JP2011024501A - 糖液の製造方法 - Google Patents
糖液の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011024501A JP2011024501A JP2009174662A JP2009174662A JP2011024501A JP 2011024501 A JP2011024501 A JP 2011024501A JP 2009174662 A JP2009174662 A JP 2009174662A JP 2009174662 A JP2009174662 A JP 2009174662A JP 2011024501 A JP2011024501 A JP 2011024501A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- derived
- glucosidase
- cellulose
- filamentous fungus
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】セルロース前処理物から糖液を製造する方法において、セルロース前処理物に好熱性菌由来βグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を添加し、酵素処理を行う、糖液の製造方法。好熱性菌由来βグルコシダーゼが、パイロコッカス属、またはサーモプラズマ属由来であり、糸状菌由来セルラーゼが、トリコデルマ属由来セルラーゼである、糖液の製造方法。
【選択図】なし
Description
一般的にセロビオハイドラーゼ、あるいはエンドグルカナーゼは、セルロース分解生成物であるセロビオースによって反応阻害を受ける。すなわち、セルラーゼによるセルロース分解反応において、その分解効率を向上させるためにβグルコシダーゼが存在することは極めて重要である。
(1)セルロース前処理物から糖液を製造する方法において、セルロース前処理物に好熱性菌由来βグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を添加し、酵素処理を行うことを特徴とする、糖液の製造方法。
(2)好熱性菌由来βグルコシダーゼが、パイロコッカス属またはサーモプラズマ属由来であることを特徴とする、上記(1)記載の糖液の製造方法。
(3)好熱性菌由来βグルコシダーゼが、配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは、それらの各アミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セロビオース分解活性を有するポリペプチド、であることを特徴とする、上記(1)または(2)記載の糖液の製造方法。
(4)好熱性菌由来βグルコシダーゼが、異種宿主によって生産されたものであることを特徴とする、上記(1)から(3)のいずれか記載の糖液の製造方法。
(5)糸状菌由来セルラーゼ混合物が、トリコデルマ属由来セルラーゼであることを特徴とする、上記(1)から(4)のいずれか記載の糖液の製造方法。
(6)酵素処理条件が、処理温度40℃〜60℃、処理pH3〜7、で行うことを特徴とする、上記(1)から(5)いずれか記載の糖液の製造方法。
(7)酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼを、重量比で1:1〜1:0.0005で添加することを特徴とする、上記(1)から(6)のいずれか記載の糖液の製造方法。
(8)酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの添加量として、セルロース前処理物1gに対し、0.01〜500mg添加し、酵素処理することを特徴とする、上記(1)から(7)のいずれか記載の糖液の製造方法。
(9)セルロース前処理物が、セルロース含有バイオマスを希硫酸処理してなることを特徴とする、上記(1)から(8)のいずれか記載の糖液の製造方法。
本発明では、セルロース含有バイオマスを糖液製造の原料として使用する。セルロース含有バイオマスとは、広く植物バイオマスに由来するセルロースのことを指し、例えば非食用の農産廃棄物、草本系植物、樹木、廃建材、紙などのことを指す。さらに具体的には、バガス、コーンストーバー、コーンコブ、スイッチグラス、稲藁、麦藁、樹木、木材、廃建材、新聞紙、古紙、パルプなどである。
エンドグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の中央部分から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、EC番号:EC3.2.1.4としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
本発明におけるβグルコシダーゼとは、βグリコシド結合である2糖を加水分解する活性(βグルコシダーゼ活性)を有する酵素のことを指す。好ましくは、2糖であるセロビオース、ガラクトース、の分解活性を有する酵素である。βグルコシダーゼ活性は、後述する実施例3に記載する方法で測定することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
糸状菌由来セルラーゼ混合物として、トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ(セルクラスト、シグマ・アルドリッチ・ジャパン)混合物を使用した。糸状菌由来セルラーゼ混合物は、分画分子量10000のポリエーテルスルホン製限外ろ過膜(ミリポア)を使用して、脱塩・精製を行った。タンパク質濃度は、BCA測定キット(BCA Protein Assay Regent kit、ピアス社)を使用して行い、牛アルブミン(2mg/mL)を標品として、562nmの吸光度を測定し、比色定量を行った。PfBGLは、実施例1で得られたタンパク質濃度を前記同様の方法で測定した。TvBGLは、実施例2で得られたタンパク質濃度を前記同様の方法で測定した。重量比率は、酵素反応に最終的に添加するタンパク質濃度(mg/mL)をもって算出した。
