JP2010533850A - 結腸直腸癌のインビトロ診断のためのアミノアシラーゼ1・アッセイ方法 - Google Patents
結腸直腸癌のインビトロ診断のためのアミノアシラーゼ1・アッセイ方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
・このテストの主な欠点は、あまり良くない感受性であり、それは最もアデノーマ(前癌の形成異常病変)で顕著であり、そのサイズが大きい場合は、10のうち1の場合で癌の進行に結果としてなる。
・また、このテストはあまり特異的でない。糞便中の血液の出現は、潰瘍性大腸炎、痔核、瘻などの非腫瘍症状に関連する可能性がある。この場合、結腸鏡検査法による検査を行わなければならないが、以下に記載されている欠点を伴う。
・最後に、Hemoccult(登録商標)テストは解釈するのが困難である;従って、それらは資格のある適格なスタッフによって、専門施設で調べられなければならない。
CEAはフォローアップのために使われている。それは、感受性と特異性が不十分であるので、結腸直腸癌のスクリーニングに、又は早期診断のために使用できない。これは、このマーカーが他の種類の癌によって及び良性病変において発現されるためである。いろいろあるけれども、CEAと他の腫瘍マーカー(例えばCA19-9またはCA72-4)を組合わせることによって、特異性を失うことなしに感受性を増すことが可能である。
・Colopath(登録商標)/ColorectAlertMD(Ambriliaによって市販されている)は、CRCのための迅速で、比較的非侵襲的スクリーニングテストである。Colopath(登録商標)は結腸直腸の病的状態をもつ個体の直腸の粘液のプラスマローゲン(リン脂質の部分である複合脂質のクラス)を検出し、ColorectAlertMDは直腸の粘液のT抗原、複合糖類を検出する。Colopath(登録商標)/ColorectAlertMDテストは試験片に直腸の粘液の塗布することを含み、陽性または陰性の結果はシッフ反応に基づく。Ambriliaは1787個体を研究して、Colopath(登録商標)/ColorectAlertMDは早期ステージ結腸直腸癌の54%のケース及び全ステージを合わせて49%を検出することを証明した。
・COLARIS(Myriad Geneticsによって市販されている)は、血液で、遺伝性非腺腫性大腸癌(HNPCC症候群)をスクリーニングするためにMLH1及びMSH2遺伝子の突然変異を検出するテストである。試験の結果は3週で入手できる。Myriadは現在利用可能な最も感受性があり及び最も特異的なシークエンシング技術を使用する。当該テストは、高価である。
・DR-70(登録商標)(AMDLによって市販されている)は、様々な種類の癌(肺、結腸、胸部、肝臓、胃、その他)を検査するテストである。従って、CRCに特異的でない。当該テストの原理は、二重サンドイッチELISA技術(DR-70抗原の分析)に基づく。検出は、酵素反応(ビオチンとストレプトアビジンに結合する抗体)によって実施される。着色した反応は、癌の存在を示す。
したがって、本発明の第1の目的は結腸直腸癌を有することが疑われる患者から採取された生物試料、好ましくは腫瘍から離れた生物試料のアミノアシラーゼ1の存在を決定することによる結腸直腸癌のインビトロ診断のための方法である。
また、本発明は、結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療、予後診断、及び再発診断の両方のための当該方法の使用に関する。
「結腸腫瘍による放出」なる表現は、機構を問わず、腫瘍細胞自身による、又は腫瘍の進行から生じている細胞表現型の病変または変化に続く隣接非腫瘍細胞による腫瘍マーカーの能動的または受動的な分泌、放出を意味することを目的とする。
「本発明の方法が実施される生物試料」なる表現は、興味がある腫瘍マーカーを含む可能性がある任意の生物試料を意味することを目的とする。腫瘍から離れていない生物試料の例として、腫瘍、この腫瘍の生検、リンパ節または患者の転移ガンに由来する組織のような固体試料、及びこれらの固体試料から精製された細胞を挙げることができる。腫瘍から離れた生物試料の例として、全血またはその派生物(例えば、血清または血漿、尿、唾液と滲出液、骨髄と糞便)のような体液及びこれらの体液から精製された細胞を挙げることができる。血液またはその派生物、更には糞便、滲出液及びこれらの液体試料から精製された細胞が好ましい。
