JP2011050950A - Method of producing decomposition product from cellulose-containing material - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、イオン液体を利用したセルロース含有材料の処理方法、分解物の生産方法等に関する。 The present invention relates to a method for treating a cellulose-containing material using an ionic liquid, a method for producing a decomposition product, and the like.
有限である石油資源を代替するものとして、植物の光合成作用に由来するバイオマスへの期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。また、バイオマスを利用し、化成品やバイオ燃料に利用しようとする試みであるバイオリファイナリーの重要性が指摘され、実用化に向けた技術開発が進められている。バイオマスを、エネルギー源やその他の原料として有効利用するためには、バイオマスを動物や微生物が容易に利用可能な炭素源にまで分解・糖化することが必要である。実用化のために解決すべき課題としては、木質系又は草本系のバイオマスの主成分であるセルロース、なかでも結晶性セルロースの効率的な分解方法の開発が挙げられる。 As an alternative to finite petroleum resources, there is an increasing expectation for biomass derived from the photosynthetic action of plants, and various attempts have been made to use biomass for energy and various materials. In addition, the importance of biorefinery, which is an attempt to use biomass for chemical products and biofuels, has been pointed out, and technological development for practical application is underway. In order to effectively use biomass as an energy source and other raw materials, it is necessary to decompose and saccharify biomass into a carbon source that can be easily used by animals and microorganisms. Problems to be solved for practical use include development of an efficient decomposition method of cellulose, which is the main component of woody or herbaceous biomass, especially crystalline cellulose.
現状の糖化プロセスでは、バイオマスを高温・高圧処理や酸処理により前処理してセルロースを分離後、セルラーゼを作用させている。しかしながら、前処理に多大なエネルギーがかかるうえに大量のセルラーゼが必要となっているため、実用化において大きな課題となっている。 In the current saccharification process, biomass is pretreated by high-temperature / high-pressure treatment or acid treatment to separate cellulose, and then cellulase is allowed to act. However, since a large amount of energy is required for pretreatment and a large amount of cellulase is required, it is a big problem in practical use.
近年、イオン液体がセルロースを可溶化することが報告されている。例えば、クロライド系のイオン液体に１００℃程度の条件下でセルロースを可溶化させる性質が見出されている（特許文献１、非特許文献１）。また、非クロライド系イオン液体が、よりマイルドな条件でセルロースを可溶化できることもわかってきている（特許文献２、非特許文献２、３、４）。 In recent years, it has been reported that ionic liquids solubilize cellulose. For example, it has been found that cellulose is solubilized in a chloride-based ionic liquid at about 100 ° C. (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). It has also been found that non-chloride ionic liquids can solubilize cellulose under milder conditions (Patent Document 2, Non-Patent Documents 2, 3, and 4).
さらに、イオン液体で可溶化したセルロースをセルラーゼで糖化する試みもなされているが、イオン液体中ではセルラーゼが不活性化されるという報告がなされている（非特許文献２，４）。イオン液体でセルロースを可溶化するという前処理を施した後、可溶化後のセルロースを水などの親水性溶媒で洗浄してイオン液体を取り除き、その後、水に投入することでセルラーゼで分解できることが報告されている（非特許文献５）。 Furthermore, attempts have been made to saccharify cellulose solubilized with ionic liquid with cellulase, but it has been reported that cellulase is inactivated in ionic liquid (Non-patent Documents 2 and 4). After the pretreatment of solubilizing cellulose with ionic liquid, the solubilized cellulose can be washed with a hydrophilic solvent such as water to remove the ionic liquid, and then poured into water so that it can be decomposed with cellulase. It has been reported (Non-Patent Document 5).
さらにまた、イオン液体でセルロースを膨潤化し、その後イオン液体を除去した後に、酵素処理を行うという手法も試みられている（特許文献３、４、非特許文献６）。 Furthermore, a technique has also been tried in which cellulose is swelled with an ionic liquid and then the enzyme treatment is performed after the ionic liquid is removed (Patent Documents 3 and 4, Non-Patent Document 6).
非特許文献２、４では、イオン液体で可溶化したセルロースをセルラーゼで分解するために、セルラーゼをポリオエチレンオキシド（ＰＥＯ）等で安定化することが有効である可能性が示唆されている。しかしながら、現時点で得られている安定化セルラーゼが十分なセルロース分解活性を有しているわけではない。また、非特許文献５に記載のように、イオン液体でセルロースを可溶化する場合、イオン液体をセルロースから除去するための丹念な洗浄操作を要するとともに、それでもなお相当程度大量のセルラーゼを必要とすることがわかった。また、セルロースの分解・糖化を、イオン液体によってセルロース可溶化したのとは別の反応場で行わなければならないということは、効率的なセルロースの分解・糖化には不都合であった。 Non-Patent Documents 2 and 4 suggest that it may be effective to stabilize cellulase with polyethylene oxide (PEO) or the like in order to decompose cellulose solubilized with ionic liquid with cellulase. However, the stabilized cellulase obtained at the present time does not have sufficient cellulolytic activity. In addition, as described in Non-Patent Document 5, when cellulose is solubilized with an ionic liquid, a careful washing operation for removing the ionic liquid from cellulose is required, and still a considerably large amount of cellulase is required. I understood it. In addition, the fact that the decomposition and saccharification of cellulose must be performed in a reaction field different from that in which the cellulose is solubilized with an ionic liquid is inconvenient for efficient decomposition and saccharification of cellulose.
特許文献３及び非特許文献６では、特定のイオン液体（エチルメチルイミダゾール[Emim][OAc]や[Emim][DEP]が使用されているが、本発明者らによれば、これらのイオン液体は、ワラ等の草本系植物に由来するソフトバイオマスに有効ではあるものの、木質チップ等の木本系植物に由来するハードバイオマス基本系に高い効果が得られるわけではないことがわかった。 In Patent Document 3 and Non-Patent Document 6, specific ionic liquids (ethylmethylimidazole [Emim] [OAc] and [Emim] [DEP] are used. According to the present inventors, these ionic liquids are used. Although it is effective for soft biomass derived from herbaceous plants such as straw, it has been found that a high effect is not obtained on a hard biomass basic system derived from woody plants such as wood chips.
以上のように、現状において、イオン液体を用いてセルロースを含む実バイオマスのセルロース含有材料を効率的に分解することは依然として困難であった。加えて、工業プロセスにおけるセルロースの糖化のためには、分解後の糖化物を効率的に回収し、イオン液体を再利用することも要請される。さらに、ソフトバイオマスのほか、より剛直な複合構造をとっていると考えられるハードバイオマスについても有効な利用が望まれる。 As described above, at present, it has still been difficult to efficiently decompose the cellulose-containing material of real biomass containing cellulose using an ionic liquid. In addition, in order to saccharify cellulose in an industrial process, it is also required to efficiently recover the saccharified product after decomposition and reuse the ionic liquid. In addition to soft biomass, effective utilization of hard biomass that is considered to have a more rigid composite structure is desired.
本発明は、セルロースをより分解するのにより実用的なイオン液体を用いたセルロース含有材料の処理方法、当該処理方法を利用したセルロース含有材料の分解産物の生産方法、有用物質の生産方法等を提供することを一つの目的とする。 The present invention provides a method for treating a cellulose-containing material using a more practical ionic liquid for further decomposing cellulose, a method for producing a degradation product of a cellulose-containing material using the treatment method, a method for producing a useful substance, etc. One purpose is to do.
本発明者らは、上記した課題を解決するために、種々のアニオン及びカチオンの組み合わせのイオン液体につき検討を実施し、特定のイオン液体を用いてセルロース含有材料に対して浸透処理し、その後、イオン液体を分離することで、セルロース含有材料におけるセルロースの複合構造を酵素による簡易な糖化処理に適した状態にすることができ、しかも、特定のイオン液体がセルロース含有材料に残留していてもその悪影響を回避又は抑制して酵素による糖化処理が可能であるという知見を得た。本明細書の開示は、これらの知見に基づいて提供される。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have studied ionic liquids of combinations of various anions and cations, infiltrated the cellulose-containing material using specific ionic liquids, and then By separating the ionic liquid, the composite structure of cellulose in the cellulose-containing material can be brought into a state suitable for simple saccharification treatment with an enzyme, and even if a specific ionic liquid remains in the cellulose-containing material, The present inventors have found that saccharification treatment with an enzyme is possible while avoiding or suppressing adverse effects. The disclosure herein is provided based on these findings.
本明細書の開示によれば、セルロース含有材料の処理方法であって、以下の工程（ａ）：
（ａ）前記セルロース含有材料とイオン液体とを接触させて前記セルロース含有材料中に前記イオン液体を浸透させる工程、
を備える、方法が提供される。
According to the disclosure herein, a method for treating a cellulose-containing material comprising the following step (a):
(A) contacting the cellulose-containing material with an ionic liquid to infiltrate the ionic liquid into the cellulose-containing material;
A method is provided comprising:
本処理方法において、前記工程（ａ）は、前記セルロース含有材料及び前記イオン液体を加熱することを含むことができる。さらに、本処理方法は、前記工程（ａ）の後、以下の工程（ｂ）：
（ｂ）前記セルロース含有材料と前記イオン液体とを固液分離する工程、を備えていてもよい。
In the present processing method, the step (a) can include heating the cellulose-containing material and the ionic liquid. Furthermore, this processing method is the following step (b) after the step (a):
(B) A step of solid-liquid separating the cellulose-containing material and the ionic liquid may be provided.
本処理方法は、さらに、前記工程（ｂ）の後、以下の工程（ｃ）：
（ｃ）前記セルロース含有材料を前記イオン液体の親溶媒で洗浄する工程、を備えることもできる。
The treatment method further includes the following step (c) after the step (b):
(C) A step of washing the cellulose-containing material with a parent solvent of the ionic liquid may be provided.
さらにまた、本処理方法は、前記工程（ｂ）の後、以下の工程（ｄ）：
（ｄ）前記セルロース含有材料から分離された前記イオン液体を回収し、前記工程（ａ）に供給する工程、を備えることもできる。
Furthermore, this processing method is the following step (d) after the step (b):
(D) The step of recovering the ionic liquid separated from the cellulose-containing material and supplying it to the step (a) may be provided.
前記セルロース含有材料は、木質系バイオマスとすることができる。 The cellulose-containing material can be woody biomass.
本明細書の開示によれば、セルロース分解産物の生産方法であって、
以下の工程（ａ）及び（ｅ）：
（ａ）セルロース含有材料とイオン液体１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム アセテートとを接触させて前記セルロース含有材料中に前記イオン液体を浸透させる工程、
（ｅ）前記セルロース含有材料中のセルロースをセルラーゼで用いて分解する工程、
を備える、方法が提供される。
According to the disclosure herein, a method for producing a cellulose degradation product comprising:
The following steps (a) and (e):
(A) contacting the cellulose-containing material with ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium acetate to infiltrate the ionic liquid into the cellulose-containing material;
(E) a step of decomposing cellulose in the cellulose-containing material using cellulase,
A method is provided comprising:
本生産方法によれば、前記工程（ｅ）は、前記セルロース含有材料から前記イオン液体を固液分離後に、前記セルロース含有材料に対する貧溶媒であって前記セルロースの分解産物に対する親溶媒に含まれる前記セルラーゼで前記セルロースを分解する工程であってもよい。さらに、本生産方法は、さらに、前記工程（e）の後、以下の工程（ｆ）：
（ｆ）前記セルラーゼによる分解残渣を固液分離して前記セルロース含有材料中の非セルロース画分を回収する工程、を備えることもできる。
According to this production method, the step (e) is a poor solvent for the cellulose-containing material after solid-liquid separation of the ionic liquid from the cellulose-containing material, and is included in the parent solvent for the decomposition product of the cellulose. It may be a step of decomposing the cellulose with cellulase. Furthermore, this production method further includes the following step (f) after the step (e):
(F) The step of recovering the non-cellulose fraction in the cellulose-containing material by solid-liquid separation of the decomposition residue by the cellulase can also be provided.
