JP2011045301A - チロシナーゼ遺伝子が染色体に組み込まれた酵母 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の工程A〜Eを含む方法により製造されるチロシナーゼ遺伝子が染色体に組み込まれた酵母:(A) 宿主酵母に変異処理を施しウラシル要求性を付与する工程、
(B) 工程Aで得られた酵母にジーンターゲッティングを施し、リジン要求性を付与する工程、(C) 工程Bで得られた酵母を、チロシナーゼ遺伝子を含みウラシル要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、(D) 工程Cで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、並びに(E) 工程Dで得られた酵母からリジン要求性であるホモ型発現株を選択する工程。
【選択図】なし
Description
(1-1) 以下の工程A〜Eを含む方法により製造されるチロシナーゼ遺伝子が染色体に組み込まれた酵母:
(A) 宿主酵母に変異処理を施しウラシル要求性を付与する工程、
(B) 工程Aで得られた酵母にジーンターゲッティングを施し、リジン要求性を付与する工程、
(C) 工程Bで得られた酵母を、チロシナーゼ遺伝子を含みウラシル要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、
(D) 工程Cで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、及び、
(E) 工程Dで得られた酵母からリジン要求性が生じたホモ型発現株を選択する工程。
(1-2) 更に以下の工程Fを含む方法により製造される、請求項1に記載の酵母:
(F) 工程Eで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程。
(1-3) 前記宿主酵母が清酒酵母である、(1-1)又は(1-2)に記載の酵母。
(1-4) 前記清酒酵母が「きょうかい9号」である、(1-3)に記載の酵母。
(1-5) 導入されたチロシナーゼ遺伝子のコピー数が3〜8であることを特徴とする、(1-1)〜(1-4)のいずれか1項に記載の酵母。
(1-6) チロシナーゼ遺伝子のコピー数が6〜16であることを特徴とする、(1-1)〜(1-5)のいずれか1項に記載の酵母。
(1-7) 前記変異処理がEMS処理である、(1-1)〜(1-6)のいずれか1項に記載の酵母。
(1-8) 前記形質転換ベクターがSED1プロモーターを含む、(1-1)〜(1-7)のいずれか1項に記載の酵母。
(1-9) 前記チロシナーゼ遺伝子がアスペルギルス属糸状菌のチロシナーゼ遺伝子である、(1-1)〜(1-8)のいずれか1項に記載の酵母。
(1-10) 前記チロシナーゼ遺伝子がmelB遺伝子である、(1-9)に記載の酵母。
(2-1) (1-1)〜(1-10)のいずれか1項に記載の酵母を培養し、培養物からのチロシナーゼを利用する ことを特徴とするチロシナーゼの製造方法。
(3-1) 反応液中で、(1-1)〜(1-10)のいずれか1項に記載の酵母の存在下で、DOPA及びこれらの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも1種の基質化合物を酸化してメラニン前駆体に変換する酸化工程と、
反応液からメラニン前駆体を回収する回収工程と
を含むメラニン前駆体の製造方法。
本発明のチロシナーゼ遺伝子が組み込まれた酵母は、以下の工程A〜Eを含む方法により製造されることを特徴としている:
(A) 宿主酵母に変異処理を施しウラシル要求性を付与する工程、
(B) 工程Aで得られた酵母にジーンターゲッティングを施し、リジン要求性を付与する工程、
(C) 工程Bで得られた酵母を、チロシナーゼ遺伝子を含みウラシル要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、
(D) 工程Cで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、及び
(E) 工程Dで得られた酵母からリジン要求性が生じたホモ型発現株を選択する工程。
(F) 工程Eで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程。
工程Aでは、宿主酵母に変異処理を施しウラシル要求性を付与する。
工程Bでは、工程Aで得られた酵母にジーンターゲッティングを施し、リジン要求性を付与する。
工程Cでは、チロシナーゼ遺伝子を含みウラシル要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する。