− グループA:白血球エラスターゼ・インヒビター、エズリン、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質AI、アポリポタンパク質AII及びI-プラスチン、これらのマーカーのいくつかは本出願人によって同定された新規マーカーである、
− グループB:付加的な診断の興味を有するマーカー、すなわち:β2-ミクログロブリン、プロテアソーム20S、ガレクチン-3、L-乳酸脱水素酵素B鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質3α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー1、II型ケラチンCytoskeletal8、I型ケラチンCytoskeletal18、I型ケラチンCytoskeletal19、上皮カドヘリン、CEA、ビリン、CA19-9、CA242、CA50、CA72-2、テストステロン、TIMP-1、Cripto-1、インテレクチン-1、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サイトケラチン20、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、(プロ)デフェンシン-A5、メチル化プロフィールについて特異的な修正を有する血液のDNA断片の検出、例えばAXL4遺伝子のメチル化DNA(aristaless様ホメオボックス4遺伝子メチル化)またはセプチン-9遺伝子のメチル化DNA、糞便DNA断片の特異的な修正の検出、例えば糞便DNAの特異的な変異、糞便DNAのメチル化プロフィールの特異的な修正、ヒト糞便のヘモグロビンの検出。
ビリンは、特許出願FR2581456において、結腸直腸癌の診断のための血液マーカーとして記載された。
正常な患者で決定される基準値と比較して、グループBから選択される腫瘍マーカーの濃度は、考慮されるマーカーに応じて、本発明の方法が実施される生物試料において増減される。
好ましくは、グループBの腫瘍マーカーは、マーカー:β2-ミクログロブリン、プロテアソーム20S、ガレクチン-3、L-乳酸脱水素酵素B鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質3α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー1、上皮カドヘリン、CEA、CA19-9、テストステロン、TIMP-1、インテレクチン-1、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サイトケラチン20、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、(プロ)デフェンシン-A5、及びヒト糞便のヘモグロビンの検出から選択される。
上記のように、興味がある腫瘍マーカーは、タンパク質の形態で、またはメッセンジャーRNAの形態で、または対応するDNAの修正(突然変異またはメチル化の修飾)によって検出される。
生物試料において、興味がある「タンパク質」腫瘍マーカーの存在の決定は、当業者に知られている試料におけるタンパク質の存在を決定する任意の方法、例えばイムノアッセイを含む生化学検査によって、または質量分析法によって行われることができる。
生化学検査は、分子相互作用、すなわち前記腫瘍マーカーと前記腫瘍マーカーに特異的あるいは非特異的な一つ以上の結合性パートナーとの間の反応を含む当該分野の当業者に知られている任意のテストであってもよい。
好ましくは、生化学検査は、当業者に知られているイムノアッセイであり、腫瘍マーカー間の免疫反応を含み、それは抗原と一つ以上の特異的な結合性パートナー、すなわち、この抗原に向かう抗体である。
第1に、動物(通常はマウス)は興味がある腫瘍マーカーによって免疫化され、それにより前記動物のBリンパ球は前記抗原に対して抗体を生じることができる。続いて、これらの抗体産生リンパ球を、「不死の」ミエローマ(例えばマウス)と融合させ、それによりハイブリドーマを産生する。次に、このように得られる細胞の異種混合物を使用して、特定の抗体を産生し、際限なく増殖することができる細胞の選抜を実施する。各々のハイブリドーマは、クローンの形で繁殖し、例えばELISAによって、一次元あるいは二次元のウエスタンブロットによって、免疫蛍光法によって、またはバイオセンサーによって、前記腫瘍マーカーに関する認識特性が試験されてもよいモノクローナル抗体の産生に結果としてなる。特に、上で記載されているアフィニティークロマトグラフィ技術によれば、このように選択されたモノクローナル抗体は続いて精製される。