本明細書の開示によれば、有用物質の生産方法であって、以下の工程（ａ）、（ｅ）及び（ｇ）：
（ａ）セルロース含有材料とイオン液体１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム アセテートとを接触させて前記セルロース含有材料中に前記イオン液体を浸透させる工程、
（ｅ）前記セルロース含有材料中のセルロースをセルラーゼで用いて分解する工程、
（ｇ）前記工程（ｅ）で得られたセルロース分解産物を含む炭素源を用いて微生物の発酵により前記有用物質を生産する工程、を備える、方法も提供される。
According to the disclosure of the present specification, a method for producing a useful substance comprising the following steps (a), (e) and (g):
(A) contacting the cellulose-containing material with ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium acetate to infiltrate the ionic liquid into the cellulose-containing material;
(E) a step of decomposing cellulose in the cellulose-containing material using cellulase,
(G) A method comprising the step of producing the useful substance by fermentation of microorganisms using the carbon source containing the cellulose degradation product obtained in the step (e) is also provided.
本明細書の開示によれば、酵素処理用セルロース含有材料であって、セルロース含有材料にイオン液体１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムアセテートを浸透処理させて得られる、材料が提供される。 According to the disclosure of the present specification, there is provided a cellulose-containing material for enzyme treatment, which is obtained by infiltrating an ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium acetate into a cellulose-containing material.
本明細書の開示は、セルロース含有材料の処理方法、セルロース分解産物の生産方法等に関する。本明細書の開示によれば、セルロース含有材料と特定のイオン液体、すなわち、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート[Bmim][OAc]をセルロース含有材料に浸透させることで、セルロース含有材料のセルロースを含むマトリックスにこのイオン液体が浸透する。この結果、セルロース含有マトリックスの少なくとも一部が崩壊すると考えられる。これにより、セルラーゼがその基質であるセルロース等にアクセスしやすい状態が形成される。さらに、その後、イオン液体と接触後のセルロース含有材料に水性媒体などのセルロース含有材料に対して貧溶媒であってセルロース分解産物に対して親溶媒である溶媒を供給することにより、特定のイオン液体が浸透されたセルロース含有マトリックスにおいて、セルラーゼがセルロースに作用し、セルロースの分解反応が進行する。 The present disclosure relates to a method for treating a cellulose-containing material, a method for producing a cellulose degradation product, and the like. According to the disclosure of the present specification, the cellulose-containing material and the specific ionic liquid, that is, 1-butyl-3-methylimidazolium acetate [Bmim] [OAc] are infiltrated into the cellulose-containing material. This ionic liquid penetrates into a matrix containing cellulose. As a result, it is considered that at least a part of the cellulose-containing matrix is collapsed. As a result, a state is formed in which cellulase can easily access cellulose or the like as its substrate. Furthermore, the specific ionic liquid is then supplied to the cellulose-containing material after contact with the ionic liquid by supplying a solvent that is a poor solvent for the cellulose-containing material such as an aqueous medium and a parent solvent for the cellulose degradation product. Cellulase acts on cellulose in the cellulose-containing matrix infiltrated with cellulose, and the decomposition reaction of cellulose proceeds.
例えば、リグノセルロース等のセルロース含有材料は、主要構成成分であるセルロースが強固な水素結合を保持していると同時に、疎水性を保有する結晶構造を形成している。[Bmim][OAc]の有するアニオンとカチオンの作用によれば、ソフトバイオマスであってもハードバイオマスであっても効果的にセルロースの結晶構造を崩壊させることができる。また、[Bmim][OAc]によれば、固液分離によってセルロース含有材料から[Bmim][OAc]を分離することで、[Bmim][OAc]が残留していても、セルラーゼがセルロースを効果的に分解できる。このため、洗浄工程を回避でき、セルロース含有材料の処理工程、分解工程を簡略化することができる。 For example, a cellulose-containing material such as lignocellulose forms a crystal structure in which cellulose as a main constituent component retains a strong hydrogen bond and at the same time possesses hydrophobicity. According to the action of the anion and cation of [Bmim] [OAc], the crystal structure of cellulose can be effectively destroyed regardless of whether it is soft biomass or hard biomass. In addition, according to [Bmim] [OAc], cellulase is effective for cellulase even if [Bmim] [OAc] remains by separating [Bmim] [OAc] from the cellulose-containing material by solid-liquid separation. Can be decomposed. For this reason, a washing | cleaning process can be avoided and the process process and decomposition | disassembly process of a cellulose containing material can be simplified.
本明細書の開示によれば、親水性イオン液体である[Bmim][OAc]は、セルロース含有材料に対して貧溶媒でありセルロース分解産物に親溶媒である溶媒、例えば、水と自由に混合する。このため、セルロース含有材料に浸透した[Bmim][OAc]は、水の存在下では、セルラーゼを含む水と混合すると考えられる。本発明者らは、親水性イオン液体は酵素反応を阻害し、セルロース含有材料中に[Bmim][OAc]が残留していると、酵素反応が進行しないと考えられた。しかしながら、本発明者らの予想に反して、[Bmim][OAc]がセルロース含有材料に浸透し、セルラーゼの基質に極めて近接して存在していても、セルラーゼのセルロース分解反応が阻害されることなく、セルロースが効果的に分解されることがわかた。[Bmim][OAc]のセルラーゼに対する阻害の程度はまったく知られておらず、また、[Bmim][OAc]について、セルロースの崩壊効果もまったく知られていなかった。 According to the disclosure herein, [Bmim] [OAc], which is a hydrophilic ionic liquid, is a poor solvent for cellulose-containing materials and is freely mixed with a solvent that is a parent solvent for cellulose degradation products, such as water. To do. For this reason, it is considered that [Bmim] [OAc] that has penetrated into the cellulose-containing material is mixed with water containing cellulase in the presence of water. The present inventors thought that the hydrophilic ionic liquid inhibits the enzyme reaction, and the enzyme reaction does not proceed when [Bmim] [OAc] remains in the cellulose-containing material. However, contrary to our expectation, even when [Bmim] [OAc] penetrates into the cellulose-containing material and is present in close proximity to the cellulase substrate, the cellulase degradation reaction of cellulase is inhibited. It was found that cellulose was effectively decomposed. The degree of inhibition of [Bmim] [OAc] on cellulase was not known at all, and the degradation effect of cellulose was not known at all for [Bmim] [OAc].
以下、本明細書に開示される各種の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法のフローの一例を示す図であり、図２は、本明細書に開示されるセルロース分解産物の生産方法のフローの一例を示す図であり、図３は、本明細書に開示される有用物質の生産方法のフローの一例を示す図であり、図４は、本明細書の開示の典型的な実施形態を示す図である。 Hereinafter, various embodiments disclosed in this specification will be described in detail with reference to the drawings as appropriate. FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a flow of a method for treating a cellulose-containing material disclosed in the present specification, and FIG. 2 illustrates an example of a flow of a method for producing a cellulose degradation product disclosed in the present specification. FIG. 3 is a diagram illustrating an example of a flow of a production method of a useful substance disclosed in the present specification, and FIG. 4 is a diagram illustrating an exemplary embodiment of the present disclosure. .
（セルロース含有材料）
本明細書において、セルロースとは、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体をいう。セルロースにおけるグルコースの重合度は特に限定しないが、好ましくは２００以上である。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。また、セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースを含んでいてもよい。さらに、セルロースは、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体であってもよい。セルロース は、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよいが、好ましくは結晶性セルロースを含む。さらに、セルロースは、天然由来のものでも、人為的に合成したものでもよい。セルロースの由来も特に限定しない。植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。
(Cellulose-containing material)
In the present specification, cellulose refers to a polymer in which glucose is polymerized by β-1,4-glucoside bonds and derivatives thereof. The degree of polymerization of glucose in cellulose is not particularly limited, but is preferably 200 or more. In addition, examples of the derivative include derivatives such as carboxymethylation, aldehyde formation, or esterification. Cellulose may contain cellooligosaccharide and cellobiose, which are partially decomposed products thereof. Further, the cellulose may be a complex with β-glucoside, which is a glycoside, lignocellulose, which is a complex with lignin and / or hemicellulose, and pectin. The cellulose may be crystalline cellulose or non-crystalline cellulose, but preferably contains crystalline cellulose. Furthermore, the cellulose may be naturally derived or artificially synthesized. The origin of cellulose is not particularly limited. It may be derived from plants, fungi, or bacteria.
本明細書において、セルロース含有材料とは、上記したセルロースを含むものであればよい。したがって、セルロースは結晶性セルロースであっても非結晶性セルロースであってもよく、セルロースのほか、ヘミセルロースやリグニンを含んでいてもよい。セルロース含有材料としては、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲ワラ、麦ワラなどの各種ワラ、籾殻、バガス、木材チップなどの農産廃棄物、古紙、建築廃材などの各種廃棄物などを含むバイオマス（木質系及び草本系）が挙げられる。なかでも、[Bmim][OAc]による処理は、ハード系バイオマス（木質系バイオマス）にも効果的である。 In the present specification, the cellulose-containing material may be any material that contains cellulose as described above. Therefore, the cellulose may be crystalline cellulose or amorphous cellulose, and may contain hemicellulose or lignin in addition to cellulose. Cellulose-containing materials include natural fiber products such as cotton and linen, recycled fiber products such as rayon, cupra, acetate, and lyocell, various straws such as rice straw and wheat straw, agricultural waste such as rice husks, bagasse and wood chips, and waste paper And biomass (woody and herbaceous) containing various wastes such as building waste. In particular, the treatment with [Bmim] [OAc] is also effective for hard biomass (woody biomass).
本明細書に開示される各種実施形態に適用されるセルロース含有材料は特に限定されない。後述する実施例においても開示するように、イオン液体[Bmim][OAc]は、結晶性セルロースであってもまたリグニンとマトリックスを構成していても、その一部を可溶化又は崩壊又は溶解できることがわかっている。すなわち、結晶性セルロースのように、水素結合により強固に相互作用して結晶性の高い領域を形成していても、[Bmim][OAc]は浸透し、その構造を緩和してセルラーゼによる分解を促進できる。また、[Emim][OAc]等との比較から[Bmim][OAc]のセルロースを含むマトリックスへの作用を考慮すると、セルロース含有材料は水に不溶性あるいは難溶解性のものであることが好ましい。かかるセルロース含有材料としては、結晶性セルロースを含有するセルロース含有材料が挙げられ、また、例えば、セルロースのほかリグニン及び／又はヘミセルロースを含有する植物細胞壁由来のセルロース含有マトリックスを含む材料が挙げられる。典型的には、草本系や木質系のバイオマスが挙げられる。セルロース含有材料は、浸透工程に先立って、粉砕、細断等により、微細化されていてもよい。セルロース含有材料は、粉末の形態を取ることが好ましいが、その平均粒経が、４ｍｍ以下であることが好ましい。典型的には、１０００μｍ以下であることが好ましい。また、平均粒経は、粉砕操作を考慮すると１００μｍ以上であることが好ましく、１５０μｍ以上であることが好ましく、２５０μｍ程度であってもよい。 The cellulose-containing material applied to the various embodiments disclosed in the present specification is not particularly limited. As disclosed in the examples described later, the ionic liquid [Bmim] [OAc] can be solubilized, disintegrated, or dissolved, whether it is crystalline cellulose or lignin and a matrix. I know. That is, even if the crystalline cellulose has a strong interaction by hydrogen bonding to form a highly crystalline region, [Bmim] [OAc] penetrates, relaxes its structure, and decomposes by cellulase. Can promote. Further, considering the effect of [Bmim] [OAc] on the matrix containing cellulose from comparison with [Emim] [OAc], etc., the cellulose-containing material is preferably insoluble or hardly soluble in water. Examples of the cellulose-containing material include a cellulose-containing material containing crystalline cellulose, and examples thereof include a material containing a cellulose-containing matrix derived from a plant cell wall containing lignin and / or hemicellulose in addition to cellulose. Typically, herbaceous or woody biomass is mentioned. The cellulose-containing material may be refined by pulverization, chopping or the like prior to the infiltration step. The cellulose-containing material preferably takes the form of a powder, but its average particle size is preferably 4 mm or less. Typically, it is preferably 1000 μm or less. The average particle size is preferably 100 μm or more in consideration of the pulverization operation, preferably 150 μm or more, and may be about 250 μm.
