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-3-O-アンゴロサミニルエリスロノリドBを含むがこれらに限定されない群より選択される。このプロセスは、実施例1〜11に例示される。しかし、当業者は、代替的な態様において、宿主細胞は、天然または組換え的のいずれかで、所望のアグリコン鋳型を発現することができることを認識する。
本明細書において用いられるように、「シュードアグリコン（pseudoaglycone）」という用語は、複数がグリコシル化される生成物の部分的にグリコシル化された中間体をいう。
当業者は、代替的な宿主株が使用可能であることを認識する。好ましい細胞は、原核細胞または真菌細胞または哺乳動物細胞である。特に好ましい宿主細胞は原核細胞、より好ましくは、放線菌、シュードモナス、粘液細菌、および大腸菌などの宿主株である。宿主細胞は、エリスロマイシンまたは密接に関連する14員マクロライドを天然に産生しない場合に、S.エリスラエアからのermE遺伝子などのマクロライド生成物に自己耐性を付与する遺伝子を導入することが必要である可能性があることが認識される。さらにより好ましくは、宿主細胞は、放線菌、なおさらにより好ましくは、S.エリスラエア、ストレプトマイセス・グリセオフスカス、ストレプトマイセス・シナモネンシス、ストレプトマイセス・アルバス、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス種、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス種変異株アスコマイセティカス、ストレプトマイセス・ロンギスポロフラバス、サッカロポリスポラ・スピノサ、ストレプトマイセス・ツクバエンシス、ストレプトマイセス・コエリコロール、ストレプトマイセス・フラジアエ、ストレプトマイセス・リモサス、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・ユーリサーマス、ストレプトマイセス・ベネズエレ、およびアミコラトプシス・メジテラネイを含むがこれらに限定されない株である。より高度に好ましい態様において、宿主細胞はS.エリスラエアである。
本発明の組換え培地に供給される基質はエリスロマイシン生合成の天然の中間体ではないことは、当業者には容易に理解される。従って、この基質は、アグリコンバックボーン（実施例8〜11を参照されたい）または3位に結合した糖またはその両方で修飾可能である。WO01/79520は、デソサミニルトランスフェラーゼEryCIIIがシュードアグリコン基質に関して緩和した特異性を示し、3-O-ラムノシルエリスロノリドを対応する3-O-ラムノシルエリスロマイシンに転換することを示す。適切な修飾された基質はまた、化学的半合成法によって製造されてもよい。代替的には、エリスロマイシン産生ポリケチドシンターゼ、DEBSを操作して修飾エリスロマイシンを産生する方法は当業者に周知である（例えば、WO93/13663、WO98/01571、WO98/01546、WO98/49315、Kato, Y.ら、2002）。同様に、WO01/79520は、3位に代替的な糖を有するエリスロライドを得るための方法を記載している。それゆえに、「本発明の化合物」という用語は、C5位に代替的な糖をさらに有する、以前に記載したすべてのこのような非天然アグリコン化合物を含む。これらの文書のすべては参照として本明細書に組み入れられる。
C5位にミカミノシル部分を含む本発明の化合物は、グリコシル化（WO01/79520もまた参照されたい）、アシル化または化学修飾を含むがこれらに限定されない、ミカミノシル部分のC4ヒドロキシル基で修飾可能であることは当業者に容易に認識される。
従って、本発明は、5位に天然に存在しない糖、特にO-ミカミノシルまたはO-アンゴロサミニル残基、またはその誘導体もしくは前駆体、具体的にはO-アンゴロサミニル残基またはその誘導体を有する、エリスロマイシンの類似体および関連するマクロライドを提供する。
「エリスロマイシンの類似体」という用語は、（a）エリスロマイシンA、B、CおよびD；（b）参照として本明細書に組み入れられる、EP1024145において議論されるようなアジスロマイシンおよび他の誘導体のような半合成誘導体；（c）遺伝子操作およびその半合成誘導体によって産生される改変体を含む。遺伝子操作によって産生される改変体には、参照として本明細書に組み入れられる、WO98/01571、EP1024145、WO93/13663、WO98/49315およびWO01/79520において開示されるか、またはこれらによって開示される方法によって産生可能な改変体が含まれる。本発明の化合物には、C5位の天然の糖がミカミノースまたはアンゴロサミンで置換されるエリスロマイシンの改変体が含まれ、およびまた、以下の化学式（I-エリスロマイシンおよびII-アジスロマイシン）の化合物およびその薬学的に許容される塩が含まれる。化学式IおよびIIには、すべての可能性が網羅されるように、立体化学は示されておらず、これは、（本明細書の他の箇所に示されるような）いくつかのまたはすべての位置における「天然の」立体化学を含む。特に、任意の-CH(OH)-基の立体化学は、一般的に独立して選択可能である。
Figure 2011147446
 R1はH、CH3、C2H5または以下のi）から選択され；
R2、R4、R5、R6、R7およびR9は各々独立してH、OH、CH3、C2H5またはOCH3であり；
R3=HまたはOHであり
R8=H、
Figure 2011147446
 、ラムノース、2'-O-メチルラムノース、2',3'-ビス-O-メチルラムノース、2',3',4'-トリ-O-メチルラムノース、オレアンドロース、オリオース、ジジトキソース、オリボースまたはアンゴロサミンであり；
R10=HまたはCH3またはC(=O)RAであり、ここでRA=C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはC2〜C6アルキニルであり；
R11=H、
Figure 2011147446
 、ミカロース、C4-O-アシル-ミカロースまたはグルコースであり；
R12=HまたはC(=O)RAであり、ここでRA=C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはC2〜C6アルキニルであり；
R13=HまたはCH3であり；
R15=Hまたは
Figure 2011147446
 であり；
R16=HまたはOHであり；
R14=Hまたは-C(O)NRcRdであり、ここでRcおよびRdの各々は、独立してH、C1〜C10アルキル、C2〜C20アルケニル、C2〜C10アルキニル、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、または-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)であり、ここでmは0〜4の範囲の整数であり、かつH以外の上記Rc基およびRd基の各々は1〜3個のQ基によって置換されてもよく；またはRcおよびRdは一緒になって4〜7員環の飽和環または5〜10員環のヘテロアリール環を形成してもよく、ここで上記飽和環およびヘテロアリール環は、RcおよびRdが結合する窒素に加えて、O、SおよびNから選択される1個または2個のヘテロ原子を含んでもよく、および上記飽和環は1個もしくは2個の炭素-炭素二重結合または三重結合を含んでもよく、ならびに上記飽和環およびヘテロアリール環は1〜3個のQ基によって置換されてもよく；またはR2およびR17は一緒になって炭酸環を形成し；各Qはハロ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、アジド、-C(O)Q1、-OC(O)Q1、-C(O)OQ1、-OC(O)OQ1、-NQ2C(O)Q3、-C(O)NQ2Q3、-NQ2Q3、ヒドロキシ、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、および-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)から独立して選択され、ここでmは0〜4の範囲の整数であり、かつ上記アリール置換基およびヘテロアリール置換基は、ハロ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、アジド、-C(O)Q1、-C(O)OQ1、-OC(O)OQ1、-NQ2C(O)Q3、-C(O)NQ2Q3、-NQ2Q3、ヒドロキシ、C1〜C6アルキル、およびC1〜C6アルコキシから独立して選択される1個または2個の置換基によって置換されてもよく；
各Q1、Q2およびQ3はH、OH、C1〜C10アルキル、C1〜C6アルコキシ、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、および-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)から独立して選択され、ここでmは0〜4の範囲の整数であり；化合物が5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAまたはDではないという条件である。
本発明はまた、化学式IまたはIIに従う化合物を提供し、ここで：
i）置換基R1は以下から選択され：
- いずれかが1つまたは複数のヒドロキシル基で任意で置換されてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシアルキル基およびアルキルチオアルキル基から選択されるα分枝C3〜C8基；
- アルキル基がα分枝C2〜C5アルキル基であるC5〜C8シクロアルキルアルキル基；
- いずれかが1つもしくは複数のヒドロキシル、または1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、C3〜C8シクロアルキル基またはC5〜C8シクロアルケニル基；
- 飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよい、かつ1つまたは複数のC1〜C4アルキル基、ハロ原子またはヒドロキシル基によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素または硫黄含有複素環；
- C1〜C4アルキル基、C1〜C4アルコキシ基およびC1〜C4アルキルチオ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル、ならびにシアノから選択される少なくとも1つの置換基で任意で置換されてもよいフェニル、あるいは；
- R1がR17-CH2-であって、ここで、R17は、H、C1〜C8アルキル、C2〜C8アルケニル、C2〜C8アルキニル、各アルキルまたはアルコキシ基において1〜6個の炭素原子を含むアルコキシアルキル、またはアルキルチオアルキルであり、そして上記アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基またはアルキニル基のいずれかは、1つもしくは複数のヒドロキシル基または1つもしくは複数のハロ原子によって置換されてもよく；またはそれらのいずれかが1個もしくは複数のC1-C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、C3〜C8シクロアルキルもしくはC5〜C8シクロアルケニルであり；または飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよい、かつ1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素もしくは硫黄含有複素環であり；または化学式SA16の基であって、ここで、A16はC1〜C8アルキル、C2〜C8アルケニル、C2〜C8アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C5〜C8シクロアルケニル、フェニルもしくは置換フェニルであり、ここで置換基はC1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシもしくはハロであり、または飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよい、かつ1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基、もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素または硫黄含有複素環であり；
ii）C11（エリスロマイシン）またはC12（アジスロマイシン）における-CHOH-はメチレン基（-CH2-）、ケト基（C=O）、または10,11-オレフィン結合（エリスロマイシン）もしくは11,12-オレフィン結合（アジスロマイシン）によって置換され；
iii）置換基R11はHまたはミカロースまたはC4-O-アシル-ミカロースまたはグルコースであり；
または、1つまたは複数のケチド単位の酸化状態が異なる化学式IまたはIIに従う化合物（すなわち、以下の基：-CO-、-CH(OH)-、アルケン-CH-、およびCH2からの代替物の選択）を提供し、ここで、任意の-CH(OH)-の立体化学もまた独立して選択可能であり、この化合物は5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンA、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンD、および5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシンからなる群より選択されないという条件である。
本発明のこの局面によって利用可能にされる新規な5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルエリスロマイシンおよびアジスロマイシンには、これらがアンゴラマイシンまたはメデルマイシンではないという条件で、R15基においてR11=R16=Hであるものが含まれるがこれらに限定されない（KinumakiおよびSuzuki、1972；Ichinoseら、2003）。
好ましい態様において、本発明は、化学式IまたはIIに記載の化合物を提供し、ここで：
R1=H、CH3、C2H5であるか、または以下から選択される：いずれかが1つまたは複数のヒドロキシル基で任意で置換されてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシアルキル基およびアルキルチオアルキル基から選択されるα分枝C3〜C8基；アルキル基がα分枝C2〜C5アルキル基であるC5〜C8シクロアルキルアルキル基；いずれかが1つもしくは複数のヒドロキシル、または1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、C3〜C8シクロアルキル基またはC5〜C8シクロアルケニル基；飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよい、かつ1つまたは複数のC1〜C4アルキル基、ハロ原子またはヒドロキシル基によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素または硫黄含有複素環；C1〜C4アルキル基、C1〜C4アルコキシ基およびC1〜C4アルキルチオ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル、ならびにシアノから選択される少なくとも1つの置換基で任意で置換されてもよいフェニル、あるいはR1はR17-CH2-であって、ここで、R17は、H、C1〜C8アルキル、C2〜C8アルケニル、C2〜C8アルキニル、各アルキルまたはアルコキシ基において1〜6個の炭素原子を含むアルコキシアルキル、またはアルキルチオアルキルであり、ここで上記アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基またはアルキニル基のいずれかは、1つもしくは複数のヒドロキシル基または1つもしくは複数のハロ原子によって置換されてもよく；またはいずれかが1個もしくは複数のC1-C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、C3〜C8シクロアルキルもしくはC5〜C8シクロアルケニルであり；または飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよい、かつ1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素もしくは硫黄含有複素環であり；または化学式SA16基であって、ここで、A16はC1〜C8アルキル、C2〜C8アルケニル、C2〜C8アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C5〜C8シクロアルケニル、フェニルもしくは置換フェニルであり、ここで置換基はC1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシもしくはハロであり、または飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよい、かつ1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基、もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素または硫黄含有複素環であり、
R2、R4、R5、R6、R7およびR9はすべてCH3であり、
R3=HまたはOHであり、
R8=Hもしくは
Figure 2011147446
 であるか、またはラムノース、2'-O-メチルラムノース、2',3'-ビス-O-メチルラムノース、2',3',4'-トリ-O-メチルラムノース、オレアンドロース、オリオース、ジジトキソース、オリボースまたはアンゴロサミンから選択され；
R10=HまたはCH3であり、
R11=Hもしくは
Figure 2011147446
 であり、
R12=HまたはC(=O)RAであり、ここでRA=C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはC2〜C6アルキニルであり、
R13=HまたはCH3であり、