また、モノクローナル抗体は、当業者によく知られている技術によって、遺伝子工学によって得られた組換え抗体であってもよい。
抗-エズリン抗体の例は知られており、特にAbcamカタログの抗-エズリン・モノクローナル抗体のクローン3C12(Cat.No.Ab4069)及びウサギ抗-エズリン・ポリクローナル抗体(Cat.No.Ab47418)が入手できる。
抗-アミノアシラーゼ1抗体の例は知られており、特にAbnovaカタログの抗-アミノアシラーゼ1モノクローナル抗体のクローン4F1-B7(Cat.No.H00000095-M01)及びAbcamカタログのチキン抗-アミノアシラーゼ1ポリクローナル抗体(Cat.No.Ab26173)が入手できる。
抗-肝臓脂肪酸結合タンパク質抗体の例は知られており、特にAbcamカタログの抗-L-FABPモノクローナル抗体のクローン6B6(Cat.No.Ab10059)及びウサギ抗-L-FABPポリクローナル抗体(Cat.No.Ab7807)が入手できる。
抗-腸脂肪酸結合タンパク質抗体の例は知られており、特にR&Dシステムカタログの抗-I-FABPモノクローナル抗体のクローン323701(Cat.No.MAB3078)及びAbcamカタログのウサギ抗-I-FABPポリクローナル抗体(Cat.No.Ab7805)が入手できる。
抗-アポリポタンパク質AI抗体の例は知られており、特にBiodesign Meridian Life Sciencesカタログの抗-Apo AIモノクローナル抗体のクローン4A90(Cat.No.H45402M)及びヤギ抗-Apo AIポリクローナル抗体(Cat.No.K45252P)が入手できる。
抗-アポリポタンパクAII抗体の例は知られており、特にUS Biologicalカタログの抗-Apo AIIモノクローナル抗体のクローン1402(Cat.No.A2299-31C)及び特にBiodesign Meridian Life Sciencesカタログのヤギ抗-Apo AIIポリクローナル抗体(Cat.No.K74001P)が入手できる。
抗-I-プラスチン・ポリクローナル抗体の例は知られており、特にサンタクルスバイオテクノロジーカタログにおいて入手できる。ウサギ・ポリクローナル抗体H-300(Cat.No.sc-28531)はI-プラスチン、L-プラスチン及びT-プラスチンと反応する。出願人はI-プラスチンに向かうモノクローナル抗体を開発した。
抗-β2-ミクログロブリン抗体、抗-CEA抗体、抗-CA19-9抗体及び抗テストステロン抗体の例が知られており、特に出願人のアッセイキット、それぞれVidas(登録商標)β2-ミクログロブリン、Vidas(登録商標)CEA、Vidas(登録商標)CA19-9TM及びVidas(登録商標)テストステロンが使用される。
抗プロテアソーム20Sの抗体の例は知られており、親和性研究用製品カタログにおいて特に入手できる。
抗-ガレクチン-3抗体、抗-L-乳酸脱水素酵素B鎖抗体、抗-カルレティキュリン抗体、抗腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー1抗体、抗-II型ケラチンCytoskeletal8抗体、抗-I型ケラチンCytoskeletal18抗体、抗-I型ケラチンCytoskeletal19抗体、抗-上皮カドヘリン抗体、抗-ビリン抗体及び抗-TIMP-1抗体は知られており、特にAbcamカタログにおいて入手できる。
抗-再生膵島由来タンパク質3α抗体の例は知られており、特にDynabioアッセイキット(La Gaude、フランス)が使われる。
抗-CA242抗体、抗-CA50抗体及び抗-CA72-4抗体の例が知られており、特にFujirebioカタログにおいて入手できる。
抗-インテレクチン-1抗体の例は知られており、アレクシス・バイオケミカルズ・カタログの抗-インテレクチン-1モノクローナル抗体のクローンSaly-1(Cat.No.ALX-804-850-C100)及びウサギ抗-インテレクチン-1ポリクローナル抗体(Cat.No.ALX-210-941)が入手できる。
