JP2010536835A - 核酸と直接的または間接的に会合するタンパク質因子の単離 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)標的核酸配列と、該標的核酸配列と会合している1つ以上のポリペプチドとを含むサンプルを入手するステップと、
(b)該サンプルと、該標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的でありハイブリダイズすることのできる配列を含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブとを接触させるステップと、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも1つのロックされた核酸(LNA)ヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも1つの親和性標識をさらに含み、
(c)該少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブと該標的核酸配列とがプローブ−標的ハイブリッドを形成できるように相互にハイブリダイズさせるステップと、
(d)該少なくとも1つの親和性標識に対して結合する分子を介して該プローブ−標的ハイブリッドを固定化することによって、該プローブ−標的ハイブリッドを該サンプルから単離するステップと、
(e)該標的核酸配列と会合している該1つ以上のポリペプチドを溶出させるステップとを含む方法を提供する。
(a)該真核細胞内のクロマチンの該特異的領域内に存在する標的核酸配列を同定するステップと、
(b)該特異的領域内に局在するDNA配列の少なくとも一部分と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ配列を構築するステップと、
(c)クロマチンの該特異的領域と会合している1つ以上のポリペプチドを単離できるように上述した方法において該オリゴヌクレオチドプローブを利用するステップと、
(d)クロマチンの該特異的領域と会合するポリペプチドを同定できるように該1つ以上の単離されたポリペプチドを分析するステップとを含む方法を提供する。
上述の方法にしたがって真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合すると同定されるポリペプチドを単離するステップと、
該単離されたポリペプチドを化合物のライブラリー由来の1つ以上の化合物と接触させるステップと、
該単離されたポリペプチドに結合してポリペプチドの活性を調節する化合物を後成的活性の調節因子であると同定するステップとを含む方法を提供する。
上述の方法にしたがって真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合すると同定されるポリペプチドを単離するステップと、
該ポリペプチドについての核酸配列を入手するステップと、
該ポリペプチドについての該核酸配列の全部もしくは一部に相補的であるアンチセンス核酸配列を生成するステップと、
該真核細胞内の該ポリペプチドの発現を減少させられるように該アンチセンス核酸配列を真核細胞内へ導入するステップと、
該ポリペプチドの該生物活性を決定できるように、該真核細胞の表現型を分析するステップとを含む方法を提供する。
このセクションで同定された酵素は、ALTテロメア維持経路が活性化されている患者における腫瘍学標的としての将来性を有することができ、そして非ALT、すなわち同一患者における非がん細胞に関するある程度の選択性を達成するためのメカニズムを提供することができる。
Pri−2
Hint2
MTA1
Pin−1
LSD1
これは、ヒトにおけるPRIM2Aとしても公知であるDNAプライマーゼの大きなサブユニット(58kDa、p58)である。このタンパク質は、小さなサブユニットであるp49の存在下では酵素的にのみ活性であると考えられる。
Hint2は、以前は機能が不明確であったアデノシンモノホスファート・リシンヒドロラーゼである。Martin et al.(Gastroenterology(2006)130:2179−2188)は、これが腫瘍学における潜在的薬物候補ではないことを示唆する多数の観察所見を報告したが、それはHint2レベルが肝細胞がん腫においてはダウンレギュレートされ、HepG2細胞におけるHint2のノックダウンはアポトーシス性刺激への感受性の低下をもたらすからである。同一系におけるHint2の過剰発現は逆作用を有し、HepG2異種移植片におけるHint2の過剰発現は腫瘍サイズの減少をもたらす。本出願に提示したデータは、Hint2のテロメア局在がその細胞機能において重要であることを示唆している。
MTA1は、ヌクレオソームのリモデリングおよび脱アセチル化(NuRD)複合体の構成要素であり、その発現は少なくとも一部にはc−Mycによって転写レベルで制御される(Zhang et al.,PNAS,2005,Vol.102,13968−13973)。MTA1は、さらにまたエストロゲン受容体コリプレッサーであることも公知である(Martin et al.,Breast Cancer Res Treat,2006,Vol.95,7−12)。MTA1は、HDAC1およびHDAC2を備える複合体内で作用する(Yao & Yang,J Biol Chem,2003,Vol.278,42560−42568)。