R14=Hまたは-C(O)NRcRdであり、ここでRcおよびRdの各々は、独立してH、C1〜C10アルキル、C2〜C20アルケニル、C2〜C10アルキニル、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、または-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)であり、ここでmは0〜4の範囲の整数であり、およびH以外の上記Rc基およびRd基の各々は1〜3個のQ基によって置換されてもよく；またはRcおよびRdは一緒になって4〜7員環の飽和環または5〜10員環のヘテロアリール環を形成してもよく、ここで上記飽和環およびヘテロアリール環は、RcおよびRdが結合する窒素に加えて、O、SおよびNから選択される1個または2個のヘテロ原子を含んでもよく、および上記飽和環は1個もしくは2個の炭素-炭素二重結合または三重結合を含んでもよく、ならびに上記飽和環およびヘテロアリール環は1〜3個のQ基によって置換されてもよく；またはR2およびR17は一緒になって炭酸環を形成し；各Qはハロ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、アジド、-C(O)Q1、-OC(O)Q1、-C(O)OQ1、-OC(O)OQ1、-NQ2C(O)Q3、-C(O)NQ2Q3、-NQ2Q3、ヒドロキシ、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、および-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)から独立して選択され、ここでmは0〜4の範囲の整数であり、および上記アリール置換基およびヘテロアリール置換基は、ハロ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、アジド、-C(O)Q1、-C(O)OQ1、-OC(O)OQ1、-NQ2C(O)Q3、-C(O)NQ2Q3、-NQ2Q3、ヒドロキシ、C1〜C6アルキル、およびC1〜C6アルコキシから独立して選択される1個または2個の置換基によって置換されてもよく；
各Q1、Q2およびQ3はH、OH、C1〜C10アルキル、C1〜C6アルコキシ、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、および-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)から独立して選択され、ここでmは0〜4の範囲の整数であり；この化合物は5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAまたはDではないという条件であり、
R15=Hまたは
Figure 2011147446
 であり、
R16=HまたはOHであり、
この化合物は5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンA、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンD、および5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシンからなる群より選択されないという条件である。
さらに好ましい態様において、本発明の化合物は化学式Iに従う化合物を提供し、ここで：
R1=H、CH3、C2H5であり、または以下から選択される：そのいずれかが1つまたは複数のヒドロキシル基で任意で置換されてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシアルキル基およびアルキルチオアルキル基から選択されるα分枝C3〜C8基；アルキル基がα分枝C2〜C5アルキル基であるC5〜C8シクロアルキルアルキル基；いずれかが1つもしくは複数のヒドロキシル、または1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、C3〜C8シクロアルキル基またはC5〜C8シクロアルケニル基；飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよい、かつ1つまたは複数のC1〜C4アルキル基、ハロ原子またはヒドロキシル基によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素または硫黄含有複素環；C1〜C4アルキル基、C1〜C4アルコキシ基およびC1〜C4アルキルチオ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル、ならびにシアノから選択される少なくとも1つの置換基で任意で置換されてもよいフェニル、あるいはR1はR17-CH2-であって、ここで、R17は、H、C1〜C8アルキル、C2〜C8アルケニル、C2〜C8アルキニル、各アルキルまたはアルコキシ基において1〜6個の炭素原子を含むアルコキシアルキル、またはアルキルチオアルキルであり、ここで上記アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基またはアルキニル基のいずれかは、1つもしくは複数のヒドロキシル基または1つもしくは複数のハロ原子によって置換されてもよく；またはいずれかが1個もしくは複数のC1-C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、C3〜C8シクロアルキルもしくはC5〜C8シクロアルケニルであり；または飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよい、かつ1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素もしくは硫黄含有複素環であり；または化学式SA16基であって、ここで、A16はC1〜C8アルキル、C2〜C8アルケニル、C2〜C8アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C5〜C8シクロアルケニル、フェニルもしくは置換フェニルであり、ここで置換基はC1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシもしくはハロであり、または飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよい、かつ1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基、もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素または硫黄含有複素環であり、
R2、R4、R5、R6、R7およびR9はすべてCH3であり、
R3=HまたはOHであり、
R8=Hもしくは
Figure 2011147446
 であるか、またはラムノース、2'-O-メチルラムノース、2',3'-ビス-O-メチルラムノース、2',3',4'-トリ-O-メチルラムノース、オレアンドロース、オリオース、ジジトキソース、オリボースまたはアンゴロサミンから選択され；
R10=HまたはCH3であり、
R11=Hもしくは
Figure 2011147446
 であり、
R12=HまたはC(=O)RAであり、ここでRA=C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはC2〜C6アルキニルであり、
R13=HまたはCH3であり、
R14=Hであり、
R15=Hまたは
Figure 2011147446
 であり、
R16=HまたはOHであり、
この化合物は5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンA、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンD、および5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシンからなる群より選択されないという条件である。
より好ましい態様において、本発明は化学式Iに従う化合物を提供し、ここで：
R1=ヒドロキシル基により任意で置換されるC2H5であり、
R2、R4、R5、R6、R7およびR9はすべてCH3であり、
R3=HまたはOHであり、
R8=Hまたは
Figure 2011147446
 であり、
R10=HまたはCH3であり、
R11=Hもしくは
Figure 2011147446
 であり、
R12=HまたはC(=O)RAであり、ここでRA=C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはC2〜C6アルキニルであり、
R13=HまたはCH3であり、
R14=Hであり、
R15=Hまたは
Figure 2011147446
 であり、
R16=HまたはOHであり、
この化合物は5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよび5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンDからなる群より選択されないという条件である。
より好ましい態様において、本発明は化学式Iに従う化合物を提供し、ここで：
R1=ヒドロキシル基により任意で置換されるC2H5であり、
R2、R4、R5、R6、R7およびR9はすべてCH3であり、
R3=HまたはOHであり、
R8=Hまたは
Figure 2011147446
 であり、
R10=HまたはCH3であり、
R12=Hであり、
R13=HまたはCH3であり、
R14=Hであり、
R15=Hまたは
Figure 2011147446
 であり、
R16=HまたはOHである。
高度に好ましい態様において、本発明は化学式Iに従う化合物を提供し、ここで：
R1=C2H5であり、
R2、R4、R5、R6、R7およびR9はすべてCH3であり、
R3=HまたはOHであり、
R8=Hまたは
Figure 2011147446
 であり、
R10=HまたはCH3であり、
R12=Hであり、
R13=HまたはCH3であり、
R14=Hであり、
R15=Hまたは
Figure 2011147446
 であり、
R16=HまたはOHであり、
この化合物は5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよび5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンDからなる群より選択されないという条件である。
さらに、当業者は、本発明の方法を使用して、ミカミノースおよびアンゴロサミンが他のアグリコンまたはシュードアグリコン、例えば（しかし非限定的に）チラクトンまたはスピノシンアグリコンに加えられてもよいことを認識する。これらの他のアグリコンまたはシュードアグリコンは天然に存在する構造であってもよいし、またはこれらはアグリコンバックボーン中で修飾されてもよく、このような修飾された基質は、化学的半合成法によって（Kanekoら、2000およびそこに引用される参考文献）、または代替的に、PKS操作を介して産生されてもよく、このような方法は当技術分野において周知である（例えば、WO93/13663、WO98/01571、WO98/01546、WO98/49315、Kato, Y.ら、2002）。それゆえに、さらなる態様において、本発明は、5-O-アンゴロサミニルチラクトン、5-O-ミカミノシルチラクトン、17-O-アンゴロサミニルスピノシンおよび17-O-ミカミノシルスピノシンを提供する。
その上、宿主細胞選択のプロセスは、遺伝子を欠失、または不活性化、または付加、または操作する任意の段階をさらに含む。このプロセスは、本発明の化合物、特に、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンおよび5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシン、具体的には、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンA、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンC、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンB、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンDおよび5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシンの調製および単離のための組換え宿主株の改善を含む。このアプローチは、基質3-O-ミカロシルエリスロノリドBから5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンへの転換を最適化するために、S.エリスラエアSGQ2の染色体にeryBVI変異を導入することによって、実施例1において例示される。
さらなる局面において、本発明は遺伝子カセットの構築に関する。これらの遺伝子カセットを単離するために使用されるクローニング方法は、PCT/GB03/003230において使用されるものと類似しており、pUC18/19プラスミド中で遺伝子をプレアセンブルするよりもむしろ発現ベクター中で直接的に遺伝子カセットをアセンブルすることによって、以前に記載されたアプローチ（WO01/79520）とは顕著に異なっており、従って、遺伝子発現の単離のためのより迅速なクローニング手順を提供する。これらの遺伝子カセットを単離するためのストラテジーは実施例1〜実施例11に例示される。このストラテジーの図式的概観は図2に与えられる。
本発明の別の局面は、遺伝子カセット中の遺伝子の順番を変化させることによって遺伝子発現の増強を可能にし、この遺伝子には、tylMI、tylMIII、tylB、eryCVI、tylAI、tylAII、eryCIII、eryBV、angAI、angAII、angMIII、angB、angMI、angorf14、angorf4、eryBVI、eryK、eryG、angMII、tylMII、desVII、midI、spnO、spnN、spnPおよび同様の機能を有する遺伝子が含まれるがこれらに限定されず、多数の順列の配置を可能にする（図2）。
本発明において概略されるクローニングストラテジーはまた、遺伝子発現を増強するために、遺伝子カセットの3'ターミネーター配列と組み合わせたヒスチジンタグの導入を可能にする（実施例1を参照されたい）。当業者は、当技術分野において周知である他のターミネーター配列が使用可能であろうことを認識する。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、BussiereおよびBastia (1999)、Bertramら (2001) およびKieserら (2000)を参照されたい。
本発明の別の局面は、発現を増強するために、遺伝子および/またはアセンブルされた遺伝子カセットを発現するためのPtipA（Aliら、2002）および/またはPptr（Salah-Beyら、1995）などの代替的なプロモーターの使用を含む。
本発明の別の局面は、実施例6に例示されるような、遺伝子発現を増強するための、アセンブルされた遺伝子カセット中でのプロモーター配列の多重使用を記載する。
本発明の別の局面は、活性化された糖脂質の内因性産生を増強するために、遺伝子カセットへの、tylAIなどのNDP-グルコース-シンターゼおよびtylAIIなどのNDP-グルコース-4,6-デヒドラターゼをコードする遺伝子の付加を記載する。当業者は、等価な糖生合成経路遺伝子の代替的な供給源が使用されてもよいことを認識する。この状況において、代替的な供給源には以下が含まれるがこれらに限定されない：
tyAI相同体：ストレプトマイセス・ベネズエレのDesIII（アクセッション番号AAC68682）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）のGrsD（アクセッション番号AAD31799）、ストレプトマイセス・アベルミティリスのAveBIII（アクセッション番号BAA84594）、サッカロポリスポラ・スピノサのGtt（アクセッション番号AAK83289）、ストレプトマイセス・ノガラテル（Streptomyces nogalater）のSnogJ（アクセッション番号AAF01820）、ストレプトマイセス・ガリラレウス（Streptomyces galilaeus）のAclY（アクセッション番号BAB72036）、ストレプトマイセス・シアノゲヌス（Streptomyces cyanogenus）のLanG（アクセッション番号AAD13545）、ストレプトマイセス・ビオラセオルベル（Streptomyces violaceoruber）のGraorfl6 (GraD)（アクセッション番号AAA99940）、ストレプトマイセス・アンチビオティカス（Streptomyces antibioticus）のOleS（アクセッション番号AAD55453）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）のStrD（アクセッション番号A26984）およびS.ユーリサーマスのAngAI。
tyAII相同体：ストレプトマイセス・テネブラリウス（Streptomyces tenebrarius）のAprE（アクセッション番号AAG18457）、S．スピノサのGdH（アクセッション番号AAK83290）、S．ベネズエラエのDesIV（アクセッション番号AAC68681）、S.エリスラエアのGdH（アクセッション番号AAA68211）、S．アベルミティリスのAveBII（アクセッション番号BAA84593）、ストレプトマイセス・コエリコロールのScf81.08C（アクセッション番号CAB61555）、S．シアノゲヌスのLanH（アクセッション番号AAD13546）、S．ビオラセオルベル（S. violaceoruber）のGraorfl7 (GraE)（アクセッション番号S58686）、S．アンチビオティカスのOleE（アクセッション番号AAD55454）、S.グリセウスのStrE（アクセッション番号P29782）およびS.ユーリサーマスのAngAII。
同様に、tylMIII、angAIII、eryCII、tylMII、angMII、tylB、angB、eryCI、tylMI、angMI、eryCVI、tylIa、angorf14、angorf4、spnO、eryBVI、eryBV、eryCIII、desVII、midI、 spnNおよびspnPに対する活性化糖生合成遺伝子相同体のための代替的な供給源は、当業者に容易に認識され、かつ使用可能である。
本発明のもう1つの局面は、EryCIIIのような遺伝子カセット中の代替的なグリコシルトランスフェラーゼの使用を説明する。当業者は、代替的なグリコシルトランスフェラーゼが使用されてもよいことを認識する。この状況において、代替的なグリコシルトランスフェラーゼには、TylMII（アクセッション番号CAA57472）、DesVII（アクセッション番号AAC68677）、MegCIII (アクセッション番号AAG13921)、MegDI（アクセッション番号AAG13908)、S.ユーリサーマスのAngMIIが含まれるがこれらに限定されない。
本発明の1つの局面において、遺伝子カセットは、キメラグリコシルトランスフェラーゼ（GT）をさらに含んでもよい。これは、天然のGTが、所望の類似体の合成のために必要とされる糖およびアグリコンの組み合わせを認識しない場合に特に有益である。それゆえに、この局面において、本発明はキメラGTの使用を具体的に意図し、ここでGTの一部は、適切な菌株バックグラウンド中で発現される場合に、上記発現カセット中で合成が遺伝子によって指向される糖の認識のために特異的であり、かつGTの一部はアグリコンまたはシュードアグリコン鋳型に対して特異的である（HuおよびWalker、2002）。
当業者は、異なるストラテジーが部位特異的組み込みベクターなどの宿主株への遺伝子カセットの組み込みのために使用されてもよいことを認識する（Smovkinaら、1990；Leeら、1991；Matsuuraら、1996；Van Mellaertら、1998；Kieserら、2000）。代替として、遺伝子カセットを含むプラスミドが、相同組換え部位を使用して、染色体上の任意の天然の部位に組み込まれてもよい。さらに、S.エリスラエアを含む多数の放線菌については、遺伝子カセットが、自己複製プラスミド上に導入されてもよい（Kieserら、2000；WO98/01571）。