抗タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ抗体の例は知られており、特にAbcamカタログの抗-PDIモノクローナル抗体のクローンRL77(Cat.No.Ab5484)及びウサギ抗-PDIポリクローナル抗体(Cat.No.Ab3672)が入手できる。
抗-サイトケラチン20抗体の例は知られており、特にAbcamカタログにおいて、抗-サイトケラチン20モノクローナル抗体のクローンKs20.8(Cat.No.Ab962)及びウサギ抗-サイトケラチン20ポリクローナル抗体(Cat.No.Ab36756)が入手できる。
抗-TCTP抗体の例は知られており、特にAbnovaカタログにおいて、抗-TCTPモノクローナル抗体のクローン3C7(No.157H00007178-M01)及び抗-TCTPポリクローナル抗体(Cat.No.157H00007178-A01)が入手できる。
抗-デフェンシン-A5抗体の例は知られており、特にサンタクルス生物工学カタログにおいて、抗-デフェンシン-A5モノクローナル抗体のクローン8C8(Cat.No.sc-53997)及びAlpha Diagnosis International 社カタログのウサギ抗-デフェンシン-A5ポリクローナル抗体(Cat.No.HDEFA51-A)が入手できる。
免疫反応、すなわち腫瘍マーカー/結合性パートナー結合の視覚化は、検出(例えば直接的または間接的な方法)の任意の方法によって実施されてもよい。
直接的検出、すなわち標識の包含なしの場合、免疫反応は、例えば表面プラスモン共鳴によって、または導電性ポリマーを有する電極上のサイクリックボルタンメトリーによって観察される。
間接的検出は、関心のある腫瘍マーカー自身の又は「検出試薬」結合パートナーのどちらかの標識によって実施される。後者の場合は、これは競合方法として記載されている。
「標識化」なる表現は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じることができる標識試薬の付加を意味することを目的とする。
・比色法、蛍光または発光によって検出可能なシグナルを生じる酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼまたはグルコース‐6‐リン酸デヒドロゲナーゼ;
・蛍光または発光化合物、染料のような発色団;
・32P、35Sまたは125Iのような放射性分子、及び
・アレクサまたはフィコシアニンのような蛍光分子
を含む。
これらの間接的な検出システムは、特定の条件下でシグナルの増幅を生じることができる。このシグナル増幅技術は当業者にとって周知であり、本出願人により先の特許出願FR98/10084またはWO-A-95/08000又はChevalier等(文献59)の論文を参照することができる。
使用する標識の種類に応じて、当業者は、標識を視覚化することを可能にする試薬を添加する。
また、質量分析法が、体液において、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを検出するために使用されてもよい。スペクトロメトリーの原理は、当業者に広く知られており、例えばPatterson,S(文献60)に記載されている。
これを行うため、生物試料(前処理されていても、いなくでもよい)は質量分析計に通され、得られたスペクトルは本発明の方法で求められる腫瘍マーカーのそれと比較される。試料の前処理の例は、それを本発明の方法で求められる腫瘍マーカーのための結合パートナーのうちの一つ、例えば本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに向かう抗体、を含む免疫捕捉支持体の上に通すことを含む。試料の前処理の他の例は、試料のタンパク質類を互いに分離するための、生物試料の前分画であってもよい。当業者によく知られている技術において、試料中の優勢なタンパク質は、例えば、まず第一に除去されてもよい。
このアプローチの技術的な実現可能性は、非常に大量のタンパク質の免疫除去後、血漿中濃度が100ng/mlのほどオーダーのタンパク質を検出することに成功したAnderson及びHunter(文献61)によって、最近証明された。