（セルロース含有材料の処理方法）
（浸透工程）
本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法は、セルロース含有材料と[Bmim][OAc]とを接触させて前記セルロース含有材料中に前記イオン液体を浸透させる工程、を備えることができる。以下、この工程を浸透工程という。この浸透工程では、液相である[Bmim][OAc]と固相であるセルロース含有材料とを接触させる。[Bmim][OAc]は、セルロース含有材料のセルロースを含むマトリックスに浸透性を有しており、セルロース含有材料の少なくとも一部を崩壊させその構造を緩和することができる。本明細書において、浸透とは、セルロース含有材料中のセルロースの構造緩和を意図しており、セルロース含有材料中のセルロースの溶解までを意図するものではない。なお、浸透の結果、セルロースの一部が溶解することを排除するものではない。本明細書の開示を拘束するものではないが、セルロースは、多くの場合、疎水性領域と親水性領域とを併せ持つ高分子材料である。[Bmim][OAc]は、全体としては親水性であり、セルロースのどの部分と作用するかは不明であるが、セルロースのいずれかの領域に親和性を有するため、セルロース系含有マトリックスに浸透し、その少なくとも一部を緩和ないし崩壊するものと考えられる。また、セルロース含有材料が、セルロース以外にヘミセルロースやリグニンを含むセルロース含有マトリックスを備えている場合には、同様に、これらの成分のいずれかの領域と相互作用して、セルロース含有マトリックスに浸透し、その一部を緩和ないし崩壊するものと考えられる。
(Method for treating cellulose-containing material)
(Penetration process)
The method for treating a cellulose-containing material disclosed in the present specification can include a step of bringing the cellulose-containing material into contact with [Bmim] [OAc] and allowing the ionic liquid to penetrate into the cellulose-containing material. Hereinafter, this process is referred to as an infiltration process. In this permeation step, [Bmim] [OAc] which is a liquid phase and a cellulose-containing material which is a solid phase are brought into contact with each other. [Bmim] [OAc] has permeability to the cellulose-containing matrix of the cellulose-containing material, and can disintegrate at least a part of the cellulose-containing material and relax its structure. In this specification, osmosis | permeation intends the structure relaxation of the cellulose in a cellulose containing material, and does not intend to melt | dissolve of the cellulose in a cellulose containing material. In addition, it does not exclude that a part of cellulose dissolves as a result of permeation. Although not limiting the disclosure herein, cellulose is often a polymeric material having both a hydrophobic region and a hydrophilic region. [Bmim] [OAc] is hydrophilic as a whole, and it is unclear which part of cellulose acts with it, but it has affinity for any region of cellulose, so it penetrates into cellulosic matrix. It is thought that at least a part of it relaxes or collapses. In addition, when the cellulose-containing material has a cellulose-containing matrix containing hemicellulose or lignin in addition to cellulose, similarly, it interacts with any region of these components and penetrates into the cellulose-containing matrix, It is thought that a part of it will ease or collapse.
本明細書に開示される各種実施形態においては、イオン液体として少なくとも[Bmim][OAc]を使用する。[Bmim][OAc]は以下の式で表される。 In various embodiments disclosed herein, at least [Bmim] [OAc] is used as the ionic liquid. [Bmim] [OAc] is expressed by the following equation.
イオン液体の純度は高いことが好ましい。イオン液体の合成工程の不純物は、イオン液体と親水性溶媒とを混合して得られる媒体のｐＨに大きく影響し、結果として酵素の触媒活性に大きく影響する場合があるからである。本発明者らによれば、例えば、イミダゾリウム系カチオンを用いるイオン液体の場合、純度が低いほど水や緩衝液などの親水性溶媒と混合したときのｐＨがアルカリにシフトしやすく、セルラーゼによるセルロース分解活性が低下する傾向があることがわかっている。なお、[Bmim][OAc]は、単独で用いることができるほか、[Bmim][OAc]の作用を阻害しない範囲で他のイオン液体と２種類以上を組み合わせて用いることもできる。 The purity of the ionic liquid is preferably high. This is because impurities in the process of synthesizing the ionic liquid greatly affect the pH of the medium obtained by mixing the ionic liquid and the hydrophilic solvent, and as a result, may greatly affect the catalytic activity of the enzyme. According to the present inventors, for example, in the case of an ionic liquid using an imidazolium cation, the lower the purity, the easier the pH when mixed with a hydrophilic solvent such as water or a buffer solution is shifted to alkali, and cellulose by cellulase It has been found that the degradation activity tends to decrease. [Bmim] [OAc] can be used alone or in combination with two or more other ionic liquids as long as they do not inhibit the action of [Bmim] [OAc].
セルロース含有材料と[Bmim][OAc]とを接触させる方法は特に限定されない。セルロース含有材料は[Bmim][OAc]が浸透されれば足り、必ずしも[Bmim][OAc]中にセルロース含有材料が浸漬され、分散され、あるいは懸濁された状態であることを要しない。セルロース含有材料に疎水性イオン液体を浸透させるには、例えば、図４及び図７に示すように、十分量の[Bmim][OAc]の液相中にセルロース含有材料を供給し浸漬するようにしてもよいし、セルロース含有材料に対して[Bmim][OAc]を噴霧等によりセルロース含有材料に浸透させるのに必要量程度供給し、セルロース含有材料に[Bmim][OAc]を浸透させるようにしてもよい。 The method for bringing the cellulose-containing material into contact with [Bmim] [OAc] is not particularly limited. The cellulose-containing material is sufficient if [Bmim] [OAc] is infiltrated, and the cellulose-containing material does not necessarily need to be immersed, dispersed or suspended in [Bmim] [OAc]. In order to allow the hydrophobic ionic liquid to penetrate into the cellulose-containing material, for example, as shown in FIGS. 4 and 7, the cellulose-containing material is supplied and immersed in a sufficient amount of the liquid phase of [Bmim] [OAc]. Alternatively, the amount of [Bmim] [OAc] necessary to permeate the cellulose-containing material by spraying or the like is supplied to the cellulose-containing material so that [Bmim] [OAc] permeates the cellulose-containing material. May be.
セルロース含有材料中に[Bmim][OAc]を浸透させるための処理は適宜設定することができる。適度に、例えば、１５０℃以下程度の範囲で加熱してもよい。好ましくは４０℃以上、より好ましくは５０℃以上、さらに好ましくは８０℃以上に加熱する。加熱を行うことで、[Bmim][OAc]のセルロース含有材料への浸透を促進することができる。１５０℃を超えると、セルロース含有材料の種類によっては好ましくない反応が生じる可能性があり、４０℃未満では、加熱の効果が得られにくいからである。加熱時間は、用いるセルロース含有材料の大きさ（粉砕されている場合は、平均粒子径、チップ等の場合には、平均長さ等）や起源（ソフトバイオマス、ハードバイオマス、さらにはその中での分類まで含む）に応じて適宜決定するが、セルロースの[Bmim][OAc]側の溶解が多くならない範囲とすることが好ましい。セルロースの溶解が進行し、[Bmim][OAc]側へのセルロースの溶解量が増えると、後段での分解工程に供するセルロースが減少し、利用率が低下するからである。例えば、温度は８０℃以上とすることが好ましい。好ましくは１３０℃以下である。また、加熱温度にもよるが、加熱時間は２時間以下とすることができる。さらに、加熱時間は１時間以下であってもよく、３０分程度であっても１時間による処理と同等の糖化効率を得ることができる。 The treatment for infiltrating [Bmim] [OAc] into the cellulose-containing material can be appropriately set. For example, the heating may be performed in a range of about 150 ° C. or less. Preferably it heats to 40 degreeC or more, More preferably, it is 50 degreeC or more, More preferably, it heats to 80 degreeC or more. By heating, the penetration of [Bmim] [OAc] into the cellulose-containing material can be promoted. If it exceeds 150 ° C., an undesirable reaction may occur depending on the type of the cellulose-containing material, and if it is less than 40 ° C., it is difficult to obtain the effect of heating. The heating time is the size of the cellulose-containing material to be used (the average particle diameter in the case of pulverization, the average length in the case of chips, etc.) and the origin (soft biomass, hard biomass, and further It is preferably determined within a range where the dissolution on the [Bmim] [OAc] side of cellulose does not increase. This is because when the dissolution of cellulose proceeds and the amount of cellulose dissolved on the [Bmim] [OAc] side increases, the cellulose used in the subsequent decomposition step decreases and the utilization rate decreases. For example, the temperature is preferably 80 ° C. or higher. Preferably it is 130 degrees C or less. Although depending on the heating temperature, the heating time can be 2 hours or less. Furthermore, the heating time may be 1 hour or less, and even if it is about 30 minutes, saccharification efficiency equivalent to the treatment by 1 hour can be obtained.
セルロース含有材料への[Bmim][OAc]の浸透を促進するために、セルロース含有材料と[Bmim][OAc]とを混合（攪拌）してもよいし、プレス処理してもよいし、粉砕処理してもよいし、超音波処理を行ってもよい。加熱を含めたこれらの各種処理は、単独で採用してもよいが、適宜組み合わせて採用してもよい。処理の種類は、用いるセルロース含有材料や用いる[Bmim][OAc]の量によっても適宜変更される。 In order to promote the penetration of [Bmim] [OAc] into the cellulose-containing material, the cellulose-containing material and [Bmim] [OAc] may be mixed (stirred), pressed, or pulverized. It may be processed or may be subjected to ultrasonic treatment. These various treatments including heating may be employed alone or in appropriate combination. The type of treatment is appropriately changed depending on the cellulose-containing material used and the amount of [Bmim] [OAc] used.
なお、[Bmim][OAc]の使用量をできるだけ低減するには、浸透に必要量程度の[Bmim][OAc]をセルロース含有材料に供給してもよいし、後述するように、十分量の[Bmim][OAc]に浸漬したセルロース含有材料を、その後、ろ過や遠心分離等の固液分離手段により[Bmim][OAc]から分離してもよい。 In order to reduce the amount of [Bmim] [OAc] used as much as possible, about [Bmim] [OAc] required for permeation may be supplied to the cellulose-containing material. The cellulose-containing material immersed in [Bmim] [OAc] may then be separated from [Bmim] [OAc] by solid-liquid separation means such as filtration or centrifugation.
このような浸透工程の実施により、セルロース含有材料には[Bmim][OAc]が浸透され、セルロース又はセルロースを含有するマトリックス中に[Bmim][OAc]が保持され、その結果、そのセルロース含有マトリックスが緩んだようになるものと考えられる。[Bmim][OAc]によってセルロース含有材料の構造が緩和されることにより、後段で水性媒体などの溶媒と接触したとき、セルロースの親水性領域がセルラーゼを含む溶媒に露出されやすくなり、セルラーゼによって分解されると考えられる。また、セルロースの疎水性領域もイオン液体による緩和により前記溶媒に露出されやすくなりセルラーゼによって分解されると考えられる。こうした浸透工程を経て[Bmim][OAc]が浸透されたセルロース含有材料は、その後、セルラーゼによるセルロースの分解に供することができる。 By carrying out such an infiltration step, [Bmim] [OAc] is infiltrated into the cellulose-containing material, and [Bmim] [OAc] is retained in the cellulose or the matrix containing cellulose. As a result, the cellulose-containing matrix It seems that will become loose. The structure of the cellulose-containing material is relaxed by [Bmim] [OAc], so that when it comes into contact with a solvent such as an aqueous medium at a later stage, the hydrophilic region of cellulose is easily exposed to a solvent containing cellulase and decomposed by cellulase. It is thought that it is done. In addition, it is considered that the hydrophobic region of cellulose is also easily exposed to the solvent due to relaxation by the ionic liquid and is degraded by cellulase. The cellulose-containing material into which [Bmim] [OAc] has been permeated through such a permeation step can be subsequently subjected to cellulose degradation by cellulase.
