JP2011047912A - ３次元配向計測装置、当該装置を備えた顕微鏡、および３次元配向計測方法 - Google Patents

Abstract

【課題】分子の３次元配向を計測可能な３次元配向計測装置を提供する。
【解決手段】計測対象の分子から到来する到来光に基づいて分子の配向を計測する３次元配向計測装置であって、到来光を少なくとも第１方向に振動する第１偏光と第２方向に振動する第２偏光と第３方向に振動する第３偏光とに分割する分割部１０８と、第１偏光と第２偏光と第３偏光とに基づいて、分子の配向を検出する配向検出部１１０とを備える。ここで、配向検出部１１０は、第１偏光の第１強度と第２偏光の第２強度と第３偏光の第３強度とを計測する強度計測部と、第１強度と第２強度と第３強度とに基づいて、分子の配向を計測する配向計測部とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、計測対象の分子から到来する到来光に基づいて分子の配向を計測する３次元配向計測装置、当該装置を備えた顕微鏡、および３次元配向計測方法に関する。

図１２は、従来の顕微鏡７００の構成を示す模式図である。特許文献１は、顕微鏡７００と実質的に同様の構成を有する顕微鏡を開示する。

顕微鏡７００は、計測対象の試料７０１（例えば、分子）をのせる試料台７０２と、試料７０１に励起光を照射する照射部７０４と、試料７０１から到来する到来光を受光する受光部７０６と、試料７０１から到来する到来光に基づいて試料７０１の配向を計測する配向計測装置７０７と、試料７０１の配向を示す情報を出力する出力部７１２とを備える。

配向計測装置７０７は、分割部７０８と第１検出部７１０ａと第２検出部７１０ｂと制御・記録装置７１１とを備える。分割部７０８は、到来光を２つの偏光（０°方向に振動する偏光Ａと、９０°方向に振動する偏光Ｂ）に分割する。第１検出部７１０ａは、偏光Ａを検出する。第２検出部７１０ｂは、偏光Ｂを検出する。制御・記録装置７１１は、第１検出部７１０ａと第２検出部７１０ｂとの検出タイミングを同期し、検出情報を記録する。出力部７１２は、第１検出部７１０ａと第２検出部７１０ｂとで検出した像を組み合わせ、出力する。

特開平８−２５４６５４号公報

従来の配向計測装置及び顕微鏡では、計測対象の分子からの到来光を第１方向に振動する第１偏光と第２方向に振動する第２偏光とに分割する。そして、到来光に関する情報を第１方向と第２方向とで分析し、分子配向を計測する。従って、計測し得る配向情報は、２次元に限られる。さらに、従来の配向計測装置では、第１偏光と第２偏光とを各々別の検出装置で検出し、各々の検出装置で検出した像を組み合わせる。そのため、各々の検出装置の検出タイミングを同期し、検出情報を記録するための制御・記録装置が必要である。さらに、従来の配向計測装置では、各々の検出装置で検出するため、ｘｙ平面における位置情報を取得できない。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、計測対象物の配向の３次元計測を実現することができる３次元配向計測装置、当該装置を備えた顕微鏡、および３次元配向計測方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明に係る３次元配向計測装置の特徴構成は、計測対象の分子から到来する到来光に基づいて分子の配向を計測する３次元配向計測装置であって、到来光を少なくとも第１方向に振動する第１偏光と第２方向に振動する第２偏光と第３方向に振動する第３偏光とに分割する分割部と、第１偏光と第２偏光と第３偏光とに基づいて、分子の配向を検出する配向検出部とを備えることにある。

背景技術の項目で説明したように、従来の配向計測装置では、計測対象の分子からの到来光を第１方向に振動する第１偏光と第２方向に振動する第２偏光とに分割する。そして、到来光に関する情報を第１方向と第２方向とで分析し、分子配向を計測する。従って、計測し得る配向情報は、２次元に限られる。一方、本発明の３次元配向計測装置によれば、計測対象の分子からの到来光を少なくとも３つの偏光（第１方向に振動する第１偏光と第２方向に振動する第２偏光と第３方向に振動する第３偏光）に分割する。そして、到来光に関する情報を３方向（第１方向と第２方向と第３方向）で分析し、分子配向を計測する。その結果、３次元の配向情報を計測し得る。