生物試料において、興味がある「mRNA」腫瘍マーカーの存在の決定は、試料中のmRNAの存在を決定する任意の方法、すなわちmRNAの直接的検出またはmRNAの間接的検出、または試料中のmRNAの存在を決定する任意の方法であって当業者に知られている方法によって、実施されてもよい。
「mRNAの直接的検出」なる表現は、生物試料においてmRNA自体を証明することを意味することを目的とする。
生物試料のmRNAの直接的検出は、例えば好ましくはPCRまたはNASBA技術によって増幅後、mRNAに特異的な結合パートナーとのハイブリダイゼーションによって、当業者に知られている任意手段によって実施されてもよい。
ストリンジェンシーは、2つのヌクレオチド断片の塩基組成の観点から、加えて2つのヌクレオチド断片間のミスマッチの程度によって、特に定められる。また、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質と濃度及び/又はハイブリダイゼーション温度のような反応パラメーターに依存する。全てのこれらのデータは知られており、当業者は適切な条件を決定することができる。一般に、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイズすることが求められるヌクレオチド断片の長さに応じて、約0.5から1Mの濃度の食塩水中で、約20と70℃との間、特に35と65℃との間にある。mRNAに特異的であるかまたは特異的でない結合パートナーは、このmRNAに結合できる任意のパートナーである。例えば、核酸プローブ、増幅プライマー及びこのmRNAに結合できる他の任意の分子を挙げることが出来る。
この増幅反応は当業者にとって周知であり、以下の技術を特に挙げることができる:
−US特許第4683195号、US4683202、及びUS4800159に記載されている、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)
−特許出願WO91/02818の、NASBA(核酸配列に基づいた増幅)、及び
−US特許第5399491号の、TMA(転写媒介増幅)。
特に、多数のプローブを固定することができるバイオチップを、支持体として使用してもよい。支持体へのプローブの固定もまた当業者に知られており、直接移動、マイクロ蒸着、インサイツ合成及びフォトリソグラフィーによるプローブの配置を挙げることができる。
生物試料において、興味がある腫瘍マーカーをコードする遺伝子における、DNA修飾又は変異の証明は、試料中におけるDNA修正を決定する任意の方法、すなわち突然変異の直接的検出、又は興味のある遺伝子座のメチル化プロフィールの修正の証明、又は試料中のDNA修正を決定するための、当業者に知られている他の任意の方法によって実施されてもよい。
突然変異を証明するためのストラテジーは、分子生物学的技術に基づいており、DNA抽出、PCR又は他の増幅技術による増幅、ハイブリダイゼーションおよび/またはシークエンシング工程を含む。結腸直腸癌の場合、以下の方法は、糞便DNAの突然変異を検出するために成功裏に使用される:沈殿によるDNA濃縮、磁気ビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチドを使用した標的の濃縮、興味がある遺伝子のPCR増幅、点突然変異を同定するための固相シークエンシング(文献64)。欠失は、予想される基準断片と変異した断片のサイズの違いに関して同定された。Imperiale等(文献64)は、K-ras、APCとp53遺伝子に位置する21突然変異のパネルを記載しており、それは浸潤性の癌の16/31を検出することを可能にする。
前述のように、DNA修正は、また、興味がある腫瘍マーカーに対応する遺伝子のメチル化プロフィールの修飾に相当してもよい。メチル化プロフィールの修飾は、低メチル化(メチル化の数が減少する)にまたはハイパー・メチル化(メチル化の数が増加する)に相当してもよい。修正された部分は、興味のある腫瘍マーカーの遺伝子のコード部分に、又は転写プロモーター領域又は転写終止領域のような5’及び3’非コード部分に位置していてもよい。
本発明の方法において、少なくとも2つのマーカーを検出する場合、それらは、例えば異なるイムノアッセイ測定を使用して別々に、あるいはマルチプレックスアッセイにおいて同時に証明されてもよい。