工程Dでは、工程Cで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する。この場合、工程Cで形質転換ベクターを形質転換したURA3座位と対のURA3座位に、リジン要求性を相補する形質転換ベクターを相同組み換えにより形質転換する。
工程Eでは、工程Dで得られた酵母からLOHでリジン要求性が生じたホモ型発現株を選択する。
工程Fでは、工程Eで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する。
本発明のメラニン前駆体の製造方法は、反応液中で、本発明の酵母の存在下で、DOPA及びこれらの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも1種の基質化合物を酸化してメラニン前駆体に変換する酸化工程と、反応液からメラニン前駆体を回収する回収工程とを含むことを特徴とする。
<基質化合物>
基質化合物としては、DOPA及びDOPA類縁体からなる群より選ばれる少なくとも1種の化合物を使用する。DOPA及びDOPA類縁体は、L体又はD体のいずれであってもよい。DOPA類縁体としては、ドーパミン(Dopamine)、DOPAメチルエステル、DOPAエチルエステル、α−メチルDOPA等が挙げられ、これらの異性体であってもよい。基質化合物として、中でも、天然型メラニン前駆体が得られる点、酵素に対する親和性の点でL-DOPAを用いることが好ましい。
反応開始時の基質の濃度は、通常10〜60 mM程度とすることが好ましく、15〜40 mM程度とすることがより好ましい。
(i)塩の存在下での保存
(ii)酸素非存在下pH3〜5、酸素非存在下pH5〜10、又は酸素存在下pH5〜7に維持した状態での保存
(iii)水溶性有機溶媒の存在下での保存
かかる各保存は特開2000-158304号公報(特許文献1)の[0066]〜[0077]の記載に従って実施することが出来る。かかる条件で保存することにより保存時にメラニン前駆体が重合してメラニン化することを抑制することができる。酸化反応終了後は、酸化を防止するため、反応液は酸素を遮断した状態とするのが望ましい。
反応終了液には、通気及び撹拌により酵母が破損して生じたタンパク質又は酵母から流出したタンパク質が含まれている場合がある。従って、限外ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知の方法で除タンパクを行うことが好ましい。
1.使用菌株
下記の試験例1−3で使用した菌株とその原ホスト酵母の一覧を以下の表1に示す。
市販の「きょうかい9号」酵母に、EMS変異処理を施し、ウラシル要求性を付与した酵母である。
ウラシル要求性のGRI-117U株にEMS変異処理を施し、リジン要求性を付与した酵母である。
ウラシル要求のGRI-117U株にジーンターゲッティングを施し、リジン要求性を付与した酵母である。
EMS処理は常法に従い行った。詳しくは、きょうかい9号を5 ml YPD培地に接種し、30℃で細胞濃度2×108 cells/mlまで増殖させ、2.5 mlを遠心集菌した。菌体を50 mMリン酸カルシウムバッファー(pH7.0)で2回洗浄し、10 mlの同じバッファーに懸濁した。この懸濁液に300μlのEMSを加え、激しく混合した後、30℃で30分振とうした。3 mlの10%チオ硫酸ナトリウムを加えよく混合し、その後遠心集菌し、滅菌水で2回洗浄した。洗浄菌体を細胞濃度2×105 cells/mlとなるように滅菌水にて希釈し、100〜200μlを5-FOA寒天培地にまいた。30℃にて5〜7日間静置し、ウラシル要求性を付与したGRI-117U株を取得した。
相同組換えに用いるDNA断片をジャンクションPCRで合成した。表2に示すプライマー(配列番号1〜8)を用い、酵母X21801A株ゲノムDNAをテンプレートとし、5’末端側の相同組換え配列としてLYS2(-250〜220)、ループアウト形成配列としてLYS2(1881〜2380)、マーカー遺伝子としてURA3マーカー、3’末端側の相同組換え配列としてLYS2(1381〜1880)の各DNA断片をPCRにて増幅した。これらの断片を精製後、各断片を混合して、1F(配列番号1)および4R(配列番号8)のプライマーを用いて2回目のPCRを行うことにより2,602 bpの遺伝子置換用DNA断片lys2-URA3を作製した。この断片で清酒酵母GRI-117-U(ウラシル要求性)を形質転換し、片方の染色体のLYS2がlys2-URA3に置換された株を得た。