さらに、従来の配向計測装置では、第１偏光と第２偏光とを各々別の検出装置で検出し、各々の検出装置で検出した像を組み合わせる。そのため、各々の検出装置の検出タイミングを同期し、検出情報を記録するための制御・記録装置が必要である。一方、本発明の３次元配向計測装置によれば、第１偏光と第２偏光と第３偏光とを１つの検出装置で検出する。従って、検出タイミングを同期し、検出情報を記録する必要がなく、制御・記録装置が不要である。その結果、制御・記録装置を経由することで生じていたノイズを低減し得、さらに、制御・記録装置を経由することで低下していた時間分解能を向上し得る。

さらに、本発明の３次元配向計測装置は、顕微鏡の部品として構成し得る。従って、従来の顕微鏡の光学系に本発明の３次元配向計測装置を組み込むことで、３次元配向の計測が可能な新規な顕微鏡を容易に実現し得る。

本発明に係る３次元配向計測装置において、配向検出部は、第１偏光の第１強度と第２偏光の第２強度と第３偏光の第３強度とを計測する強度計測部と、第１強度と第２強度と第３強度とに基づいて、分子の配向を計測する配向計測部とを備えてもよい。

本発明の３次元配向計測装置の構成によれば、強度計測部によって光強度を計測することができる。更に配向計測部を備えている。従って、分割された輝点間の光強度の比較から計測対象の分子の３次元配向を計測し得る。

本発明に係る３次元配光計測装置において、第１偏光と第２偏光と第３偏光とに基づいて、第１偏光の像と第２偏光の像と第３偏光の像とを結像する結像部を備えてもよい。

従来の配向計測装置では、２つの検出装置で検出した像を組み合わせるため、ｘｙ平面における位置情報を取得できない。一方、本発明の３次元配向計測装置によれば、第１偏光の像と第２偏光の像と第３偏光の像とを結像し、１つのカメラで録画し得るため、計測対象の分子のｘｙ平面における位置情報を取得し得る。

さらに、本発明の３次元配向計測装置によれば、複数の分子の各々の偏光の像を重畳して結像し得る。従って、複数の分子の配向を計測し得る。

本発明に係る３次元配向計測装置において、前記第１偏光の配置と前記第２偏光の配置と前記第３偏光の配置とを示すテンプレートを記憶した記憶部と、複数の分子から到来する到来光に基づく複数の偏光と前記テンプレートとを照合し、前記第１偏光と前記第２偏光と前記第３偏光とを選択する選択部とを備えてもよい。

本発明の３次元配向計測装置の構成によれば、第１偏光の配置と第２偏光の配置と第３偏光の配置とを示すテンプレートと複数の分子から到来する到来光に基づく複数の偏光とを照合することにより、第１偏光の配置と第２偏光の配置と第３偏光の配置とを判別し得る。その結果、計測対象の分子の偏光を容易に短時間で特定し得、計測対象の分子の配向を計測することができる。

本発明に係る３次元配向計測装置において、到来光は、単一ダイポール由来の到来光を含んでもよい。

本発明の３次元配向計測装置の構成によれば、単一ダイポール由来の到来光を少なくとも第１偏光と第２偏光と第３偏光とに３分割し、３つの偏光の光強度比較からダイポールの配向を求め得る。

上記課題を解決するため、本発明に係る顕微鏡の特徴構成は、分子を観察する顕微鏡であって、分子に励起光を照射する照射部と、分子から到来する到来光を受光する受光部と、上記記載の３次元配向計測装置と、分子の配向を示す情報を出力する出力部とを備えることにある。

本発明の顕微鏡は、従来の顕微鏡の光学系に本発明の３次元配向計測装置を組み込むことで構成し得る。従来の顕微鏡との互換性が良好であり、３次元配向の計測が可能な新規な顕微鏡を容易に実現し得る。

上記課題を解決するため、本発明に係る３次元配向計測方法の特徴構成は、計測対象の分子から到来する到来光に基づいて分子の配向を計測する３次元配向計測方法であって、到来光を少なくとも第１方向に振動する第１偏光と第２方向に振動する第２偏光と第３方向に振動する第３偏光とに分割する分割工程と、第１偏光と第２偏光と第３偏光とに基づいて、分子の配向を検出する配向検出工程とを包含することにある。

本発明に係る３次元配向計測方法によれば、上記説明した本発明の３次元配向計測装置と同様の作用効果を奏する。すなわち、本発明に係る３次元配向計測方法によれば、計測対象の分子からの到来光を第１方向に振動する第１偏光と第２方向に振動する第２偏光と第３方向に振動する第３偏光とに分割する。そして、到来光に関する情報を第１方向と第２方向と第３方向とで分析し、分子配向を計測する。その結果、３次元の配向情報を計測し得る。

