JP2011015682A - 細胞及び生物の寿命を延ばし、ストレス耐性を増す方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細胞内のNAD+再利用経路を通る流れを、例えば、NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択される1つ以上のタンパク質のレベル又は活性を調節するなどにより、調節するステップを含む。別の方法は、細胞内のニコチンアミドのレベルを調節するステップを含む。
【選択図】なし
Description
生理学的研究や、より最近の遺伝子発現パターンのDNAアレイ解析により、老化は複雑な生物学的プロセスであることが裏付けられている。対照的に、モデル生物での遺伝子研究では、生物の環境又は遺伝子の構成に比較的小さな変化があっても、老化プロセスが劇的に遅くなることが実証されている。例えば、数多くの多様な生物の寿命は、単にカロリ制限と呼ばれる食餌療法でカロリ摂取を制限するだけで、大きく延ばすことができる(1−3)。
このような調節系は、資源を、成長及び生殖から、ストレス耐性をもたらす経路へと方向修正することにより、生物が逆境を生き延びられるようにするために、進化の過程で生じたのかも知れない(4,6)。
NAD+再利用経路の一番目の段階では、ニコチンアミドのニコチン酸及びアンモニアへの加水分解が、pncA 遺伝子産物により触媒される(33)。pncAに対して相同性のS.セレビジエの遺伝子 YGL037は最近、名称PNC1 (SGD)を与えられている(34)。S.セレビジエではNPT1遺伝子にコードされているニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、この反応からのニコチン酸をニコチン酸モノヌクレオチド (NaMN)に転化させる(35−38)。この時点で、NAD+再利用経路及びde novo NAD+経路が一つになり、NaMNが、デスアミド-NAD+(NaAD)に、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ(NaMNAT) により転化させられる。S.セレビジエでは、YLR328(39)と、特徴付けがまだ済んでいないORFであるYGR010という、細菌 NaMNAT遺伝子に対して相同性を持つ2つの推定ORFがある(23,39)。我々はこれら2つのORFをそれぞれNMA1 及びNMA2と言及する。サルモネラでは、NAD+の再生の最終段階は、NADシンセターゼにより触媒される(40)。まだ特徴付けの済んでいないORFのQNS1は、NAD シンセターゼをコードしていると予測される(23)。
(Campisi, 2000 及びGuarente, 2000にレビュー)。
HDACの始祖ファミリである。Sir2様デアセチラーゼはTSAによって阻害されず、NAD+依存的であるという固有の特徴を有する(10’−13’)。このクラスのタンパク質は、細菌からヒトまで、幅広い種類の生物に見られる。酵母のHst2及びヒトのSIRT2という少なくとも2種のSir2相同体が細胞質に局在しており、ヒトSIRT1は最近、p53を脱アセチル化の標的とすることが示された(11’13’−15’)。これらの結果は、このファミリのメンバのすべてが、ヒストン又は他の核内基質に特異的という訳ではないことを示している。
は、100-200 回タンデムに反復した9 kbのユニットから成り、リボゾームRNAをコードしている。酵母の老化の主要な原因は、染色体外rDNA環(ERC)の切り出しにつながる、これらの反復間の組換えから生ずる(25’−27’)ことが示されている。ERCは複製はするが分離して娘細胞になることはできず、従って細胞分裂時には指数関数的に増幅される。ERCは、古い細胞の酵母ゲノム全体のそれよりも大きなDNA含有量になるまで蓄積することがあり、必須な転写及び/又は複製因子を滴定することにより、細胞を致死させると考えられている(28’)。Sir2 は、rDNAに一体化されたPol
II転写型遺伝子をサイレント状態にするが、この遺伝子座でのその主な働きは、組換えを抑制することであるとの証拠がある。SIR2 を欠失させるとrDNAサイレント状態が消え、マーカ遺伝子がrDNAの外で組換えられる頻度が10倍に増加する(29’)。その結果、ERCの形成が増し、寿命が劇的に短縮される(29’,30’)。
ある実施態様では、本発明は、細胞内のNAD+再利用経路を通る流れを調節するステップを含む、細胞の寿命やそのストレスへの耐性を調節する方法を提供するものである。本方法は、細胞内のNAD+再利用経路を通る流れを増加させるステップを含む、細胞の寿命を増加又は延命させること、又は、そのストレスへの耐性を増すことを含むものであろう。NAD+再利用経路を通る流れの調節は、NAD+及びNADHの定常状態レベルを基本的に変えることなく、そして基本的には細胞内のNAD+/NADH比を維持することにより、起こさせられよう。
(NMNAT-1 及び2);NMA1
及び2 並びにそのヒト相同体、がある。
前記酵素の活性を判定するステップであって、但しこの場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下での前記酵素の活性の違いは、前記検査化合物が、細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節する化合物であることを示す、ステップと、を含む。さらに本方法は、細胞を前記検査化合物に接触させるステップと、細胞の寿命が調節されたかどうかを判定するステップとを含んでもよい。さらに本方法は、細胞を前記検査化合物に接触させるステップと、細胞のストレス耐性が調節されたかどうかを判定するステップとを含んでもよい。
本発明は、酵母細胞の寿命は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)+再利用経路(図6及び図7に示す)を通る流れを増すことにより、少なくとも約60%、延長できるという発見に少なくとも基づくものである(図1に示す)。加えて、ここでは、NAD+再利用経路を通る流れのこのような増加は、基本的にはNAD+及びNADHレベルの増加なしに、また基本的には、NAD+/NADH定数の比を維持することにより、起きることが示された。実施例で示すように、NAD+再利用経路を通る流れを増し、またそれにより、細胞の寿命を増すには、例えばNPT1、PNC1、NMA1及びNMA2など、NAD+再利用経路に関与する遺伝子の付加的なコピーを細胞に導入することにより、可能である。さらに実施例では、NAD+再利用経路を通る流れを増すと、熱ショックなど特定の種類のストレスから酵母細胞が保護されることも示されている。加えて、PNC1を過剰発現させると、サイレント状態、寿命やストレス耐性が増し、例えば紫外線(U.V.)及び臭化エチジウム及び浸透圧ストレスにより引き起こされるDNA損傷から細胞が保護される。他方、PNC1を欠失させると寿命が延びることを妨げ、細胞がストレスに感受性となる。
ここで用いられる以下の用語及び文言は、以下に記載する意味を有するものとする。他にそうでないと明示しない限り、ここで用いられた技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する当業の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of
Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USAに解説されている。好ましくは、配列中のギャップを許すアライメント・プログラムを用いて配列をアライメントするとよい。スミス・ウォーターマンは、配列アライメント時にギャップを許す種類のアルゴリズムの一つである。Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)を参照されたい。さらに、ニードルマン及びワンシュのアライメント法を用いたGAPプログラムを用いても、配列をアライメントすることができる。代替的な検索戦略は、MASPARコンピュータで作動するMPSRCHソフトウェアを用いるものである。MPSRCHはスミス・ウォーターマンのアルゴリズムを用いて配列を超並列コンピュータで採点する。このアプローチは、関係の遠い対合を探し出す能力が高く、特に小さなギャップ及びヌクレオチド配列エラーに寛容である。核酸にコードされたアミノ酸配列を用いると、タンパク質及びDNAの両方のデータベースを検索することができる。個々の配列を持つデータベースは、上記のMethods
in Enzymology, ed. Doolittleに解説されている。データベースには、Genbank、EMBL、及び日本のDNAデータベース(DDBJ)がある。
の560に記載された定義を有する。
ある実施態様では、NAD+再利用経路を通る流れを増すことにより、細胞の寿命を増す、及び/又は、細胞を特定のストレスから保護する。これは、例えば、 NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択されるタンパク質など、NAD+再利用経路に関与する少なくとも1つのタンパク質のレベル又は活性を増すことにより、達成することができる。
001147 及びAAB59317に提供されている。登録番号L11274 及びAAB59317はまた、それぞれS.セレビジエのヌクレオチド及びアミノ酸配列にも言及しているようである。細菌でのNPT1相同体はPncB(35、37及び38)である。E. coliの NPT1はGenBank登録番号J05568として提供されている。そのヒトヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank 登録番号 BC006284 及びAAH06284、並びにそれぞれ X71355 及びCAA50490、AAH32466 及びBC032466
に提供されており、Chong et al. (1993) Genomics 18:355に解説されている。該ヒトヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号13及び14にも記載しておく(並びにGenBank登録番号BC032466に相当する)。該ヒトタンパク質は、さらに、「腎リン酸ナトリウム輸送タンパク質」とも言及されている。マウスNPT1ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、GenBank 登録番号X77241 及びCAA54459に提供されており、Chong et al. (1995) Am. J. Physiol. 268:1038に解説されている。マウスNPT1のプロモータ領域は GenBank登録番号 AF361762として提供されており、Soumounou et al. (2001)