この株をYPDで3日間培養し、5-FOAプレートに塗布すると、1.0×10-4の頻度でコロニーが出現した。コロニーを形成する菌体は、染色体からURA3マーカー遺伝子が除去されたものである。5'- AAATACGCTGTCGCTTTGAGTGTATGGGCT -3'(配列番号9)及び5'-GACCTCACCTTGAGATGATCCACCCGATGA-3'(配列番号10)の2つのプライマーを用いて、コロニーから直接PCRを行い、増幅断片が2.6 kbと0.9 kbの2種類である株をLYS2遺伝子とマーカー遺伝子URA3とがループアウトにより脱落した株として選抜した。得られた株をLYS2へテロ破壊株GKT-1000とした。GKT-1000は、相同染色体の一方のみにLys2遺伝子を有する。このGKT-1000をYPDで3日間培養し、α-AAプレートに塗布すると、1.1×10-4の頻度でコロニーが出現した。出現したコロニーは、選択マーカーURA3がLOHにより消失し(ウラシル要求性を示し)、かつリジン要求性を示したため、これをLYS2ホモ破壊株GKT-1001とした。
各形質転換ベクターの調製方法を以下に示す。
酵母ベクターpRS406(STRATAGENE社より販売)(GenBank Accession no.U03446)を基にして、発現プラスミド(pGEK11, 図2)を作製した。
上記のプラスミド(pGEK11)を基にして、目的とする発現プラスミド(pGEK13, 図3)を作製した。
pRS406を基にして、目的とするプラスミド(pURA3-UTR, 図4)を作製した。
pRS406を基にして、目的とするプラスミド(pK199-8, 図5)を作製した。
pRS406を基にして、目的とするプラスミド(pAKK1, 図6)を作製した。
プラスミドを制限酵素にて消化した後、常法どおり酢酸リチウム法(J. Bacteriol.,153: 163-168 (1983))にて宿主とする酵母に導入し、形質転換した。
酵母GRI-117Uを宿主として、StuI消化したpGEK11を導入した。
酵母GRI-117Uを宿主として、StuI消化したpGEK13を導入した。
酵母GRI-117UKを宿主として、StuI消化したpGEK13を導入した株で、ウラシル要求性を示さず、リジン要求性を示す。
酵母GKT-1001を宿主として、StuI消化したpK119-8を2倍体の一方の核のURA3座位に1コピー導入しTY5株を得た。このTY5株に、HpaI消化したpURA3-UTRを、TY5の2倍体のpK119-8を含まない他方の核のURA3座位に導入し、リジン要求性が回復した株としてTY5マーキング株を得た。TY5マーキング株に対して、YPD培地で培養した後、リジン要求性を選択するためにα-AAプレートへ塗布し、生育してきた酵母TY5-HOM株を選択した。TY5-HOM株は、TY5マーキング株のpK119-8が存在する一方のURA3座位が、TY5マーキング株のpURA3-UTRが存在する他方のURA3座位とLOHが生じて組み換えが起こり、リジン要求性が復帰したホモ型発現株として選択されたものである。さらに、TY5-HOM株を、stuI消化したpAKK1を導入してTY6株を取得した。TY6株は、ウラシル要求性を示さず、リジン要求性を示さない。
菌体のチロシナーゼ活性の測定は次のようにして行った。すなわち、回収した菌体の一部を水に懸濁し、その0.1 mlに対して30℃に保温しておいた10 mM L-DOPA(0.005Nの塩酸に溶解)0.8 ml及び1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)0.1 mlを添加し、30℃で5分間反応させた後、15,000 rpmで30秒間遠心分離を行うことにより菌体を取り除き、DOPAの吸収極大波長である475 nmにおける吸光度を測定した。菌体の懸濁量は、実験の便宜上、反応の後の反応液の475 nmにおける吸光度が0.1〜0.3に収まるように調整した。
(株)アークレイファクトリー製、グルコース分析装置(アダムスグルコース GA-1152)により測定した。
理研計器(株)製、簡易アルコール分析器(アルコメイトAL-3)により測定した。
YNB+2% グルコース平板培地、またはYPD+2% グルコース平板培地に種菌を植菌した(この株を初代とする)。コロニーが十分生育した数日後、任意のコロニーを1つ選び、次の平板培地に植菌した(この株を2代目とする)。同様に継代を繰り返した。
30 L培養槽に基本培地10 Lを入れ、以下の条件でTY2株とTY6株の培養試験を行った。
培養28時間〜44時間: 50%グルコースを150 mL/hでフィード
培養44時間〜52時間: 50%グルコースを300 mL/hでフィード
培養52時間〜68時間: 50%グルコースを150 mL/hでフィード
培養の結果を図7に示す。図7に示されているように、TY6株を1種類のベクターで形質転換されたTY2株と同じ条件の培養を行った場合、TY6株とTY2株で増殖性能に顕著な差は認められない。
10L培養槽に基本培地3 L入れ、培養試験を行った。ただし、TY3株はエタノール資化能力を欠損していることがわかっていたため、グルコース蓄積を避けるため、指数的にグルコースのフィード速度変化させた(グルコース濃度が高いと、エタノール蓄積することが知られている)。
上記試験例1−3の結果をまとめると以下の表5のようになる。
b) チロシナーゼ活性は初代活性のものである。
c) すべての培養条件で活性残存数が90%以上の場合を極めて良好、80%以上の場合を良好、一つでも活性残存数が70%未満の場合を悪いとした。
melB遺伝子のコピー数が1コピーであるベクターを用いて形質転換を行うことにより作製した特開2006-158304号公報で開示された菌株である。
染色体に組み込むmelB遺伝子のコピー数を3に増加することにより、活性の高いTY2株を作製した。TY2株は、継代培養によりチロシナーゼ活性が低下する欠点を持っていた。
EMS処理によりウラシル要求性とリジン要求性を付与した酵母はエタノール資化能力を失っており、これにmelB遺伝子を組み込んだTY3株は高濃度培養ができなかった。
栄養要求性マーカーを2つ持ちエタノール資化できる株にmelB遺伝子を組み込んだTY6株について、培養試験と活性確認を行った。その結果、TY6株は高活性で、且つ、継代によりチロシナーゼ活性が低下せず、高濃度培養が可能であるという優れた特徴を持つ。
Claims (8)
- 以下の工程A〜Eを含む方法により製造されるチロシナーゼ遺伝子が染色体に組み込まれた酵母:
(A) 宿主酵母に変異処理を施しウラシル要求性を付与する工程、
(B) 工程Aで得られた酵母にジーンターゲッティングを施し、リジン要求性を付与する工程、
(C) 工程Bで得られた酵母を、チロシナーゼ遺伝子を含みウラシル要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、
(D) 工程Cで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、及び
(E) 工程Dで得られた酵母からリジン要求性が生じたホモ型発現株を選択する工程。 - 更に以下の工程Fを含む方法により製造される、請求項1に記載の酵母:
(F) 工程Eで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程。 - 前記宿主酵母が清酒酵母である、請求項1又は2に記載の酵母。
- 前記清酒酵母が「きょうかい9号」である、請求項3に記載の酵母。
- 導入されたチロシナーゼ遺伝子のコピー数が3〜8であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の酵母。
- チロシナーゼ遺伝子のコピー数が6〜16であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の酵母。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の酵母を培養し、培養物からのチロシナーゼを利用することを特徴とするチロシナーゼの製造方法。
- 反応液中で、請求項1〜6のいずれか1項に記載の酵母の存在下で、DOPA(3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アラニン)及びこれらの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも1種の基質化合物を酸化してメラニン前駆体に変換する酸化工程と、
反応液からメラニン前駆体を回収する回収工程と
を含むメラニン前駆体の製造方法。
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JP2006158304A (ja) * | 2004-12-08 | 2006-06-22 | Gekkeikan Sake Co Ltd | メラニン前駆体の製造方法 |
JP2009178104A (ja) * | 2008-01-31 | 2009-08-13 | Gekkeikan Sake Co Ltd | ヘテロ接合性の消失を利用した二倍体細胞染色体特定領域のホモ化方法 |
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