本発明に係る３次元配向計測方法において、配向検出工程は、第１偏光の第１強度と第２偏光の第２強度と第３偏光の第３強度とを計測する強度計測工程と、第１強度と第２強度と第３強度とに基づいて、分子の第１回転角と分子の第２回転角とを算出する算出工程とを包含してもよい。第１回転角は、到来光の光軸に直交する平面内での回転角を示し、第２回転角は、到来光の光軸に対する回転角を示す。

本発明の３次元配向計測方法の構成によれば、到来光の光軸に直交する平面内での分子の回転角と到来光の光軸に対する分子の回転角とを算出し得る。その結果、３次元の配向情報を計測し得る。

本発明の第１実施形態の３次元配向計測装置を備えた顕微鏡の構成を示す模式図である。 分割部の詳細な構成を示す模式図である。 ３次元配向計測の原理を示す模式図である。 配向検出部の詳細な構成を示す模式図である。 計測対象の分子（タンパク質）と蛍光色素（テトラメチルローダミン）とを示す模式図及び蛍光色素の構造式を示す図である。 本発明の第１実施形態の顕微鏡を用いた３次元配向計測方法を示すフローチャートである。 出力部に示された第１回転角（Φ）と第２回転角（Θ）とを示すグラフである。 本発明の第２実施形態の３次元配向計測装置に含まれる配向検出部の構成を示す模式図である。 記憶部に記憶されているテンプレートの一例を示す模式図及び輝点の認識方法を説明する模式図である。 分割部１０８で分割され結像部３０１で結像した像の一例を示す写真である。 本発明の第２実施形態の３次元配向計測方法を示すフローチャートである。 従来の顕微鏡の構成を示す模式図である。

図１から図１１を参照して本発明の３次元配向計測装置、当該装置を備えた顕微鏡、および３次元配向計測方法に関する実施形態を説明する。本発明は、以下に説明する実施形態や図面に記載される構成に限定されることを意図せず、当該構成と均等な構成も含む。

〔第１実施形態〕
図１は、本発明の第１実施形態の３次元配向計測装置を備えた顕微鏡の構成を示す模式図である。顕微鏡１００は、計測対象を観察する顕微鏡である。

顕微鏡１００は、計測対象の試料１をのせる試料台１０２と、試料１に励起光を照射する照射部１０４と、試料１から到来する到来光を受光する受光部１０６と、試料１から到来する到来光に基づいて試料１の配向を計測する３次元配向計測装置１０７と、試料１の配向を示す情報を出力する出力部１１２とを備える。

３次元配向計測装置１０７は、分割部１０８と配向検出部１１０とを備える。分割部１０８は、到来光を４つの偏光（第１方向に振動する第１偏光と、第２方向に振動する第２偏光と、第３方向に振動する第３偏光と、第４方向に振動する第４偏光）に分割する。配向検出部１１０は、４つの偏光に基づいて、試料１の配向を検出する。

以下、顕微鏡１００の各構成部の機能を説明する。

試料台１０２に試料１としてタンパク質の分子（以下、単に「分子」と称する。）を含むサンプルをのせる。分子には、蛍光色素として、例えば、テトラメチルローダミンが結合されている。

照射部１０４は、分子に励起光を照射する。このとき、分子から、当該分子の単一ダイポールに関する情報を有する蛍光が発光される。受光部１０６は、蛍光を受光する。例えば、顕微鏡の対物レンズが受光部１０６として機能する。蛍光は３次元配向計測装置１０７に入射する。３次元配向計測装置１０７は、蛍光に基づいて分子の配向を計測する。出力部１１２は、分子の配向を示す情報を表示する。例えば、表示装置が出力部１１２として機能する。

分割部１０８は、蛍光を４つの偏光（例えば、０°方向に振動する第１偏光と、９０°方向に振動する第２偏光と、４５°方向に振動する第３偏光と、１３５°方向に振動する第４偏光）に分割する。４つの偏光は、配向検出部１１０に入射する。配向検出部１１０は、４つの偏光に基づいて、分子の配向を検出する。

上記実施形態では、蛍光を４つの偏光に分割しているが、本発明の第１実施形態の３次元配向計測装置１０７によれば、計測対象の分子からの到来光を少なくとも３つの偏光に分割すればよい。そして、到来光に関する情報を第１方向と第２方向と第３方向とで分析し、分子配向を計測する。その結果、３次元の配向情報を計測し得る。