Am J. Physiol. 281: F1082に解説されている。NPT1はまた、番号3957135でイメージ(原語:IMAGE)クローンとしても記載されている。NPT1相同体のアライメントを図15に示す。
YGL037とも言及され、Ghislain et al. (2002) Yeast 19:215に解説されている。ナンキンマメ(Arachis hypogaea)PNC1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、GenBank登録番号M37636及びAAB06183に提供されており、Buffard et al. (1990) PNAS 87:8874に解説されている。ヒト相同体のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank登録番号BC017344及びAAH17344、それぞれAK027122 及びNP 078986;それぞれXM 041059及びXP 041059;並びにそれぞれNM 016048及び NP 057132に提供されている。ヒトPNC1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号15及び16に挙げてあるが、GenBank登録番号BC017344に相当する。ヒト、ハエ及びS.セレビジエのPNC1のアライメントを図16に示す。
及びXP 087387;並びにそれぞれAF345564及びAAK52726、並びにNP 073624;AAL76934;NP 073624;及びAF314163に提供されている。ヒトNMA1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号17及び18に記載されており、GenBank 登録番号 NM 022787に相当する。イメージ(原語:IMAGE)クローンは、番号4874147及びHRCクローンhrc08458に提供されている。細菌相同体は、例えばZhang et al. (2002) Structure 10:69に解説されている。
455:13に解説されたORF YGR010に相当する。NMA2は、細菌NaMNAT遺伝子のS.セレビジエ相同体である。ヒト相同体のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank 登録番号NM 015039及びNP 055854に提供されている。ヒトNMA2のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号19及び20に記載されており、GenBank
登録番号 NM 015039に相当する。
al. (1994) Clin. Chim. Acta 229: 15-25 及びSestini et al.
(2000) Archives of Biochem. Biophys. 379:277に解説されている。PNC1タンパク質の活性を判定するための検定法は、例えばGhislain et al. Yeast 19:215に解説されている。NMA1及びNMA2タンパク質の活性を判定するための検定法は、例えば上記のSestini et
al.に解説されている。代替的には、このようなタンパク質の活性を、細胞の寿命が判定されるような検定法で検査することができる。例えば、細胞に、NPT1、PNC1、NMA1又はNMA2タンパク質の一部分をコードする配列の一つ以上のコピーを含む核酸、又は、コントロール核酸、をトランスフェクトし、該細胞の寿命を比較する。前記タンパク質のうちの一つの一部分をトランスフェクトされた細胞の寿命の方が長いことは、前記タンパク質の当該部分が、生物学的に活性な部分であることの指標である。細胞の寿命を判定するための検定法は当業で公知であるが、ここでもさらに解説されている。具体的には、哺乳動物細胞の寿命を判定するための検定法は、例えばCell Growth, Differentiation and Senescence: A Practical
Approach. George P. Studzinski (ed.)に解説された通りに行うことができる。寿命を測定する代わりに、あるタンパク質のある部分が生物学的に活性な部分であるかを判断するために、熱ショックなどの特定のストレスに対するトランスフェクト細胞の耐性を測定することもできる。特定のストレスに対する耐性を測定する方法は当業で公知であるが、ここでもさらに解説されている。具体的には、哺乳動物細胞の、熱ショックに対する耐性を判定する検定法は、例えば Bunelli et al. (1999) Exp. Cell Res. 262: 20に解説された通りに行うことができる。
biology-hybridization with nucleic acid probesの例えば第1部第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic
acid probe assays,” Elsevier, New York は、核酸ハイブリダイゼーションに対する基本的な指針を提供するものである。
et al., Ann NY Acad Sci 126-139, 1995)。次に、多様な脂質又はリポソーム物質を用いたDNAの調合を、公知の方法及び材料を用いて行い、レシピエント哺乳動物に送達する。例えばCanonico
et al, Am J Respir Cell Mol Biol 10:24-29, 1994;Tsan et
al, Am J Physiol 268; Alton et al., Nat Genet.
5:135-142, 1993 及びカーソンらによる米国特許第5,679,647号を参照されたい。
kBの直線状の二本鎖DNAウィルスであるアデノウィルスの遺伝子構造の知見により、アデノウィルスDNA中の大きな断片を、最大8 kBの外来配列に置換することが可能である。レトロウィルスとは対照的に、アデノウィルスDNAをホスト細胞内に感染させても、染色体への組込みは起きない。なぜなら、アデノウィルスDNAは、潜在的な遺伝毒性なしでエピソームとして複製することができるからである。さらに、アデノウィルスは構造上安定であり、また、広汎な増幅後でも、ゲノム再編成が検出されたことはない。アデノウィルスは、ほぼすべての上皮細胞に、それらの細胞周期段階に関係なく感染することができる。これまでのところ、アデノウィルス感染は、例えばヒトの急性呼吸器疾患など、関係があるのは軽度の疾患のみであるようである。
vivo遺伝子輸送ベクタとしての安全性や、治療上の可能性が実証されている。さらに、外来DNAを運ぶアデノウィルスゲノムの能力は、他の遺伝子送達ベクタに比較して大きい(最高8キロベース)(上記のBerkner et al.;Haj-Ahmand and Graham (1986)
J. Virol. 57:267)。現在用いられており、従って本発明で好適な大半の複製欠陥アデノウィルスベクタは、ウィルスE1及びE3遺伝子の全部又は一部を欠失させてあるが、アデノウィルス遺伝物質の80%もが残されたものである(例えば Jones et al., (1979) Cell 16:683; 上記のBerkner
et al.;及びGraham et al., in Methods in Molecular
Biology, E.J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7. pp. 109-127を参照されたい)。本発明の挿入されたポリヌクレオチドの発現を、例えばE1A プロモータ、主要後期プロモータ (MLP)及び関連するリーダ配列、ウィルスE3プロモータ、又は外因的に加えられたプロモータ配列の制御下に置くことができる。
Science 252:431-434; and Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155を参照されたい)。アデノウィルス株Ad型 5 dl324又は他のアデノウィルス株(例えばAd2、Ad3、Ad7等)を由来とする適したアデノウィルスベクタは当業者に公知である。組換えアデノウィルスは、非分裂細胞に感染できず、また気道上皮 (上記のRosenfeld et al., (1992) )、内皮細胞 (Lemarchand et al., (1992) PNAS USA 89:6482-6486)、肝細胞 (Herz and Gerard, (1993) PNAS USA 90:2812-2816) 及び筋細胞 (Quantin et al., (1992) PNAS USA 89:2581-2584)を含め、幅広い細胞種を感染させるために用いることができるために、特定の状況で有利な場合がある。
96/18418);コヴェスディらの PCT/US95/07341 (WO 95/346671);イムラーらのPCT/FR94/00624 (WO94/28152);ペロコーデットらのPCT/FR94/00851
(WO 95/02697)、ワンらのPCT/US95/14793 (WO96/14061) に解説されているように、アデノウィルス遺伝子E1、E2a、及びE4 DNA配列のうちの一つ以上を、これらの遺伝子のうちの一つ以上を変異又は欠失させてあるアデノウィルスベクタをパッケージするために、含めることができる。
158:97-129を参照されたい)。
Samulski et al., (1989) J. Virol. 63:3822-3828; and McLaughlin et al., (1989)
J. Virol. 62:1963-1973を参照されたい)。300塩基対という小さなAAVを含有するベクタをパッケージし、組み込ませることができる。外因性DNAのためのスペースは、約4.5kbに限られている。Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260に解説されたものなどのAAVベクタを、DNAを細胞内に導入するために用いることができる。多種の核酸が、様々な細胞種にAAVベクタを用いて導入されてきた(例えばHermonat et al., (1984) PNAS USA 81:6466-6470; Tratschin et al.,
(1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al., (1988) Mol. Endocrinol.