本発明の方法において、異なる性質の2つのマーカー、例えばタンパク質マーカー及びmRNAマーカーが検出される場合、上記の方法から選択される2つの異なる検出方法が使用されてもよい。特許出願WO03/104490に記載したように、それらは同じ検出媒質で、同じ反応条件下で、同時に検出されてもよい。この特許出願に記載されている検出方法の工程は、少なくとも1つの核酸および少なくとも1つの異なる性質の他のリガンドからなる標的分析物を含む試料中のハイブリダイゼーションと免疫反応を同時に検出することを含んでなり:
(i)反応バッファーで希釈された試料の既知の体積量を、前記標的分析物についての捕捉パートナーであって、少なくとも一つの核酸プローブ及び少なくとも1つの抗リガンドを含む前記捕捉パートナーでプレコートした捕捉表面上に置くこと、
(ii)15℃と60℃との間の温度で反応させること、および
(iii)このようにして得られたハイブリダイゼーションと免疫反応を明視化することを含む。
生物試料は、特別な処理を必要としてもよい。なぜなら、それは、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを含んでいるか、あるいは本発明の方法で求められるマーカーを含む循環腫瘍細胞および/または本発明の方法で求められるマーカーを分泌することができる循環腫瘍細胞を含んでいる可能性があるためである。
したがって、本発明のある実施形態によれば、生物試料は、前記液体に含まれる循環腫瘍細胞を分離するために前処理される。
「循環腫瘍細胞を分離する」なる表現は、循環腫瘍細胞が濃縮された細胞分画を得ることを意味することを目的とする。
循環腫瘍細胞を分離するための生物試料の処理は、フロー・サイトメーターの細胞選別によって、フィコール上の濃縮によって、特異的抗体で覆われた磁気ビーズによる濃縮によって、または当業者に知られている特異的な濃縮法の任意の方法によって実行されうる。
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、次にサイトスピンによってスライド上に循環腫瘍細胞を付着させた後に、例えば本発明の方法で求められる腫瘍マーカーに対する抗体により、これらの細胞の免疫細胞化学的な標識化することによって、生物試料から分離される循環腫瘍細胞を使用して直接的に行うことができる。本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、また、Metezeau等(文献69)に記載されているフローサイトメトリー法を使用して、循環腫瘍細胞において、直接的に実施されてもよい。
これらの条件下では、前記循環細胞は、本発明の方法で求められる腫瘍マーカーを前記細胞内部で遮断することを可能にする条件で処理されることができる。このような処理は、Mathieu等(文献70)によって記載されている。
本発明の方法で求められる腫瘍マーカーの検出は、本発明の方法で求められるマーカーのための結合パートナー特異的な侵入を可能にするために細胞膜を透過可能にようにした後に行われる。
(i)前記細胞の量を前記腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの結合性パートナーが取り付けられた培養表面の底に置くこと、
(ii)前記腫瘍マーカーが放出又は分泌されるような条件下で前記細胞を培養し、培養表面の底に免疫的に捕捉すること、
(iii)洗浄によって細胞を取り除くこと、
(iv)前記腫瘍マーカーに特異的な少なくとも一つの標識されたコンジュゲートを加えること、および
(v)このように得られた標識を明視化すること
を含む。
腫瘍マーカーの放出または発現のための培養条件は、37℃、湿潤雰囲気下及び5%CO2のような通常の条件である。
また、生物試料が固体試料である場合、腫瘍マーカーの存在は、腫瘍のインビボ、インサイツで証明されてもよい。
インビボの腫瘍において腫瘍マーカーの存在を示すために、当業者に知られている任意のイメージング方法が使用されてもよい。このために、前記腫瘍マーカーの結合パートナーは、イメージング・トレーサーに結合されてもよい。