本発明の第１実施形態の３次元配向計測装置１０７によれば、単一ダイポール由来の到来光を少なくとも第１偏光と第２偏光と第３偏光とに３分割し、３つの偏光の光強度比較からダイポールの配向を求め得る。

図２は、分割部１０８の詳細な構成を示す模式図である。分割部１０８は、光路を２つに分割するハーフミラー１０８ｂと、光を偏光する第１偏光素子１０８ｃと、光路を変更する第１ミラー１０８ｄと、光路を変更するプリズム１０８ｅと、結像レンズ１０８ｆと、光路を変更する第２ミラー１０８ｇと、光を偏光する第２偏光素子１０８ｈとを含む。

第１偏光素子１０８ｃは、到来光を第１の方向に振動する第１偏光と第２の方向に振動する第２偏光とに分割する。第２偏光素子１０８ｈは、到来光を第３の方向に振動する第３偏光と第４の方向に振動する第４偏光とに分割する。結像レンズ１０８ｆは、第１偏光素子１０８ｃと第２偏光素子１０８ｈとで分割された４つの偏光の各々の像が配向検出部１１０で結像するように、４つの偏光を配向検出部１１０に集める。

以下、分割部１０８の各構成部の機能を説明する。

ハーフミラー１０８ｂは、受光部１０６から到来する蛍光の光路を第１偏光素子１０８ｃへの光路と第２ミラー１０８ｇへの光路とに分割する。

第１偏光素子１０８ｃは、蛍光を０°の方向に振動する第１偏光と９０°の方向に振動する第２偏光とに分割する。第１ミラー１０８ｄは、第１偏光と第２偏光とがプリズム１０８ｅに至るように第１偏光と第２偏光との光路を変更する。プリズム１０８ｅは第１偏光と第２偏光とが結像レンズ１０８ｆに至るように第１偏光と第２偏光との光路を変更する。第２ミラー１０８ｇは、ハーフミラー１０８ｂで分割された蛍光の一方が第２偏光素子１０８ｈに至るようにハーフミラー１０８ｂで分割された蛍光の一方の光路を変更する。第２偏光素子１０８ｈは、ハーフミラー１０８ｂで分割された蛍光の一方を４５°の方向に振動する第３偏光と１３５°の方向に振動する第４偏光とに分割する。

結像レンズ１０８ｆは、第１偏光素子１０８ｃと第２偏光素子１０８ｈとで分割された４つの偏光の各々の像が配向検出部１１０で結像するように、４つの偏光を配向検出部１１０に集める。

図３は、３次元配向計測の原理を示す模式図である。単一ダイポールから放出された光が顕微鏡光路のフーリエ面においてどのようなｘｙ成分を有するかを示す。放出される散乱光を振動方向（例えば、０°、４５°、９０°の方向）に分割し、異方性の方向をΦの指標とし、異方性の度合いをΘの指標として、分子の３次元配向を計測する。ｚ軸を顕微鏡の対物レンズの光軸（対物レンズへ到来する到来光の光軸）と平行にとり、分子の配向を方位角ΘおよびΦで示す。分子のダイポールが光軸に垂直な場合（Θ＝９０°）、散乱光は、フーリエ面において強い偏光異方性を有する。一方、ダイポールが対物レンズの光軸に沿っている場合（Θ＝０°）、全体としての異方性は消失する。

ａ°の方向に振動する偏光の強度をＩ_ａで示し、放出された光の全強度をＩ_ｔｏｔで示すと、方位角Φは式１で、方位角Θは式２で、強度Ｉ_ｔｏｔは式３で示される。

なお、αは、対物レンズが集光し得る光の最大角を示す。

図４は、配向検出部１１０の詳細な構成を示す模式図である。配向検出部１１０は、第１偏光と第２偏光と第３偏光と第４偏光とに基づいて第１偏光の像と第２偏光の像と第３偏光の像と第４偏光の像とを結像する結像部３０１と、第１偏光の第１強度と第２偏光の第２強度と第３偏光の第３強度と第４偏光の第４強度とを計測する強度計測部３０６と、第１強度と第２強度と第３強度と第４強度とに基づいて試料１の配向を計測する配向計測部３０８とを備える。

