JP2011069695A - 歯周病予防剤または/および改善剤をスクリーニングする方法ならびにその方法に用いる歯周病動物モデルの作製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】メタボリックシンドロームモデルのげっ歯類に属する動物に、被検試料または対照試料を投与するとともに、レッドコンプレックスに属する細菌の1種以上の懸濁液を一定間隔で複数回、口腔内接種することを含む歯周病予防剤または/および改善剤をスクリーニングする方法、ならびに、メタボリックシンドロームモデルのげっ歯類に属する動物に、レッドコンプレックスに属する細菌の1種以上の懸濁液を一定間隔で複数回、口腔内接種して歯槽骨の吸収を引き起こさせることを特徴とする歯周病動物モデルの作製方法。
【選択図】なし
Description
したがって、本発明の第1の目的は、メタボリックシンドロームに起因して増悪する歯周病を予防または/および増悪した歯周病を改善することができる剤をスクリーニングする方法を提供することにある。
また、本発明の第2の目的は、前記したスクリーニング方法に用いる歯周病動物モデルを作製する方法を提供することにある。
[1] 歯周病予防または/および改善剤をスクリーニングする方法であって、
1)メタボリックシンドロームモデルのげっ歯類に属する動物に、被検試料または対照試料を投与するとともに、レッドコンプレックスに属する細菌の1種以上の懸濁液を一定間隔で複数回、口腔内接種し;ついで
2)被検試料を投与した動物と対照試料を投与した動物との歯槽骨の吸収を調べる
ことを含む該方法;
[2] 6〜15週齢の動物に細菌懸濁液の接種を開始する前記[1]記載の方法;
[3] 細菌懸濁液を一定の間隔をあけて2〜4回接種し、ついで、一定の期間を置いた後に1〜4回の接種を2〜4回繰り返す前記[1]または[2]記載の方法;
[4] 歯周病動物モデルの作製方法であって、
メタボリックシンドロームモデルのげっ歯類に属する動物に、レッドコンプレックスに属する細菌の1種以上の懸濁液を一定間隔で複数回、口腔内接種して歯槽骨の吸収を引き起こさせることを特徴とする該方法;
[5] 6〜15週齢の動物に細菌懸濁液の接種を開始する前記[4]記載の方法;
[6] 8〜10週齢の動物に細菌懸濁液の接種を開始する前記[4]記載の方法;
[7] 細菌懸濁液を一定の間隔をあけて2〜4回接種し、その後、一定の期間を置いた後に1〜4回の接種を2〜4回繰り返す前記[4]ないし[6]のいずれか1に記載の方法
を提供するものである。
さらに本発明は、
[8] メタボリックシンドロームモデルのげっ歯類に属する動物がSHR/NDmcr-cp(cp/cp)ラットである前記[1]記載の方法;
[9] レッドコンプレックスに属する細菌がポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)である前記[1]記載の方法;
[10] 9週齢のSHR/NDmcr-cp(cp/cp)ラットに細菌懸濁液の接種を開始する前記[8]記載の方法
を提供する。
また、本発明によれば、メタボリックシンドローム患者における歯周病疾患の病態メカニズムを調べる動物モデルを提供することができる。
本発明は第1の態様において、歯周病の予防または/および改善剤のスクリーニング方法を提供する。
また、本発明は、第2の態様において、かかる歯周病動物モデルの作製方法を提供する。
さらに、本発明は、1の態様において、かかる作製方法により作製した歯周病動物モデル、歯周病予防または/および改善剤スクリーニングのためのメタボリックシンドローム動物モデルの使用を提供する。
詳細には、メタボリックシンドロームモデルのげっ歯類に属する動物に、被検試料または対照試料を投与するとともに、レッドコンプレックスに属する細菌の1種以上の懸濁液を一定間隔で複数回、口腔内接種して歯周病を確立し、被検試料または対照試料を投与した動物の歯槽骨の吸収を調べることを含む歯周病予防剤をスクリーニングする方法、ならびにかかる歯周病が確立された歯周病動物モデルの作製方法およびかかる方法により作製した歯周病動物モデルを提供する。
ここに、対照試料とは歯周病に影響しないことが知られている物質または精製水をいう。