本発明のさらなる局面は、本発明の化合物の産生のため、および任意で上記化合物の単離のためのプロセスを提供する。
本発明のさらなる局面は、実施例1に例示されるような、本発明の化合物の産生を最適化するための異なる発酵の使用である。本発明のもう1つの局面は、遺伝子カセットへの、eryKおよび/またはeryGのようなery遺伝子の付加である。当業者は、プロセスが、遺伝子eryG（ミカロース糖上のメチル化の原因である）および/またはeryK（C12における水酸化の原因である）の操作によって、特異的エリスロマイシン（すなわち、A、B、C、D）またはアジスロマイシンの産生のために最適化可能であることを認識する。従って、A型の産生を最適化するために、eryKの余分のコピーが遺伝子カセットに含まれてもよい。逆に、エリスロマイシンB類似体が必要とされるならば、これは、S.エリスラエア宿主株からのeryK遺伝子の欠失によって、または遺伝子および/もしくはその機能的相同体が存在しない異種宿主中で操作することによって達成可能である。同様に、エリスロマイシンDアナログが必要とされるならば、これは、S.エリスラエア宿主株からのeryG遺伝子とeryKの両方の欠失によって、または遺伝子および/もしくはその機能的相同体が存在しない異種宿主中で操作することによって達成可能である。同様に、エリスロマイシンCアナログが必要とされるならば、これは、S.エリスラエア宿主株からのeryG遺伝子の欠失によって、または遺伝子および/もしくはその機能的相同体が存在しない異種宿主中で操作することによって達成可能である。
この状況において、好ましい宿主細胞株は、原核細胞株、真菌細胞株または哺乳動物細胞である。より好ましくは、宿主細胞株は放線菌、シュードモナス、粘液細菌、または大腸菌である。より好ましい態様において、宿主細胞株は、放線菌、なおさらにより好ましくは、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Saccharopolyspora erythraea）、ストレプトマイセス・コエリコロール、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・グリセオフスカス、ストレプトマイセス・シナモネンシス、ストレプトマイセス・フラジエ、ストレプトマイセス・ユーリサーマス、ストレプトマイセス・ロンギスポロフラバス、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス、サッカロポリスポラ・スピノサ、ミクロモノスポラ・グリセオルビダ（Micromonospora griseorubida）、ストレプトマイセス・ラサリエンシス（Streptorrayces lasaliensis）、ストレプトマイセス・ベネズエレ、ストレプトマイセス・アンチビオティカス、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・リモサス、ストレプトマイセス・アルバス、アミコラトプシス・メジテラネイ、ノカルジア種（Nocardia sp）、ストレプトマイセス・ツクバエンシス、およびアクチノプラネス種（Actinoplanes sp.）N902-109を含むがこれらに限定されない。なおより好ましい態様において、宿主細胞株は、サッカロポリスポラ・エリスラエア、ストレプトマイセス・グリセオフカス、ストレプトマイセス・シナモネンシス、ストレプトマイセス・アルバス、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス種、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス種変異株アスコマイセティカス、ストレプトマイセス・ロンギスポロフラバス、サッカロポリスポラ・スピノサ、ストレプトマイセス・ツクバエンシス、ストレプトマイセス・コエリコロール、ストレプトマイセス・フラジエ、ストレプトマイセス・リモサス、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・ユーリサーマス、ストレプトマイセス・ベネズエレ、およびアミコラトプシス・メジテラネイから選択される。最も高度に好ましい態様において、宿主細胞はサッカロポリスポラ・エリスラエアである。
本発明は、本発明の化合物、特にC5位のグリコシル化が天然の化合物とは異なる、ヒトまたは動物の健康における使用のために抗微生物剤として有用である、エリスロマイシンおよびアジスロマイシン類似体、例えば、ただし非限定的には、新規な5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシル またはアンゴロサミニル エリスロマイシン、および5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルまたはアンゴロサミニル アジスロマイシンの調製および単離のための方法を提供する。
さらなる局面において、本発明は、本明細書に開示される任意のプロセスによて入手可能であるような新規な生成物を提供する。
一般的方法
大腸菌XL1-Blue MR（Stratagene）、大腸菌DH10B（GibcoBRL）および大腸菌ET12567は、Sambrookら（1989）によって記載されるように2ｘYT培地中で増殖させた。ベクターpUC18、pUC19およびLitmus28はNew England Biolabsから入手した。大腸菌形質転換体は100μg/mLアンピシリンを用いて選択した。サッカロポリスポラ・エリスラエアNRRL 2338-red変異型株は以前に記載されたとおりであった（Gaisserら、1997、Gaisser、1998）。プラスミドを含むS.エリスラエアは、25〜40μg/mLチオストレプトンまたは50μg/mLアプラマイシンを用いて選択した。抗生物質の産生を調べるために、S.エリスラエア株は、以前に記載されたように（Gaisserら、1997）スクロース-コハク酸培地（Caffreyら、1992）中で増殖させ、細胞は遠心分離によって収集した。ストレプトマイセス・ロケイ（Streptomyces rochei）ATCC21250の染色体DNAは、標準的な手順（Kieserら、2000）を使用して単離した。3-O-ミカロシルエリスロノリドBまたはチラクトンの供給は、25〜50mg/Lの間の濃度で実行した。
DNA操作および配列決定
DNA操作、PCRおよび電気穿孔法手順は、Sambrookら（1989）に記載されるように実行した。S.エリスラエアのプロトプラスト形成および形質転換手順は、以前に記載されたものと同様であった（Gaisserら、1997）。サザンハイブリダイゼーションは、DIG DNA標識キット（Boehringer Mannheim）を使用してジゴキシゲニンを用いて標識したプローブを用いて実行した。DNA配列決定は、ABI Prism 3700 DNA分析装置を用いる二本鎖鋳型上での自動化DNA配列決定を使用して、以前に記載されたように実行した（Gaisserら、1997）。
抽出および質量分析法
各発酵ブロスの1mLを収集し、pH9に調整した。抽出のために、等量の酢酸エチル、メタノール、またはアセトニトリルを加え、少なくとも30分間混合し、かつ遠心分離した。酢酸エチルを用いる抽出については、有機層を乾燥までエバポレートし、次いで0.5mLエタノールに再溶解した。メタノール抽出およびアセトニトリル抽出については、遠心分離後に上清を収集し、分析のために使用した。高分解能スペクトルを、Bruker BioApex II FT-ICR（Bruker, Bremen, FRG）上で得た。
全ブロスのアリコート（1mL）を、CH3CN（1mL）とともに30分間インキュベートした。この混合物を、遠心分離によって清澄化し、上清をLCMSによって分析した。HPLCシステムは、40℃に加熱したLuna 5μm C18 BDS 4.6×250mmカラム（Phenomenex, Macclesfield, UK）を装着したAgilent HP1100を含んだ。グラジエント溶液は、1mL/分の流速で、19分間にわたる、25%移動相B〜75%移動相Bであった。移動相Aは10mM酢酸アンモニウムおよび0.15%ギ酸を含む10%アセトニトリル：90%水であり、移動相Bは10mM酢酸アンモニウムおよび0.15%ギ酸を含む90%アセトニトリル：10%水であった。記載されたHPLCシステムは、陽イオンモードで操作するBruker Daltonics Esquire3000エレクトロスプレー質量分析装置に接続した。
抽出および精製のプロトコール：
5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAのNMR分析のために、発酵ブロスを遠心分離によって清澄化し、上清および細胞を供給した。上清を、Diaion（登録商標）HP20レジン（Supelco）のカラム（16×15cm）に適用し、10%Me2CO/H2Oで洗浄し（2×2L）、次いでMe2CO（3.5L）で溶出した。細胞を、均質になるまで等量のMe2CO/MeOH（1：1）と混合した。少なくとも30分後、スラリーを遠心分離によって清澄化し、上清をデカントした。ペレット化した細胞を、同様に再度Me2CO/MeOH（1：1）で抽出した。細胞抽出物をHP20カラムからのMe2COと合わせ、溶媒を真空中で除去して、水性濃縮物を得た。水分をEtOAcで抽出し（3×）、溶媒を真空中で除去して粗抽出物を得た。残渣をCH3CN/MeOH中に溶解し、そしてPhenomenex 21.2×250mm Luna 5μm C18 BDSカラムを21mL/分で溶出するGilson HPLCを使用する逆相（C18）液体クロマトグラフィーの反復ラウンドによって精製した。32.5%B〜63%Bの直線状グラジエントを用いる溶出を使用してマクロライドを濃縮し、次いで30%Bを用いるイソクラティク溶出によって個々のエリスロマイシンを分離した。移動相Aは20mM酢酸アンモニウムであり、移動相Bはアセトニトリルであった。
高解像度質量スペクトルは、Bruker BioApex II FTICR（Bruker, Bremen, Germany）上で得た。
5-O-アンゴロサミニルチラクトンのNMR分析のために、5%の前培養物を接種した各400mLのSSDM培地を含む4個の2Lフラスコを用いて、以前に記載されたように生物転換（bioconversion）実験を実行した。チラクトンの供給は50mg/Lで実行した。培養物を遠心分離し、上清のpHを約9に調整し、その後3倍等量の酢酸エチルを用いる抽出を行った。細胞ペレットを、等量のアセトン-メタノールの混合物（50:50、体積/体積）で2回抽出した。抽出液を合わせて、真空中で濃縮した。得られた水性画分を酢酸エチルで3回抽出し、抽出物を合わせて、乾燥するまでエバポレートした。この半精製抽出物をメタノール中に溶解し、21mm×250mm Prodigy ODS3カラム（Phenomenex, Macclesfield, UK）を使用するGilson 315システム上での調製用HPLCによって精製した。移動相は、30% CH3CN、70% H2Oからなり、20分間にわたって70% CH3CNまで直線的に増加する2成分系として、21mL/分の流速でポンプで送られた。
配列情報
Figure 2011147446
実施例1：遺伝子カセットpSG144tylAItylAIItylMIIItylBtylIatylMIeryCIIIを使用する、3-O-ミカロシルエリスロマイシンBの5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンへの生物転換
pSG143の単離
プラスミドpSG142（Gaisserら、2000）をXbaIで消化し、フィルイン（fill-in）反応を標準的なプロトコールを使用して実行した。DNAを再ライゲーションし、大腸菌DH10Bを形質転換するために使用した。構築物pSG143を単離し、XbaI部位の除去を配列分析によって確認した。
pUC18eryBVcasの単離
遺伝子eryBVは、プライマーcasOleG21（国際公開公報第01/79520号）および
Figure 2011147446
を、ならびにpSG142（Gaisserら、2000）を鋳型として使用してPCRにより増幅した。PCR断片を標準的な手順を使用してクローニングし、プラスミドpUC18eryBVを、eryBVの開始コドンと重複するNdeI部位、ならびに終止コドンの後のXbaI部位およびBglII部位（下線を付した）を用いて単離した。この構築物を配列分析によって確認した。
ベクターpSGLit1の単離
このベクターの単離はPCT/GB03/003230に記載されている。
pSGLitleryCIIIの単離
プラスミドpSGCIII（WO01/79520）をNdeI/BglIIで消化し、挿入断片を単離し、pSGLit1のNdeI/BglII処理ベクター断片とともにライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌ET12567を形質転換し、プラスミドpSGLit1eryCIIIを標準的な手順を使用して単離した。この構築物を、制限消化および配列分析を使用して確認した。このクローニングストラテジーは、EryCIIIのC末端のhisタグの導入を可能にする。
pSGLit1tylMIIの単離
プラスミドpSGTYLM2（WO01/7952）をNdeI/BglIIで消化し、挿入断片を単離し、pSGLit1のNdeI/BglII処理ベクター断片とともにライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌ET12567を形質転換し、プラスミドpSGLit1tylMIIを標準的な手順を使用して単離した。この構築物を、制限消化および配列分析を使用して確認した。このクローニングストラテジーは、TylMIIのC末端のhisタグ導入を可能にする。
pSG144の単離
プラスミドpSGLit1を単離し、NdeI/BglIIで消化し、約1.3kbインサートを単離した。プラスミドpSG143をNdeI/BglIIで消化し、ベクターバンドを単離し、pSGLit1からの約1.3kbバンドとライゲーションし、次に大腸菌DH10Bの形質転換を行った。プラスミドpSG144（図2）を単離し、構築物をDNA配列分析によって確認した。このベクターは、pSGset1の代わりにベクターpSG144を使用するPCT/GB03/003230と類似して、pUC誘導ベクター（WO01/79520）における事前のアセンブリーなしで、発現ベクター中での直接的な遺伝子カセットのアセンブリーを可能にする（図2）。プラスミドpSG144は、チオストレプトン耐性遺伝子とeryRHSとの間のXbaI部位が欠失しており、かつeryBVの末端のhisタグがpSG142から除去されており、pSG144においてeryBV末端のXbaI部位により置換されているという点で、pSG142とは異なる。これは、遺伝子の直接的クローニングを容易にし、eryBVを置き換え、次いでカセットを構築するためである。
pSG144eryCIIIの単離
eryCIIIを、標準的なプロトコールを使用し、プライマーcasOleG21（WO01/79520）およびcaseryCIII2（WO01/79520）を、ならびに鋳型としてpSGCIII（Gaisserら、2000）を用いるPCR反応によって増幅した。約1.3kbのPCR産物を単離し、標準的な技術を使用してpUC18にクローニングした。プラスミドpUCCIIIcassを単離し、配列を確認した。プラスミドpUCCIIIcassのインサート断片をNdeI/XbaI消化後に単離し、NdeI/XbaI消化したpSG144のベクター断片とライゲーションした。大腸菌DH10Bプラスミドの形質転換後、標準的な技術を使用してpSG144eryCIIIを単離した。
pUC19tylAIの単離
プライマー
Figure 2011147446
を、鋳型としてのストレプトマイセス・フラジエのゲノムDNAとともに使用してtylAIを増幅した。増幅した生成物を標準的なプロトコールを使用してクローニングし、プラスミドpUCl9tylAIを単離した。DNA配列分析によってインサートを確認した。公開されていた配列との違いを図3に示す。
pSGLit2の単離
プラスミドLitmus28をSpeI/XbaIで消化し、ベクター断片を単離した。プラスミドpSGLit1（dam-）をXbaIで消化し、インサートバンドを単離し、Litmus28のSpeI/XbaI消化ベクター断片とライゲーションし、その後標準的な技術を使用する大腸菌DH10Bの形質転換を行った。プラスミドpSGLit2を単離し、構築物を、制限消化および配列分析によって確認した。このプラスミドを使用して、Damメチル化およびShine Dalgarno領域に感受性である5'領域を付加することが可能であり、このようにして、遺伝子カセットのアセンブリーのために、開始コドンと重複するNdeI部位および終止コドンの3'のXbaI部位を用いてもともとクローニングした遺伝子を転換した。この転換は、大腸菌ET12567へのこのライゲーションの形質転換、次にdam-DNAおよびXbaI消化物の単離を含む。このストラテジーについての例は以下に概説する。
pSGLit2tylAIの単離
プラスミドpSGLit2およびpUC19tyl4IをNdeI/XbaIで消化し、pUC19tylAIのインサートバンドおよびpSGLit2のベクターバンドを単離し、ライゲーションし、そして大腸菌ET12567を形質転換するために使用した。プラスミドpSGLit2tylAI（dam-）を単離した。
pUC19tylAIIの単離
プライマー
Figure 2011147446
を、ならびに鋳型としてのストレプトマイセス・フラジエを、標準的なプロトコールを適用するPCR反応のために使用して、tylAIIを増幅した。約1kbのサイズのDNA断片を単離し、標準的な技術を使用して、SmaIで切断したpUC19にクローニングした。この構築物のDNA配列決定は、5'末端の12ヌクレオチドが、PCR反応中に存在するエキソヌクレアーゼ反応によっておそらく除去されたことを示した。公開されていた配列と比較した、クローニングした断片のアミノ酸配列の比較を図4に示す。
pSGLit2tylAIIの単離
欠落した5'ヌクレオチドを付加するために、pSGLit2をPacI/XbaIで消化し、ベクター断片を単離し、そしてpUC19tylAIIのPacI/XbaI消化インサート断片とライゲーションした。ライゲーションしたDNAを使用して大腸菌ET12567を形質転換し、プラスミドpSGLit2tylAII（dam-）を単離した。
プラスミドpUCl9eryCVIの単離
eryCVIを、プライマー
Figure 2011147446
を、ならびに鋳型としてのプラスミドpNCO62（Gaisserら、1997）を使用するPCRによって増幅した。このPCR産物を、標準的な技術を使用して、SmaI消化したpUC19にクローニングし、プラスミドpUCl9eryCVIを単離し、配列分析によって確認した。
プラスミドpSGLit2eryCVIの単離
プラスミドpUCl9eryCVIをNdeI/XbaIで消化し、pSGLit2のNdeI/XbaI消化したベクター断片でライゲーションし、次に大腸菌ET12567の形質転換を行った。プラスミドpSGLit2eryCVI（dam-）を単離した。