以下、式１〜式６及び図４を参照して配向検出部１１０の各構成部の機能を説明する。

結像部３０１は、結像レンズ１０８ｆによって集光された４つの偏光（第１偏光、第２偏光、第３偏光、第４偏光）に基づいて、４つの偏光の各々の像を結像する。強度計測部３０６は、結像レンズ１０８ｆによって集光された４つの偏光に基づいて、第１偏光の第１強度（Ｉ_０）と第２偏光の第２強度（Ｉ_９０）と第３偏光の第３強度（Ｉ_４５）と第４偏光の第４強度（Ｉ_１３５）とを計測する。配向計測部３０８は、上記４つの強度のうち、例えば、第１強度（Ｉ_０）と第２強度（Ｉ_９０）と第３強度（Ｉ_４５）とに基づいて、式１〜式６に基づく情報処理を実行することによって分子の配向（Φ、Θ）を算出する。

本発明の第１実施形態の３次元配向計測装置１０７によれば、第１偏光と第２偏光と第３偏光と第４偏光とを１つの検出装置で検出する。従って、検出タイミングを同期し、検出情報を記録する必要がなく、制御・記録装置が不要である。その結果、制御・記録装置を経由することで生じたノイズを低減し得、さらに、制御・記録装置を経由することで低下していた時間分解能を向上し得る。

さらに、本発明の第１実施形態の３次元配向計測装置１０７によれば、強度計測部によって光強度を計測することができる。更に配向計測部を備えている。従って、分割された輝点の光強度の比較から計測対象の分子の３次元配向を計測し得る。

さらに、本発明の第１実施形態の３次元配向計測装置１０７によれば、第１偏光の像と第２偏光の像と第３偏光の像とを結像部で結像し、１つのカメラで録画し得るため、計測対象の分子のｘｙ平面における位置情報を取得し得る。

図５は、計測対象の分子（タンパク質）と蛍光色素（テトラメチルローダミン）とを示す模式図及び蛍光色素の構造式を示す図である。分子には、蛍光色素が結合している。顕微鏡１００は、分子の単一ダイポールに関する情報を有する蛍光に基づいて分子の配向を計測する。

図６は、本発明の第１実施形態の顕微鏡１００を用いた３次元配向計測方法を示すフローチャートである。以下、図１、図２、図４および図６を参照して、３次元配向計測方法を説明する。

ステップ６０２：照射部１０４が計測対象の分子に励起光を照射する。

ステップ６０４：受光部１０６が分子から到来する到来光を受光する。

ステップ６０６：分割部１０８は、到来光を第１方向（０°方向）に振動する第１偏光と第２方向（９０°方向）に振動する第２偏光と第３方向（４５°方向）に振動する第３偏光と第４方向（１３５°方向）に振動する第４偏光とに分割する。

ステップ６０８：結像部３０１は、第１偏光と第２偏光と第３偏光と第４偏光とに基づいて、第１偏光の像と第２偏光の像と第３偏光の像と第４偏光の像とを結像する。

ステップ６１０：強度計測部３０６は、第１偏光の第１強度（Ｉ_０）と第２偏光の第２強度（Ｉ_９０）と第３偏光の第３強度（Ｉ_４５）と第４偏光の第４強度（Ｉ_１３５）とを計測する。

ステップ６１２：配向計測部３０８は、第１強度と第２強度と第３強度とに基づいて、分子の第１回転角（Φ）と分子の第２回転角（Θ）とを算出する。第１回転角（Φ）は、到来光の光軸に直交する平面内での回転角を示し、第２回転角（Θ）は、到来光の光軸に対する回転角を示す。

ステップ６１４：出力部１１２は、分子の配向を示す情報を出力する。

なお、本発明の第１実施形態において、分子から到来する到来光に基づいて分子の配向を計測する３次元配向計測方法は、ステップ６０６〜ステップ６１２によって実行される。さらに、第１偏光と第２偏光と第３偏光とに基づいて分子の配向を検出する配向検出工程は、ステップ６１０とステップ６１２とによって実行される。

本発明の第１実施形態の顕微鏡１００を用いた３次元配向計測方法によれば、上記説明した本発明の３次元配向計測装置と同様の作用効果を奏する。すなわち、本発明の第１実施形態の顕微鏡１００を用いた３次元配向計測方法によれば、計測対象の分子からの到来光を第１方向に振動する第１偏光と第２方向に振動する第２偏光と第３方向に振動する第３偏光とに分割する。そして、到来光に関する情報を第１方向と第２方向と第３方向とで分析し、分子配向を計測する。その結果、３次元の配向情報を計測し得る。

さらに、本発明の第１実施形態の顕微鏡１００を用いた３次元配向計測方法によれば、到来光の光軸に直交する平面内での分子の回転角と到来光の光軸に対する分子の回転角とを算出し得る。その結果、３次元の配向情報を計測し得る。