ある種の態様において、この細菌懸濁液は増粘剤を添加して約100〜3000mPa・s、好ましくは約500〜2000mPa・s(ブルックフィールド型粘度計、#3スピンドル:25℃:60r.p.m.:120秒測定、70ml広口ガラス容器使用)に増粘した細菌懸濁液を使用することにより、細菌の口腔への定着を促進することができる。増粘剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース(CMC)などが挙げられ、カルボキシセルロースを使用する場合は約1.3〜5.0質量%、好ましくは約2.0〜4.0質量%の濃度で添加することにより、各々、上記の粘度に調整することができる。
また、細菌懸濁液の接種様式は、1回目の接種の後に一定の間隔をあけて2、3または4回目までの接種を行ってこれを第1の接種群とし、第1の接種群の後に一定の期間をおいて、第1の接種群と同様に一定の間隔をあけて1、2、3または4回目までの接種を行ってこれを第2の接種群とし、その後、同様に第3または第4の接種群まで行うことができる(図1、1日間隔で3回接種/接種群、第1〜3接種群の態様)。各接種群中の接種の間隔は、いずれの時間とすることもできるが、好ましくは1または2日である。また、各接種群間の期間は、好ましくは3〜20日、より好ましくは5〜20日、よりさらに好ましくは9〜19日である。
使用する抗菌剤としては、例えば、約0.5〜3mg/mlのサルファメトキサゾール、約50〜500μg/mlのトリメトプリムなどが挙げられ、これらを単独または組み合わせて水溶液として、動物に約2〜6日間自由に摂取させることができる。また、その後の蒸留水は、動物に約2〜4日間自由に摂取させることができる。
被検試料またはそれを含有する餌を投与した動物モデルの歯周病の程度が、対照試料または対照餌を投与した動物モデルの程度と比べて低ければ、その被検試料は歯周病の予防剤または/および改善剤として有効と考えられる。
1.動物および使用菌種
8週齢のSHR/cpラットおよび対照動物として起源動物であるWKYラットを用いて以下の実験を行った。また、1実験区につきラット6匹を用いた。
歯周炎の惹起にはポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)ATCC33277(以下、「P.g.」という)を用い、ブレインハートインフュージョンブロス(BHI培地)に0.5%イーストエキストラクト、0.001%ヘミン、0.001%ビタミンK1を添加した培地にて、嫌気条件下(5% CO2、10% H2、85% N2)、37℃で約24〜48時間培養したものを実験に用いた。
ラットの健康状態を確認後、体重の分布が均等になるように群分けし、8週齢のラットの口腔内の常在細菌の数を減少させるため、蒸留水に抗生物質であるサルファメトキサゾールおよびトリメトプリムをそれぞれ1mg/mlおよび200μg/mlとなるように添加し、飲料水として4日間自由に与えた。その後、3日間、口腔内残留薬物の除去を目的に、抗生物質を含まない蒸留水を自由に与えた。
9週齢時には、感染実験区については、PBSに5%となるようにカルボキシメチルセルロース(CMC、Sigma、粘度:Med)を溶解したものに、P.g. ATCC33277株の懸濁液(109CFU/mL以上)を1:1となるように混合し、ゾンデ針を装着したシリンジを用いて、口腔内に接種した。この細菌懸濁液の接種を2日毎に3回を1接種群とし9日間の間隔を空けて計3接種群、合計9回接種を行った。また、非感染実験区については、細菌懸濁液の代わりにPBSを加えたCMC溶液をラット口腔内へ感染実験区と同様に接種した。16週齢時に麻酔下で上顎右側の歯周組織を摘出した。この感染スケジュールを図1に示す。
歯槽骨吸収量の評価は、右側上顎口蓋側臼歯部のセメントエナメル境から歯槽骨頂までの距離を7箇所測定して行った。すなわち、右側上顎組織を2気圧下で10分間加熱後、3%次亜塩素酸ナトリウム液に浸漬して軟組織を除去し、1%メチレンブルー溶液で歯槽骨を染色して乾燥させた検体をマイクロスコープ下で測定した。これを各個体につき3回繰り返し測定を行った。7箇所の測定値を平均して個体あたりの骨吸収量とし3回の平均を算出した。群毎の平均値を平均骨吸収量として評価した。
実験例1
従来行われている細菌感染方法と同様に1接種群(3回接種)の歯周病原菌接種によりメタボリックシンドローム動物モデルにおいても歯周病を確立し得るかを調べた。
8週齢のSHR/cpラットに、サルファメトキサゾールおよびトリメトプリムを各々1mg/mlおよび200μg/ml含有する蒸留水を飲料水として4日間自由に与えた。その後の3日間は飲料水として蒸留水のみを自由に与えた。
ついで、9週齢時のラットに、PBSに5%となるようにカルボキシメチルセルロース(CMC、Sigma、粘度:Med)を溶解したものに、P.g. ATCC33277株の懸濁液(109CFU/mL以上)を1:1となるように混合し、ゾンデ針を装着したシリンジを用いて、口腔内に接種し、接種完了から45−47日後にその平均歯槽骨吸収量を測定した。その結果を図2に示す。