LSD1は、同定された最初のヒストンデメチーゼラであり(Shi et al.,Cell,2005,Vol.122,654−658)、ヒストンH3リシン4およびリシン9からモノメチルおよびジメチル修飾を選択的に取り除く。LSD1は、アンドロゲン受容体と相互作用してアンドロゲン受容体依存性転写を刺激する(Metzger et al.,Nature,2005,Vol.437,436−439)。LSD1レベルは、高リスクの前立腺がんではアップレギュレートされる(Kahl et al.,Cancer Res,2006,Vol.66,11341−11347)。LSD1は、細胞増殖のために必要とされ、このタンパク質の欠乏症は部分的細胞周期停止および外部刺激による増殖抑制への感作をもたらす(Scoumanne & Chen,J Biol Chem,2007,Vol.282,15471−15475)。これらの特徴は全部がLSD1を腫瘍学にとって魅力的な標的にさせる。これまでには報告されていないテロメアとの関連についての理由は、調査のための有益な領域を表している。
Pin−1は、多数の発がん経路および細胞シグナリング経路の異性化に含まれるペプチジルプロピルイソメラーゼである(He et al.,Lung Cancer,2007,Vol.56,51−58において精査されている)。Pin−1の過剰発現は非小細胞肺がん(He et al.,Lung Cancer,2007,Vol.56,51−58)、およびB型肝炎コーディングHBxがん遺伝子と相乗作用的に機能する可能性がある肝細胞がん(Pang et al.,Gastroenterology,2007,Vol.132,1088−1103)を含む多数のがんにおいて報告されてきた。Pin−1によるStat−3の活性化は、乳がん細胞における上皮細胞から間葉細胞への転移増加を引き起こす(Lufei et al.,Oncogene,2007,Jun 11、印刷出版に先行した電子出版)。マウスモデルでは、Pin−1およびp53の二重除去は胸腺肥大の加速をもたらす(Takahashi et al.,Oncogene,2007,Vol.26,3835−3845)。
一部のテロメア関連タンパク質は、HeLa細胞においてのみ検出され、ALT−陽性細胞系においては検出されなかった。これは、ALTテロメア維持系の使用が所定のタンパク質のテロメアへの局在化を誘導するだけではなく、これがさらにその他の会合も防止することを意味する可能性がある(HeLaテロメアは、テロメラーゼによって維持されるので、したがって例えばGAR1もしくはBAT1などのALTにおいて見いだされないテロメラーゼ会合タンパク質を予測することができる)。これは、さらにがんの療法における患者を階層化するためのメカニズムを提供できる。
Aurora B
USP1
AuroraキナーゼBは、内部セントロメアタンパク質およびスルビビンと複合体を形成する染色体パッセンジャータンパク質である(Sistayanarain et al.,Anticancer Res 2006,Vol.26,3585−3593によって精査された)。本発明者らのスクリーニング中に検出されたHeLa細胞におけるテロメアとの会合は、全く予想外である。異常なAurora Bの活性は、肺(Hayama et al.,Cancer Res,2007,Vol.67,4113−4122;Vischioni et al.,Mol Cancer Ther 2006,Vol.5,2905−2013)、口腔扁平上皮細胞がん(Qi et al.,Virchows Arch,2007,Vol.450,297−302)、乳がん(Tchatchou et al.,Cancer Lett,2007,Vol.247,266−272)、前立腺がん(Lee et al.,Cancer Res,2006,Vol.66,4996−5002)、神経膠芽細胞腫(Zeng et al.,J Clin Pathol,2007,Vol.60,218−221)および中皮腫(Lopez−Rios et al.,Cancer Res,2006,Vol.66,2670−2679)を含む多数のがんにおいて重要であると考えられる。腎腫瘍の動物モデルでは、Aurora Bの発現はエストロゲン応答性である(Hontz et al.,Cancer Res,2007,Vol.67,2957−2963)。
USP1は、モノ−ユビキチン化PCNAを脱ユビキチン化するシステインプロテアーゼである。モノ−ユビキチン化PCNAは、損傷したDNAの病巣内合成のために必要とされる。USP1の阻害は、この形態のタンパク質の蓄積をもたらす(Huang et al.,Nat Cell Biol 2006,Vol.8,339−347)。
所定のタンパク質は、ALTおよび非ALT細胞両方のテロメアと会合することが見いだされた。これは、これらの細胞条件のための所定の特異的タンパク質に加えて、病理−生理学的両方の状況においてテロメアと会合するより小さな群のタンパク質が存在する。以前にはテロメアと会合することが既知ではないタンパク質の選択は、以前には予測することのできなかった新規な治療介入点を示す可能性がある。
GMPシンターゼ
Fen1
USP7
PRMT1
転写中間因子1β