図７は、出力部１１２に示された第１回転角（Φ）と第２回転角（Θ）とを示すグラフである。縦軸は分子の回転角を示し、横軸は観測時間を示す。折れ線（破線）は、到来光の光軸に直交する平面内での回転角（第１回転角（Φ））を示し、折れ線（実線）は、到来光の光軸に対する回転角（第２回転角（Θ））を示す。

以上、図１から図７を参照して本発明の第１実施形態の顕微鏡１００、３次元配向計測装置１０７および３次元配向計測方法を説明した。

〔第２実施形態〕
図８は、本発明の第２実施形態の３次元配向計測装置に含まれる配向検出部９１０の構成を示す模式図である。配向検出部９１０は、記憶部３０２と選択部３０４とを含む。配向検出部９１０の構成は、記憶部３０２と選択部３０４とを除けば第１実施形態の３次元配向計測装置１０７に含まれる配向検出部１１０の構成と同一である。

記憶部３０２には、第１偏光の配置と第２偏光の配置と第３偏光の配置と第４偏光の配置とを示すテンプレートが記憶されている。選択部３０４は、複数の分子から到来する到来光に基づく複数の偏光とテンプレートとを照合し、複数の分子から到来する到来光に基づく複数の偏光から第１偏光と第２偏光と第３偏光と第４偏光とを選択する。

図９は、記憶部３０２に記憶されているテンプレートの一例を示す模式図及び輝点（所定分子からの到来光に基づく複数の偏光）の認識方法を説明する模式図である。

テンプレートは、第１偏光の配置と第２偏光の配置と第３偏光の配置と第４偏光の配置とを示す。輝点の位置関係を記述する特徴ベクトルを抽出し、解析する画像内の輝点と特徴ベクトルとを照合することで、解析する画像内の輝点から、特定の分子からの到来光に基づく複数の偏光を選択し得る。

記憶部３０２には、予め、テンプレートに関する情報が記憶されている。

図１０は、分割部１０８で分割され結像部３０１で結像した像の一例を示す写真である。結像部３０１は、結像レンズ１０８ｆによって集光された４つの偏光に基づいて、４つの偏光の各々の像を結像する。図１０の写真には、第１分子〜第３分子の各々から分割された４つの偏光の像が写っている。

以下、前述の式１〜式６、及び図８〜図１０を参照して配向検出部９１０の各構成部の機能を説明する。

結像部３０１は、結像レンズ１０８ｆによって集光された４つの偏光（第１偏光、第２偏光、第３偏光、第４偏光）に基づいて、４つの偏光の各々の像を結像する。第１分子と第２分子と第３分子とから到来する光の各々を４つに偏光した場合、結像部３０１には、１２個の偏光の像が結像される（図１０参照）。記憶部３０２には、予め、テンプレートに関する情報が記憶されている。

解析する画像には、複数の分子から到来する到来光に基づく複数の偏光が写っている。例えば、複数の偏光には、第１分子から到来する到来光に基づく４つの偏光（第１分子に基づく４つの偏光）と、第２分子から到来する到来光に基づく４つの偏光と、第３分子から到来する到来光に基づく４つの偏光とが含まれる。選択部３０４は、解析する画像に写る複数の偏光とテンプレートとを照合し、複数の偏光から、第１分子に基づく４つの偏光と第２分子に基づく４つの偏光と第３分子に基づく４つの偏光とを選択する。

強度計測部３０６は、第１偏光の第１強度（Ｉ_０）と第２偏光の第２強度（Ｉ_９０）と第３偏光の第３強度（Ｉ_４５）と第４偏光の第４強度（Ｉ_１３５）とを計測する。

配向計測部３０８は、上記４つの強度のうち、例えば、第１強度（Ｉ_０）と第２強度（Ｉ_９０）と第３強度（Ｉ_４５）とに基づいて、式１〜式６を実行することによって分子の配向（Φ、Θ）を算出する。

本発明の第２実施形態の３次元配向計測装置によれば、複数の分子の各々の偏光の像を結像部に結像し得る。更に、複数の分子の各々を同定し得る。従って、複数の分子の各々の配向を計測し得る。

図１１は、本発明の第２実施形態の３次元配向計測方法を示すフローチャートである。第２実施形態の３次元配向計測方法のステップは、ステップ８０９を除いて第１実施形態の３次元配向計測方法のステップと同一である。