そこで、同じ週齢の動物モデルに複数回の細菌懸濁液を接種した場合の歯周病の確立について調べた。
8週齢のSHR/cpラットに、サルファメトキサゾールおよびトリメトプリムを各々1mg/mlおよび200μg/ml含有する蒸留水を飲料水として4日間自由に与えた。その後の3日間は飲料水として蒸留水のみを自由に与えた。
ついで、9週齢時のラットに、PBSに5%となるようにカルボキシメチルセルロース(CMC、Sigma、粘度:Med)を溶解したものに、P.g. ATCC 33277株の懸濁液(109cfu/mL以上)を1:1となるように混合し、ゾンデ針を装着したシリンジを用いて口腔内に接種した。この接種を1日間隔で3回の接種を1の接種群とし、接種群間の期間を9日として第1から第3接種群までの、合計9回の細菌懸濁液の接種を行い、接種完了から17−19日後(16週齢時)に平均歯槽骨吸収量を測定した。対照区として、細菌懸濁液の代わりにPBSのみ接種したラットの平均歯槽骨吸収量を測定した。その結果を図3に示す。
また、メタボリックシンドロームモデル(SHR/cpラット)とそのモデルの起源(WKYラット)に歯周病原菌を接種した場合の歯周病の程度を調べた。両方のラットに対して細菌懸濁液を接種する以外は実験例2に記載したのと同じ様式で合計9回の接種を行い、接種完了から17−19日後(16週齢時)に平均歯槽骨吸収量を測定した。その結果を図4に示す。
つぎに、細菌懸濁液接種を開始するモデル動物の週齢が歯槽骨吸収に及ぼす影響を調べた。細菌接種を開始するSHR/cpラットの週齢を6〜15週齢で行う以外は実験例2に記載したのと同じ様式で合計9回の接種を行い、接種完了から17−19日後(13〜22週齢時)に平均歯槽骨吸収量を測定した。その結果を図5に示す。
6週齢時のSHR/cpラットに0.1質量%のオレウロペインまたは0.025質量%のヒドロキシチロソールを配合した餌30g/日を与えて飼育し、8週齢時にサルファメトキサゾールおよびトリメトプリムを各々1mg/mlおよび200μg/ml含有する蒸留水を飲料水として4日間自由に与えた。その後の3日間は飲料水として蒸留水のみを自由に与えた。ついで、9週齢時に口腔内にP.g. ATCC33277株の接種を開始した。この接種を1日間隔で3回までの接種を1の接種群とし、接種群間の期間を7日として第1から第3接種群までの、合計9回の細菌懸濁液の接種を行い、さらに第3の接種群の接種完了から16−18日後に1回のみの接種を行い、翌日(16週齢時)に平均歯槽骨吸収量を測定した。その結果を図6に示す。
Claims (7)
- 歯周病予防または/および改善剤をスクリーニングする方法であって、
1)メタボリックシンドロームモデルのげっ歯類に属する動物に、被検試料または対照試料を投与するとともに、レッドコンプレックスに属する細菌の1種以上の懸濁液を一定間隔で複数回、口腔内接種し;ついで
2)被検試料を投与した動物と対照試料を投与した動物との歯槽骨の吸収を調べる
ことを含む該方法。 - 6〜15週齢の動物に細菌懸濁液の接種を開始する請求項1記載の方法。
- 細菌懸濁液を一定の間隔をあけて2〜4回接種し、ついで、一定の期間を置いた後に1〜4回の接種を2〜4回繰り返す請求項1または2記載の方法。
- 歯周病動物モデルの作製方法であって、
メタボリックシンドロームモデルのげっ歯類に属する動物に、レッドコンプレックスに属する細菌の1種以上の懸濁液を一定間隔で複数回、口腔内接種して歯槽骨の吸収を引き起こさせることを特徴とする該方法。 - 6〜15週齢の動物に細菌懸濁液の接種を開始する請求項4記載の方法。
- 8〜10週齢の動物に細菌懸濁液の接種を開始する請求項4記載の方法。
- 細菌懸濁液を一定の間隔をあけて2〜4回接種し、その後、一定の期間を置いた後に1〜4回の接種を2〜4回繰り返す請求項4ないし6のいずれか1項に記載の方法。
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JPN6013001758; INFECTION AND IMMUNITY Vol. 76, No. 8, 2008, p. 3725-3734 * |
JPN6013001759; 日本歯周病学会学術大会プログラムおよび講演抄録集 第47巻, 2004, 第111ページ * |
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