GMPシンターゼは、グルタミンおよびATPの存在下でGMPを形成するためのキサントシン5’−モノホスフェートのアミノ化を触媒するアミドペプチダーゼである(Nakamura et al.,JBC,1995,Vol.270,23450−23455)。このため、GMPシンターゼはグアニンヌクレオチドの新規合成における重要な酵素である。迅速に分割する細胞におけるヌクレオチドのための要件を前提にすると、ヌクレオチド合成経路における酵素は、創薬のための前途有望な標的となる可能性がある。最もよく知られていて臨床的に最も有用な例は、チミジル酸シンターゼ阻害剤である5−FUである。より近年には、GMPシンターゼは、キイロショウジョウバエにおいてUsp7(下記参照)と相互作用してヒストンH2B脱ユビキチン化を刺激することが証明されている(van der Knaap et al.,Mol Cell,2005,Vol.17,695−707)。
Fen1は、多ヌクレオチドDNA合成を含むロング・パッチベースの切除修復(Prasad et al.,J Biol Chem,2000,Vol.275,4460−4466)およびOkazakiフラグメント再生に関係する構造特異的フラップエンドヌクレアーゼである。この酵素はアニーリングしていない5’末端を備える基質を切断し、その活性はPCNAとの会合によって5〜50倍に増加する(Tom et al.,J Biol Chem,2000,Vol.275,10498−10505)。
USP7システインプロテアーゼは、大多数の哺乳動物細胞中に存在するPML(前骨髄球性白血病)核小体の成分である(Muratani et al.,Nat Cell Biol,2002,Vol.4,106−110)。USP7は、少なくとも2つのウイルスタンパク質であるHSVタイプのICPOおよびEBVのEBNA1の標的である(Holowaty et al.,J Biol Chem,2003,Vol.278,47753−47761)。EBNA1は、USP7のp53と同一領域へ結合するが、他方ICPOは相違する領域へ結合する。
PRMT1は、その標的にヒストンH4、GRIP1およびPPARγコアクチベーター1α(Lee et al.,Mol Endocrinol,2007,Vol.21,1381−1393において精査された)、DNAポリメラーゼβ(El−Andaloussi et al.,FASEB J,2007,Vol.21,26−34)およびRIP140(Mostaqul Huq et al.,EMBO J,2006,Vol.25,5094−5104)が含まれるアルギニンメチルトランスフェラーゼである。PRMT1は、hCAF1によって調節される(Robin−Lespinasse et al.,J Cell Sci,2007,Vol.120,638−647)。ヒストンH4メチル化は、エストロゲン受容体媒介性遺伝子調節における早期の重要な事象である(Wagner et al.,J Biol Chem,2006,Vol.281,27242−27250)。インターフェロンα/β−媒介性遺伝子転写の誘導は、さらにPRMT1の活性、この場合にはStat1によって作用することによって厳密に決定される(Mowan et al.,Cell,2001 Vol.104,731−741)。PRMT1の活性の阻害は、大規模に遺伝子発現に影響を及ぼす能力を有している。
TRIM28としても公知であるTIF−1βは、転写調節複合体の構成要素として同定されてきた(Friedman et al.,Genes Dev 1996,Vol.10,2067−2078;Moosmann et al.,Nucleic Acids Res 1996 Vol.24,4859−4867)。DNA自体に結合するとは考えられていないが、TRIM28はKRABリプレッサー(Kim et al.,Proc Natl Acad Sci USA,1996 Vol.93,15299−15304)、ヒストン結合タンパク質HP1、SETDB1(ESET)、およびp53の重要な調節因子であるMDM2(Wang et al.,Embo J 2005 Vol.24 3279−3290)を含む多種多様な各因子と相互作用することは公知である。
本発明者らは、標的遺伝子座でのタンパク質およびポリペプチドの同定を可能にする十分な純度で会合した結合因子を備えるクロマチンを単離する技術を考案した。例えば、哺乳動物クロマチン中に存在する中間反復エレメントと会合しているタンパク質が、質量分析法を用いて直接的に精製および同定されている。この技術をヒトテロメアに適用すると、低レベル発現を示すタンパク質を含めて、以前にテロメアに結合することが証明された全タンパク質の92%が同定された。以下の実施例では、HeLaテロメアがALTテロメアと比較され、ALTテロメアに特異的に結合する複数の因子が同定された。これによって、それらのテロメアの配列内の変化によって様々なタンパク質がクロマチンに結合すると推測される。
出発細胞はHeLa S3細胞(ヒトがん細胞系)であった。懸濁液から、スピナーフラスコ内の細胞(0.5〜1×106cells/mLの密度で20Lの培養)を室温で10分間、2,500gでの遠心分離によってペレット化し、その直後に架橋溶液(1010cellsに対して200mL;架橋溶液:3%ホルムアルデヒド/1×PBS(ホルムアルデヒド37%、メタノール安定化溶液から調製))中に再懸濁させた。付着性細胞については、媒質を最初に廃棄し、直ちにプレートへ架橋溶液を加えた(10mL/15cmプレート)。細胞は、室温で30分間にわたり架橋溶液中でインキュベートした。
次のステップは、出発点において単一の1.5mLアリコートのクロマチン鋳型調製物を参照しながら記載する。
DNA濃度(O.D.260):2〜2.5mg/mL
O.D.260/O.D.280=1.30〜1.45.