（固液分離工程）
本明細書に開示される処理方法においては、浸透工程後に、さらに、セルロース含有材料と[Bmim][OAc]とを固液分離する工程を備えることができる。こうした固液分離によって、[Bmim][OAc]を効果的に再利用に都合のよい形で回収することができるとともに、セルロース含有材料が過剰の[Bmim][OAc]を除去することで、後段でのセルロース分解工程におけるセルラーゼによるセルロースの分解効率を向上させることができる。浸透工程において、セルロース含有材料に[Bmim][OAc]が浸透できる量又はそれに近い量のみが供給されている場合には、固液分離工程は必ずしも要しない。
(Solid-liquid separation process)
The treatment method disclosed in the present specification may further include a step of solid-liquid separation of the cellulose-containing material and [Bmim] [OAc] after the infiltration step. By such solid-liquid separation, [Bmim] [OAc] can be effectively recovered in a form that is convenient for reuse, and the cellulose-containing material removes excess [Bmim] [OAc], so that The cellulose decomposition efficiency by cellulase in the cellulose decomposition step can be improved. In the permeation step, when only the amount capable of penetrating [Bmim] [OAc] or the amount close thereto is supplied to the cellulose-containing material, the solid-liquid separation step is not necessarily required.
固液分離工程における固液分離の方法は特に限定しない。ろ過、圧搾、遠心分離、沈降分離等が挙げられる。良好な分離のために、適宜ろ過時においてプレス等してもよい。また、圧搾等のように、[Bmim][OAc]により少なくとも部分的に構造が緩和したセルロース含有材料を固液分離しつつ粉砕、すりつぶし等してもよい。固液分離工程の実施により、セルロース含有材料から液相として[Bmim][OAc]が分離され、セルロース含有材料は固相として分離される。なお、分離されたセルロース含有材料には、緩和されたセルロースに[Bmim][OAc]がなんらかの形態で保持された状態で残留していると考えられる。セルロース含有材料に残留した[Bmim][OAc]は、セルラーゼによる分解工程において、セルロースの酵素への暴露に対して有利に作用していると考えられる。 The solid-liquid separation method in the solid-liquid separation step is not particularly limited. Examples include filtration, pressing, centrifugation, and sedimentation. For good separation, it may be appropriately pressed during filtration. Moreover, you may grind | pulverize, grind | pulverize, etc., carrying out solid-liquid separation of the cellulose containing material which the structure eased at least partially by [Bmim] [OAc] like pressing. By performing the solid-liquid separation step, [Bmim] [OAc] is separated from the cellulose-containing material as a liquid phase, and the cellulose-containing material is separated as a solid phase. The separated cellulose-containing material is considered to remain [Bmim] [OAc] in some form in the relaxed cellulose. [Bmim] [OAc] remaining in the cellulose-containing material is considered to have an advantageous effect on the exposure of cellulose to the enzyme in the cellulase degradation process.
（洗浄工程）
本明細書に開示される処理方法は、さらに、固液分離工程後に、セルロース含有材料を[Bmim][OAc]の親溶媒で洗浄する工程を備えることもできる。こうすることで、セルロース含有材料から[Bmim][OAc]を効果的に除去することができる。こうした洗浄工程によれば、セルラーゼの処理に先立って、[Bmim][OAc]を回収できるため、セルラーゼを含むセルロース分解反応液から[Bmim][OAc]を回収するよりも有利であり、[Bmim][OAc]の回収率及び再利用率を向上させることができる。[Bmim][OAc]の親溶媒は、[Bmim][OAc]が親水性イオン液体であることから、例えば、水性の液体であって、水又は水と相溶性のある有機溶媒との混液が挙げられる。有機溶媒としては、炭素数が１〜４程度の低級アルコールが挙げられる。
(Washing process)
The treatment method disclosed in the present specification can further include a step of washing the cellulose-containing material with a [Bmim] [OAc] parent solvent after the solid-liquid separation step. By doing so, [Bmim] [OAc] can be effectively removed from the cellulose-containing material. According to such a washing step, [Bmim] [OAc] can be recovered prior to the cellulase treatment, and therefore, it is more advantageous than recovering [Bmim] [OAc] from the cellulose decomposition reaction solution containing cellulase. ] [OAc] recovery rate and reuse rate can be improved. The parent solvent of [Bmim] [OAc] is, for example, an aqueous liquid and a mixed liquid of water or an organic solvent compatible with water since [Bmim] [OAc] is a hydrophilic ionic liquid. Can be mentioned. Examples of the organic solvent include lower alcohols having about 1 to 4 carbon atoms.
洗浄工程は、例えば、固液分離後のセルロース含有材料に対して[Bmim][OAc]親溶媒を供給して、セルロース含有材料と接触させた後、先に説明した固液分離手法を適宜用いて[Bmim][OAc]親溶媒を回収する方法を採用できる。 In the washing step, for example, after supplying the [Bmim] [OAc] parent solvent to the cellulose-containing material after the solid-liquid separation and bringing it into contact with the cellulose-containing material, the solid-liquid separation method described above is appropriately used. The method of recovering the [Bmim] [OAc] parent solvent can be employed.
（[Bmim][OAc]の再利用工程）
本明細書に開示される処理方法は、さらにまた、固液分離工程後に、セルロース含有材料から分離された[Bmim][OAc]を回収し、再利用する工程を備えていてもよい。[Bmim][OAc]の再利用は、工程全体のコストを大きく低下させることができる。固液分離工程で液相として回収された[Bmim][OAc]は、再び、浸透工程に供給して用いることもできる。また、再利用工程は、洗浄工程で回収した[Bmim][OAc]を合わせて利用することもできる。洗浄工程では、[Bmim][OAc]をその親溶媒に溶解した状態で含有しているため、浸透工程への再利用にあたっては、適宜親溶媒を除去あるいは分離されることが好ましい。
([Bmim] [OAc] reuse process)
The processing method disclosed in the present specification may further include a step of recovering and reusing [Bmim] [OAc] separated from the cellulose-containing material after the solid-liquid separation step. Reusing [Bmim] [OAc] can greatly reduce the cost of the entire process. [Bmim] [OAc] recovered as a liquid phase in the solid-liquid separation step can be supplied again to the infiltration step and used. In the reuse process, [Bmim] [OAc] recovered in the cleaning process can be used together. Since the washing step contains [Bmim] [OAc] dissolved in the parent solvent, it is preferable to remove or separate the parent solvent as appropriate for reuse in the permeation step.
（前処理されたセルロース含有材料）
本明細書の開示によれば、セルロース含有材料に、[Bmim][OAc]を浸透処理させて得られる、酵素処理用のセルロース含有材料が提供される。この材料によれば、セルラーゼ処理に適した状態に、セルロースの構造が緩和されているため、効果的にセルラーゼ糖化が可能となっている。浸透は、すでに説明した浸透工程と同様に処理されることが好ましい。また、すでに説明した固液分離工程と同様の処理がなされていてもよい。本明細書に開示される前処理されたセルロース含有材料は、[Bmim][OAc]を含有するとともに、結晶性の低下したセルロースを備えていることを特徴としている。
(Pretreated cellulose-containing material)
According to the disclosure of the present specification, a cellulose-containing material for enzyme treatment, which is obtained by infiltrating [Bmim] [OAc] into a cellulose-containing material, is provided. According to this material, since the structure of cellulose is relaxed to a state suitable for cellulase treatment, cellulase saccharification can be effectively performed. The infiltration is preferably treated in the same way as the infiltration process already described. Moreover, the process similar to the already described solid-liquid separation process may be made | formed. The pretreated cellulose-containing material disclosed in the present specification is characterized in that it contains [Bmim] [OAc] and has cellulose with reduced crystallinity.
（セルロース含有材料の分解産物の生産方法）
本明細書の開示によれば、図２に示すように、前記浸透工程と、セルロース含有材料中のセルロースをセルラーゼを用いて分解する工程と、を備えるセルロース含有材料の分解産物の生産方法が提供される。本明細書に開示される生産方法によれば、セルロース含有材料中のセルロースは、[Bmim][OAc]によりセルラーゼによる分解に適した状態に緩和され、セルラーゼに暴露されやすい状態となっているため、セルラーゼにより効率的に分解される。また、セルロース含有材料中に[Bmim][OAc]が残留保持されていたとしても、酵素反応への悪影響が回避又は抑制されているため、[Bmim][OAc]の除去を高精度に行う必要がないため、工程を簡略化できる。
(Production method of degradation products of cellulose-containing materials)
According to the disclosure of the present specification, as shown in FIG. 2, there is provided a method for producing a degradation product of a cellulose-containing material, comprising the permeation step and a step of degrading cellulose in the cellulose-containing material using cellulase. Is done. According to the production method disclosed in the present specification, the cellulose in the cellulose-containing material is relaxed to a state suitable for cellulase degradation by [Bmim] [OAc] and is easily exposed to cellulase. It is efficiently degraded by cellulase. In addition, even if [Bmim] [OAc] remains in the cellulose-containing material, the adverse effect on the enzyme reaction is avoided or suppressed, so it is necessary to remove [Bmim] [OAc] with high accuracy. Since there is no, the process can be simplified.
本明細書に開示されるセルロース分解産物の生産方法における浸透工程は、本明細書に開示される処理方法において説明した各種の態様をそのまま適用することができる。また、適宜、固液分離工程、洗浄工程及び再利用工程を実施してもよい。なお、セルロースの分解産物としては、セルロースの低分子化されたものであればよい。より具体的には、最終分解産物であるグルコースのほか、セロビオース及びセロオリゴ糖が挙げられる。 The various aspects demonstrated in the processing method disclosed by this specification can be applied as it is to the osmosis | permeation process in the production method of the cellulose degradation product disclosed by this specification. Moreover, you may implement a solid-liquid separation process, a washing | cleaning process, and a reuse process suitably. In addition, as a decomposition product of cellulose, any cellulose having a low molecular weight may be used. More specifically, there are cellobiose and cellooligosaccharide in addition to glucose which is the final degradation product.
（セルロース分解工程）
セルロース分解工程は、セルラーゼを用いてセルロース含有材料中のセルロースを分解する。セルラーゼは、セルロースをグルコースにまで加水分解するのに作用する各種の酵素の総称である。セルラーゼとしては、狭義には、β１，４−エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、グルカン１，４−βグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）、セルロース１，４−βセロビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、βグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）等が挙げられる。また、セルラーゼは、天然由来であっても人工的に改変されたものであってもよい。天然由来のものとしては、特に限定しないが、Trichoderma属又はAspergillus属由来のセルラーゼなどを好ましく用いることができる。また、７０℃以上で高い活性を示し、９０℃から１００℃でも活性を維持する耐熱性セルラーゼを用いることもできる。例えば、Pyrococcus属に代表される超好熱性古細菌由来のセルラーゼであってもよい。本発明においては、上記した狭義のセルラーゼを１種類又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。異種のセルラーゼでなく、同種であっても２種類以上組み合わせてもよい。また、由来の異なるセルラーゼを組み合わせて用いることもできる。また、セルラーゼは、適当な担体に保持された形態であってもよい。
(Cellulose decomposition process)
In the cellulose decomposition step, cellulase is used to decompose cellulose in the cellulose-containing material. Cellulase is a general term for various enzymes that act to hydrolyze cellulose to glucose. As cellulases, β1,4-endoglucanase (EC 3.2.1.4), glucan 1,4-β glucosidase (EC 3.2.1.74), cellulose 1,4-β cellobiosidase (EC 3) are narrowly defined. 2.1.91), β-glucosidase (EC 3.2.1.21) and the like. The cellulase may be naturally derived or artificially modified. Although it does not specifically limit as a thing of natural origin, The cellulase derived from the genus Trichoderma or Aspergillus etc. can be used preferably. A thermostable cellulase that exhibits high activity at 70 ° C. or higher and maintains activity at 90 ° C. to 100 ° C. can also be used. For example, it may be a cellulase derived from a hyperthermophilic archaea represented by the genus Pyrococcus. In the present invention, the above-mentioned narrowly defined cellulases can be used singly or in combination of two or more. Instead of different types of cellulases, they may be the same type or a combination of two or more types. In addition, cellulases having different origins can be used in combination. The cellulase may be in a form held on a suitable carrier.