2:32-39; Tratschin et al., (1984) J. Virol. 51:611-619; and Flotte et al.,
(1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790を参照されたい)。
適したDNAリンカを連結し、制限消化し、該ITR間の部位に連結するといった方法により、当該導入遺伝子のサブクローニングに用いることができる。AAVベクタの能力は約4.4kbである (Kotin, R.M., Human Gene Therapy
5:793-801, 1994 and Flotte, et al. J. Biol.Chem. 268:3781-3790, 1993)。
63:3822が解説したようにpAAV/Adを用いることで改良したHermonat and Muzyczka (1984) PNAS 81:6466に解説された通りに作製することができる。ウィルスの濃縮及び精製は、AAVベクタのin vivo発現の最初の報告(Flotte, et al. J.Biol. Chem.
268:3781-3790, 1993)で用いられたように、塩化セシウム勾配でのバンディングや、又は、O'Riordan
et al., WO97/08298に解説されたようなクロマトグラフィ精製など、報告された方法により、行うことができる。AAVベクタのin vitroパッケージングのための方法も利用でき、粒子内にパッケージされるDNAの大きさに制限がないという長所がある。(ツォウらの1997年11月18日発行の米国特許第5,688,676号を参照されたい)。この手法は、無細胞パッケージング抽出物の調製を含む。
Vectors”, In: Rodriguez and Denhardt ed. Vectors: A
Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses. Stoneham:Butterworth;
Temin, (1986) “Retrovirus Vectors for Gene Transfer:
Efficient Integration into and Expression of Exogenous DNA in Vertebrate Cell
Genome”, In: Kucherlapati ed. Gene Transfer. New York:
Plenum Press; 上記のMann et al., 1983)。次に、該組換えレトロウィルスを含有する培地を採集し、選択的には濃縮し、遺伝子輸送に用いる。レトロウィルス・ベクタは幅広い細胞種に感染することができる。組込み及び安定な発現には、ホスト細胞の分裂が必要である(Paskind et al. (1975) Virology 67:242)。この局面は、PVRの治療に特に関係する。なぜなら、これらのベクタにより、増殖する細胞の選択的ターゲティングが可能となり、即ち、PVR対象の眼においてこれらは唯一増殖性のものであるため、網膜上皮の細胞の選択的ターゲティングが可能となるからである。
Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14 及び他の標準的な実験室用手引きに見ることができる。適したレトロウィルスの例には、当業者に公知のpLJ、pZIP、pWE 及び pEMがある。好適なレトロウィルスベクタはpSR MSVtkNeo (Muller
et al. (1991) Mol. Cell Biol. 11:1785 及びpSR MSV(XbaI)
(Sawyers et al. (1995) J. Exp. Med. 181:307) 及びその由来株である。例えば、クラックソンらによるPCT/US96/09948に解説されているように、これらのベクタの両方にある固有のBamHI部位は、ベクタをBamHIで消化することで取り除くことができ、Klenowで充填し、再連結すれば、それぞれpSMTN2 及びpSMTX2を生じさせることができる。環境栄養性及び両栄養性レトロウィルス系の両方を調製するために適したパッケージングウィルス系の例には、Crip、Cre、2 及びAmがある。
(1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan, (1988) PNAS USA 85:6460-6464;
Wilson et al., (1988) PNAS USA 85:3014-3018; Armentano et al., (1990) PNAS USA
87:6141-6145; Huber et al., (1991) PNAS USA 88:8039-8043; Ferry et al., (1991)
PNAS USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., (1991) Science 254:1802-1805; van
Beusechem et al., (1992) PNAS USA 89:7640-7644; Kay et al., (1992) Human Gene
Therapy 3:641-647; Dai et al., (1992) PNAS USA 89:10892-10895; Hwu et al.,
(1993) J. Immunol. 150:4104-4115; 米国特許第4,868,116号;米国特許第4,980,286号;PCT出願WO
89/07136; PCT 出願WO 89/02468;PCT出願 WO 89/05345;及びPCT出願
WO 92/07573によるレビューを参照されたい)。
86:9079-9083; Julan et al., (1992)
J. Gen Virol 73:3251-3255; and Goud et al., (1983) Virology 163:251-254);あるいは細胞表面リガンドをウィルスenvタンパク質に結合させる (Neda et al., (1991) J. Biol.
Chem. 266:14143-14146)方法がある。結合は、タンパク質又は他の多様体との化学的架橋の形(例えばenvタンパク質をアシアロ糖タンパク質に転化させるラクトースなど)や、融合タンパク質(例えば一本鎖抗体/env融合タンパク質)を作製することによってもよい。この技術は、特定の組織種に感染を制限又は方向付けるために有用であるが、環境栄養性ベクタを両栄養性ベクタに変換するためにも用いることができる。
expression vectors,” In: Rodriguez R L, Denhardt D T,
ed. Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Stoneham:
Butterworth,; Baichwal and Sugden (1986) “Vectors for
gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression
of transferred genes,” In: Kucherlapati R, ed. Gene
transfer. New York: Plenum Press; Coupar et al. (1988) Gene, 68:1-10)、及びいくつかのRNAウィルスから得られてきた。好適なウィルスには、アルファウィルス、ポックスウィルス、アレナウィルス、ワクシニアウィルス、ポリオウィルス等がある。これらは、多種の哺乳動物細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を持つ(Friedmann (1989) Science, 244:1275-1281 ; 上記のRidgeway, 1988;上記のBaichwal and Sugden, 1986;Coupar et al., 1988; Horwich et al.(1990) J.Virol., 64:642-650)。
Principles and Practice” Third Ed. Springer-Verlag,
N.Y. 1994を参照されたい)。ある実施態様では、本ポリペプチドを、約6個の連続したヒスチジン残基から成るエピトープ・タグを含む融合ポリペプチドとして作製する。こうして、この融合ポリペプチドを、Ni++カラム上で精製することができる。前記タグと当該ポリペプチドとの間にプロテアーゼ部位を挿入することにより、本ペプチドをNi++カラム上で精製後に前記タグを取り外すことができる。これらの方法は当業で公知であり、市販のベクタ及びアフィニティ・マトリックスは市販のものを入手することができる。
Cell 55:1179-1188)。別の実施態様では、前記内部移行ペプチドはドゥロソフィラ-アンテナペディア(原語:Drosophila antennapedia)タンパク質又はその相同体を由来とする。このホメオタンパク質アンテナペディアの60個のアミノ酸長のホメオドメインは、生体膜を通って転位し、それが結合した相手の異種ポリペプチドを転位させるのに便利であることが実証されている。このように、経細胞輸送のために、ポリペプチドを、ドゥロソフィラ-アンテナペディアの約アミノ酸42-58から成るペプチド又はそれより短いフラグメントに融合させることができる。例えばDerossi et al. (1996) J Biol Chem 271:18188-18193; Derossi et al.
(1994) J Biol Chem 269:10444-10450; and Perez et al. (1992) J Cell Sci
102:717-722を参照されたい。
N-メチルトランスフェラーゼ(NNMT;EC 2.1.1.1;CAS 登録番号9029-74-7)など、ニコチンアミドを代謝、分解又は阻害する酵素の活性を刺激したり、又はレベルを増加させるなどしても、ニコチンアミドレベルを低下させたり、あるいはニコチンアミドを失活させることができる。この酵素は、反応S-アデノシル-L-メチオニン+ニコチンアミド=S-アデノシル-L-ホモシステイン+1-メチルニコチンアミドを触媒して、細胞からのニコチンアミドの排出を促進する(さらにCantoni (1951) J. Biol. Chem. 203-216を参照されたい)。このヒト酵素はNNMTと呼ばれ、その完全な配列は、GenBank 登録番号 U08021に、そしてヌクレオチド配列の場合は配列番号9に、そしてタンパク質の場合は配列番号10に、見ることができる(Aksoy et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:14835 )。この酵素の酵母のものはNNT1(YLR258wとも言及)と言及されている。
2.7.7.1)である。
及びNP 002758 (Prps 関連タンパク質2);gi:24418495 及び Q14558(Prps関連タンパク質1);gi:17644236 及びCAD18892;gi:2160401 及びBAA05675(Prpsアイソフォーム1);並びにgi:2160402及びBAA05676 (Prpsアイソフォーム2)を有するいくつかの関連する酵素がある。
2026021 AAM13003.;gi 15234571 NP 195412.1; gi 25054896
AAN71931.1;及びgi 15227832 NP 179923.1。酵母NMA1/2の相同体:gi 22327861 NP 200392.2 及びgi 9758615 BAB09248.1。酵母NNT1 (YL285W)の相同体;gi 20197178 AAC14529;gi 22325900 NP 565619.2;gi 15219438 NP 177475.1 (腫瘍関連タンパク質);gi 12324311 AA652120.1;gi:22330409 NP 683465;gi:15240506 NP 199767; gi 8778835 AAF79834.1;及びgi 15231011
NP 188637。ヒトNNMTの相同体:gi 15238203 NP 196623。酵母QNS1 (NAD+再利用経路ではNMA1/2の下流の遺伝子)の相同体:gi:15221990 NP 175906。酵母BNA6の相同体:gi:18379203
NP 565259 及びgi:21555686 AAM63914。
ある実施態様では、NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択されるタンパク質の発現レベル又は活性を細胞内で減少させる。これは、対応する遺伝子の発現を阻害する作用薬を細胞に導入することにより、達成することができる。作用薬は、対応する遺伝子のプロモータに直接又は間接的に作用して、その転写を減少又は阻害するような低分子であってもよい。さらに作用薬は、当該タンパク質の生物学的活性を阻害する化合物であってもよい。さらに作用薬は、アンチセンス分子、三重分子又はsiRNAであってもよい。さらに他の作用薬は、例えばドミナント・ネガティブ変異体、又は、細胞内抗体、又は、当該タンパク質の生物学的活性に干渉する他のタンパク質など、をコードする核酸である。このような方法は当業で公知である。方法の例を以下に紹介する。
は、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、又は少なくとも200ヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドはDNAでも、又はRNAでも、あるいはそのキメラ混合物又は誘導体又は修飾された形であっても、一本鎖でも、又は二本鎖でもよい。該オリゴヌクレオチドを、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で修飾することができる。該オリゴヌクレオチドには、ペプチドなどの他の付属基や、又は、細胞膜を横切った輸送を促す作用薬(例えばLetsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556;
Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652: PCT Publication No.
WO 88/09810, published Dec. 15, 1988を参照されたい)、ハイブリダイゼーションで惹起される切断剤(例えばKrol et al., 1988, BioTechniques 6: 958-976を参照されたい)又はインターカレート剤(例えばZon, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549を参照されたい)を含めてもよい。
1980, Cell 22: 787-797)、疱疹チミジンキナーゼプロモータ(Wagner et al.,
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42)等がある。
Drug Design (1997) 12:359-371に論じられている。その他にも、重要なアンチセンス・ターゲットには、白血病(Geurtz, A.M., Anti-Cancer Drug Design (1997) 12:341-358);ヒトC-refキナーゼ(Monia, B.P., Anti-Cancer Drug
Design (1997) 12:327-339);及びプロテインキナーゼC(McGraw
et al., Anti-Cancer Drug Design (1997) 12:315-326がある。
Rev. Biochem. (1992) 61:641; Perrotta et al., Biochem. (1992)
31:16-17; Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1992)
89:10802-10806;及び米国特許第5,254,678号に解説された通りに調製及び使用することもできる。HIV-I RNAのリボザイムによる切断は、米国特許第5,144,019号に解説されている。リボザイムを用いてRNAを切断する方法は米国特許第5,116,742号に解説されており、そしてリボザイムの特異性を増す方法は、米国特許第5,225,337号及びKoizumi et al., Nucleic
Acid Res. (1989) 17:7059-7071に解説されている。ハンマーヘッド構造中のリボザイム断片の調製及び使用も、Koizumi et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17:7059-7071に解説されている。ヘアピン構造中のリボザイム断片の調製及び使用は、Chowrira and Burke, Nucleic Acids Res. (1992) 20:2835に解説されている。リボザイムはさらに、Daubendiek and Kool, Nat. Biotechnol. (1997) 15(3):273-277に解説されているように、ローリング転写(原語:rolling transcription)でも作製することができる。
vivoでは、長いdsRNAがリボヌクレアーゼIIIにより切断されて21及び22ヌクレオチドのsiRNAが生じる。21-ヌクレオチドのsiRNA二本鎖は、ヒトの胚性腎(293)及びHeLa細胞を含め、様々な哺乳動物細胞系で内因性及び異種の遺伝子の発現を特異的に抑制することが示されている(Elbashir et al. Nature 2001 ;411(6836):494-8)。従って、細胞中の遺伝子の翻訳は、その細胞を、約15乃至30ヌクレオチド、好ましくは約18乃至21ヌクレオチド、そして最も好ましくは19乃至21ヌクレオチドの長さを有する短い二本鎖RNAに接触させることにより、阻害することができる。代替的には、このようなsiRNA、又は、代謝されてsiRNAになるヘアピンRNAをコードするベクタを標的細胞に導入することができる(例えばMcManus et
al. (2002) RNA 8:842; Xia et al. (2002) Nature Biotechnology 20:1006; 及びBrummelkamp et al. (2002) Science 296:550を参照されたい。使用可能なベクタは、例えば OligoEngine社の名称pSuper RNAi システムTMなど、市販のものを入手可能である。
al., 1992, Ann, N.Y. Accad. Sci., 660:27-36; and Maher, L.J., 1992, Bioassays
14(12):807-15を参照されたい)。
Therapy 4: 45-54) などのタンパク質の翻訳を特異的に阻害することができる、それらに対する特異的RNAリガンドである。
乃至約100 mM、好ましくは約1 mM 乃至約20mM、さらにより好ましくは2 mM 乃至約10 mM、そして最も好ましくは約5 mMの量のニコチンアミドに接触させる。ニコチンアミドは市販のものを入手可能である(例えば実施例で提供した供給源を参照されたい)。細胞をニコチンアミドに、所望の効果を果たさせるために充分な時間、接触させる。
例えば、細胞を少なくとも約60分間又は少なくとも約24時間、ニコチンアミドに接触させることができる。さらに細胞をニコチンアミドに継続的に接触させてもよい。
LはO、NR、又はSであり;
Rはアルキル又はフェニルであり;
R1は-NH2
、-O-アルキル、-N(R)2、又は-NH(R)であり;そして
Hetはヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルである。
L はO、NR、又はSであり;
R はアルキル又はフェニルであり;
R1は-NH2、-O-アルキル、-N(R)2、又は-NH(R)であり;
X はH、アルキル、-O-アルキル、OH、ハロゲン化物、又はNH2であり;そして
n は1以上4以下の整数である。
は-NH2であり、XはHであり、そしてnは4である)がある。
作用薬には、低分子、例えば低有機分子、又はいずれかの生物学的巨大分子、一本鎖もしくは二本鎖の、DNAもしくはRNAなどの核酸;タンパク質又はペプチド;多糖;脂質;又はこれらの分子的組合せ、がある。
ここで示すように、ニコチンアミドはSir2及びヒトSRT1を阻害する。また、ニコチンアミドはSir2のCポケットに結合することにより、Sir2を非競合的に阻害することも示されている。従って、本発明は、合理的な薬物デザインなどに基づいて、Sir2や、Cポケットを含むSir2ファミリのタンパク質の他のメンバの阻害剤であるニコチンアミドの類似体も特定するための検定法を提供するものである。
ある実施態様では、NAD+再利用経路を通る流れを増加させる、又は、ニコチンアミドレベルを減少させるステップを用いて、細胞の寿命を増し、細胞を少なくとも特定のin vitroでのストレスから保護する。例えば、培養細胞を、例えばより長時間増殖させるなどのために、ここで解説された通りに処理することができる。これは、培養ではごく限られた寿命しか持たないことが知られている初代細胞培養株(即ち、ヒトなどの生物から得られた細胞)に特に有用である。例えばNPT1、PNC1、NMA1、NMA2、ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ(NNMT及びNNT1)、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPRT)、及び選択的にはヒトニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ(NMNAT、NMAT-1及び2)から成る群より選択される一つ以上の遺伝子の一つ以上の付加的なコピーを組み込むなどにより、本発明の方法に従ってこのような細胞を処理すると、培養で細胞が生きた状態に維持される時間量が増加するであろう。胚性幹(ES)細胞及び多能細胞や、それらから分化した細胞も、該細胞又はそれらの後代細胞をより長時間培養できるように、本発明の方法に従って改変することができる。細胞の初代培養物、ES細胞、多能細胞及びそれらの後代細胞は、例えば細胞に対して特定の生物学的効果を有する化合物を特定したり、あるいは、細胞に対して化合物の毒性を検査する(即ち細胞毒性検定)ために、用いることができる。
化合物、核酸、タンパク質、細胞及び他の組成物を、当業で公知の方法に従って対象に投与することができる。例えば、タンパク質をコードする核酸、又は、アンチセンス分子は、ウィルスベクタを用いるなどして、上に解説した通りに対象に投与することができる。細胞は、シクロスポリンAなどの免疫抑制剤の投与など、付随する方法を伴ってもよい、対象に移植片を投与する方法に従って、投与することができる。医学的処方の一般的原則については、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular
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1996; and Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law,
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Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,
1986)を参照されたい。
実施例1: 核内NAD + 再利用経路を操作して老化を遅らせる
栄養を枯渇させた酵母は、NAD+依存的ヒストンデアセチラーゼであるSir2pの活性を必要とする著しい寿命の伸長を示す。そこで我々は、NAD+再利用経路にとって重要なニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするNPT1を増量投与すると、Sir2依存的サイレント状態が増し、そのrDNA遺伝子座が安定化して、酵母の複製寿命が最高60%延びることを示す。NPT1及びSIR2は両者とも、熱ショックに対する耐性を提供するが、このことは、これらの遺伝子が、細胞生存を促進するためにより一般的な態様で作用することを示すものである。我々は、Npt1や、まだ特徴付けられていない再利用経路酵素であるNma2は両者とも、核内に濃縮されていることを示し、かなりの量のNAD+がこのオルガネラ内で再生されていることを示唆する。再利用経路遺伝子のPNC1、NMA1及びNMA2 のコピーが増すと、テロメア及びrDNAサイレント状態も増すことから、多段階のステップがこの経路の速度に影響を与えていることが分かる。SIR2-依存的プロセスは付加的なNPT1により高められるが、定常状態NAD+レベル及びNAD+/NADH 比は変化しないままである。この発見から、酵母寿命の延びは、Sir2にとってのNAD+利用能が高まると、定常状態レベルが単純に増すことが原因ではないが、促進されるのではないかと思われる。そこで我々は、NAD+再利用経路を通る流れの増加が、寿命のSir2依存的延びを担っているとのモデルを提案する。
プラスミド及び株 − この研究で用いられる株を表2に挙げる。W303AR5 sir3::URA3(16)、W303AR5 sir4::HIS3、W303AR5
sir2::TRP1 及びPSY316ATが解説されている(41)。PSY316ATでのSIRの欠失を、ScaI/PvuIIで直線化させたpC369を用いて行った(41)。JS209、JS241、JS237 及びJS218はJ.スミス氏から提供された(42)。NPT1のコーディング領域及び1.1kbの上流配列をPCRで増幅し(43)、2.4 kbの産物断片を、pRS306ベースのベクタpSP400のNotI とSacI (M.I.T.大のL.ガランテ氏により提供)の間と、 2μベースのベクタpDB20とにサブクローニングして(44)、それぞれpSPNPT1及びpDBNPT1 を生じさせた。
bp のSacI/NotI断片をベクタpSR400内にクローニングしてpSPYGL037を作製した。NMA2/YGR010 のコーディング領域及び500bp上流をPCRによりゲノム・テンプレートから増幅し、1730 bpのSacI/NotI断片をpSP400内にサブクローニングしてpSPYGR010を作製した。NMA1/YLR328 のコーディング領域及び450 bpの上流をゲノム・テンプレートからPCRにより増幅し、2150 bp の断片をpRS306中にクローニングしてp306YLR328を作製した。QNS1/YHR074 のコーディング領域及び600bp上流をPCRにより増幅し、2.8 kbのSacI/NotI 断片をpSP400中にクローニングしてpSPYHR074を作製した。PNC1/YGL037、NMA1/YLR328、NMA2/YGR010、及びQNS1/YHR074 の付加的なコピーを、W303AR5 及びPSY316AT のURA3遺伝子座に形質転換により組み込んだ。増幅された全てのDNAに変異がないことを配列決定で確認した。
の判定は、他の箇所で解説した通りに測定された(50)。GFP融合体を発現する細胞を中対数期までYPD培地又はYPD低グルコース(0.5%
w/v)で成長させた後に、20μMの Hoechst 33342 DNA株(シグマ社)を含有するPBSで5分間、インキュベートした。画像を100倍の倍率でニコンE600蛍光顕微鏡で撮像し、フォトショップ6.0ソフトウェアを用いて解析した。
NPT1 を増量投与すると寿命は延びるが定常状態NAD+レベルは上がらない − SIR2 は、酵母の寿命の制限要素であり、触媒にはNAD+を必要とする。E. coli での研究では、PncB
は、NAD+を循環させる再利用経路中の律速段階を触媒する(35、37、38)ことが示された。我々は、酵母
pncB 相同体である NPT1のコピーが付加的にあると、Sir2に対するNAD+産生が増し、ひいては酵母寿命が延びるかどうかを疑問にした。NPT1 を、URA3 遺伝子座にその天然プロモータの制御下に置いて組み込んだ。次に、NPT1の1つ又は4つのタンデム・コピーを持つ株をサザン・ブロット法で特定した。我々はその結果得られた遺伝子型をそれぞれ2xNPT1 及び5xNPT1 と言及する。
株は、驚くべきことに最高60%、長く生存した。NPT1で誘導された寿命の延びは、sir2を欠失させると完全に失われ、SIR2の付加的なコピーがあっても有意には向上しなかった(図1B)ことから、NPT1 によりもたらされた寿命の延びはSir2により媒介されていることが分かる。
C.エレガンス及びドゥロソフィラのインシュリン/IGF-1経路の成分に変異があると、動物はコントロールの最高2倍も長く生きることができる(5)。C.エレガンスでは、この長寿はストレス耐性に関係している(4)。対照的に、ホモ接合型では最高50%、寿命が延びるドゥロソフィラでのchico変異は、熱ショックからも、酸化ストレスからも保護しない(51)。C.エレガンスでのsir2.1 の寿命の延びとストレス耐性との関係が調べられたことはないが、Sir2/3/4 複合体がこのような応答に関与しているのでないかという証拠が酵母で上がっている。酵母sir4-42変異があると、複製寿命が延びるだけでなく、飢餓及び熱ショックへの耐性も増す(52)。このことから、SIR2長寿経路がストレス耐性にも影響を与えている可能性が浮かび上がる。
sir3 株では破壊的効果を有していたが、この効果は、sir4 株では観察されなかった。これは、sir4 変異体がSir2をrDNAに再局在させるという事実で説明でき、これが高レベルのNpt1に対抗するのかも知れない。sir2 変異体ではNPT1の付加的なコピーがあることで、SIR2依存的サイレント状態よりも相当に弱いrDNAサイレント状態に僅かな増加が起きた。この見かけの増加の基礎は不明である。これがサイレント状態に対する全体的な影響であるかどうかを判断するために、我々はテロメア遺伝子座でのサイレント状態を調べた。5番染色体のサブテロメア領域にADE2マーカが挿入されたPSY316ATに、NPT1の付加的なコピーを導入した(53)。図3Dに示すように、NPT1 の付加的なコピーがあることで、テロメアのサイレント状態がSIR2依存的な態様で増加した。
株から欠失させると、rDNA 組換えは劇的に増加してsir2 ヌル株のレベルになった(図3F)。これらの結果は、NPT1が、Sir2のrDNA組換え阻害能を増すことにより複製寿命を延ばすというモデルと一致している。
NPT1 の発現で観察された。熱ショック又はMMSもしくはパラコートへの曝露後、NPT1発現に有意な変化は検出されなかった(図4C及びD)。そこで我々は、カロリ制限はNPT1発現を上方調節することにより寿命を増すのではないと結論する。
NPT1 は、Sir2のコファクタであるNAD+を再循環させる酵母再利用経路の鍵となる成分をコードしている。
我々は、NPT1 の付加的なコピーがあると、寿命が最高60%、SIR2依存的な態様で増すことを示した。酵母の寿命は高いNAD+レベルと関係がある可能性が提案されている。しかしながら、我々は、NPT1 の付加的なコピーを持つ株では、定常状態のNAD+レベルは変化がないことを示した。さらに、NAD+/NADH比も、野生型細胞に同様であることから、全細胞レドックス状態は劇的には変化していないことが分かる。
変異体は野生型のNAD+レベルを有するため、Sir2はNAD+の主要な消費物質ではないことが分かることを示した。にも係わらず、NAD+をニコチンアミドに転化するその能力があるため、Sir2は再利用経路を通る流れの増加に対して応答性であるはずである(図6)。このように、NAD+の定常状態レベルは一定のままであるが、この分子のターンオーバーが上昇するのかも知れない。GFPで標識された酵素の局在から、NAD+再利用経路中の酵素のうちの少なくとも2つが、核内に濃縮していることが分かった。これと一致して、Nma1 及びNma2 は、高スループットの2種ハイブリッド・スクリーニング法により、核内局在配列(NLS)の受容体として作用するタンパク質であるSrp1と相互作用することが示されている(54)。同じ2種ハイブリッド・スクリーニングで、Nma1及びNma2はそれら同士の間でも、また相互の間でも相互作用することができることも見出されている。おそらくNmaタンパク質は、バシラス-サチリス(Bacillus subtilis )NaMNAT (55)の場合と同様に二量体として存在するか、メタノコッカス-ジャナスチイ(Methanococcus jannaschii)(56)及び
メタノバクテリウム-テルモオートトロフィカム(Methanobacterium
Thermoautotrophicum )(57)NaMNATの場合と同様に六量体として存在する。NMA1 又はNMA2 のいずれかを破壊した株は生存しており(58)、これらは機能的に重複していることが論じられることに注目されたい。
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酵母検定 − この研究で用いた全ての酵母株を表3に挙げる。細胞は、他に記載しない限り、30℃でYPD培地(1% 酵母抽出物、2% バクトペプトン、2% グルコース w/v)上で成長させた。リボゾームDNA遺伝子座でのサイレント状態の程度は、RDN1::MET15 株をPb2+含有培地(0.3% ペプトン、0.5% 酵母抽出物、4% グルコース、0.02% (w/v) 酢酸アンモニウム、0.07% Pb(NO3)2及び2% 寒天)上で成長させることにより判定された。ADE2ベースのテロメア及びHM 遺伝子座のサイレント状態の検定は、前に解説された通りに行われた(実施例1を参照されたい)。リボゾームDNA組換え頻度は前に解説された通りに判定された(44’)。
寿命の統計学的有意差は、ウィルコキソンの順位和検定を用いて判定された。差は、信頼度が95%より高いときに差として記載されている。
のDTT 、及び、解説された通りの一定の範囲のNAD+濃度を50μl検定緩衝液に溶かしたものと一緒にインキュベートした。酵母及びヒトタンパク質との反応を、それぞれ30℃及び37℃で30分間、行わせた。
NAD+と、ニコチンアミド(0、50、150 又は300μM)(シグマ社)又は50μMの以下の阻害剤;ニコチン酸(シグマ社)、シルチノール(原語:sirtinol)、M15(ケンブリッジ大)、スプリトマイシン(47)、TSA(BIOMOL社)のいずれかとの存在下で行わせた。
ニコチンアミドはrDNA、テロメア及び接合型遺伝子座でのサイレント状態を損なう。
ニコチンアミドはSir2脱アセチル化の生成物であり、NAD+再利用経路の鍵となる基質である。NAD+生合成を操作すると、Sir2依存的活性に影響を与えることができるという我々の前の観察に基づき(実施例1を参照されたい)、我々は、どのような効果をNAD+前駆体がサイレント状態に対して有するかを調べたいと考えた。ADE2 又はMET15 マーカをrDNA遺伝子座(RDN1)に組み込ませた形で持つ株を調べた。ADE2 がサイレント状態になと、アデニンを制限したプレート上では赤色の色素が蓄積するが、MET15 がサイレント状態になると、Pb2+含有培地上で茶色の色素が生じる。我々は2つのマーカ遺伝子を用いて、我々が観察した効果が、単にアデニン又はメチオニン生合成の変化の結果ではないことを確認した。SIR2 のコピーを1つ余分に持つ株(2X SIR2)、又は、SIR2を欠く株(sir2::TRP1)を、それぞれサイレント状態の増加及びサイレント状態の消失に関するコントロールとして含めた。図8Aに示すように、5 mM ニコチンアミドの存在下で成長させたとき、サイレント状態は完全に失われる。この遺伝子座にあるADE2 マーカのサイレント状態も、ニコチンアミドの添加により同様に失われた。
の存在下では、コロニは白色であり、抑制の完全な消失が実証された(図8B)。さらに我々は、接合型遺伝子のサイレント状態も観察し、ニコチンアミドは、この遺伝子座でもサイレント状態を完全に失わせることを見出した。
sir2 株を処理しても、それ以上組換えは増加せず、観察されたマーカの消失は、Sir2の阻害が原因であることを示した。
細胞を2日間、新鮮な酵母YPD培地上で成長させて、それらが検定前に確実にカロリ制限条件から完全に回復しているようにした。その後、前に萌芽していない母細胞から萌芽した娘細胞をマイクロ操作で取り出し、採点した。図9Cは、野生型(三角)及び短命のsir2 変異体(丸)の両方の代表的な寿命曲線を示す。5mMのニコチンアミドを含有する培地上で成長させた細胞(塗りつぶしたダイヤモンド)は、野生型のそれの平均で最高45%の寿命を有し、sir2 変異体のそれと同等だった。該sir2 株をニコチンアミドで処理しても、寿命はそれ以上、縮まなかった(四角)。これらの結果とは対照的に、我々は、5 又は50 mM のニコチン酸の存在下では、複製寿命に何の有害な効果も観察しなかった(図9D、それぞれ塗りつぶしたダイアモンド及び開放したダイアモンド)。
はIC50<50μMでSIRT1を阻害し、この値は、検査された他の全ての阻害剤のそれと同等であるか、又は低かった。我々の in vivo での結果をさらに裏付けるものとして、我々は、構造上関連する化合物であるニコチン酸が、SIRT1の活性に対してin vitroで何の効果も持たないことを示した(図13C)。
我々は、Sir2の脱アセチル化反応の生成物であるニコチンアミドが、in vivo及びin vitroの両方でSir2活性の強力な阻害剤であることを示した。外因性ニコチンアミドを酵母細胞に加えると、3つのサイレントな遺伝子座すべてが抑制解除され、リボゾームDNA遺伝子座での不安定性が高まり、酵母寿命がsir2 変異体のそれまで縮まる。ニコチンアミドで処理された細胞の、rDNAの不安定性及び短い寿命という表現型は、sir2 変異でも強まらないことは、これらの表現型がSir2阻害の結果であることを示している。重要なことに、これらの結果はさらに、rDNAの不安定性及び寿命は、もう一方の酵母Sir2ファミリ・メンバであるHstタンパク質の影響を受けていないことを示している。
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structure of a SIR2 homolog-NAD complex. Cell 105, 269-279)に嵌め込んだ。それをまず、Sir2-Af1のC部位に、QUANTA(MSI社)を用いて手動で嵌め込んだ。次に、エネルギ最小化計算を CHARMM (Brooks et al. (1983) J. Comput. Chem. 4, 187-217)により、Sir2-Af1及びNAD+(F = 2.4 Kcal/molÅ2)の調和定数を用いて行った。図14A−CをPYMOL(DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System
(2002) DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA)を用いて作製した。
図17Aに示すように、PNC1 はアミドの加水分解を触媒し、ニコチンアミドをニコチン酸にNAD+再利用経路で転化させる(図17B)。大半の野生型酵母株は21乃至23回の分裂という平均寿命を有し、最大寿命は40回の分裂である。カロリ制限(0.5%グルコース)又は熱ストレス(37℃)を与えた野生型株は、未処理のコントロール(それぞれ2.0% グルコース又は30℃)に比較して長い寿命を示した(図17C及びD)。sir2D 株は、前の報告と一致して短い寿命を有し12,13、カロリ制限も熱も、この株の寿命を延ばさなかった(図17C及びD)。pnc1D 株は、これらの条件下のいずれでも、寿命の延びを示さず、PNC1 が寿命の延びに必要であることが実証された。
S.セレビジエを様々なストレス条件でインキュベートし、PNC1の発現レベルを、ウェスタン・ブロットを行って測定した。2.0%グルコース完全培地(YPD)中で成長させた酵母細胞で測定されたPNC1の量を1に設定した。下の表及び図18は、この基準発現レベルに比較したときの様々な成長条件でのフォールド(原語:fold)誘導を示す:
他の種での寿命とストレス耐性との間の強い関係に基づき、我々は、PNC1が付加的にあるとある範囲のストレスへの耐性ももたらされるかどうかを検査した。酵母においてよく特徴付けられたストレス耐性検査は、細胞の高塩濃度に対する耐性である26。我々は、5×PNC1株が高いレベルのNaCl(600mM)及びLiCl(200mM)の両方に対して、野生型よりも劇的に耐性が高かったことを見出した(図19A)。さらに我々は、紫外線照射(5mJ/cm2)によるDNA損傷後の生存率も調べ、やはり、PNC1 が付加的にあると耐性がもたらされたことを見出した(図19B)。ミトコンドリアDNAの損傷が哺乳動物の老化に関係があるとされているため27、さらに我々は、付加的なPNC1のこの種類のストレスからの保護能力も調べた。強制換気条件(3% グリセロールを炭素供給源とする)下では、5×PNC1 細胞は、野生型よりも、臭化エチジウムによるミトコンドリア変異誘発に対してより耐性だった(図19C)。5×PNC1 株のLiClに対する耐性増加はSIR2依存的だった。驚くべきことに、この株のNaCl、紫外線及び臭化エチジウムに対する耐性は、SIR2 からは独立だった(図19A−C)。これらの結果は、PNC1 が長寿及びストレス耐性の両方を促進することを実証しており、SIR2 が、この遺伝子の唯一の下流エフェクタではないことを示唆している。このように、ニコチンアミド はSir2以外のタンパク質も調節している可能性が高い。
我々は前に、NAD+再利用経路中の2つの酵素Npt1(ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ)及びNma2(ニコチン酸モノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ)が核内に濃縮していることを示した23。我々は、別の再利用経路酵素であるPnc1が同様な細胞内分布を有するかどうかを調査した。驚いたことに、完全2% グルコース培地上ではPnc1-GFPは細胞質、核、及び細胞一個当たり3乃至6箇所の離散した細胞質内焦点距離に観察された(図20A)。カロリ制限した又はストレスを与えた細胞は、ウェスタン・データと一致して、蛍光輝度の劇的な増加を示した。興味深いことに、アミノ酸制限又は塩ストレスの条件下では、このパターンは変化しており、蛍光は主に焦点距離に局在していた(図20B)。このことは、Pnc1の局在は、異なるストレスにより異なる方法で調節されていることを示すものである。
pex6D
変異体ではもはや観察されなかった(図20D)。我々のストレス研究では、ペルオキソソームへのPnc1の局在が調節可能かも知れないことが示されていたため、我々は、このオルガネラへのその輸入を担うトランスポータを特定しようと試みた。Pex5 はペルオキシソーム性タンパク質の大半を輸入するが、Pnc1のペルオキシソームへの局在には、より利用頻度の低いトランスポータPex7 が必要だった(図20D)。Pnc1の、核より外側の部位への局在は、ニコチンアミドがSir2以外のタンパク質を調節することを実証した我々のストレス結果と一致している。ペルオキシソームへの局在は、これらのオルガネラは反応性酸素種の主要な供給源であり、哺乳動物の老化への関与が指摘されている28、29ために、特に興味深い。加えて、脂質代謝の数多くの重要なステップがペルオキシソーム内で行われ、脂質シグナル伝達は最近、塩耐性にも関連付けられている26。付加的なPNC1 の耐塩性は、Pnc1のペルオキシソーム機能の結果かも知れない。
我々の予測モデルの1つは、細胞内ニコチンアミドレベルを何らかの方法で操作すると、Sir2活性を変えるには充分なはずであるというものである。Sir2活性の通常の指標は、rDNA(RDN1) に挿入されたレポータ遺伝子がサイレントになる程度である。NAD+レベルがいずれかのサイレント効果を担っている可能性を除外するために、我々は、NAD+再利用経路の外にある遺伝子を用いて細胞内ニコチンアミドレベルを操作することを試みた。ヒトでは、ニコチンアミド代謝の主要な経路は、ニコチンアミド N-メチルトランスフェラーゼ(NNMT)を通る30。NNMTはニコチンアミドをN’-メチルニコチンアミドに転化させ、このN'-メチルニコチンアミドが腎臓を通じて排出される31。我々は、相同性により、S.セレビジエNNMT遺伝子を同定し、この遺伝子をNNT1と命名した。Nnt1 は哺乳動物NNMTコア・ドメインに対して23%同一であり30、S-アデノシルメチオニン(SAM)依存的メチルトランスフェラーゼの4つのシグナチャ・モチーフを含有する32。
によるSir2阻害の酵素学に基づき(実施例2及び34)、NAD+を2段階の反応で切断するタンパク質が考えられる候補である。例には、Sir2 (Hst1-4)及びTpt1の相同体、タンパク質の変性応答を促進するNAD+依存的2'-ホスホトランスフェラーゼがある35。ニコチンアミド代謝が変化した細胞の発現プロファイリングをすれば、これらのエフェクタや、ストレス耐性の下流経路を特定する助けになるはずである。
培地及び株: 全ての株を、他に記載しない限り、30℃の完全2.0% (w/v) グルコース(YPD)培地で成長させた。実験のすべてで、我々は、空のベクタを組み込むことにより、確実に株同士の間で栄養要求性マーカが一致しているようにした。欠失はすべて、kanMX6 PCRベースの技術39を用いて作製され、PCRで確認された。PNC1 の付加的なコピーは、前に解説した通りに組み込まれた23。NNT1 (YLR285w) の開放読み取り枠全体及び700塩基の上流配列を、ゲノムDNAからPCRによりpSP400中にクローニングし40、配列決定し、酵母ゲノムに前に解説した通りに組み込んだ23。組み込まれた遺伝子のコピー数は、サザン・ブロット法で判定された。GFP カセットを、天然PNC1 遺伝子の3’側にインフレームで前に解説した通りに導入した39。RFP-PTS1プラスミド(pSG421)はS.J.グールド氏(ジョンズ・ホプキンス大)から提供された。PSY316AT由来株を寿命の分析及びストレス耐性検定に用いた。PSY316ATを由来とする株(MATα、ura3-53 leu2-3,112 his3-D200 ade2-1,01
can1-100 ADE2-TEL V-R): pnc1D (YDS1741)、sir2D (YDS1750)、5xPNC1 (YDS1853)、5xPNC1 sir2D (YDS1851)、pnc1D sir2D (YDS1853)。W303由来株をウェスタン・ブロット分析、蛍光顕微鏡法及びSIR2 依存的サイレント状態検定法に用いた。W303 (MATa, ade2-1, leu2-3,112, can1-100, trp1-1, ura3-52,
his3-11,15, RDN1::ADE2, RAD5) を由来とする株には:PNC1-GFP (YDS1742)、pnc1D (YDS1911)、nnt1D (YDS1747)、2xPNC1 (YDS1588)、2xNNT1 (YDS1926)、ADE2 (YDS1596)が含まれた。以下の株をPNC1-GFP (YDS1742)から得た: bna6D (YDS1857),
pSG421 (YDS1916), pex6D (YDS1869), pex5D (YDS1870) 及びpex7D (YDS1871)。cdc25-10 株はL・ギャランテ氏(M.I.T.大)から提供された。
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NMNAT(EC 2.1.1.1;
CAS 登録番号 9029-74-7)は、ニコチンアミド N-メチルトランスフェラーゼとも呼ばれ、反応S-アデノシル-L-メチオニン+ニコチンアミド=S-アデノシル-L-ホモシステイン+1-メチルニコチンアミドを触媒する酵素である(さらにCantoni (1951) J. Biol. Chem. 203-216も参照されたい)。放射線感受性ヒト細胞中でヒトNMNATが過剰発現すると、この細胞の放射線抵抗性が増すことが見出された。
当業者であれば、ごく慣例的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
Claims (23)
- 細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節する方法であって、前記細胞内のNAD+再利用経路を通る流れを調節するステップを含む、方法。
- NAD+再利用経路を調節する前記ステップが、NPT1、PNC1、NMA1 及びNMA2から成る群より選択されるタンパク質のレベル又は活性を調節するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 調節が増加させることであり、前記方法が、NPT1、PNC1、NMA1 及びNMA2から成る群より選択されるタンパク質のレベル又は活性を増加させるステップを含む、請求項2に記載の方法。
- NPT1、PNC1、NMA1 及びNMA2 から成る群より選択されるタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸、又は、細胞内の前記NAD+再利用経路を通る流れを増加させるために充分な、少なくともその一部分、を細胞内に導入するステップを含む、請求項3に記載の方法。
- NPT1、PNC1、NMA1 及びNMA2 から成る群より選択される一種以上のタンパク質をコードする少なくとも5つのヌクレオチド配列、又は、細胞内の前記NAD+再利用経路を通る流れを増加させるために充分な、少なくともその一部分、を細胞内に導入するステップを含む、請求項4に記載の方法。
- NPT1、PNC1、NMA1 及びNMA2 から成る群より選択される少なくとも1つのタンパク質、又は、細胞内の前記NAD+再利用経路を通る流れを増加させるために充分な、少なくともその一部分、を細胞内に導入するステップを含む、請求項3に記載の方法。
- 細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節する方法であって、前記細胞内のニコチンアミドのレベルを調節するステップを含む、方法。
- 調節が増加させることであり、前記方法が、細胞をニコチンアミド又はその類似体に接触させるステップを含む、請求項7に記載の方法。
- 細胞の寿命を、少なくとも約40%、延ばす、請求項2又は7に記載の方法。
- 前記細胞がin vitroにある、請求項1又は7に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項1又は7に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞が酵母細胞である、請求項1又は7に記載の方法。
- ストレスが熱ショック浸透圧ストレス;DNA損傷性作用因子;不適切な塩レベル;不適切な窒素レベル、又は不適切な栄養レベルである、請求項1又は7に記載の方法。
- NAD+再利用経路を通る流れを調節するステップが、基本的にNAD+及びNADHの定常状態レベルを変えずに行われる、請求項1又は7に記載の方法。
- 細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節する化合物を特定する方法であって、
(i)NPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NNMT、NAMPRT、NMNAT-1、及びNMNAT-2
から成る群より選択されるタンパク質を、検査化合物に、前記タンパク質の活性に影響するのに充分であろう時間、接触させるステップと、
(ii) 前記酵素の活性を判定するステップであって、但しこの場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下での前記酵素の活性の違いは、前記検査化合物が、細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節する化合物であることを示す、ステップと
を含む方法。 - 細胞の寿命、又は、そのストレス耐性を調節する化合物を特定する方法であって、
(i)NPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NNMT、NAMPRT、NMNAT-1、及びNMNAT-2
から成る群より選択される遺伝子の転写調節核酸を、レポータ遺伝子に作動上連結させて含む細胞又はライセートを、検査化合物に、前記転写調節核酸に影響するのに充分であろう時間、接触させるステップと、(ii)
前記レポータ遺伝子のレベル又は活性を判定するステップであって、但しこの場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下での前記レポータ遺伝子のレベル又は活性の違いは、前記検査化合物が、細胞の寿命、又は、そのストレス耐性を調節する化合物であることを示す、ステップと
を含む方法。 - 細胞を前記検査化合物に接触させるステップと、細胞の寿命又はそのストレス耐性が調節されたかどうかを判定するステップとを含む、請求項17又は18に記載の方法。
- Sir2ファミリ・メンバの活性の阻害剤を特定する方法であって、
(i)コンピュータ・モデリング・アプリケーションに、分子又は分子複合体の一組の構造座標を提供するステップであって、前記分子又は分子複合体が、Cポケットを含むSir2ファミリ・メンバの少なくとも一部分を含む、ステップと、
(ii)前記コンピュータ・モデリング・アプリケーションに、ある化学的実体の一組の構造座標を提供するステップと、
(iii)前記化学的実体が、前記分子又は分子複合体に結合する又は干渉すると予測される阻害剤であるかどうかを判定するステップであって、前記分子又は分子複合体に結合又は干渉することは、Sir2ファミリ・メンバの活性の潜在的阻害の指標である、ステップと
を含む方法。 - 前記化学的実体がニコチンアミドの類似体である、請求項19に記載の方法。
- Sir2ファミリ・メンバの活性の阻害剤を特定する方法であって
(i)少なくともCポケットを含むSir2ファミリのタンパク質を、検査化合物に、前記検査化合物が前記Sir2ファミリのタンパク質のCポケットにおそらくは結合するのに充分な時間、接触させるステップと、
(ii)タンパク質の活性を判定するステップであって、但しこの場合、前記検査化合物の非存在下に比べたときに、前記検査化合物の存在下で、前記タンパク質の活性が低いことは、前記検査化合物が、Sir2ファミリ・メンバの活性の阻害剤であることを示す、ステップと
を含む方法。 - 対象の細胞死又は老化に関連する障害を治療又は予防する方法であって、細胞死又は老化に易罹患性又は罹患性の細胞においてNAD+再利用経路を通る流れを増加させる、又は、細胞内のニコチンアミドレベルを下げる作用薬を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
- 細胞の寿命を下げる、又は細胞をストレスに対してより感受性とすることが有益であるような障害を治療又は予防する方法であって、対象のNAD+再利用経路を通る流れを減らす、又は、細胞内のニコチンアミドレベルを増加させる作用薬を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
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