パイロコッカス属由来βグルコシダーゼの大腸菌での発現
パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子は、配列番号1記載の遺伝子を全合成し、pET11dのNcoIおよびBamHIにLigation High(東洋紡)を使用して連結し、JM109(タカラバイオ)に形質転換した。スクリーニングは、アンピシリンを抗生物質として含むLB寒天培地を用いて行った。形質転換されたJM109株より、作製したベクターpET−PfBGLをミニプレップキット(キアゲン)により単離し、塩基配列解析を行った。pET−PfBGLは、発現用大腸菌BL21(DE3)pLysS株に形質転換し、BL21−PfBGL株を作製した。BL21−PfBGL株を、アンピシリン含有LB培地10mLに植菌し、37℃で一晩振とう培養(前培養)を行った。本培養として、アンピシリン含有LB培地1Lに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長600nmでの吸光度OD600が0.6となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が0.4mMになるようにイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)を加え、さらに25℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、トリスHCl緩衝液(50mM、pH8.0)に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液を、85℃で15分保温し、βグルコシダーゼ以外の大腸菌に由来するタンパク質を凝集沈殿した。遠心分離により沈殿物を除去し、上清を分画分子量10000の再生セルロース製透析膜(スペクトラム・ラボラトリーズ製)を使用して、トリス緩衝液(50mM、pH8.0)に透析した。透析後の溶液をHiTrap Qカラム(NaCl勾配、0M〜0.5M)にて、さらに精製した。得られたタンパク質溶液をパイロコッカス属由来βグルコシダーゼ(PfBGL)として使用した。SDS−PAGE等による分析の結果、得られたPfBGLは、純度95%以上であることが確認できた。
サーモプラズマ属由来βグルコシダーゼの大腸菌での発現
サーモプラズマ・ボルカニウム由来のβグルコシダーゼ遺伝子は、配列番号3記載の遺伝子を全合成し、pET11dのNcoIおよびBamHIにLigation High(東洋紡)を使用して連結し、JM109(タカラバイオ)に形質転換した。スクリーニングは、アンピシリンを抗生物質として含むLB寒天培地を用いて行った。形質転換されたJM109株より、作製したベクターpET−TvBGLをミニプレップキット(キアゲン)により単離し、塩基配列解析を行った。pET−TvBGLは、発現用大腸菌BL21(DE3)pLysS株に形質転換し、BL21−TvBGL株を作製した。BL21−TvBGL株を、アンピシリン含有LB培地10mLに植菌し、37℃で一晩振とう培養(前培養)を行った。本培養として、アンピシリン含有LB培地1Lに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長600nmでの吸光度OD600が0.6となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が0.4mMになるようにイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)を加え、さらに25℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、トリスHCl緩衝液(50mM、pH8.0)に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液を、85℃で15分保温し、βグルコシダーゼ以外の大腸菌に由来するタンパク質を凝集沈殿した。遠心分離により沈殿物を除去し、上清を分画分子量10000の再生セルロース製透析膜(スペクトラム・ラボラトリーズ製)を使用して、トリス緩衝液(50mM、pH8.0)に透析した。透析後の溶液をHiTrap Qカラム(NaCl勾配、0M〜0.5M)にて、さらに精製した。得られたタンパク質溶液をサーモプラズマ属由来βグルコシダーゼ(TvBGL)として使用した。SDS−PAGE等による分析の結果、得られたTvBGLは、純度95%以上であることが確認できた。
アスペルギルス・ニガー由来のβグルコシダーゼの調製を行った。アスペルギルス・ニガー由来のβグルコシダーゼは、Novozyme188(シグマ・アルドリッチ・ジャパン)より調製した。まず、Novozyme188をタンパク質濃度20mg/mLとなるように、酢酸緩衝液(50mM、pH5.0)で希釈した。希釈した溶液を、酢酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム(GEヘルスケア)により精製した。次に、分画分子量30000の限外濾過膜(ミリポア)を使用して、さらに脱塩・濃縮を行い、アスペルギルス・ニガー由来βグルコシダーゼ(AspBGL)を精製した。SDS−PAGE等による分析の結果、得られたAspBGLは、純度95%以上であることが確認できた。
セロビオース分解活性(比活性)の比較
実施例1および実施例2で得られたパイロコッカス属由来βグルコシダーゼ(PfBGL)、サーモプラズマ属由来βグルコシダーゼ(TvBGL)、および比較例1で得られたアスペルギルス・ニガー由来βグルコシダーゼ(AspBGL)のタンパク質濃度あたりセロビオース分解活性(比活性)を測定した。セロビオース分解活性の測定は以下の方法で実施した。
糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼによるセルロース前処理物の分解と反応温度条件