また、セルロース分解工程では、植物細胞壁においてセルロースと複合体を形成しているヘミセルロースを分解する酵素を用いることもできる。ヘミセルロースとしては、キシラン、マンナン、グルコマンナン等が挙げられる。ヘミセルロースの分解酵素としては、キシラナーゼ等が挙げられ、こうした酵素は、上記のTrichoderma属、Aspergillus属等のセルロース分解性微生物に由来するものであってもよい。また、Pyrococcus属に代表される超好熱性古細菌由来のセルラーゼなどの好熱性セルラーゼであってもよい。 In the cellulose decomposition step, an enzyme that decomposes hemicellulose forming a complex with cellulose in the plant cell wall can also be used. Examples of hemicellulose include xylan, mannan, glucomannan and the like. Examples of hemicellulose-degrading enzymes include xylanase and the like, and these enzymes may be derived from cellulolytic microorganisms such as the above-mentioned genus Trichoderma and Aspergillus. Further, it may be a thermophilic cellulase such as a cellulase derived from a hyperthermophilic archaea represented by the genus Pyrococcus.
浸透処理後のセルロース含有材料に対しては、[Bmim][OAc]の効率的な回収及び再利用の観点から、固液分離を実施後のセルロース含有材料にセルラーゼを供給し分解工程を実施することが好ましい。 For cellulose-containing materials after osmosis treatment, cellulase is supplied to the cellulose-containing material after solid-liquid separation from the viewpoint of efficient recovery and reuse of [Bmim] [OAc], and a decomposition process is performed. It is preferable.
浸透処理後のセルロース含有材料には、緩和されたセルロース又はセルロース含有マトリックス中に[Bmim][OAc]が保持されている。洗浄工程を実施しない固液分離後であっても、セルロース又はセルロース含有マトリックス中には[Bmim][OAc]が保持されたままとなっているといえる。こうした状態のセルロースに対してセルラーゼによる分解を実施しても、[Bmim][OAc]のセルラーゼへの悪影響が抑制されているか、あるいはBmim][OAc]によるセルロースの構造緩和によるセルラーゼのアタック性向上効果が、[Bmim][OAc]のセルラーゼへの悪影響を上回っていると考えられる。固液分離後であっても、[Bmim][OAc]はセルロース又はセルロース含有マトリックス中に保持されていると考えられる。したがって、本セルロース分解工程は、洗浄工程を実施しない場合には、[Bmim][OAc]の存在下に、セルロース含有材料中のセルロースをセルラーゼで分解する工程であるといえる。 [Bmim] [OAc] is retained in the cellulose-containing material after the infiltration treatment in a relaxed cellulose or a cellulose-containing matrix. Even after solid-liquid separation without performing the washing step, it can be said that [Bmim] [OAc] remains retained in the cellulose or cellulose-containing matrix. Even if cellulase is decomposed into cellulose in such a state, the adverse effect of [Bmim] [OAc] on cellulase is suppressed, or the attack of cellulase is improved by relaxation of cellulose structure by Bmim] [OAc] The effect is considered to exceed the adverse effect of [Bmim] [OAc] on cellulase. Even after solid-liquid separation, [Bmim] [OAc] is considered to be retained in the cellulose or cellulose-containing matrix. Therefore, it can be said that the cellulose decomposition step is a step of decomposing cellulose in the cellulose-containing material with cellulase in the presence of [Bmim] [OAc] when the washing step is not performed.
また、セルラーゼは、セルロース含有材料に対する貧溶媒であってセルロースの分解産物に対する親溶媒である溶媒の存在下に、セルロース含有材料に接触されることが好ましい。こうした溶媒を用いることで、セルロース分解産物を溶媒である液相に確保できるとともに、セルロース含有材料中の未分解部分や本来的にセルラーゼでは分解不能な残渣（例えば、リグニン等）を固相に保持することができる。 Cellulase is preferably contacted with the cellulose-containing material in the presence of a solvent that is a poor solvent for the cellulose-containing material and is a parent solvent for the degradation product of cellulose. By using these solvents, cellulose degradation products can be secured in the liquid phase of the solvent, and undegraded parts of cellulose-containing materials and residues that cannot be essentially degraded by cellulase (eg, lignin) are retained in the solid phase. can do.
こうした溶媒としては、通常親水性溶媒を用いることができる。また、親水性溶媒は、用いるセルラーゼの至適ｐＨを含む酵素活性に適したｐＨ範囲に一致する範囲に緩衝能を有する緩衝液を用いることが好ましい。一般的なセルラーゼの典型的な好適ｐＨは４〜６程度であるため、例えば、クエン酸緩衝液（クエン酸及びクエン酸ナトリウム）、酢酸緩衝液（酢酸−酢酸ナトリウム）、クエン酸−リン酸緩衝液（クエン酸−リン酸二水素ナトリウム）等が挙げられる。こうした緩衝液の濃度やｐＨを適宜調製して、親水性溶媒相のｐＨを４以上６以下、より確実には、４．０以上６．０以下となるように設定することが好ましい。なお、疎水性イオン液体の特性の変動によるｐＨシフトやｐＨ変動の酵素活性及び分解効率への悪影響を抑制又は回避するためにも十分なｐＨ調整能力のある親水性溶媒を用いることが好ましい。親水性溶媒には、適切な塩濃度を形成するための酸、アルカリあるいは塩類が含まれていてもよい。酵素反応に必要な金属イオンを含めることもできる。 As such a solvent, a hydrophilic solvent can usually be used. In addition, as the hydrophilic solvent, it is preferable to use a buffer solution having a buffer capacity in a range corresponding to the pH range suitable for the enzyme activity including the optimum pH of the cellulase to be used. Since typical preferred pH of general cellulase is about 4 to 6, for example, citrate buffer (citric acid and sodium citrate), acetate buffer (acetic acid-sodium acetate), citrate-phosphate buffer Liquid (citric acid-sodium dihydrogen phosphate) and the like. It is preferable to appropriately adjust the concentration and pH of such a buffer solution and set the pH of the hydrophilic solvent phase to 4 or more and 6 or less, more surely 4.0 or more and 6.0 or less. In addition, it is preferable to use a hydrophilic solvent having a sufficient pH adjusting ability in order to suppress or avoid a pH shift caused by fluctuations in the characteristics of the hydrophobic ionic liquid or adverse effects on enzyme activity and degradation efficiency due to pH fluctuations. The hydrophilic solvent may contain an acid, an alkali or a salt for forming an appropriate salt concentration. Metal ions necessary for the enzymatic reaction can also be included.
セルラーゼによるセルロース分解のための温度や時間は特に限定されない。セルラーゼの種類にもよるが、通常、３０℃〜７０℃程度、好ましくは３５℃〜４５℃程度で、ｐＨ２以上６以下程度とし、数時間から数十時間程度実施する。好熱性セルラーゼを用いる場合は、７０℃以上１００℃以下であってもよい。 The temperature and time for cellulose degradation by cellulase are not particularly limited. Although it depends on the type of cellulase, it is usually about 30 ° C. to 70 ° C., preferably about 35 ° C. to 45 ° C., pH 2 or more and about 6 or less, and is performed for several hours to several tens of hours. When a thermophilic cellulase is used, it may be 70 ° C. or higher and 100 ° C. or lower.
本セルロース分解工程によれば、[Bmim][OAc]によりセルロースマトリックスの構造が緩和されかつ一部が親水性溶媒との界面に露出されているため、セルラーゼがセルロースを攻撃しやすくなっており、親水性溶媒中のセルラーゼがセルロースを効率的に分解することができる。そして、分解の結果得られるグルコースなどセルロースの低分子化物（二糖やオリゴ糖を含む分解産物）は、親水性溶媒に溶解し、親水性溶媒から回収することができる。また、セルロースの低分子化に伴って、新たなセルラーゼのアクセス箇所が親水性媒体に露出されるため、セルラーゼによる分解が促進される。本法によれば、[Bmim][OAc]が親水性イオン液体であるために、セルロース含有材料中のセルロースは、セルラーゼが存在する親水性媒体に露出されやすくなっているからである。また、中間分解産物は、親水性溶媒でセルラーゼによってさらに低分子化される。一方、ヘミセルロース（ヘミセルラーゼを用いる場合を除く）やリグニンなどのセルロース含有材料由来のセルラース以外の炭素源は固相として親水性媒体中に残存される。 According to the present cellulose decomposition step, the structure of the cellulose matrix is relaxed by [Bmim] [OAc] and a part is exposed at the interface with the hydrophilic solvent, so that cellulase is likely to attack the cellulose, Cellulase in the hydrophilic solvent can efficiently decompose cellulose. And the low molecular weight product (decomposition product containing disaccharides or oligosaccharides) of cellulose such as glucose obtained as a result of decomposition can be dissolved in a hydrophilic solvent and recovered from the hydrophilic solvent. In addition, as cellulosic molecular weight decreases, new cellulase access sites are exposed to the hydrophilic medium, so that degradation by cellulase is promoted. This is because according to this method, since [Bmim] [OAc] is a hydrophilic ionic liquid, the cellulose in the cellulose-containing material is easily exposed to the hydrophilic medium in which cellulase is present. Further, the intermediate degradation product is further reduced in molecular weight by cellulase with a hydrophilic solvent. On the other hand, carbon sources other than cellulose derived from cellulose-containing materials such as hemicellulose (except when hemicellulase is used) and lignin remain in the hydrophilic medium as a solid phase.
以上のことから、セルロース分解工程の実施により、親水性溶媒中に、固相としてのセルラーゼ分解残渣と、溶質としてのセルロース分解産物が得られることになる。 From the above, by carrying out the cellulose decomposition step, a cellulase decomposition residue as a solid phase and a cellulose decomposition product as a solute are obtained in a hydrophilic solvent.
（セルロース分解産物の回収工程）
セルロース分解工程の実施後は、適宜、セルロース分解産物の回収工程を実施すればよい。親水性溶媒相を適当な固液分離手段で回収することで、セルロース分解産物を分解残渣と容易に分離できる。回収した親水性溶媒相は、[Bmim][OAc]を固液分離後に分解工程に供されたセルロース含有材料であれば、十分に[Bmim][OAc]の濃度が低減されたものとなっているため、そのまま、たとえば後段で説明する有用物質の生産方法における発酵工程等に利用できる。また、必要に応じて濃縮されてもよい。なお、親水性溶媒相にはセルラーゼが含まれているが、セルラーゼを固相に固定化して用いる等により、公知の方法でセルラーゼの分離回収も可能である。
(Cellulose degradation product recovery process)
What is necessary is just to implement the collection process of a cellulose degradation product suitably after implementation of a cellulose decomposition process. By recovering the hydrophilic solvent phase with an appropriate solid-liquid separation means, the cellulose degradation product can be easily separated from the degradation residue. If the recovered hydrophilic solvent phase is a cellulose-containing material that has been subjected to a decomposition step after solid-liquid separation of [Bmim] [OAc], the concentration of [Bmim] [OAc] is sufficiently reduced. Therefore, it can be used as it is, for example, in the fermentation process in the production method of useful substances described later. Moreover, you may concentrate as needed. Cellulase is contained in the hydrophilic solvent phase, but cellulase can be separated and recovered by a known method, for example, by immobilizing cellulase on a solid phase.