先行ステップにおいて得られた可溶化クロマチンサンプルは、室温の16,000gで15分間にわたり遠沈させた。約5mLのクロマチンサンプルを生じさせるためにアリコートを一緒にプールし、これに最終濃度0.02%(クロマチンサンプルの1/1,000の容量)まで20%SDSを加えた。
25℃で3分間
70℃で6分間
38℃で60分間
60℃で2分間
38℃で60分間
60℃で2分間
38℃で120分間
最終温度25℃
0.3Mスクロース;10mMのHEPES−NaOH(pH7.9);1%TritonX−100;3mMのCaCl2;2mMのMgOAc(酢酸マグネシウム)
25%グリセロール;10mMのHEPES−NaOH(pH7.9);0.1mMのEDTA;0.1mMのEGTA;5mMのMgOAc(酢酸マグネシウム)
プローブは、LNAおよびDNA残留物の混合物から構成され、長さ25ヌクレオチドであった。さらに、それらをそれらの5’末端でのデスチオビチンであるビオチンアナログで標識したが、この標識は典型的に長さ20〜95炭素原子からなる極めて長いスペーサー基によってプローブ配列に結合している。デスチオビオチンは、ビオチンに比較してより穏和な溶出条件を使用できるように、親和性標識として選択された。極めて長いスペーサーは相当に重要であるが、それはクロマチン固定化戦略が立体障害問題によって損なわれる可能性があるためである(例えば、Sandaltzopoulos R,Blank T,Becker PB.EMBO J.1994を参照されたい)。適切な極めて長いスペーサー技術は、Morocho et al.(Nucleos.Nucleot.Nuc.Acids.(2003)22(5−8):1439−41およびMethods Mol Biol.(2005);288:225−40)に記載されている。
5’ TtAgGgTtAgGgTtAgGgTtAgGgt 3’[配列番号1]
であった。
ランダム化/スクランブル化コントロールプローブ配列は、
5’ GaTgTgGaTgTggAtGtGgAtgTgg 3’[配列番号2]
であった。
このとき大文字はLNA残基を表し、小文字はDNA残基であった。オリゴヌクレオチドプローブを含有するデスチオビオチン化LNAは、Fidelity Systems社(米国メリーランド州ゲーサーズバーグ)による発注のために合成された。上記のプローブにおいて利用された分子スペーサーは、長さが108炭素原子であった。
プルダウンしたタンパク質はBis−Trisの12%アクリルアミドミニゲル(Invitrogen社)上に装填し、泳動用色素がゲルから抜け出るまで100Vで泳動した。次にこのゲルを、製造業者の取扱説明書にしたがってコロイダルブルー(Invitrogen社)により染色して固定した。15〜25のバンドを全レーンに沿って切り取った(全レーンを被覆する)。これらのサンプルは、分析およびタンパク質同定のためにTaplin Harvard質量分析施設(THMS)に提出された(例えば、http://gygi.med.harvard.edu/facility/#Introを参照。Taplin生物学質量分析施設、ハーバード医科大学、C棟517号室、ロングウッドアベニュー240、米国マサチューセッツ州ボストン02115)。
a.ゲルバンド/スポットのゲル内消化
b.マイクロキャピラリーLC/MS/MS分析
c.タンパク質データベース検索
これらの結果は、民間アクセスのウェブサイトデータベースの形態にあるTHMSによって提供される。
本発明の方法によって同定された候補が機能的に重要であることを証明する実験を実施した。ALT細胞系WI38 VA13は、COUP−TF2遺伝子を標的とする2つのshRNA構築体(SIGMA、Mission shRNAコレクション)を用いてトランスフェクトした。COUP−TF2は、実施例2における新規なクロマチン会合因子であると同定されたオーファン核受容体である(表2においてボールド体で表示した)。細胞は、トランスフェクトに成功していた細胞を同定するために緑色蛍光タンパク質構築体をコトランスフェクトした。トランスフェクションの96時間後、細胞を固定し、テロメアを検出するための抗rap1抗体(ウサギポリクローナルab4181、AbCam社)およびPML体を同定するための抗PML抗体(マウスモノクローナルPGM3、Santa Cruz社)を用いて二重染色した。局在化シグナルは、ロバ抗ウサギ−Cy3およびロバ抗マウス−Cy5ポリクローナル抗体(Jackson Labs社)により示された。
本実施例は、実施例1に記載したクロマチンフラグメントを調製するための代替方法を提供する。
Claims (40)
- 標的核酸配列と会合している1つ以上のポリペプチドを単離するための方法であって、
(a)標的核酸配列と、前記標的核酸配列と会合している1つ以上のポリペプチドとを含むサンプルを入手するステップと、