糸状菌由来セルラーゼ混合物として、トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ(セルクラスト、シグマ・アルドリッチ・ジャパン)を使用した。糸状菌由来セルラーゼ混合物は、分画分子量10000のポリエーテルスルホン製限外ろ過膜(ミリポア)を使用して、脱塩・精製を行った。SDS−PAGE等による分析の結果、トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ混合物には、セロビオハイドラーゼが純度80%〜95%で含まれていた。
糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比の最適化
糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの重量比(混合比率)の最適化の検討を行った。好熱性菌由来βグルコシダーゼは、実施例1で調製したPfBGL、実施例2で調製したTvBGL、比較例1で調製したAspBGLを使用した。糸状菌由来セルラーゼ混合物は、実施例4で調製したトリコデルマ由来セルラーゼ混合物を使用した。
Claims (9)
- セルロース前処理物から糖液を製造する方法において、セルロース前処理物に好熱性菌由来βグルコシダーゼと糸状菌由来セルラーゼ混合物を添加し、酵素処理を行うことを特徴とする、糖液の製造方法。
- 好熱性菌由来βグルコシダーゼが、パイロコッカス属またはサーモプラズマ属由来であることを特徴とする、請求項1記載の糖液の製造方法。
- 好熱性菌由来βグルコシダーゼが、配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは、それらの各アミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有するアミノ酸配列を含み、かつ、セロビオース分解活性を有するポリペプチド、であることを特徴とする、請求項1または2記載の糖液の製造方法。
- 好熱性菌由来βグルコシダーゼが、異種宿主によって生産されたものであることを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項記載の糖液の製造方法。
- 糸状菌由来セルラーゼ混合物が、トリコデルマ属由来セルラーゼであることを特徴とする、請求項1から4のいずれか1項記載の糖液の製造方法。
- 酵素処理条件が、処理温度40℃〜60℃、処理pH3〜7で行うことを特徴とする、請求項1から5のいずれか1項記載の糖液の製造方法。
- 酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼを、重量比で1:1〜1:0.0005で添加することを特徴とする、請求項1から6のいずれか1項記載の糖液の製造方法。
- 酵素処理条件が、糸状菌由来セルラーゼ混合物と好熱性菌由来βグルコシダーゼの添加量として、セルロース前処理物1gに対し、0.01〜500mg添加し、酵素処理することを特徴とする、請求項1から7のいずれか1項記載の糖液の製造方法。
- セルロース前処理物が、セルロース含有バイオマスを希硫酸処理してなることを特徴とする、請求項1から8のいずれか1項記載の糖液の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009174662A JP5614673B2 (ja) | 2009-07-27 | 2009-07-27 | 糖液の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009174662A JP5614673B2 (ja) | 2009-07-27 | 2009-07-27 | 糖液の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011024501A true JP2011024501A (ja) | 2011-02-10 |
JP5614673B2 JP5614673B2 (ja) | 2014-10-29 |
Family
ID=43634012
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009174662A Expired - Fee Related JP5614673B2 (ja) | 2009-07-27 | 2009-07-27 | 糖液の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5614673B2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013008480A1 (ja) * | 2011-07-14 | 2013-01-17 | 東レ株式会社 | 変異型βグルコシダーゼ、バイオマス分解用酵素組成物および糖液の製造方法 |
WO2014077264A1 (ja) * | 2012-11-16 | 2014-05-22 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | バイオマス分解用組成物およびそれを用いた糖液の製造方法 |
KR20150076346A (ko) * | 2013-12-26 | 2015-07-07 | 주식회사 포스코 | 목질계 바이오매스의 발효 효율 향상 방법 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009273379A (ja) * | 2008-05-13 | 2009-11-26 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | セルロースの糖化方法 |
-
2009
- 2009-07-27 JP JP2009174662A patent/JP5614673B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009273379A (ja) * | 2008-05-13 | 2009-11-26 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | セルロースの糖化方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6014001190; Eur. J. Biochem., 1993, Vol.213, p.305-312 * |