（非セルロース画分の回収工程）
セルロース分解工程実施後の親水性溶媒中の固相残渣を固液分離して回収することもできる。回収した固相は、セルラーゼによる分解残渣であり、セルロース含有材料中の非セルロース画分（典型的にはリグニンであり、ヘミセルラーゼを用いない場合には、ヘミセルロースも含まれる。）を回収できる。この残渣を、芳香族系高分子であるリグニンを高率で含有しており、かつ、過度な縮合等が抑制されているため、多種の用途に利用が可能である。また、リグニンを分解する酵素と接触させることで、フェノール系化合物を得ることもできる。さらに、この固相残渣に、セルロースを含有する場合には、再度、セルラーゼと接触させてセルロース分解工程を繰り返し実施して、セルロースの利用率を向上させることができる。
(Recovery process of non-cellulose fraction)
The solid phase residue in the hydrophilic solvent after the cellulose decomposition step can be recovered by solid-liquid separation. The recovered solid phase is a decomposition residue by cellulase, and a non-cellulose fraction in the cellulose-containing material (typically lignin, and if hemicellulase is not used, hemicellulose is also included) can be recovered. Since this residue contains lignin, which is an aromatic polymer, at a high rate and excessive condensation is suppressed, it can be used for various applications. Moreover, a phenol type compound can also be obtained by making it contact with the enzyme which decomposes | disassembles a lignin. Furthermore, when the solid phase residue contains cellulose, it can be contacted with cellulase again, and the cellulose decomposition step can be repeated to improve the utilization rate of cellulose.
以上説明したように、本明細書に開示されるセルロース分解産物の生産方法によれば、用いた[Bmim][OAc]及びセルロース分解産物の回収等が容易なより実用的なセルロース含有材料の利用が可能となる。なお、本明細書に開示される実施形態の典型例を図４に示す。上段は、[Bmim][ＯAc]が通液可能な通液部（フィルター）を少なくとも一部に有する容器にリグノセルロース等の実バイオマスを収容して、[Bmim][ＯAc]に浸漬して浸透工程を実施し、その後、[Bmim][ＯAc]から容器を取り出すとともに処理後の実バイオマスを加圧することにより。実バイオマスと[Bmim][ＯAc]との固液分離工程を実施し、その後、容器内の実バイオマスから[Bmim][ＯAc]をさらに除去する洗浄工程を実施し、その後、容器ごとセルロース分解工程を実施する形態を示す。また、下段は、上段の工程群から洗浄工程を省略した形態を示す。 As described above, according to the method for producing a cellulose degradation product disclosed in the present specification, [Bmim] [OAc] and the use of a more practical cellulose-containing material in which the cellulose degradation product can be easily recovered. Is possible. A typical example of the embodiment disclosed in this specification is shown in FIG. The upper row contains real biomass such as lignocellulose in a container having at least part of a fluid passage (filter) through which [Bmim] [OAc] can pass, and is immersed in [Bmim] [OAc]. By carrying out the process and then removing the container from [Bmim] [OAc] and pressurizing the real biomass after treatment. A solid-liquid separation process between real biomass and [Bmim] [OAc] is performed, and then a washing process is performed to further remove [Bmim] [OAc] from the actual biomass in the container. The form which implements is shown. The lower part shows a form in which the cleaning process is omitted from the upper process group.
（有用物質の生産方法）
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、上記したセルロースの分解産物の生産方法によって得られるセルロース分解産物を含む炭素源を用いて酵母などの微生物の発酵によって有用物質を生産する工程（以下、単に発酵工程ともいう。）を備えることができる。この生産方法によれば、セルロース含有材料から効率的に分解回収されたセルロース分解産物を用いることで、全体としての製造コストを低減することができる。
(Useful substance production method)
The method for producing a useful substance disclosed in the present specification comprises a step of producing a useful substance by fermentation of microorganisms such as yeast using a carbon source containing a cellulose degradation product obtained by the above-described method for producing a cellulose degradation product ( Hereinafter, it is also simply referred to as a fermentation process.). According to this production method, the manufacturing cost as a whole can be reduced by using the cellulose degradation product efficiently decomposed and recovered from the cellulose-containing material.
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、既に説明した浸透工程、セルロース分解工程及び発酵工程を備える形態を採ることができる。炭素源としては、セルロース分解産物の生産方法におけるセルロース分解工程で得られたセルロース分解産物を用いる。本生産方法において用いるセルロース分解産物は、セルロース分解工程後の親水性溶媒相、その濃縮物、又は親水性溶媒相から分離回収されたものであってもよい。上述したように親水性溶媒相は、[Bmim][OAc]の含有量が十分に低減されている場合、そのままであっても発酵工程に供することができる。したがって、例えば、セルロース分解工程後の親水性溶媒相等を発酵用の培地の一部として用いることができる。なお、発酵工程に先立って、非セルロース画分の回収工程を実施してもよいが、発酵工程後に、非セルロース画分の回収工程を実施することもできる。 The production method of a useful substance disclosed in the present specification can take a form including the permeation process, the cellulose decomposition process, and the fermentation process described above. As a carbon source, the cellulose degradation product obtained by the cellulose degradation process in the production method of a cellulose degradation product is used. The cellulose degradation product used in this production method may be separated and recovered from the hydrophilic solvent phase after the cellulose decomposition step, its concentrate, or the hydrophilic solvent phase. As described above, when the content of [Bmim] [OAc] is sufficiently reduced, the hydrophilic solvent phase can be used as it is in the fermentation process. Therefore, for example, the hydrophilic solvent phase after the cellulose decomposition step and the like can be used as a part of the fermentation medium. In addition, although the collection process of a non-cellulose fraction may be implemented prior to a fermentation process, the collection process of a non-cellulose fraction can also be implemented after a fermentation process.
発酵工程で用いる微生物は、特に限定しないで、セルロースの分解産物を資化可能であって生産しようとする有用物質の種類に応じて適宜選択される。セルロース分解産物は、グルコースが主であるが、分解工程の実施態様によっては、二糖、オリゴ糖、ヘミセルロース由来のキシラン等であってもよい。例えば、酵母やカビなどの真菌類や大腸菌等の微生物が挙げられる。微生物は、野生型であってもよいし、遺伝子工学的技術等によって人為的にセルロース分解産物を効率的に資化可能に改変されたり、有用物質を生産可能に改変されたりしたものであってもよい。典型的には、エタノールを生産する酵母などの微生物が挙げられる。また、有機酸を生産する酵母や乳酸菌であってもよい。 The microorganism used in the fermentation process is not particularly limited, and is appropriately selected according to the type of useful substance that can assimilate the degradation product of cellulose and is to be produced. The cellulose degradation product is mainly glucose, but it may be disaccharide, oligosaccharide, hemicellulose-derived xylan, etc. depending on the embodiment of the degradation process. For example, fungi such as yeast and mold, and microorganisms such as E. coli. The microorganism may be a wild type, artificially modified so as to efficiently assimilate cellulose degradation products by genetic engineering techniques, etc., or modified so that useful substances can be produced. Also good. A typical example is a microorganism such as yeast that produces ethanol. Moreover, the yeast and lactic acid bacteria which produce an organic acid may be sufficient.
発酵工程は、用いる微生物の種類や生産しようとする有用物質に応じて実施すればよい。発酵のための培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、数時間〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。なお、変換工程終了後、培養液から微生物を除去してエタノール等の有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを濃縮する工程を実施してもよい。 What is necessary is just to implement a fermentation process according to the kind of microorganisms to be used and the useful substance which it is going to produce. For the culture for fermentation, stationary culture, shaking culture, aeration-agitation culture, or the like can be used. The aeration conditions can be appropriately selected from anaerobic conditions, microaerobic conditions, aerobic conditions, and the like. The culture temperature is not particularly limited, but may be in the range of 25 ° C to 55 ° C. Moreover, although culture | cultivation time is also set as needed, it can be set as several hours-about 150 hours. The pH can be adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like. During the culture, antibiotics such as ampicillin and tetracycline can be added to the medium as necessary. In addition, after completion | finish of a conversion process, you may implement the process of removing microorganisms from a culture solution, collect | recovering fractions containing useful substances, such as ethanol, and also concentrating this.
有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましい。例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、乳酸等の有機酸、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。 Although it does not specifically limit as a useful substance, The thing which can produce | generate microorganisms using glucose is preferable. For example, lower alcohols such as ethanol, propanol, isopropanol, butanol and isobutanol, fine chemicals (coenzyme Q10, vitamins and their raw materials, etc.) by adding an isoprenod synthesis route, organic acids such as lactic acid, glycerin and plastics by modifying glycolysis -Materials targeted by biorefinery technology, such as chemical raw materials.
以上説明したように、本明細書に開示される有用物質の生産方法によれば、従来に比してより効率的に得られたセルロース分解産物を利用するため、有用物質の生産コストを効果的に低減することができる。 As described above, according to the useful substance production method disclosed in the present specification, the cellulose degradation product obtained more efficiently than the conventional method is used, so the production cost of the useful substance is effectively reduced. Can be reduced.
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited to a following example.
（バイオマス処理に最適なイオン液体の選抜）
４種類のイオン液体１．０ｇをバイアル瓶に採取し、これに３０ｍｇのバイオマス試料を加えた。バイオマスとしては、カッターミルで破砕処理した粒径２５０μｍスギとユーカリ粉末を使用した。これを１２０℃にて１時間処理し、１５ｍｌの滅菌水にて洗浄した。処理試料にクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）９．９ｍｌを添加した後、セルラーゼ混合溶液０．１ｍｌを添加した。本試料を４０℃にて、糖化反応を実施した。
(Selection of ionic liquids suitable for biomass processing)
Four kinds of ionic liquids 1.0 g were collected in a vial, and 30 mg of a biomass sample was added thereto. As biomass, cedar and eucalyptus powder having a particle size of 250 μm, which was crushed by a cutter mill, were used. This was treated at 120 ° C. for 1 hour and washed with 15 ml of sterilized water. After adding 9.9 ml of citrate buffer (pH 5.0) to the treated sample, 0.1 ml of the cellulase mixed solution was added. This sample was subjected to a saccharification reaction at 40 ° C.
イオン液体としては、1-Ethyl-3-methylimidazolium diethylphosphate(以下、[Emim][DEP]と称す)、2-Hydroxyethyl-trimethylammonium acetate (以下、[Cholin][OAc]と称す)、1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate (以下、[Emim][OAc]と称す) 1-Butyl-3-methylimidazolium acetate (以下、[Bmim][OAc]と称す)を使用した。なお、それぞれの構造式を以下に示す。 Examples of ionic liquids include 1-Ethyl-3-methylimidazolium diethylphosphate (hereinafter referred to as [Emim] [DEP]), 2-Hydroxyethyl-trimethylammonium acetate (hereinafter referred to as [Cholin] [OAc]), 1-Ethyl-3 -Methylimidazolium Acetate (hereinafter referred to as [Emim] [OAc]) 1-Butyl-3-methylimidazolium acetate (hereinafter referred to as [Bmim] [OAc]) was used. Each structural formula is shown below.
糖化反応におけるセルラーゼ混合溶液は、Treichoderma reeseiATCC26921からなるNovozyme-Celluclast (Sigma-Aldrich) と Aspergillus nigerからなるNovozyme 188 (Sigma-Aldrich) を５：１の割合で混合させたものを、６ＦＰＵ／ｇバイオマスになるよう添加した。 Cellulase mixture in glycation, a Novozyme 188 consisting of Novozyme-Celluclast (Sigma-Aldrich) and Aspergillus niger consisting Treichoderma reeseiATCC26921 (Sigma-Aldrich) 5: those were mixed at a ratio of 1, the 6FPU / g biomass Was added.
