JP2011019414A - 皮膚光損傷予防又は治癒剤の評価又は選択方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の工程(A)〜(D):
(A)TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞に、被検物質を接触させる工程、
(B)当該細胞におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を測定する工程、
(C)上記(B)で算出された発現量を、被検物質をTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞に接触させない対照群におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量と比較する工程、
(D)上記(C)の結果に基づいて、TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を増加させる被検物質を皮膚光損傷の予防又は治癒剤として評価又は選択する工程、を含む、皮膚光損傷の予防又は治癒剤の評価又は選択方法。
【選択図】なし
Description
斯かる光損傷皮膚のメカニズムを解明したり、光損傷に起因する皮膚トラブルの予防・治癒に有用な医薬品等を評価したりするためには、ヒトの光損傷皮膚をより忠実に反映できる系が有用である。
また、特許文献2では、レチノールとシトステロールを組み合わせることにより、内在的老化に関連するMMP−1及びMMP−3の含有量を低下させること、及びTIMP−1の含有量を増大させることが記載されているが、その実施例に示すデータでは、前記組み合わせにより必ずしもMMP−1及びMMP−3の含有量は低下しておらず、また同様に、TIMP−1の含有量も増大していない。また、当該特許文献2は、光損傷に関するものでもない。
しかしながら、これまでにUVBの長期照射がTIMP−1へ与える影響については全く知られていなく、皮膚光損傷とTIMP−1との関連性についても知られていない。
(A)TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞に、被検物質を接触させる工程、
(B)当該細胞におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を測定する工程、
(C)上記(B)で算出された発現量を、被検物質をTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞に接触させない対照群におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量と比較する工程、
(D)上記(C)の結果に基づいて、TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を増加させる被検物質を皮膚の光損傷予防又は治癒剤として評価又は選択する工程、
を含む、皮膚光損傷の予防又は治癒剤の評価又は選択方法を提供するものである。
ここで、TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞の播種時の細胞濃度は、24wellプレートを使用した場合、0.5×103〜1.0×105cells/wellとするのが好ましく、特に1.0×103〜3.5×104 cells/wellとするのが好ましい。また、被物質の添加濃度は、0.00001〜10質量%(固形残分)とするのが好ましく、特に0.0001〜3質量%(固形残分)とするのが好ましい。
(1)severe combined immunodeficient(SCID)マウスへの腹部皮膚の移植
Cincinnati大学病院(Cincinnati、OH)におけるabdominoplasty手術由来の白人(Caucasian、41歳)女性の腹部皮膚を適当な大きさ(約2.0 cm×2.0 cm〜約3.0 cm×3.0 cm)にトリミングし、Phosphate Buffered Saline(PBS)で洗浄後、L-glutamineとantibiotic/antimycotic(Invitrogen)を含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)中に浸漬させて移植まで保存した。約1週間馴化した4〜6週齢の雌のSCIDマウス(Taconic、NY)の背部をCincinnati子供病院の動物施設(Children's Hospital Research Foundation、Cincinnati、OH)にて剃毛後、isofluorane/oxygen(3%/0.8 liter)を含む箱の中で麻酔した。その後isofluorane/oxygen(2%/0.7 liter)を吸引させながらマウス背部皮膚を切除し(直径約2−3cm)、ヒト腹部皮膚をマウス皮膚に縫合した。移植した腹部皮膚とマウス皮膚の境界にはsensorcaineを添加し、感覚脱失の処理を施した。移植後、マウスは1時間もしくは麻酔から覚めるまで37℃にて維持した。
移植腹部皮膚が完全に癒合した移植後10週間が経過した時点で、Hachiyaらが示す方法(Hachiya A, et al., Am J Pathol, 174, 401 (2009))でヒト移植皮膚に光損傷を誘導した。すなわち、302 nm をピークとするUVBが照射されるフィルターがついたUVBランプ(34-0044-01 lamps、UVB、Upland、CA)を使用しての照射を開始した。UVBのエネルギー量はUV LIGHT METER、UV-340 MSR7000(Lutron Electronic Enterprise Co. ltd、 Taiwan)を用いて測定した。フィルターから移植皮膚表面までの距離は約30 cmを確保し、最初の1週間は1 minimal erythema dose(MED)に相当する40 mJ/cm2のUVBを照射した。3週目まで10 mJ/cm2ずつ照射量を増加し、その後6週目まで60 mJ/cm2の量を維持した。週に5日間照射したため、totalで1.65 J/cm2のUVBを照射したことになる。UVBを照射する間は、底面積約100 cm2の透明容器内をマウスが自由に動けるようにした。また、1日おきにUVBを照射した直後にTIMP−1中和抗体の皮内投与を行った。投与濃度は、Reed MJ, et al., Microvasc Res, 65, 9 (2003)で用いられていた濃度の4倍量に相当する20μg/mLに設定した。