プラスミドpSG144tylAIの単離
プラスミドpSG144およびpUC19tylAIをNdeI/XbaIで消化し、pUC19tylAIのインサートバンドおよびpSG144のベクターバンドを単離し、ライゲーションし、そして大腸菌DH10Bを形質転換するために使用した。プラスミドpSG144tylAIを標準的なプロトコールを使用して単離した。
プラスミドpSG144tylAItylAIIの単離
プラスミドpSGLit2tylAII（dam-）をXbaIで消化し、XbaI消化したプラスミドpSG144tylAIとライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、プラスミドpSG144tylAItylAIIを単離し、標準的なプロトコールを使用して確認した。
プラスミドpSGLit2tylMIIIの単離
プラスミドpUC18tylM3（WO01/79520に記載される単離物）をNdeI/XbaIで消化し、インサートバンドおよびNdeI/XbaI消化したpSGLit2のベクターバンドを単離し、ライゲーションし、そして大腸菌ET12567を形質転換するために使用した。プラスミドpSGLit2tylMIII（dam-）を標準的なプロトコールを使用して単離した。この構築物を、制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIIの単離
プラスミドpSGLit2tylMIII（dam-）をXbaIで消化し、インサートバンドを、XbaI消化したプラスミドpSG144tylAItyIAIIとライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIIno36を標準的なプロトコールを使用して単離した。この構築物を、制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSGLit2tylBの単離
プラスミドpUC18tylB（WO01/79520に記載される単離物）をPacI/XbaIで消化し、インサートバンドおよびPacI/XbaI消化したpSGLit2のベクターバンドを単離し、ライゲーションし、そして大腸菌ET12567を形質転換するために使用した。プラスミドpSGLit2tylB no1（dam-）を標準的なプロトコールを使用して単離した。この構築物を、制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIItylB
プラスミドpSGLit2tylB（dam-）をXbaIで消化し、インサートバンドをXbaI消化したプラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIIとライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIItylB no5を標準的なプロトコールを使用して単離し、制限消化および配列分析によって確認した。
pUCl8tylIaの単離
プライマー
Figure 2011147446
を使用して、ORF1（シトクロムP450）からORF2の末端（TylB）までを含むtyl領域（アクセッション番号u08223.em_pro2）を有するプラスミドを鋳型として使用してtylIaを増幅した。プラスミドpUCtylIa no1を標準的な手順を使用して単離し、この構築物を配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSGLit2tylIaの単離
プラスミドpUCtylIa no1をNdeI/XbaIで消化し、インサートバンドおよびNdeI/XbaI消化したpSGLit2のベクターバンドを単離し、ライゲーションし、そして大腸菌ET12567を形質転換するために使用した。プラスミドpSGLit2tylIa no54（dam-）を標準的なプロトコールを使用して単離した。この構築物を配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIItylBtylIa
プラスミドpSGLit2tylIa（dam-）をXbaIで消化し、インサートバンドをXbaI消化プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIItylBとライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIItylBtylIa no3を標準的なプロトコールを使用して単離し、制限消化および配列分析によって確認した。
プラスミドpSGLit1tylMIeryCIIIの単離
標準的な手順を使用して、プラスミドpUCtylMI（WO01/79520に記載される単離物）をPacI消化し、インサートバンドをPacI消化したpSGLit1eryCIIIのベクター断片とライゲーションした。プラスミドpSGLit1tylMIeryCIII no20を単離し、その方向を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIItylBtyl1atylMIeryCIIIの単離
プラスミドpSGLit1tylMIeryCIII no20をXbaI/BglIIで消化し、インサートバンドを単離し、プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIItylBtylIa no3のXbaI/BglII消化ベクターフラグメントとライゲーションした。プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIItylBtyl1atylMIeryCIIIを標準的な手順を使用して単離し、この構築物を、制限消化および配列決定を使用して確認した。標準的な手順を用いて、プラスミド調製物を使用して、S.エリスラエア変異株を形質転換した。
pSGKC1の単離
基質3-O-ミカロシルエリスロノリドBの、3,5-ジ-O-ミカロシルエリスロノリドBへの転換を妨害するために、さらなる染色体変異をS.エリスラエアSGQ2（WO01/79520に記載される単離物）に導入して、菌株バックグラウンド中でのL-ミカロースの生合成を妨害した。鋳型としてコスミド2またはプラスミドpGG1（WO01/79520）を用い、かつプライマー
Figure 2011147446
を用いて、標準的なプロトコールを使用するPCR増幅を使用することによって、eryBVI遺伝子の約0.7kbのDNAフラグメントをクローニングすることによりプラスミドpSGKC1を単離した。eryクラスターの右手部位を含むコスミド2を、既存のコスミドライブラリー（Gaisserら、1997）から、標準的な技術を使用して、eryBVをプローブとして用いるスクリーニングによって単離した。標準的な方法を使用して、増幅したDNAフラグメントを単離し、EcoRV消化したpKC1132（Biermanら、1992）にクローニングした。ライゲーションしたDNAを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、プラスミドpSGKC1を標準的な分子生物学的技術を使用して単離した。この構築物をDNA配列分析によって確認した。
S.エリスラエアQ42/1（Biot-2166）の単離
プラスミドpSGKC1を使用し、標準的な技術を使用してS.エリスラエアSGQ2を形質転換し、次にアプラマイシンを用いる選択を行った。チオストレプトン/アプラマイシン耐性形質転換体S.エリスラエアQ42/1を単離した。
S.エリスラエアQ42/1pSG144tylAItylAIItylMIIItylBtyl1atylMIeryCIIIを使用する生物転換
3-O-ミカロシルエリスロノリドBを使用する生物転換アッセイを、一般的方法に記載されるように実行する。ミカミノシルエリスロマイシンAの改善レベルを、S.エリスラエアQ42/1pSG144tylAItylAIItylMIIItylBtyl1atylMIeryCIIIを使用する生物転換アッセイにおいて、以前に観察された生物転換レベル（WO01/79520）と比較して検出する。
実施例2：遺伝子カセットpSG144tylAItylAIItylMIIItylBtylIatylMItylMIIを使用するミカミノシルチラクトンの単離
プラスミドpSGLit1tylMItylMIIの単離
標準的な手順を使用して、pUCtylMI（国際公開公報第01/79520号において記載される単離物）をPacI消化し、インサートを、PacI消化したpSGLit1tylMIIのベクター断片とライゲーションした。プラスミドpSGLit1tylMItylMII no16を単離し、この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。
プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIItylBtylIatylMItylMII
プラスミドpSGLit1tylMItylMII no16をXbaI/BglIIで消化し、インサートバンドを単離し、プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIItylBtylIa no3のXbaI/BglII消化ベクター断片とライゲーションした。プラスミドpSG144tylAItylAIItylMIIItylBtyl1atylMItylMIIを標準的な手順を使用して単離し、この構築物を、制限消化および配列分析を使用して確認した。標準的なプロトコールを使用して、このプラスミドを単離し、S.エリスラエア変異体株の形質転換のために使用した。
遺伝子カセットpSG144tylAItylAIItylMIIItylBtyl1atylMItylMIIを使用する生物転換
供給されたチラクトンからミカミノシルチラクトンへの転換を、S.エリスラエアQ42/1pSG144tylAItylAIItylMIIItylBtyl1atylMItylMIIを使用する生物転換アッセイにおいて評価した。生物転換アッセイは標準的なプロトコールを使用して実行した。培養物の分析は、プロトン化チラクトンの存在と一致する568.8 [M+H]+である主要イオンを示した。このイオンの断片化は、プロトン化ミカミノースから予測されるように、m/z 174の娘イオンを与えた。培養抽出物の分析の間にチラクトンは検出されず、このことは、供給されたチラクトンの生物転換が完了したことを示した。
最近、TylIaの相同体がアノイリニバチルス・サーモアエロフィルス（Aneurinibacillus thermoaerophilus）L420-91T*（Pfoestlら、2003）におけるdTDP-3-アセトアミド-3,6-ジデオキシ-α-D-ガラクトースの生合成経路において同定され、その機能は、dTDP-6-デオキシ-D-キシロヘクス-4-ウロースからdTDP-6-デオキシ-D-キシロヘクス-3-ウロースを合成することが可能である新規な型のイソメラーゼと仮定された。
実施例3：遺伝子カセットpSG1448/27/95/21/44/193/6eryCIII（pSG144angAIangAIIorf14angMIIIangBangMIeryCIII)を使用する、3-O-ミカロシルエリスロノリドBから5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンへの生物転換
プラスミドLit1/4を単離することによるangMIIIのクローニング
遺伝子angMIIIを、プライマー
Figure 2011147446
を使用するPCRによって増幅した。アンゴラマイシン生合成経路の断片を含むコスミド5B2を鋳型として使用した。1.4kb PCR断片（PCR no1）を標準的な手順およぼEcoRV消化したプラスミドLitmus28を使用してクローニングした。プラスミドLit1/4をangMIIIの開始コドンと重複するNdeI部位および終止コドンの後のXbaI部位を用いて単離した。この構築物を配列分析によって確認した。
プラスミドpSGLit21/4の単離
プラスミドpSGLit1/4をNdeI/XbaIで消化し、約1.4kb断片を単離し、pSGLit2のNdeI/XbaI消化DNAにライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌ET12567を形質転換し、プラスミドpSGLit21/4 no7（dam-）を単離した。この構築物をXbaIで消化し、遺伝子カセットの構築のために使用した。
プラスミドLit2/8を単離することによるangMIIのクローニング
遺伝子angMIIを、プライマー
Figure 2011147446
を使用するPCRによって増幅し、アンゴラマイシン生合成経路の断片を含むコスミド5B2を鋳型として使用した。1.3kb PCRフラグメント（PCR no2）を、標準的な手順およびEcoRV消化プラスミドLitmus28を使用してクローニングした。プラスミドLit2/8を、angMIIの開始コドンと重複するNdeI部位および終止コドンの後のXbaI部位を用いて単離した。この構築物を配列分析によって確認した。
プラスミドpLitangMII（BglII）を単離することによるangMIIのクローニング
遺伝子angMIIを、プライマー
Figure 2011147446
を使用するPCRによって増幅し、アンゴラマイシン生合成経路の断片を含むコスミド5B2を鋳型として使用した。1.3kb PCRフラグメントを、標準的な手順およびEcoRV消化プラスミドLitmus28を使用してクローニングした。プラスミドLitangMII（BglII）no8を、angMIIの開始コドンと重複するNdeI部位および終止コドンの代わりのBglII部位を用いて単離し、このようにしてhisタグの付加を可能にした。この構築物を配列分析によって確認した。
プラスミドpSGLit1angMIIの単離
プラスミドLitangMII（BglII）をNdeI/BglIIで消化し、NdeI/BglII消化したpSGLit1のベクターフラグメントとライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌ET12567を形質転換し、プラスミドpSGLit1angMII（dam-）を標準的な手順を使用して単離した。
プラスミドLit3/6を単離することによるangMIのクローニング
遺伝子angMIを、プライマー
Figure 2011147446
を使用してPCRによって増幅し、アンゴラマイシン生合成経路の断片を含むコスミド5B2を鋳型として使用した。0.75kb PCRフラグメント（PCR no3）を、標準的な手順およびEcoRV消化プラスミドLitmus28を使用してクローニングした。プラスミドLit3/6を、angMIの開始コドンと重複するNdeI部位および終止コドンの後のXbaI部位を用いて単離した。この構築物を配列分析によって確認した。
プラスミドpSGlit23/6 no8の単離
プラスミドLit3/6をNdeI/XbaIで消化し、約0.8kb断片を単離し、NdeI/XbaI消化したpSGLit2のDNAにライゲーションした。このライゲーションを大腸菌ET12567を形質転換するために使用し、プラスミドpSGLit23/6 no8（dam-）を単離した。この構築物をXbaIで消化し、約1kb断片を遺伝子カセットのアセンブリーのために使用した。
プラスミドLit4/19を単離することによるangBのクローニング
遺伝子angBを、プライマー
Figure 2011147446
を使用してPCRによって増幅し、アンゴラマイシン生合成経路の断片を含むコスミド4H2を鋳型として使用した。1.2kb PCRフラグメント（PCR no4）を、標準的な手順およびEcoRV消化プラスミドLitmus28を使用してクローニングした。プラスミドLit4/19を、angBの開始コドンと重複するNdeI部位および終止コドンの後のXbaI部位を用いて単離した。この構築物を配列分析によって確認した。
プラスミドpSGlit24/19の単離
プラスミドLit4/19をNdeI/XbaIで消化し、約1.2kb断片を単離し、NdeI/XbaI消化したpSGLit2のDNAにライゲーションした。このライゲーションを大腸菌ET12567を形質転換するために使用し、プラスミドpSGLit24/19 no24（dam-）を単離した。この構築物をXbaIで消化し、約1.2kb断片を遺伝子カセットのアセンブリーのために使用した。
プラスミドLit5/2を単離することによるorf14のクローニング
遺伝子orf14を、プライマー
Figure 2011147446
を使用してPCRによって増幅し、アンゴラマイシン生合成経路の断片を含むコスミド4H2を鋳型として使用した。1.0kb PCRフラグメント（PCR no5）を、標準的な手順およびEcoRV消化プラスミドLitmus28を使用してクローニングした。プラスミドLit5/2を、ORF14の開始コドンと重複するNdeI部位および終止コドンの後のXbaI部位を用いて単離した。この構築物を配列分析によって確認した。
プラスミドpSGlit25/2 no24の単離
プラスミドLit5/2をNdeI/XbaIで消化し、約1kb断片を単離し、NdeI/XbaI消化したpSGLit2のDNAにライゲーションした。このライゲーションを大腸菌ET12567を形質転換するために使用し、プラスミドpSGLit25/2 no24（dam-）を単離した。この構築物をXbaIで消化し、約1kb断片を遺伝子カセットのアセンブリーのために使用した。
プラスミドpSGlit27/9 no15の単離
プラスミドLit7/9をNdeI/XbaIで消化し、約1kb断片を単離し、NdeI/XbaI消化したpSGLit2のDNAにライゲーションした。このライゲーションを大腸菌ET12567を形質転換するために使用し、プラスミドpSGLit27/9 no15（dam-）を単離した。この構築物をXbaIで消化し、約1kb断片を遺伝子カセットのアセンブリーのために使用した。
プラスミドLit8/2を単離することによるangAI（orf2）のクローニング
遺伝子angAIを、プライマー
Figure 2011147446
を使用してPCRによって増幅し、アンゴラマイシン生合成経路の断片を含むコスミド4H2を鋳型として使用した。約1.0kb PCRフラグメント（PCR no8）を、標準的な手順およびEcoRV消化プラスミドLitmus28を使用してクローニングした。プラスミドLit8/2を、angAIの開始コドンと重複するNdeI部位および終止コドンの後のXbaI部位を用いて単離した。この構築物を配列分析によって確認した。
プラスミドLit7/9を単離することによるangAII（orf3）のクローニング
遺伝子angAIIを、プライマー
Figure 2011147446
を使用してPCRによって増幅し、アンゴラマイシン生合成経路の断片を含むコスミド4H2を鋳型として使用した。約1.0kb PCRフラグメントを、標準的な手順およびEcoRV消化プラスミドLitmus28を使用してクローニングした。プラスミドLit7/9を、angAIIの開始コドンと重複するNdeI部位および終止コドンの後のXbaI部位を用いて単離した。この構築物を配列分析によって確認した。
プラスミドpSGlit28/2 no18（pSGLit2angAI）の単離