糖化反応の試料より、３，８，２４，４８，７２時間後にサンプリングし、溶液中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度の測定には、バイオセンサＢＦ−５（王子計測機器）を用い、操作の詳細は付属のプロトコールに従った。得られたグルコース濃度をもとに、各バイオマス中に含有されるセルロースを１００とした場合の糖への変換効率（糖化率）を、以下の計算式に従って算出した。
グルコース変換効率 (%) = [produced glucose] / [glucose units in cellulose]×100
Sampling was performed after 3, 8, 24, 48, and 72 hours from the saccharification reaction sample, and the glucose concentration in the solution was measured. Biosensor BF-5 (Oji Scientific Instruments) was used for measuring the glucose concentration, and the details of the operation were in accordance with the attached protocol. Based on the obtained glucose concentration, the conversion efficiency (saccharification rate) to sugar when the cellulose contained in each biomass was 100 was calculated according to the following formula.
Glucose conversion efficiency (%) = [produced glucose] / [glucose units in cellulose] × 100
各バイオマスあたりにおける変換効率の７２時間時点でのグラフを図５にまとめた。比較の結果、スギやユーカリといったハード系バイオマスの糖化に、[Bmim][OAc]が適していることが確認された。なお、独立した同様の試験を3回実施したが、いずれも同様の結果になった。 A graph of the conversion efficiency per biomass at 72 hours is summarized in FIG. As a result of comparison, [Bmim] [OAc] was confirmed to be suitable for saccharification of hard biomass such as cedar and eucalyptus. In addition, the same independent test was carried out three times.
（バイオマス処理に最適なイオン液体の選抜（バイオマス粒径の検討））
バイオマスの粒径を大きくした場合におけるイオン液体の処理検討を実施した。イオン液体としては、[Emim][OAc] 、[Bmim][OAc]を使用した。すなわち、２種類のイオン液体１．０ｇをバイアル瓶に採取し、これに３０ｍｇのバイオマス試料を加えた。バイオマスとしては、カッターミルで破砕処理した粒径４ｍｍのスギとユーカリ粉末を使用した。これを１２０℃にて１時間処理し、１５ｍｌの滅菌水にて洗浄した。処理試料にクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）９．９ｍｌを添加した後、セルラーゼ混合溶液０．１ｍｌを添加した。本試料を４０℃にて、糖化反応を実施した。
(Selection of ionic liquids suitable for biomass treatment (examination of biomass particle size))
We examined the treatment of ionic liquid when the particle size of biomass was increased. [Emim] [OAc] and [Bmim] [OAc] were used as the ionic liquid. That is, 1.0 g of two kinds of ionic liquids were collected in a vial, and 30 mg of a biomass sample was added thereto. As biomass, cedar and eucalyptus powder having a particle diameter of 4 mm, which was crushed by a cutter mill, were used. This was treated at 120 ° C. for 1 hour and washed with 15 ml of sterilized water. After adding 9.9 ml of citrate buffer (pH 5.0) to the treated sample, 0.1 ml of the cellulase mixed solution was added. This sample was subjected to a saccharification reaction at 40 ° C.
糖化反応におけるセルラーゼ混合溶液は、Treichoderma reeseiATCC26921からなるNovozyme-Celluclast (Sigma-Aldrich) と Aspergillus nigerからなるNovozyme 188 (Sigma-Aldrich) を５：１の割合で混合させたものを、６ＦＰＵ／ｇバイオマスになるよう添加した。 Cellulase mixture in glycation, a Novozyme 188 consisting of Novozyme-Celluclast (Sigma-Aldrich) and Aspergillus niger consisting Treichoderma reeseiATCC26921 (Sigma-Aldrich) 5: those were mixed at a ratio of 1, the 6FPU / g biomass Was added.
糖化反応の試料より、３，８，２４，４８，７２時間後にサンプリングし、溶液中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度の測定には、バイオセンサＢＦ−５（王子計測機器）を用い、操作の詳細は付属のプロトコールに従った。得られたグルコース濃度をもとに、各バイオマス中に含有されるセルロースを１００とした場合の糖への変換効率を、以下の計算式に従って算出した。
グルコース変換効率 (%) = [produced glucose] / [glucose units in cellulose]×100
Sampling was performed after 3, 8, 24, 48, and 72 hours from the saccharification reaction sample, and the glucose concentration in the solution was measured. Biosensor BF-5 (Oji Scientific Instruments) was used for measuring the glucose concentration, and the details of the operation were in accordance with the attached protocol. Based on the obtained glucose concentration, the conversion efficiency to sugar when the cellulose contained in each biomass was taken as 100 was calculated according to the following formula.
Glucose conversion efficiency (%) = [produced glucose] / [glucose units in cellulose] × 100
各バイオマスあたりにおける変換効率の７２時間時点でのグラフを図６にまとめた。比較の結果、スギやユーカリといったハード系バイオマスの糖化に、[Bmim][OAc]が適していることが確認された。なお、独立した同様の試験を３回実施したが、いずれも同様の結果になった。 The graph of the conversion efficiency for each biomass at 72 hours is summarized in FIG. As a result of comparison, [Bmim] [OAc] was confirmed to be suitable for saccharification of hard biomass such as cedar and eucalyptus. In addition, although the independent similar test was implemented 3 times, all became the same result.
（洗浄工程の除去した簡易プロセスでの検討）
イオン液体[Emim][DEP]５０ｇをビーカーに採取し、これに３００ｍｇのバイオマス試料を加えた。バイオマスとしては、カッターミルで破砕処理した粒径４ｍｍのバガス粉末を使用し、これを茶越しに添加させた。本試料を、１２０℃にて１時間処理させた後、茶越しをそのまま、セルラーゼ混合溶液０．１ｍｌを含有させたクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍｌに添加した。本試料を４０℃にて、糖化反応を実施した。
(Examination of simple process with washing process removed)
50 g of ionic liquid [Emim] [DEP] was collected in a beaker, and 300 mg of a biomass sample was added thereto. As biomass, bagasse powder having a particle diameter of 4 mm, which was crushed by a cutter mill, was used, and this was added over tea. This sample was treated at 120 ° C. for 1 hour, and then added to 50 ml of citrate buffer (pH 5.0) containing 0.1 ml of the cellulase mixed solution as it was over the tea. This sample was subjected to a saccharification reaction at 40 ° C.
糖化反応におけるセルラーゼ混合溶液は、Treichoderma reeseiATCC26921からなるNovozyme-Celluclast (Sigma-Aldrich) と Aspergillus nigerからなるNovozyme 188 (Sigma-Aldrich) を５：１の割合で混合させたものを、６ＦＰＵ／ｇバイオマスになるよう添加した。 Cellulase mixture in glycation, a Novozyme 188 consisting of Novozyme-Celluclast (Sigma-Aldrich) and Aspergillus niger consisting Treichoderma reeseiATCC26921 (Sigma-Aldrich) 5: those were mixed at a ratio of 1, the 6FPU / g biomass Was added.
糖化反応の試料より、０，２，４，６，２２，２４，２６，３０，４８，１１８時間後にサンプリングし、溶液中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度の測定には、バイオセンサＢＦ−５（王子計測機器）を用い、操作の詳細は付属のプロトコールに従った。得られたグルコース濃度をもとに、各バイオマス中に含有されるセルロースを１００とした場合の糖への変換効率を、以下の計算式に従って算出した。
グルコース変換効率 (%) = [produced glucose] / [glucose units in cellulose]×100
Sampling was performed after 0, 2, 4, 6, 22, 24, 26, 30, 48, and 118 hours from the sample of the saccharification reaction, and the glucose concentration in the solution was measured. Biosensor BF-5 (Oji Scientific Instruments) was used for measuring the glucose concentration, and the details of the operation were in accordance with the attached protocol. Based on the obtained glucose concentration, the conversion efficiency to sugar when the cellulose contained in each biomass was taken as 100 was calculated according to the following formula.
Glucose conversion efficiency (%) = [produced glucose] / [glucose units in cellulose] × 100
各バイオマスあたりにおける変換効率の経時変化を図７にまとめた。その結果、洗浄工程を省いた簡易プロセスであっても、糖化が進行し、８０％と高い糖化効率を示すことがわかった。 FIG. 7 summarizes the change over time in the conversion efficiency for each biomass. As a result, it was found that saccharification progressed and a high saccharification efficiency of 80% was obtained even in a simple process without a washing step.
（[Bmim][OAc]と同様のカチオンを保有するイオン液体での検討）
５種類のイオン液体１．０ｇをバイアル瓶に採取し、これに３０ｍｇのバイオマス試料を加えた。バイオマスとしては、カッターミルで破砕処理した粒径２５０μｍのスギとユーカリ粉末を使用した。これを１２０℃にて１時間処理し、１５ｍｌの滅菌水にて洗浄した。処理試料にクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）９．９ｍｌを添加した後、セルラーゼ混合溶液０．１ｍｌを添加した。本試料を４０℃にて、糖化反応を実施した。
(Studies on ionic liquids with cations similar to [Bmim] [OAc])
Five kinds of ionic liquids 1.0 g were collected in a vial, and 30 mg of a biomass sample was added thereto. As biomass, cedar and eucalyptus powder having a particle size of 250 μm, which was crushed by a cutter mill, were used. This was treated at 120 ° C. for 1 hour and washed with 15 ml of sterilized water. After adding 9.9 ml of citrate buffer (pH 5.0) to the treated sample, 0.1 ml of the cellulase mixed solution was added. This sample was subjected to a saccharification reaction at 40 ° C.
イオン液体としては、1-Butyl-3-methylimidazolium 2(2-methoxyethoxy)ethylsulfate (以下、[Bmim][MEES]と称す)、1-Butyl-3-methylimidazolium iodide (以下、[Bmim][I]と称す)、1-Butyl-3-methylimidazolium trifluoroacetate (以下、[Bmim][CF3CO2]と称す) 1-Butyl-3-methylimidazolium chloride (以下、[Bmim][Cl]と称す) [Bmim][OAc]を使用した。なお、それぞれの構造式を以下に示す。 Examples of ionic liquids include 1-Butyl-3-methylimidazolium 2 (2-methoxyethoxy) ethylsulfate (hereinafter referred to as [Bmim] [MEES]), 1-Butyl-3-methylimidazolium iodide (hereinafter referred to as [Bmim] [I] and 1-Butyl-3-methylimidazolium trifluoroacetate (hereinafter referred to as [Bmim] [CF3CO2]) 1-Butyl-3-methylimidazolium chloride (hereinafter referred to as [Bmim] [Cl]) [Bmim] [OAc] used. Each structural formula is shown below.
糖化反応におけるセルラーゼ混合溶液は、Treichoderma reeseiATCC26921からなるNovozyme-Celluclast (Sigma-Aldrich) と Aspergillus nigerからなるNovozyme 188 (Sigma-Aldrich) を５：１の割合で混合させたものを、６ＦＰＵ／ｇバイオマスになるよう添加した。 Cellulase mixture in glycation, a Novozyme 188 consisting of Novozyme-Celluclast (Sigma-Aldrich) and Aspergillus niger consisting Treichoderma reeseiATCC26921 (Sigma-Aldrich) 5: those were mixed at a ratio of 1, the 6FPU / g biomass Was added.
糖化反応の試料より、０，３，８，２４，４８，７２時間後にサンプリングし、溶液中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度の測定には、バイオセンサＢＦ−５（王子計測機器）を用い、操作の詳細は付属のプロトコールに従った。得られたグルコース濃度をもとに、各バイオマス中に含有されるセルロースを１００とした場合の糖への変換効率を、以下の計算式に従って算出した。
グルコース変換効率 (%) = [produced glucose] / [glucose units in cellulose]×100
Sampling was performed after 0, 3, 8, 24, 48, and 72 hours from the sample of the saccharification reaction, and the glucose concentration in the solution was measured. Biosensor BF-5 (Oji Scientific Instruments) was used for measuring the glucose concentration, and the details of the operation were in accordance with the attached protocol. Based on the obtained glucose concentration, the conversion efficiency to sugar when the cellulose contained in each biomass was taken as 100 was calculated according to the following formula.