ステップ６０２〜ステップ６０８に続いてステップ８０９を実行する。

ステップ８０９：選択部３０４は、解析する画像に写る複数の偏光とテンプレートとを照合し、複数の偏光から、４つの偏光（第１偏光、第２偏光、第３偏光、第４偏光）を選択する。

ステップ８０９に続いて、ステップ６１０〜ステップ６１４を実行する。

なお、本発明の第２実施形態において、分子から到来する到来光に基づいて分子の配向を計測する３次元配向計測方法は、ステップ６０６、ステップ６０８、ステップ８０９、ステップ６１０、ステップ６１２によって実行される。さらに、第１偏光と第２偏光と第３偏光とに基づいて分子の配向を検出する配向検出工程は、ステップ６１０とステップ６１２とによって実行される。

本発明の第２実施形態の３次元配向計測装置の構成によれば、第１偏光の配置と第２偏光の配置と第３偏光の配置とを示すテンプレートと複数の偏光とに基づいて、計測対象の分子に基づく複数の偏光の配置を判別し得る。その結果、計測対象の分子の偏光を容易に短時間で特定し得、計測対象の分子の配向を計測することができる。

以上、図８から図１１を参照して本発明の第２実施形態の３次元配向計測装置および３次元配向計測方法を説明した。

なお、本発明の第２実施形態において、配向検出部９１０が記憶部３０２を含むことは必須ではない。選択部３０４が、複数の偏光と記憶部３０２に記憶されているテンプレートとに基づいて複数の偏光の各々の配置を選択し得る限りは、記憶部３０２が配向検出部９１０の外部に備えられてもよい。

さらに、本発明の第２実施形態において、記憶部３０２に記憶されるテンプレートの数は１種類に限らない。複数種類でよい。

以上、図１から図１１を参照して本発明の３次元配向計測装置、当該装置を備えた顕微鏡、および３次元配向計測方法を説明した。

本発明の３次元配向計測装置１０７は、顕微鏡の部品として構成し得る。従って、従来の顕微鏡の光学系に３次元配向計測装置１０７を組み込むことで、３次元配向の計測が可能な新規な顕微鏡１００を容易に実現し得る。

本発明の実施形態において、タンパク質の分子を計測対象として説明したが、本発明の３次元配向計測装置が計測対象からの到来光を計測し得る限りは、計測対象はタンパク質の分子に限定されない。計測対象は有機ポリマーでもよい。また、蛍光色素からの蛍光が計測対象の有するダイポールの配向に関する情報を有する限りは、蛍光色素は、テトラメチルローダミンに限定されない。蛍光色素は、緑色蛍光タンパク質でもよい。

本発明の実施形態において、計測対象の有するダイポールに関する情報を得ることができる限りは、ダイポールに関する情報が蛍光を媒体として得られることに限らない。例えば、ダイポールに関する情報は、分子から到来する散乱光、ラマン光、赤外線、又は電磁波を媒体として得られる。例えば、ダイポールに関する情報が分子から到来する散乱光を媒体として得る場合は、受光部１０６が、当該散乱光を受光する。

本発明の実施形態において、分子の配向を計測対象として説明したが、計測対象は、計測対象の有するダイポールから情報を得ることができる限りは、分子の配向に限定されない。例えば、分子構造、結合の仕方等の分子状態でもよい。計測対象が分子状態の場合、本発明の３次元配向計測装置は、計測対象の有するダイポールから分子状態の情報を得て３次元分子状態を計測する３次元状態計測装置として機能する。

さらに、本発明の３次元配向計測装置においては、第１偏光素子１０８ｃが、到来光を第１の方向に振動する光と第２の方向に振動する光とに分割し得る限りは、その方向は０°と９０°とに限定されない。例えば、第１の方向が１０°であり、第２の方向が５５°でもよい。第２偏光素子１０８ｈが、到来光を第３の方向に振動する光と第４の方向に振動する光とに分割し得る限りは、その方向は４５°と１３５°とに限定されない。例えば、第３の方向が３０°であり、第４の方向が６５°でもよい。

本発明の実施形態において、分割部１０８が、到来光を４つの偏光に分割する形態を説明したが、分割部１０８が、到来光を少なくとも３つの偏光に分割し得る限りは、４つの偏光に分割する形態に限定されない。分割部１０８が、到来光を３つの偏光に分割する場合は、配向検出部１１０は、３つの偏光に基づいて、試料１の配向を検出する。到来光を３つの偏光に分割する形態においては、結像レンズ１０８ｆが、第１偏光素子１０８ｃと第２偏光素子１０８ｈとで分割された第１偏光と第２偏光と第３偏光とに基づいて、第１偏光の像と第２偏光の像と第３偏光の像とを配向検出部１１０に結像させる。