プラスミドLit8/2をNdeI/XbaIで消化し、1kb断片を単離し、NdeI/XbaI消化したpSGLit2のDNAにライゲーションした。このライゲーションを大腸菌ET12567を形質転換するために使用し、プラスミドpSGlit28/2 no18（dam-）を単離した。
プラスミドpSG1448/2（pSG144angAI）の単離
プラスミドLit8/2をNdeI/XbaIで消化し、約1kb断片を単離し、NdeI/XbaI消化したpSG144のDNAにライゲーションした。このライゲーションを大腸菌DH10Bを形質転換するために使用し、プラスミドpSG1448/2（dam-）（pSG144angAI）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。
プラスミドpSG1448/27/9（pSG144angAIangAII）の単離
プラスミドpSGLit27/9（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、1kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/2（pSG144angAI）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを大腸菌DH10Bを形質転換するために使用し、標準的なプロトコールを使用して、プラスミドpSG1448/27/9（pSG144angAIangAII）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。
プラスミドpSG1448/27/91/4（pSG144angAIangAIIangMIII）の単離
プラスミドpSGLit21/4（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、1.4kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/9（pSG144angAIangAII）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを大腸菌DH10Bを形質転換するために使用し、標準的なプロトコールを使用して、プラスミドpSG1448/27/91/4（pSG144angAIangAIIangMIII）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。
プラスミドpSG1448/27/91/44/19（pSG144angAIangAIIangMIIIangB）の単離
プラスミドpSGLit24/19（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、約1.2kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/91/4（pSG144angAIangAIIangMIII）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを大腸菌DH10Bを形質転換するために使用し、標準的なプロトコールを使用して、プラスミドpSG1448/27/91/44/19（pSG144angAIangAIIangMIIIangB）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。
プラスミドpSG1448/27/91/44/193/6（pSG144angAIangAIIangMIIIangBangMI）の単離
プラスミドpSGLit23/6（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、約0.8kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/91/44/19（pSG144angAIangAIIangMIIIangB）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを大腸菌DH10Bを形質転換するために使用し、標準的なプロトコールを使用して、プラスミドpSG1448/27/91/44/193/6（pSG144angAIangAIIangMIIIangBangMI）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。
プラスミドpSG1448/27/91/44/193/6eryCIII（pSG144angAIangAIIangMIIIangBangMIeryCIII）の単離
プラスミドpSGLit1eryCIII（大腸菌ET12567から単離した）をXbaI/BglIIで消化し、約1.2kb断片を単離し、XbaI消化しおよびBglIIで部分消化したpSG1448/27/91/44/193/6（pSG144angAIangAIIangMIIIangBangMI）のベクター断片にライゲーションした。このBglII部分消化は、angB中のBglII部位の存在のために必要であった。このライゲーションを大腸菌DH10Bを形質転換するために使用し、標準的なプロトコールを使用して、プラスミドpSG1448/27/91/44/193/6eryCIII no9（pSG144angAIangAIIangMIIIangBangMIeryCIII）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。eryCIIIは末端にhisタグを有する。
S.エリスラエアQ42/1pSG1448/27/91/44/193/6eryCIII no9（pSG144angAIangAIIangMIIIangBangMIeryCIII）を使用する、3-O-ミカロシルエリスロノリドBから5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAへの転換
S.エリスラエア株Q42/1pSG1448/27/91/44/193/6eryCIIIを増殖させ、供給した3-O-ミカロシルエリスロノリドBを用いる生物転換を、一般的方法に記載したように実行した。培養物を分析し、m/z 750を有する少量の化合物を検出し、これは5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAの存在と一致した。
プラスミドpSG1448/27/95/2（pSG144angAIangAIIorf14）の単離
プラスミドpSGLit25/2（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、約1kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/9（pSG144angAIangAII）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを大腸菌DH10Bを形質転換するために使用し、標準的なプロトコールを使用して、プラスミドpSG1448/27/95/2（pSG144angAIangAIIorf14）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。
プラスミドpSG1448/27/95/21/4（pSG144angAIangAIIorf14angMIII）の単離
プラスミドpSGLit21/4（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、約1.4kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/95/2（pSG144angAIangAIIorf14）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを大腸菌DH10Bを形質転換するために使用し、標準的なプロトコールを使用して、プラスミドpSG1448/27/95/21/4（pSG144angAIangAIIorf14angMIII）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。
プラスミドpSG1448/27/95/21/44/19（pSG144angAIangAIIorf14angMIIIangB）の単離
プラスミドpSGLit24/19（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、1.2kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/95/21/4（pSG144angAIangAIIorf14angMIII）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを大腸菌DH10Bを形質転換するために使用し、標準的なプロトコールを使用して、プラスミドpSG1448/27/95/21/44/19（pSG144angAIangAIIorf14angMIIIangB）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。
プラスミドpSG1448/27/95/21/44/193/6eryCIII（pSG144angAIangAIIorf14angMIIIangBangMIeryCIII）の単離
プラスミドpSG1448/27/91/44/193/6eryCIII no9をBglIIで消化し、約2kb断片を単離し、BglII消化したpSG1448/27/95/21/44/19（pSG144angAIangAIIorf14angMIIIangB）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを大腸菌DH10Bを形質転換するために使用し、標準的なプロトコールを使用して、プラスミドpSG1448/27/95/21/44/193/6eryCIII（pSG144angAIangAIIorf14angMIIIangBangMIeryCIII）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。eryCIIIは末端にhisタグを有する。この構築物を使用し、標準的な手順を用いてS.エリスラエアSGQ2を形質転換した。
3-O-ミカロシルエリスロノリドBから5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAへの生物転換
S.エリスラエア株SGQ2pSG1448/27/95/21/44/193/6eryCIIIを増殖させ、供給した3-O-ミカロシルエリスロノリドBを用いる生物転換を、一般的方法に記載したように実行した。培養物を分析し、m/z 750を有する少量の化合物の改善された量を検出し、これは5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAの存在と一致した。同様の結果を、遺伝子カセットpSG1448/27/95/21/44/193/6eryCIIIを含むS.エリスラエア株Q42/1を用いて得た。m/z 750を有する16mgの化合物を精製し、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAの構造をNMR分析によって確認した（表1および図1を参照されたい）。
Figure 2011147446
実施例4：ミカミノシルチラクトンの単離
プラスミドpSG1448/27/95/21/44/193/6tylMII（pSG144angAIangAIIorf14angMIIIangB3/6tylMII)の単離
プラスミドpSG1448/27/91/44/193/6tylMII no9をBglIIで消化し、約2kb断片を単離し、BglII消化したpSG1448/27/95/21/44/19（pSG144angAIangAIIorf14angMIIIangB）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを大腸菌DH10Bを形質転換するために使用し、標準的なプロトコールを使用して、プラスミドpSG1448/27/95/21/44/193/6tylMII（pSG144angAIangAIIorf14angMIIIangBangMItylMII)を単離した。この構築物を制限消化および配列分析によって確認した。tylMIIは末端にhisタグを有する。
チラクトンからミカミノシルチラクトンへの生物転換
S.エリスラエア株Q42/1pSG1448/27/95/21/44/193/6tylMIIを増殖させ、供給したチラクトンを用いる生物転換を、一般的方法に記載したように実行した。培養物を分析し、m/z 568を有する化合物を検出し、これはミカミノシルチラクトンの存在と一致した。
実施例5：3-O-ミカロシルエリスロノリドBの生物転換による、遺伝子カセットpSG1448/27/91/4spnO5/2p4/193/6tylMIIを使用する5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルエリスロマイシンAの単離
プラスミドconv no1の単離
活性制御遺伝子カセット中でのプロモーター配列の複数使用のために、240bp断片を、プライマー
Figure 2011147446
ならびに鋳型としてプラスミドpSG142（Gaisserら、2000）使用するPCRによって増幅した。0.2kb PCR断片（PCR no5）を標準的なプロトコールおよびEcoRV消化したプラスミドLitmus28を使用してクローニングした。プラスミドconv no1を単離した。この構築物を配列分析によって確認した。
プラスミドpSGLit3relig1の単離
プラスミドconv no1をNdeI/BglIIで消化し、約0.2kb断片を単離し、BamHI/NdeI消化したpSGLit2のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的な手順を使用してプラスミドpSGLit3relig1を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSGlit34/19の単離
プラスミドLit4/19をNdeI/XbaIで消化し、1.2kb断片を単離し、NdeI/XbaI消化したpSGLit3のDNAにライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌ET12567を形質転換し、標準的な手順を使用してプラスミドpSGlit34/19 no23を単離した。この構築物をXbaIで消化し、1.4kb断片を遺伝子カセットのアセンブリーのために使用した。
プラスミドLit6/4を単離することによるorf4のクローニング
遺伝子orf4を、プライマー
Figure 2011147446
を使用してPCRによって増幅し、アンゴラマイシン生合成経路の断片を含むコスミド4H2を鋳型として使用した。2.5kb PCRフラグメント（PCR no6）を、標準的な手順およびEcoRV消化プラスミドLitmus28を使用してクローニングした。プラスミドLit6/4を、orf4の開始コドンと重複するNdeI部位および終止コドンの後のXbaI部位を用いて単離した。この構築物を配列分析によって確認した。
プラスミドpSGlit26/4 no9の単離
プラスミドLit6/4をNdeI/XbaIで消化し、DNAを単離し、NdeI/XbaI消化したpSGLit2のDNAにライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌ET12567を形質転換し、標準的な手順を使用してプラスミドpSGlit26/4 no9を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpUC19spnOを単離することによるspnOのクローニング
サッカロポリスポラ・スピノサの生合成遺伝子クラスターからのspnO遺伝子を、プライマー
Figure 2011147446
ならびに鋳型としてのS.スピノサのゲノムDNAを使用するPCRによって増幅した。約1.5kb PCR断片を、標準的な手順およびSmaI消化したプラスミドpUC19を使用してクローニングした。プラスミドpUC19spnO no2を、spnOの開始コドンと重複するNdeI部位および終止コドンの後のXbaI部位を用いて単離した。この構築物を配列分析によって確認した。
プラスミドpSGlit2spnO no4の単離
プラスミドpUC19spnOをNdeI/XbaIで消化し、1.5kb断片を単離し、NdeI/XbaI消化したpSGLit2のDNAにライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌ET12567を形質転換し、標準的な手順を使用してプラスミドpSGLit2spnO no4を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/91/4spnO（pSG144angAIangAIIangMIIIsynO）の単離
プラスミドpSGLit2spnO no4（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、1.5kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/91/4（pSG144angAIangAIIangMIII）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的な手順を使用してプラスミドpSG1448/27/91/4spnO（pSG144angAIangAIIangMIIIsynO）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/91/4spnO5/2（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOangorf14）の単離
プラスミドpSGLit25/2 no24（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、1kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/91/4spnO（pSG144angAIangAIIangMIIIsynO）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的な手順を使用してプラスミドpSG1448/27/91/4spnO5/2（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOangorf14）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/91/4spnO5/2p4/19（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOangorf14pangB）の単離
プラスミドpSGLit34/19 no23（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、約1.4kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/91/4spnO5/2（pSG144angAIangAIIangMIIIsynOangorf14）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的な手順を使用してプラスミドpSG1448/27/91/4spnO5/2p4/19（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOangorf14pangB）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。「p」はこの構築物中の複数のプロモーター部位の存在を強調するために、angBの前のプロモーター領域の存在を示す。
プラスミドpSG1448/27/91/4spnO5/2p4/193/6eryCIII（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOorf14pangBangMIeryCIII）の単離
プラスミドpSG1448/27/91/193/6eryCIII no9をBglIIで消化し、約2kb断片を単離し、BglII消化したpSG1448/27/91/4spnO5/2p4/19（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOorf14pangB）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的な手順を使用してプラスミドpSG1448/27/91/4spnO5/2p4/193/6eryCIII（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOorf14pangBangMIeryCIII）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。eryCIIIは末端にhisタグ融合物を有する。「p」はこの構築物中の複数のプロモーター部位の存在を強調するために、angBの前のプロモーター領域の存在を示す。このプラスミド構築物を使用して、標準的な手順を用いてS.エリスラエアの変異株を形質転換した。
3-O-ミカロシルエリスロノリドBから5-O-デデソサミニル-5-O-アンゴロサミニルエリスロマイシンへの生物転換
S.エリスラエア株Q42/1pSG1448/27/91/4spnO5/2p4/193/6eryCIIIを増殖させ、供給した3-O-ミカロシルエリスロノリドBを用いる生物転換を、一般的方法に記載したように実行した。培養物を分析し、アンゴロサミニルエリスロマイシンD、BおよびAの存在とそれぞれ一致する、m/z 704、m/z 718およびm/z 734を有するピークを観察した。
実施例6：5-O-アンゴロサミニルチラクトンの産生
プラスミドpSG1448/27/91/4spnO5/2p4/193/6tylMII（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOorf14pangBangMItylMII）の単離
プラスミドpSG1448/27/91/44/193/6eryMII no9をBglIIで消化し、約2kb断片を単離し、BglII消化したpSG1448/27/91/4spnO5/2p4/19（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOorf14pangB）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的な手順を使用してプラスミドpSG1448/27/91/4spnO5/2p4/193/6tylMII（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOorf14pangBangMItylMII）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。tylMIIは末端にhisタグ融合物を有する。このプラスミドを使用し、標準的なプロトコールを適用してS.エリスラエアの変異株を形質転換した。「p」はこの構築物中の複数のプロモーター部位の存在を強調するために、angBの前のプロモーター領域の存在を示す。
S.エリスラエア18AI（BIOT-2634）の単離
PKSおよびPKS後遺伝子の大部分を含む欠失を、eryCIの部分を含むS.エリスラエアのeryクラスターの左方向側の領域に導入するために、完全なermE遺伝子およびeryBI遺伝子の断片を、eryBVII遺伝子、完全なeryK遺伝子およびeryKに隣接したDNAの断片を含むeryクラスターの右方向側（RHS）の領域を用いて一緒にクローニングした。この構築物は、これらの2つのDNAの領域間に欠失を含む株の単離を生じる、LHS領域とRHS領域の両方におけるゲノムへの相同組換えを可能にするはずである。LHS断片（2201bp）を、S.エリスラエア染色体DNAを鋳型として、かつプライマー
Figure 2011147446
を使用してPCR増幅した。プライマーBIdelNdeはNdeI制限部位を含み（下線部）、プライマーBIdelSpeは、次のクローニング工程のために使用されるSpeI制限部位を含む。PCR産物をpUC19のSmaI制限部位にクローニングし、プラスミドpLSB177を標準的な手順を使用して単離した。この構築物を配列分析によって確認した。同様に、RHS（2158bp）を、S.エリスラエア染色体DNAを鋳型として、かつプライマー
Figure 2011147446
を使用するPCRによって増幅した。プライマーBVIIdelSpeはSpeI制限部位を含み、プライマーBVIIdelEcoはEcoRV制限部位を含む。PCR産物を、KpnIに隣接して配置されるSpeIおよびXbaIに隣接して配置されるEcoRVを有する方向でpUC19のSmaI制限部位にクローニングした。プラスミドpLSB178を単離し、配列分析によって確認した。標準的な方法を使用して、プラスミドpLSB177をNdeIおよびSpeIで消化し、〜2.2kb断片を単離し、かつ同様にプラスミドpLSB178をNdeIおよびSpeIで消化し、〜4.6kb断片を単離した。標準的な方法を使用して、両方の断片をライゲーションし、pUC19中でSpeI部位において合わせたLHSおよびRHSを一緒に含むプラスミドpLSB188を単離した。pLSB188からのNdeI/XbaI断片（〜4.4kbp）を単離し、SpeIおよびNdeI処理したpCJR24とともにライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的な方法を使用してプラスミドpLSB189を単離した。プラスミドpLSB189を使用してS.エリスラエアP2338を形質転換し、形質転換体をチオストレプトンを使用して選択した。S.エリスラエアDel18を単離し、6ml TSB培地に接種し、2日間増殖させた。5%接種物を使用してこの株を3回継代培養した。100μlの最終培養物を使用してR2T20寒天にプレートし、次に30℃でインキュベーションを行って胞子形成させた。標準的な手順を使用して、胞子を収集し、濾過し、希釈し、そしてR2T20寒天にプレートした。コロニーを、チオストレプトンの付加のあるなしで、R2T20プレート上でレプリカプレート作製した。チオストレプトン上でもはや増殖可能ではなかったコロニーを選択し、TSB培地中でさらに増殖させた。S.エリスラエア18AIを単離し、PCRおよびサザンブロット分析を使用して確認した。この株をLB-1/BIOT-2634と名付けた。さらなる分析のために、エリスロマイシンの産生を、一般的方法において記載したように評価し、エリスロマイシン産生の欠如を確認した。生物転換アッセイにおいては、この株は、供給されたエリスロノリドBをさらに処理せず、エリスロマイシンDは予想された通りC12位で水酸化されてエリスロマイシンCを与え、このことは、EryKがなお機能的であったことを示した。
チラクトンから5-O-アンゴロサミニルチラクトンへの生物転換
菌株S.エリスラエアSGQ2pSG1448/27/91/4spnO5/2p4/193/6tylMIIを増殖させ、供給されたチラクトンを用いる生物転換を、一般的方法において記載したように実行した。培養物を抽出および分析した。アンゴロサミニルチラクトンの存在と一致する化合物を検出した。20mgのこの化合物を精製し、この構造をNMR分析によって確認した。アンゴロサミニルチラクトンと一致する化合物はまた、遺伝子カセットpSG1448/27/91/4spnO5/2p4/193/6tylMIIをS.エリスラエア株Q42/1またはS.エリスラエア18A1において発現させた場合に得られた。
Figure 2011147446
プラスミドpSG1448/27/91/4spnOp5/2（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOpangorf14）の単離
プラスミドpSGLit35/2（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、挿入断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/91/4spnO（pSG144angAIangAIIangMIIIsynO）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的なプロトコールを使用してプラスミドpSG1448/27/91/4spnOp5/2（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOpangorf14）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/91/4spnOp5/24/19（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOpangorf14angB）の単離
プラスミドpSGLit24/19（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、挿入断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/91/4spnOp5/2（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOpangorf14）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的なプロトコールを使用してプラスミドpSG1448/27/91/4spnOp5/24/19（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOpangorf14angB）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/91/4spnOp5/24/193/6（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOpangorf14angBangMI）の単離
プラスミドpSGLit23/6（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、挿入断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/91/4spnOp5/24/19（pSG144angAIangAIIangMIIIsynOpangorf14angB）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的なプロトコールを使用してプラスミドpSG1448/27/91/4spnOp5/24/193/6（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOpangorf14angBangMI）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/91/4spnOp5/24/193/6angMII（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOpangorf14angBangMIangMII）の単離
プラスミドpSGLit1angMII（大腸菌ET12567から単離した）をXbaI/BglIIで消化し、挿入断片を単離し、XbaIで消化しかつBglIIで部分消化したpSG1448/27/91/4spnOp5/24/193/6（pSG144angAIangAIIangMIIIsynOpangorf14angBangMI）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的なプロトコールを使用してプラスミドpSG1448/27/91/4spnOp5/24/193/6angMII（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOpangorf14angBangMIangMII）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。このプラスミドを使用して、標準的な手順を用いてS.エリスラエアの変異株を形質転換した。
S.エリスラエアQ42/1pSG1448/27/91/4spnOp5/24/193/6angMII（pSG144angAIangAIIangMIIIspnOpangorf14angBangMIangMII）を使用する生物形質転換
チラクトンを供給する生物形質転換実験を、一般的方法において記載したように実行し、培養物を分析する。アンゴロサミニルチラクトンを検出する。
プラスミドpSG1448/27/96/4（pSG144angAIangAIIangorf4）の単離
標準的なプロトコールを使用して、プラスミドpSG1448/27/9（pSG144angAIangAII）をXbaIで消化し、アルカリホスファターゼで処理した。このベクター断片を、XbaI処理したプラスミドpSGLit26/4 no9とともにライゲーションのために使用し、次に標準的なプロトコールを使用して、大腸菌DH10Bの形質転換を行った。プラスミドpSG1448/27/96/4（pSG144angAIangAIIangorf4）を標準的な手順を使用して単離し、この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/96/4p5/2（pSG144angAIangAIIangorf4pangorf14）の単離
プラスミドpSGLit35/2（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、挿入断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/96/4（pSG144angAIangAIIangorf4）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的なプロトコールを使用してプラスミドpSG1448/27/96/4p5/2（pSG144angAIangAIIangorf4pangorf14）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/96/4p5/21/4（pSG144angAIangAIIangorf4pangorf14angMIII）の単離
プラスミドpSGLit21/4（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、1.4kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/96/4p5/2（pSG144angAIangAIIangorf4pangorf14）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的なプロトコールを使用してプラスミドpSG1448/27/96/4p5/21/4（pSG144angAIangAIIangorf4pangorf14angMIII）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/96/4p5/21/44/19（pSG144angAIangAIIangorf4pangorf14angMIIIangB）の単離
プラスミドpSGLit24/19（大腸菌ET12567から単離した）をXbaIで消化し、1.4kb断片を単離し、XbaI消化したpSG1448/27/96/4p5/21/4（pSG144angAIangAIIpangorf4pangorf14angMIII）のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的なプロトコールを使用してプラスミドpSG1448/27/96/4p5/21/44/19（pSG144angAIangAIIangorf4pangorf14angMIIIangB）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/96/4p5/21/44/193/6angMII（pSG144angAIangAIIangorf4pangorf14angMIIIangBangMIangMII）の単離
プラスミドpSG1448/27/91/4spnOp5/24/193/6angMIIをBglIIで消化し、約2.2kb断片を単離し、BglII処理したpSG1448/27/96/4p5/21/44/19のベクター断片にライゲーションした。このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的なプロトコールを使用してプラスミドpSG1448/27/96/4p5/21/44/193/6angMII（pSG144angAIangAIIangorf4pangorf14angMIIIangBangMIangMII）を単離した。この構築物を制限消化および配列分析を使用して確認した。このプラスミドを使用して、標準的な手順を用いてS.エリスラエアの変異株を形質転換した。
S.エリスラエアQ42/1 pSG1448/27/96/4p5/21/44/193/6angMII（pSG144angAIangAIIangorf4pangorf14angMIIIangBangMIangMII）を用いる、チラクトンの生物転換
チラクトンを供給する生物形質転換実験を、一般的方法において記載したように実行し、培養物を分析する。アンゴロサミニルチラクトンを検出する。
実施例7：遺伝子カセットpSG144へのeryKのクローニング
プラスミドpUC19eryKの単離
eryKを増幅するために、プライマー
Figure 2011147446
を使用し、PCR産物をpUC19eryCVIについて記載したようにクローニングした。プラスミドpUC19eryKを単離した。
プラスミドpLSB111（pCJR24eryK）の単離
プラスミドpUC19eryKをNdeI/XbaIで消化し、挿入バンドを、NdeI/XbaI消化したpCJR24とともにライゲーションした。プラスミドpLSB111（pCJR24eryK）を単離し、この構築物を制限消化を用いて確認した。
プラスミドpLSB115の単離
プラスミドpLSB111（pCJR24eryK）をNdeI/XbaIで消化し、挿入断片を、NdeI/XbaI消化したpSGLit2のベクター断片とともにライゲーションし、プラスミドpLSB115を標準的なプロトコールを使用して単離した。このプラスミドを、制限消化およびDNA配列決定を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/95/21/4eryKの単離
大腸菌ET12567からのプラスミドpLSB115をXbaIで消化し、挿入断片を、XbaI処理したpSG1448/27/95/21/4（pSG144angAIangAIIangorf14angMIII）のベクター断片とともにライゲーションした。標準的な手順を用いて、このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的なプロトコールを使用してプラスミドpSG1448/27/95/21/4eryK（pSG144angAIangAIIangorf14angMIIIeryK）を単離した。この構築物を制限消化を使用して確認した。
プラスミドpSG1448/27/95/21/4eryK4/19の単離
大腸菌ET12567からのプラスミドpSGLit24/19をXbaIで消化し、挿入断片を、XbaI処理したpSG1448/27/95/21/4eryKのベクター断片とともにライゲーションした。標準的な手順を用いて、このライゲーションを使用して大腸菌DH10Bを形質転換し、標準的なプロトコールを使用してプラスミドpSG1448/27/95/21/4eryK4/19（pSG144angAIangAIIangorf14angMIIIeryKangB）を単離した。この構築物を制限消化を用いて確認した。
プラスミドpSG1448/27/95/21/4eryK4/193/6eryCIIIの単離
プラスミドpSG1448/27/95/21/44/193/6eryCIIIをBglIIで消化し、約2.1kb断片を、BglII処理したpSG1448/27/95/21/4eryK4/19のベクター断片とともにライゲーションした。プラスミドpSG1448/27/95/21/4eryK4/193/6eryCIIIを標準的な手順を使用して単離し、この構築物を制限消化を用いて確認した。このプラスミドを使用して、標準的な手順を用いてS.エリスラエアの変異株を形質転換した。
3-O-ミカロシルエリスロノリドBから5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAへの生物転換
S.エリスラエア株Q42/1pSG1448/27/95/21/4eryK4/193/6eryCIIIを増殖させ、3-O-ミカロシルエリスロノリドBを供給する生物転換を、一般的方法において記載したように実行する。この培養物を分析し、m/z 750を有する化合物が検出され、このことは、5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAの存在と一致した。
実施例8：13-デセチル-13-メチル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよびB；13-デセチル-13-イソプロピル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよびB；13-デセチル-13-secブチル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよびBの産生
13-デセチル-13-メチル-3-O-ミカロシルエリスロノリドB、13-デセチル-13-イソプロピル-3-O-ミカロシルエリスロノリドBおよび13-デセチル-13-secブチル-3-O-ミカロシルエリスロノリドBの産生
DEBS1のローディングモジュールがアベルメクチン生合成クラスターのローディングモジュールによって置き換えられている、DEBS1遺伝子、DEBS2遺伝子およびDEBS3遺伝子を含むpCJR24ベースのプラスミドである、プラスミドpLS025（WO03/033699）を使用して、標準的な技術を使用してS.エリスラエアJC2ΔeryCIII（以前に記載された技術およびプラスミド（Roweら、1998；Gaisserら、2000）を使用して単離した）を形質転換した。形質転換体JC2ΔeryCIIIpLS025を単離し、培養物を標準的なプロトコールを使用して増殖させた。S.エリスラエアJC2ΔeryCIIIpLS025の培養物を、一般的方法の節に記載されている方法を使用して抽出し、粗抽出物中の3-O-ミカロシルエリスロノリドB、13-デセチル-13-メチル-3-O-ミカロシルエリスロノリドB、13-デセチル-13-イソプロピル-3-O-ミカロシルエリスロノリドBおよび13-デセチル-13-secブチル-3-O-ミカロシルエリスロノリドBをLCMS分析によって確認する。
13-デセチル-13-メチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよびB；13-デセチル-13-イソプロピル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよびB；13-デセチル-13-secブチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよびBの産生
S.エリスラエアJC2ΔeryCIIIpLS025の培養物を、一般的方法の節に記載した方法を使用して抽出し、粗抽出物を5mlのメタノールに溶解し、次にS.エリスラエア株SGQ2pSG1448/27/95/21/44/193/6eryCIIIの上清に、標準的な技術を使用して供給する。13-デセチル-13-メチル-3-O-ミカロシルエリスロノリドB、13-デセチル-13-イソプロピル-3-O-ミカロシルエリスロノリドBおよび13-デセチル-13-secブチル-3-O-ミカロシルエリスロノリドBから、13-デセチル-13-メチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよび13-デセチル-13-メチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンB；13-デセチル-13-イソプロピル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよび13-デセチル-13-イソプロピル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンB；13-デセチル-13-secブチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよび13-デセチル-13-secブチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンBへの生物転換を、LCMS分析によって確認する。
実施例9：13-デセチル-13-メチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよび13-デセチル-13-メチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンB
13-デセチル-13-メチル-3-O-ミカロシルエリスロノリドBの産生
DEBS1遺伝子、DEBS2遺伝子およびDEBS3遺伝子を含むpCJR24ベースのプラスミドである、プラスミドpIB023（特許出願第0125043.0号）を使用して、標準的な技術を使用してS.エリスラエアJC2ΔeryCIIIを形質転換した。形質転換体JC2ΔeryCIIIpIB023を単離し、培養物を標準的なプロトコールを使用して増殖させ、抽出し、そして粗抽出物を、一般的方法の節に記載した方法を使用してアッセイした。3-O-ミカロシルエリスロノリドB、および13-デセチル-13-メチル-3-O-ミカロシルエリスロノリドBをLCMS分析によって確認する。
13-デセチル-13-メチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンA、13-デセチル-13-メチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンBの産生
S.エリスラエアJC2ΔeryCIIIpIB023の培養物を、一般的方法の節に記載した方法を使用して抽出し、粗抽出物を5mlのメタノールに溶解し、次にS.エリスラエア株SGQ2pSG1448/27/95/21/44/193/6eryCIIIの上清に、標準的な技術を使用して供給する。13-デセチル-13-メチル-3-O-ミカロシルエリスロノリドBから、13-デセチル-13-メチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよび13-デセチル-13-メチル-5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンBへの生物転換を、LCMS分析によって確認する。
実施例10：5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシンの産生
アジスロマイシンアグリコンを、EP1024145A2（Pfizer Products Inc. Groton, Connecticut）に記載される方法を使用して調製した。S.エリスラエア株SGT2pSG142を、以前に記載された技術およびプラスミド構築物を使用して単離した（Gaisserら、2000）。供給実験を、以前に記載された方法（Gaisserら、2000）を使用して、S.エリスラエア変異体SGT2pSG142を用いて実行し、このようにして、アジスロマイシンアグリコンを3-O-ミカロシルアジスロマイシンに転換する。生物形質転換実験を、S.エリスラエアSGC2pSG1448/27/95/21/44/193/6eryCIIIを使用して実行し、3-O-ミカロシルアジスロノリドを含む粗抽出物を、標準的な微生物学的技術を使用して加える。3-O-ミカロシルアジスロノリドから5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルアジスロマイシンへの生物転換を、LCMS分析によって確認する。
実施例11：5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンCの産生
S.エリスラエア変異体SGP1（SGQ2ΔeryG）の単離
eryGにおける染色体欠失を作製するために、構築物pSGΔG3を以下のように単離した：断片1をプライマー
Figure 2011147446
を使用して増幅し、かつS.エリスラエアのゲノムDNAを鋳型として使用した。断片2をプライマー
Figure 2011147446
を使用して増幅し、かつS.エリスラエアのゲノムDNAを鋳型として使用した。両方のDNA断片をSmaI切断したpUC19に、標準的な技術を使用してクローニングし、プラスミドpUCPCR1およびpUCPCR2を単離し、そして増幅断片の配列を確認した。プラスミドpUCPCR1を、EcoRI/XbaIを使用して消化し、挿入バンドDNAを単離し、EcoRI/XbaI消化したpUC19にクローニングした。プラスミドpSGΔG1を標準的な方法を使用して単離し、SphI/XbaIで消化し、次にSphI/XbaI消化したpUCPCR2の挿入断片をライゲーションを行った。プラスミドpSGΔG2を標準的な手順を使用して単離し、SphI/HindIIIで消化し、そしてチオストレプトン耐性をコードする遺伝子を含むpCJR24（Roweら、1998）のSphI/HindIII断片とライゲーションした。プラスミドpSGΔG3を単離し、以前に記載された方法（Gaisserら、1997；Gaisserら、1998）を使用して、S.エリスラエア株SGQ2のゲノム中でeryGを欠失させるために使用し、S.エリスラエア変異体SGP1（SGQ2ΔeryG）を作製する。
5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンCの産生
S.エリスラエア株SGP1（S.エリスラエアSGQ2ΔeryG）を標準的な技術を使用して単離し、結果として以前に記載したカセット構築物pSG1448/27/95/21/44/193/6eryCIIIを形質転換するために使用する。S.エリスラエア株SGP1pSG1448/27/95/21/44/193/6eryCIIIを単離し、実施例2と同様に生物形質転換のために使用し、アッセイを上記のように実行して、3-O-ミカロシル-エリスロノリドBから5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンCへの転換を、LCMC分析によって確認する。
実施例12：3-O-アンゴロサミニル-エリスロノリドBの産生
S.エリスラエアQ42/1 pSG1448/27/91/4spnOp5/24/193/6angMII(pSG144angAIangAIIangMIIIspnOpangorf14angBangMIangMII)
エリスロノリドBを供給する生物形質転換実験を、一般的方法に記載されるように実行し、培養物を分析した。アンゴロサミニル化エリスロノリドBを検出した。約30mgの3-O-アンゴロサミニル-エリスロノリドBを単離し、その構造をNMR分析によって確認した。
Figure 2011147446
S.エリスラエア18A1 pSB1448/27/96/4p5/21/44/193/6angMII（pSG144angAIangAIIangorf4pangorf14angMIIIangBangMIangMII）を用いるエリスロノリドBの生物転換
エリスロノリドBを供給する生物形質転換実験を、一般的方法に記載されるように実行し、培養物を分析した。アンゴロサミニル化エリスロノリドBに特徴的なピークを検出した。
参考文献
Figure 2011147446

Figure 2011147446

Figure 2011147446
Figure 2011147446

Figure 2011147446

Claims (26)

  1. 適切な株のバックグラウンド中でミカミノース（mycaminose）またはアンゴロサミン（angolosamine）の合成を方向付けること、およびアグリコン（aglycone）またはシュードアグリコン（pseudoaglycone）へのその引き続いての移入を方向付けることが可能である、遺伝子の組み合わせを含む遺伝子カセット。
  2. ミカミノースの合成および移入を方向付けることが可能である遺伝子の組み合わせを含み、
    a）少なくとも1つの遺伝子が、angorf14、tylMIII、tylMI、tylB、tylAI、tylAII、tylIa、angAI、angAII、angMIII、angB、angMI、eryGおよびeryKからなる群より選択され；かつ
    b）少なくとも1つの遺伝子が、tylMII、angMII、desVII、eryCIII、eryBV、spnP、およびmidIからなる群より選択されるグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項1記載の遺伝子カセット。
  3. 遺伝子カセット中の遺伝子の1つがtylIaである、請求項2記載の遺伝子カセット。
  4. 遺伝子カセット中の遺伝子の1つがangorf14である、請求項2記載の遺伝子カセット。
  5. eryCIII、tylMIIおよびangMIIからなる群より選択される１つまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子と組み合わせた、angAI、angAII、angorf14、angMIII、angBおよびangMIを含む、請求項2または4記載の遺伝子カセット。
  6. eryCIII、tylMIIおよびangMIIからなる群より選択される１つまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子と組み合わせた、tylAI、tylAII、tylMIII、tylB、tylIaおよびtylMIを含む、請求項2または3記載の遺伝子カセット。
  7. アンゴロサミンの合成および移入を方向付けることが可能である遺伝子の組み合わせを含み、
    a）少なくとも1つの遺伝子が、angMIII、angMI、angB、angAI、angAII、angorf14、angorf4、tylMIII、tylMI、tylB、tylAI、tylAII、eryCVI、spnO、eryBVI、およびeryKから選択され；かつ
    b）少なくとも1つの遺伝子が、eryCIII、tylMII、angMII、desVII、eryBV、spnPおよびmidIからなる群より選択されるグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項1記載の遺伝子カセット。
  8. angMII、tylMIIおよびeryCIIIからなる群より選択される1つまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を組み合わせた、angMIII、angMI、angB、angAI、angAII、angorf14およびspn0を含む、請求項7記載の遺伝子カセット。
  9. angMII、tylMIIおよびeryCIIIからなる群より選択される1つまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を組み合わせた、angMIII、angMI、angB、angAI、angAII、angorf4、およびangorf14を含む、請求項7記載の遺伝子カセット。
  10. C5位にミカミノースまたはアンゴロサミンのいずれかを含むエリスロマイシンまたはアジスロマイシンの産生のためのプロセスであって、上記の請求項1〜9のいずれか一項に記載の遺伝子カセットで菌株を形質転換する段階、および該エリスロマイシンまたはアジスロマイシンの産生のための適切な条件下で菌株を培養する段階を含む、プロセス。
  11. 菌株が放線菌、シュードモナス（Pseudomonas）、粘液細菌（myxobacteria）、および大腸菌から選択される、請求項10記載のプロセス。
  12. 宿主株がS.エリスラエア（S. erythraea）由来のermEでさらに形質転換される、請求項10記載のプロセス。
  13. 宿主株が放線菌である、請求項10または11記載のプロセス。
  14. 宿主株がS.エリスラエア（S. erythraea）、ストレプトマイセス・グリセオフスカス（Streptomyces griseofuscus）、ストレプトマイセス・シナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）、ストレプトマイセス・アルバス（Streptomyces albus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス種（Streptomyces hygroscopicus sp.）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変異株アスコマイセティカス（Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus）、ストレプトマイセス・ロンギスポロフラバス（Streptomyces longisporoflavus）、サッカロポリスポラ・スピノサ（Saccharopolyspora spinosa）、ストレプトマイセス・ツクバエンシス（Streptomyces tsukubaensis）、ストレプトマイセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・フラジエ（Streptomyces fradiae）、ストレプトマイセス・リモサス（Streptomyces rimosus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・ユーリサーマス（Streptomyces eurythermus）、ストレプトマイセス・ベネズエレ（Streptomyces venezuelae）、およびアミコラトプシス・メジテラネイ（Amycolatopsis mediterranei）から選択される、請求項13に記載のプロセス。