(b)前記サンプルと、前記標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的であり、ハイブリダイズすることのできる配列を含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを接触させるステップと、ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも1つのロックされた核酸(LNA)ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも1つの親和性標識をさらに含み、
(c)前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブおよび前記標的核酸配列がプローブ−標的ハイブリッドを形成できるように相互にハイブリダイズさせるステップと、
(d)前記少なくとも1つの親和性標識に対して結合する分子を介して前記プローブ−標的ハイブリッドを固定化することによって、前記プローブ−標的ハイブリッドを前記サンプルから単離するステップと、
(e)前記標的核酸配列と会合している前記1つ以上のポリペプチドを溶出させるステップと
を含む方法。 - 前記標的核酸配列は、真核細胞DNAを含む請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸配列は、RNAを含む請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸配列は、原核細胞DNAを含む請求項1に記載の方法。
- 前記真核細胞DNAは、哺乳動物DNAを含む請求項2に記載の方法。
- 前記標的核酸配列は、哺乳動物DNAに組み込まれたウイルス由来配列を含む請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸配列は、クロマチン内に含まれる請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸配列と会合している前記1つ以上のポリペプチドは、クロマチン会合ポリペプチドである、請求項7に記載の方法。
- 前記親和性標識は、ビオチンまたはそのアナログ、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノールおよび免疫タグからなる群から選択される請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ビオチンアナログは、デスチオビオチンである請求項9に記載の方法。
- 前記プローブ−標的ハイブリッドは、前記少なくとも1つの親和性標識に結合する分子を通して固定化され、前記分子は固体支持体に付着している請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記固体支持体は、マイクロビーズを含む請求項11に記載の方法。
- 前記マイクロビーズは、溶液から磁気的に分離することができる請求項12に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブ配列は、複数のLNAヌクレオチドを含む請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブは、約50%のLNAヌクレオチド残基を含む請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記親和性標識は、約40〜約170原子、より適切には約70〜約130原子、より典型的には約90〜約120原子、適切には約100〜約110原子を有するスペーサー基によってオリゴヌクレオチドプローブに共役結合している請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸配列と会合している前記1つ以上のポリペプチドは、前記サンプルを前記オリゴヌクレオチドプローブに曝露するステップの前に、前記1つ以上のポリペプチドの架橋結合を生じる条件に曝露され、次いで前記架橋結合ステップは、前記1つ以上のポリペプチドを溶出するステップの前に脱架橋される請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- (f)前記1つ以上のポリペプチドの同一性を決定するために、前記溶出された1つ以上のポリペプチドを分析するステップをさらに含む請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分析は、質量分析法を含む請求項18に記載の方法。
- 以下に規定する一般式I:
- 前記ハプテンは、ビオチンまたはそのアナログ、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、およびジニトロフェノールからなる群から選択される請求項20に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記親和性標識は、スペーサー基によってオリゴヌクレオチドプローブへ共役結合し、nは約40〜約170原子、より適切には約70〜約130原子、より典型的には約90〜約120原子、適切には約100〜約110原子である請求項20に記載のプローブ。
- 前記ビオチンアナログは、デスチオビオチンである請求項21に記載のプローブ。
- 以下に規定する一般式II:
- 前記ヌクレオチドの少なくとも25%は、ロックされた核酸ヌクレオチドである請求項24に記載のプローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも25ヌクレオチドであり、およそ50%のLNAおよび50%のヌクレオチドを含んでいる請求項24または25に記載のプローブ。
- 前記親和性標識は、スペーサー基によってオリゴヌクレオチドプローブへ共役結合し、nは約40〜約170原子、より適切には約70〜約130原子、より典型的には約90〜約120原子、適切には約100〜約110原子である、請求項24〜26のいずれか1項に記載のプローブ。
- 前記スペーサー基は、前記オリゴヌクレオチドプローブの5’ヌクレオチドに結合されている請求項24〜27のいずれか1項に記載のプローブ。
- 以下に規定する一般式III:
- 前記親和性標識は、ビオチンまたはそのアナログ(例えばデスチオビオチンなど)、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、および/またはジニトロフェノールから選択される請求項29に記載のプローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブは、一般式IIIの基を含み、式中、ヌクレオチドZが前記オリゴヌクレオチドプローブ内の5’ヌクレオチドを表す請求項29または30に記載のプローブ。
- 真核細胞のゲノム内のクロマチンの特異的領域と会合するポリペプチドを同定する方法であって、
(a)前記真核細胞内のクロマチンの前記特異的領域内に存在する標的核酸配列を同定するステップと、
(b)前記特異的領域内に局在するDNA配列の少なくとも一部分と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ配列を構築するステップと、
(c)クロマチンの前記特異的領域と会合している1つ以上のポリペプチドを単離するために、請求項1に記載の方法における前記オリゴヌクレオチドプローブを利用するステップと、
(d)クロマチンの前記特異的領域と会合するポリペプチドを同定するために、前記1つ以上の単離されたポリペプチドを分析するステップと
を含む方法。 - クロマチンの前記特異的領域は、テロメア、セントロメア、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、遺伝子、反復配列、異種挿入配列および組み込まれたウイルスゲノムからなる群から選択される領域の1つ以上を含む、請求項32に記載の方法。
- クロマチンの特異的領域と会合する前記ポリペプチドは、酵素活性についてさらにスクリーニングされる、請求項32または33に記載の方法。
- クロマチンの特異的領域と会合する前記ポリペプチドは、薬物標的として同定される請求項32〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 後成的活性の調節因子についてのスクリーニング法であって、
請求項32〜35のいずれか1項に記載の方法にしたがって、真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合するものとして同定されたポリペプチドを単離するステップと、
前記単離されたポリペプチドを化合物のライブラリー由来の1つ以上の化合物と接触させるステップと、
前記単離されたポリペプチドに結合して前記単離されたポリペプチドの活性を調節する化合物を後成的活性の調節因子として同定するステップと
を含む方法。 - 前記単離されたポリペプチドは、Hint2、GMPシンターゼ、Pri2、Fen1、USP7、PRMT1、Pin−1、オーロラキナーゼB、USP1およびMTA1からなる群から選択される請求項36に記載の方法。
- ポリペプチドの生物活性を特性付ける方法であって:
請求項32〜35のいずれか1項に記載の方法にしたがって真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合するものとして同定されたポリペプチドを単離するステップと、
前記ポリペプチドについての核酸配列を入手するステップと、
前記ポリペプチドについての前記核酸配列の全部もしくは一部に相補的であるアンチセンス核酸配列を生成するステップと、
前記真核細胞内の前記ポリペプチドの発現を減少させるために、前記アンチセンス核酸配列を真核細胞内へ導入するステップと、
前記ポリペプチドの前記生物活性を決定するために、前記真核細胞の表現型を分析するステップと、を含む方法。 - 前記アンチセンス核酸配列は、siRNAオリゴヌクレオチドを含む請求項38に記載の方法。
- 前記真核細胞は、哺乳動物である請求項36〜39のいずれか1項に記載の方法。
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