本発明の実施形態において、分割部１０８は、ハーフミラー１０８ｂと第１偏光素子１０８ｃと第１ミラー１０８ｄとプリズム１０８ｅと結像レンズ１０８ｆと第２ミラー１０８ｇと第２偏光素子１０８ｈとを含む形態を説明したが、分割部１０８が受光部１０６から到来する到来光を少なくとも３つの偏光に分割し、３つの偏光を配向検出部１１０に送り得る限りは、分割部１０８の詳細な構成は本発明の実施形態に限定されない。

本発明の実施形態において、結像部３０１を備えた配向検出部１１０を説明したが、少なくとも３つの偏光が配向検出部１１０に入射され、配向検出部１１０が、３つの偏光に基づいて、分子の配向を検出し得る限りは、配向検出部１１０が結像部３０１を備える形態に限定されない。

本発明による３次元配向計測装置、３次元配向計測方法及び顕微鏡は、生体分子計測、物性計測等の計測分野に広く利用可能である。

１００ 顕微鏡
１０４ 照射部
１０６ 受光部
１０７ ３次元配向計測装置
１０８ 分割部
１１０ 配向検出部
１１２ 出力部
３０１ 結像部
３０２ 記憶部
３０４ 選択部
３０６ 強度計測部
３０８ 配向計測部

Claims (8)

1. 計測対象の分子から到来する到来光に基づいて前記分子の配向を計測する３次元配向計測装置であって、
   前記到来光を少なくとも第１方向に振動する第１偏光と第２方向に振動する第２偏光と第３方向に振動する第３偏光とに分割する分割部と、
   前記第１偏光と前記第２偏光と前記第３偏光とに基づいて、前記分子の配向を検出する配向検出部と
   を備えた３次元配向計測装置。
2. 前記配向検出部は、
   前記第１偏光の第１強度と前記第２偏光の第２強度と前記第３偏光の第３強度とを計測する強度計測部と、
   前記第１強度と前記第２強度と前記第３強度とに基づいて、前記分子の配向を計測する配向計測部と
   を備えた、請求項１に記載の３次元配向計測装置。
3. 前記第１偏光と前記第２偏光と前記第３偏光とに基づいて、前記第１偏光の像と前記第２偏光の像と前記第３偏光の像とを結像する結像部を備えた、請求項１または請求項２に記載の３次元配向計測装置。
4. 前記第１偏光の配置と前記第２偏光の配置と前記第３偏光の配置とを示すテンプレートを記憶した記憶部と、
   複数の分子から到来する到来光に基づく複数の偏光と前記テンプレートとを照合し、前記第１偏光と前記第２偏光と前記第３偏光とを選択する選択部と
   を備えた、請求項１から請求項３の何れか一項に記載の３次元配向計測装置。
5. 前記到来光は、単一ダイポール由来の到来光を含む、請求項１から請求項４の何れか一項に記載の３次元配向計測装置。
6. 前記分子を観察する顕微鏡であって、
   前記分子に励起光を照射する照射部と、
   前記分子から到来する到来光を受光する受光部と、
   請求項１から請求項４の何れか一項に記載の３次元配向計測装置と、
   前記分子の配向を示す情報を出力する出力部と
   を備えた顕微鏡。
7. 計測対象の分子から到来する到来光に基づいて前記分子の配向を計測する３次元配向計測方法であって、
   前記到来光を少なくとも第１方向に振動する第１偏光と第２方向に振動する第２偏光と第３方向に振動する第３偏光とに分割する分割工程と、
   前記第１偏光と前記第２偏光と前記第３偏光とに基づいて、前記分子の配向を検出する配向検出工程と
   を包含する３次元配向計測方法。
8. 前記配向検出工程は、
   前記第１偏光の第１強度と前記第２偏光の第２強度と前記第３偏光の第３強度とを計測する強度計測工程と、
   前記第１強度と前記第２強度と前記第３強度とに基づいて、前記分子の第１回転角と前記分子の第２回転角とを算出する算出工程と
   を包含し、
   前記第１回転角（Φ）は、前記到来光の光軸に直交する平面内での回転角を示し、
   前記第２回転角（Θ）は、前記到来光の光軸に対する回転角を示す、請求項７に記載の３次元配向計測方法。