Glucose conversion efficiency (%) = [produced glucose] / [glucose units in cellulose] × 100
各バイオマスあたりにおける変換効率の７２時間時点でのグラフを図８にまとめた。比較の結果、カチオンが同様に［Ｂｍｉｍ］であっても糖化効率は様々で、特に[Bmim][OAc]が優れていることが確認された。なお、独立した同様の試験を２回実施したが、いずれも同様の結果になった。 A graph of the conversion efficiency per biomass at 72 hours is summarized in FIG. As a result of comparison, it was confirmed that the saccharification efficiency varies even when the cation is [Bmim], and [Bmim] [OAc] is particularly excellent. In addition, although the independent similar test was implemented twice, all became the same result.
５種類のイオン液体各１．０ｇをバイアル瓶に採取し、これに３０ｍｇのバイオマス試料を加えた。バイオマスとしては、カッターミルで破砕処理した粒径１５０μｍのユーカリ粉末を用いた。これを１２０℃にて３０分間処理し、１５ｍｌの滅菌水にて洗浄した。メンブレンフィルターにてろ過して得られたバイオマス試料をバイアル瓶に採取した。本試料にクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）９．９ｍｌを添加したのち、セルラーゼ混合溶液０．１ｍｌを添加した。これを４０℃にて糖化反応を実施した。 1.0 g of each of the five ionic liquids was collected in a vial, and 30 mg of a biomass sample was added thereto. As the biomass, eucalyptus powder having a particle size of 150 μm that was crushed by a cutter mill was used. This was treated at 120 ° C. for 30 minutes and washed with 15 ml of sterilized water. A biomass sample obtained by filtration through a membrane filter was collected in a vial. After adding 9.9 ml of citrate buffer (pH 5.0) to this sample, 0.1 ml of a cellulase mixed solution was added. This was subjected to a saccharification reaction at 40 ° C.
イオン液体としては、[Bmin][OAc]に加えて以下の５種類を用いた。なお、それぞれの構造式を以下に示す。
1-Allyl-3-methylimidazolium acetate(以下、[Amim][OAc]と称す)
1-Ethyll-3-methylimidazolium acetate(以下、[Emim][OAc]と称す)
1-Allyl-3-methylimidazolium cloride(以下、[Amim][Cl]と称す)
1-Ethyl-3-methylimidazolium cloride(以下、[Emim][Cl]と称す)
1-Buthyl-3-methylimidazolium cloride(以下、[Bmim][Cl]と称す)
As the ionic liquid, in addition to [Bmin] [OAc], the following five types were used. Each structural formula is shown below.
1-Allyl-3-methylimidazolium acetate (hereinafter referred to as [Amim] [OAc])
1-Ethyll-3-methylimidazolium acetate (hereinafter referred to as [Emim] [OAc])
1-Allyl-3-methylimidazolium cloride (hereinafter referred to as [Amim] [Cl])
1-Ethyl-3-methylimidazolium cloride (hereinafter referred to as [Emim] [Cl])
1-Buthyl-3-methylimidazolium cloride (hereinafter referred to as [Bmim] [Cl])
糖化反応におけるセルラーゼ混合溶液は、Trichoderma reesei ATCC26921からなるNovozyme-Celluclast（Sigma-Aldrich）とAspergillus nigerからなるNovozyme188（Sigma-Aldrich）を５：１の割合で混合したものを６ＦＰＵ／ｇバイオマスとなるよう添加した。 Cellulase mixture in glycation, Trichoderma reesei consisting ATCC26921 Novozyme-Celluclast (Sigma-Aldrich) and consisting of Aspergillus niger Novozyme188 (Sigma-Aldrich) 5: To a 6FPU / g biomass in a mixing ratio of 1 Added.
糖化反応の試料より７２時間後にサンプリングし、溶液中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度の測定には、バイオセンサＢＦ−５（王子計測機器）を用い、操作の詳細は、付属のプロトコールに従った。得られたグルコース濃度をもとに、バイオマス中に含有するセルロースを１００とした場合の糖への変換効率を、実施例１と同様にして算出した。 Sampling was performed 72 hours after the saccharification reaction sample, and the glucose concentration in the solution was measured. Biosensor BF-5 (Oji Scientific Instruments) was used for measuring the glucose concentration, and details of the operation were in accordance with the attached protocol. Based on the obtained glucose concentration, the conversion efficiency to sugar when the cellulose contained in the biomass was 100 was calculated in the same manner as in Example 1.
バイオマスあたりにおける変換効率の７２時間時点でのグラフを図９に示す。図９に示すように、いずれのイオン液体を用いても、［Bmin][OAc]による変換効率（７８．３％）に到達することはなく、［Bmin][OAc]の変換効率への寄与が特に大きいことがわかった。以上のことからも、スギやユーカリといったハード系（木質系）バイオマスの糖化には、[Bmin][OAc]が適していることがわかった。 A graph of the conversion efficiency per biomass at 72 hours is shown in FIG. As shown in FIG. 9, the conversion efficiency by [Bmin] [OAc] (78.3%) is not reached with any ionic liquid, and the contribution of [Bmin] [OAc] to the conversion efficiency Was found to be particularly large. From the above, it was found that [Bmin] [OAc] is suitable for saccharification of hard (woody) biomass such as cedar and eucalyptus.
（前処理の最適化）
２種類の各イオン液体（[Emim][OAc]と[Bmim][OAc]）各１．０ｇをバイアル瓶に採取し、これに３０ｍｇのバイオマス試料を加えた。バイオマスとしては、カッターミルで破砕処理した粒径２５０μｍ及び１５０μｍのユーカリ粉末を使用した。これを１２０℃にて３０分及び１時間それぞれ処理し、１５ｍｌの滅菌水にて洗浄した。処理試料にクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）９．９ｍｌを添加した後、セルラーゼ混合溶液０．１ｍｌを添加した。本試料を４０℃にて、糖化反応を実施した。なお、それぞれｎ＝３で試験した。
(Pre-processing optimization)
1.0 g of each of the two types of ionic liquids ([Emim] [OAc] and [Bmim] [OAc]) was collected in a vial, and 30 mg of a biomass sample was added thereto. As the biomass, eucalyptus powder having a particle size of 250 μm and 150 μm, which was crushed by a cutter mill, was used. This was treated at 120 ° C. for 30 minutes and 1 hour, respectively, and washed with 15 ml of sterilized water. After adding 9.9 ml of citrate buffer (pH 5.0) to the treated sample, 0.1 ml of the cellulase mixed solution was added. This sample was subjected to a saccharification reaction at 40 ° C. In addition, it tested by n = 3, respectively.
糖化反応におけるセルラーゼ混合溶液は、実施例１と同様の混合溶液を同様量加えた。また、糖化反応（７２時間）及びグルコースへの変換効率（７２時間時点）の算出も実施例１と同様に実施した。結果を図１０に示す。 The same amount of the same mixed solution as in Example 1 was added to the cellulase mixed solution in the saccharification reaction. Moreover, the calculation of the saccharification reaction (72 hours) and the conversion efficiency to glucose (72 hours) was also carried out in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG.
図１０に示すように、実施例２において、粒径４ｍｍのバイオマスでは大幅な糖化効率の低下が観察されたが、粒径２５０μｍ及び１５０μｍでは大きな差がないことが確認された。また前処理時間についても、１２０℃での反応においては、３０分処理、１２０分処理に差がないことが認められた。 As shown in FIG. 10, in Example 2, a significant decrease in saccharification efficiency was observed for biomass with a particle size of 4 mm, but it was confirmed that there was no significant difference between the particle sizes of 250 μm and 150 μm. In addition, regarding the pretreatment time, it was confirmed that there was no difference between the 30 minute treatment and the 120 minute treatment in the reaction at 120 ° C.
Claims (11)
以下の工程（ａ）：
（ａ）前記セルロース含有材料とイオン液体１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム アセテートとを接触させて前記セルロース含有材料中に前記イオン液体を浸透させる工程、
を備える、方法。 A method for treating a cellulose-containing material,
The following step (a):
(A) contacting the cellulose-containing material with ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium acetate to infiltrate the ionic liquid into the cellulose-containing material;
A method comprising:
前記工程（ａ）は、前記セルロース含有材料及び前記イオン液体を加熱することを含む、請求項１に記載の方法。 The cellulose-containing material is
The method of claim 1, wherein step (a) comprises heating the cellulose-containing material and the ionic liquid.
（ｂ）前記セルロース含有材料と前記イオン液体とを固液分離する工程、
を備える、請求項１又は２に記載の方法。 Further, after the step (a), the following step (b):
(B) solid-liquid separation of the cellulose-containing material and the ionic liquid;
The method according to claim 1, comprising:
（ｃ）前記セルロース含有材料を前記イオン液体の親溶媒で洗浄する工程、
を備える、請求項３に記載の方法。 Further, after the step (b), the following step (c):
(C) washing the cellulose-containing material with a parent solvent of the ionic liquid;
The method of claim 3 comprising:
（ｄ）前記セルロース含有材料から分離された前記イオン液体を回収し、前記工程（ａ）に供給する工程、
を備える、請求項３又は４に記載の方法。 Further, after the step (b), the following step (d):
(D) recovering the ionic liquid separated from the cellulose-containing material and supplying it to the step (a);
The method according to claim 3 or 4, comprising:
以下の工程（ａ）及び（ｅ）：
（ａ）セルロース含有材料とイオン液体１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム アセテートとを接触させて前記セルロース含有材料中に前記イオン液体を浸透させる工程、
（ｅ）前記セルロース含有材料中のセルロースをセルラーゼで用いて分解する工程、
を備える、方法。 A method for producing a cellulose degradation product,
The following steps (a) and (e):
(A) contacting the cellulose-containing material with ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium acetate to infiltrate the ionic liquid into the cellulose-containing material;
(E) a step of decomposing cellulose in the cellulose-containing material using cellulase,
A method comprising:
（ｆ）前記セルラーゼによる分解残渣を固液分離して前記セルロース含有材料中の非セルロース画分を回収する工程、
を備える、請求項７又は８に記載の方法。 Further, after the step (e), the following step (f):
(F) a step of recovering a non-cellulose fraction in the cellulose-containing material by solid-liquid separation of the decomposition residue by the cellulase,
A method according to claim 7 or 8, comprising:
以下の工程（ａ）、（ｅ）及び（ｇ）：
（ａ）セルロース含有材料とイオン液体１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム アセテートとを接触させて前記セルロース含有材料中に前記イオン液体を浸透させる工程、
（ｅ）前記セルロース含有材料中のセルロースをセルラーゼで用いて分解する工程、
（ｇ）前記工程（ｅ）で得られたセルロース分解産物を含む炭素源を用いて微生物の発酵により前記有用物質を生産する工程、
を備える、方法。 A method for producing useful substances,
The following steps (a), (e) and (g):
(A) contacting the cellulose-containing material with ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium acetate to infiltrate the ionic liquid into the cellulose-containing material;
(E) a step of decomposing cellulose in the cellulose-containing material using cellulase,
(G) a step of producing the useful substance by fermentation of microorganisms using the carbon source containing the cellulose degradation product obtained in the step (e);
A method comprising:
セルロース含有材料にイオン液体１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム アセテートを浸透させて得られる、材料。 A cellulose-containing material for enzyme treatment,
A material obtained by impregnating an ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium acetate into a cellulose-containing material.
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|---|---|---|---|---|
| WO2013151093A1 (en) * | 2012-04-04 | 2013-10-10 | 花王株式会社 | Method for producing organic acid |
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