UVB照射により移植腹部皮膚上に誘導される形状の変化を視覚的に観察した。UVBを照射せずに非特異的なIgGを皮内投与した群(Figure1上段)においては、見た目上大きな変化は認められなかったのに対し、UVBを連続照射しながら非特異的なIgGを皮内投与した群では、4週間が経過した時点で皮膚の表面に粗い構造が観察され始め、6週間連続照射した時点ではそれが明瞭に形成されていた(Figure1中段)。一方、UVBを連続照射しながらTIMP−1中和抗体を皮内投与した群(Figure1下段)では、UVBを連続照射しながら非特異的なIgGを皮内投与した群よりも早く、4週間連続照射した時点で、皮膚の表面が明らかに粗くなっていることが確認された。また、表面粗さと同様に顕著な落屑も観察された。
(1)紫外線非照射皮膚の各TIMPsの発現
DallasのコントラクトラボラトリーであるStephens &Associates, Inc.(Carrollton, TX,)に依頼して、20代と50代の白人(Caucasian)女性の上腕内側部皮膚をパンチバイオプシーにより採取し、その一部から常法に従いTotal RNAを抽出した。cDNAを作製してから特異的なprobe及び7300 Real Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて定量的なTIMP-1、TIMP-2及びTIMP-3の遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現解析の内部標準として、RPLP0の発現を用いた。
上記(1)で採取したヒト皮膚に対して6週間の連続照射(40〜60 mJ/cm2)を行ったが、その最終照射から24時間後にTotal RNAを抽出し、cDNAを作成してから特異的なprobe及び7300 Real Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて定量的なTIMP-1、TIMP-2及びTIMP-3の遺伝子発現解析を行った。なお、内部標準には上記と同様にRPLP0の発現を用いた。
上腕内側部皮膚由来のTotal RNAを用いてTIMP-1、TIMP-2及びTIMP-3の相対的発現量を解析したところ、その発現比率は5:1:5(1:0.2:1)であった(Figure2A)
また、光損傷モデル皮膚とUVB未照射の移植皮膚におけるTIMP-1、TIMP-2、TIMP-3の遺伝子発現量を比較したところ、TIMP-1の発現は慢性的なUVB照射による光損傷において顕著に減少するのに対し、TIMP-2、TIMP-3の発現は光損傷時においても変化は認められなかった(Figure2B)。
以上の結果から、TIMPsの中でもTIMP-1の顕著な発現減少がとりわけ光損傷の亢進に寄与しているものと考えられた。
(1)方法
本スクリーニング方法の概要をFigure3に示した。すなわち、正常ヒト皮膚線維芽細胞を2×104 cells/wellの細胞密度で24wellプレートに播種し、0.5mLの10%FBS含有DMEM(Sigma)を用いて培養を開始した。その24時間後に0.5mLの血清不含培地に交換し、同時に被検物質として各種植物エキス(50% EtOH抽出品)を添加した。エキスの添加濃度は0.001%(固形残分濃度)とし、コントロールとして、等量の50% EtOHを添加したものを用いた。エキス添加から48時間後に、測定サンプルとして培地および細胞をそれぞれ回収した。培地は各wellよりそのまま回収後、12,000 rpmで2分間遠心し、その上清中のTIMP-1のタンパク質量をhuman TIMP-1 assay system(GEヘルスケア バイオサイエンス(株))を用いて測定した。
また、各wellより培地を回収後、細胞を0.5 mLのPBSで2回洗浄し、0.1 N NaOHを125μL添加して5分程度室温で細胞を溶解させたものを細胞溶解液として回収した。この細胞溶解液のタンパク質量をBCA Protein Assay Kit (Pierce)を用いて測定することで、添加した各種植物エキスの毒性を評価した。
各種植物エキス(抽出溶媒50% EtOH)のTIMP-1産生に対する効果について評価を行ったところ、シソエキス及びセイヨウハッカにおいて、TIMP−1タンパク質量がコントロール(対照群)に対する相対値で2.0倍以上増加していた(表1)。なお、コントロール(50% EtOH添加)に対してタンパク質量比が0.5以下になるものは排除した。また、いずれの植物エキスにも細胞毒性はみられなかった。
シソエキスは、光老化防御剤として既に知られており(特開2002-104924号公報)、また、セイヨウハッカエキス(ペパーミント)は、コラゲナーゼ(MMP-1)阻害剤として知られている(特開2000-159631号公報)。
これらの結果から、TIMP−1の産生増加作用を指標として、皮膚の光損傷に対する予防又は治癒効果を有する物質を評価又は選択できることが確認された。
Claims (1)
- 以下の工程(A)〜(D):
(A)TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞に、被検物質を接触させる工程、
(B)当該細胞におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を測定する工程、
(C)上記(B)で算出された発現量を、被検物質をTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞に接触させない対照群におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量と比較する工程、
(D)上記(C)の結果に基づいて、TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を増加させる被検物質を皮膚光損傷の予防又は治癒剤として評価又は選択する工程、を含む、皮膚光損傷の予防又は治癒剤の評価又は選択方法。
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