JPN6014001192; J. Bacteriol., 1995, Vol.177, No.24, p.7105-7111 * |
JPN6014001194; Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, vol.97, no.26, p.14257-14262 * |
JPN6014001196; Biotechnol. Prog., 2001, vol.17, p.110-117 * |
JPN6014001197; Biotechnol. Prog., 2001, vol.17, p.104-109 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013008480A1 (ja) * | 2011-07-14 | 2013-01-17 | 東レ株式会社 | 変異型βグルコシダーゼ、バイオマス分解用酵素組成物および糖液の製造方法 |
US9080164B2 (en) | 2011-07-14 | 2015-07-14 | Toray Industries, Inc. | Mutant β-glucosidase, enzyme composition for decomposing biomass, and method of producing sugar solution |
WO2014077264A1 (ja) * | 2012-11-16 | 2014-05-22 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | バイオマス分解用組成物およびそれを用いた糖液の製造方法 |
KR20150076346A (ko) * | 2013-12-26 | 2015-07-07 | 주식회사 포스코 | 목질계 바이오매스의 발효 효율 향상 방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5614673B2 (ja) | 2014-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20190161772A1 (en) | Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions | |
JP6148183B2 (ja) | セルラーゼ組成物並びにこれを用いリグノセルロース系バイオマスの発酵性糖質への変換を向上させる方法 | |
KR20190054187A (ko) | D-타가토스의 효소적 생산 | |
US9080164B2 (en) | Mutant β-glucosidase, enzyme composition for decomposing biomass, and method of producing sugar solution | |
JP5614673B2 (ja) | 糖液の製造方法 | |
US9193963B2 (en) | Mutant endoglucanase | |
US10435728B2 (en) | Endoxylanase mutant, enzyme composition for biomass decomposition, and method of producing sugar solution | |
Moriyoshi et al. | Expression and characterization of a thermostable acetylxylan esterase from Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis involved in the degradation of insoluble cellulose acetate | |
US20240117331A1 (en) | Polypeptides having pectinase activity, polynucleotides encoding same, and uses thereof | |
EP2794871A1 (en) | Endoglucanase 1b (eg1b) variants | |
JP6332584B2 (ja) | Acremoniumcellulolyticus(アクレモニウム・セルロリティカス)由来のβ−グルコシダーゼ及びその利用 | |
AU2015261652B2 (en) | Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions | |
US20220356499A1 (en) | Endoglucanase, and use thereof | |
JPWO2018155650A1 (ja) | キシラナーゼ変異体、及びバイオマス分解用酵素組成物 | |
KR101224505B1 (ko) | 자일라네이즈 및 익스팬신을 포함하는 자일란 분해 촉진용 조성물 | |
US9487770B2 (en) | Recombinant cellulase and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120727 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120731 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140121 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140324 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140805 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140829 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5614673 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |