JP2010539580A - 動的分子の３次元構造の決定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、分子、特に、限定されるものではないが、ペプチド、炭水化物、タンパク質、および薬物分子等の生物学的関心のある動的有機分子の三次元構造を決定する方法に関する。本発明の第１の態様は、分子の三次元構造の集団を表すデータを生成する方法を提供し、前記分子は少なくとも１つの結合で連結された第１および第２の原子を含み、前記結合は関連する角度を有し、前記角度は変化して前記分子の複数の三次元構造を生成し、前記方法は、前記角度の可変性を示すデータを含む前記分子を表すデータを受け取ること；および、前記角度が前記可変性に基づいて選択される関連する値を有するように、構造の集団を生成することを含む。本発明の第２の態様は、分子の三次元構造の可変性をシミュレートするコンピュータ実行方法を提供する。
Description
本発明は分子（限定はされないが特にペプチド、炭水化物、タンパク質および薬物分子等の生物学的に興味ある動的有機分子）の３次元構造の決定方法に関する。
多くの重要な分子は本質的にフレキシブルで動的な構造を有する（例えばペプチド、炭水化物、抗生物質、有機薬物分子およびタンパク質）。多くの生化学的分析において、溶液中でのこのような分子の３次元（３Ｄ）構造についての知識が、それらの物理化学的特性、化学修飾の効果、またはそれらがどのようにタンパク質等の他の分子と相互作用するかを理解するために望まれる。
分子の３Ｄ構造を理解するために現在のアプローチはしばしば単なる計算的な分子モデリングを用いるが、それは著しく不確かである。なぜなら、溶液中での分子のポテンシャルエネルギー面がよく理解されておらず、実験データが研究中のシステムの分子成分のモデルに組み込まれるのはまれであるからである。小分子の３Ｄ構造を決定するために実験データを用いることに伴う重要な課題の一つは、それらが溶液中ではしばしば比較的に無秩序であるために力学が考慮されなければならないことであり、その溶液中での３次元構造決定の問題はほとんど未解決のままである。小分子の３Ｄ構造を正確に定義できる手段は、合理的な薬物設計および仮想スクリーニング等の、これまで不正確とみなされてきた多くのプロセスを可能にするだろう。
本発明の目的は、現在の分子の３Ｄ構造決定法に付随する欠点を取り除くかまたは軽減することである。
本発明の第一の態様によれば、分子の３次元構造の集団を表すデータを生成する方法であって、前記分子が少なくとも１つの結合で連結された第一および第二の原子を含み、前記結合が関連角（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｇｌｅ）を有し、かつ前記角が変動して前記分子の３次元構造を複数生成する方法が提供され、前記方法は、
前記角の可変性を示すデータを含む、前記分子を表すデータを受け取ることと、
前記角が前記可変性に基づいて選択された関連値（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖａｌｕｅ）を有するように、構造の集団を生成することと、を含む。
前記角の可変性を示すデータを含む、前記分子を表すデータを受け取ることと、
前記角が前記可変性に基づいて選択された関連値（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖａｌｕｅ）を有するように、構造の集団を生成することと、を含む。
本発明のこの態様は、多数のさらなる応用に利用できる分子の３Ｄ構造の集団を生成するための計算的な方法を提供する。例えば好ましい一実施形態によれば、構造の集団は分析されて１種以上の予測実験データが提供され、これは対応する実際の実験データと比較できる。この比較は、構造の集団が何回か修飾される最適化手段、および構造の最適な集団が同定されるまで各集団について繰り返される、予測データの実験データに対する比較を駆動するために使用でき、これは実際のデータの予測実験データに対する最も密接な比較を提供する。
本発明の好ましい実施形態の重要な特色は、１種以上の実際の実験データに対する３Ｄ分子構造の集団の最適化を同時に促進することであり、これは１種の実験データ単独では分子の溶液３Ｄ構造を適切に特徴付けるために十分でないと思われる際に、特に重要となる。このことは、以下の実施例１、２および３で例証される。
本発明の第二の態様によれば、分子の３次元構造の可変性をシミュレートするためのコンピュータ実行方法であって、前記分子が少なくとも１つの結合で連結された第一および第二の原子を含み、前記結合が関連角（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｇｌｅ）を有し、かつ前記角が変動して前記分子の３次元構造を複数生成する方法が提供され、前記方法は、
前記角の可変性を示すデータを含む、前記分子を表すデータを受け取ることと、
前記角の可変性を示す前記データに基づいて前記分子の３次元構造の可変性をシミュレートすることと、
前記角が前記シミュレートに基づいて選択された関連値（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖａｌｕｅ）を有するように、構造の集団を生成することと、を含む。
前記角の可変性を示すデータを含む、前記分子を表すデータを受け取ることと、
前記角の可変性を示す前記データに基づいて前記分子の３次元構造の可変性をシミュレートすることと、
前記角が前記シミュレートに基づいて選択された関連値（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖａｌｕｅ）を有するように、構造の集団を生成することと、を含む。
本発明は、限定されないが、下記の例のような広範囲の分子に対して適用可能である。
１）炭水化物リガンドおよび炭水化物ミメティクス（例えばアミノグリコシド抗生物質）
２）ペプチドおよび人工ペプチドミメティクス
３）薬物分子の分子フレキシビリティー
４）酵素／受容体活性部位またはタンパク質−タンパク質相互作用部位内のフレキシブルなタンパク質側鎖
５）核酸分子内のフレキシブルな塩基（例えばＲＮＡアプタマー）
６）幾つかのコンフォメーション状態をもつタンパク質（例えばインテグリン）および本質的に折り畳まれていないタンパク質
１）炭水化物リガンドおよび炭水化物ミメティクス（例えばアミノグリコシド抗生物質）
２）ペプチドおよび人工ペプチドミメティクス
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４）酵素／受容体活性部位またはタンパク質−タンパク質相互作用部位内のフレキシブルなタンパク質側鎖
５）核酸分子内のフレキシブルな塩基（例えばＲＮＡアプタマー）
６）幾つかのコンフォメーション状態をもつタンパク質（例えばインテグリン）および本質的に折り畳まれていないタンパク質
フレキシブルな分子の構造情報を必要とするプロジェクト、特に、相互作用−エネルギー予測に頼る合理的薬物設計等のリガンド−タンパク質相互作用を伴うものは、本発明に従って生成される動的構造から劇的に利益を享受するであろう。エンタルピーの寄与は十分に推定できるが、エントロピーの寄与は十分に推定できないことから、現在、先行技術モデルに基づくこのような予測は乏しい（予測される分子のわずかに１０％が、その受容体にうまく結合する）。本発明の方法論を用いて決定した薬物分子の好ましい構造（内部エンタルピー）および動的運動（エントロピー）の両方の使用はそれ故、合理的薬物設計アプローチによるヒット同定およびリード最適化において著しい改善をもたらす［３０］。さらに、本発明の方法およびそれらから生み出される動的３Ｄ構造は、その結合型から遊離溶液構造の偏差を算出するために使用でき、これは候補分子を比較および選択するための正確な評価関数として使用できる。
以下の実施例４は異なる有機分子の一連の結果を提示し、これにより本発明の方法がこれらの分子の生物活性（すなわちリガンド結合）コンフォメーションを正確に予測できることが示される。以下の実施例５は、本発明の方法を用いて生成したリシノプリルおよびアンギオテンシンＩの動的３Ｄ構造の比較が、次世代のＡＣＥ阻害剤であるベナゼプリラートの構造の特色を予測したリシノプリルの化学構造への修飾を、どのように示唆したかについて述べる。この結果は、本発明の方法が、医薬品化学者によるリード最適化の決定を大いに助ける動的３Ｄ構造をどのように提供できるかを明瞭に示す。
本発明の方法により生成される３Ｄ動的構造のさらなる応用は、改善された仮想スクリーニング結果の中にある。天然のリガンドまたは薬物の３Ｄ動的構造は、クエリー化合物と類似した形を有する他の分子をデータベース中で探索する仮想スクリーニング技術で理論的に生成された３Ｄコンフォメーションよりも、さらに正確なクエリー化合物に対する３Ｄコンフォメーション鋳型またはファーマコフォアマップとして使用できる。典型的には、クエリー化合物の好ましい形状に対する不確実性を克服するため、仮想スクリーニング戦略は各クエリーに対して多くのコンフォメーション変異体を使用する。本発明の方法論を用いることにより、これら多くの潜在的な誘導体を実験から直接決定された単一または多くても数個の鍵となる好ましいコンフォメーションによって置き替えることができ、計算の複雑さおよび検索時間が数桁減少する。このような仮想スクリーニングから同定された分子は、新薬開発のための新たなヒットまたはｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｈｏｐｓとなり得る。
本発明の他の応用は、３Ｄ−ＱＳＡＲ（定量的構造活性相関）の改善である。本発明の方法論により決定された薬物ファミリー全体にわたる幾つかの分子の３Ｄ動的構造は、本発明の方法論によって実験データから決定された３Ｄ動的構造が理論的に生成されたコンフォメーションよりもさらにいっそう現実的であることから、（伝統的な計算機化学の方法論によって現在生成されているものよりも高い）３Ｄ−ＱＳＡＲ技術に対する新たなレベルの論理付けを提供することが期待される。
従って本発明は、存在する医薬分子の動的構造のシミュレーションや予測を容易にし、合理的薬物設計および化学的模倣による新薬発見の著しい助けとなるであろう。
上記に加え、本発明の方法から利益を享受するその他の技術分野は、
１）バイオミメティック分子の生成、例えばヘパリンミメティクスの設計；
２）受容体分子のアレイを用いる分子相互作用の分析、例えばシステム生物学およびプロテオミクスにおいて；
３）コンビナトリアルケミストリーにおける、可能性のある反応経路の予測による薬物ライブラリーの設計；および
４）分子機械の設計および構築（ナノテクノロジー）を含む。
１）バイオミメティック分子の生成、例えばヘパリンミメティクスの設計；
２）受容体分子のアレイを用いる分子相互作用の分析、例えばシステム生物学およびプロテオミクスにおいて；
３）コンビナトリアルケミストリーにおける、可能性のある反応経路の予測による薬物ライブラリーの設計；および
４）分子機械の設計および構築（ナノテクノロジー）を含む。
本発明の第三の態様によれば、分子の３次元構造の複数の集団から選択される前記分子の３次元構造の最適化された集団を表すデータを生成するための方法であって、各集団が本発明の第一および／または第二の態様に従う方法により生成される方法が提供される。
実際の実験データの主要な源は、水性または有機溶液中の有機分子からの核磁気共鳴（ＮＭＲ）データであるが、他の実験技術からのデータもまた用いられてよい。以下にさらに十分に記述されるように、様々なＮＭＲ実験が分子の３Ｄ構造および動的運動を抽出するため相乗的に使用できる。各ＮＭＲ実験から得られたデータは、各実験データの種類に対して特定の方法を用いて処理され、分子構造の一連の集団を用いる最適化アルゴリズムへ入力する準備がなされる（各集団は本発明の第一および／または第二の態様に従って生成される）。
本発明の第四の態様によれば、前記化合物に関して得られたＮＭＲスペクトル由来の分子の３次元構造を示すＮＭＲデータを処理するためのコンピュータ実行方法が提供され、前記方法は、
ａ．前記スペクトル中の共鳴多重線成分に関する共鳴周波数νを決定すること；
ｂ．前記多重線スペクトルの最大高さの半分での固有共鳴線幅λよりも小さい共鳴周波数差（Δν）を有する前記ＮＭＲスペクトル中の共鳴多重線成分を同定すること；
ｃ．前記ＮＭＲスペクトルについて工程ｂ．で同定された多重線成分ｉのそれぞれの高さｈiを決定すること；
ｄ．各多重線について、以下のように広幅化因子ｂを決定すること：
ａ．前記スペクトル中の共鳴多重線成分に関する共鳴周波数νを決定すること；
ｂ．前記多重線スペクトルの最大高さの半分での固有共鳴線幅λよりも小さい共鳴周波数差（Δν）を有する前記ＮＭＲスペクトル中の共鳴多重線成分を同定すること；
ｃ．前記ＮＭＲスペクトルについて工程ｂ．で同定された多重線成分ｉのそれぞれの高さｈiを決定すること；
ｄ．各多重線について、以下のように広幅化因子ｂを決定すること：
ｆ．理想多重線構造が二重線の場合、各多重線成分についてスケーリング係数ｆiを以下のように決定し：
ｆi＝２・ｂ
かつ、１モル存在量での共鳴多重線成分ｉの高さＨiを以下のように決定すること：
Ｈi＝ｈi×ｆi
ｇ．理想多重線構造が三重線の場合、各外側多重線成分（ｏｕｔｅｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）についてスケーリング係数ｆi(outer)を以下のように決定し：
ｆi(outer)＝４・ｂ
かつ、重複する内側多重線成分についてスケーリング係数ｆi(inner)を以下のように決定すること：
ｆi(inner)＝２・ｂ
ｈ．１モル存在量での共鳴多重線成分ｉの高さＨiを以下のように決定すること：
Ｈi(inner)＝ｈi(inner)×ｆi(inner)
Ｈi(outer)＝ｈi(outer)×ｆi(outer)
を含む。
本発明のこの態様は、ＮＭＲスペクトル由来のデータを、本発明の第一または第二の態様に従って生成される分子集団を用いる最適化において用いることを可能にする。
本発明の第一および第二の態様に関して、分子を表すデータは、好ましくは前記結合についての平均角を示すデータをさらに含む。好ましくは、前記角の可変性を示すデータは、前記平均角に関連するデータを含む。前記結合の可変性を示すデータは、前記平均角の周りの角の分布を示すデータを含んでよい。前記分布は、好ましくは確率分布である。前記角の確率分布は、前記平均角の周りで対称であってよい。好ましくは前記結合の可変性を示すデータは、前記平均角の周りの角のガウス分布である。
好ましい態様によれば分子を表すデータは、前記結合についてのさらなる平均角を示すさらなるデータをさらに含む。前記角の可変性を示すデータは、前記さらなる平均角に関連するさらなるデータを含むことが好ましい。前記結合の可変性を示すデータは、前記さらなる平均角の周りのさらなる角の確率分布を含んでよい。前記さらなる角の確率分布は、前記さらなる平均角の周りで対称であってよい。好ましくは前記結合の可変性を示すデータは、前記さらなる平均角の周りのさらなる角のガウス分布である。
本発明の第一および第二の態様は、特定の関連する可変性を有する結合または一連の結合を介して連結した第一および第二の原子の単一ペアを含む分子の３Ｄ構造の集団を生成するために使用できるが、本発明の方法に供される各分子が比較的多数のフレキシブルな結合を含んでいる以下の実施例１から５に例証されるように（例えば実施例１に関連する図１６および１７を参照）、本発明の第一および第二の態様は、相互結合した第一および第二の原子の複数のペアを含む分子の３Ｄ構造の集団を生成するために大いに適していることが認識されるであろう。従って、以下「第一および第二の原子」について述べられる際には、本発明の方法論を用いて調べられるいずれの興味ある分子も、関連角の可変性を有する少なくとも１つの結合を介して連結される「第一および第二の原子」の１つ、２つまたはそれ以上のペアを組み込んでいてよいことが理解されるべきである。
本発明の第一および第二の態様に関して、分子を表すデータは、好ましくは第一および第二の原子の化学的性質を示すデータを含む。分子を表すデータは、第一および第二の原子の化学的性質に基づく前記結合の可変性を示すデータをさらに含んでよい。
前記結合の可変性を示す前記データは、第一および第二の原子が二重共有結合や三重共有結合を介して連結しているとき、または第一および第二の原子が芳香環構造に組み込まれているときに結合の可変性がゼロであることを示すデータを含んでよい。
前記結合の可変性を示す前記データが、第一および第二の原子のうちの一つが水素原子またはハロゲン原子であるときに結合の可変性がゼロであることを示すデータを含むケースであってもよい。
前記結合の可変性を示す前記データは、第一および第二の原子が３員または４員の環構造に組み込まれているときに結合の可変性がゼロであることを示すデータを含んでよい。
前記結合の可変性を示す前記データは、第一および第二の原子が単一の共有結合を介して連結され、かつ、第一および第二の原子のうちの一つが、二重または三重共有結合を介して第三の原子に連結するか、または、第一および第二の原子が酸素原子であるとき、結合の可変性がゼロではなく単峰性の結合角可変性を示すことを示すデータを含むことができる。
前記結合の可変性を示す前記データは、第一および第二の原子が５員または６員の飽和脂環構造に組み込まれているとき、結合の可変性がゼロではなく二峰性の結合角可変性を示すことを示すデータを含むケースであってもよい。
前記結合の可変性を示す前記データは、第一および第二の原子が単一の共有結合を介して連結され、かつ第一および第二の原子のうちの一方がｓｐ3混成であり、かつ第一および第二の原子のうちの他方がｓｐ2混成であるか、または、第一および第二の原子が単一の共有結合を介して連結され、かつ分子内で前記単一の共有結合が少なくとも一つのさらなる二重共有結合と共役するとき、結合の可変性がゼロではなく二峰性の結合角可変性を示すことを示すデータを含んでよい。
前記結合の可変性を示す前記データは、第一および第二の原子が単一の共有結合を介して連結され、かつ、第一および第二の原子の両方が四価でｓｐ3混成であるか、または、第一および第二の原子のうちの一方がｓｐ3混成であり、第一および第二の原子のうちの他方が酸素原子であるとき、結合の可変性がゼロではなく三峰性の結合角可変性を示すことを示すデータを含んでよい。
本発明の第一および第二の態様に関し、前記角は前記第一と第二の原子の間に規定される二面角であることが好ましい。
本発明の第一および第二の態様の好ましい実施形態では、前記方法は、前記分子の３次元構造の前記生成された集団から、少なくとも１の実験パラメータを予測することをさらに含む。
前記方法は、好ましくは、前記少なくとも１の予測される実験パラメータの、少なくとも１の物理的実験に由来する少なくとも１のさらなるパラメータに対する比較をさらに含む。すなわち、興味ある分子に対応する化学物質について行われる実験である。
前記方法は、前記比較に基づいて一致関数を決定することをさらに含むことが好ましい。
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の第一および／または第二の態様による方法は、
前記分子の３次元構造のさらなる集団を表すさらなるデータを生成すること；
前記分子の３次元構造の前記さらなる生成された集団から、少なくとも１のさらなる実験パラメータを予測すること；
前記少なくとも１のさらなる予測される実験パラメータを、少なくとも１の物理的実験に由来する前記少なくとも１のパラメータに対して比較すること；
前記少なくとも１のさらなる実験パラメータの、少なくとも１の物理的実験に由来する前記少なくとも１のパラメータに対する前記比較に基づいて、さらなる一致関数を決定すること；および
最もよい一致関数を有する集団を示すデータを生成すること、をさらに含んでよい。
前記分子の３次元構造のさらなる集団を表すさらなるデータを生成すること；
前記分子の３次元構造の前記さらなる生成された集団から、少なくとも１のさらなる実験パラメータを予測すること；
前記少なくとも１のさらなる予測される実験パラメータを、少なくとも１の物理的実験に由来する前記少なくとも１のパラメータに対して比較すること；
前記少なくとも１のさらなる実験パラメータの、少なくとも１の物理的実験に由来する前記少なくとも１のパラメータに対する前記比較に基づいて、さらなる一致関数を決定すること；および
最もよい一致関数を有する集団を示すデータを生成すること、をさらに含んでよい。
前記方法は、前記さらなる集団を複数生成すること、および前記複数のさらなる集団から決定される最もよい一致関数を有する集団を選択すること、を含んでよい。
前記方法は、好ましくは、前記分子の３次元構造の前記生成された集団から少なくとも２の実験パラメータを予測することをさらに含む。
前記方法は、前記少なくとも２の予測される実験パラメータの、少なくとも２の物理的実験に由来する少なくとも２のさらなるパラメータに対する比較をさらに含んでよい。すなわち、興味ある分子に対応する化学物質について行われる少なくとも２の実験である。
好ましくは、前記少なくとも２の物理的実験は、異なる期間にわたって抽出された前記分子の３次元構造を示すデータを提供する。
前記少なくとも２の物理的実験は、前記分子の動きの異なる範囲にわたって抽出された前記分子の３次元構造を示すデータを提供してよい。
前記予測される実験パラメータの少なくとも一つは、前記分子の３次元構造を示すＮＭＲデータに関連することが好ましい。
前記ＮＭＲデータは、スカラーカップリング、核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）、回転座標系ＮＯＥ（ＲＯＥ）、残留双極子カップリング（ＲＤＣ）、異核ＮＯＥ、およびＴ1緩和データから成る群より選択されてよい。
前記物理的実験の少なくとも一つは１Ｄ ＮＭＲ分光法を含んでよい。前記１Ｄ ＮＭＲ分光法は、［1Ｈ］−１Ｄ分光法、［13Ｃ］−１Ｄ分光法、［13Ｃ］−フィルター［1Ｈ］−１Ｄ分光法、［15Ｎ］−１Ｄ分光法および［15Ｎ］−フィルター［1Ｈ］−１Ｄ分光法から成る群より選択されてよい。
好ましくは、前記物理的実験の少なくとも一つは２Ｄ ＮＭＲ分光法を含む。前記２Ｄ ＮＭＲ分光法は、［1Ｈ，1Ｈ］−ＤＱＦ−ＣＯＳＹ分光法、［1Ｈ，1Ｈ］−ＴＯＣＳＹ分光法、［1Ｈ，13Ｃ］−ＨＳＱＣ分光法、［1Ｈ，13Ｃ］−ＨＭＢＣ分光法および［1Ｈ，15Ｎ］−ＨＳＱＣ分光法から成る群より選択されてよい。
好ましくは、前記分子は有機分子である。
好ましくは、前記分子はペプチド、炭水化物、抗生物質、核酸、脂質、代謝産物、薬物分子およびタンパク質から成る群より選択される。
前記分子は、好ましくはヒアルロナン、リシノプリルおよびアンギオテンシンＩから成る群より選択される。
分子内の回転性結合には、平均角の値およびこれら平均の周りの角確率分布を含む多数動的パラメータが指定される。最適化アルゴリズムが、全ての実際の実験データに最もよく適合する動的パラメータそれぞれの値を決定するために用いられてよい。最適化の際の動的パラメータに対する修正およびさらに多くの実験データの包含を伴うアルゴリズムの繰り返し使用により、分子のフレキシブルな部分の平均構造および動的運動は正確に予測できる。この方法論は以下さらに詳しく説明され、３種の有機分子、すなわちヒアルロナン六糖類（オリゴ糖）、リシノプリル（ペプチドミメティック薬物分子）およびアンギオテンシンＩ（ペプチド）について以下の実施例１、２および３に示される。
本発明の別の態様は、本発明の第一および／または第二態様に従う方法により生成された分子の３次元構造の集団の使用を提供し、前記分子の３次元構造を示すＮＭＲデータを予測する。
本発明のさらなる態様は、本発明の第一および／または第二態様に従う方法を用いて生成された分子の３次元構造の集団を用いてＮＭＲデータを予測するための方法を提供する。
本発明の別の態様は、分子の３次元構造を示すＮＭＲデータを予測することにより生成された分子の３次元構造の集団に対する、本発明の第一および／または第二態様に従う方法の使用を提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明の第一および／または第二態様に従う方法を用いて生成された分子の３次元構造の集団を用いてＮＭＲデータを予測するための方法を提供する。
本発明の別の態様は、本発明の第一および／または第二態様に従う方法を用いて分子の３次元構造の集団を生成することにより、分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための、本発明の第一および／または第二態様において提示された方法により生成された分子の３次元構造の集団の使用を提供する。
本発明の別の態様は、本発明の第一および／または第二態様に従う方法を用いた分子の３次元構造の集団の生成により、その目的とする標的に結合したときの分子のコンフォメーションをシミュレートするための方法を提供する。
本発明はさらに、さらなる態様において、その目的とする標的に結合したときの分子のコンフォメーションをシミュレートするための、本発明の第一および／または第二態様において提示された方法により生成された分子の３次元構造の集団の使用を提供する。
別の態様によれば本発明は、本発明の第一および／または第二態様に従う方法を用いたリガンド分子の３次元構造の集団の生成による、その目的とする標的に結合したときのリガンド分子のコンフォメーションをシミュレートするための方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、その目的とする標的に結合したときのリガンド分子のコンフォメーションをシミュレートするための、本発明の第一および／または第二態様において提示された方法により生成された、リガンド分子の３次元構造の集団の使用を提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明の第一および／または第二態様に従う方法を用いたペプチド分子の３次元構造の集団の生成による、ペプチド分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための方法を提供する。
別の態様において本発明はさらに、ペプチド分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための、本発明の第一および／または第二態様において提示された方法により生成されたペプチド分子の３次元構造の集団の使用を提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明の第一および／または第二態様に従う方法を用いた炭水化物分子の３次元構造の集団の生成による、炭水化物分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための方法を提供する。
別の態様において本発明はさらに、炭水化物分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための、本発明の第一および／または第二態様において提示された方法により生成された炭水化物分子の３次元構造の集団の使用を提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明の第一および／または第二態様に従う方法を用いた薬物分子の３次元構造の集団の生成による、薬物分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための方法を提供する。
別の態様において本発明はさらに、薬物分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための、本発明の第一および／または第二態様において提示された方法により生成された薬物分子の３次元構造の集団の使用を提供する。
本発明の態様は、本発明の第一および／または第二態様に従う方法を用いた、ペプチド分子の３次元構造の集団の生成による分子内の水素結合占有率をシミュレートするための方法に関する。
本発明の別の態様によれば、分子の水素結合占有率をシミュレートするための、本発明の第一および／または第二態様において提示された方法により生成された分子の３次元構造の集団の使用がさらに提供される。
本発明のさらなる態様によれば、分子の３次元構造の集団の生成に使用できるデータを保持するデータキャリアであって、前記分子が少なくとも１つの結合で連結した第一および第二の原子を含み、前記データが前記角の可変性を示すデータを含む前記分子を表すデータを含むデータキャリアが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、コンピュータに本発明の第一および／または第二態様に従う方法を行わせるように構成されたコンピュータで読み取り可能な命令を保持するキャリア媒体が提供される。
本発明の別の態様によれば、分子の３次元構造の集団を表すデータを生成するためのコンピュータ装置が提供され、前記装置は、プロセッサで読み取り可能な命令を記憶するメモリーと、前記メモリーに記憶された命令を読み取りかつ実行するために構成されたプロセッサと、を含み、前記プロセッサで読み取り可能な命令は、前記プロセッサに本発明の第一および／または第二態様に従う方法を行わせるように構成された命令を含む。
本発明の第一および／または第二態様に従って分子集団を生成するための開始点は、分子トポロジーについての記載であり、それは興味ある分子の化学式によって決定され、かつ、結合の数および種類、その長さ、それらの間の角およびねじれ（二面）角について記載するものである。この幾何学的情報は内部座標のセットにより便利に記述できる（一般的にはＺ−マトリックスとして知られる）［１］。内部座標は、他の隣接する原子に対する、結合の長さ、結合角、および二面角に関して、分子の原子それぞれについての記述を提供する。これらの内部座標は、標準の幾何学的議論を用いて、空間の原子についての分子（デカルト）座標のセットを特定するために使用できる［２］。
共有化学結合の性質（例えばσ結合、π結合）および軌道の混成（ｓｐ2、ｓｐ3）のため、分子が溶液中で局所的な動的運動を行う間、ほとんどの場合に結合および角はそれらの平均的配置を維持すると仮定できる（よい近似値となる）。すなわちそれらは一定であることができる。従って、溶液中の分子の局所的な動的運動は、二面角のまわりの回転によって第一の近似値に向かって起こる（図１ａおよび１ｂを参照）。さらに、これらの回転は通常、平均角付近の可能な角度の限られたセットを占める（これについては後にさらに詳しく述べられる）。すなわち、フレキシブルな結合が選ぶことのできる角の範囲は、その結合に付随する結合角における可変性を定義することによって特徴付けられる。
本発明の第一および／または第二態様に従って生成される３Ｄ構造の分子集団は、屈曲しているときの溶媒和した分子が有する３Ｄ形状の範囲を可能な限り密接に反映することを意図した、別々の分子構造（それ自体が原子座標のセットである）のセットである。本発明の好ましい実施形態によれば、分子運動の十分に確立されたモデルに従い、特定の二面角（回転可能なもの、コンフォメーションの自由度としても知られる）を変化させることによって分子集団が生成され、その間他のコンフォメーションの自由度は固定された状態で保たれる（角、結合および非回転性のねじれ）。コンフォメーションの自由度の例は、グリコシド、ホスホジエステル、およびペプチド骨格の二面角である。溶液中の特定の種類の結合の動的挙動に関する一連の法則が発明者らによって開発されており、以下に説明される。これらの法則は、興味ある分子内のどの結合が回転可能か、あるいはそうでないかを確立するために用いられる。結合が回転可能であるかどうかは、以下の考察により決定できる。
１）分子内の全ての単結合は回転可能であるが、二重、三重、芳香族結合は回転不可能である；
２）多くの単結合の回転は分子内の原子の相対的位置における効果をもたないため、これらの種類の単結合は回転する必要がない。このような単結合の例は、水素原子と他の原子との間、またはハロゲン原子と他の原子との間の結合を含む；
３）幾つかの環状化学における単結合は、拘束された配置のために回転できない；この例はシクロプロパン内のＣ−Ｃ結合であろう
１）分子内の全ての単結合は回転可能であるが、二重、三重、芳香族結合は回転不可能である；
２）多くの単結合の回転は分子内の原子の相対的位置における効果をもたないため、これらの種類の単結合は回転する必要がない。このような単結合の例は、水素原子と他の原子との間、またはハロゲン原子と他の原子との間の結合を含む；
３）幾つかの環状化学における単結合は、拘束された配置のために回転できない；この例はシクロプロパン内のＣ−Ｃ結合であろう
二面角の小さな振動（平均角付近での変動）については、分子のポテンシャルエネルギーは調和していると考えられる（すなわち平均からの角度偏差の二乗に依存する）［３］。このようなポテンシャルから平均付近での角分布は、ガウス（正規としても知られる）分布を用いてモデル化できる（図１ｃを参照）が、結合角可変性の他のモデルを採用してもよいことは認識されるであろう。
一旦興味ある分子の化学構造が分析され、分子の適切なコンフォメーションの自由度が上に説明された法則と共に標準的な方法を用いて同定された後、それが適当な場合には、分子内の各結合について記述するための初期パラメータのセットの確立が必要である。単なる例として、単一の可変二面角のみを含む、興味ある分子の最も単純な事例を考察することにする。この事例では、二面角には平均結合角（例えば４０°）および平均角の周りでの結合角の最大可変性（例えば１８°）が割り当てられる。それ故、モデルとなる二面角は、４０°の平均値を有するが、実際はその分子について生成された構造の集団にわたって２２°〜５８°に変化し得る。集団の大きさを１０とした場合、この単純な例において、集団が生成されるとき、それは、全ての二面角の全体平均が４０°であり、各構造が２２°〜５８°の可変性二面角の特定値を含む、１０の別々の分子構造から構成されるであろう。２２°〜５８°の範囲にわたる二面角の分布は、好ましくは、ガウス確率分布関数等の、ある種の分布関数を用いることによって制御される。本発明の好ましい実施形態では、角に関するカノニカルガウス展開（式（１））を用いるが、他の分布も容易に実行される。他の分布の例は、トップハット関数（式（２））およびワイブル分布（式（３））を含む。
角の確率分布がガウス分布としてモデル化される好ましい実施形態では、分布はｐ（α）＝Ｇ（μ，σ）となり、これは、平均角μ（平均結合配置）および標準偏差角σ（局所的振動）を有するガウス分布角（α）であり、単一の自由度を表す。図１（ｃ）を参照のこと。この確率分布は、単一のコンフォーマーの周囲の３Ｄ分布に対応する単結合の周りでの振動をシミュレートするであろう。自由度が０、１および２であるアンギオテンシン４に基づく例について、図２を参照のこと。
一般に遭遇するｓｐ2およびｓｐ3結合化学（それぞれ平面および四面体）には、幾つかの異なるコンフォメーションの状態が存在し得る（例えば、各炭素−炭素結合においてｇ＋、ｇ−、およびｔ回転異性体を採用できるアルカン鎖、いす型、ふね型および／またはねじれふね型コンフォメーション等のコンフォメーション範囲を採用できる環状環、およびゆっくりと相互変換するシスおよびトランスコンフォメーションを採用できる、ペプチド結合等の官能基）。このような事例において、さらに複雑かつさらに一般的な式が確率分布のために用いられてよい。例えば、ｐ1、ｐ2およびｐ3が確率であって、ｐ1＋ｐ2＋ｐ3＝１である、３までの振動状態を有するシステムに対応する、ｐ（α）＝ｐ1Ｇ（μ1，σ1）＋ｐ2Ｇ（μ2，σ2）＋ｐ3Ｇ（μ3，σ3）である（特定の例については、以下に詳しく述べる）。さらに、幾つかの確率ならびに／あるいは平均および標準偏差値は、例えばペプチドもしくはパッカリングシクロヘキサン型環に見られるような事例をモデル化するため、互いに組み合わせてよい。例えば、σ1＝σ2＝σ3（上記の式において）は、各コンフォメーションの基質が同一の範囲の振動運動を有することを示すであろう。
この様式における動的集団の算出は、分子の一部が互いに偶然に衝突する結果を招き得る。このような状態を避けるため、単一の構造それぞれを生成した後（集団内で）、設定距離内に（典型的には０．１ｎｍ）いずれかのファンデルワールス活性原子（以下を参照）が存在するか否かについて試験されてよい。この条件が満たされる場合に３Ｄ構造は削除かつ再計算できる。この過程は立体的に許容できる３Ｄ構造が生成されるまで（典型的には５０回である最大試行数まで、その後現在の３Ｄ構造が自動的に承認される）繰り返されてよい。
分子構造の集団が一旦生成されると、実際の実験データ、例えば限定はされないがＮＭＲデータを予測するために使用されてよい。予測の質、すなわち予測実験データの実際の実験データに対する適合の密接さは、構造の集団が、溶液中に存在する実際の分子の構造の範囲をどれ程密接にモデル化しているかを評価するために使用されてよい。
静的な表現からよりも動的分子集団からの方が、さらに測定可能な分子特性の算出が理論的に可能であることが認識されるであろう（この二つを比較する関連物理的理論が知られていると仮定する）。これは、分子システムについての完全な記述が、それが占めることのできる状態（巨視的状態）およびそれらの発生の確率（統計的な重み）を含むという、古典的な統計物理学の基本的仮説である［４］。従って、以前の方法においては各回転性結合を表すために単一の平均角のみを使用するのに対し、各コンフォメーションの自由度における可変度を含む場合は、１以上の異なる種類のＮＭＲ実験データを同時に満たすことが可能になる。このＮＭＲ実験データそれぞれは、分子の幾何学的形状についての異なる関数にわたって集団から平均化されるため、分子のフレキシビリティーについての異なるスナップショットを提供し、モデルを定義するために利用できる実験情報の量を効果的に増大させる。このことは、多数のＮＭＲデータベースの使用を促進し、動的分子のコンフォメーションを定義するためにしばしば必要とされる多数の制限を可能にする。
実際の実験データとの比較が行われるとき、分子の構造集団は最初に本発明の第一および／または第二の態様に従って生成される。集団の各メンバーについての実験パラメータを予測するため、標準的方法（以下、さらに詳細に説明する）が用いられる。集団の各メンバーについての予測値は平均化され、この平均値は実際の実験データ由来の対応するパラメータと比較される。
例えば、核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）は、距離の六乗に対して平均化されることが知られている。従って、実際の実験データから算出したＮＯＥとの比較で、集団の各メンバーについての予測ＮＯＥ値、この平均化された予測ＮＯＥのセット、およびこの平均値を決定するために、標準的方法を用いることができる。さらなる例は、二乗したコサイン角に対して平均化される残留双極子カップリング、およびねじれ角に対して平均化されるスカラーカップリングを含む。
実験パラメータの予測、および前記予測されたパラメータの対応する実際のパラメータに対する比較に続き、１以上のさらなる集団が本発明の第一および／または第二の態様に従って生成でき、各さらなる集団は上記と同様の方法で実際の実験データに対して試験できる。このようにして最適化のルーチンが確立され（図３を参照）、ここで分子構造の一連の集団は繰り返し生成され、実際の実験データに最も密接に一致する集団、すなわち実際の実験データに最も高い相関関係を示す集団を決定するために、実際の実験データと比較される。
アルゴリズムの核心は、最適化ルーチンの各繰り返しごとに動的分子集団を生成する、コンフォメーションモデル生成部である。この生成部は、上で概説され、以下でさらに詳しく述べられる変数パラメータのセット（幾つかはコンフォメーションを定義し、他は動的広がりを定義する）から集団を導き出す。これらのパラメータは、１種またはそれ以上の実験に由来する実際の実験データ（好ましくは異なる種類のＮＭＲデータを含む）に適合するように同時に最適化され、モンテカルロアプローチを用いて、分子に対して最も適合する動的集団が得られる［５］。このプロセスは、以下の方法においてアルゴリズムにより記述され、これによりデジタルコンピュータ上でのその実行が可能となる：
１）動的分子の変数のセットによるコンフォメーション自由度に基づく動的集団の生成。コンフォメーション自由度は局所的な化学の考慮に基づいて選択される（定義は以下を参照）。特に、化学結合の種類および混成が、それらが回転可能か否かを決定する。
２）適切な物理理論および積分（平均化）の使用による動的集団からの実験データの予測。例としての目的で、以下に詳しく考慮されるＮＭＲ実験のため（核オーバーハウザー効果実験（ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ）、残留双極子カップリング、カップリング定数および1Ｈ−15Ｎ異核効果（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓ））、適切な物理理論が導かれ検証されてきた［６、７〜９］。
３）予測実験データの真の実験データに対する比較および一致関数の算出。これは通常二つの間の距離の二乗であり（実験誤差を含む）、χ2と称される。
４）χ2が以前に見られたものよりも小さい場合、この動的構造は承認され、最も良い構造の新しい候補となる。
５）分子変数はランダムに変化し（平均および動的広がりの両方において）、特定の繰り返し数が経過するまでは工程１へ戻る。要求される工程の数は問題の複雑さに依存する。簡単に述べると、この複雑さはコンフォメーション自由度の数から推定できる。
６）十分に定義された最終集団が再現性よく生成できるように適切な数の繰り返しが行われたら、現在の候補となる構造は単一の解決済みの動的構造を表す。この構造は、コンフォメーション制限あたりの平均χ2を算出することにより、実験データに対する適合の良さについて評価できる。
７）多くの動的構造が生成され、繰り返された構造決定の精度を決定するため、それらについての統計が取られる。このことは、単一の独特な動的分子のコンフォメーションの決定における実験データのロバスト性を決定する。
１）動的分子の変数のセットによるコンフォメーション自由度に基づく動的集団の生成。コンフォメーション自由度は局所的な化学の考慮に基づいて選択される（定義は以下を参照）。特に、化学結合の種類および混成が、それらが回転可能か否かを決定する。
２）適切な物理理論および積分（平均化）の使用による動的集団からの実験データの予測。例としての目的で、以下に詳しく考慮されるＮＭＲ実験のため（核オーバーハウザー効果実験（ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ）、残留双極子カップリング、カップリング定数および1Ｈ−15Ｎ異核効果（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓ））、適切な物理理論が導かれ検証されてきた［６、７〜９］。
３）予測実験データの真の実験データに対する比較および一致関数の算出。これは通常二つの間の距離の二乗であり（実験誤差を含む）、χ2と称される。
４）χ2が以前に見られたものよりも小さい場合、この動的構造は承認され、最も良い構造の新しい候補となる。
５）分子変数はランダムに変化し（平均および動的広がりの両方において）、特定の繰り返し数が経過するまでは工程１へ戻る。要求される工程の数は問題の複雑さに依存する。簡単に述べると、この複雑さはコンフォメーション自由度の数から推定できる。
６）十分に定義された最終集団が再現性よく生成できるように適切な数の繰り返しが行われたら、現在の候補となる構造は単一の解決済みの動的構造を表す。この構造は、コンフォメーション制限あたりの平均χ2を算出することにより、実験データに対する適合の良さについて評価できる。
７）多くの動的構造が生成され、繰り返された構造決定の精度を決定するため、それらについての統計が取られる。このことは、単一の独特な動的分子のコンフォメーションの決定における実験データのロバスト性を決定する。
カイ二乗最小二乗測定（χ2）が実験データ（Ｘexp）および理論的予測（Ｘpred）の間の適合の良さを決定するために用いられ、これは予測と実験の間の距離の二乗の和を、各実験測定での推定される誤差の二乗（ε2 exp）で割ったものである。ここでは三種の測定、個々の制限それぞれについての最小二乗適合（χ2 restraint）、データセット（χ2 dataset）についての最小二乗適合を求めるためのこれらの値の和、および全ての実験データ（χ2 total）についての最小二乗適合を求めるためのこれらの値の和について考察される。式４〜６を参照のこと。
アルゴリズムのそれぞれの繰り返しにおいて、現在の動的分子集団は、分子の幾何学的形状の異なる関数にわたる集団を理想的に平均化する１以上の実験データセットを予測するために用いられる（上での考察の通り）。それぞれのデータ点のχ2適合が報告され、そこから、それぞれの異なるデータセットの統計を算出できる（以下の実施例１、２および３に例証される）。
ガウス分布角の平均、その広がり（ここでは可変性とも称される）および相対的確率の重み付けは、実験データに対する良い適合が見出されるまで、動的分子集団の繰り返される算出および実験データとの比較により繰り返し探索される（図３）。本発明の好ましい実施形態では、モンテカルロ繰り返しアプローチがこの探索を行うために用いられているが、他の繰り返し最適化手順、例えば限定はされないがＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムまたは遺伝的アルゴリズムも用いられてよい。
あるクラスの分子制限が実験データに依存しない計算に加えられてよいが、代わりにそれらは基本的分子特性とみなされる。最も明らかなものはファンデルワールスエネルギーであり、これはχ2へ直接追加できる。ファンデルワールス力定数の実際の数値は、他の実験データセットと調和するように、使用者により選択された一定のスケーリング係数（以下を参照）により修正されるべきである。
以下に、動的コンフォメーションに対して感受性のあるＮＭＲ実験データの例を示す。これは以下の実施例１、２および３で用いられ、様々な分子、特に有機分子の動的構造を決定するために用いることができる。ＮＭＲ実験を実行し、ＮＭＲデータセットを得る方法についてもまた、以下に詳しく述べられる。さらに、これらの実験ＮＭＲパラメータを予測するために使われる理論、および、実験測定を予測に対して比較することによって構造がどのように最適化されるかについて記述される。ＮＭＲは、水溶液中での原子規模の情報を提供することから、特に適した方法である。しかしながら、他の種類の実験データ（動的情報を提供する）、例えば溶液状態での散乱および蛍光エネルギー転移、も使用できることに留意すべきである（これらの使用についての特定の例は、この出願においては詳述しない）。
考慮されるべき第一の種類の実験データは、核オーバーハウザー効果に基づくＮＭＲ実験により生成される［１０］。この場合、特に有用な実験はＮＯＥＳＹおよびＲＯＥＳＹ分光法である。標準的なＮＭＲ構造計算法を超える重要な進歩は、実験データを理論的に予測するための完全な緩和行列［７］の使用である。このような計算法（距離ｒからｒ-6までに強度を単純に関係付ける近似値の使用と共に）は重要である。なぜなら、小分子は小容量に多数のＮＭＲ活性核を含むことができ、しばしば混合時間が比較的長いからである。従って、重要なスピン拡散の強い可能性があり、これは、完全な緩和行列の計算のみによって考慮することができる。この計算を行列対角比によって行う方法は、以前に公表されている［７］。最終的には、交差ピークは最終行列において非対角項により表されるが、対角ピークは行列の対角に見出される。スペクトル密度関数の異なる一次結合が、異なる可能な緩和実験（例えばＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、およびＴ−ＲＯＥＳＹ）の計算を行うために使用できる。
異核Ｔ1緩和およびＮＯＥデータ（典型的には、1Ｈと13Ｃもしくは15Ｎの間）等の他の種類のＮＭＲ緩和実験は、以前に記述されたように［８］、秩序パラメータ（Ｓ2）、全反転相関時間（ｏｖｅｒａｌｌ ｔｕｍｂｌｉｎｇ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ）（τc）および内部相関時間（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ）（τi）として解釈できる。これらのデータは、局所的動態と密接に関連しており、他のＮＭＲ測定に対する補足として使用できる。予測するために、分子集団内の全ての構造は、それらの間で最小の二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有するようにオーバーレイされてよい。以前に得られた［１１］この分子骨格の中で、選択されたベクトルについての相関関数が算出され、Ｓ2が推定される。
ＮＭＲスカラーカップリング定数（Ｊ）、特に三結合カップリングは、経験的関係、Ｋａｒｐｌｕｓ曲線を通してコンフォメーションを示す［１２］。各二面角について、Ｋａｒｐｌｕｓ式が知られていると仮定すると、動的集団に対して平均化することによってＪを算出し、χ2を決定するために実験データと直接比較することが可能である。
不活性で弱く配列する共溶質（ｗｅａｋｌｙ−ａｌｉｇｈｎｉｎｇ ｃｏ−ｓｏｌｕｔｅ）により誘導された残留双極子カップリング（ＲＤＣ）は、以前に得られた方法により算出できる［７］。さらに一般的な事例に対する他の方法は文献から得られる［１３］。ＲＤＣは、緩和データにより提供される局所的情報よりも長距離にわたるコンフォメーション情報を提供することから、全実験データプールに対する重要な補完物である。幾つかのデータ（例えばスカラーカップリング）は理論的計算と直接比較される。しかしながら他の事例では（例えばＮＯＥＳＹ測定）、データセットは、サンプル濃度、分光計の感度などに基づく任意の定数によってスケーリングする必要があり、かつ実験データおよび直線適合（０を通る）によるそれらの各予測から算出できる。適切な係数（κdataset）は式（７）に示され、｛κχpred，χexp｝で示されるグラフが単一の勾配を有するように、全ての予想に適用できる（以下を参照）。
式（７）における重要な考慮は、誤差への強い依存である。これらが正確に定量化されない場合、結果としての構造にはバイアスがかかり得る。実験誤差（εexp）の計算は上で考察されてきたが、集団の有限サイズによる誤差については考察されていない。これが特に重要となる一事例（ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、またはスカラーカップリングに対しては考慮されていない）は、ＲＤＣの予測を行う際であり、それは分子骨格内での核間ベクトルの方向に依存する。ここで角への依存は高度に非線形的であり、従って追加の誤差補正が適用される必要がある。これは実効誤差をスケーリングすることにより最も適切に達成される。このスケーリング（実効誤差εexp’を生じるための）は以下の方法で導くことができる。θが分子骨格内の配列の主軸の間の角である場合、残留双極子カップリングを定義する式から始まり［１３］、式（８）が得られ、これにより、計算誤差が微分（式（９））により得られる。適切な近似の結果は式（１０）である。
恒等式：ｃｏｓ４θ＝８ｃｏｓ4θ−８ｃｏｓ2θ＋１を（１０）に代入し、これで実験誤差を割ると、式（１１）および（１２）を得る。後者はほとんど式（１１）と同一であるが、分母に最小値である１／４を有することによって０による除算が避けられるため、実際に用いられる。
式（１２）を用いることにより、総実験誤差推定量（εexp）を増加させて、残留双極子カップリングの予測に付随する誤差を考慮に入れることが可能になり、これは実験データとの適合度をさらに正確に評価するため用いることができる。
ここで本発明の様々な好ましい特性のさらなる記述のために供される、本発明の好ましい実施形態を記述する。
興味ある分子についての第一の集団が生成でき、かつ前記集団に基づいて構造計算が行われる前に、様々なパラメータが特定される。
実際の実験において用いられるそれぞれの溶媒における分子に対する一連の溶媒マスク（ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｓｋ）が特定され、そこから、実際の実験データのデータセットが得られた。これは溶媒との迅速な交換のためＮＭＲ活性および不活性である水素原子のリストを含む。この情報は、分子内の全てのプロトンの正確な位置に非常に敏感であるＮＭＲ緩和予測（上記を参照）の計算において使用される完全緩和行列の計算の正確さにとって重要である。従って、溶媒との化学交換によりＮＭＲ不活性である分子内の全てのプロトンは計算から除外されなければならない。例えば、Ｈ2Ｏ中の炭水化物に対する溶媒マスク（ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｓｋ）は、全てのヒドロキシル水素原子がＮＭＲ不活性であることを特定するが、ＤＭＳＯ中の同じ炭水化物に対しては、溶媒マスク（ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｓｋ）は同じヒドロキシルプロトンが活性であることを特定する。各データセットはそれに付随する適切な溶媒マスク（ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｓｋ）を、入力パラメータとして有する。
最初に必要な溶媒の数が特定され、必要な溶媒の数に続いて、名称によりリスト化される（これらは後に実験データ入力ファイルにより使用される）。溶媒マスク（ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｓｋ）において含まれるかまたは除外される実際の原子は、溶媒マスク（ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｓｋ）に原子を加えるかまたはそれらを取り去る、ａｄｄステートメントまたはｅｘｃステートメントにより特定される。これらのステートメントのそれぞれにおける次の２つのフィールドは、残基数および原子タイプを定義する。全てのプロトン（Ｈ★）を選択し、全てのヒドロキシル（ＨＯ★）を取り除くために、ワイルドカードアスタリスクが用いられる。典型的なファイルを以下に示す。
構造計算の必要に従い、全体的なパラメータセットである（すなわち特定のデータセットに特異的ではない）ファンデルワールスマスクが準備される。このマスクは原子をＮＭＲ活性にとどめるが、ファンデルワールス力（χ2への加算として算出される。以下を参照。）に対して効果的に透過性であり、これは原子が、構造計算の間に不利益なく分子の他の部分と重複および衝突することを可能にする。このマスクの使用は、構造計算からの結果に不運な立体的衝突によってバイアスをかけないために、原子を、未確定な配向の構造であるが任意の初期（および／または固定された）配置の範囲内とする点で重要である。このケースの例は、そのコンフォメーションが水中では実験的に容易には調べられない、ヒドロキシルプロトンおよびカルボキシレート基酸素原子である。このマスクはまた、動的変数の一セットが他から独立して試験可能な場合に、構造の他の部分に不利益なくコンフォメーションおよび立体衝突を選択させることによって構造の他の部分からそれらをアンカップリングさせることにより、３Ｄ構造決定の初期段階において使用可能である。分子の動的構造が定義されていくに従い、ファンデルワールスマスクは適切に更新される。すなわち、現在解決された分子の全ての部分を含む。
ファンデルワールス入力ファイルのｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎセクションにおいて、計算のためのカットオフ距離が特定され（１または２の共有結合により分離される原子は常に計算から除外される）、そしてカップリング定数が特定され、これは全体のχ2計算に項として含められる前にファンデルワールス計算に適用されるスケーリング係数を決定する。次のセクション（ｎｏｎｂｏｎｄｅｄセクション）は、各種の原子についての原子半径および反発エネルギーを定義する（例えば水素については、ｖｄｗ ★ Ｈ★ ０．０１６ ０．６０）。これに続き、含まれる原子および除かれる原子を詳述する一連のステートメントがリストされる（いずれのステートメントも存在しないときには全ての原子が含まれる）。以下に示す入力ファイルの例では、全てのヒドロキシル原子は除かれるが（ｅｘｃ ★ ＨＯ★）、他の全ての原子は含まれる。この明細書で使用される命名法は、溶媒マスク（ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｓｋ）で使用されるものに類似する。
モデルなしの近似［１１］を経たＮＭＲ緩和データ（ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、Ｔ−ＲＯＥＳＹ）の予測のために、値は、２９８Ｋかつ０．８８ｃＰの粘度（すなわち、２５℃におけるＨ2Ｏ）での分子相関時間（τc）に対して特定されなければならず、これは一般的なパラメータである。τcの値は実験的に決定できるか［８］、または最初の実例において推定できる。妥当な最初の近似値まで、分子量が〜４００Ｄａの小分子は２９８Ｋにおいて０．４ｎｓの相関時間を有するが、〜１０ｋＤａの小タンパク質は２９８Ｋにおいて〜５ｎｓの相関時間を有する。時折、分子は、ＮＯＥの交差ピークが陰性（タンパク質にとっては正常）から陽性（すなわち、これらは対角ピークに対する逆の徴候を有する）への閾値を越える十分な低分子量（約〜２５０Ｄａ）であり、これはτcが式τcω〜１．１２（ωがプロトン共鳴角周波数であるとき、ＮＯＥ交差ピークがゼロとなるτcの値）を通して推定されることを可能にする。ＲＯＥはこのゼロ点を持たず、従ってτcωが〜１．１２であるとき非常に有用となることに留意すべきである［９］。
緩和データの予測において用いられるスペクトル密度の計算は、分子拡散のための対称トップモデルを導入することにより、高度に異方性の形をもつ分子のために改善できる。この事例において、単一のτc値は二つの相関時間（対称トップにおいて対称な軸に対して平行および垂直）によって置き換えられる。得られるスペクトル密度関数への改変は［４６］、式（３）〜（９）に記述される。
τcに対する値が実験的に決定されていないとき、最初の推定値は、構造計算の数回のラウンドの後（これが必要とみなされる場合）、動的構造が実験データと良好な相関を持ち始めることが明らかな時点で、検討できる。この時点において、τc値は、同じデータセットを用いて、しかし異なるτc値を用いて、実験データに対して最も良いχ2 total値を与える値を取って、繰り返し計算により最適化できる。
τc値は構造計算の間に固定される一般的な物理パラメータであるが、溶媒の粘度（例えば１００％Ｄ2Ｏは１００％Ｈ2Ｏの〜１．２５の粘度を有する）または温度（例えば、一緩和データセットは２９８Ｋにおいて、別のデータセットは２７８Ｋにおいて記録された可能性がある）の差によるデータセット内での実際のτc値の変動は、τc値は温度に比例して溶媒粘度に反比例するという、回転拡散についての単純なデバイ理論を用いて補償される。それ故、各緩和データセットは、ＮＭＲサンプルの粘度（ｃＰにおいて）、およびそのデータセットが取得された温度（Ｋにおいて）の両方の値を有する。異なる温度（Ｔ１，Ｔ２；１００％Ｈ2Ｏのζ298＝０．００８８Ｐ）における１００％Ｈ2Ｏの粘度（ζ）は、式（１３）を用いて算出できる。所定の温度における１００％Ｄ2Ｏの粘度は、式（１４）を通して１００％Ｈ2Ｏの粘度に関係する。Ｈ2Ｏ／Ｄ2Ｏの所定のパーセンテージｖ／ｖに対して式（１３）および一次スケーリング式（１４）を用いることにより、いずれの所定の温度におけるＨ2Ｏ／Ｄ2Ｏ混合物の粘度も推定できる。
ここに記載される好ましい実施形態では、実験データは、特定の測定、スペクトル重複に関する情報、および実験条件を記述する物理パラメータを含む一連のテキストファイルを通して、構造計算へ入力される。全てのファイルにおいて、ｃｏｎｆｉｇｕｌａｔｉｏｎセクションは、ＮＭＲ磁場強度（ｆｉｅｌｄ ９００ＭＨｚ）、データセットの名称識別子（ｉｄｅｎｔ ＮＯＥＳＹ）および使用される適切な溶媒マスク（ｈ２ｏ）を特定する。緩和データセットの場合、温度（ｔｅｍｐ ２９８、Ｋｅｌｖｉｎにて）、溶媒粘度（ｖｉｓｃ ０．８８、ｃＰにて）、および使用される混合時間（ｍｉｘｔｉｍｅ ４００ｍｓ）もまた特定される。ＮＯＥＳＹデータを特定する入力ファイルの例を以下に示す。
実験ｄａｔａセクションはやや標準化されたフォーマットを有するが、実験測定の特定の種類に合わせることもまたできる。例えば、上記のＮＯＥＳＹデータ入力ファイルにおいてａｓｇｎ ２ ａ ６ Ｈ３ ａ ６ Ｈ２Ｎ ３４．２ １３．７０の行は制限数２を特定するが、それに続く４フィールドは２原子を定義し、その２原子間でＮＯＥが観察される（かつ計算される必要がある）。次の２フィールドは制限強度およびその誤差（ａｓｇｎ １０の場合、３４．２±１３．７）を与え、最後のフィールドは、χ2 restraint値（この制限の予測値の実験的に観察された値に対する比較）が動的集団に対する総χ2 total値に含まれるべきであることを特定するｆｌａｇ（０）である（５を超える値は、それが使用されるべきではないことを示す）。重複した制限はフォーマットｏｖｌｐ １ ａ ６ Ｈ２Ｍ ａ ６ Ｈ２Ｎ ４８．８ １９．６ ０により特定され、ここでｏｖｌｐ １は、この重複した制限における原子間のＮＯＥを、同数の最初の制限から算出されたＮＯＥ（すなわちａｓｇｎ １）と組み合わせる必要があることを示す。スペクトルの対角ピークは、単純に同じ２原子の間のＮＯＥとして表現される（これについての例は付表Ａの実際の入力データファイルを参照）。
残留双極子カップリング（ＲＤＣ）入力ファイルのｃｏｎｆｉｇｕｌａｔｉｏｎセクションは、緩和データについて上に記載されたものに直接類似する。上記の入力ファイルの例を参照のこと。ａｓｇｎ １ ａ ６ Ｃ１ ａ ６ Ｈ１ −５．８５ ０．３５ ０、ａｓｇｎ １の行は、この行が制限数１であることを特定する。続くａ ６ Ｃ１ ａ ６ Ｈ１の文字は、２原子の割り当てを定義し、その２原子間で残留双極子カップリングが算出される。これに続き、実験測定およびその誤差がリストされ（すなわち、ａｓｇｎ １の場合、−５．８５±０．３５Ｈｚ）、ｆｌａｇ（０）はこの制限の予測値の実験的に観察された値に対する比較のχ2 restraint値が、動的集団に対する総χ2 total値に含まれるべきであることを特定する（上記の通り）。
コンフォメーションに依存するスカラーカップリングを表す入力データファイルは同様に特定される。典型的な入力ファイルは上に直接示される。ｃｏｕｐ １ ２ Ｈ２ ２ Ｃ２ ２ Ｎ２ ２ Ｈ２Ｎ ９．４５ −２．０８ ０．６３ ０ ９．６７ ０．５ １の行において、ｃｏｕｐ １はこの構造制限がカップリング定数型のデータであり、かつ制限数は１であることを特定する。９．４５ −２．０８ ０．６３ ０の４フィールドは、ＨＣＮＨ角θに対する一般的なＫａｒｐｌｕｓ式3ＪHH＝Ａｃｏｓ2（θ＋φ）＋Ｂｃｏｓ（θ＋φ）＋Ｃにおいて用いられる、Ａ、ＢおよびＣならびにフェーズ（φ）パラメータを特定する。これに続き、実験測定およびその誤差が与えられ（ｃｏｕｐ １の場合、９．６７±０．５Ｈｚ）、ｆｌａｇ（０）は、この制限の予測値の実験的に観察された値に対する比較のχ2 restraint値が、集団に対する総χ2 dataset値に含まれるべきであることを特定する（上記）。
ペプチドに対する二面角構造制限は化学シフトおよびＴＡＬＯＳプログラム［４２］を用いて生成できる。ＴＡＬＯＳプログラムは、ペプチド配列および分子内の各残基に対するＨＮ、ＨＡ、Ｃ、ＣＡおよびＣＢ核の化学シフトを入力し、予測値を各骨格のｐｈｉおよびｐｓｉ角に対する誤差と共に出力する。ＴＡＬＯＳは一般的にペプチドよりも強固であるタンパク質に対して実際に設計されたことから、χ2計算に実際に用いられる誤差はＴＡＬＯＳにより予測される誤差値の２倍とされる（この値は我々の現在の経験に基づく）。二面角構造制限ファイルのフォーマットの例は以下の通りである。
このファイルにおいてｃｏｎｆｉｇｕｌａｔｉｏｎ：セクションは、他のデータ型と同じフォーマットに従う。ｄａｔａ：セクションにおいて、各制限はｄｉｈｅにより導入され、続くフィールドは制限数である。次の８フィールドは二面角内の４原子を、（残基数、原子の名称）の組み合わせにおいて定義する。これらに続き、二面角値、続いてその誤差が与えられる。
水素結合相互作用の存在または不在は、アミドプロトン交換率および温度係数を含む数種の実験データから推測できる。水素結合が存在するか否かについての考慮は、角および距離基準の両方に依存する。典型的には、ドナーおよびアクセプター電気陰性原子は３．３〜２．５オングストロームの距離で隔てられ、ドナー水素およびアクセプター電気陰性原子は２．５〜１．５オングストロームの距離で隔てられ、３原子間の角は＞１１０°である。構造内のこれらの３基準が満たされる場合、水素結合が存在するとみなすことができる。フレキシブルな分子内で水素結合は一過性に形成かつ切断でき、これらに実験データから推定され得るパーセンテージ占有率を与える（［３６］を参照）。これらの基準を満たす現在最も良い集団内の分子数を数えることにより、集団内の水素結合のパーセンテージ占有率を算出できる。現在の集団の算出された占有率と実験による制限占有値との比較は、χ2 restraintスコアの直接の算出を可能にする。
水素結合構造制限ファイルのフォーマットの例を以下に示す。
このファイルにおいてｃｏｎｆｉｇｕｌａｔｉｏｎ：セクションは、他のデータ型と同じフォーマットに従う。ｄａｔａ：セクションにおいて、各制限はｈｂｏｎｄにより導入され、続くフィールドは制限数である。次の６フィールドは水素結合（電気陰性ドナー、水素原子、電気陰性アクセプターそれぞれ）内の３原子を、（残基数、原子の名称）の組み合わせにおいて定義する。これらに続き次の５フィールドは、構造内に水素結合が存在するか否かを判定するための３基準を特定する。最初の二つの値は、その間で二つの電気陰性原子が見出されなければならない平均距離および範囲（例えばｈｂｏｎｄ １に対し、２．９±０．４オングストローム）を与え、次の二つの値はその間で水素およびアクセプター原子が見出されなければならない平均距離および範囲を与え、最後の値は３原子全ての間の角の最小値である。次の二つの値は、実験データから決定された、水素結合の予期されるパーセンテージ占有率および誤差を定義する（例えばｈｂｏｎｄ １，０および１０に対し、０±１０％の占有率）。最後の２フィールドは、制限がχ2 totalスコアおよび品質コードそれぞれに含まれる、各計算の実行中の点を定義する。水素結合アクセプター原子が１原子を超えることが可能な場合、他のアクセプター原子は、ＮＯＥＳＹデータセットにおいて使用されるｏｖｉｐ行と同等の様式で挙動する、ｈｃｏｍｂで始まる行による制限の累積スコア内へ含めることができる（例えば上の例中のｈｂｏｎｄ １について、残基３のアミドプロトンと残基１の二つの側鎖酸素ＯＤ原子に対する全ての水素結合相互作用の総占有率は０±１０であるべきである）。
秩序パラメータ（Ｌｉｐａｒｉ−Ｓｚａｂｏモデルのない解析による結果）は、局所的動態および特定の実行に有用な記述であり、入力データファイルはここに記載される。この入力ファイルのｃｏｎｆｉｇｕｌａｔｉｏｎセクションは、以前に記載されたものに直接類似し、例は上に示される。実験ｄａｔａセクションにおいて、ｈｎｏｅ １ ｗ ２ Ｈ２Ｎ ｗ ２ Ｎ２ ０．４４ ０．０１ ０，ｈｎｏｅ １は、この構造制限が秩序パラメータ型データであり、制限数は１であることを特定する。続くフィールドのｗ ２ Ｈ２Ｎ ｗ ２ Ｎ２は、秩序パラメータが算出される２原子の割り当てを定義する。これに続き、実験測定およびその誤差が与えられ（ｈｎｏｅ １の場合、０．４４±０．０１）、ｆｌａｇ（０）は、この制限の予測値の実験的に観察された値に対する比較のχ2 restraint値が、動的集団に対する総χ2 dataset値に含まれるべきであることを特定する（上記の通り）。
３Ｄ構造の集団を正確に算出するため、別の一般的パラメータである分子の動的モデルが特定されなければならない。この動的モデルは、分子内の興味ある回転性結合の変数についての全ての明細を含む。結合が回転可能であるかどうかについては以下の考慮：
１）分子内の全ての単結合は回転可能であるが、二重、三重、または芳香結合は回転不可能である；
２）多くの単結合の回転は分子内の原子の相対的位置における効果をもたないため、これらの種類の単結合は回転する必要がない。このような単結合の例は、水素原子とその他のいずれかの原子の間、またはハロゲン原子とその他のいずれかの原子の間の結合を含む；および
３）幾つかの環状化学の中での単結合は、制約された配置のために回転できない；この例はシクロプロパン内のＣ−Ｃ結合であろう
により決定できる。
１）分子内の全ての単結合は回転可能であるが、二重、三重、または芳香結合は回転不可能である；
２）多くの単結合の回転は分子内の原子の相対的位置における効果をもたないため、これらの種類の単結合は回転する必要がない。このような単結合の例は、水素原子とその他のいずれかの原子の間、またはハロゲン原子とその他のいずれかの原子の間の結合を含む；および
３）幾つかの環状化学の中での単結合は、制約された配置のために回転できない；この例はシクロプロパン内のＣ−Ｃ結合であろう
により決定できる。
ここで、動的モデルが必要であることが同定された分子内の単結合（上記の考慮に従い）には、単峰性、二峰性、または三峰性が割り当てられる。問題となっている結合の様式を示す実験データが存在しないとき、動的モデルの様式の選択は表１を用いて決定される。この表は、単結合における２原子（原子ＡおよびＢ）の、使用される結合様式と混成状態［１４］の間の相関関係を示す。
これらの明細に従い、様式の挙動は最初に、以下に説明される広範囲の共有結合へ割り当てられる。
一般に内部座標配置に固定されるとみなされる共有結合の例（黒で示す共有結合は固定されるとみなされる）。
一般に単峰性分布を好むとみなされる共有結合の例（黒で示す共有結合は単峰性の挙動を好むとみなされる）。
一般に二峰性分布を好むとみなされる共有結合の例（黒で示す共有結合は二峰性の挙動を好むとみなされる）。
一般に、電子共役によるシスおよびトランスのコンフォメーション異性体となる二峰性分布を好むとみなされる共有結合の例（黒で示す共有結合はシス／トランスの挙動を好むとみなされる）。
一般に三峰性分布を好むとみなされる共有結合の例（黒で示す共有結合は三峰性の挙動を好むとみなされる）。
各モードに対する平均角の最初の値は、立体的に好ましいコンフォメーションである値に設定される。例えば三峰性モデルにおいて、三つの平均角は、結合の完全なねじれ型の状態に相当し得る［１５］。単結合および二重結合の間で中間特性を有する共有結合（電子共役により）は二峰性モデルを与え、ここで二つのコンフォメーションの二つの平均角はシスおよびトランス二面構造を与える。１以上のコンフォメーションの間で内部変換する環状化学には、必要に応じて二峰性または三峰性モデルが与えられ、ここで幾つかの二面角は一緒に同時に動く（いくつかの例は以下を参照）。
１以上のコンフォメーションを選択できる環状化学の例。
動的３Ｄ構造の決定の間、最初に二峰性または三峰性の挙動に設定された（上記の表および記述に従い）回転性結合が、実際の分子内で実際により下位の様式の挙動を選択することが、実験データへの最も良い適合から明らかになるであろう。この場合、動的モデルファイルにおける様式の挙動は適宜更新される。
回転性結合の様式の挙動のために利用可能な以前の実験データが存在する場合、これは様式の挙動を定義するために用いることができる。所定の結合の様式の挙動を定義するために用いることのできる実験データの種類は、ＮＭＲデータ（例えばプロリンアミド結合のシス／トランス型は異なる化学シフトを有する）またはケンブリッジ構造データベースにおいてその結合（ならびに原子ＡおよびＢにおける置換基）のために表示されるコンフォメーションの範囲の考慮を含む。分子動態のシミュレーションが行われるとき、これらはまた結合に対する最も良い様式の挙動を決定するためにも用いられてよい。
実験データに対して最も良く適合する集団を見出すためにどの回転性結合を変化させるべきかの決定後、各結合に対して使用者により指定される二つの基本的種類の定義されたフレキシビリティー：
１）単峰性結合のフレキシビリティーを定義する旋回
２）二峰性、三峰性およびより高次の様式の結合フレキシビリティーを定義する複数の旋回
が存在する。
１）単峰性結合のフレキシビリティーを定義する旋回
２）二峰性、三峰性およびより高次の様式の結合フレキシビリティーを定義する複数の旋回
が存在する。
以下に述べるように、本発明の好ましい実施形態では、回転性結合は単一の平均角値（μ）および角のガウス広がり（σ）を有する旋回によって指定され、これらは分子構造の集団を繰り返し生成しかつ各集団を実際の実験データに対して試験する適切な最適化アルゴリズムによって最適化される。この方法により特定される結合の例は、炭水化物内のグリコシド結合である。複数の旋回により指定される回転性結合には、それが選択可能な複数の配置が割り当てられ（典型的には２または３の低エネルギー回転異性体の位置）、これらはそれぞれ最適化できる角の値および角のガウス広がりを有し、かつそれらの相対的割合は確率モデルにより特定される（以下を参照）。これらの確率は、局所的なＮＯＥ／ＲＯＥの相対強度に従い、またはコンフォメーション依存性カップリング定数（例えばピラノース環内のヒドロキシメチル基）によって特定できるが、それらはアルゴリズムによってもまた最適化できる。二峰性の複数の旋回によって典型的に記載される結合の例はペプチドＣα−ＣO結合（すなわちΨ二面）であり、これは典型的にはαらせん状（Ψ≒−６０°）およびβひも状（Ψ≒１２０°）の幾何学的形状の間を跳躍する。以下に示す入力データファイルは、このようなモデル化の考慮が実際にはどのように実行できるかについての例を提供する。
このファイルのｖａｒｉａｂｌｅｓセクションにおいて、変数は、それぞれが回転性結合の二面角についての平均値またはガウス広がりのいずれかを定義する、ｖａｒコマンドを用いて定義される。ｖａｒコマンドに続くものは、変数の数を示す数（後に変数を同定するために用いる）である。次のオプションは変数の初期開始値を決定する。例えば「ｒａｎｄ ０ ３６０」は最初の立体配置が０°〜３６０°のランダムな値であることを示すが、「ｆｉｘ １８」は変数が１８°から始まることを示す。「ｊｕｍｐ」オプションは、最適化において各変数へランダムな変更を適用するために用いられる最初の値を特定する。大きな値（〜１８０）は、典型的には角の自由度（それらが効果的に空間を抽出することを確実にする）として用いられる変数のために用いられるが、より小さな値（〜１０）は、典型的には２５°までの最終値を有する動的広がりとして適用され得る変数のために用いられる（以下の実施例１、２および３を参照）。最後に「ｓｔａｒｔ」オプションは、最適化が開始される点を特定する。ここで、値０．０を用いることは最適化が直ちに開始されることを示すが、値０．５は、最適化の繰り返しの中間で最適化が開始されることを示す。
ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓセクションは二峰性および三峰性分布を定義するために用いられる。ｍｏｄｅの後、コマンドは確率数（それを参照するために用いられる）であり、二峰性分布に対する２、三峰性分布に対する３、または「対称的な」三峰性分布（ここで二つの確率は同等である。以下を参照。）に対する４のいずれかの数である。次の２または３の数は、そこにおいて異なるモードが選択される累積確率を表す。最後の数は、確率の繰り返し最適化を可能にする値である（値０．０は、最適化の間に確率モデルが変化すべきではないことを示す）。例えば上記の「ｍｏｄｅ １ ２ ０．５」は、二峰性モデルを示し、ここで各構造は０．５（０．５）の確率を有する。上記第二のｍｏｄｅ ２コマンドは三峰性分布を特定する（例えばメチル基に適用される）。両方は最適化されない設定である。最後のｍｏｄｅ ３ ４ ０．３３ ０．１コマンドは、１自由度のみによる三峰性分布、単一の確率ｐ1（すなわち対称三峰性モデル）を特定し；他の二つの確率は正確に同じ、すなわちｐ2＝ｐ3＝１／２（１−ｐ1）である。この場合ｐ1は、適切な繰り返し跳躍サイズである０．１のこのコマンドにおける最後のカラムにより特定される浮動確率（floating probability）を有する。
このファイルのｄｙｎａｍｉｃｓセクションにおいて、定義された変数と分子二面結合角との間の相関関係が特定される。ｇｙｒａｔｅで始まる行は、
１）分子構造内の正確な二面角
２）二面角の平均値に対して用いられる変数（ｖａｒｉａｂｌｅｓセクションから）および
３）二面角のガウス広がりに対して用いられる変数
を特定する三つの付随する数による、単峰性確率分布モデルを特定する。
１）分子構造内の正確な二面角
２）二面角の平均値に対して用いられる変数（ｖａｒｉａｂｌｅｓセクションから）および
３）二面角のガウス広がりに対して用いられる変数
を特定する三つの付随する数による、単峰性確率分布モデルを特定する。
例えば、上記のｇｙｒａｔｅの行の場合、４１ １ ３，４１は二面角を特定し（４１は内部座標の表において使用される特定の結合に対する値である。内部座標ファイルの例については、実施例１、２および３それぞれに付随する付表Ａ、ＢおよびＣを参照。）、１は平均値に対してｖａｒ １が使用されるべきであることを特定し、かつ３はガウス広がりに対してｖａｒ ３が使用されるべきであることを特定する。
ｍｕｌｔｉｇｙｒａｔｅで始まる行は、二峰性または三峰性角のモデルを特定する。ｍｕｌｔｉｇｙｒａｔｅ ４８ １ ４ ６ ５ ６の行において、例えば最初の数（４８）は内部座標表からの変化する分子二面角を特定し、二番目の数は使用される確率モデルであり（１、ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓセクションより）、続く数は各モードに対する平均およびガウス広がりの適切な組み合わせ（ｖａｒ４および６、ならびにｖａｒ５および６）である。確率モデル２、３および４は、それぞれ２、３および２組の変数を必要とする。
変数および確率モデルは幾つかのｇｙｒａｔｅまたはｍｕｌｔｉｇｙｒａｔｅコマンドにおいて繰り返し使用でき、動的モデルが特定され得る方法において著しいフレキシビリティーが可能になることに留意すべきである。例えば、これにより、ある回転性結合が連結すること（例えば重合体内での同一の環境）、または複数の結合が主要なコンフォメーション状態の間で一斉に動くこと（例えばシクロヘキサン環）が可能になる。上で説明された一般的な原理は、以下の実施例１、２および３で用いられる。
溶媒マスク（ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｓｋ）、ファンデルワールスマスク、および動的モデルの定義後、例えば実施例１０における、実験データに最も良い適合を与える未知の変数のそれぞれの値を見出すための最適化アルゴリズムの使用が可能となる。これは構造計算の繰り返されるラウンドの過程を用いることにより達成できる。図４は、全体的な集団生成および最適化過程の好ましい実施形態を代表するフローチャートを示す。
多数の最適化された動的構造を生成するため、構造計算のラウンドの間に、最適化過程は多数回（例えば約４０回）実行されてよい。個々の実行はそれぞれ、同数の繰り返される最適化工程（例えば、動的小分子内に典型的に見出される自由度の数に対し、約１０，０００）を有してよく、かつ、動的集団において同数の構造（例えば約１００）を用いてよい。最適化工程および動的集団内の構造の数は、構造計算の連続的なラウンドの間で一定に保たれてよく、異なるラウンドからの結果の直接比較が可能になる。または代わりに、最適化工程の数および／または動的集団内の構造数は、構造計算の１以上の連続的なラウンドの間で変動してよい。
好ましい実施形態では、実験データセットは構造計算の連続するラウンドに徐々に加えることができる。全てのデータセットファイルにおいて、最初の制限リスト内に様々な人的および実験的な誤差の源が存在し得ることから、これは実用的な限定を表し得る。これらの誤差の源は例えば、
１）構造制限の割り当ての誤り；
２）構造制限強度の決定におけるスケーリング係数の不正確な適用；
３）制限誤差の不正確な算出；および／または
４）スペクトルのアーティファクト
を含み得る。
１）構造制限の割り当ての誤り；
２）構造制限強度の決定におけるスケーリング係数の不正確な適用；
３）制限誤差の不正確な算出；および／または
４）スペクトルのアーティファクト
を含み得る。
これらの誤差を見出しかつ訂正するために、ＮＭＲによるタンパク質３Ｄ静的構造の決定に類似の様式において、構造計算の繰り返されるラウンドを行うことができる［１６］。全データセットのうち、わずかな誤りしかなく、非常に高い信頼性を持つサブセット（典型的には、構造制限２Ｄ−ＮＯＥＳＹおよびＴ−ＲＯＥＳＹデータセットの６０〜７０％）を最初に使用することにより、構造計算のラウンドの後に高いχ2 restraintスコア（例えばχ2 restraint＞＞１０）を有するわずかな構造制限が、異常値として容易に同定できる。これらの異常値は上記のように完全に再分析され、通常これにより不一致の源の決定およびその解決は成功する。これらが解決されたか否かを調べるため、修正された測定およびスケーリング係数による構造計算の別のラウンドが行なわれてよい。予測実験データと一致する実際の実験データ（構造制限）の適切なサブセットが一旦見出されると、実際の実験データセットからのさらなる構造制限を含めることができる。
この過程は、実際の実験データセット内の全ての構造制限が同時に満たされるまで繰り返されてよい。上記の構造制限リスト内でのフラッグフィールドの使用は、続く計算のラウンドにおいて個々の構造制限を迅速に含めるかまたは除くために用いることができる。一つの実際の実験データセットファイルを完了した後、別の実際の実験データセットが含められてさらなる計算のラウンドが行われ、新しいデータセットにおける誤った構造制限がこれまでのように徐々に訂正されるが、ここで新しいデータとの矛盾が見出された以前のデータセット内の誤った構造制限もまた訂正される。
前述の考察から、構造計算のラウンドにおいて、さらに、その構造と矛盾する誤った構造制限が同定できる前に、最適化された動的構造の大まかな収束を達成するため、十分な数の正確に測定された構造制限が、最初の実例において要求されることが認識されるであろう。動的構造は、さらなる構造制限または構造制限の実際の実験データセットの全体の包含が、最適化された動的構造における動的変数または確率に対する最終値に変化をもたらさないときには、十分に決定されている。
動的構造の解決においてもたらされた進歩は、少なくとも一つの実行について、好ましくはそれ以上、例えば構造計算の全てのラウンドについて、統計によりモニターされることが好ましい。最適化アルゴリズムの各実行は最適化された動的構造を生成し、これには各変数および確率に対する最も良い適合値、動的集団に対するχ2 total値、最適化に使用される各構造制限に対するχ2 restraint値、およびファンデルワールスの寄与に対するχ2値が付随する。計算のラウンドにおいて最も良い実行を用い（すなわち最も低いχ2 total値を有するもの）、これらの各パラメータについて平均値および標準偏差を算出する；例としての目的のみで、４０のうち最も良い１０の実行が使用され得る。各データセットファイルについてのχ2 dataset値に対する平均値および標準偏差が好ましくは算出される。これらのデータは以下の形であり得る第一の統計表において報告できる。
このような第一の統計表において、最も良いχ2 total値を有する実行からのデータが示される（この場合、実行はχ2 totalの項において順位付けられ、最も良い１０の実行が選択された）。ＴｏｔＣｈｉ行は、各実行についてのχ2 total値、およびこれらのχ2 total値に対するｍｅａｎ値および標準偏差（ＳｔＤｅｖ）を与える。この行の上に、個々のデータセットファイルそれぞれについての平均χ2 totalおよびその標準偏差が与えられる（この場合、この計算のラウンドにおいて使用された２Ｄ−ＮＯＥＳＹ，ＪＣＯＵＰ，ＯＲＤＥＲ、１５Ｎ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣが指定される）。平均χ2 totalおよび標準偏差値は、各実行におけるファンデルワールス（ＶＤＷ）項目に対してもまた与えられる。ＴｏｔＣｈｉ行に続くのは動的モデルファイルにおいて特定されるｖａｒｉａｂｌｅｓの結果、続いてｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓである。
本発明のさらなる好ましい実施形態では、いずれか１のデータセットファイルが新たに生じる動的構造へ過度にバイアスをかけているかどうかを決定するため、第二の統計表もまた作られてよい。この第二の統計表は、各データセットファイルにおける構造制限の数（Ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ）およびデータセットに対する総χ2 dataset値（Ｔｏｔ Ｃｈｉ）から、各データセットについてのχ2 dataset／制限（Ｃｈｉ／Ｒｅｓ）を報告する。
どの１データセットも新たに生じる動的構造へ過度にバイアスをかけていないとき、全てのχ2 dataset／制限値は〜１であり、互いに同程度である。上記の例において、実際にそのようになっていることが認められる。１５Ｎ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセットが構造に若干のバイアスをかけているようではあるが（χ2 dataset／制限＝１．６）。秩序パラメータ（ＯＲＤＥＲ）およびスカラーカップリング（ＪＣＯＵＰ）のような種類のデータについての誤差は実験的に決定できるが、ＮＯＥＳＹおよびＴ−ＲＯＥＳＹデータセットに対する誤差は、正確に知られていない値であるｍに依存する。経験によるｍに対する適切な値は、ほとんどの一般的な種類のＮＯＥＳＹおよびＴ−ＲＯＥＳＹ実験に与えられており（以下を参照）、これらは他のＮＯＥＳＹおよびＴ−ＲＯＥＳＹ実験に対する指針とすることができる。他の実験に対するｍの値をさらに正確に決定するため、〜１のχ2 dataset／制限値が達成されるまで異なるｍ値を試みることができ、これはバランシングと称されてよい。バランシングの過程が非常に主観的になることを避けるため、下に挙げるものと同等なｍ値が使用されなければならず（すなわち０．１〜０．８）、かつバランシングは、ベースのデータセットがバランシングされるデータセットであると決定されるまでは試みるべきではない。
バランシングと類似の過程において、τcについての最も適切な値が、それが実験的に正確に決定されていない場合に見出すことができる。τcについての最初の推定値が、行われるべき構造計算、および収束構造を大まかに生成するための最適化アルゴリズムにおいて用いられるべき十分な構造制限を可能にするために使用できる。この点において、τc値のみが異なる幾つかの構造計算のラウンドを行うことができ、最も低い平均χ2 total値を与えるτcの値がτcの最も良い値とされる（上記の通り）。
実際の実験データに最も良く適合する分子の最初の動的３Ｄ溶液構造を決定した後、本発明のさらなる好ましい実施形態において、最初の最も良い３Ｄ溶液構造は、全ての利用可能な実験データへの可能な最も良い適合を見出すために、構造計算のさらに広範なラウンドにより改良される。この構造改良のラウンドは、構造計算の以前のラウンドで用いられたものと同じ実際の実験データセットの幾つかまたは全てを使用してよいが、例えば集団サイズは増大してよく（例えば２５０構造へ）、繰り返し工程数は増加してよく（例えば１５０００へ）、および／またはさらなる実行が行なわれてよい（例えば１００）。それに加え、またはそれとは別に、動的モデルファイルは、分子の開始点が以前の構造計算のラウンドで決定された最も良いコンフォメーションにあるように（すなわちランダムなコンフォメーションにおいて始まる全ての変数は、以前に決定された最も良い値へ最初に固定される）、および／または動的パラメータ内で小さな跳躍サイズのみが許容されるように、変更できる。このことは、既知のχ2 total最小値が、実験変数および確率の可能な最も良い値が決定されるまで、局所的に探索されることを可能にする。この改良ラウンドの統計が、好ましくは全ての実際の実験データに最も良く適合する最初の集団または動的構造を提供する元の動的構造計算のラウンドにおいて以前に行われた統計と同じ様式において行なわれてよい。この改良ラウンドからの最も良い実行を用いて、平均の最適化された動的構造および平均の最適化された動的集団が算出されてよい（例えば、変数および確率についての平均値が、例えば１００のうち最も良い２０の実行から取られる）。
ここで図５を参照すると、本発明の実行を提供するために協同する複数の構成成分が図示されている。使用者のインターフェース構成成分１は、使用者とプログラムされたコンピュータとの間のインターフェイスを提供する。使用者のインターフェース構成成分１は、受け取ったデータを処理し、かつ処理されたデータを出力するように複数のモジュールと連絡する。例えば、構成成分２は本発明の実施形態により処理されるフレキシブルな分子を表す。フレキシブルな分子の構成成分２により表されるフレキシブルな分子は、使用者のインターフェース１により受け取られる。予測および実験計算構成成分３は、上記の様式において実験データ値を予測し、かつこれらの予測値をフレキシブルな分子の構成成分２に付随するデータを更新するために使用する。予測および実験計算構成成分３は、構造の集団から分子特性の平均を生成するために準備された、分子特性平均化構成成分４と連絡する。予測および実験計算構成成分３は、フレキシブルな分子の構成成分２により表されるフレキシブルな分子に影響する複数の繰り返しを行うため構成された、繰り返しスレッド５と連絡する。データ記憶構成成分６はシステムにより要求されるデータを記憶し、かつ複数のシステム構成成分と連絡する。動的コンフォメーション生成部構成成分７は、実験データの予測を実際の実験データに対して比較する。
フレキシブルな分子の構成成分２により表されるフレキシブルな分子は、デカルト座標を用いるよりも、結合、角およびねじれ角に関して定義される。フレキシブルな分子の表現は図６に示す複数のクラスを用いて達成される。分子クラス８は、フレキシブルな分子クラス９に対するスーパークラスとして作用する。フレキシブルな分子クラス９はトポロジークラス１０とのつながりを有し、これは原子クラス１１および結合クラス１２とのつながりを有する。原子クラス１１および結合クラス１２はそれぞれ、分子内に含まれる原子および結合を表す。
図５のデータ記憶構成成分６のさらなる詳細を図７に示す。データ記憶クラス１３は、データファイルを表すデータファイルクラス１４とのつながりを有する。データ記憶クラス１３は、実験データを記憶する実験データ記憶クラス１５、および興味ある分子の物理パラメータを記憶する物理パラメータクラス１６とのつながりを有する。分子特性記憶クラス１７はデータ記憶クラス１３ともまた接続し、分子特性を示すデータを記憶する。
実験データ記憶クラス１５は、使用者により選択された実験データを予測し、かつ予測された実験測定と実際の実験測定の間の一致についてのχ2測定を報告するために、データ記憶クラスと接続する。分子特性平均化構成成分４は、実験データの予測に使用できる動的自由度から動的分子集団を生成する間に統計を算出する。これは、実験データの各型を定義する多形クラス構造の複数の例として実行される。従って新しい型の実験データを容易に加えることができる。これを図５に示す。
図８への参照により、データ＿ファイルクラス１４は異なるタイプの実験データを表す複数のサブクラスを有することがみとめられる。さらに詳細には、緩和＿データクラス１８、ｒｄｃ＿データクラス１９、ｊｃｏｕｐ＿データクラス２０、ｈｅｔｎｏｅ＿データクラス２１、ｈｂｏｎｄ＿データクラス２２、二面角＿データクラス２３、およびｖｄｗ＿データクラス２４は全てデータ＿ファイルクラス１４のサブクラスである。データ＿ファイルクラス１４は、ファイルを同定する同定パラメータおよびデータのタイプを示す整数値であるデータタイプパラメータの二つのパラメータを公開する。多数の方法もまた、データ＿ファイルクラス１４により公開される。特に、データファイルからデータを読み取るために読み取りデータ法が準備され、クラスの内容をシリアル化するため、またはその内容を非シリアル化するためにシリアル化および非シリアル化法がそれぞれ準備され、一方、χ2計算を行うため、計算カイ二乗法が準備される。リターンデータタイプ法は、データ＿ファイルクラス１４により表されるデータファイルのデータタイプを変換し、一方、出力違反法はクラスに起こり得るいずれの違反も出力する。
緩和＿データクラス１８はｎｏｅ＿データクラス２５を有し、ｒｏｅ＿データクラス２６およびｔｒｏｅ＿データクラス２７は、緩和＿データクラス１８により表される緩和データのサブタイプを表すことがみとめられる。
図８への参照により記述されるクラス構造は、実験データの様々な異なるタイプを一般的な構造内で表すことを可能にする。複数の異なるタイプの実験データは、単一の動的モデルを生成するために共に使用できる。これについては上でさらに詳しく述べた。
図８への参照により記述されるクラス構造は、かなりのフレキシビリティーを提供し、かつ物理モデルに関連できるいずれの種類の動的データも上記の方法において使用されることを可能にする。例えば、ＮＭＲ緩和データ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）データ、分析超遠心（ＡＵＣ）データおよび小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）データは全て使用できる。
ＮＭＲデータが最適化に用いられる場合、研究される分子は典型的に炭素および水素原子を含み（しばしば有機分子と称される）、かつ１以上の回転可能な共有結合（すなわち固定された配置を持たない）を有する。純粋な（＞９５％の単一分子種）分子が研究されてよいが、測定される実験的に観察可能なものが十分に分離または解析できれば、関連分子の混合物（すなわち数個の原子が異なる変異体）または実質的に異なる分子（例えば不純物の存在において）もまた使用できる。分子は、ＮＭＲデータが記録できる場合、受容体分子（例えばタンパク質または核酸）の存在下でもまた分析できる。
標準的な実践に従い、ＮＭＲサンプルは、生物学的に興味ある分子に対し、興味ある分子を溶媒、典型的には水（Ｈ2Ｏ、Ｄ2Ｏおよびそれらの混合物）に溶解することにより準備してよいが、適切な場合には有機溶媒もまた用いることができる。サンプルは典型的には１〜１００ｍＭの溶質濃度、３００ｍＭまでの塩（たとえば塩化ナトリウム、リン酸緩衝液）と共におおよそ中性のｐＨにおいて調製されるが、これらの範囲の条件に限定されるものではない。サンプルは典型的には内部標準化合物（例えばＤＳＳ、ジメチル−２−シラペンタン−５−スルホネート）および無機抗菌剤（例えばアジ化ナトリウム）を含むが、これらのいずれの条件も必須ではない。興味ある分子のわずかに異なる条件による１以上のサンプル（例えば、１０％Ｄ2Ｏ／９０％Ｈ2Ｏ Ｖ／Ｖ、１００％Ｄ２Ｏ、アラインメント媒質（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｍｅｄｉａ）の存在）が、必要により調製されてよい。分子は同位体が濃縮（例えば15Ｎ、13Ｃ、19Ｆまたは31Ｐにより）または枯渇（例えば天然存在13Ｃの12Ｃ、15Ｎの14Ｎ、または1Ｈの2Ｈによる置換）されている必要はないが、追加的な実験を行うことはでき、最適化において用いられるデータは分子がよく濃縮または枯渇しているべきである。ＮＭＲサンプルは、現代のいずれのＮＭＲ分光計において利用可能な、標準的なパルス系列を用いるＮＭＲデータセットを記録するために用いられる。
ＮＭＲデータセットは、上記のように調製された分子サンプルにおいて記録され、1Ｈ、13Ｃおよび／または15Ｎ核（および存在するいずれのその他のＮＭＲ活性核）の帰属を可能にし（すなわちそれらのＮＭＲ化学シフトが決定される）、かつプロトン−プロトン等核スカラーカップリング定数が測定される。分子が溶液中にとどまっていれば、ＮＭＲスペクトルはいずれの温度においても記録できる。スペクトルは典型的には６００ＭＨｚのプロトン共鳴周波数において記録されるが、より高いまたは低い磁界強度もまた使用でき、適切なスペクトル分解が達成できると推測される。これらの帰属実験［１７、１８］は、典型的には
１）［1Ｈ］−１Ｄ
２）［1Ｈ、1Ｈ］−ＤＱＦ−ＣＯＳＹ
３）［1Ｈ、1Ｈ］−ＴＯＣＳＹ
４）［1Ｈ、13Ｃ］−ＨＳＱＣ
５）［1Ｈ、13Ｃ］−ＨＭＢＣ
６）［13Ｃ］−１Ｄスペクトル
７）［13Ｃ］−フィルター［1Ｈ］−１Ｄスペクトル
８）［1Ｈ、15Ｎ］−ＨＳＱＣ
９）［15Ｎ］−１Ｄスペクトル
１０）［15Ｎ］−フィルター［1Ｈ］−１Ｄスペクトル
を含む。
１）［1Ｈ］−１Ｄ
２）［1Ｈ、1Ｈ］−ＤＱＦ−ＣＯＳＹ
３）［1Ｈ、1Ｈ］−ＴＯＣＳＹ
４）［1Ｈ、13Ｃ］−ＨＳＱＣ
５）［1Ｈ、13Ｃ］−ＨＭＢＣ
６）［13Ｃ］−１Ｄスペクトル
７）［13Ｃ］−フィルター［1Ｈ］−１Ｄスペクトル
８）［1Ｈ、15Ｎ］−ＨＳＱＣ
９）［15Ｎ］−１Ｄスペクトル
１０）［15Ｎ］−フィルター［1Ｈ］−１Ｄスペクトル
を含む。
次にＮＭＲ実験データセットが記録され、これは分子の３Ｄ構造および動的情報を定量的に示すパラメータの測定を可能にする。これを達成するため典型的に行われる実験は、以下のものを含むが、これらに限定されない。
１）核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）および回転座標系ＮＯＥ（ＲＯＥ）。ＮＯＥおよびＲＯＥデータは、［1Ｈ、1Ｈ］−ＮＯＥＳＹ、［1Ｈ、15Ｎ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、［1Ｈ、13Ｃ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、［1Ｈ、1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹおよび［1Ｈ、15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ［１９、２０］のような実験を用いて典型的に測定される。水が溶媒である特定の場合において、通常溶媒シグナルは前飽和または専用のパルス系列、例えばＷＡＴＥＲＧＡＴＥフィルターを含むものを用いて抑制される［２１］。
２）コンフォメーション依存性スカラーカップリング。コンフォメーション依存性スカラーカップリング（例えば3ＪHH）は、［1Ｈ］−１Ｄスペクトル、定量的Ｅ−ＣＯＳＹ［２２］、ＨＮＨＡ［２３］およびＪ−変調15Ｎ−ＨＳＱＣ実験［２４］のような実験を用いて典型的に測定される。
３）残留双極子カップリング（ＲＤＣ）。これは［1Ｈ］−１Ｄスペクトル、ならびに［1Ｈ、13Ｃ］−ＨＳＱＣおよび［1Ｈ、15Ｎ］−ＨＳＱＣのような実験から典型的に測定され、取得の間の広帯域異核デカップリングは動作しない［１３］。分子が13Ｃおよび／または15Ｎにより同位体濃縮されている特定の場合において、タンパク質において行われるような標準的な実験もまた、ＲＤＣおよびコンフォメーション依存性スカラーカップリング（例えば3ＪHC）を測定するために使用できる。
４）以前に得られた［６］、パルス系列を用いて測定するＴ1−およびＴ2−緩和データならびに異核（例えば1Ｈ−13Ｃまたは1Ｈ−15Ｎ）ＮＯＥ［２５］。
５）化学シフト異方性、常磁性誘導シフト、水素結合（例えば交換率、プロトン−カルボニルスカラーカップリング、同位元素効果または交換プロトン温度係数の決定により同定される）および塩橋（例えばｐＨまたはＮａＣｌ滴定により同定される）。
１）核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）および回転座標系ＮＯＥ（ＲＯＥ）。ＮＯＥおよびＲＯＥデータは、［1Ｈ、1Ｈ］−ＮＯＥＳＹ、［1Ｈ、15Ｎ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、［1Ｈ、13Ｃ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、［1Ｈ、1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹおよび［1Ｈ、15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ［１９、２０］のような実験を用いて典型的に測定される。水が溶媒である特定の場合において、通常溶媒シグナルは前飽和または専用のパルス系列、例えばＷＡＴＥＲＧＡＴＥフィルターを含むものを用いて抑制される［２１］。
２）コンフォメーション依存性スカラーカップリング。コンフォメーション依存性スカラーカップリング（例えば3ＪHH）は、［1Ｈ］−１Ｄスペクトル、定量的Ｅ−ＣＯＳＹ［２２］、ＨＮＨＡ［２３］およびＪ−変調15Ｎ−ＨＳＱＣ実験［２４］のような実験を用いて典型的に測定される。
３）残留双極子カップリング（ＲＤＣ）。これは［1Ｈ］−１Ｄスペクトル、ならびに［1Ｈ、13Ｃ］−ＨＳＱＣおよび［1Ｈ、15Ｎ］−ＨＳＱＣのような実験から典型的に測定され、取得の間の広帯域異核デカップリングは動作しない［１３］。分子が13Ｃおよび／または15Ｎにより同位体濃縮されている特定の場合において、タンパク質において行われるような標準的な実験もまた、ＲＤＣおよびコンフォメーション依存性スカラーカップリング（例えば3ＪHC）を測定するために使用できる。
４）以前に得られた［６］、パルス系列を用いて測定するＴ1−およびＴ2−緩和データならびに異核（例えば1Ｈ−13Ｃまたは1Ｈ−15Ｎ）ＮＯＥ［２５］。
５）化学シフト異方性、常磁性誘導シフト、水素結合（例えば交換率、プロトン−カルボニルスカラーカップリング、同位元素効果または交換プロトン温度係数の決定により同定される）および塩橋（例えばｐＨまたはＮａＣｌ滴定により同定される）。
上で述べたように、実験データセットはいずれのＮＭＲ磁場強度、いずれの温度においても記録でき、ここで分子はなお可溶性であり、異なる組成のサンプル上にある。興味あるスペクトル特性の分離を可能にするため（例えばプロトン多重線構造）、全てのデータセットは取得次元（acquisition dimension）において十分な数のデータ点により記録されるべきである。ＮＯＥＳＹおよびＴ−ＲＯＥＳＹ［２６］スペクトルの場合において、プロトン多重線成分が間接的なプロトンの次元において分離されないように（何故ならこのことはスケーリング係数の決定を著しく複雑にするため（以下を参照））スペクトルは適切なパラメータにより好ましく記録される。スペクトルはまた、ピーク高さおよび化学シフト（ピーク−中心）測定における誤差を最少にするため、高いシグナル対ノイズ比によっても典型的に記録される。
ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹおよびＴ−ＲＯＥＳＹ ＮＭＲデータセットにおいて、構造および動的情報は各スペクトルのピーク強度（対角および交差ピークの両方）内でコード化され、従ってこれらのピーク強度は正確に決定されなければならない（しばしば最大ピーク高さを測定することによって達成される）。しかしながら、等核スカラーカップリングをもたない分子におけるプロトンは例外であるが（例えばアルデヒドプロトン）、プロトンからの各ピークは、プロトンに付随するスカラーカップリングの数および大きさ、ＮＭＲ磁場強度、およびプロトンとそれに対してスカラーカップリングするプロトンとの間の化学シフト差に従い、取得次元（acquisition dimension）内で共鳴多重線へと多重分裂する
［２７］。
［２７］。
アルゴリズムへの入力のため、１モル存在量のプロトンの真のピーク高さが必要とされることから（以下、図９、１０および１１への参照と共に記述する）、これらの分裂は、１モル存在量のプロトンの正確な等価ピーク高さ値の算出を可能にするために補正されなければならない。これはスケーリング係数ｆの使用により達成される。簡単に述べると、共鳴多重線内の各共鳴に対するスケーリング係数が決定されなければならず、このスケーリング係数は、共鳴多重線内の観察される共鳴の高さを１モル存在量のプロトンに対する値へ変換することを可能にする変換係数である。特定のプロトンの共鳴多重線に対するスケーリング係数のセットは、スケーリング係数セットｆi＝｛ｉ1，・・・，ｉn｝と称される。従って、観察されたＮＯＥの１モル存在量に相当する高さを決定するため、観察されたＮＯＥ（またはＲＯＥ）の取得次元（acquisition dimension）におけるプロトンのスケーリング係数セットを知ることが必要になる。スケーリング係数セットの決定、および１モル存在量の真のピーク高さの算出におけるそれらの使用についての詳細を以下に述べる。
プロトン共鳴多重線は、隣接するプロトン間のスカラーカップリングから生じる。一次のケースにおいて、各スカラーカップリングはプロトンの線形を分岐させ、従って、プロトンに対するｃのスカラーカップリングに対し、プロトンは２cの多重線成分を有するであろう。この一次のケースは、いわゆる弱いカップリング制限が満たされるときに起こり、これは式（１５）に示すように、二つの核ＩおよびＳの間における周波数差（ΔＮIS）がそれらの間のスカラーカップリング（ＪIS）よりもかなり大きなときである（作動定義は、周波数差がスカラーカップリングの１０倍であること）。
ΔＮIS＝｜ＮI−ＮS｜＞＞ＪIS （１５）
式中、ＮIは核Ｉの測定された共鳴周波数、ＮSは核Ｓの測定された共鳴周波数、（ΔＮIS）は核ＩおよびＳの間における周波数差、および（ＪIS）は核ＩおよびＳの間のスカラーカップリングを表す。
式中、ＮIは核Ｉの測定された共鳴周波数、ＮSは核Ｓの測定された共鳴周波数、（ΔＮIS）は核ＩおよびＳの間における周波数差、および（ＪIS）は核ＩおよびＳの間のスカラーカップリングを表す。
弱くカップリングしているプロトンの場合において、各等核カップリング定数の値が既知であるとき（上記）、プロトンスケーリング係数は明確かつ容易に算出できる（以下を参照）。しかしながら弱いカップリング制限が満たされないとき、核は強くカップリングしていると考えられ、一次では予想されない共鳴多重線の線形への変形が起こる。これらの変形はスケーリング係数の容易な計算を妨げるため（以下を参照）、弱く、および強くカップリングしたプロトンに対するスケーリング係数セットは異なる方法論により決定される。プロトンの等核カップリング定数は典型的には１５Ｈｚ未満であることから（ＪIS）、一旦プロトンの化学シフトが分子内のプロトンを帰属する標準的方法によって決定されると、プロトンが特定のプロトン共鳴周波数（Ｈｚ）においてスカラーカップリングしている他のプロトンと弱くカップリングしているか否かは、式（１）によって容易に確認できる（上記）。
プロトンがスカラーカップリングしている全てのプロトンに対して弱いカップリング制限を満たすとき、プロトンのスケーリング係数セットは以下の方法論により決定できる。最も単純な場合において、全ての多重線成分は互いに分離される。すなわちｃのスカラーカップリングを有するプロトンは、共鳴多重線における２Cの共鳴としてスペクトルにおいて独特に現れる２Cの多重線成分を有するであろう。この場合、理論的に全ての共鳴は互いに同じ高さを持つため、図９に示すように、この場合の各共鳴のスケーリング係数もまた２Cである。０、１、２または３の等核カップリング定数の存在により生成される各ピークに対するスケーリング係数セットを、図９に明確に示す。このようなスケーリング係数セットは単純スケーリング係数セットと称される。
弱いカップリング制限に従うプロトンのさらに複雑な場合において、多重線成分はある程度互いに重複し、このことはより少ない異なる共鳴（多重線成分数２Cよりも）がスペクトルにおいて観察されることを意味する。重複の程度および性質は、プロトンへのスカラーカップリングの数および大きさの両方、ならびにスペクトルにおける半分の高さでの固有プロトン共鳴線幅（λで表され、それ自体が温度、溶媒条件、および分子の相関時間に依存する）に依存する。λは特定のスペクトルの特性であることから、スケーリング係数セットは定量されるスペクトルそれぞれについて決定されなければならないことは明らかである。スペクトルにおける半分の高さでの固有プロトン共鳴線幅（λ）は、他の共鳴との重複から分離された幾つかの共鳴（例えば等核スカラーカップリングをもたないアルデヒドプロトン）から、半分の高さでの線幅の平均を取って測定される。多重線成分は、成分間の共鳴周波数差（Δν）がλの値よりも少ないか同等であるときに（すなわちΔν≦λ）重複し（すなわち別々に分離されない）、スペクトルにおいて個々の多重線成分に予想されるよりも高い単一共鳴として現れる。さらに、多重線成分が正確に重複（すなわちΔν＝０）しない限り、共鳴はスペクトル内の重複しない多重線成分よりも広幅である。
プロトンの多重線成分の重複の程度は、そのプロトンに対する等核スケーリングカップリングの値に依存する。全てのカップリング定数が同時に同じ値（Ｊ）を有し、かつその値が半分の高さでの固有プロトン共鳴線幅よりも大きいとき（すなわちＪ＞λ）、多重線成分は完全に重複し（すなわちΔν＝０）、かつ理想的なスケーリング係数セットを与える。１、２、３および４つの同一等核スケーリングカップリング定数が存在する事例について、プロトン線形の外観およびそれに付随するスケーリング係数セットを図１０に示す。
むしろより一般的な事例であるカップリング定数の全てが同じ値を持たない場合、多重線成分は完全には重複せず（すなわちΔν≠０）、かつ非理想的な線形が観察される。このような多重線成分は、上で定義されたように本発明の第四の態様による方法を用いて解析することができ、本発明のこの態様の応用を示すため、この特定の実施形態をここに詳述する。
これらの非理想的な線形は一般に、図９および１０に示す共鳴多重線パターンの一つに類似する外観を有する。この場合、非理想的なプロトンからのスケーリング係数セットは最初に、スペクトル内に観察されるものに最も類似する図９または１０の線形から取られる。多重線成分の不完全な重複により広幅化されるこの多重線内の各共鳴について、重複成分間の値Δνは既知の等核カップリング定数の値から明確に算出される。例えば、プロトンが第二のプロトンに対して３Ｈｚ（Δν＝３Ｈｚ）の単一のスカラーカップリングを有し、かつ、半分の高さでのスペクトルの固有線幅が６Ｈｚ（λ＝６Ｈｚ）であるとき、二つの多重線成分は互いに完全には重複せず、かつ、スペクトル内に、１モル存在量のプロトンに要求されるものよりは低いが、１モル存在量のプロトンの値の半分よりは高い、単一の広幅の共鳴が観察される。単一の共鳴が観察されることから、このプロトンの多重線パターンは図９に示される事例（スカラーカップリングを持たないプロトン）に最も類似し、スケーリング係数セットは最初にｆ＝｛１｝とされる。しかしながら、この単一の広幅の共鳴の高さは、二つの成分が完全に重複した場合に重複した共鳴に対して観察されたであろう高さを決定するために、適切な広幅化調節（ｂ）によりさらにスケーリングしなければならない。この広幅化調節は式（１６）により適切にモデル化されることを示すことができる（１つのスカラーカップリングＪの図解については図１１を参照）。
従って、半分の高さでの固有線幅が６Ｈｚ（λ＝６Ｈｚ）であり、スペクトル内の単一のスカラーカップリング定数が３Ｈｚ（Δν＝３Ｈｚ）である上記のプロトンの場合、最初のスケーリング係数セットがｆ＝｛１｝である広幅の共鳴は、広幅化調節ｂ＝６／（６−（３／２））＝１．３を通して変換され、ｆ＝｛１．３｝となる。スケーリング係数と組み合わせたこのセットは、この共鳴の実験的に測定された高さを、１モル存在量のプロトンについての同等な高さへ変換することを要求される正確なスケーリング係数である。共鳴多重線内の各広幅の共鳴は、非理想的な弱くカップリングしたプロトンに対する組み合わせたスケーリング係数のセットを決定するために、同様に処理されてよい。
第二の特に一般的な例として、６Ｈｚ（λ＝６Ｈｚ）の半分の高さでの固有線幅を有するスペクトル中の、８Ｈｚおよび１０Ｈｚの二つのスカラーカップリングを持つプロトンについて考慮する。このプロトンの線形は二つの同一なスケーリングカップリング定数を有するプロトンのそれに最も類似し（図１０）、ここで二つの中央多重線成分は重複し、二つの外側の共鳴よりも約２倍高い共鳴を作り出す。従って共鳴には最初のスケーリング係数セットｆ＝｛４，２，４｝が与えられる。多重線成分間の分離は明らかに８Ｈｚ（第一および第二成分、Δν1,2＝８Ｈｚ）、２Ｈｚ（第二および第三成分、Δν2,3＝２Ｈｚ）および８Ｈｚ（第三および第四成分、Δν3,4＝８Ｈｚ）である。Δν1,2およびΔν2,3の値がλよりも小さいことから、外側多重線成分（ｏｕｔｅｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）は他のいずれの多重線成分とも重複せず、従って広幅化調節は必要ではない。しかしながら二つの内側の多重線成分（Δν2,3＜λであることから、単一の広幅の共鳴を与えるように不完全に重複している）については、広幅化調節が適用される。最初の値、すなわち２×ｂ、ここでｂ＝５／（５−（２／２））＝１．２５（Δν2,3＝２、λ＝５であるため）、従って２×１．２５＝２．５により、多重線内の中央共鳴に対する組み合わせたスケーリング係数ｆが与えられる。従って、このプロトンの共鳴多重線に対するスケーリング係数セットは、ｆi＝｛４，２．５，４｝となる。弱いカップリングの規則が適用される限りにおいて、これらの式および規則を用いて、いずれの所定のスペクトル内で異なる数および大きさのスカラーカップリングを持つプロトンに対して、組み合わせたスケーリング係数セットを明確に算出することが可能である。ヒアルロナン六糖類の加工例において、様々な異なる例が与えられる（以下の加工例を参照）。ここに提示される、単純な事例を超えた多重線パターンを計算するためのさらに一般的な規則は公表されている［２７］。
広幅化調節式（１６）から、Δνの値がλに等しいときｂ＝２（すなわち二つの多重線成分が単に重複し、個々の多重線成分と同じ高さで、広幅のプラトーとしてスペクトル内に現れる共鳴を作り出す）であることが容易にみとめられる。二つの多重線成分が完全に重複するとき（すなわちΔν＝０）ｂ＝１であることもまたみとめられ、これはそれぞれの多重線成分のスケーリング係数の数値の和と同等であり、かつ、広幅化のない理想的なスケーリング係数セットの事例と同等である。
プロトンが他のプロトンと強くカップリングしているとき、すなわち式（１５）を満たさないとき、プロトンのスケーリング係数セットは以下の方法論により決定され得る。最初に、他のいずれのピークとも重複しないプロトンに由来するスペクトルピーク（すなわちこのプロトンに対応する取得次元（acquisition dimension）における化学シフト）を探索する（強いシグナル強度で）。従って、選択されたピークにおいて、多重線内の全ての共鳴は、スペクトル内の他のピークからの重複によって不明瞭になることなく明瞭に観察できる。そして、共鳴多重線内に他のいずれよりも特に広幅のものがあるか否かを決定するために、多重線内の共鳴の半分の高さでの線幅をスペクトルから直接測定する。実際に共鳴が全て互いにおおよそ同程度に広幅であるとき（最も広幅の共鳴が最も狭い共鳴の２倍に満たないことであると考えてよい）、プロトンのスケーリング係数セットは以下のように決定できる。各共鳴の高さはスペクトルから直接測定され（ｈi）、各共鳴のスケーリング係数（ｆi）は式（１７）を用いて決定される。
このようにして、スペクトル内で明確に分離されたピークが同定できれば、スケーリング係数セットは強くカップリングしたプロトンそれぞれについて決定できる。式（１７）は、多重線内の各共鳴が半分の高さでおおよそ同じ線幅を有し、かつ共鳴多重線内の全ての共鳴の高さが正確に測定できるときにのみ、合理的に正確な結果を与えることに留意しなければならない。共鳴が半分の高さでおおよそ同じ線幅を有さないとき、その体積が十分な正確さで測定されれば、各共鳴の体積（ｖi）が式（１７）における高さの代わりに用いられてよい。
分子の構造および動態についての情報を含む異なるＮＭＲデータセットを分析し、各スペクトル内のデータ点を、スペクトルに含まれるデータの種類に応じて特定の方法により変換する。これらの手順は、データを動的構造計算アルゴリズム（上記）による使用に適した形へ変換するために必要とされる。各構造制限値の測定に加え、動的モデルが実験データに対しどのようによく適合するかをアルゴリズムが計算できるように、測定の標準誤差もまた決定されなければならない。
ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹおよびＴ−ＲＯＥＳＹからの構造制限は、スペクトルからの対角および交差ピーク高さの両方の測定により得られる。プロトンの共鳴多重線内での共鳴に対するスケーリング係数セットを決定した後（上を参照）、各共鳴からの１モル存在量のプロトンについての真のピーク高さ（Ｈ）が以下のように算出できる。共鳴多重線内での各共鳴の共鳴高（ｈi）がスペクトルから直接測定され、これにスケーリング係数セットからの関連するスケーリング係数ｆiを掛け、真のピーク高さＨiの個々の測定が与えられる。式（１８）。
Ｈi＝ｈi×ｆi （１８）
共鳴多重線内の幾つかの共鳴高さを測定し、それぞれに、それに付随するスケーリング係数を掛けることにより、真のピーク高さ（Ｈ）についての幾つかの異なる値が算出される。従って、真のピーク高さとして使用する最も良い値は、これらの繰り返し測定からの平均値（＜Ｈ＞）である。式（１９）。
式（１９）を用い、ＮＯＥＳＹまたはＲＯＥＳＹにおける全てのピーク（対角および交差ピークの両方）の真のピーク高さが、アルゴリズムへの直接入力のために算出されてよい。それぞれの真のピーク高さは、一対のプロトンに関連し、該プロトンを示すＮＯＥまたはＲＯＥの帰属であり、それに対するＮＯＥまたはＲＯＥ値がアルゴリズムにより予測されるべきである。それぞれの真のピーク高さはまた、算出された標準誤差値が与えられる（以下を参照）。真のピーク高さ値および真のピーク高さ値についての標準誤差を伴う、ＮＯＥ／ＲＯＥ効果を受ける二つのプロトンの指定は、ＮＯＥまたはＲＯＥ構造制限と称される。重複したＮＯＥまたはＲＯＥ構造制限の場合（特にスペクトル内でピークを形成するプロトンが同一の化学シフトを有するときに起こる）、幾つかのプロトン対が共にスペクトル内のピークを生じさせるため、アルゴリズムはこのプロトン対の群の真のピーク高さに対する組み合わせた予想値を算出する。互いにスカラーカップリングするプロトンに対して帰属された等核２Ｄ−ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹまたはＴ−ＲＯＥＳＹスペクトルにおける交差ピークは、一般に正確な構造制限の生成には有用でないことに留意しなければならない。これは、ＮＯＥまたはＲＯＥ混合時間の間のスカラーカップリングの発生が、共鳴多重線線形および構造を自明ではないように大きく歪め、この様式での分析を困難にするからである。
ピークの、平均の真のピーク高さ（＜Ｈ＞）を決定した後、この測定における推定誤差（εexp）もまた算出されなければならない。算出された平均の真のピーク高さにおける誤差の源は、スペクトルのシグナル対ノイズ、位相のねじれおよびスペクトルのアーティファクトによる各共鳴の線形内の固有の非理想性、および適用されるスケーリング係数による、それぞれの測定された共鳴高さにおける誤差のスケーリングを含む。スペクトルのシグナル対ノイズは直接測定される。各共鳴の線形内の非理想性は、測定された共鳴の高さに直接比例するＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹおよびＴ−ＲＯＥＳＹスペクトルにわたる均一な系統的誤差を与えると考えることができる。比例定数はｍとされ、２Ｄ−ＮＯＥＳＹスペクトルの場合約０．４（すなわち測定された共鳴高さの〜４０％）、２ＤＴ−ＲＯＥＳＹスペクトルの場合０．５、15Ｎ−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトルの場合０．２、および15Ｎ−Ｔ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトルの場合０．４であると考えてよい。従って、標準的な統計手法によれば、これら二つの系統的誤差に由来する、スペクトルからの各共鳴高さｈの測定における誤差ε（ｈ）は式（２０）により与えられる。
真のピーク高さの決定には、測定された共鳴高さそれぞれに適切なスケーリング係数（ｆi）を掛ける。この結果は真のピーク高さ（Ｈ）の個々の測定それぞれにおける誤差ε（Ｈ）をもたらし、これは式（２１）により与えられる。
従って、幾つかの共鳴の共鳴多重線について、真のピーク高さ（Ｈi）の推定値それぞれは、ｆi√（ｍ2ｈi 2＋ｓ2）で表される、付随する推定標準誤差を有する。真のピーク高さの平均値（＜Ｈ＞）を算出するだけで、推定標準誤差（εexp）に使用できる適切な単一の値が式（２２）により与えられる（標準的な統計学的手順により）。
ＮＯＥＳＹまたはＴ−ＲＯＥＳＹでのピーク高さの決定において起こり得るさらなる複雑さは、異なるピークからの共鳴が、各ピークを形成するプロトンの化学シフトに依存して、より大きなまたはより小さな範囲で重複し得るということである。同等なモル比の二つの重複する共鳴（Δν）間のＨｚにおける差（例えば異なる二重線からの二つの共鳴の重複）が正確に決定され得る場合（各プロトンの既知の化学シフト、ならびにスケーリング係数セットおよびスカラーカップリングから算出した共鳴多重線内の各共鳴の周波数を用いて）、広幅化調節のための上記式が直接適用でき、アルゴリズムにおける使用のための定量化された重複ＮＯＥまたはＲＯＥ構造制限がもたらされる（すなわち真のピーク高さは２以上のＮＯＥ／ＲＯＥの和を表す）。重複が同等でないモル比の二つの成分によって生じる場合（例えば、０．５モルのプロトン存在量での二重線共鳴が、０．２５モルのプロトン存在量での外側三重線共鳴と重複する場合）、この非同等性に対応するために重複および広幅化調節が適切に重み付けられてよい。
関連する分子種の混合物（すなわち数個の原子が異なる変異体）がＮＭＲサンプル中に存在する場合、あるＮＯＥ／ＲＯＥは、モル存在量で存在するプロトン由来であるが（すなわち、化学構造に違いがない分子の部分）、別のＮＯＥ／ＲＯＥは、著しく少ないモル存在量で存在するプロトン由来である（すなわち、分子種の混合物の間で化学構造が変化している、分子の部分間でのＮＯＥ）。例えば、還元末端を有する糖の事例において、還元末端環は溶液中でαおよびβアノマーの混合物として、それぞれ１モル当たり０．４および０．６モルの典型的な相対的存在量（ｒ）で存在することが知られているが、分子の残りは同一である。従って、分子の残りの基の間でのＮＯＥは１モル存在量で存在するが、αまたはβ環におけるプロトン対するＮＯＥは低い強度を有する。従って、α還元末端環にあるプロトンに対する還元末端環にないプロトンからのＮＯＥの場合、強度はα型を１００％存在量とした場合の４０％となる。従って、真のピーク高さ（上記のように、共鳴多重線からの測定された共鳴高さから決定され、スケーリング係数によりスケーリングされる）には、１モルの値を決定するためさらに１／ｒの要素を掛けなければならない。それ故、この場合の真のピーク高さにおける推定標準誤差εexpは、ここで式（２３）により算出される。
１モル存在量にて挙動するプロトンの同様の欠乏は、用いたＮＭＲパルス系列に起因する分子内のプロトンの不均一な励起を通して起こる。これは水サンプル中での水共鳴に近いプロトンの場合において特に当てはまり、ここでＨ2Ｏからのシグナルを最小化するためにＷＡＴＥＲＧＡＴＥ励起プロファイルが用いられる。この問題を克服するために、均一な励起が達成される（例えば、水を減少させるための光前飽和による１Ｄスペクトル、または13Ｃフィルターによる１Ｄスペクトル）スペクトル内のプロトンからの共鳴高さは、不均一な励起を伴う（例えば、ＷＡＴＥＲＧＡＴＥによる１Ｄスペクトル）スペクトルからの共鳴に対して比較でき、かつ共鳴高さの比は、同じ励起プロファイル（例えば、ＷＡＴＥＲＧＡＴＥによる２Ｄ ＮＯＥＳＹ）を用いる全ての実験における１モル存在量に対する適切な再スケーリング係数を提供するために用いることができる。この方法で得られた真のピーク高さにおける誤差は、式（９）で表される、分子の混合によって起こる非モル存在量のプロトンを作り出す分子の混合物に対するものと同じ様式において決定される。明らかに、これらの励起プロファイルが誤差の別の源を導入することから、実験的に可能なプロトンシグナルの均一な励起が好ましい。
ＮＯＥＳＹおよびＲＯＥＳＹスペクトルそれぞれからの「ｎｏＮＯＥ」および「ｎｏＲＯＥ」構造制限の使用は、各データセットの分析に重要な部分であり得る。データセットのサイズの増大に加え、ｎｏＮＯＥおよびｎｏＲＯＥの重要性は、実験データになお一致するように分子中の原子が分子集団にわたって占めることのできる相対的３Ｄ空間において、それらが課す制限にある。ｎｏＮＯＥ（またはｎｏＲＯＥ）は、化学シフト座標（相関が可能であり得る）においてスペクトルのノイズを超えるシグナルが存在しないときに帰属される。このようなｎｏＮＯＥには、ゼロの真のピーク高さ、および取得次元（acquisition dimension）プロトンのスケーリング係数セットからの最小スケーリング係数を掛けた化学シフト座標において測定された強度の第三の値に設定された、それらの標準誤差を与えられてよい（すなわちεexp＝（ｆmin×ｈzero）／３であり、式中、ｆminは取得次元（acquisition dimension）プロトンのスケーリング係数セットからの最小スケーリング係数、およびｈzeroは化学シフト座標において測定された強度）。各スペクトル内に、できるだけ多くのｎｏＮＯＥ（およびｎｏＲＯＥ）が帰属される。
３Ｄ分子構造および動態を報告する別の種類のＮＭＲデータはコンフォメーション依存性スカラーカップリングである。これらは測定され、その標準誤差は上記のような標準的な実験から決定される。各スカラーカップリングは、アルゴリズムへの入力に関して適切なＫａｒｐｌｕｓ相関に関連し［２８］；適切なＫａｒｐｌｕｓ相関は公表された文献から引用されるか、または量子力学的アプローチを用いて明確に算出されてよい。幾つかの特定の場合において、測定されたカップリング定数は個々の分子の幾何学的形状または分子の幾何学的形状のセットに直接関連してよい。これらの場合、異なる結合回転異性体の状態およびその相対的割合は、アルゴリズムにより用いられる分子内部座標モデルにおいて明確に表現されてよい。この場合の例は、ｇｇおよびｇｔコンフォーマーの相対的割合を明確に算出するためにＨａｓｎｏｏｔ ｅｔ ａｌ．の相関が使用できる、ピラノース環のヒドロキシメチル基である［２９］。
３Ｄ分子構造および動態を報告するさらなる種類のＮＭＲデータは、残留双極子カップリング（ＲＤＣ）である。残留双極子カップリングは、分子が弱いアラインメント媒質（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｍｅｄｉａ）中にあるとき（例えばファージ、バイセル、ゲル）、スカラーカップリングにおいて観察される明らかな変化として測定される［１３］。最初に、分子内のカップリング定数（１、２および３結合）がアラインメント媒質（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｍｅｄｉａ）の非存在下で記録された適切なスペクトルから標準的な方法論を用いて測定される。これらの同じカップリングは、次にアラインメント媒質（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｍｅｄｉａ）の存在下で記録された同一のスペクトル内で測定され、この二つの測定の間のＨｚにおける相違が残留双極子カップリング（ＲＤＣ）である。このＲＤＣの決定に付随する誤差もまた、標準的な統計法を用いて算出されてよい（例えば、以下に述べる［1Ｈ，13Ｃ］−ＨＳＱＣスペクトルから測定されたＲＤＣの特定の事例のための方法）。
興味ある分子が同位体濃縮されていないときにＲＤＣを測定するために用いられる特定の実験は、取得の間に13Ｃ広帯域デカップリングのない13Ｃの天然存在において記録される［1Ｈ，13Ｃ］−ＨＳＱＣスペクトルである。この実験は1ＪCHカップリングの直接の測定を可能にするだけではなく、記録される取得次元（acquisition dimension）における十分なデータ点を可能にし、プロトンカップリングによる多重線成分が分離される。各1ＪCHカップリング（Ｊ）は次に、それぞれの高および低フィールド共鳴多重線における類似共鳴の間のＨｚによる分離として数（ｎ）回測定でき、各測定に付随する平均値（μJ）および標準偏差（σJ）を与える。次にデータセット内の全ての1ＪCHカップリングの二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を算出し、これが個々の1ＪCHカップリングそれぞれに付随する標準誤差（σJ）とされる。同様に、アラインメント媒質（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｍｅｄｉａ）存在下での、各1ＪCHカップリングの平均値（μR）および標準誤差（σR）を決定する。次に、残留双極子カップリング（Ｄ）が二つの平均値（μR−μJ）の間のＨｚにおける相違として算出されてよく、その標準誤差（σD）が標準誤差の二乗の和の平方根として与えられる（√（σD 2＋σJ 2））。
プロトン−プロトンＲＤＣのための化合物ＲＤＣ（ここで化合物ＲＤＣは、２以上のＲＤＣの和として定義される）もまた、このようなデカップリングされた［1Ｈ，13Ｃ］−ＨＳＱＣスペクトルから同時に測定できる。強いカップリングが存在しないとき、これらは、各プロトン多重線の最外側成分の間のＨｚによる分離は、その多重線を形成する全ての２および３結合のプロトンスカラーカップリングの和に等しいという事実を用いて測定できる。同様にアラインメント媒質（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｍｅｄｉａ）の存在下で、この分離はその多重線を形成するプロトン−プロトンＲＤＣに組み合わせた全ての２および３結合のプロトンスカラーカップリングの和に等しい。これら二つの値の減算、および上記のものに同様の統計分析を行うことにより、化合物ＲＤＣおよびその標準誤差を測定できる。
上記の１以上の過程を用いた後、定量化誤差を伴う構造制限は抽出され、興味ある分子の分子３Ｄ構造および動的運動を抽出するＮＭＲ実験から適切に変換される。分子の動的構造は、構造および動的データを含む単一のＮＭＲデータセットから決定できるが（例えば２Ｄ−ＮＯＥＳＹ）、異なる種類のデータを有する２以上の実際の実験データセットを用いるとき（例えばＲＤＣデータを伴うＮＯＥデータ）、質的に異なる方法における異なる種類の実験サンプルの分子運動により（すなわちここに記述される物理理論により、分子距離および幾何学的形状の様々な異なる平均を報告することにより）、著しく大きな正確さが達成され得る。２以上の実験データセットが、わずかに異なる方法により記録された（例えば２Ｄ−ＮＯＥＳＹおよび13Ｃ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセット、あるいは異なるＮＯＥ混合時間による複数の２Ｄ ＮＯＥＳＹデータセット）同じ型のデータを含む時、決定された構造の正確度が改善されるがこれは実質的ではない可能性がある。１を超える実験データセットが用いられるとき、上記のように、各データセットはアルゴリズムによる使用のための構造制限の別々のリストとして保持される。
上記の方法は動的分子の３Ｄ構造の決定を可能にする。このような構造は、実験的に観察可能なものを予測できる、試みられる分析的およびコンピュータモデル化演習の多重度を可能にするため有用である。この技術は、限定されないが下記の例：
１）炭水化物リガンドおよび炭水化物ミメティクス（例えばアミノグリコシド抗生物質）；
２）ペプチドおよび人工ペプチドミメティクス；
３）薬物分子の分子フレキシビリティー；
４）酵素／受容体活性部位またはタンパク質−タンパク質相互作用部位内のフレキシブルなタンパク質側鎖；
５）核酸分子内のフレキシブルな塩基（例えばＲＮＡアプタマー）；および
６）幾つかのコンフォメーション状態をもつタンパク質（例えばインテグリン）および本質的に折り畳まれていないタンパク質
のような、広範囲の分子に対して適用性をもつ。
１）炭水化物リガンドおよび炭水化物ミメティクス（例えばアミノグリコシド抗生物質）；
２）ペプチドおよび人工ペプチドミメティクス；
３）薬物分子の分子フレキシビリティー；
４）酵素／受容体活性部位またはタンパク質−タンパク質相互作用部位内のフレキシブルなタンパク質側鎖；
５）核酸分子内のフレキシブルな塩基（例えばＲＮＡアプタマー）；および
６）幾つかのコンフォメーション状態をもつタンパク質（例えばインテグリン）および本質的に折り畳まれていないタンパク質
のような、広範囲の分子に対して適用性をもつ。
フレキシブルな分子についての構造情報を必要とするいずれの研究および開発計画も、本発明の好ましい実施形態により生成された動的構造、特にリガンドタンパク質相互作用に関するものから劇的な利益を得るであろう。本発明により生成された動的構造のさらなる潜在的に重要な使用は、合理的薬物設計（ＲＤＤ）、すなわち特定の方法で標的タンパク質と相互作用する分子を設計するためのコンピュータの使用である。ＲＤＤは相互作用−エネルギー予測に頼ることから、薬物およびタンパク質両方の詳細かつ正確な物理データを必要とする。現在、わずかに〜１０％の予測された分子がその受容体にうまく結合するという事実にみられるように、予測は不十分である。これを改善するため、結合エネルギーに対するエンタルピーの寄与（分子の形により支配される分子間結合の形成）および結合エネルギーに対するエントロピーの寄与（結合における無秩序およびフレキシビリティーの変化）の両方に関わるデータが必要とされる。分子結合相互作用（エンタルピー）は十分に推定できるが、分子のフレキシビリティー（エントロピー）はそうではなく、このフレキシビリティーの情報なしでは、ＲＤＤはその予測能において基本的に限定される。我々の方法論により決定された薬物分子の好ましい構造（内部エンタルピー）および動的運動（エントロピー）の両方の使用はそれ故、ＲＤＤアプローチによるヒット同定およびリード最適化において著しい改善をもたらす［３０］。この方法論は、合理的薬物設計および化学的模倣による新薬発見の著しい助けとなり得る、医薬分子の動的構造の決定を可能にする。
さらに、本発明およびそれから生み出される動的３Ｄ構造は、その結合型由来の遊離溶液構造の偏差を算出するために使用でき、かつ正確な評価関数として使用できる（図１２を参照）。動的構造はそれ故、エンタルピーエネルギーの項のみを考慮する技術（例えば水素結合、疎水性など）または分子動態シミュレーションの使用に比較して、潜在的なリガンド−受容体相互作用を理解するための予知力において著しい進歩を提供する。特に、これは実験的に測定された結合定数および相互作用エネルギーに定量的に適合する評価関数により、さらに正確に行われるドッキングを可能にする［３２］。本発明から利益を享受するその他の分野は、
１）バイオミメティック分子の生成、例えばヘパリンミメティクスの設計；
２）受容体分子のアレイを用いる分子相互作用の分析、例えばシステム生物学およびプロテオミクスにおいて；
３）コンビナトリアルケミストリーにおける、可能性のある反応経路の予測による薬物ライブラリーの設計；および
４）分子機械の設計および構築（ナノテクノロジー）を含む。
１）バイオミメティック分子の生成、例えばヘパリンミメティクスの設計；
２）受容体分子のアレイを用いる分子相互作用の分析、例えばシステム生物学およびプロテオミクスにおいて；
３）コンビナトリアルケミストリーにおける、可能性のある反応経路の予測による薬物ライブラリーの設計；および
４）分子機械の設計および構築（ナノテクノロジー）を含む。
ここで本発明について、以下の限定されない実施例への参照によりさらに記述する。
ヒアルロナンヘキササッカライド
ヒアルロナン（ＨＡ）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）の二糖の繰り返しからなる炭水化物である（図１３参照）。多くの他の機能の中でも、ＨＡは、脊椎動物の細胞外基質に構造的統一性および組織性を与える。ＨＡの多糖形態は、二糖の数千の繰り返しを有し、生理学的プロセス（例えば、子宮頸部熟化、歯の発育）および疾患プロセス（例えば、子宮内膜癌、アテローム性動脈硬化症）の両方に関わる。ＨＡのオリゴ糖は、二糖の数個のみの繰り返しを有し、別の条件下で顕著な活性を有する（例えば樹状細胞の成熟誘導）。したがって、ＨＡは生物工学分野および化粧品分野で商業的に重要である。
ヒアルロナン（ＨＡ）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）の二糖の繰り返しからなる炭水化物である（図１３参照）。多くの他の機能の中でも、ＨＡは、脊椎動物の細胞外基質に構造的統一性および組織性を与える。ＨＡの多糖形態は、二糖の数千の繰り返しを有し、生理学的プロセス（例えば、子宮頸部熟化、歯の発育）および疾患プロセス（例えば、子宮内膜癌、アテローム性動脈硬化症）の両方に関わる。ＨＡのオリゴ糖は、二糖の数個のみの繰り返しを有し、別の条件下で顕著な活性を有する（例えば樹状細胞の成熟誘導）。したがって、ＨＡは生物工学分野および化粧品分野で商業的に重要である。
ヒアルロナンのオリゴ糖は、ポリマーより研究が容易である。なぜなら、これらは決まった長さの均一な標品として精製することができ、ポリマーと異なり極端な粘性溶液を形成しないためである［３３］。ＨＡのヘキササッカライド（ＨＡ6、図１４）は、ＨＡの二糖の繰り返しを３個だけ含み、ＨＡの長さは、ＮＭＲによる構造解析が可能なポリマーの局所的な構造的特徴を有するのに十分な長さであることが示されている［３４、３５］。本実施例で、本発明者らは、本特許に記載の方法を用いてＮＭＲの実験データからＨＡ6の動的３Ｄ溶液構造がどのように決定されたかを示す。
＜化学シフトの帰属および等核スカラーカップリング定数の測定＞
ＨＡ6中に「還元末端」（すなわちヘミアセタール基）が存在するため、ＨＡ6の末端環（環６）は実際には溶液中でα−およびβ−立体異性体の分離不可能な混合物として存在する（図１４）。これら２つの形態の化学シフトはほぼ同じである［３４］。本発明者らは以前に、ＨＡ6のα形態およびβ形態の両方の1Ｈ、15Ｎ、および13Ｃの化学シフトを全て帰属し、これら２つの形態のモル存在比がαが６０％、βが４０％であることを決定している［３５］。α−ＨＡ6が混合物中により多く存在し、β−ＨＡ6よりも相当良い解像度を示したので、この段階で、β−ＨＡ6ではなくα−ＨＡ6の動的３Ｄ構造を決定することにした。
ＨＡ6中に「還元末端」（すなわちヘミアセタール基）が存在するため、ＨＡ6の末端環（環６）は実際には溶液中でα−およびβ−立体異性体の分離不可能な混合物として存在する（図１４）。これら２つの形態の化学シフトはほぼ同じである［３４］。本発明者らは以前に、ＨＡ6のα形態およびβ形態の両方の1Ｈ、15Ｎ、および13Ｃの化学シフトを全て帰属し、これら２つの形態のモル存在比がαが６０％、βが４０％であることを決定している［３５］。α−ＨＡ6が混合物中により多く存在し、β−ＨＡ6よりも相当良い解像度を示したので、この段階で、β−ＨＡ6ではなくα−ＨＡ6の動的３Ｄ構造を決定することにした。
種々のＨＡオリゴ糖のＧｌｃＡ環およびＧｌｃＮＡｃ環中の2ＪHHおよび3ＪHHのカップリング定数を測定し、これらの残基タイプ中の各カップリング定数の合意値（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｖａｌｕｅ）を得た（図１５）［３５］。
＜スペクトルの線形の解析＞
α−ＨＡ6の構造的制約を求めるために、４個の異なるＮＯＥＳＹおよびＴ−ＲＯＥＳＹデータセットを用いた。それらは、２Ｄ−［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセット、２Ｄ−［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセット、３Ｄ［1Ｈ，15Ｎ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセット、および３Ｄ−［1Ｈ，15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセットであり、各データセットの取得パラメータの完全な詳細を以下に示す。これらのデータセットのそれぞれについてスケーリング係数（ｓｃａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）セットを以下のように決定した。ブロードニング調整式（ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ ｆｏｒｍｕｌａ）に必要なα−ＨＡ6内の全プロトンの2ＪHHおよび3ＪHHスカラーカップリングを図１５からとった。
α−ＨＡ6の構造的制約を求めるために、４個の異なるＮＯＥＳＹおよびＴ−ＲＯＥＳＹデータセットを用いた。それらは、２Ｄ−［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセット、２Ｄ−［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセット、３Ｄ［1Ｈ，15Ｎ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセット、および３Ｄ−［1Ｈ，15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセットであり、各データセットの取得パラメータの完全な詳細を以下に示す。これらのデータセットのそれぞれについてスケーリング係数（ｓｃａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）セットを以下のように決定した。ブロードニング調整式（ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ ｆｏｒｍｕｌａ）に必要なα−ＨＡ6内の全プロトンの2ＪHHおよび3ＪHHスカラーカップリングを図１５からとった。
２Ｄ−［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセットの記録は、取得次元中でプロトンの多重分裂を解像するのに十分なデータポイント数且つ間接次元でこれらのマルチプレットが解像されるのを防ぐのに十分な少ないデータポイント数で記録した（すなわち、前述のように、プロトンマルチプレットの解析を取得次元だけに単純化した）。このデータセットのλの値（Ｈｚで表した共鳴の線幅、上記参照）は、全て単純なダブレットを呈するアミドおよびＧｌｃＡのＨ１プロトンのＮＯＥＳＹ交差ピークの測定から求めた（したがって、各ダブレットの要素がλの真の測定値を与える）。各ダブレットの別々の共鳴から、４．８３、４．７５、５．２８、および５．２１Ｈｚの値が測定され、平均値は４．８Ｈｚであった。このλの値、スカラーカップリング定数（図１５）、およびブロードニング調整式を用いて、以下の通り、この２Ｄ−［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセットのα−ＨＡ6中の各プロトンについて、スケーリング係数セットを決定した：
＜ＧｌｃＡ環１、３、および５、Ｈ１プロトン＞
このプロトンは唯一つの3ＪHHカップリング定数７．８Ｈｚを有し、これはλより大きいため、この２Ｄ−ＮＯＥＳＹスペクトルの取得次元中で単純なダブレットとして（すなわち、図９のスカラーカップリング１個のように）現れる。したがって、ダブレットの各要素についてのスケーリング係数セットは２である。すなわちｆi＝｛２，２｝である。
このプロトンは唯一つの3ＪHHカップリング定数７．８Ｈｚを有し、これはλより大きいため、この２Ｄ−ＮＯＥＳＹスペクトルの取得次元中で単純なダブレットとして（すなわち、図９のスカラーカップリング１個のように）現れる。したがって、ダブレットの各要素についてのスケーリング係数セットは２である。すなわちｆi＝｛２，２｝である。
＜ＧｌｃＡ環１、３、および５、Ｈ２プロトン＞
このプロトンは２個の3ＪHHカップリング定数、９．５Ｈｚおよび７．８Ｈｚを有し、その結果、このプロトンは基本的なトリプレットで（すなわち、図１０のスカラーカップリング２個のように）現れる。すなわち、初期スケーリング係数セットはｆi＝｛４，２，４｝である。しかし、２個のカップリング定数が同じでないため、真ん中の２個のマルチプレット要素は完全には重ならず、「トリプレット」の中央のピークは広がっている。これら真ん中の要素間の距離Δνは（９．５〜７．８）＝約１．７Ｈｚであり、これはλよりかなり小さく、この要素のブロードニングは、ブロードニング調整式から（４．８／（４．８−１，７／２））＝１．２と決定される。このブロードニング調整に重複調整因子（すなわち２）をかけると、共鳴マルチプレット中の中央ピークの複合スケーリング係数（上記参照）２．４が得られる。したがって、このプロトンのトリプレットの各要素のスケーリング係数セットはｆi＝｛４，２．４，４｝である。
このプロトンは２個の3ＪHHカップリング定数、９．５Ｈｚおよび７．８Ｈｚを有し、その結果、このプロトンは基本的なトリプレットで（すなわち、図１０のスカラーカップリング２個のように）現れる。すなわち、初期スケーリング係数セットはｆi＝｛４，２，４｝である。しかし、２個のカップリング定数が同じでないため、真ん中の２個のマルチプレット要素は完全には重ならず、「トリプレット」の中央のピークは広がっている。これら真ん中の要素間の距離Δνは（９．５〜７．８）＝約１．７Ｈｚであり、これはλよりかなり小さく、この要素のブロードニングは、ブロードニング調整式から（４．８／（４．８−１，７／２））＝１．２と決定される。このブロードニング調整に重複調整因子（すなわち２）をかけると、共鳴マルチプレット中の中央ピークの複合スケーリング係数（上記参照）２．４が得られる。したがって、このプロトンのトリプレットの各要素のスケーリング係数セットはｆi＝｛４，２．４，４｝である。
＜ＧｌｃＡ環１、３、および５、Ｈ３プロトン＞
ＧｌｃＡのＨ２プロトン同様、このプロトンも、９．５Ｈｚおよび８．８Ｈｚという値の異なる２個の3ＪHHカップリング定数を有する。ＧｌｃＡ Ｈ２と同じプロセスの後、初期スケーリング係数パターンｆi＝｛４，２，４｝の基本的なトリプレットも、２個のカップリング定数の不一致により生じる中央のピークのブロードニングについて補正される必要があることが分かった。Ｈｚで表した結合間の差Δν（１．３Ｈｚ）より、ブロードニング調整因子は１．１となり、補正後のスケーリング係数セットはｆi＝｛４，２．２，４｝となる。
ＧｌｃＡのＨ２プロトン同様、このプロトンも、９．５Ｈｚおよび８．８Ｈｚという値の異なる２個の3ＪHHカップリング定数を有する。ＧｌｃＡ Ｈ２と同じプロセスの後、初期スケーリング係数パターンｆi＝｛４，２，４｝の基本的なトリプレットも、２個のカップリング定数の不一致により生じる中央のピークのブロードニングについて補正される必要があることが分かった。Ｈｚで表した結合間の差Δν（１．３Ｈｚ）より、ブロードニング調整因子は１．１となり、補正後のスケーリング係数セットはｆi＝｛４，２．２，４｝となる。
＜ＧｌｃＡ環１、３、および５、Ｈ４プロトン＞
このプロトンは２個の3ＪHHカップリング定数９，７および８．８Ｈｚを有する。ＧｌｃＡ Ｈ２およびＨ３プロトンと同じ推論から、スケーリング係数セットはｆi＝｛４，２．２，４｝となる。
このプロトンは２個の3ＪHHカップリング定数９，７および８．８Ｈｚを有する。ＧｌｃＡ Ｈ２およびＨ３プロトンと同じ推論から、スケーリング係数セットはｆi＝｛４，２．２，４｝となる。
＜ＧｃｌＡ環１、３、および５、Ｈ５プロトン＞
このプロトンは唯一つの3ＪHHカップリング定数７．８Ｈｚを有し、これはλより大きい。したがって、これは、スケーリング係数セットｆi＝｛２，２｝の単純なダブレットである（すなわち、図９のスカラーカップリング１個）。
このプロトンは唯一つの3ＪHHカップリング定数７．８Ｈｚを有し、これはλより大きい。したがって、これは、スケーリング係数セットｆi＝｛２，２｝の単純なダブレットである（すなわち、図９のスカラーカップリング１個）。
＜ＧｌｃＮＡｃ環２および４、Ｈ１プロトン＞
このプロトンは唯一つの3ＪHHカップリング定数８．５Ｈｚを有し、これはλより大きく（すなわち、図９のスカラーカップリング１個と同様）、スケーリング係数セットはｆi＝｛２，２｝である。
このプロトンは唯一つの3ＪHHカップリング定数８．５Ｈｚを有し、これはλより大きく（すなわち、図９のスカラーカップリング１個と同様）、スケーリング係数セットはｆi＝｛２，２｝である。
＜ＧｌｃＮＡｃ環２および４、Ｈ２プロトン＞
このプロトンは、Ｈ2Ｏ中で３個の3ＪHHカップリング定数１０．４Ｈｚ、９．７Ｈｚ、および８．５Ｈｚを有し、このプロトンは基本的なカルテットの形で（すなわち、図１０のスカラーカップリング３個のように）現れ、すなわち初期スケーリング係数セットはｆi＝｛８，２．７，２．７，８｝である。外側の２つのマルチプレット要素は明確に解像されて初期スケーリング係数８を維持しているが、カルテットの内側の対の要素は、３個のカップリング定数の不一致により幾分ブロード化している。この場合のブロードニング調整の解析は非常に複雑であるが、この重複を、重複するマルチプレット要素の２つの連続する対として処理すると、ブロードニング式により中央の共鳴が更に１．４倍にスケール調整（ｓｃａｌｉｎｇ)される。したがって、補正後のスケーリング係数セットはｆi＝｛８，３．８，３．８，８｝となる。
このプロトンは、Ｈ2Ｏ中で３個の3ＪHHカップリング定数１０．４Ｈｚ、９．７Ｈｚ、および８．５Ｈｚを有し、このプロトンは基本的なカルテットの形で（すなわち、図１０のスカラーカップリング３個のように）現れ、すなわち初期スケーリング係数セットはｆi＝｛８，２．７，２．７，８｝である。外側の２つのマルチプレット要素は明確に解像されて初期スケーリング係数８を維持しているが、カルテットの内側の対の要素は、３個のカップリング定数の不一致により幾分ブロード化している。この場合のブロードニング調整の解析は非常に複雑であるが、この重複を、重複するマルチプレット要素の２つの連続する対として処理すると、ブロードニング式により中央の共鳴が更に１．４倍にスケール調整（ｓｃａｌｉｎｇ)される。したがって、補正後のスケーリング係数セットはｆi＝｛８，３．８，３．８，８｝となる。
＜ＧｌｃＮＡｃ環２および４、Ｈ３プロトン＞
２個の3ＪHHカップリング定数１０．４Ｈｚおよび８．７Ｈｚを有し（したがって、図１０におけるスカラーカップリング２個のもののように現れる）、初期スケーリング係数セットはｆi＝｛４，２，４｝となる。前述のように中央の共鳴にブロードニング式を適用すると、補正後のスケーリング係数セットはｆi＝｛４，２．４，４｝となる。
２個の3ＪHHカップリング定数１０．４Ｈｚおよび８．７Ｈｚを有し（したがって、図１０におけるスカラーカップリング２個のもののように現れる）、初期スケーリング係数セットはｆi＝｛４，２，４｝となる。前述のように中央の共鳴にブロードニング式を適用すると、補正後のスケーリング係数セットはｆi＝｛４，２．４，４｝となる。
＜ＧｌｃＮＡｃ環２および４、Ｈ４プロトン＞
２個の3ＪHHカップリング定数９．９Ｈｚおよび８．７Ｈｚを有する。したがって、中央の共鳴のブロードニングを考慮した補正スケーリング係数はｆi＝｛４，２．４，４｝となる。
２個の3ＪHHカップリング定数９．９Ｈｚおよび８．７Ｈｚを有する。したがって、中央の共鳴のブロードニングを考慮した補正スケーリング係数はｆi＝｛４，２．４，４｝となる。
＜ＧｌｃＮＡｃ環２および４、Ｈ５プロトン＞
４個の異なる3ＪHHカップリング定数を有するため複数の重複を生じ、共鳴は、４つの共鳴を有する広いプラトーとして現れる（図９におけるスカラーカップリング２個に最も近い）。このプロトンのスケーリング係数は、重複するマルチプレットの要素を考慮して（図１１参照）、ｆi＝｛２．８，２．８，２．８，２．８｝と計算された。
４個の異なる3ＪHHカップリング定数を有するため複数の重複を生じ、共鳴は、４つの共鳴を有する広いプラトーとして現れる（図９におけるスカラーカップリング２個に最も近い）。このプロトンのスケーリング係数は、重複するマルチプレットの要素を考慮して（図１１参照）、ｆi＝｛２．８，２．８，２．８，２．８｝と計算された。
＜ＧｌｃＮＡｃ環２および４、Ｈ６ｐｒｏＳプロトン＞
１個の2ＪHHおよび１個の3ＪHHカップリング定数を有し、その値は−１２．３Ｈｚおよび２．３Ｈｚであり、したがって、ブロード化した共鳴のダブレットとして現れ（すなわち、図９の１つのスカラーカップリング１個に見た目が最も近い）、初期スケーリング係数セットはｆi＝｛２，２｝となる。各共鳴のブロードニングは、この小さな２．３Ｈｚの結合により生じるので、各スケーリング係数のブロードニング調整は１．３となる。したがって、このプロトンの補正スケーリング係数セットはｆi＝｛２．６，２．６｝である。
１個の2ＪHHおよび１個の3ＪHHカップリング定数を有し、その値は−１２．３Ｈｚおよび２．３Ｈｚであり、したがって、ブロード化した共鳴のダブレットとして現れ（すなわち、図９の１つのスカラーカップリング１個に見た目が最も近い）、初期スケーリング係数セットはｆi＝｛２，２｝となる。各共鳴のブロードニングは、この小さな２．３Ｈｚの結合により生じるので、各スケーリング係数のブロードニング調整は１．３となる。したがって、このプロトンの補正スケーリング係数セットはｆi＝｛２．６，２．６｝である。
＜ＧｌｃＮＡｃ環２および４、Ｈ６ｐｒｏＲプロトン＞
１個の2ＪHHおよび１個の3ＪHHカップリング定数を有し、その値は−１２．３Ｈｚおよび５．４Ｈｚであり、これらとλの間の周波数差のために、４つの明確に解像された共鳴を呈する（すなわち、図９のスカラーカップリング２個に最も近い）。したがって、このプロトンのスケーリング係数セットはｆi＝｛４，４，４，４｝である。
１個の2ＪHHおよび１個の3ＪHHカップリング定数を有し、その値は−１２．３Ｈｚおよび５．４Ｈｚであり、これらとλの間の周波数差のために、４つの明確に解像された共鳴を呈する（すなわち、図９のスカラーカップリング２個に最も近い）。したがって、このプロトンのスケーリング係数セットはｆi＝｛４，４，４，４｝である。
＜ＧｌｃＮＡｃ環２および４、ＨＮプロトン＞
このプロトンは唯一つの3ＪHHカップリング定数９．７Ｈｚを有し、これはλより大きい。したがって、これは単純なダブレットであり（すなわち、図９のスカラーカップリング１個に最も近い）、スケーリング係数セットはｆi＝｛２，２｝である。
このプロトンは唯一つの3ＪHHカップリング定数９．７Ｈｚを有し、これはλより大きい。したがって、これは単純なダブレットであり（すなわち、図９のスカラーカップリング１個に最も近い）、スケーリング係数セットはｆi＝｛２，２｝である。
ＧｌｃＮＡｃ環６の場合、ＧｌｃＮＡｃ環２＆４とはプロトンＨ１およびＨ２の間のカップリング定数が異なるため（図１５参照）、Ｈ１およびＨ２プロトンのスケーリング係数セットはＧｌｃＮＡｃ環４および６とはわずかに異なる。更に、αアノマーが６０％のモル存在比でしかないことを補償するために、全てのスケーリング係数に、モル存在比１／ｒ（ｒ＝０．６）（スケール調整比１．７）をかける。
＜ＧｌｃＮＡｃ環６、Ｈ１プロトン＞
このプロトンは唯一つの3ＪHHカップリング定数３．５Ｈｚを有し、これはλより小さい。したがって、これは、スペクトル中でブロード化したシングレットとして現れ（すなわち、図９のスカラーカップリング１個に最も近い）、ブロードニング調整は１．６である。したがって、そのスケーリング係数セットはｆi＝｛１．６｝であり、モル存在比でのスケール調整後は、ｆi＝｛２．７｝である。
このプロトンは唯一つの3ＪHHカップリング定数３．５Ｈｚを有し、これはλより小さい。したがって、これは、スペクトル中でブロード化したシングレットとして現れ（すなわち、図９のスカラーカップリング１個に最も近い）、ブロードニング調整は１．６である。したがって、そのスケーリング係数セットはｆi＝｛１．６｝であり、モル存在比でのスケール調整後は、ｆi＝｛２．７｝である。
＜ＧｌｃＮＡｃ環６、Ｈ２プロトン＞
このプロトンは、Ｈ2Ｏ中で３個の3ＪHHカップリング定数、１０．４、９．７、および３．５Ｈｚを有し、その結果、このプロトンは、複数のブロードニングを有する基本的なトリプレットの形をとり（すなわち、図１０のスカラーカップリング２個に最も近い）、初期スケーリング係数セットは、ｆi＝｛４，２，４｝となる。外側の二つの共鳴は、３．５Ｈｚの結合によりブロード化しており、ブロードニング調整はどちらの場合も１．６である。内側の共鳴は３．５Ｈｚの結合で基本的にブロード化しており、ブロードニング調整は１．６であるが、２つの大きな結合間の差０．７Ｈｚも寄与して１．１の更なるブロードニング調整を有し、正味１．７となる。したがって中央の共鳴のスケーリング係数は３．４である。したがって、スケーリング係数セットはｆi＝｛６．２，３．４，６．２｝であり、モル存在比でのスケール調整後は、ｆi＝｛１０．５，５．８，１０．５｝である。
このプロトンは、Ｈ2Ｏ中で３個の3ＪHHカップリング定数、１０．４、９．７、および３．５Ｈｚを有し、その結果、このプロトンは、複数のブロードニングを有する基本的なトリプレットの形をとり（すなわち、図１０のスカラーカップリング２個に最も近い）、初期スケーリング係数セットは、ｆi＝｛４，２，４｝となる。外側の二つの共鳴は、３．５Ｈｚの結合によりブロード化しており、ブロードニング調整はどちらの場合も１．６である。内側の共鳴は３．５Ｈｚの結合で基本的にブロード化しており、ブロードニング調整は１．６であるが、２つの大きな結合間の差０．７Ｈｚも寄与して１．１の更なるブロードニング調整を有し、正味１．７となる。したがって中央の共鳴のスケーリング係数は３．４である。したがって、スケーリング係数セットはｆi＝｛６．２，３．４，６．２｝であり、モル存在比でのスケール調整後は、ｆi＝｛１０．５，５．８，１０．５｝である。
＜ＧｌｃＮＡｃ環６、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６ｐｒｏＳ、Ｈ６ｐｒｏＲプロトン＞
これらのプロトンは、ＧｌｃＮＡｃ環２＆４と同じカップリング定数を有するため、これらはＧｌｃＮＡｃ環２＆４と同じスケーリング係数セットを有するが、各スケーリング係数セット中の各スケーリング係数には、モル存在比スケール調整比の１．７がかけられる。
これらのプロトンは、ＧｌｃＮＡｃ環２＆４と同じカップリング定数を有するため、これらはＧｌｃＮＡｃ環２＆４と同じスケーリング係数セットを有するが、各スケーリング係数セット中の各スケーリング係数には、モル存在比スケール調整比の１．７がかけられる。
要約すると、２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセット中のプロトン共鳴マルチプレットのスケーリング係数セットは以下の通りである。
２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセットは、取得次元中でプロトンのマルチプレット分裂を解像するのに十分なデータポイント数且つ間接次元中でこれらのマルチプレットが解像されるのを防ぐのに十分な少ないデータポイント数で記録された。このデータセットのスペクトルの線幅（λ）を、前述の２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセットのスペクトルの線幅を決定したのと同様な方法で、６．５Ｈｚと決定した。前述と同様なプロセスから、この２Ｄ−Ｔ−ＲＯＥＳＹスペクトルのスケーリング係数セットは以下のように算出された：
このスペクトルのスケーリング係数セットと前述の２Ｄ−ＮＯＥＳＹのスケーリング係数セットの第１の顕著な差は、アミドプロトンがスケーリング係数を有しないことであり、これは、スペクトルを１００％Ｄ2Ｏ α−ＨＡ6サンプルで記録したために、アミドプロトンが完全に溶媒の重プロトンで置換されてＮＭＲ不活性となっているからである。第２の顕著な差は、環２および４上のＧｌｃＮＡｃ Ｈ２プロトンは、3ＪHHスカラーカップリングを２個しか有さず（アミドプロトンが置換されている）、初期スケーリング係数セットが、Ｈ2Ｏサンプルで見られるカルテットではなく、トリプレット（すなわち、図１０のスカラーカップリング２個に最も近い）となる。
３Ｄ［1Ｈ，15Ｎ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセットは、取得次元中でプロトンマルチプレット分裂を解像するのに十分なデータポイント数且つ間接次元中でこれらのマルチプレットが解像されるのを防ぐのに十分少ないデータポイント数で記録された。このスペクトルはα−ＨＡ6中のアミドプロトン以外のプロトンに由来するピークを含まないため、このデータセット中でスケーリング係数セットはアミドプロトンについてのみ決定すればよい。各アミドプロトンは、環のＨ２プロトンと９．５Ｈｚのスカラーカップリングで結合されており（図１５参照）、このデータセットのλの値は６Ｈｚであり、各ＮＯＥは、スペクトル中で単純なダブレットの共鳴として現れる。すなわち初期スケーリング係数セットはｆi＝｛２，２｝である。環６の中のアミドプロトンの場合、初期スケーリング係数セット中の各スケーリング係数には、モル存在比スケール（＝１．７）をかけなければならない。すなわち、環６のスケーリング係数セットはｆi＝｛３．３，３．３｝である。環２および４のスケーリング係数セットはモル存在比で調整しないので、ｆi＝｛２，２｝のままである。
３Ｄ［1Ｈ、15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣのデータセットも、３Ｄ［1Ｈ，15Ｎ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣと非常によく似たパラメータで取得したので、同じスケーリング係数セットを有する。
＜ＮＭＲスペクトルの測定および定量＞
α−ＨＡ6の動的溶液構造の決定に、７個の異なるＮＭＲ実験データセット中の５個の異なる種類のＮＭＲデータを用いた。これらの制約を、１３個の未知の変数の最適値を見つけるための最適化アルゴリズムで用いた（上記参照）。使用した５種類のＮＭＲデータは：
１）ＮＯＥＳＹ緩和データ：２個の実験データセット。１）［1Ｈ、15Ｎ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、２）［1Ｈ，1Ｈ］−２Ｄ−ＮＯＥＳＹ
２）Ｔ−ＲＯＥＳＹ緩和データ：２個の実験データセット。１）［1Ｈ，15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、２）［1Ｈ，1Ｈ］−２Ｄ−ＮＯＥＳＹ
３）コンフォメーション依存性スカラーカップリング：１個の実験データセット
４）残留双極子カップリング（ＲＤＣ）：１個の実験データセット
５）秩序変数（［1Ｈ，15Ｎ］−異種核ＮＯＥおよびＴ1−測定より算出）：１個の実験データセット
である。
α−ＨＡ6の動的溶液構造の決定に、７個の異なるＮＭＲ実験データセット中の５個の異なる種類のＮＭＲデータを用いた。これらの制約を、１３個の未知の変数の最適値を見つけるための最適化アルゴリズムで用いた（上記参照）。使用した５種類のＮＭＲデータは：
１）ＮＯＥＳＹ緩和データ：２個の実験データセット。１）［1Ｈ、15Ｎ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、２）［1Ｈ，1Ｈ］−２Ｄ−ＮＯＥＳＹ
２）Ｔ−ＲＯＥＳＹ緩和データ：２個の実験データセット。１）［1Ｈ，15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、２）［1Ｈ，1Ｈ］−２Ｄ−ＮＯＥＳＹ
３）コンフォメーション依存性スカラーカップリング：１個の実験データセット
４）残留双極子カップリング（ＲＤＣ）：１個の実験データセット
５）秩序変数（［1Ｈ，15Ｎ］−異種核ＮＯＥおよびＴ1−測定より算出）：１個の実験データセット
である。
これらの異なるＮＭＲデータセットのそれぞれに適切な取得パラメータおよびそれから測定される構造的制約の数は以下の通りであった（全てのデータは２９８Ｋで得られた）。
５ｍＭ ＨＡ6（９５％ Ｈ2Ｏ、ｐＨ６．０、０．３ｍＭ ＤＳＳ）のサンプルについて、９００ＭＨｚの２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹスペクトルを、ＮＯＥ混合時間を４００ｍｓ、両次元中の掃引幅を１０８００Ｈｚにして記録した。前述のスケーリング係数セットを用いて、各ＮＯＥピークの真のピーク高さを求めたところ、８２個のＮＯＥ構造的制約が得られた。各ＮＯＥ制約の誤差は、２Ｄ−ＮＯＥＳＹスペクトルのｍの初期値に０．４を用いた。このスペクトルから、前述の方法に従って、９４個のｎｏＮＯＥ構造的制約も測定された。これらのＮＯＥおよびｎｏＮＯＥの構造的制約は付表Ａに示すデータセットファイル中に含めた。
１２ｍＭ 15Ｎ標識ＨＡ6（９５％Ｈ2Ｏ）のサンプルについて、６００ＭＨｚでの３Ｄ［1Ｈ，15Ｎ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトル（ＮＯＥ混合時間は４００ｍｓ；掃引幅は、両方のプロトン次元については７２００Ｈｚ、15Ｎ次元については１４０Ｈｚ；15Ｎオフセットは１２２．５ｐｐｍ）を、以前に報告されている［８、３６］ように記録した。前述のスケーリング係数セットを用いて、各ＮＯＥの交差ピークおよび対角ピークについて、１モル存在比の真のピーク高さを求めた。３Ｄ［1Ｈ，15Ｎ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトルのｍ値は０．４に設定し、真のピーク高さについての誤差が前述のように算出されるようにした。このスペクトルから１９個のＮＯＥ制約が測定された。それを付表Ａ中のデータセットファイルに示す。
２０ｍＭ ＨＡ6（１００％ Ｄ2Ｏ、ｐＨ６．０、０．３ｍＭ ＤＳＳ）のサンプルについて、６００ＭＨｚでの２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹスペクトルを、ＮＯＥ混合時間を４００ｍｓ、掃引幅を両方の次元で７２００Ｈｚにして記録した。前述のスケーリング係数セットを用いて、このスペクトルから６２個のＲＯＥ構造的制約が測定された。各ＲＯＥ制約の誤差を、２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹスペクトルのｍの初期値に０．５を用いて前述のように決定した。このスペクトルから６３個のｎｏＮＯＥ構造的制約も測定された。これらのＲＯＥおよびｎｏＲＯＥの構造的制約は付表Ａ中に示したデータセットファイル中に含めた。
１２ｍＭ 15Ｎ標識ＨＡ6（９５％Ｈ2Ｏ）のサンプルについて、６００ＭＨｚでの３Ｄ［1Ｈ，15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトル（ＲＯＥ混合時間は４００ｍｓ；掃引幅は、両方のプロトン次元には７２００Ｈｚ、15Ｎ次元には１４０Ｈｚ；15Ｎオフセットは１２２．５ｐｐｍ）を記録した。前述の式を用いて、３Ｄ［1Ｈ，15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトルのｍの初期値を０．２として、各ＲＯＥ制約の誤差を求めた。このスペクトルから、付表Ａに示すデータセットファイルに記載されているように、１８個のＲＯＥ構造的制約が測定された。
α−ＨＡ6中のアセトアミド側鎖基のコンフォメーション依存性スカラーカップリング定数（3Ｊ2，ＨＮ）は以前に測定されている（図１５参照）［３５］。上述したように、環６のカップリング定数は、環２および４のカップリング定数とわずかに異なる値であることが観察されている。これらのカップリング定数を分子中の二面角と関連付ける最良のＫａｒｐｌｕｓ式が、前述のように［３７］量子力学的計算により得られる。結合測定（約０．３Ｈｚ）およびこれらのＫａｒｐｌｕｓの関係の予測精度（約０．３Ｈｚ）を合わせた誤差は約０．５Ｈｚである。３個のスカラーカップリング定数は付表Ａ中に示すデータセットファイル中に含めた。
α−ＨＡ6の残留双極子カップリングデータは以前に報告されていないので、前述の高解像度１Ｄ ＮＭＲスペクトルおよび天然存在比［1Ｈ，13Ｃ］−ＨＳＱＣ／［1Ｈ，15Ｎ］−ＨＳＱＣスペクトルを用いた方法で本実験のために新たに測定した。５０％Ｄ2Ｏ中のＨＡ6の２０ｍＭサンプルについて、単結合性Ｃ−Ｈおよび重複するＨ−Ｈのカップリング定数を測定するために、［1Ｈ，13Ｃ］−ＨＳＱＣスペクトル（取得中に13Ｃのブロードバンドデカップリングなし）を、（本発明者らが以前に記載しているように［３５］）配向媒体の非存在下にて天然存在比で記録した。二回目の［1Ｈ，13Ｃ］−ＨＳＱＣスペクトルは、配向媒体を含むサンプル（アラインメントファージが３ｍｇ／ｍｌで存在する、５０％Ｄ2Ｏ中のＨＡ6の５ｍＭサンプル）について、同じ取得パラメータを用いて天然存在比で記録した。「1Ｈ，13Ｃ］−ＨＳＱＣスペクトルから３１個の非重複ＲＤＣ（付表Ａのリストの１〜３１）および２７個の重複ＲＤＣ（付表Ａのリストの１０１〜１２７）が測定された。同じサンプルの天然存在比で記録した［1Ｈ，15Ｎ］−ＨＳＱＣスペクトルから、更に３個の非重複ＲＤＣ（付表Ａのリストの１３１〜１３２）が得られた。高解像度１Ｄ ＮＭＲスペクトルから、更に３個の非重複ＲＤＣが測定された（付表Ａのリストの１２８〜１３０）。前述の方法を用いて、各ＲＤＣ構造的制約の標準誤差は０．３５Ｈｚに決定された。これらのＲＤＣ（合計６５個）は付表Ａに示すデータセットファイルに含めた。
α−ＨＡ6中の３個のアセトアミドＮ−Ｈ基の秩序変数およびその誤差は以前に測定されている［２２］。３個の秩序変数は付表Ａに示すデータセットファイルに含めた。
＜分子の詳細＞
前述の実験データセットは２つの異なる溶媒、すなわちＨ2ＯおよびＤ2Ｏで取得した。これらのそれぞれに対する溶媒マスク（上記参照）を以下の通り決定した：
１）Ｈ2Ｏ溶媒マスク：α−ＨＡ6中の全ヒドロキシルプロトンは非常に急速に溶媒プロトンで置換されるため、これらのプロトンは全てＮＭＲ不活性と定義した（ｅｘｃ* ＨＯ*）。アミドプロトンは観察するのに十分にゆっくり置換されるのでＮＭＲ活性である［３４］。その他のプロトンは全て活性と定義した（ａｄｄ* Ｈ*）。
２）Ｄ2Ｏ溶媒マスク：α−ＨＡ6中の全ヒドロキシルプロトン（ｅｘｃ* ＨＯ*）およびアミドプロトン（ｅｘｃ *Ｈ２Ｎ）は溶媒重水素で完全に置換されるので、これらのプロトンは全てＮＭＲ不活性と定義した。その他のプロトンは全て活性と定義した（ａｄｄ* Ｈ*）
前述の実験データセットは２つの異なる溶媒、すなわちＨ2ＯおよびＤ2Ｏで取得した。これらのそれぞれに対する溶媒マスク（上記参照）を以下の通り決定した：
１）Ｈ2Ｏ溶媒マスク：α−ＨＡ6中の全ヒドロキシルプロトンは非常に急速に溶媒プロトンで置換されるため、これらのプロトンは全てＮＭＲ不活性と定義した（ｅｘｃ* ＨＯ*）。アミドプロトンは観察するのに十分にゆっくり置換されるのでＮＭＲ活性である［３４］。その他のプロトンは全て活性と定義した（ａｄｄ* Ｈ*）。
２）Ｄ2Ｏ溶媒マスク：α−ＨＡ6中の全ヒドロキシルプロトン（ｅｘｃ* ＨＯ*）およびアミドプロトン（ｅｘｃ *Ｈ２Ｎ）は溶媒重水素で完全に置換されるので、これらのプロトンは全てＮＭＲ不活性と定義した。その他のプロトンは全て活性と定義した（ａｄｄ* Ｈ*）
これら２つの溶媒マスクを指定するために用いた実際のファイルは以下の通りであった。
α−ＨＡ6内の種々の原子の、分子構造の残りの部分に対する位置は、利用可能な実験データからは特定できなかった（すなわち、各カルボキシレート基中の２個の酸素原子および全ヒドロキシルプロトン）。これらの原子は、視覚的現実性のために分子中に保持したが、これらの（任意に定義された）分子内座標が反対のファンデルワールス相互作用により構造計算に影響を与えてはいけない。したがって、これらの原子は以下のファンデルワールスマスクによりファンデルワールス不活性に設定した。
＜実験データインプット＞
構造計算の全てのラウンドでτcの値は、以前に記載したように実験的に決定された［２２］０．４ｍｓとした。前述の種々の実験データセットを、異なるＨ2Ｏ／Ｄ2Ｏ溶媒混合物を含むＮＭＲサンプル（上記参照）について記録した。したがって、各データセットについて、調整した溶媒粘度を、式（２２）および（２３）を用いて算出した。構造計算に使用した７個の実験データセットファイルを付表Ａに示す。
構造計算の全てのラウンドでτcの値は、以前に記載したように実験的に決定された［２２］０．４ｍｓとした。前述の種々の実験データセットを、異なるＨ2Ｏ／Ｄ2Ｏ溶媒混合物を含むＮＭＲサンプル（上記参照）について記録した。したがって、各データセットについて、調整した溶媒粘度を、式（２２）および（２３）を用いて算出した。構造計算に使用した７個の実験データセットファイルを付表Ａに示す。
＜動的モデル＞
前述の方法を用いて、α−ＨＡ6内の関連するコンフォメーションのフレキシブルな結合および化学的性質（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を以下のように特定した（図１６参照）：
１）６個の炭水化物環のそれぞれは種々のコンフォメーション、例えばいす型、ふね型、ねじれふね型のコンフォメーションで存在し得る。
２）３個のβ１→β３グリコシド結合、すなわち、環１＆２、３＆４、および５＆６の間の結合。結合酸素原子のいずれかの側の各化学結合は、未定義の二面角を有し、それぞれファイ（φ）およびプシー（φ）とする。
３）２個のβ１→４グリコシド結合、すなわち、環２＆３および３＆４の間の結合。結合酸素原子のいずれかの側の各化学結合は、未定義の二面角を有し、それぞれファイ（φ）およびプシー（φ）とする。
４）ＧｌｃＮＡｃ環（環２、４、および６）に関して、３個のアセトアミド側鎖基が、Ｎ（窒素）−Ｃ２（環）結合の回りで回転可能である。
５）３個のアセトアミド側鎖基（環２、４、および６）が、アミドＮ（窒素）−Ｃ（カルボニル）結合でシスまたはトランスコンフォメーションで存在し得る。
６）アセトアミド側鎖基（環２、４、および６）上の３個のメチル基が、そのアセトアミド側鎖に関して、Ｃ（メチル）−Ｃ（カルボニル）結合の回りで回転可能である。
７）ＧｌｃＮＡｃ環（環２、４、および６）に関して、３個のヒドロキシメチル側鎖基がＣ６（ヒドロキシメチル）−Ｃ５（環）結合の回りで回転可能である。
８）ＧｌｃＡ環（環１、３、および５）に関して、３個のカルボキシレート基がＣ（カルボキシレート）−Ｃ５（環）結合の回りで回転可能である
９）ＧｌｃＮＡｃ環およびＧｌｃＡ環の全てのヒドロキシル基が、それぞれのＯ（酸素）−Ｃ（炭素）結合の回りで回転可能である。
前述の方法を用いて、α−ＨＡ6内の関連するコンフォメーションのフレキシブルな結合および化学的性質（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を以下のように特定した（図１６参照）：
１）６個の炭水化物環のそれぞれは種々のコンフォメーション、例えばいす型、ふね型、ねじれふね型のコンフォメーションで存在し得る。
２）３個のβ１→β３グリコシド結合、すなわち、環１＆２、３＆４、および５＆６の間の結合。結合酸素原子のいずれかの側の各化学結合は、未定義の二面角を有し、それぞれファイ（φ）およびプシー（φ）とする。
３）２個のβ１→４グリコシド結合、すなわち、環２＆３および３＆４の間の結合。結合酸素原子のいずれかの側の各化学結合は、未定義の二面角を有し、それぞれファイ（φ）およびプシー（φ）とする。
４）ＧｌｃＮＡｃ環（環２、４、および６）に関して、３個のアセトアミド側鎖基が、Ｎ（窒素）−Ｃ２（環）結合の回りで回転可能である。
５）３個のアセトアミド側鎖基（環２、４、および６）が、アミドＮ（窒素）−Ｃ（カルボニル）結合でシスまたはトランスコンフォメーションで存在し得る。
６）アセトアミド側鎖基（環２、４、および６）上の３個のメチル基が、そのアセトアミド側鎖に関して、Ｃ（メチル）−Ｃ（カルボニル）結合の回りで回転可能である。
７）ＧｌｃＮＡｃ環（環２、４、および６）に関して、３個のヒドロキシメチル側鎖基がＣ６（ヒドロキシメチル）−Ｃ５（環）結合の回りで回転可能である。
８）ＧｌｃＡ環（環１、３、および５）に関して、３個のカルボキシレート基がＣ（カルボキシレート）−Ｃ５（環）結合の回りで回転可能である
９）ＧｌｃＮＡｃ環およびＧｌｃＡ環の全てのヒドロキシル基が、それぞれのＯ（酸素）−Ｃ（炭素）結合の回りで回転可能である。
観察される実験データと比較するための分子の現実的な動的モデルを作製するために、自由度を以下のようにモデリングした：
１）ＧｌｃＡおよびＧｌｃＮＡｃ環中の大きな3ＪHHの値は、環が水溶液中で4Ｃ1いす型コンフォメーションをとっており、他の形態と容易に相互変換されないことが示している［３６］。したがって、各炭水化物環を強固な4Ｃ1いす型コンフォメーションでモデリングした。
２）化学シフトおよびＮＯＥパターンの解析から、環１＆２および３＆４の間の２個のβ１→３グリコシド結合が水溶液中で（未決定ではあるが）実質的に同一のコンフォメーションをとり、複数の相互変換する安定なコンフォメーションが存在する実験的証拠はないことが示されている［８、３４、３６］。したがって、これら２個のβ１→３結合は、同じ変数で表され、角度ファイ（ψ）およびプシー（φ）のそれぞれは１つの単峰性のコン
フォメーション確率分布（すなわち、１＆２および３＆４の間の結合について、２つの平均値、μψおよびμφ）をしており、これら２つの二面角は直接動的に結合しているため
、局所的振動（ｌｏｃａｌ ｌｉｂｒａｔｉｏｎ）の標準偏差角（σ）は同じになる。化学シフト、ＮＯＥパターン、および分子の動的シミュレーションの解析から、環５＆６の間のβ１→３グリコシド結合（「アルファ」結合）は、溶液中で他の２個のβ１→３結合とは異なるコンフォメーションをとりやすいことが示されている［８、３４、３６］。そこで、この結合を、他のβ１→３結合と同様に（すなわち、同じ局所的振動の標準偏差角σを有する２つの平均値μψおよびμφ）、しかし他の２つのβ１→３結合とは独立した
変数をもたせ、モデリングした。
３）化学シフトおよびＮＯＥパターンの解析から、２個のβ１→４グリコシド結合が、水溶液中で（未決定ではあるが）実質的に同一のコンフォメーションをとり、複数の相互変換する安定なコンフォメーションが存在する実験的証拠はないことが示されている［８、３４、３６］。したがって、２個のβ１→４結合は、同じ変数で表され、すなわち、角度ファイ（ψ）およびプシー（φ）のそれぞれは１つの単峰性のコンフォメーション確率分
布をし（すなわち、２＆３および４＆５の間の結合について、μψおよびμφ）、同じ局
所的振動の標準偏差角（σ）を有する。
４）環２および４中の全アセトアミド側鎖は、環に関してほぼトランスコンフォメーション（すなわち、ＨＮ−Ｎ−Ｃ２−Ｈ２の二面角＝１８０°）であることが示されているが、環６中のアミド基は正確には分からないが少し他の２つとは異なることが示されている［８、３４、３６］。帰属スペクトルまたはＮＯＥ制約のいずれからも、いずれのアミド基にも複数のコンフォメーションが存在する実験的証拠はない［８、３５］。したがって、アセトアミド側鎖は全て単峰性のコンフォメーション確率分布でモデリングした。環２および４中のアセトアミド側鎖は溶液中で区別できないため、それらの両方に同じ変数を用い（残基２＆４中のμHN、σHN）、一方、環６中のアセトアミド側鎖は独立した変数でモデリングした（残基６のμHN、σHN）。
５）３個のアセトアミド側鎖基中のアミド結合は、その他の力がない場合のこの化学基の形状はトランスコンフォメーションであると予想され、トランスコンフォメーションは単糖ＧｌｃＮＡｃに見られる状態でもあるため［３８］、トランスコンフォメーションになるように設定した。
６）メチル基はＣ−Ｃ結合の回りを自由に回転し、半エクリプス状態よりもわずかに優位な３つのねじれ形の回転異性体配置を有する。この動きは、二面角に３つの値を与え（３つのねじれ形回転異性体配置に対応して３つの値０°、１２０°、および２４０°）、各コンフォメーションである確率を同じにした三峰性のコンフォメーションモデルによりモデリングした。更に、局所的振動は、各コンフォメーションについて３０°の固定値とした。
７）３個のヒドロキシルメチル側鎖基は、化学シフトならびに3Ｊ5,6proSおよび3Ｊ5,6proRカップリング定数の比較により、水溶液中で互いに区別できないコンフォメーションをとることが示されている［３５］。Ｈａｓｎｏｏｔ ｅｔ ａｌ．［１５］の関係によれば、これら２つの結合で観察される値（図１５参照）は、各ヒドロキシメチル基が２つのコンフォーマー（ｇｇおよびｇｔと呼ばれる）間で５０：５０％の比率で急速に相互変換することを示している。したがって、この動きは二峰性のコンフォメーションモデルでモデリングし、各コンフォメーションである確率が等しいｇｇおよびｇｔに対する２つの適切な値を二面角に与え、各コンフォメーションの局所的振動は固定値１５とした（すなわち、この値をより正確に決定するのに十分な実験データがないため、別の系の本発明者らの実験に基づく適切な値）。
８）カルボキシレート基のコンフォメーションを制約する利用可能な実験データはなかったので（酸素原子はＮＭＲ不活性）、各基の２個の酸素原子の位置は分子の残りの部分に対して決定することはできなかった。したがって、全てのカルボキシレート基に同じ任意の値を与え、この任意の値の選択が悪いと起こり得るそれらの立体的衝突が構造計算に影響を与えるのを防ぐために、これらは如何なるファンデルワールス反発にも寄与しないように設定した（上記参照）。幸運にも、カルボキシレート基の回転はα−ＨＡ6の全体的形状または動的動きに影響を与えない。更に、全ての実験はｐＨ６，０で行ったので、カルボキシレート基は非プロトン化状態でモデリングした［３６］。
９）同様に、ヒドロキシル基の水素原子のいずれかのコンフォメーションを制約するための利用可能な実験データはなかった（これらは溶媒の水と非常に急速に置換される）ので、各ヒドロキシル基中の水素原子の位置は分子の残りの部分に関して決定することができなかった。したがって、ヒドロキシルプロトンには任意の値を与え、この任意の値の選択が悪いと起こり得る立体的衝突が構造計算に影響を与えるのを防ぐためにファンデルワールス不活性にする。
１）ＧｌｃＡおよびＧｌｃＮＡｃ環中の大きな3ＪHHの値は、環が水溶液中で4Ｃ1いす型コンフォメーションをとっており、他の形態と容易に相互変換されないことが示している［３６］。したがって、各炭水化物環を強固な4Ｃ1いす型コンフォメーションでモデリングした。
２）化学シフトおよびＮＯＥパターンの解析から、環１＆２および３＆４の間の２個のβ１→３グリコシド結合が水溶液中で（未決定ではあるが）実質的に同一のコンフォメーションをとり、複数の相互変換する安定なコンフォメーションが存在する実験的証拠はないことが示されている［８、３４、３６］。したがって、これら２個のβ１→３結合は、同じ変数で表され、角度ファイ（ψ）およびプシー（φ）のそれぞれは１つの単峰性のコン
フォメーション確率分布（すなわち、１＆２および３＆４の間の結合について、２つの平均値、μψおよびμφ）をしており、これら２つの二面角は直接動的に結合しているため
、局所的振動（ｌｏｃａｌ ｌｉｂｒａｔｉｏｎ）の標準偏差角（σ）は同じになる。化学シフト、ＮＯＥパターン、および分子の動的シミュレーションの解析から、環５＆６の間のβ１→３グリコシド結合（「アルファ」結合）は、溶液中で他の２個のβ１→３結合とは異なるコンフォメーションをとりやすいことが示されている［８、３４、３６］。そこで、この結合を、他のβ１→３結合と同様に（すなわち、同じ局所的振動の標準偏差角σを有する２つの平均値μψおよびμφ）、しかし他の２つのβ１→３結合とは独立した
変数をもたせ、モデリングした。
３）化学シフトおよびＮＯＥパターンの解析から、２個のβ１→４グリコシド結合が、水溶液中で（未決定ではあるが）実質的に同一のコンフォメーションをとり、複数の相互変換する安定なコンフォメーションが存在する実験的証拠はないことが示されている［８、３４、３６］。したがって、２個のβ１→４結合は、同じ変数で表され、すなわち、角度ファイ（ψ）およびプシー（φ）のそれぞれは１つの単峰性のコンフォメーション確率分
布をし（すなわち、２＆３および４＆５の間の結合について、μψおよびμφ）、同じ局
所的振動の標準偏差角（σ）を有する。
４）環２および４中の全アセトアミド側鎖は、環に関してほぼトランスコンフォメーション（すなわち、ＨＮ−Ｎ−Ｃ２−Ｈ２の二面角＝１８０°）であることが示されているが、環６中のアミド基は正確には分からないが少し他の２つとは異なることが示されている［８、３４、３６］。帰属スペクトルまたはＮＯＥ制約のいずれからも、いずれのアミド基にも複数のコンフォメーションが存在する実験的証拠はない［８、３５］。したがって、アセトアミド側鎖は全て単峰性のコンフォメーション確率分布でモデリングした。環２および４中のアセトアミド側鎖は溶液中で区別できないため、それらの両方に同じ変数を用い（残基２＆４中のμHN、σHN）、一方、環６中のアセトアミド側鎖は独立した変数でモデリングした（残基６のμHN、σHN）。
５）３個のアセトアミド側鎖基中のアミド結合は、その他の力がない場合のこの化学基の形状はトランスコンフォメーションであると予想され、トランスコンフォメーションは単糖ＧｌｃＮＡｃに見られる状態でもあるため［３８］、トランスコンフォメーションになるように設定した。
６）メチル基はＣ−Ｃ結合の回りを自由に回転し、半エクリプス状態よりもわずかに優位な３つのねじれ形の回転異性体配置を有する。この動きは、二面角に３つの値を与え（３つのねじれ形回転異性体配置に対応して３つの値０°、１２０°、および２４０°）、各コンフォメーションである確率を同じにした三峰性のコンフォメーションモデルによりモデリングした。更に、局所的振動は、各コンフォメーションについて３０°の固定値とした。
７）３個のヒドロキシルメチル側鎖基は、化学シフトならびに3Ｊ5,6proSおよび3Ｊ5,6proRカップリング定数の比較により、水溶液中で互いに区別できないコンフォメーションをとることが示されている［３５］。Ｈａｓｎｏｏｔ ｅｔ ａｌ．［１５］の関係によれば、これら２つの結合で観察される値（図１５参照）は、各ヒドロキシメチル基が２つのコンフォーマー（ｇｇおよびｇｔと呼ばれる）間で５０：５０％の比率で急速に相互変換することを示している。したがって、この動きは二峰性のコンフォメーションモデルでモデリングし、各コンフォメーションである確率が等しいｇｇおよびｇｔに対する２つの適切な値を二面角に与え、各コンフォメーションの局所的振動は固定値１５とした（すなわち、この値をより正確に決定するのに十分な実験データがないため、別の系の本発明者らの実験に基づく適切な値）。
８）カルボキシレート基のコンフォメーションを制約する利用可能な実験データはなかったので（酸素原子はＮＭＲ不活性）、各基の２個の酸素原子の位置は分子の残りの部分に対して決定することはできなかった。したがって、全てのカルボキシレート基に同じ任意の値を与え、この任意の値の選択が悪いと起こり得るそれらの立体的衝突が構造計算に影響を与えるのを防ぐために、これらは如何なるファンデルワールス反発にも寄与しないように設定した（上記参照）。幸運にも、カルボキシレート基の回転はα−ＨＡ6の全体的形状または動的動きに影響を与えない。更に、全ての実験はｐＨ６，０で行ったので、カルボキシレート基は非プロトン化状態でモデリングした［３６］。
９）同様に、ヒドロキシル基の水素原子のいずれかのコンフォメーションを制約するための利用可能な実験データはなかった（これらは溶媒の水と非常に急速に置換される）ので、各ヒドロキシル基中の水素原子の位置は分子の残りの部分に関して決定することができなかった。したがって、ヒドロキシルプロトンには任意の値を与え、この任意の値の選択が悪いと起こり得る立体的衝突が構造計算に影響を与えるのを防ぐためにファンデルワールス不活性にする。
これらの考察の具体的な実施は以下の動的モデルファイルを用いて達成された。
このファイルのｖａｒｉａｂｌｅｓセクションでは、２０個の変数（ｖａｒ １〜ｖａｒ ２０）を定義し、これらの変数を、図１７に示すα−ＨＡ6中の各回転結合に用いた。２個の変数（ｖａｒ ４およびｖａｒ ５）を、環５および６の間のβ１→３結合の二面角ψおよびφの平均値に割り当て（ｒｅｍａｒｋ ｂ１−３ ｌｉｎｋａｇｅｓ ｒｉ
ｎｇ ５−６ ｍｅａｎ）、１個の変数（ｖａｒ６）をそれらの共通するガウス広がり（ｒｅｍａｒｋ ｂ１−３ ｌｉｎｋａｇｅ ｒｉｎｇｓ ５−６ Ｇａｕｓｓｉａｎ ｓｐｒｅａｄ）に割り当てた。これらψおよびφ平均二面角の両方に、繰り返し最適化の開
始時（ｓｔａｒｔ ０．０）に０〜３６０°のランダム値（ｒａｎｄ ０ ３６０）を与え、ガウス広がりには、最適化の開始時に特定の（且つ合理的な）値２０°（ｆｉｘ ２０）を帰属し、これは最適化の各ステップで、最適化の開始（ｓｔａｒｔ ０．０）から最大１０°のランダムな幅で変えられる（ｊｕｍｐ １０．０）。他の２個のβ１→３結合も同様に指定し（ｖａｒ １、ｖａｒ ２、およびｖａｒ ３）、これらには同じ変数が当てられるため、互いに動的およびコンフォメーション的に同じであるとしてモデリングされる。２個のβ１→４結合中のψ結合およびφ結合の単峰性分布も同様に変数７〜９
で指定される。アセトアミド側鎖Ｃ２−Ｎ２結合の単峰性分布も同様に変数９および１０（環２および４中の側鎖）ならびに１１および１２（環６中の側鎖）で指定される。ヒドロキシメチル基は全て同じ二峰性の角度分布を有する。この二峰性分布の２つの平均二面角をｖａｒ １４およびｖａｒ １５で指定し、これらは最適化の開始時（ｓｔａｒｔ ０．０）から両方とも固定され（ｊｕｍｐ ０．０）、最適化の間変化しない（ｊｕｍｐ ０．０）同じガウス広がり（ｖａｒ １６）１５°（ｆｉｘ １５．０）を有する。メチル基は全て同じ三峰性の角度分布を有する。この三峰性分布の３つの平均二面角をｖａｒ １７、ｖａｒ １８、およびｖａｒ １９で指定し、これらは最適化の開始時（ｓｔａｒｔ ０．０）から全て固定され（ｊｕｍｐ ０．０）、これらは全て最適化の間変化しない同じガウス広がり（ｖａｒ ２０）３０°（ｆｉｘ ３０．０）を有する。これらの変数を、（前述の通り）ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ、ｇｙｒａｔｉｏｎ、およびｍｕｌｔｉｇｙｒａｔｉｏｎｓを用いて分子内の特定の二面角にマッピングする。
ｎｇ ５−６ ｍｅａｎ）、１個の変数（ｖａｒ６）をそれらの共通するガウス広がり（ｒｅｍａｒｋ ｂ１−３ ｌｉｎｋａｇｅ ｒｉｎｇｓ ５−６ Ｇａｕｓｓｉａｎ ｓｐｒｅａｄ）に割り当てた。これらψおよびφ平均二面角の両方に、繰り返し最適化の開
始時（ｓｔａｒｔ ０．０）に０〜３６０°のランダム値（ｒａｎｄ ０ ３６０）を与え、ガウス広がりには、最適化の開始時に特定の（且つ合理的な）値２０°（ｆｉｘ ２０）を帰属し、これは最適化の各ステップで、最適化の開始（ｓｔａｒｔ ０．０）から最大１０°のランダムな幅で変えられる（ｊｕｍｐ １０．０）。他の２個のβ１→３結合も同様に指定し（ｖａｒ １、ｖａｒ ２、およびｖａｒ ３）、これらには同じ変数が当てられるため、互いに動的およびコンフォメーション的に同じであるとしてモデリングされる。２個のβ１→４結合中のψ結合およびφ結合の単峰性分布も同様に変数７〜９
で指定される。アセトアミド側鎖Ｃ２−Ｎ２結合の単峰性分布も同様に変数９および１０（環２および４中の側鎖）ならびに１１および１２（環６中の側鎖）で指定される。ヒドロキシメチル基は全て同じ二峰性の角度分布を有する。この二峰性分布の２つの平均二面角をｖａｒ １４およびｖａｒ １５で指定し、これらは最適化の開始時（ｓｔａｒｔ ０．０）から両方とも固定され（ｊｕｍｐ ０．０）、最適化の間変化しない（ｊｕｍｐ ０．０）同じガウス広がり（ｖａｒ １６）１５°（ｆｉｘ １５．０）を有する。メチル基は全て同じ三峰性の角度分布を有する。この三峰性分布の３つの平均二面角をｖａｒ １７、ｖａｒ １８、およびｖａｒ １９で指定し、これらは最適化の開始時（ｓｔａｒｔ ０．０）から全て固定され（ｊｕｍｐ ０．０）、これらは全て最適化の間変化しない同じガウス広がり（ｖａｒ ２０）３０°（ｆｉｘ ３０．０）を有する。これらの変数を、（前述の通り）ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ、ｇｙｒａｔｉｏｎ、およびｍｕｌｔｉｇｙｒａｔｉｏｎｓを用いて分子内の特定の二面角にマッピングする。
この方法で、上で与えた自由度９の解析に従って、α−ＨＡ6分子の全てのフレキシビリティー部分およびその挙動をコンピュータ用に定義する。変数１４〜２０は所定の固定値を有するため、α−ＨＡ6の溶液構造を解明するために、決定すべき１３の個別の未知の分子変数がある。
＜構造計算＞
α−ＨＡ6の構造計算の各ラウンドは４０回のランを含む。χ2が最も小さい１０個のランに対して統計処理を行った。個々のランはそれぞれ１０，０００回の繰り返しステップを有し、動的アンサンブルは１００個の構造からなる。後述するように、構造計算の連続するラウンドで、連続的に７個の実験データセットファイル（付表Ａ参照）を導入した。
α−ＨＡ6の構造計算の各ラウンドは４０回のランを含む。χ2が最も小さい１０個のランに対して統計処理を行った。個々のランはそれぞれ１０，０００回の繰り返しステップを有し、動的アンサンブルは１００個の構造からなる。後述するように、構造計算の連続するラウンドで、連続的に７個の実験データセットファイル（付表Ａ参照）を導入した。
（後述するように）固定された幾何学的関係にある分子の部分についての標準的な結合距離、角度、および化学的性質の知見に基づいて、ＨＡヘキササッカライドの最初の３Ｄモデルを構築した。構造計算の初期のラウンド（ラウンド１〜３０）では、４個のデータセットファイルを用いてα−ＨＡ6の大まかな溶液コンフォメーションを決定した。それらは以下の通りである：
１）秩序変数のデータセットファイル（３個の構造的制約）
２）スカラーカップリングのデータセットファイル（３個の構造的制約）
３）15Ｎ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣのデータセットファイル（１９個の構造的制約）
４）２Ｄ−ＮＯＥＳＹデータセットファイル（８２個のＮＯＥ構造的制約）
１）秩序変数のデータセットファイル（３個の構造的制約）
２）スカラーカップリングのデータセットファイル（３個の構造的制約）
３）15Ｎ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣのデータセットファイル（１９個の構造的制約）
４）２Ｄ−ＮＯＥＳＹデータセットファイル（８２個のＮＯＥ構造的制約）
秩序変数、スカラーカップリング、および15Ｎ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセットファイル中の構造的制約は比較的少なく、容易に生成することができるので、誤りが含まれにくく、構造決定プロセスの開始からすぐに含めることができきる。対照的に、大きな２Ｄ−ＮＯＥＳＹデータセットファイルは多くの誤りを含むと予想されるので、最も確実なＮＯＥ構造的制約（約６０個の制約）のみを計算の最初のラウンドに用い、「ｎｏＮＯＥ」の構造的制約は使用しない。３０ラウンドの構造計算の後には、２Ｄ−ＮＯＥＳＹデータセット中の誤ったＮＯＥ構造的制約は補正され、全てのＮＯＥ構造的制約が含められている。以下の統計が示すように、このラウンドの４０回のランのトップ１０は全て１０個の未知の変数に同様な値を与えた。
この表には、χ2 totalが最も良かったトップ１０のランの出力データを示し、ラン番号２２が最も良く、ラン番号２６が１０番目に良い。Ｔｏｔｃｈｉのラインは、各ランのχ2 totalの値ならびにこれらのχ2 total値の平均値および標準偏差（ＳｔＤｅｖ）を示す。このライン（χ2 total）より上は、このラウンドの計算で用いた個々のデータセットファイル、すなわち15Ｎ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ（ＮＯＥ−ＨＳＱＣ）、２Ｄ−ＮＯＥＳＹ（２Ｄ−ＮＯＥＳＹ）、スカラーカップリング（ＪＣＯＵＰ）、および秩序変数（ＯＲＤＥＲ）のそれぞれのχ2 total、平均、および標準偏差の値を示す。χ2 total、平均、および標準偏差の値はファンデルワールス（ＶＤＷ）の点からも各ランに与える。ＴｏｔＣｈｉライン以下は、動的モデルファイルで指定した１０個の変数ｖａｒ １〜ｖａｒ １０の結果である。したがって、このラウンドの計算の後、環１＆２および３＆４の間のβ１→３結合は、角度φおよびψがそれぞれ８３．４±８．９°（ｖａｒ １）お
よび−１１９．３±５．２°（ｖａｒ ２）、ガウス広がりが２０．９±５．５°（ｖａｒ ３）であった。環５＆６の間のβ１→３結合の角度は、φおよびψがそれぞれ−５８
．４±２５．７°（ｖａｒ ４）および−１２９．７±５．２°（ｖａｒ ５）、ガウス広がりが１６．７±３．５°（ｖａｒ ６）であった。β１→４結合は、角度φおよびψ
が−９１．９±８．８°（ｖａｒ ７）および−１２９．３±１６．５°（ｖａｒ ８）
、ガウス広がりが１８．９±３．０°（ｖａｒ９）であった。環２＆４のアセトアミド基
は、平均値が１１９．１±１．３°（ｖａｒ １０）、ガウス広がりが３２．３±１．６°（ｖａｒ １１）であり、環６のアセトアミド基は、平均値が１１９．１±１．０°（ｖａｒ １２）、ガウス広がりが２６．４±２．６°（ｖａｒ １３）であった。
よび−１１９．３±５．２°（ｖａｒ ２）、ガウス広がりが２０．９±５．５°（ｖａｒ ３）であった。環５＆６の間のβ１→３結合の角度は、φおよびψがそれぞれ−５８
．４±２５．７°（ｖａｒ ４）および−１２９．７±５．２°（ｖａｒ ５）、ガウス広がりが１６．７±３．５°（ｖａｒ ６）であった。β１→４結合は、角度φおよびψ
が−９１．９±８．８°（ｖａｒ ７）および−１２９．３±１６．５°（ｖａｒ ８）
、ガウス広がりが１８．９±３．０°（ｖａｒ９）であった。環２＆４のアセトアミド基
は、平均値が１１９．１±１．３°（ｖａｒ １０）、ガウス広がりが３２．３±１．６°（ｖａｒ １１）であり、環６のアセトアミド基は、平均値が１１９．１±１．０°（ｖａｒ １２）、ガウス広がりが２６．４±２．６°（ｖａｒ １３）であった。
出現する構造に対していずれかのデータセットファイルが過度に影響を与えていないかを確かめるために、各データセットについて、χ2 dataset／制約数（Ｃｈｉ／Ｒｅｓ）およびχ2 total／制約数を計算した。
この場合、各データセットでＣｈｉ／Ｒｅｓの値が近い（０．９〜１．６）ことが確認され、これはどのデータセットファイルも他のデータセットファイルより優勢（ｄｏｍｉｎａｔｉｎｇ）ではないことを示している。秩序変数およびスカラーカップリングデータの誤差は直接求めることができるが、ＮＯＥＳＹデータセットファイルの誤差は正確に分かっていない値ｍに依存し、２Ｄ−ＮＯＥＳＹデータセットのｍ値（０．４）および15Ｎ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセットのｍ値（０．４）が適していると考えられる。このラウンドで用いた１０７個の構造的制約はいずれも異常値（ｖｉｏｌａｔｏｒ）ではない。
次の１０ラウンドの構造計算では、２Ｄ−ＮＯＥＳＹスペクトルからのｎｏＮＯＥ構造的制約を含めた。この構造計算のラウンドの結果は以下の通りであり、全てのｎｏＮＯＥが含まれ、そのいずれも異常値ではないか、その他のデータセットファイル中の構造的制約のいずれも異常値ではない。
これらの結果から分かるように、グリコシド結合変数に対する新規な値は、（データのより少ない）それ以前のラウンドで決定された値と基本的には同じであるが異なる。これらの構造的制約データでは、環１＆２および環３＆４の間のβ１→３結合は、ガウス広がりが２０．０±４．７°で（ψ，φ）が（−６２．７±８．２°，−１１２．０±４．１
°）のコンフォメーションをとりやすく、環５＆６の間のβ１→３結合は、ガウス広がりが１５．７±２．８°で（ψ，φ）が（−５０．４±７．７°、−１２７．４±３．５°
）のコンフォメーションをとりやすく、一方、β１→４結合は、ガウス広がりが１８．７±５．１°で（ψ，φ）が（８２．０±１０．６°、−１３１．４±１５．１°）のコン
フォメーションをとりやすい。アミド基はラウンド３０と大きく変わらない。ｎｏＮＯＥ制約のＣｈｉ／Ｒｅｓ値（２Ｄ−ＮＯＥＳＹ（ｎｏ））は０．５であり、これは他のデータセットの値よりかなり小さい。このことは、ｎｏＮＯＥ構造的制約は実際、観察データの欠如を表すので直接観察された構造的制約よりも信頼性が低く、したがって構造計算で優勢になるべきではないため、重要である。
°）のコンフォメーションをとりやすく、環５＆６の間のβ１→３結合は、ガウス広がりが１５．７±２．８°で（ψ，φ）が（−５０．４±７．７°、−１２７．４±３．５°
）のコンフォメーションをとりやすく、一方、β１→４結合は、ガウス広がりが１８．７±５．１°で（ψ，φ）が（８２．０±１０．６°、−１３１．４±１５．１°）のコン
フォメーションをとりやすい。アミド基はラウンド３０と大きく変わらない。ｎｏＮＯＥ制約のＣｈｉ／Ｒｅｓ値（２Ｄ−ＮＯＥＳＹ（ｎｏ））は０．５であり、これは他のデータセットの値よりかなり小さい。このことは、ｎｏＮＯＥ構造的制約は実際、観察データの欠如を表すので直接観察された構造的制約よりも信頼性が低く、したがって構造計算で優勢になるべきではないため、重要である。
次の３０ラウンドの計算では、ＲＤＣデータを含め、ここでも、最初に基本的なデータセット（約４５個の制約）を、次に残りの約２０個を含めた。このラウンドの構造計算の結果は以下の通りであり、全てのＲＤＣが含まれ、そのいずれも異常値ではないか、他のデータセットファイル中の構造的制約のいずれも異常値ではない。
これらの結果から分かるように、グリコシド結合変数の新規な値は、ラウンド４０で求めた値とわずかに異なるだけである。これらの構造的制約データでは、環１＆２および３＆４の間のβ１→３結合は、ガウス広がりが２１．０±４．１°で（ψ，φ）が（−７０
．４±８．３°，−１１４．４±４．３°）のコンフォメーションをとりやすく、環５＆６の間のβ１→３結合は、ガウス広がりが１６．７±３．４°で（ψ，φ）が（−２０．
３±９．１°、−１２０．５±１６．７°）のコンフォメーションをとりやすく、β１→４結合は、ガウス広がりが１９．２±４．９°で（ψ，φ）が（−５９．４±４．２°、
−１５２．３±８．５°）のコンフォメーションをとりやすい。アミド基は今回も前回のラウンドの計算と非常に近かった。
．４±８．３°，−１１４．４±４．３°）のコンフォメーションをとりやすく、環５＆６の間のβ１→３結合は、ガウス広がりが１６．７±３．４°で（ψ，φ）が（−２０．
３±９．１°、−１２０．５±１６．７°）のコンフォメーションをとりやすく、β１→４結合は、ガウス広がりが１９．２±４．９°で（ψ，φ）が（−５９．４±４．２°、
−１５２．３±８．５°）のコンフォメーションをとりやすい。アミド基は今回も前回のラウンドの計算と非常に近かった。
次の５ラウンドの計算では、［1Ｈ，15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータを、構造的制約が誤りを含まない信頼性が高いため、全体のブロックとして含めた。しかし、このデータセットを含めることで、他のデータセットファイル中のいくつかの誤りが明らかになった。このラウンドの構造計算の結果は以下の通りであり、全ての15Ｎ ｆｉｌｔｅｒｅｄ−ＲＯＥが含まれ、そのいずれも異常値ではないか、他のデータセットファイル中の構造的制約のいずれも異常値ではない。
これらの結果から分かるように、グリコシド結合変数の新規な値は、ラウンド７０で求めた値と非常に近い。これらの構造的制約データでは、環１＆２および３＆４の間のβ１→３結合は、ガウス広がりが２１．５±３．９°で（φ，ψ）が（７０．７±５．６°，
−１２２．９±３．７°）のコンフォメーションをとりやすく、環５＆６の間のβ１→３結合は、ガウス結合が１８．１±２．１°で（φ，ψ）が（−１６．６±４．１°，−１
２１．７±２．６°）のコンフォメーションをとりやすく、β１→４結合は、ガウス広がりが１９．９±３．２°で（φ，ψ）が（−６３．６±７．０°，−１４７．０±８．８
°）のコンフォメーションをとりやすい。ここでも、アミド基は前回の計算ラウンドと非常に近い。
−１２２．９±３．７°）のコンフォメーションをとりやすく、環５＆６の間のβ１→３結合は、ガウス結合が１８．１±２．１°で（φ，ψ）が（−１６．６±４．１°，−１
２１．７±２．６°）のコンフォメーションをとりやすく、β１→４結合は、ガウス広がりが１９．９±３．２°で（φ，ψ）が（−６３．６±７．０°，−１４７．０±８．８
°）のコンフォメーションをとりやすい。ここでも、アミド基は前回の計算ラウンドと非常に近い。
次の３５ラウンドの計算では、２Ｄ−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータを含め（このスペクトルの幾つかの部分にはアーティファクトがあり、異常なデータポイントを除くために多くの計算ラウンドが必要であった）、やはり最初はＲＯＥ構造的制約の基本的なデータセット（約４０個の制約）を含め、次に残りの約２０個を含めた。このラウンドの構造計算の結果は以下の通りであり、このデータセットの全てのＲＯＥが含まれ、そのいずれも異常値ではないか、他のデータセットファイル中の構造的制約のいずれも異常値ではない。
これらの結果から分かるように、グリコシド結合変数の新規な値は、ラウンド７５で求めた値とほとんど変わらない。これらの構造的制約データでは、環１＆２および３＆４の間のβ１→３結合は、ガウス広がりが２０．６±４．５°で（φ，ψ）が（−６８．８±
１０．１°，−１２０．６±３．７°）のコンフォメーションをとりやすく、環５＆６の間のβ１→３結合は、ガウス広がりが１７．８±３．７°で（φ，ψ）が（−２１．９±
８．５°，−１１８．４±３．６°）のコンフォメーションをとりやすく、β１→４結合は、ガウス広がりが２１．７±２．４°で（φ，ψ）が（−６０．４±５．７°，−１４
６．９±１２．９°）のコンフォメーションをとりやすい。ここでも、アミド基は前回のラウンドの計算と非常に近い。
１０．１°，−１２０．６±３．７°）のコンフォメーションをとりやすく、環５＆６の間のβ１→３結合は、ガウス広がりが１７．８±３．７°で（φ，ψ）が（−２１．９±
８．５°，−１１８．４±３．６°）のコンフォメーションをとりやすく、β１→４結合は、ガウス広がりが２１．７±２．４°で（φ，ψ）が（−６０．４±５．７°，−１４
６．９±１２．９°）のコンフォメーションをとりやすい。ここでも、アミド基は前回のラウンドの計算と非常に近い。
次の１５ラウンドの計算では、２Ｄ−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセット中のｎｏＲＯＥを含めた。このラウンドの構造計算の結果は以下の通りであり、全てのｎｏＲＯＥが含まれ、そのいずれも異常値ではないか、他のデータセットファイル中の構造的制約のいずれも異常値ではない。
これらの結果から分かるように、１０個の変数、特にグリコシド結合変数およびそのガウス広がりのそれぞれの値は、７５ラウンド以降２Ｄ−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータ（ＲＯＥまたはｎｏＲＯＥ）を含める前から、大きく変化していない。この大きなデータ部分（１５４個の構造的制約）を含めてもこれら１０個の変数の値は変わらなかったので、動的構造が解明されたとみなし、更なる実験データは必要としなかった。
＜構造の精密化＞
α−ＨＡ6の動的３Ｄ溶液構造を、ラウンド１２５（上記参照）の結果から採った１３個の変数を開始値とする動的モデルファイル（以下に記載）を用いて精密化した。これにより、最適化アルゴリズムでこの特定のχ2 totalの最小値を非常に効果的に調べ、１３個の変数の最良であろう値を探すことができる。アンサンブルのサイズを２５０に増やし、各ランについて１５，０００回の繰り返しステップを実施し、１００回のランを行った。ラウンド１２５に用いた７個のＮＭＲデータセット全てを構造精密化に用いた。
α−ＨＡ6の動的３Ｄ溶液構造を、ラウンド１２５（上記参照）の結果から採った１３個の変数を開始値とする動的モデルファイル（以下に記載）を用いて精密化した。これにより、最適化アルゴリズムでこの特定のχ2 totalの最小値を非常に効果的に調べ、１３個の変数の最良であろう値を探すことができる。アンサンブルのサイズを２５０に増やし、各ランについて１５，０００回の繰り返しステップを実施し、１００回のランを行った。ラウンド１２５に用いた７個のＮＭＲデータセット全てを構造精密化に用いた。
この最小化ラウンドの合計１００回のラン中で最小の合計χ2 total値を有する２０個のランを統計解析に用いた。最も良い５個のランの値を簡潔に示すが、平均および標準偏差（ＳｔＤｅｖ）の値は最も良い２０個のランから計算したものである。
これら１０個の変数の値で、χ2 restraintが１０を超える構造的制約はなく、このことは構造の質が高いことを示している。全４１２個の構造的制約とその個々のχ2ｒｅｓｔｒａｉｎｔ値の最終リストを付表Ａに示す。したがって、最適化アルゴリズムを用いて、α−ＨＡ6の動的溶液構造を記述する１３個の変数に最も適合（ｂｅｓｔ ｆｉｔ）する値が決定された。４１２個の構造的制約があるので、これは定義した自由度１当たり、平均３１．７個の構造的制約を意味する。最も適合した値は、環１＆２および３＆４の間のβ１→３結合では、角度φおよびψがそれぞれ−６９．７±４．１°（ｖａｒ １）お
よび−１２２．３±１．９°、振動のガウス広がりが２３．５±２．２°（ｖａｒ ３）；環５＆６の間のβ１→３結合では、角度φおよびψがそれぞれ−２０．４±２．６°（
ｖａｒ ４）および−１２１．８±２．３°（ｖａｒ ５）、振動のガウス広がりが１７．５±１．１°（ｖａｒ ６）；β１→４結合では、角度φおよびψがそれぞれ−６０．
４±２．４°（ｖａｒ ７）および−１４２．２±４．７°（ｖａｒ ８）、振動のガウス広がりが１９．４±１．３°（ｖａｒ ９）である。環２＆４中のアセトアミド基は、二面角の平均値が１２０．４±０．８°（ｖａｒ １０）（すなわち、二面角は重原子に対して定義されるため、ＨＮおよびＨ２は互いに正確にトランスである。）、ガウス広がりが２９．８±１．４°（ｖａｒ １１）である。環６中のアセトアミド基は、平均値が１１９．６±１．０°（ｖａｒ １２）、ガウス広がりが２５．８±１．０°（ｖａｒ １３）である。これらの変数から生成したα−ＨＡ6の平均的な溶液構造の座標を付表Ａに示す。平均構造および構造の動的アンサンブルの視覚的例を図１８〜２０に示す。
よび−１２２．３±１．９°、振動のガウス広がりが２３．５±２．２°（ｖａｒ ３）；環５＆６の間のβ１→３結合では、角度φおよびψがそれぞれ−２０．４±２．６°（
ｖａｒ ４）および−１２１．８±２．３°（ｖａｒ ５）、振動のガウス広がりが１７．５±１．１°（ｖａｒ ６）；β１→４結合では、角度φおよびψがそれぞれ−６０．
４±２．４°（ｖａｒ ７）および−１４２．２±４．７°（ｖａｒ ８）、振動のガウス広がりが１９．４±１．３°（ｖａｒ ９）である。環２＆４中のアセトアミド基は、二面角の平均値が１２０．４±０．８°（ｖａｒ １０）（すなわち、二面角は重原子に対して定義されるため、ＨＮおよびＨ２は互いに正確にトランスである。）、ガウス広がりが２９．８±１．４°（ｖａｒ １１）である。環６中のアセトアミド基は、平均値が１１９．６±１．０°（ｖａｒ １２）、ガウス広がりが２５．８±１．０°（ｖａｒ １３）である。これらの変数から生成したα−ＨＡ6の平均的な溶液構造の座標を付表Ａに示す。平均構造および構造の動的アンサンブルの視覚的例を図１８〜２０に示す。
［付表Ａ−ヒアルロナンヘキササッカライド］
＜ＰＤＢとして表したヒアルロナンヘキササッカライドの開始３Ｄ座標＞
これはタンパク質データバンク（ＰＤＢ）のファイルフォーマットである。列２は原子番号、列３は原子の種類、列５は残基番号、列６〜８は各原子核のデカルト座標（ｘ、ｙ、ｚ）である。
＜ＰＤＢとして表したヒアルロナンヘキササッカライドの開始３Ｄ座標＞
これはタンパク質データバンク（ＰＤＢ）のファイルフォーマットである。列２は原子番号、列３は原子の種類、列５は残基番号、列６〜８は各原子核のデカルト座標（ｘ、ｙ、ｚ）である。
＜ヒアルロナンヘキササッカライドの分子内座標の表＞
最初の列は分子内座標番号、次の８列は原子の定義を示す。次の５列は距離（ｉｊ）、角度（ｉｊｋ）、二面角（ｉｊｋｌ）、角度（ｊｋｌ）、および距離（ｋｌ）を示す。列７のアスタリスクは、原子が他の原子に関して固定された形状（通常、混成、例えばｓｐ2、ｓｐ3による固定形状を指定する。）であり、角度が少し異なる方法で用いられているがこれらの角度は最適化中に変動しにくいことを意味する。
最初の列は分子内座標番号、次の８列は原子の定義を示す。次の５列は距離（ｉｊ）、角度（ｉｊｋ）、二面角（ｉｊｋｌ）、角度（ｊｋｌ）、および距離（ｋｌ）を示す。列７のアスタリスクは、原子が他の原子に関して固定された形状（通常、混成、例えばｓｐ2、ｓｐ3による固定形状を指定する。）であり、角度が少し異なる方法で用いられているがこれらの角度は最適化中に変動しにくいことを意味する。
＜ヒアルロナンヘキササッカライドの［1Ｈ−1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセット＞
＜ヒアルロナンヘキササッカライドの［1Ｈ−15Ｎ］−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセット＞
＜ヒアルロナンヘキササッカライドの［1Ｈ−15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセット＞
＜ヒアルロナンヘキササッカライドの［1Ｈ−15Ｎ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ−ＨＳＱＣデータセット＞
＜ヒアルロナンヘキササッカライドのスカラーカップリングデータセット＞
＜ヒアルロナンヘキササッカライドの残留双極子カップリングデータセット＞
＜ヒアルロナンヘキササッカライドの秩序変数データセット＞
＜構造精密化後の各構造的制約の最終χ2 restraint値＞
このファイル中、各ラインのフィールドは以下の通りである：最初の数は構造的制約の数（例えば１２３）であり、この後ろに、構造的制約に関わる原子を定義する６つの文字または番号が続き（例えば、ｗ ２ Ｈ１Ｍ ａ’ ５ Ｈ１）、次の２つの値は構造的制約の測定値およびその誤差を示し（例えば、０．００ ２．００）、次の３つの値は、動的アンサンブルから得られたその構造的制約の予測値（例えば−０．００）、その構造的制約のχ2 restraint値（例えば０．００）、およびχ2 restraint値の標準偏差（例えば０．００）を示す。次の値はフラグ値（例えば０）であり、その次の値は制約が有する重複の数（例えば＋２）を示す。最後のフィールドは構造的制約の見られるデータセットファイルの名称（例えば２Ｄ−ＲＯＥＳＹ）を示す。このファイル中、構造的制約は、χ2 restraint値の最も低い値から最も高い値へと（すなわち、２Ｄ−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセット中の制約１２３からＲＤＣデータセット中の制約１０４へと）並んでいる。
このファイル中、各ラインのフィールドは以下の通りである：最初の数は構造的制約の数（例えば１２３）であり、この後ろに、構造的制約に関わる原子を定義する６つの文字または番号が続き（例えば、ｗ ２ Ｈ１Ｍ ａ’ ５ Ｈ１）、次の２つの値は構造的制約の測定値およびその誤差を示し（例えば、０．００ ２．００）、次の３つの値は、動的アンサンブルから得られたその構造的制約の予測値（例えば−０．００）、その構造的制約のχ2 restraint値（例えば０．００）、およびχ2 restraint値の標準偏差（例えば０．００）を示す。次の値はフラグ値（例えば０）であり、その次の値は制約が有する重複の数（例えば＋２）を示す。最後のフィールドは構造的制約の見られるデータセットファイルの名称（例えば２Ｄ−ＲＯＥＳＹ）を示す。このファイル中、構造的制約は、χ2 restraint値の最も低い値から最も高い値へと（すなわち、２Ｄ−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセット中の制約１２３からＲＤＣデータセット中の制約１０４へと）並んでいる。
＜最終的な最適化平均構造のＰＤＢ座標＞
リシノプリル
リシノプリルは、高血圧、うっ血性心不全、心臓発作の治療に用いられる親水性有機薬物分子であり（図２１参照）、糖尿病の腎臓および網膜の合併症を予防するためにも用いられている。リシノプリルは、アンギオテンシンＩのアンギオテンシンＩＩ（強力な血管収縮剤）への変換を触媒し且つブラジキニン（強力な血管拡張剤）の不活化にも関わるアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害剤である。歴史的に、リシノプリルは（カプトリルおよびエナラプリルに次いで）３番目に開発されたＡＣＥ阻害剤であり１９９０年代初期に治療に導入された。リシノプリルはメルク社（Ｍｅｒｃｋ＆ＣＯ．）により開発され、Ｐｒｉｎｉｖｉｌ（登録商標）として、およびアストラゼネカ社（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）からＺｅｓｔｒｉｌ（登録商標）として世界中で販売されている。オーストラリアでは、これはアルファファーム社（ＡｌｐｈａＰｈａｒｍ）からＬｉｓｏｄｕｒ（登録商標）として販売されている。本実施例で本発明者らは、リシノプリルの動的３Ｄ溶液構造がＮＭＲの実験データから本発明の方法を用いてどのように決定されたかを示す。
リシノプリルは、高血圧、うっ血性心不全、心臓発作の治療に用いられる親水性有機薬物分子であり（図２１参照）、糖尿病の腎臓および網膜の合併症を予防するためにも用いられている。リシノプリルは、アンギオテンシンＩのアンギオテンシンＩＩ（強力な血管収縮剤）への変換を触媒し且つブラジキニン（強力な血管拡張剤）の不活化にも関わるアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害剤である。歴史的に、リシノプリルは（カプトリルおよびエナラプリルに次いで）３番目に開発されたＡＣＥ阻害剤であり１９９０年代初期に治療に導入された。リシノプリルはメルク社（Ｍｅｒｃｋ＆ＣＯ．）により開発され、Ｐｒｉｎｉｖｉｌ（登録商標）として、およびアストラゼネカ社（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）からＺｅｓｔｒｉｌ（登録商標）として世界中で販売されている。オーストラリアでは、これはアルファファーム社（ＡｌｐｈａＰｈａｒｍ）からＬｉｓｏｄｕｒ（登録商標）として販売されている。本実施例で本発明者らは、リシノプリルの動的３Ｄ溶液構造がＮＭＲの実験データから本発明の方法を用いてどのように決定されたかを示す。
＜化学シフトの帰属および等核スカラーカップリング定数の測定＞
リシノプリルは、トリペプチドＮＨ3−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＣＯＯと同様な化学的構造を有するペプチド模倣分子である。したがって、リシノプリル中の原子および残基はこのペプチドの命名法に従って命名され（付表Ｂ参照）、フェニルアラニン側鎖中の過飽和炭素はＣＧと呼ばれる。リシノプリルのＮＭＲデータは全てｐＨ６．０で記録されたので、アミン基（すなわち骨格第２級アミンおよびＬｙｓ３側鎖の第１級アミン）およびカルボキシレート基（Ｐｈｅ１およびＰｒｏ３残基中）のイオン化状態は、図２１に示すように、これらの基の典型的なｐＫａの値からすぐに決定することができる。プロリン残基の窒素原子に由来する孤立電子対の隣接するカルボニル二重結合との部分的共役により、溶液中でリシノプリルはシスおよびトランス両方の立体異性体が存在する（図２２）。
リシノプリルは、トリペプチドＮＨ3−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＣＯＯと同様な化学的構造を有するペプチド模倣分子である。したがって、リシノプリル中の原子および残基はこのペプチドの命名法に従って命名され（付表Ｂ参照）、フェニルアラニン側鎖中の過飽和炭素はＣＧと呼ばれる。リシノプリルのＮＭＲデータは全てｐＨ６．０で記録されたので、アミン基（すなわち骨格第２級アミンおよびＬｙｓ３側鎖の第１級アミン）およびカルボキシレート基（Ｐｈｅ１およびＰｒｏ３残基中）のイオン化状態は、図２１に示すように、これらの基の典型的なｐＫａの値からすぐに決定することができる。プロリン残基の窒素原子に由来する孤立電子対の隣接するカルボニル二重結合との部分的共役により、溶液中でリシノプリルはシスおよびトランス両方の立体異性体が存在する（図２２）。
２７８Ｋにおけるリシノプリルの両立体異性体の1Ｈおよび13Ｃの化学シフトを、リシノプリルの２０ｍＭのＮＭＲサンプル（１００％Ｄ2Ｏ、ｐＨ*６．０、０．３ｍＭ ＤＳＳ）について６００ＭＨｚで記録した［1Ｈ−1Ｈ］−ＣＯＳＹ、［1Ｈ−1Ｈ］−ＴＯＣＳＹ、および天然存在比の［1Ｈ−13Ｃ］−ＨＳＱＣのスペクトルを用いて帰属した。シスおよびトランスの形態に特徴的な共鳴のピーク体積を積分することで、モル存在比はトランス８０％：シス２０％に決定された。トランス−リシノプリルが混合物により多く含まれるため、この段階で、トランスリシノプリルの動的３Ｄ構造を決定することにした。トランスリシノプリルのプロトン化学シフトを図２３に示す。
トランスリシノプリル中のＨＡプロトンを除き、ほとんどのプロトンは、多くのスカラーカップリングの存在（リシン側鎖中には2ＪHH／3ＪHHスカラーカップリングが５個も存在する）および強い結合（ｓｔｒｏｎｇ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ）のため、スペクトルの線形が複雑であった。この複雑さにより、多くのスカラーカップリングが測定できなかった。しかし、図２３に示す６個の3ＪHHカップリング定数が測定された。
＜スペクトル線形の解析＞
２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセットを用いてトランスリシノプリルの構造的制約を得た。このデータセットは、取得次元でプロトンのマルチプレット分裂を解像するのに十分なデータポイント数且つ間接次元でこれらの分裂が解像されるのを防ぐのに十分な少ないデータポイント数で（すなわち、プロトンマルチプレットの解析を取得次元のみに単純化して）記録された。このデータセットのλの値（１．８Ｈｚ）を、ＲＯＥのＰｒｏ３ ＨＡプロトンの共鳴測定で決定した。この２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセットのトランスリシノプリル中の各プロトンのスケーリング係数セットは以下の通り決定された。
２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセットを用いてトランスリシノプリルの構造的制約を得た。このデータセットは、取得次元でプロトンのマルチプレット分裂を解像するのに十分なデータポイント数且つ間接次元でこれらの分裂が解像されるのを防ぐのに十分な少ないデータポイント数で（すなわち、プロトンマルチプレットの解析を取得次元のみに単純化して）記録された。このデータセットのλの値（１．８Ｈｚ）を、ＲＯＥのＰｒｏ３ ＨＡプロトンの共鳴測定で決定した。この２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセットのトランスリシノプリル中の各プロトンのスケーリング係数セットは以下の通り決定された。
＜Ｐｒｏ３、ＨＡプロトン＞
このプロトンは２個の3ＪHHカップリング定数６．０Ｈｚおよび８．０Ｈｚを有し（図２４参照）、ダブレットの中でも単純なダブレットとして（すなわち、図９中のスカラーカップリング２個のように）現れている。したがって、この初期スケーリング係数セットはｆi＝｛４，４，４，４｝である。各スケーリング係数にモル存在比のスケール調整比（＝１／０．８）である１．２５をかけ、補正スケーリング係数セットは、ｆi＝｛５，５，５，５｝となる。
このプロトンは２個の3ＪHHカップリング定数６．０Ｈｚおよび８．０Ｈｚを有し（図２４参照）、ダブレットの中でも単純なダブレットとして（すなわち、図９中のスカラーカップリング２個のように）現れている。したがって、この初期スケーリング係数セットはｆi＝｛４，４，４，４｝である。各スケーリング係数にモル存在比のスケール調整比（＝１／０．８）である１．２５をかけ、補正スケーリング係数セットは、ｆi＝｛５，５，５，５｝となる。
＜Ｐｈｅ１、ＨＡプロトン＞
このプロトンは、スペクトル中で（図１０中のスカラーカップリング２個で示すように）理想的なトリプレットとして現れると予想される。しかし、このプロトンに隣接する第２級アミン基の化学的置換により、このプロトンのマルチプレット共鳴は更にブロード化し、このマルチプレットは広幅のシングレットとして現れている（すなわち、図９中のスカラーカップリングなしに最も近い）。したがって、このプロトンのスケーリング係数セットは、スペクトル中のＰｒｏ３ ＨＡの対角ピークと比較することで推定した。Ｐｒｏ３ ＨＡのスケーリング係数セット、すなわちｆi＝｛５，５，５，５｝を用て、Ｐｒｏ３ ＨＡ対角ピークの真のピーク高さを求めた。Ｐｈｅ１ ＨＡプロトンは、このスペクトル中のＰｒｏ３ ＨＡ対角ピークと同様な真のピーク高さであると予想されるので、スケーリング係数は、観察されたシングレットＰｈｅ１ ＨＡ対角ピークの高さをＰｒｏ３ ＨＡ対角ピークの真のピーク高さと同じ値にスケール調整するのに必要な値であると推定することができる。これにより、スケーリング係数セットはｆi＝｛４．５｝となる。
このプロトンは、スペクトル中で（図１０中のスカラーカップリング２個で示すように）理想的なトリプレットとして現れると予想される。しかし、このプロトンに隣接する第２級アミン基の化学的置換により、このプロトンのマルチプレット共鳴は更にブロード化し、このマルチプレットは広幅のシングレットとして現れている（すなわち、図９中のスカラーカップリングなしに最も近い）。したがって、このプロトンのスケーリング係数セットは、スペクトル中のＰｒｏ３ ＨＡの対角ピークと比較することで推定した。Ｐｒｏ３ ＨＡのスケーリング係数セット、すなわちｆi＝｛５，５，５，５｝を用て、Ｐｒｏ３ ＨＡ対角ピークの真のピーク高さを求めた。Ｐｈｅ１ ＨＡプロトンは、このスペクトル中のＰｒｏ３ ＨＡ対角ピークと同様な真のピーク高さであると予想されるので、スケーリング係数は、観察されたシングレットＰｈｅ１ ＨＡ対角ピークの高さをＰｒｏ３ ＨＡ対角ピークの真のピーク高さと同じ値にスケール調整するのに必要な値であると推定することができる。これにより、スケーリング係数セットはｆi＝｛４．５｝となる。
＜Ｌｙｓ２、ＨＡプロトン＞
このプロトンは、Ｐｈｅ１ ＨＡプロトンで観察されたのと同様にブロード化されていた。同じように処理し、推定スケーリング係数セットはｆi＝｛４．１｝となった。
このプロトンは、Ｐｈｅ１ ＨＡプロトンで観察されたのと同様にブロード化されていた。同じように処理し、推定スケーリング係数セットはｆi＝｛４．１｝となった。
＜その他の全プロトン＞
非常に複雑な線形を有し、強く結合（ｓｔｒｏｎｇ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ）していた。これらの初期スケーリング係数セットは、強く結合したプロトン用の規則を用いて決定した（上記参照）。次いで、各スケーリング係数にモル存在比をかけた。要約すると、２Ｄ［1Ｈ−1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセット中のプロトン共鳴マルチプレットのスケーリング係数セットは以下の通りである：
非常に複雑な線形を有し、強く結合（ｓｔｒｏｎｇ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ）していた。これらの初期スケーリング係数セットは、強く結合したプロトン用の規則を用いて決定した（上記参照）。次いで、各スケーリング係数にモル存在比をかけた。要約すると、２Ｄ［1Ｈ−1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセット中のプロトン共鳴マルチプレットのスケーリング係数セットは以下の通りである：
＜ＮＭＲスペクトルの測定および定量＞
トランスリシノプリルの動的溶液構造の決定に、７個の異なるＮＭＲ実験データセット中の２個の異なるＮＭＲデータを用いた：
１）Ｔ−ＲＯＥＳＹ緩和データ：１個の実験データセット。２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ
２）コンフォメーション依存性のスカラーカップリング：１個の実験データセット。
トランスリシノプリルの動的溶液構造の決定に、７個の異なるＮＭＲ実験データセット中の２個の異なるＮＭＲデータを用いた：
１）Ｔ−ＲＯＥＳＹ緩和データ：１個の実験データセット。２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹ
２）コンフォメーション依存性のスカラーカップリング：１個の実験データセット。
これらの異なるＮＭＲデータセットのそれぞれについて、関連する取得パラメータ（およびそれから測定された構造的制約の数）は以下の通りであった。２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹスペクトルの記録は、２０ｍＭリシノプリルのサンプル（１００％Ｄ2Ｏ、ｐＨ*６．０、０．３ｍＭ ＤＳＳ）について、６００ＭＨｚ、２７８Ｋ、ＲＯＥ混合時間を４００ｍｓ、掃引幅を両方の次元で７２００Ｈｚにして行った。前述のスケーリング係数セットを用いて、このスペクトルから６７個のＲＯＥ構造的制約が測定された。各ＲＯＥ制約の誤差を、２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹスペクトルのｍの初期値を０．５として、前述のように求めた（このスペクトル中に存在しない３９個のｎｏＮＯＥ構造的制約も推測された）。これらのＲＯＥおよびｎｏＲＯＥの構造的制約は、付表Ｂに示すデータセットファイルに詳述する。
プロリン環は２つの既知のコンフォメーションの間で平衡しているため、この環中のＨＡプロトンの２個のスカラーカップリング定数（図２４参照）は、環の形状をより正確に定義する役には立たず、したがって、これらのカップリング定数は構造的制約として使用しなかった。図２４に示す残りの４個のスカラーカップリング定数を未知の結合形状を定義するための構造計算で構造的制約として用いることができる。これらのカップリング定数を分子中の二面角と関連付けるための最良のＫａｒｐｌｕｓ式は、通常、タンパク質およびペプチド中のχ1側鎖形状に用いられるものである［３９］。結合の測定（約０．３Ｈｚ）およびこれらのＫａｒｐｌｕｓの関係の予測精度（約０．３Ｈｚ）を合わせた誤差は約０．５Ｈｚである。４個のスカラーカップリング定数の測定値を関連するデータセットファイルに示す（付表Ｂ参照）。
＜分子の詳細＞
前述の実験データセットはどちらもＤ2Ｏ中で得られたのものである。Ｄ2Ｏ中では、リシノプリル中の全てのアミンプロトンは非常に急速に溶媒重水素と置換される。したがって、これらのプロトンはＮＭＲ不活性であると定義した（ｅｘｃ １ ＨＮ*，ｅｘｃ ２ ＨＺ*）。その他のプロトンは全て活性と定義した（ａｄｄ* Ｈ*）。この溶媒マスクの指定に使用したファイルは以下の通りである。
前述の実験データセットはどちらもＤ2Ｏ中で得られたのものである。Ｄ2Ｏ中では、リシノプリル中の全てのアミンプロトンは非常に急速に溶媒重水素と置換される。したがって、これらのプロトンはＮＭＲ不活性であると定義した（ｅｘｃ １ ＨＮ*，ｅｘｃ ２ ＨＺ*）。その他のプロトンは全て活性と定義した（ａｄｄ* Ｈ*）。この溶媒マスクの指定に使用したファイルは以下の通りである。
リシノプリルの各カルボキシレート基中の２個の酸素原子の、分子構造の残りの部分に対する位置は、実験データから特定することはできなかった。したがって、これらの原子は、以下のファンデルワールスインプットファイルに詳述するように、ファンデルワールス不活性とした。
＜実験データインプット＞
トランスリシノプリルのτcの値は実験から正確に測定されていない。しかし、２０ｍＭのＨＡ6サンプル（１００％Ｄ2Ｏ、ｐＨ６．０、０．３ｍＭ ＤＳＳ）について６００ＭＨｚ、２７８Ｋ（すなわち、２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹで用いたのと同じサンプル条件）で記録した２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセットスペクトルは、弱いＮＯＥ陽性を示した。したがって、ＮＯＥが陽性になる（上記参照）τcの閾値を得るための式から、これらの条件下でトランスリシノプリルのτc値が０．３ｎｓ未満であることが示される。したがって、この値を最初０．１ｎｓに設定した。構造計算を数回行った後（上記方法を参照）、値は０．２が好ましいことが分かり、式（２２）および（２３）を用いて、２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセットの１００％Ｄ2Ｏの２７８Ｋにおける調整した溶媒粘度を１．９４に決定した。構造計算に用いた２個の実験データセットファイルを付表Ｂに示す。
＜動的モデル＞
前述の方法を用いて、リシノプリル内の関連するコンフォメーションのフレキシブルな結合および化学的性質を特定した（図２５参照）：
１）分子骨格を含む４個の単結合、すなわちＮF1−ＣＡF1、ＮF1−ＣＡK2、ＣＡK2−ＣK2、ＣK2−ＮP3。
２）プロリン環は溶液中で、Ｎ状態およびＳ状態と名付けられた（アップ（ＵＰ）コンフォメーションおよびダウン（ＤＯＷＮ）コンフォメーション、またはＣ３’エンドコンフォメーションおよびＣ３’−エキソコンフォメーションともいう）２つの主要なコンフォメーションをとる［１５］。トランスプロリン環の場合、これらは約５０：５０の比率であることが分かっている［４０］。
３）Ｐｈｅ１残基中のカルボキシレート基はＣＡF1−ＣF1単結合の回りで回転可能である。同様にＰｒｏ３残基中のカルボキシレート基もＣＡP3−ＣP3単結合の回りで回転可能である。
４）リジン側鎖中の５個の単結合は回転可能である（ＣＡK2−ＣＢK2、ＣＢK2−ＣＧK2、ＣＧK2−ＣＤK2、ＣＤK2−ＣＥK2、ＣＥK2−ＮＺK2）。
５）フェニルアラニン側鎖中の３個の単結合は回転可能である（ＣＡF1−ＣＢF1、ＣＢF1−ＣＧF1、ＣＧF1−ＣＤF1）。
トランスリシノプリルのτcの値は実験から正確に測定されていない。しかし、２０ｍＭのＨＡ6サンプル（１００％Ｄ2Ｏ、ｐＨ６．０、０．３ｍＭ ＤＳＳ）について６００ＭＨｚ、２７８Ｋ（すなわち、２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹで用いたのと同じサンプル条件）で記録した２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセットスペクトルは、弱いＮＯＥ陽性を示した。したがって、ＮＯＥが陽性になる（上記参照）τcの閾値を得るための式から、これらの条件下でトランスリシノプリルのτc値が０．３ｎｓ未満であることが示される。したがって、この値を最初０．１ｎｓに設定した。構造計算を数回行った後（上記方法を参照）、値は０．２が好ましいことが分かり、式（２２）および（２３）を用いて、２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセットの１００％Ｄ2Ｏの２７８Ｋにおける調整した溶媒粘度を１．９４に決定した。構造計算に用いた２個の実験データセットファイルを付表Ｂに示す。
＜動的モデル＞
前述の方法を用いて、リシノプリル内の関連するコンフォメーションのフレキシブルな結合および化学的性質を特定した（図２５参照）：
１）分子骨格を含む４個の単結合、すなわちＮF1−ＣＡF1、ＮF1−ＣＡK2、ＣＡK2−ＣK2、ＣK2−ＮP3。
２）プロリン環は溶液中で、Ｎ状態およびＳ状態と名付けられた（アップ（ＵＰ）コンフォメーションおよびダウン（ＤＯＷＮ）コンフォメーション、またはＣ３’エンドコンフォメーションおよびＣ３’−エキソコンフォメーションともいう）２つの主要なコンフォメーションをとる［１５］。トランスプロリン環の場合、これらは約５０：５０の比率であることが分かっている［４０］。
３）Ｐｈｅ１残基中のカルボキシレート基はＣＡF1−ＣF1単結合の回りで回転可能である。同様にＰｒｏ３残基中のカルボキシレート基もＣＡP3−ＣP3単結合の回りで回転可能である。
４）リジン側鎖中の５個の単結合は回転可能である（ＣＡK2−ＣＢK2、ＣＢK2−ＣＧK2、ＣＧK2−ＣＤK2、ＣＤK2−ＣＥK2、ＣＥK2−ＮＺK2）。
５）フェニルアラニン側鎖中の３個の単結合は回転可能である（ＣＡF1−ＣＢF1、ＣＢF1−ＣＧF1、ＣＧF1−ＣＤF1）。
観察される実験データに対して最適化するために用いることができる現実的な動的分子モデルを作製するために、動的モデルファイル中で以下の自由度をモデリングした（下記参照）。
１）ＮF1−ＣＡF1およびＮF1−ＣＡK2結合はｓｐ3混成原子間にあるので、三峰性モデルを必要とする。３つの回転異性体状態（ｇｔ、ｔｇ、ｇｇ）が変数１、２、および３（繰り返し最適化の間、これらは固定されたままである。）で指定され、各結合には固有のガウス広がり値が与えられ（それぞれｖａｒ ４およびｖａｒ ５）、これは最適化の間に変更可能とした。各結合の３つの回転異性体状態の相対数は最適化の間に変更可能であり、それぞれ確率ｍｏｄｅ１およびｍｏｄｅ２とした。ＣＡK2−ＣK2結合はｓｐ3混成原子（ＣＡK2）とｓｐ2混成原子（ＣK2）の間にあるので二峰性モデルを必要とする。これは、最適化の間に変更可能な２個の平均値（ｖａｒ ８および１０）および２個の異なるガウス広がり値（ｖａｒ ９および１１）を用いてモデリングした。これら２つのコンフォメーションの相対数は変更可能であり、確率ｍｏｄｅ３でとした。トランス形態のリシノプリルだけをモデリングしているので、ＣK2−ＮP3結合は固定した単峰性モデルで表しており、トランスの形状に適した平均二面角（すなわち１８０°）をとっている。この結合のガウス広がりには小さな値を設定し、小さなジャンプサイズを与え、ペプチド結合がかなり強固であることを反映させた。
２）プロリン環の２つの主要なコンフォメーションは、詳細に明らかにされた形状を有する［１５］。したがって、環中の各結合は、２つの固定された平均値を有しガウス広がりがゼロの二峰性モデルとした。この環は、溶液中で見られるこれらのコンフォメーションの比５０：５０を反映した固定値０．５に設定した確率ｍｏｄｅ６で２つの状態の間を変化する。
３）いずれかのカルボキシレート基のカルボキシレート酸素原子が関わる構造的制約はないため、結合ＣＡF1−ＣF1およびＣＡP3−ＣP3の正確な二面角の値をこれらのデータセットから決定することはできない。これらの初期の任意の位置が繰り返し最適化に影響を与えるのを防ぐために、カルボキシレート原子はファンデルワールス不活性（上記参照）に設定した。
４）ＣＡK2−ＣＢK2、ＣＢK2−ＣＧK2、ＣＧK2−ＣＤK2、ＣＤK2−ＣＥK2、ＣＥK2−ＮＺK2結合は全てｓｐ3混成原子間にあるので三峰性のモデルを必要とする。ＨＢ１およびＨＢ２プロトンは化学シフトが同じなので（図２３参照）、これらは対称性の三峰性モデルを必要とし（ｖａｒ １、ｖａｒ ２、ｖａｒ ３、ｖａｒ ７、ｍｏｄｅ ５ ４）、ｔｇおよびｇｔ回転異性体の確率値は常に等しく、残りの１つの確率自由度は変更可能である。同じ論法で、ＣＢK2−ＣＧK2、ＣＧK2−ＣＤK2、およびＣＤK2−ＣＥK2結合にも、変更可能且つそれぞれが自身のガウス広がり（ｖａｒ ２９〜３１）を有する確率値の、対称性の三峰性モデル（ｍｏｄｅ ９、１０、および１１）を与えた。ＣＥK2−ＮＺK2結合をメチル基として同じようにモデリングした（付表Ａのヒアルロナンヘキササッカライド参照）。
５）ＣＡF1−ＣＢF1およびＣＢF1−ＣＧF1結合は、ｓｐ3混成原子間にあるので三峰性のモデルを必要とする。ＨＢプロトンは化学シフトが同じなので（図２３参照）、ＣＡF1−ＣＢF1結合には、確率値が変更可能な対称性の三峰性モデルを用いた（ｖａｒ １、ｖａｒ ２、ｖａｒ ３、ｖａｒ ６、ｍｏｄｅ ４ ４）。同様にＨＧプロトンも化学シフトが同じなので（図２３参照）、ＣＢF1−ＣＧF1結合にも、確率値が変更可能な対称性の三峰性モデルを用いた（ｖａｒ １、ｖａｒ ２、ｖａｒ ３、ｖａｒ ６、ｍｏｄｅ ７ ４）ＣＧF1−ＣＤF1結合はｓｐ3混成原子（ＣＧF1）とｓｐ2混成原子（ＣＤF1）の間にあるので二峰性のモデルを必要とする。動的モデルファイル中に示す２つの二面角（ｖａｒ ２６、ｖａｒ ２７）は、これらが種々の小分子結晶構造中のこの結合で主に観察される対称性コンフォメーションの両方の形態をモデリングするものであるためにこの値を選択した。この対称性のため、この結合には１個のガウス値を与えた（ｖａｒ ２８）。
１）ＮF1−ＣＡF1およびＮF1−ＣＡK2結合はｓｐ3混成原子間にあるので、三峰性モデルを必要とする。３つの回転異性体状態（ｇｔ、ｔｇ、ｇｇ）が変数１、２、および３（繰り返し最適化の間、これらは固定されたままである。）で指定され、各結合には固有のガウス広がり値が与えられ（それぞれｖａｒ ４およびｖａｒ ５）、これは最適化の間に変更可能とした。各結合の３つの回転異性体状態の相対数は最適化の間に変更可能であり、それぞれ確率ｍｏｄｅ１およびｍｏｄｅ２とした。ＣＡK2−ＣK2結合はｓｐ3混成原子（ＣＡK2）とｓｐ2混成原子（ＣK2）の間にあるので二峰性モデルを必要とする。これは、最適化の間に変更可能な２個の平均値（ｖａｒ ８および１０）および２個の異なるガウス広がり値（ｖａｒ ９および１１）を用いてモデリングした。これら２つのコンフォメーションの相対数は変更可能であり、確率ｍｏｄｅ３でとした。トランス形態のリシノプリルだけをモデリングしているので、ＣK2−ＮP3結合は固定した単峰性モデルで表しており、トランスの形状に適した平均二面角（すなわち１８０°）をとっている。この結合のガウス広がりには小さな値を設定し、小さなジャンプサイズを与え、ペプチド結合がかなり強固であることを反映させた。
２）プロリン環の２つの主要なコンフォメーションは、詳細に明らかにされた形状を有する［１５］。したがって、環中の各結合は、２つの固定された平均値を有しガウス広がりがゼロの二峰性モデルとした。この環は、溶液中で見られるこれらのコンフォメーションの比５０：５０を反映した固定値０．５に設定した確率ｍｏｄｅ６で２つの状態の間を変化する。
３）いずれかのカルボキシレート基のカルボキシレート酸素原子が関わる構造的制約はないため、結合ＣＡF1−ＣF1およびＣＡP3−ＣP3の正確な二面角の値をこれらのデータセットから決定することはできない。これらの初期の任意の位置が繰り返し最適化に影響を与えるのを防ぐために、カルボキシレート原子はファンデルワールス不活性（上記参照）に設定した。
４）ＣＡK2−ＣＢK2、ＣＢK2−ＣＧK2、ＣＧK2−ＣＤK2、ＣＤK2−ＣＥK2、ＣＥK2−ＮＺK2結合は全てｓｐ3混成原子間にあるので三峰性のモデルを必要とする。ＨＢ１およびＨＢ２プロトンは化学シフトが同じなので（図２３参照）、これらは対称性の三峰性モデルを必要とし（ｖａｒ １、ｖａｒ ２、ｖａｒ ３、ｖａｒ ７、ｍｏｄｅ ５ ４）、ｔｇおよびｇｔ回転異性体の確率値は常に等しく、残りの１つの確率自由度は変更可能である。同じ論法で、ＣＢK2−ＣＧK2、ＣＧK2−ＣＤK2、およびＣＤK2−ＣＥK2結合にも、変更可能且つそれぞれが自身のガウス広がり（ｖａｒ ２９〜３１）を有する確率値の、対称性の三峰性モデル（ｍｏｄｅ ９、１０、および１１）を与えた。ＣＥK2−ＮＺK2結合をメチル基として同じようにモデリングした（付表Ａのヒアルロナンヘキササッカライド参照）。
５）ＣＡF1−ＣＢF1およびＣＢF1−ＣＧF1結合は、ｓｐ3混成原子間にあるので三峰性のモデルを必要とする。ＨＢプロトンは化学シフトが同じなので（図２３参照）、ＣＡF1−ＣＢF1結合には、確率値が変更可能な対称性の三峰性モデルを用いた（ｖａｒ １、ｖａｒ ２、ｖａｒ ３、ｖａｒ ６、ｍｏｄｅ ４ ４）。同様にＨＧプロトンも化学シフトが同じなので（図２３参照）、ＣＢF1−ＣＧF1結合にも、確率値が変更可能な対称性の三峰性モデルを用いた（ｖａｒ １、ｖａｒ ２、ｖａｒ ３、ｖａｒ ６、ｍｏｄｅ ７ ４）ＣＧF1−ＣＤF1結合はｓｐ3混成原子（ＣＧF1）とｓｐ2混成原子（ＣＤF1）の間にあるので二峰性のモデルを必要とする。動的モデルファイル中に示す２つの二面角（ｖａｒ ２６、ｖａｒ ２７）は、これらが種々の小分子結晶構造中のこの結合で主に観察される対称性コンフォメーションの両方の形態をモデリングするものであるためにこの値を選択した。この対称性のため、この結合には１個のガウス値を与えた（ｖａｒ ２８）。
これらの考察の具体的実施は、以下に示す動的モデルファイルを用いて行った。各変数および確率モードと化学構造との関係を図２６に示す。
このようにして、アンサンブル生成アルゴリズムをコンピュータで実現するために必要なトランスリシノプリル分子の全てのフレキシビリティー部分およびその挙動を定義する。このモデルでは、トランスリシノプリルの溶液構造を解明するために決定すべき１３個の未知のガウス広がり、２個の未知の平均二面角値、および１１個の確率値がある。
＜構造計算＞
トランスリシノプリルの構造計算の各ラウンドは１００回のランを含み、α−ＨＡ6で用いた回数（４０）よりも多いが、これはモデリングされる自由度がより多いためである。χ2 totalの最も小さい２５個のランについて統計処理を行った。個々のランはそれぞれ１０，０００回の繰り返しステップを有し、動的アンサンブルは２５０個の構造からなり、これはα−ＨＡ6で用いた数（４０）より多いが、動的モデルファイル中で用いた二峰性および三峰性モデルの数がより多いためである。スカラーカップリングデータセットファイル（付表Ｂ参照）は、実験誤差が低く、構造計算の第１ラウンドから用いた。２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセットの基本的なデータセット（３７個の構造的制約）を、構造計算の最初の８ラウンドで確立し、その後、未知の各パラメータに好ましい（および構造的に可能な）値へと構造を緩やかに収束させる。このラウンドの１００回のランのトップ２５についての一次統計および二次統計のデータ表を以下に示す（ランキングされた上位１０ランのみを示す）。
トランスリシノプリルの構造計算の各ラウンドは１００回のランを含み、α−ＨＡ6で用いた回数（４０）よりも多いが、これはモデリングされる自由度がより多いためである。χ2 totalの最も小さい２５個のランについて統計処理を行った。個々のランはそれぞれ１０，０００回の繰り返しステップを有し、動的アンサンブルは２５０個の構造からなり、これはα−ＨＡ6で用いた数（４０）より多いが、動的モデルファイル中で用いた二峰性および三峰性モデルの数がより多いためである。スカラーカップリングデータセットファイル（付表Ｂ参照）は、実験誤差が低く、構造計算の第１ラウンドから用いた。２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセットの基本的なデータセット（３７個の構造的制約）を、構造計算の最初の８ラウンドで確立し、その後、未知の各パラメータに好ましい（および構造的に可能な）値へと構造を緩やかに収束させる。このラウンドの１００回のランのトップ２５についての一次統計および二次統計のデータ表を以下に示す（ランキングされた上位１０ランのみを示す）。
この場合、Ｃｈｉ／Ｒｅｓ値が２個のデータセットで近いことが分かる。このことは、２Ｄ−Ｔ−ＲＯＥＳＹがスカラーカップリングデータセット（ＪＣＯＵＰ）より特別に優勢ではなく、すなわち、ｍの値は０．４が好適であることを示している。
次の２９ラウンドの構造計算では、より多くのＲＯＥ構造的制約および多くのｎｏＲＯＥ構造的制約を含めた。２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセットを完全に解析したこのラウンドの構造計算の結果は以下の通りである。
これらの結果から分かるように、各パラメータの値、特に骨格結合の平均値、ガウス広がり、および確率値は、ラウンド８の結果と近い。どの構造的制約も１０．０を超えるχ2 restraint値は有しない。ラウンド８に対して更にデータ（６８個の構造的制約）を含めても、最適化された動的構造はあまり変わらないことから、動的構造が一次近似で解明された。その他の種類のＮＭＲデータセットを含めることで、この分子の動的構造のより完全な理解が容易に得られるであろう（ヒアルロナンヘキササッカライドについて前述したように）。
これらの値に従って生成されるトランスリシノプリルの平均動的溶液構造の座標を付表Ｂに示す。平均動的構造および構造の動的アンサンブルの複数を視覚的例を図２７〜２９に示す。
［付表Ａ−リシノプリル］
＜リシノプリルの開始ＰＤＢ ３Ｄ座標＞
＜リシノプリルの開始ＰＤＢ ３Ｄ座標＞
＜リシノプリルの分子内座標の表＞
＜リシノプリルの［1Ｈ−1Ｈ］−Ｔ−ＲＯＥＳＹデータセット＞
＜リシノプリルのスカラーカップリングデータセット＞
＜最も良く最適化されたリシノプリルの動的構造のχ2 restraint値＞
＜リシノプリルの最も良い平均最適化動的構造のＰＤＢ座標＞
アンギオテンシンＩ
アンギオテンシンＩは、血管を収縮させて血圧を上昇させる天然のデカペプチドである。アンギオテンシンＩはデカペプチドホルモン（配列ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ）であり、強力な口渇誘発剤である。アンギオテンシンＩは、肝臓で生成される血清グロブリンである前駆体分子アンギオテンシノーゲンに由来し、レニン−アンギオテンシン系で重要な役割を果たす。アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）はアンギオテンシンＩから２個のＣ末端残基を切断してアンギオテンシンＩＩを生成し、これはこれらの生物学的プロセスを仲介する。本実施例では、本発明者らは本発明の方法を用いてＮＭＲ実験データからどのようにアンギオテンシンＩの動的３Ｄ溶液構造が決定されたかを示す。
アンギオテンシンＩは、血管を収縮させて血圧を上昇させる天然のデカペプチドである。アンギオテンシンＩはデカペプチドホルモン（配列ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ）であり、強力な口渇誘発剤である。アンギオテンシンＩは、肝臓で生成される血清グロブリンである前駆体分子アンギオテンシノーゲンに由来し、レニン−アンギオテンシン系で重要な役割を果たす。アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）はアンギオテンシンＩから２個のＣ末端残基を切断してアンギオテンシンＩＩを生成し、これはこれらの生物学的プロセスを仲介する。本実施例では、本発明者らは本発明の方法を用いてＮＭＲ実験データからどのようにアンギオテンシンＩの動的３Ｄ溶液構造が決定されたかを示す。
＜化学シフトの帰属および等核スカラーカップリング定数の測定＞
アンギオテンシンＩ中の原子および残基を、ＸＰＬＯＲフォーマットに従って命名した（付表Ｃ参照）。アンギオテンシンＩの全てのＮＭＲデータはｐＨ６．０で記録されており、典型的なｐＫａ値と合わせて、分子中の滴定可能な基、すなわち骨格Ｎ末端アミン基（＋ｖｅ）、Ａｓｐ１側鎖（−ｖｅ）、Ａｒｇ２側鎖（＋ｖｅ）、骨格Ｃ末端カルボキシレート（−ｖｅ）のほとんどのイオン化状態を記述する。２個のヒスチジン側鎖（Ｈｉｓ６、Ｈｉｓ９）に、その予測ｐＫａ値（６．５）に一致した＋ｖｅの電荷を与えるが、これが妥当であるか決定するためには更に実験データを収集すべきである。プロリン残基の窒素原子の孤立電子対の、隣接するカルボニル二重結合との部分的共役により、溶液中でアンギオテンシンＩのシスおよびトランスの立体異性体の両方が存在する。
アンギオテンシンＩ中の原子および残基を、ＸＰＬＯＲフォーマットに従って命名した（付表Ｃ参照）。アンギオテンシンＩの全てのＮＭＲデータはｐＨ６．０で記録されており、典型的なｐＫａ値と合わせて、分子中の滴定可能な基、すなわち骨格Ｎ末端アミン基（＋ｖｅ）、Ａｓｐ１側鎖（−ｖｅ）、Ａｒｇ２側鎖（＋ｖｅ）、骨格Ｃ末端カルボキシレート（−ｖｅ）のほとんどのイオン化状態を記述する。２個のヒスチジン側鎖（Ｈｉｓ６、Ｈｉｓ９）に、その予測ｐＫａ値（６．５）に一致した＋ｖｅの電荷を与えるが、これが妥当であるか決定するためには更に実験データを収集すべきである。プロリン残基の窒素原子の孤立電子対の、隣接するカルボニル二重結合との部分的共役により、溶液中でアンギオテンシンＩのシスおよびトランスの立体異性体の両方が存在する。
アンギオテンシンＩの両立体異性体の３００Ｋにおける1Ｈおよび13Ｃの化学シフトを、アンギオテンシンＩの５ｍＭのＮＭＲサンプル（５％Ｄ2Ｏ、ｐＨ６．０、０．３ｍＭ ＤＳＳ）について６００ＭＨｚで記録した［1Ｈ−1Ｈ］−ＣＯＳＹ、［1Ｈ−1Ｈ］−ＴＯＣＳＹ、および天然存在比での［1Ｈ−13Ｃ］−ＨＳＱＣのスペクトルを用いて帰属した。シス形態およびトランス形態に特徴的な共鳴のピーク体積を積分することで、モル存在比がトランス８０％：シス２０％に決定された。混合物中にトランス−アンギオテンシンＩがより多く含まれるため、この段階で、トランスアンギオテンシンＩの動的３Ｄ構造を決定することにした。アンギオテンシンＩで測定されたプロトン化学シフトを以下の表２に示す。
a1Ｈ化学シフトは全て３００Ｋ、ｐＨ６．０、５％Ｄ2Ｏ／９０％Ｈ2Ｏ中で、内部ＤＳＳに対して決定された。
b斜体で示した化学シフトは、局所的３Ｄ構造を参照せずに立体特異的に帰属できなかった原子を表す。
cアスタリスクの付いた原子は、縮重した化学シフトを表す（例えば、ＨＢ*は、ＨＢ１およびＨＢ２が同じ値を有することを意味する）。
b斜体で示した化学シフトは、局所的３Ｄ構造を参照せずに立体特異的に帰属できなかった原子を表す。
cアスタリスクの付いた原子は、縮重した化学シフトを表す（例えば、ＨＢ*は、ＨＢ１およびＨＢ２が同じ値を有することを意味する）。
化学シフトは２７８Ｋおよび３１０Ｋでも測定したが、大きな変化は見られず（アミドプロトンの場合は直線的にだけ変化する。以下参照。）、この温度範囲で分子のコンフォメーションが顕著に乱れないことを示している。
トランスアンギオテンシンＩ中のＨＡプロトンおよびＨＮプロトンを除き、ほとんどのプロトンは、存在する多数のスカラーカップリング（アルギニン側鎖中には2ＪHH／3ＪHHスカラーカップリングが５個も存在する）および強い結合（ｓｔｒｏｎｇ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ）により、スペクトルの線形が複雑であった。この複雑さにより、側鎖中のほとんどのスカラーカップリングが測定できなかった。しかし、スカラーカップリング制約のリストに示すように（付表Ｃ参照）、種々の側鎖プロトンの3ＪHHカップリング定数が測定された。
＜スペクトル線形の解析＞
２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセットを用いてトランスアンギオテンシンＩの構造的制約を得た。このデータセットのλの値（１．８Ｈｚ）を、ＮＯＥのＩｌｅ５ＨＮプロトンの共鳴を測定することで決定した。全てのＨＮプロトンは、単純なダブレットのスケーリング係数セットを有していた（すなわち、ｆi＝｛２，２｝）。種々の芳香環プロトンは０、１、または２個の3Ｊスカラーカップリングを有し、強い結合の影響は受けず、したがって、それぞれ理想的なシングレット（例えばＨｉｓ６ ＨＥ１）、ダブレット（例えばＴｙｒ４ ＨＤ*）、またはトリプレット（例えばＰｈｅ８ ＨＺ）の線形を有していた。複数のＨＡプロトン（例えばＨｉｓ６ ＨＡ）は、３個の3Ｊスカラーカップリングを有するため、基本的なクアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）の線形をしていた。これらの場合、前述のようにブロードニングの式を適用した。その他の全てのプロトンは複雑な線形をしており、強い結合の影響を受け、そのスケーリング係数セットは強く結合した（ｓｔｒｏｎｇ−ｃｏｕｐｏｌｉｎｇ）プロトンの規則を用いて決定した（上記参照）。
２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセットを用いてトランスアンギオテンシンＩの構造的制約を得た。このデータセットのλの値（１．８Ｈｚ）を、ＮＯＥのＩｌｅ５ＨＮプロトンの共鳴を測定することで決定した。全てのＨＮプロトンは、単純なダブレットのスケーリング係数セットを有していた（すなわち、ｆi＝｛２，２｝）。種々の芳香環プロトンは０、１、または２個の3Ｊスカラーカップリングを有し、強い結合の影響は受けず、したがって、それぞれ理想的なシングレット（例えばＨｉｓ６ ＨＥ１）、ダブレット（例えばＴｙｒ４ ＨＤ*）、またはトリプレット（例えばＰｈｅ８ ＨＺ）の線形を有していた。複数のＨＡプロトン（例えばＨｉｓ６ ＨＡ）は、３個の3Ｊスカラーカップリングを有するため、基本的なクアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）の線形をしていた。これらの場合、前述のようにブロードニングの式を適用した。その他の全てのプロトンは複雑な線形をしており、強い結合の影響を受け、そのスケーリング係数セットは強く結合した（ｓｔｒｏｎｇ−ｃｏｕｐｏｌｉｎｇ）プロトンの規則を用いて決定した（上記参照）。
要約すると、この２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセットにおけるトランスアンギオテンシンＩ中の各プロトンのスケーリング係数セットは以下の通りである。
＜ＮＭＲスペクトルの測定および定量＞
全ＮＭＲスペクトルの記録は５ｍＭアンギオテンシンＩサンプル（５％Ｄ2Ｏ、ｐＨ６．０、０．３ｍＭ ＤＳＳ）について６００ＭＨｚで行った。６個の異なるＮＭＲ実験データセット中の４個の異なる種類のＮＭＲデータをトランスアンギオテンシンＩの動的溶液構造の決定に用いた。
１）ＮＯＥＳＹ緩和データ：１個の実験データセット、２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹ
２）コンフォメーション依存性スカラーカップリング：３個の実験データセット
３）二面角の制約：１個の実験データセット
４）水素結合の制約：１個の実験データセット
全ＮＭＲスペクトルの記録は５ｍＭアンギオテンシンＩサンプル（５％Ｄ2Ｏ、ｐＨ６．０、０．３ｍＭ ＤＳＳ）について６００ＭＨｚで行った。６個の異なるＮＭＲ実験データセット中の４個の異なる種類のＮＭＲデータをトランスアンギオテンシンＩの動的溶液構造の決定に用いた。
１）ＮＯＥＳＹ緩和データ：１個の実験データセット、２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹ
２）コンフォメーション依存性スカラーカップリング：３個の実験データセット
３）二面角の制約：１個の実験データセット
４）水素結合の制約：１個の実験データセット
これらの異なるＮＭＲデータセットのそれぞれの関連する取得パラメータ（およびそれらから測定された構造的制約の数）は以下の通りであった。
１）２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹスペクトルを、２７８Ｋ、ＮＯＥを混合時間７００ｍｓ、掃引幅を両方の次元で７２００Ｈｚにして記録した。前述のスケーリング係数セットを用いて、このスペクトルから３４３個のＮＯＥおよび３８２個のｎｏＮＯＥの構造的制約を測定した。２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹスペクトルのｍの初期値０．４を用いて、各ＮＯＥ制約の誤差を前述したように決定した。このファイルのヘッダーを付表Ｃに示し、ＮＯＥおよびｎｏＮＯＥの構造的制約は、簡潔にするために付表Ｃ中のχ2 restraintファイル中に非明示的に含めた。
２）２７８Ｋ、２９８Ｋ、および３１０Ｋの１Ｄ、15Ｎ−ＨＳＱＣ、および13Ｃ−ＨＳＱＣのスペクトルから、ＨＮプロトン、ＨＡプロトン、およびＩｌｅ５ ＣＡ−ＣＢ−ＣＧ１−ＣＤ１二面角について合計６１個のコンフォメーション依存性スカラーカップリングが測定された。これらを、各温度について別々のスカラーカップリング制約のファイルにまとめた。その全てを付表Ｃに示す。
３）表２に示す化学シフトおよびプログラムＴＡＬＯＳ［４２］を用いて、二面角の制約を生成した。これらの予測される骨格角度ファイおよびプシーおよびその（二倍の）誤差の値を、合計１６個の制約を含む付表Ｃに示す二面角の制約ファイル中で用いた。
４）アミドプロトンの化学シフト温度係数から、アンギオテンシンＩ中のアミド基の水素結合の有無を決定した。−４．６ｐｐｂ／Ｋより小さい温度係数は、アミドプロトンが関わる有意な水素結合相互作用が存在しないことを示している［４４］。アンギオテンシンＩのアミドプロトンの温度係数の値は、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ａｎｄ Ａｌｍｏｎｄ（２００７）［４３］に記載されているように測定した。値は、Ｖａｌ３（−８．９ｐｐｂ／Ｋ）、Ｔｙｒ４（−９．４ｐｐｂ／Ｋ）、Ｉｌｅ５（−６．４ｐｐｂ／Ｋ）、Ｈｉｓ６（−８．９ＰＰＢ／Ｋ）、Ｐｈｅ８（−９．１ＰＰＢ／Ｋ）、およびＬｅｕ１０（８．２ｐｐｂ／Ｋ）であり、したがって、全てが−４．６ｐｐｂ／Ｋより小さかった。このことは、これらが水溶液中であまり水素結合を形成しないことを示している（すなわち、＜約１０〜約２０％の時間）。したがって、付表Ｃに示すファイル中の構造計算に５個の水素結合の制約を含めた。
１）２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹスペクトルを、２７８Ｋ、ＮＯＥを混合時間７００ｍｓ、掃引幅を両方の次元で７２００Ｈｚにして記録した。前述のスケーリング係数セットを用いて、このスペクトルから３４３個のＮＯＥおよび３８２個のｎｏＮＯＥの構造的制約を測定した。２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹスペクトルのｍの初期値０．４を用いて、各ＮＯＥ制約の誤差を前述したように決定した。このファイルのヘッダーを付表Ｃに示し、ＮＯＥおよびｎｏＮＯＥの構造的制約は、簡潔にするために付表Ｃ中のχ2 restraintファイル中に非明示的に含めた。
２）２７８Ｋ、２９８Ｋ、および３１０Ｋの１Ｄ、15Ｎ−ＨＳＱＣ、および13Ｃ−ＨＳＱＣのスペクトルから、ＨＮプロトン、ＨＡプロトン、およびＩｌｅ５ ＣＡ−ＣＢ−ＣＧ１−ＣＤ１二面角について合計６１個のコンフォメーション依存性スカラーカップリングが測定された。これらを、各温度について別々のスカラーカップリング制約のファイルにまとめた。その全てを付表Ｃに示す。
３）表２に示す化学シフトおよびプログラムＴＡＬＯＳ［４２］を用いて、二面角の制約を生成した。これらの予測される骨格角度ファイおよびプシーおよびその（二倍の）誤差の値を、合計１６個の制約を含む付表Ｃに示す二面角の制約ファイル中で用いた。
４）アミドプロトンの化学シフト温度係数から、アンギオテンシンＩ中のアミド基の水素結合の有無を決定した。−４．６ｐｐｂ／Ｋより小さい温度係数は、アミドプロトンが関わる有意な水素結合相互作用が存在しないことを示している［４４］。アンギオテンシンＩのアミドプロトンの温度係数の値は、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ａｎｄ Ａｌｍｏｎｄ（２００７）［４３］に記載されているように測定した。値は、Ｖａｌ３（−８．９ｐｐｂ／Ｋ）、Ｔｙｒ４（−９．４ｐｐｂ／Ｋ）、Ｉｌｅ５（−６．４ｐｐｂ／Ｋ）、Ｈｉｓ６（−８．９ＰＰＢ／Ｋ）、Ｐｈｅ８（−９．１ＰＰＢ／Ｋ）、およびＬｅｕ１０（８．２ｐｐｂ／Ｋ）であり、したがって、全てが−４．６ｐｐｂ／Ｋより小さかった。このことは、これらが水溶液中であまり水素結合を形成しないことを示している（すなわち、＜約１０〜約２０％の時間）。したがって、付表Ｃに示すファイル中の構造計算に５個の水素結合の制約を含めた。
＜分子の詳細＞
全ての実験データセットはＨ2Ｏ中で取得した。Ｈ2Ｏ中ではＮ末端第１級アミン、Ａｒｇ２グアニジノ側鎖プロトン、Ｔｙｒ４ヒドロキシルプロトン、およびＨｉｓ６およびＨｉｓ９の両方に含まれる両ヒスチジン側鎖アミンプロトンは素早く置換される。したがって、これらのプロトンは全て、以下の通り、溶媒マスクファイル中でＮＭＲ不活性として定義した。
全ての実験データセットはＨ2Ｏ中で取得した。Ｈ2Ｏ中ではＮ末端第１級アミン、Ａｒｇ２グアニジノ側鎖プロトン、Ｔｙｒ４ヒドロキシルプロトン、およびＨｉｓ６およびＨｉｓ９の両方に含まれる両ヒスチジン側鎖アミンプロトンは素早く置換される。したがって、これらのプロトンは全て、以下の通り、溶媒マスクファイル中でＮＭＲ不活性として定義した。
アンギオテンシンＩ中のカルボキシル基（すなわちＡｓｐ１側鎖＆Ｃ末端）中の２個の酸素原子、Ａｒｇ２グアニジノ基、およびＴｙｒ４ヒドロキシルプロトンの、分子構造の残りの部分に対する位置は、実験データからは特定できなかった。したがって、これらの原子は、以下のファンデルワールスインプットファイルに詳述するように、ファンデルワールス不活性と設定した。
＜実験データインプット＞
トランスアンギオテンシンＩのτcの値は実験では正確に測定されなかった。従って、τcの値は０．４ｎｓを推定値として用いた。数ラウンドの構造計算の後、分子が非常に拡張された形状をとっていることおよび対称性のトップ異方性モデルがより適切であることが明らかとなった。２Ｄ−ＮＯＥＳＹデータの定数セットについて計算ラウンドを繰り返した後、このことが更に確認され、この異方性モデルはかなりより良く実験データに適合した。垂直τc値１．２および平行τc値０．５ｎｓで最も良く実験データに適合する（すなわち最もχ2 totalが小さい）ことが分かった。構造計算に用いた全実験データファイルを付表Ｃに詳述する。
トランスアンギオテンシンＩのτcの値は実験では正確に測定されなかった。従って、τcの値は０．４ｎｓを推定値として用いた。数ラウンドの構造計算の後、分子が非常に拡張された形状をとっていることおよび対称性のトップ異方性モデルがより適切であることが明らかとなった。２Ｄ−ＮＯＥＳＹデータの定数セットについて計算ラウンドを繰り返した後、このことが更に確認され、この異方性モデルはかなりより良く実験データに適合した。垂直τc値１．２および平行τc値０．５ｎｓで最も良く実験データに適合する（すなわち最もχ2 totalが小さい）ことが分かった。構造計算に用いた全実験データファイルを付表Ｃに詳述する。
＜動的モデル＞
前述の方法を用いて、アンギオテンシンＩ内の関連するコンフォメーションのフレキシビリティー結合および化学的性質を特定した：
１）分子骨格を含む各残基のファイ（φ，Ｎi−ＣＡi）、プシー（ψ，ＣＡi−Ｃi）
およびオメガ（ω，Ｃi−Ｎi+1）単結合。
２）Ａｓｐ１側鎖中の２個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ，ＣＢ−ＣＧ）。
３）Ａｒｇ２側鎖中の４個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ、ＣＧ−ＣＤ、ＣＤ−ＮＥ）。
４）Ｖａｌ３側鎖中の３個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ１、ＣＢ−ＣＧ２）。
５）Ｔｙｒ４側鎖中の３個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ、ＯＨ−ＨＨ）。
６）Ｉｌｅ５側鎖中の４個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ１、ＣＧ１−ＣＤ１、ＣＢ−ＣＧ２）。
７）Ｈｉｓ６側鎖中の２個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ）
８）Ｐｒｏ７環は、リシノプリルで記載したように、溶液中で２つの主要なコンフォメーションをとる。
９）Ｐｈｅ８側鎖中の２個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ）。
１０）Ｈｉｓ９側鎖中の２個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ）。
１１）Ｌｅｕ１０側鎖中の４個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ、ＣＧ−ＣＤ１、ＣＧ−ＣＤ２）。
前述の方法を用いて、アンギオテンシンＩ内の関連するコンフォメーションのフレキシビリティー結合および化学的性質を特定した：
１）分子骨格を含む各残基のファイ（φ，Ｎi−ＣＡi）、プシー（ψ，ＣＡi−Ｃi）
およびオメガ（ω，Ｃi−Ｎi+1）単結合。
２）Ａｓｐ１側鎖中の２個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ，ＣＢ−ＣＧ）。
３）Ａｒｇ２側鎖中の４個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ、ＣＧ−ＣＤ、ＣＤ−ＮＥ）。
４）Ｖａｌ３側鎖中の３個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ１、ＣＢ−ＣＧ２）。
５）Ｔｙｒ４側鎖中の３個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ、ＯＨ−ＨＨ）。
６）Ｉｌｅ５側鎖中の４個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ１、ＣＧ１−ＣＤ１、ＣＢ−ＣＧ２）。
７）Ｈｉｓ６側鎖中の２個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ）
８）Ｐｒｏ７環は、リシノプリルで記載したように、溶液中で２つの主要なコンフォメーションをとる。
９）Ｐｈｅ８側鎖中の２個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ）。
１０）Ｈｉｓ９側鎖中の２個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ）。
１１）Ｌｅｕ１０側鎖中の４個の単結合は回転可能である（ＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧ、ＣＧ−ＣＤ１、ＣＧ−ＣＤ２）。
観察された実験データに対して最適化するために用いることができる現実的な動的分子モデルを作製するために、上記の自由度を以下の通り動的モデルファイル中でモデリングした。
１）骨格のファイ結合およびプシー結合の大半はｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子の間にあるので最初は二峰性モデルにした。骨格オメガ結合は全て固定単峰性モデルで表し、トランスの形状に適した平均二面角（すなわち１８０°）を用いた。Ｎ末端アミン結合（Ａｓｐ１のＮ−ＣＡ）は２個のｓｐ3混成原子の間にあるので、アミン基の回転を表すために三峰性モデルとした。
２）Ａｓｐ１側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（カイ１、χ１ともいう）はｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。３つの回転異性体状態（ｇｔ、ｔｇ、ｇｇ）を３個の異なる変数（ｖａｒ １１、１２、１３）で指定し、ガウス広がりは各回転異性体の位置で同じにした（ｖａｒ １４）。３つの回転異性体状態を与えるために用いられる最初の区切りはＨＡプロトンおよびＨＢ１／ＨＢ２プロトンの間の3Ｊカップリング定数の差から推定した。Ａｓｐ１側鎖中のＣＢ−ＣＧ結合（カイ２、χ２ともいう）は、ｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子の間にあるので二峰性モデルをとる。
３）Ａｒｇ２側鎖中のＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧおよびＣＧ−ＣＤ結合（χ１、χ２、χ３）は、ｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。各結合について、３つの回転異性体状態（ｇｔ、ｔｇ、ｇｇ）を３個の異なる変数で指定し、ガウス広がりは各回転異性体の位置で同じにした。Ａｒｇ２側鎖中のＣＤ−ＮＥ結合（χ４）はｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子の間にあるので二峰性モデルをとる。
４）Ｖａｌ３側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（カイ１、χ１ともいう）はｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。３つの回転異性体状態（ｇｔ、ｔｇ、ｇｇ）を３個の異なる変数で特定し、ガウス広がりは各回転異性体の位置で同じにした。３つの回転異性体状態を与えるための最初の区切りはＨＡプロトンおよびＨＢプロトンの間の3Ｊカップリング定数から推定した。２個のｓｐ3混成原子の間にあるＣＢ−ＣＧ１およびＣＢ−ＣＧ２の結合で２個のメチル基が連結されている。これらはどちらも三峰性モデルにして、メチル基の回転を表した。
５）Ｔｙｒ側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（χ１）はｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。ＣＢ−ＣＧ結合（χ２）はｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子間にあるので二峰性モデルをとる。ＯＨ−ＨＨ結合は単峰性モデルをとる。
６）Ｉｌｅ５側鎖中の結合は全てｓｐ3混成原子の間にあるので三峰性モデルをとる。ＣＡ−ＣＢおよびＣＢ−ＣＧ１結合の３つの回転異性体状態を与える最初の区切りは、ＨＡ−ＨＢ、ＨＢ−ＨＧ１２、およびＨＢ−ＨＧ１３の3Ｊカップリング定数から推定した。
７）Ｈｉｓ６側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（χ１）は、ｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。ＣＢ−ＣＧ結合（χ２）は、ｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子の間にあるので二峰性モデルをとる。
８）プロリン環の２つのコンフォメーションを、前述のリシノプリルで用いたのと同じように表した。
９）Ｐｈｅ８側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（χ１）はｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。ＣＢ−ＣＧ結合（χ２）はｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子の間にあるので二峰性モデルをとる。
１０）Ｈｉｓ９側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（χ１）は、ｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。ＣＢ−ＣＧ結合（χ２）はｓｐ２混成原子とｓｐ３混成原子の間にあるので二峰性モデルをとる。
１１）Ｌｅｕ１０側鎖内の結合は全てｓｐ３混成原子間にあるので、三峰性モデルをとる。
１）骨格のファイ結合およびプシー結合の大半はｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子の間にあるので最初は二峰性モデルにした。骨格オメガ結合は全て固定単峰性モデルで表し、トランスの形状に適した平均二面角（すなわち１８０°）を用いた。Ｎ末端アミン結合（Ａｓｐ１のＮ−ＣＡ）は２個のｓｐ3混成原子の間にあるので、アミン基の回転を表すために三峰性モデルとした。
２）Ａｓｐ１側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（カイ１、χ１ともいう）はｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。３つの回転異性体状態（ｇｔ、ｔｇ、ｇｇ）を３個の異なる変数（ｖａｒ １１、１２、１３）で指定し、ガウス広がりは各回転異性体の位置で同じにした（ｖａｒ １４）。３つの回転異性体状態を与えるために用いられる最初の区切りはＨＡプロトンおよびＨＢ１／ＨＢ２プロトンの間の3Ｊカップリング定数の差から推定した。Ａｓｐ１側鎖中のＣＢ−ＣＧ結合（カイ２、χ２ともいう）は、ｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子の間にあるので二峰性モデルをとる。
３）Ａｒｇ２側鎖中のＣＡ−ＣＢ、ＣＢ−ＣＧおよびＣＧ−ＣＤ結合（χ１、χ２、χ３）は、ｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。各結合について、３つの回転異性体状態（ｇｔ、ｔｇ、ｇｇ）を３個の異なる変数で指定し、ガウス広がりは各回転異性体の位置で同じにした。Ａｒｇ２側鎖中のＣＤ−ＮＥ結合（χ４）はｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子の間にあるので二峰性モデルをとる。
４）Ｖａｌ３側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（カイ１、χ１ともいう）はｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。３つの回転異性体状態（ｇｔ、ｔｇ、ｇｇ）を３個の異なる変数で特定し、ガウス広がりは各回転異性体の位置で同じにした。３つの回転異性体状態を与えるための最初の区切りはＨＡプロトンおよびＨＢプロトンの間の3Ｊカップリング定数から推定した。２個のｓｐ3混成原子の間にあるＣＢ−ＣＧ１およびＣＢ−ＣＧ２の結合で２個のメチル基が連結されている。これらはどちらも三峰性モデルにして、メチル基の回転を表した。
５）Ｔｙｒ側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（χ１）はｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。ＣＢ−ＣＧ結合（χ２）はｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子間にあるので二峰性モデルをとる。ＯＨ−ＨＨ結合は単峰性モデルをとる。
６）Ｉｌｅ５側鎖中の結合は全てｓｐ3混成原子の間にあるので三峰性モデルをとる。ＣＡ−ＣＢおよびＣＢ−ＣＧ１結合の３つの回転異性体状態を与える最初の区切りは、ＨＡ−ＨＢ、ＨＢ−ＨＧ１２、およびＨＢ−ＨＧ１３の3Ｊカップリング定数から推定した。
７）Ｈｉｓ６側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（χ１）は、ｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。ＣＢ−ＣＧ結合（χ２）は、ｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子の間にあるので二峰性モデルをとる。
８）プロリン環の２つのコンフォメーションを、前述のリシノプリルで用いたのと同じように表した。
９）Ｐｈｅ８側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（χ１）はｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。ＣＢ−ＣＧ結合（χ２）はｓｐ2混成原子とｓｐ3混成原子の間にあるので二峰性モデルをとる。
１０）Ｈｉｓ９側鎖中のＣＡ−ＣＢ結合（χ１）は、ｓｐ3混成原子間にあるので三峰性モデルをとる。ＣＢ−ＣＧ結合（χ２）はｓｐ２混成原子とｓｐ３混成原子の間にあるので二峰性モデルをとる。
１１）Ｌｅｕ１０側鎖内の結合は全てｓｐ３混成原子間にあるので、三峰性モデルをとる。
これらの考察の具体的な実施は、以下に示す動的モデルファイルを用いて行った（関連する分子内座標の表については付表Ｃを参照されたい）。
このようにして、本発明に係るアンサンブル生成アルゴリズムをコンピュータで実施するために必要とされるトランスアンギオテンシンＩ分子の全てのフレキシビリティー部分およびその挙動を完全に定義した。
＜構造計算＞
トランスアンギオテンシンＩの構造計算の各ラウンドは４８０回のランを含み、リシノプリルで用いたランの回数（１００）よりも多いが、これはモデリングされる自由度の数がより多いからである。χ2 totalの最も小さい１５個のランを統計処理した。個々のランはそれぞれ最初に５０００回の繰り返しステップを有し、動的アンサンブルは２００個の構造からなり、これは、α−ＨＡ6で用いた数（４０）より多いが、動的モデルファイルで用いる二峰性モデルおよび三峰性モデルの数がより多いためである。
トランスアンギオテンシンＩの構造計算の各ラウンドは４８０回のランを含み、リシノプリルで用いたランの回数（１００）よりも多いが、これはモデリングされる自由度の数がより多いからである。χ2 totalの最も小さい１５個のランを統計処理した。個々のランはそれぞれ最初に５０００回の繰り返しステップを有し、動的アンサンブルは２００個の構造からなり、これは、α−ＨＡ6で用いた数（４０）より多いが、動的モデルファイルで用いる二峰性モデルおよび三峰性モデルの数がより多いためである。
このペプチドで生じる困難の１つは、最初に立体化学的に不明瞭なプロトンが多いことから生じるものである。分子内の不斉中心の全てのプロトンの化学シフトが帰属されているものの、どのプロトンがｐｒｏＲまたはｐｒｏＳであるかの特定は収集したスペクトルの帰属からは簡単に決定されない。したがって、立体化学的に不明瞭なプロトンに固有且つ特異的な構造的制約（スカラーカップリングおよびＮＯＥデータの両方を含む）が解明され得る一方で、これらは不明瞭さが解消されるまで構造計算に含めることはできない。これらの立体中心の一部は、構造計算から得られる更に詳細な３Ｄの知見がなくとも、局所的ＮＯＥおよびスカラーカップリング定数を考慮することで容易に決定され得る：
１）Ｖａ１３ ＨＧ１*／ＨＧ２*：ＨＡとＨＢの間のカップリング定数は、ＨＡプロトンおよびＨＢプロトンが互いにトランスに強い傾向を有することを示しており、これは、一方のメチル基は平均してＴｙｒ４内のプロトンにより近く、他方は平均してＡｒｇ２により近いことを意味する。したがって、Ｖａｌ３の両メチル基に対するＴｙｒ４およびＡｒｇ２中のプロトンのＮＯＥ強度を比較することで、２個のメチル基を容易に立体特異的に帰属することができる。
２）Ｐｒｏ７ ＨＤ１／ＨＤ２：Ｐｒｏ７ ＨＡからどちらも固定された距離にある両ＨＤプロトンのＰｒｏ７ ＨＡプロトンに対するＮＯＥ強度を比較することで、２個のＨＤプロトンをすぐに立体特異的に帰属することができる。
１）Ｖａ１３ ＨＧ１*／ＨＧ２*：ＨＡとＨＢの間のカップリング定数は、ＨＡプロトンおよびＨＢプロトンが互いにトランスに強い傾向を有することを示しており、これは、一方のメチル基は平均してＴｙｒ４内のプロトンにより近く、他方は平均してＡｒｇ２により近いことを意味する。したがって、Ｖａｌ３の両メチル基に対するＴｙｒ４およびＡｒｇ２中のプロトンのＮＯＥ強度を比較することで、２個のメチル基を容易に立体特異的に帰属することができる。
２）Ｐｒｏ７ ＨＤ１／ＨＤ２：Ｐｒｏ７ ＨＡからどちらも固定された距離にある両ＨＤプロトンのＰｒｏ７ ＨＡプロトンに対するＮＯＥ強度を比較することで、２個のＨＤプロトンをすぐに立体特異的に帰属することができる。
スカラーカップリング、二面角、および水素結合の制約ファイル（付表Ｃ参照）は、信頼性が高く、構造計算の最初のラウンドからほとんど全体を使用した。２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセットの基本的なデータセット（１６７個のＮＯＥおよび４４個のｎｏＮＯＥの構造的制約）を最初の３０ラウンドの構造計算で確立し、その後、全ての残基の好ましいラマチャンドランプロット領域まで、構造を緩やかに収束させた。この時点での二次統計表は以下の通りである。
この場合、Ｃｈｉ／Ｒｅｓ値がデータセットと近いことが分かり、このことは、データセットのどれか１つが構造計算の結果に特に優勢ではないことを示している。実際、２Ｄ−ＮＯＥＳＹデータセットで観察された、より高い値は、相関時間が準最適値であるためおよび少ない数の繰り返しステップ（５，０００）で可能なコンフォメーション空間の探索が比較的不完全であるためと理解された。この時点で、このペプチドが全体的に拡張されたコンフォメーションをとっており、したがって、異方性モデルがより適していることが明確となった。アンギオテンシンＩの対称性トップモデルの垂直および平行の両方の相関時間の値範囲の探索から、１．２ｎｓ（垂直）および０．５ｎｓ（平行）が、相関時間が０．４ｎｓの最初の対称性モデルより２Ｄ−ＮＯＥＳＹデータに相当良好なχ2 datasetスコアを与えることが示され、これらを残りのラウンドの構造計算で用いた。また、構造を更に効果的に最適化できるように１０，０００回の繰り返しステップを用いた。
次の３０ラウンドの構造計算では、前述の不正確に解析されたアーティファクトなデータを除く繰り返し方法の後で、より多くのＮＯＥ構造的制約（合計２７７個）および多くのｎｏＮＯＥ構造的制約（合計２２５個）を含めた。この時点で、構造はとても良く収束した。二次統計表は以下の通りである。
このプロセスの間、構造がより解明されるにつれて、残りの立体化学的に不明瞭なプロトンを以下のように立体特異的に帰属することができるようになった。
１）Ｐｒｏ７ ＨＢ１／ＨＢ２：両Ｐｒｏ７ ＨＢプロトンに対するＰｈｅ８およびＩｌｅ５中のプロトンのＮＯＥ強度の比較から、これらの構造はプロリン環の一方の面がＰｈｅ８に面し、他方の面がＩｌｅ５に面していることを示していたため、２個のＨＢプロトンを容易に立体特異的に帰属することができた。
２）Ａｓｐ１ ＨＢ１／ＨＢ２、Ｉｌｅ５ ＨＧ１１／ＨＧ１２、Ｈｉｓ６ ＨＢ１／ＨＢ２、Ｌｅｕ１０ ＨＤ１*／ＨＤ２*：これらのプロトンは、同じデータで３２個の可能な組合せ全てに対して計算を何ラウンドも行い、χ2 totalのスコアを比較することで、立体特異的に帰属した。これらのラウンド間でχ2 totalにかなりの差があることから、Ｉｌｅ５ ＨＧ１*およびＨｉｓ６ ＨＢ*プロトンの立体特異的帰属の信頼性は非常に高く、Ａｓｐ１ ＨＢ*およびＬｅｕ１０ ＨＤ*プロトンの立体特異的帰属の信頼性は良好である。
１）Ｐｒｏ７ ＨＢ１／ＨＢ２：両Ｐｒｏ７ ＨＢプロトンに対するＰｈｅ８およびＩｌｅ５中のプロトンのＮＯＥ強度の比較から、これらの構造はプロリン環の一方の面がＰｈｅ８に面し、他方の面がＩｌｅ５に面していることを示していたため、２個のＨＢプロトンを容易に立体特異的に帰属することができた。
２）Ａｓｐ１ ＨＢ１／ＨＢ２、Ｉｌｅ５ ＨＧ１１／ＨＧ１２、Ｈｉｓ６ ＨＢ１／ＨＢ２、Ｌｅｕ１０ ＨＤ１*／ＨＤ２*：これらのプロトンは、同じデータで３２個の可能な組合せ全てに対して計算を何ラウンドも行い、χ2 totalのスコアを比較することで、立体特異的に帰属した。これらのラウンド間でχ2 totalにかなりの差があることから、Ｉｌｅ５ ＨＧ１*およびＨｉｓ６ ＨＢ*プロトンの立体特異的帰属の信頼性は非常に高く、Ａｓｐ１ ＨＢ*およびＬｅｕ１０ ＨＤ*プロトンの立体特異的帰属の信頼性は良好である。
次の１５ラウンドの構造計算では、２Ｄ［1Ｈ，1Ｈ］−ＮＯＥＳＹデータセットが完全に解析されるまで、残りのＮＯＥおよびｎｏＮＯＥ制約を含めた。この時点での二次統計表は以下の通りである。
これら１５ラウンドには前回のラウンドと比べて追加のデータ（２５０個の構造制約）を含めたが、最適化された動的構造はあまり変化しなかったので、動的構造は一次近似まで解明されたとみなした。
＜構造精密化＞
動的モデルファイルを用いて、アンギオテンシンＩの動的３Ｄ溶液構造を精密化した。動的モデルファイル中の変数の開始値は、上記最後のラウンドの結果からとった。これにより、最適化アルゴリズムでこの特定のχ2 total最小値を極めて効果的に調べることができた。アンサンブルサイズを大きくし、より多くの繰り返しステップを実施した。構造精密化後の二次統計表は以下の通りである。
動的モデルファイルを用いて、アンギオテンシンＩの動的３Ｄ溶液構造を精密化した。動的モデルファイル中の変数の開始値は、上記最後のラウンドの結果からとった。これにより、最適化アルゴリズムでこの特定のχ2 total最小値を極めて効果的に調べることができた。アンサンブルサイズを大きくし、より多くの繰り返しステップを実施した。構造精密化後の二次統計表は以下の通りである。
χ2 restraintの値が１０．０より大きい構造的制約が３個だけあり、全てＬｅｕ１０側鎖に関連している。このことは、この側鎖で計算された構造が何らかの理由でここでの実験データと幾分一致していないことを示している。この不一致は、Ｌｅｕ１０ ＨＢ*およびＨＧプロトンのスケーリング係数が良くないためである可能性が高く、このスケーリング係数は、Ｌｅｕ１０ ＨＢ*とＨＧの間の強い結合により線のブロード化が生じたために推定しなければならなかったものである。Ｌｅｕ１０側鎖の構造をより正確に決定するためには更なる実験データが必要である。全８０７個の構造的制約およびその個々のχ2ｒｅｓｔｒａｉｎｔ値の最終リストを付表Ｃに示す。アンギオテンシンＩの平均動的構造および構造の動的アンサンブルの複数の視覚的描写を図３０〜３１に示す。
［付表Ｃ−アンギオテンシンＩ］
＜アンギオテンシンＩの開始ＰＤＢ ３Ｄ座標＞
＜アンギオテンシンＩの開始ＰＤＢ ３Ｄ座標＞
＜アンギオテンシンＩの分子内座標の表＞
＜アンギオテンシンＩの構造的制約ファイル＞
１）２Ｄ−ＮＯＥＳＹ制約ファイル：［簡潔さのために、ここではヘッダーのみを示す。全３４３個のＮＯＥ制約および３８３個のｎｏＮＯＥ制約の全ては、以下のχ2 restraint値ファイルの中に非明示的に示されている。］
１）２Ｄ−ＮＯＥＳＹ制約ファイル：［簡潔さのために、ここではヘッダーのみを示す。全３４３個のＮＯＥ制約および３８３個のｎｏＮＯＥ制約の全ては、以下のχ2 restraint値ファイルの中に非明示的に示されている。］
２）スカラーカップリング制約ファイル：
３）二面角制約ファイル
４）水素結合制約ファイル
＜アンギオテンシンＩの最も良く最適化された動的構造についてのχ2 restraint値＞
生物活性コンフォメーションの予測
リガンド分子の生物活性コンフォメーションは、そのリガンドのタンパク質結合コンフォメーションであり、コンピュータ支援分子設計プロセス（これは製薬業界全体で新薬の開発に使用されている。）における有用性から強く探求されている。特に生物活性コンフォメーションの知見は、リード化合物（ｌｅａｄ）の最適化および同定に非常に重要である。通常、タンパク質は、水溶液中での全体の自由エネルギーが最小にとても近いコンフォメーションのリガンド分子に結合する［４５］。本発明に係る方法を用いて決定される水溶液中での平均的な動的３Ｄ構造は、この全体自由エネルギーが最小のコンフォメーションに等しい。したがって、本方法を用いて決定された分子の平均動的３Ｄ構造は、分子の生物活性コンフォメーションの予測に優れ、したがって、本方法はコンピュータ支援分子設計プロセスに相当有用である。以下の表３に示すのは、様々な種類の分子について、本方法を用いて決定した平均動的３Ｄ構造が正確に生物活性コンフォメーションを予測していることを示す複数の例である。
リガンド分子の生物活性コンフォメーションは、そのリガンドのタンパク質結合コンフォメーションであり、コンピュータ支援分子設計プロセス（これは製薬業界全体で新薬の開発に使用されている。）における有用性から強く探求されている。特に生物活性コンフォメーションの知見は、リード化合物（ｌｅａｄ）の最適化および同定に非常に重要である。通常、タンパク質は、水溶液中での全体の自由エネルギーが最小にとても近いコンフォメーションのリガンド分子に結合する［４５］。本発明に係る方法を用いて決定される水溶液中での平均的な動的３Ｄ構造は、この全体自由エネルギーが最小のコンフォメーションに等しい。したがって、本方法を用いて決定された分子の平均動的３Ｄ構造は、分子の生物活性コンフォメーションの予測に優れ、したがって、本方法はコンピュータ支援分子設計プロセスに相当有用である。以下の表３に示すのは、様々な種類の分子について、本方法を用いて決定した平均動的３Ｄ構造が正確に生物活性コンフォメーションを予測していることを示す複数の例である。
水溶液中の平均動的３Ｄ構造が生物活性コンフォメーションとほぼ同一であることで明らかに利益を受ける特定のコンピュータ支援分子設計技術は、リガンドベースのドラッグデザイン（Ｌｉｇａｎｄ−Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）である。
医薬品化学における合理性の向上
本発明の方法を用いて得られるリシノプリルおよびアンギオテンシンＩの動的３Ｄ構造の比較から、リシノプリルが天然リガンドのまたは生物活性コンフォメーションの形状および静電的特性を最適に模倣していない領域が明らかになった。
本発明の方法を用いて得られるリシノプリルおよびアンギオテンシンＩの動的３Ｄ構造の比較から、リシノプリルが天然リガンドのまたは生物活性コンフォメーションの形状および静電的特性を最適に模倣していない領域が明らかになった。
この以前には利用可能でなかった情報を用いることで、リシノプリルの化学構造の適切な修飾の選択を実現することが可能になり、これにより、結合エネルギーに不利であると認められたフレキシビリティーが除かれる。この３Ｄ動態情報がなければ、当業者にさえ、このような修飾の根本的理由は明らかではなかったであろう。
これらの示唆される修飾の１つ（架橋基を含める）は、スクリーニング、ＳＡＲ解析、および医薬品化学の繰り返し（ｉｎｔｅｒａｔｉｖｅ）ラウンドからなる従来の時間のかかるプロセスで独立して得られた次世代のＡＣＥ阻害剤ベナゼプリラートの構造的特徴を予想していた（図３２参照）。この結果から、本発明に従って作製された動的３Ｄ構造が医薬品化学者のリード化合物最適化の決定の大きな助けとなり得ることは明らかである。
Claims (62)
- 分子の３次元構造の集団を表すデータを生成するためのコンピュータ実行方法であって、前記分子が少なくとも１つの結合で連結された第一および第二の原子を含み、前記結合が関連角を有し、かつ前記角が変動して前記分子の３次元構造を複数生成し、前記方法が、
前記角の可変性を示すデータを含む、前記分子を表すデータを受け取ることと、
前記角が前記可変性に基づいて選択された関連値を有するように、構造の集団を生成することと、を含む方法。 - 分子の３次元構造の可変性をシミュレートするためのコンピュータ実行方法であって、前記分子が少なくとも１つの結合で連結された第一および第二の原子を含み、前記結合が関連角を有し、かつ前記角が変動して前記分子の３次元構造を複数生成し、前記方法が、
前記角の可変性を示すデータを含む、前記分子を表すデータを受け取ることと、
前記角の可変性を示す前記データに基づいて前記分子の３次元構造の可変性をシミュレートすることと、
前記角が前記シミュレートに基づいて選択された関連値を有するように、構造の集団を生成することと、を含む方法。 - 前記分子を表すデータが前記結合の平均角を示すデータをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記角の可変性を示すデータが前記平均角に関連するデータを含む、請求項３に記載の方法。
- 前記結合の可変性を示すデータが前記平均角の周りの角の分布を示すデータを含む、請求項４に記載の方法。
- 前記分布が確率分布である、請求項５に記載の方法。
- 前記角の確率分布が前記平均角の周りで対称である、請求項６に記載の方法。
- 前記結合の可変性を示すデータが前記平均角の周りの角のガウス分布である、請求項４に記載の方法。
- 前記分子を表すデータが、前記結合のさらなる平均角を示すさらなるデータをさらに含む、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記角の可変性を示すデータが、前記さらなる平均角に関連するさらなるデータを含む、請求項９に記載の方法。
- 前記結合の可変性を示すデータが、前記さらなる平均角の周りのさらなる角の確率分布を含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記角のさらなる確率分布が前記さらなる平均角の周りで対称である、請求項１１に記載の方法。
- 前記結合の可変性を示すデータが、前記さらなる平均角の周りのさらなる角のガウス分布である、請求項１０に記載の方法。
- 前記分子を表すデータが第一および第二の原子の化学的性質を示すデータを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記分子を表すデータが、第一および第二の原子の化学的性質に基づく前記結合の可変性を示すデータをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
- 前記結合の可変性を示すデータが、第一および第二の原子が二重共有結合、三重共有結合を介して連結しているとき、または第一および第二の原子が芳香環構造に組み込まれているときに結合の可変性がゼロであることを示すデータを含む、請求項１５に記載の方法。
- 前記結合の可変性を示すデータが、第一および第二の原子のうちの一方が水素原子またはハロゲン原子であるときに結合の可変性がゼロであることを示すデータを含む、請求項１５に記載の方法。
- 前記結合の可変性を示すデータが、第一および第二の原子が３員または４員の環構造に組み込まれているときに結合の可変性がゼロであることを示すデータを含む、請求項１５に記載の方法。
- 前記結合の可変性を示すデータが、第一および第二の原子が単一の共有結合を介して連結され、かつ、
ａ．第一および第二の原子のうちの一方が、二重または三重共有結合を介して第三の原子に連結するか、または
ｂ．第一および第二の原子が酸素原子であるとき、
結合の可変性がゼロではなく単峰性の結合角可変性を示すことを示すデータを含む、請求項１５に記載の方法。 - 前記結合の可変性を示すデータが、第一および第二の原子が５員または６員の飽和脂環構造に組み込まれているとき、結合の可変性がゼロではなく二峰性の結合角可変性を示すことを示すデータを含む、請求項１５に記載の方法。
- 前記結合の可変性を示すデータが、
ａ．第一および第二の原子が単一の共有結合を介して連結され、第一および第二の原子のうちの一方がｓｐ3混成であり、第一および第二の原子のうちの他方がｓｐ2混成であるか；または
ｂ．第一および第二の原子が単一の共有結合を介して連結され、かつ分子内で前記単一の共有結合が少なくとも一つのさらなる二重共有結合と共役するとき、
結合の可変性がゼロではなく二峰性の結合角可変性を示すことを示すデータを含む、請求項１５に記載の方法。 - 前記結合の可変性を示すデータが、第一および第二の原子が単一の共有結合を介して連結され、かつ：
ａ．第一および第二の原子の両方が四価でｓｐ3混成であるか；または
ｂ．第一および第二の原子のうちの一方がｓｐ3混成であり、かつ第一および第二の原子のうちの他方が酸素原子であるとき、
結合の可変性がゼロではなく三峰性の結合角可変性を示すことを示すデータを含む、請求項１５に記載の方法。 - 前記角が第一と第二の原子の間に規定される二面角である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、前記分子の３次元構造の前記生成された集団から少なくとも１の実験パラメータを予測することをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、前記少なくとも１の予測される実験パラメータの、少なくとも１の物理的実験に由来する少なくとも１のさらなるパラメータに対する比較をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
- 前記方法が、前記比較に基づいて一致関数を決定することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
- 前記方法が、
前記分子の３次元構造のさらなる集団を表すさらなるデータを生成すること；
前記分子の３次元構造の前記さらなる生成された集団から、少なくとも１のさらなる実験パラメータを予測すること；
前記少なくとも１のさらなる予測される実験パラメータを、少なくとも１の物理的実験に由来する前記少なくとも１のパラメータに対して比較すること；
少なくとも１のさらなる実験パラメータの、少なくとも１の物理的実験に由来する前記少なくとも１のパラメータに対する前記比較に基づいてさらなる一致関数を決定すること；および
最もよい一致関数を有する集団を示すデータを生成すること、をさらに含む、請求項２６に記載の方法。 - 前記方法が、前記さらなる集団を複数生成すること、および前記複数のさらなる集団から決定される最もよい一致関数を有する集団を選択することを含む、請求項２７に記載の方法。
- 前記方法が、前記分子の３次元構造の前記生成された集団から少なくとも２の実験パラメータを予測することをさらに含む、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、前記少なくとも２の予測される実験パラメータの、少なくとも２の物理的実験に由来する少なくとも２のさらなるパラメータに対する比較をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
- 前記少なくとも２の物理的実験が、異なる期間にわたって抽出された前記分子の３次元構造を示すデータを提供する、請求項３０に記載の方法。
- 前記少なくとも２の物理的実験が、前記分子の動きの異なる範囲にわたって抽出された前記分子の３次元構造を示すデータを提供する、請求項３０または３１に記載の方法。
- 前記予測される実験パラメータの少なくとも一つが、前記分子の３次元構造を示すＮＭＲデータに関連する、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＮＭＲデータが、スカラーカップリング、核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）、回転座標系ＮＯＥ（ＲＯＥ）、残留双極子カップリング（ＲＤＣ）、異核ＮＯＥ、およびＴ1緩和データから成る群より選択される、請求項３３に記載の方法。
- 前記物理的実験の少なくとも一つが１Ｄ ＮＭＲ分光法を含む、請求項２５または３０に記載の方法。
- 前記１Ｄ ＮＭＲ分光法が、［1Ｈ］−１Ｄ分光法、［13Ｃ］−１Ｄ分光法、［13Ｃ］−フィルター［1Ｈ］−１Ｄ分光法、［15Ｎ］−１Ｄ分光法および［15Ｎ］−フィルター［1Ｈ］−１Ｄ分光法から成る群より選択される、請求項３５に記載の方法。
- 前記物理的実験の少なくとも一つが２Ｄ ＮＭＲ分光法を含む、請求項２５または３０に記載の方法。
- 前記２Ｄ ＮＭＲ分光法が、［1Ｈ，1Ｈ］−ＤＱＦ−ＣＯＳＹ分光法、［1Ｈ，1Ｈ］−ＴＯＣＳＹ分光法、［1Ｈ，13Ｃ］−ＨＳＱＣ分光法、［1Ｈ，13Ｃ］−ＨＭＢＣ分光法および［1Ｈ，15Ｎ］−ＨＳＱＣ分光法から成る群より選択される、請求項３７に記載の方法。
- 前記分子が有機分子である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記分子がペプチド、炭水化物、抗生物質、核酸、脂質、代謝産物、薬物分子およびタンパク質から成る群より選択される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記分子がヒアルロナン、リシノプリルおよびアンギオテンシンＩから成る群より選択される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
- 分子の３次元構造の複数の集団から選択される分子の３次元構造の最適化された集団を表すデータを生成するための方法であって、各集団が請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法により生成される方法。
- 分子の３次元構造を示すＮＭＲデータを予測するための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法により生成された分子の３次元構造の集団の使用。
- 請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法を用いて生成された分子の３次元構造の集団を用いて、ＮＭＲデータを予測するための方法。
- 請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法を用いて分子の３次元構造の集団を生成することにより、分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための方法。
- 分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法により生成された分子の３次元構造の集団の使用。
- 請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法を用いた分子の３次元構造の集団の生成により、その目的とする標的に結合したときの分子のコンフォメーションをシミュレートするための方法。
- その目的とする標的に結合したときの分子のコンフォメーションをシミュレートするための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法により生成された分子の３次元構造の集団の使用。
- 請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法を用いたリガンド分子の３次元構造の集団の生成により、その目的とする標的に結合したときのリガンド分子のコンフォメーションをシミュレートするための方法。
- その目的とする標的に結合したときのリガンド分子のコンフォメーションをシミュレートするための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法により生成されたリガンド分子の３次元構造の集団の使用。
- 請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法を用いたペプチド分子の３次元構造の集団の生成により、ペプチド分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための方法。
- ペプチド分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法により生成されたペプチド分子の３次元構造の集団の使用。
- 請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法を用いた炭水化物分子の３次元構造の集団の生成により、炭水化物分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための方法。
- 炭水化物分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法により生成された炭水化物分子の３次元構造の集団の使用。
- 請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法を用いた薬物分子の３次元構造の集団の生成により、薬物分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための方法。
- 薬物分子の生物活性コンフォメーションをシミュレートするための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法により生成された薬物分子の３次元構造の集団の使用。
- 請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法を用いたペプチド分子の３次元構造の集団の生成による分子内の水素結合占有率をシミュレートするための方法。
- 分子の水素結合占有率をシミュレートするための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法により生成された分子の３次元構造の集団の使用。
- 分子の３次元構造の集団の生成に使用できるデータを保持するデータキャリアであって、前記分子が少なくとも１つの結合で連結した第一および第二の原子を含み、前記データが前記角の可変性を示すデータを含む前記分子を表すデータを含む、データキャリア。
- コンピュータに請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法を行わせるように構成されたコンピュータで読み取り可能な命令を保持するキャリア媒体。
- 分子の３次元構造の集団を表すデータを生成するためのコンピュータ装置であって、
前記装置が、プロセッサで読み取り可能な命令を記憶するメモリーと、前記メモリーに記憶された命令を読み取りかつ実行するために構成されたプロセッサと、を含み、
前記プロセッサで読み取り可能な命令は、前記プロセッサに請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法を行わせるように構成された命令を含む、装置。 - 化合物に関して得られたＮＭＲスペクトル由来の分子の３次元構造を示すＮＭＲデータを処理するためのコンピュータ実行方法であって、前記方法が、
ａ．前記スペクトル中の共鳴多重線成分に関する共鳴周波数νを決定すること；
ｂ．前記多重線スペクトルの最大高さの半分での固有共鳴線幅λよりも小さい共鳴周波数差（Δν）を有する前記ＮＭＲスペクトル中の共鳴多重線成分を同定すること；
ｃ．前記ＮＭＲスペクトルについて工程ｂ．で同定された多重線成分ｉのそれぞれの高さｈiを決定すること；
ｄ．各多重線について、以下のように広幅化因子ｂを決定すること：
ｆ．理想多重線構造が二重線の場合、各多重線成分についてスケーリング係数ｆiを以下のように決定し：
ｆi＝２・ｂ
かつ、１モル存在量での共鳴多重線成分ｉの高さＨiを以下のように決定すること：
Ｈi＝ｈi×ｆi
ｇ．理想多重線構造が三重線の場合、各外側多重線成分についてスケーリング係数ｆi(outer)を以下のように決定し：
ｆi(outer)＝４・ｂ
かつ、重複する内側多重線成分についてスケーリング係数ｆi(inner)を以下のように決定すること：
ｆi(inner)＝２・ｂ
ｈ．１モル存在量での共鳴多重線成分ｉの高さＨiを以下のように決定すること：
Ｈi(inner)＝ｈi(inner)×ｆi(inner)
Ｈi(outer)＝ｈi(outer)×ｆi(outer)
を含む、方法。
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