  15. 宿主株がS.エリスラエアである、請求項14記載のプロセス。
  16. 宿主株がS.エリスラエアのSGQ2、Q42/1または18A1から選択される、請求項15記載のプロセス。
  17. 組換え株へのアグリコンおよび/またはシュードアグリコン基質の供給をさらに含む、請求項10〜16のいずれか一項記載のプロセス。
  18. アグリコンおよび/またはシュードアグリコンが、以下からなる群より選択される、請求項17に記載のプロセス：3-O-ミカロシルエリスロノリド（mycarosyl erythronolide）B、エリスロノリドB、6-デオキシエリスロノリドB、3-O-ミカロシル-6-デオキシエリスロノリドB、チラクトン（tylactone）、スピノシン(spinosyn)シュードアグリコン、3-O-ラムノシルエリスロノリドB、3-O-ラムノシル-6-デオキシエリスロノリドB、3-O-アンゴロサミニルエリスロノリドB、15-ヒドロキシ-3-O-ミカロシルエリスロノリドB、15-ヒドロキシエリスロノリドB、15-ヒドロキシ-6-デオキシエリスロノリドB、15-ヒドロキシ-3-O-ミカロシル-6-デオキシエリスロノリドB、15-ヒドロキシ-3-O-ラムノシルエリスロノリドB、15-ヒドロキシ-3-O-ラムノシル-6-デオキシエリスロノリド B、15-ヒドロキシ-3-0-アンゴロサミニルエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-3-O-ミカロシルエリスロノリドB、14-ヒドロキシエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-6-デオキシエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-3-O-ミカロシル-6-デオキシエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-3-O-ラムノシルエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-3-O-ラムノシル-6-デオキシエリスロノリドB、14-ヒドロキシ-3-O-アンゴロサミニルエリスロノリドB。
  19. 生成された化合物を単離する段階をさらに含む、請求項10〜18のいずれか一項記載のプロセス。
  20. 以下の化学式Iの化合物：
    Figure 2011147446
     R1は以下から選択され、
    - H、CH3、C2H5、
    - いずれかの基が1つまたは複数のヒドロキシル基により任意で置換されてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシアルキル基およびアルキルチオアルキル基から選択されるα分枝C3〜C8基、
    - アルキル基がα分枝C2〜C5アルキル基であるC5〜C8シクロアルキルアルキル基、
    - いずれかが1つもしくは複数のヒドロキシル、または1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、C3〜C8シクロアルキル基またはC5〜C8シクロアルケニル基、
    - 飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよく、かつ、1つまたは複数のC1〜C4アルキル基、ハロ原子またはヒドロキシル基によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素または硫黄含有複素環、
    - C1〜C4アルキル基、C1〜C4アルコキシ基およびC1〜C4アルキルチオ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル、ならびにシアノから選択される少なくとも1つの置換基により任意で置換されてもよいフェニル、または、
    - R17-CH2-であって、ここで、R17は、H、C1〜C8アルキル、C2〜C8アルケニル、C2〜C8アルキニル、各アルキルまたはアルコキシ基において1〜6個の炭素原子を含むアルコキシアルキルまたはアルキルチオアルキルであり、ここで該アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基またはアルキニル基のいずれかは、1つもしくは複数のヒドロキシル基または1つもしくは複数のハロ原子によって置換されてもよく；または、いずれかが1つもしくは複数のC1-C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、C3〜C8シクロアルキルもしくはC5〜C8シクロアルケニルであり；または、飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよく、かつ1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素もしくは硫黄含有複素環であり；または、化学式SA16の基であって、ここで、A16はC1〜C8アルキル、C2〜C8アルケニル、C2〜C8アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C5〜C8シクロアルケニル、フェニルもしくは置換フェニルであり、ここで置換基はC1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシもしくはハロであり、または飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよく、かつ1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素または硫黄含有複素環であり、
    R2、R4、R5、R6、R7およびR9は各々独立してH、OH、CH3、C2H5またはOCH3であり、
    R3=HまたはOHであり、
    R8=H、
    Figure 2011147446
     、ラムノース、2'-O-メチルラムノース、2',3'-ビス-O-メチルラムノース、2',3',4'-トリ-O-メチルラムノース、オレアンドロース、オリオース、ジジトキソース（digitoxose）、オリボースまたはアンゴロサミンであり；
    R10=HまたはCH3またはC(=O)RAであり、ここでRA=C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはC2〜C6アルキニルであり、
    R11=H、
    Figure 2011147446
     、ミカロース、C4-O-アシル-ミカロースまたはグルコースであり、
    R12=HまたはC(=O)RAであり、ここでRA=C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはC2〜C6アルキニルであり、
    R13=HまたはCH3であり、
    R15=Hまたは
    Figure 2011147446
     であり、
    R16=HまたはOHであり、
    R14=Hまたは-C(O)NRcRdであり、ここでRcおよびRdの各々は、独立してH、C1〜C10アルキル、C2〜C20アルケニル、C2〜C10アルキニル、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、または-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)であり、ここでmは0〜4の範囲の整数であり、かつここでH以外の該Rc基およびRd基の各々は1〜3個のQ基によって置換されてもよく；またはRcおよびRdは一緒になって4〜7員環の飽和環または5〜10員環のヘテロアリール環を形成してもよく、ここで飽和環およびヘテロアリール環は、RcおよびRdが結合する窒素に加えて、O、SおよびNから選択される1個または2個のヘテロ原子を含んでもよく、かつ飽和環は1個もしくは2個の炭素-炭素二重結合または三重結合を含んでもよく、かつ該飽和環およびヘテロアリール環は1〜3個のQ基によって置換されてもよく；またはR2およびR17は一緒になって炭酸環を形成し；各Qはハロ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、アジド、-C(O)Q1、-OC(O)Q1、-C(O)OQ1、-OC(O)OQ1、-NQ2C(O)Q3、-C(O)NQ2Q3、-NQ2Q3、ヒドロキシ、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、および-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)から独立して選択され、ここでmは0〜4の範囲の整数であり、かつ該アリール置換基およびヘテロアリール置換基は、ハロ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、アジド、-C(O)Q1、-C(O)OQ1、-OC(O)OQ1、-NQ2C(O)Q3、-C(O)NQ2Q3、-NQ2Q3、ヒドロキシ、C1〜C6アルキル、およびC1〜C6アルコキシから独立して選択される1個または2個の置換基によって置換されてもよく；
    各Q1、Q2およびQ3はH、OH、C1〜C10アルキル、C1〜C6アルコキシ、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、および-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)から独立して選択され、ここでmは0〜4の範囲の整数であり；ここで化合物が5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAまたはDではないという条件であり、
    または該化合物は上記のいずれかの変種であり、ここでC11における-CHOR14-がメチレン基（-CH2-）、ケト基（C=O）、または10,11-オレフィン結合によって置換され；
    または該化合物は1つまたは複数のケチド単位の酸化状態が異なる上記のいずれかの変種であり（すなわち、-CO-、-CH(OH)-、アルケン-CH-、およびCH2基からなる群からの代替物の選択）；ここで化合物は5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンAおよび5-O-デデソサミニル-5-O-ミカミノシルエリスロマイシンDからなる群より選択されないという条件である。
  21. 以下の化学式IIの化合物：
    Figure 2011147446
     R1は以下から選択され：
    - H、CH3、C2H5、
    - いずれかが1つまたは複数のヒドロキシル基により任意で置換されてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシアルキル基およびアルキルチオアルキル基から選択されるα分枝C3〜C8基；
    - アルキル基がα分枝C2〜C5アルキル基であるC5〜C8シクロアルキルアルキル基、
    - いずれかが1つもしくは複数のヒドロキシル、または1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、C3〜C8シクロアルキル基またはC5〜C8シクロアルケニル基、
    - 飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよく、かつ1つまたは複数のC1〜C4アルキル基、ハロ原子またはヒドロキシル基によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素または硫黄含有複素環、
    - C1〜C4アルキル基、C1〜C4アルコキシ基およびC1〜C4アルキルチオ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル、ならびにシアノから選択される少なくとも1つの置換基により任意で置換されてもよいフェニル、または、
    - R17-CH2-であって、ここで、R17は、H、C1〜C8アルキル、C2〜C8アルケニル、C2〜C8アルキニル、各アルキルまたはアルコキシ基において1〜6個の炭素原子を含むアルコキシアルキル、またはアルキルチオアルキルであり、ここで該アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基またはアルキニル基のいずれかは、1つもしくは複数のヒドロキシル基または1つもしくは複数のハロ原子によって置換されてもよく；または、いずれかが1つもしくは複数のC1-C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、C3〜C8シクロアルキルもしくはC5〜C8シクロアルケニルであり；または、飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよく、かつ1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素もしくは硫黄含有複素環であり；または、化学式SA16の基であって、ここで、A16はC1〜C8アルキル、C2〜C8アルケニル、C2〜C8アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C5〜C8シクロアルケニル、フェニルもしくは置換フェニルであり、ここで置換基はC1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシもしくはハロであり、または飽和しているか、または完全にもしくは部分的に不飽和であってもよく、かつ1つもしくは複数のC1〜C4アルキル基もしくはハロ原子によって任意で置換されてもよい、3〜6員環の酸素または硫黄含有複素環であり、
    R2、R4、R5、R6、R7およびR9は各々独立してH、OH、CH3、C2H5またはOCH3であり、
    R3=HまたはOHであり、
    R8=H、
    Figure 2011147446
     、ラムノース、2'-O-メチルラムノース、2',3'-ビス-O-メチルラムノース、2',3',4'-トリ-O-メチルラムノース、オレアンドロース、オリオース、ジジトキソース、オリボースまたはアンゴロサミンであり；
    R10=HまたはCH3またはC(=O)RAであり、ここでRA=C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはC2〜C6アルキニルであり、
    R11=H、
    Figure 2011147446
     、ミカロース、C4-O-アシル-ミカロースまたはグルコースであり、
    R12=HまたはC(=O)RAであり、ここでRA=C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはC2〜C6アルキニルであり、
    R13=HまたはCH3であり、
    R15=Hまたは
    Figure 2011147446
     であり、
    R16=HまたはOHであり、
    R14=Hまたは-C(O)NRcRdであり、ここでRcおよびRdの各々は、独立してH、C1〜C10アルキル、C2〜C20アルケニル、C2〜C10アルキニル、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、または-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)であり、ここでmは0〜4の範囲の整数であり、かつここでH以外の該Rc基およびRd基の各々は1〜3個のQ基によって置換されてもよく；またはここでRcおよびRdは一緒になって4〜7員環の飽和環または5〜10員環のヘテロアリール環を形成してもよく、ここで飽和環およびヘテロアリール環は、RcおよびRdが結合する窒素に加えて、O、SおよびNから選択される1個または2個のヘテロ原子を含んでもよく、かつ該飽和環は1個もしくは2個の炭素-炭素二重結合または三重結合を含んでもよく、かつ該飽和環およびヘテロアリール環は1〜3個のQ基によって置換されてもよく；またはR2およびR17は一緒になって炭酸環を形成し；各Qはハロ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、アジド、-C(O)Q1、-OC(O)Q1、-C(O)OQ1、-OC(O)OQ1、-NQ2C(O)Q3、-C(O)NQ2Q3、-NQ2Q3、ヒドロキシ、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、および-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)から独立して選択され、ここでmは0〜4の範囲の整数であり、かつここで該アリール置換基およびヘテロアリール置換基は、ハロ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、アジド、-C(O)Q1、-C(O)OQ1、-OC(O)OQ1、-NQ2C(O)Q3、-C(O)NQ2Q3、-NQ2Q3、ヒドロキシ、C1〜C6アルキル、およびC1〜C6アルコキシから独立して選択される1個または2個の置換基によって置換されてもよく；
    各Q1、Q2およびQ3はH、OH、C1〜C10アルキル、C1〜C6アルコキシ、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、-(CH2)m(C6〜C10アリール)、および-(CH2)m(5〜10員環ヘテロアリール)から独立して選択され、ここでmは0〜4の範囲の整数であり；
    または該化合物は上記のいずれかの変種であり、ここでC12における-CHOR14-がメチレン基（-CH2-）、ケト基（C=O）、または11,12-オレフィン結合によって置換され；
    または該化合物は1つまたは複数のケチド単位の酸化状態が異なる上記のいずれかの変種（すなわち、-CO-、-CH(OH)-、アルケン-CH-、およびCH2基からなる群からの代替物の選択）である。
  22. R2、R4、R5、R6、R7およびR9がすべてCH3である、請求項20または21記載の化合物。
  23. R11=Hまたは
    Figure 2011147446
     、かつR14=Hである、請求項22記載の化合物。
  24. R1がヒドロキシル基により任意で置換されるC2H5である、請求項23記載の化合物。
  25. R12=Hである、請求項24記載の化合物。
  26. R1=C2H5である、請求項25記載の化合物。
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