「結合パートナーをイメージング・トレーサーに結合させる」なる用語は、当業者に知られている任意のイメージング方法によって検出され、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じることができるトレーサーの付加を意味することを目的とする。したがって、トレーサーは、テクネチウム-99のような放射性トレーサーであってもよい。この場合、原発癌または転移癌を有する器官は、腫瘍マーカーとそのトレーサーを結合する。器官によって放出される放射線は、特別なカメラ(例えばガンマ線カメラ)で撮影されうる。計測器は、放射性物質によって生成されるシンチレーションを収集して、これにより器官を視覚化することを可能にする。
本発明の他の方法において、トレーサーは、ポジトロンを放出する放射性物質(フッ素18)を含んでもよい。画像は、それからポジトロンエミッショントモグラフィーシステムによって得られる。
インビボで腫瘍マーカーの検出を可能にする本発明の方法によって、腫瘍マーカー、癌、特に結腸直腸癌を生じている腫瘍マーカーに結合パートナーの結合があった体の部位、更にはそれらの遠隔転移癌と関連しているリンパ節の局在は、視覚化されることができる。
癌細胞だけがアミノアシラーゼ1を分泌し、この産生は癌の悪性度に依存するので、本発明の方法が早期診断だけでなく、結腸直腸癌に関するスクリーニング、フォローアップ治療、予後診断及び再発診断のためにも用いられることができる。それは本発明の別の課題を構成する。
1. cDNA増幅とクローニング
FCS(ウシ胎仔血清)なしに、Caco-2結腸直腸癌株を、2mMのL-グルタミンを含むDMEM培地中で培養した(全てギブコ)。
LEI、L-FABP及びGal-3遺伝子のクローニングの場合、メッセンジャーRNAを、インビトロゲンFastTrack2.0キット(Cat.No.45-0019)を使用して、108のCaco-2細胞のペレットから、製造業者によって供給されたプロトコルに従って抽出した。逆転写とPCR工程は、プラチナTaq DNAポリメラーゼ酵素を使用しているスーパースクリプトIII ワンステップRT-PCRシステム・キット(インビトロゲン Cat.No.12574-018)で、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、450ngのCaco-2 mRNAを使用する一工程で実施した。遺伝子増幅のために使用するPCRプライマーを、表1に示す。
表1
得られたDNA断片は、Bsm BI及びXbaIで消化後、TAクローニング・キット(インビトロゲンCat.No.K4520-01)のベクターpCR2.1 TOPO(LEI及びGal-3)又はOrigene社のベクターpCMV6-XL4(L-FABP)にクローニングした。プラスミドは、cDNAが実際に期待される配列に合うことを確認するために配列決定された。
アミノアシラーゼ1をコードする遺伝子のクローニングの場合は、キアゲンのRNA Easy Miniキットを使用して、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、108のCaco-2細胞のペレットから抽出した。逆転写は、スーパースクリプトII酵素(インビトロゲン)で、製造業者によって供給されるプロトコルに従って、10ngのCaco-2 RNAを使用して実施した。逆転写プライマーは、オリゴ(dT)である。
この反応由来のcDNAは、AccuPrime Pfxキット(インビトロゲン Cat.No.12344-024)を使用して、製造業者によって供給されたプロトコルに従って、PCR反応のテンプレートとして使用した。PCRプライマーは、次の通りであるACY-1 Fwd2(配列番号7:5’−GCGAATTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGACGAGCAAAGGTCCGGAAGAGGAGCACCCATCG−3’)および、ACY-1 Rev(配列番号8:5’−GCAAGCTTCAGCTGTCACTGGGCAGGGC−3’)。
これらの条件下では、Zero Blunt TOPO PCRクローニング・キット・タイプのクローニングベクターにクローニングされた1.3kbの断片を増幅することが可能である(インビトロゲン Cat.No.K2820-20)。このプラスミドは、cDNAが実際に期待される配列にあっていることを確認するために配列決定された。
I-FABP翻訳領域を含む以下のDNA断片(配列番号9)を、Geneart社によって実施された化学合成によって得た。
配列番号9:
GGTACCGAATTCCGCGTTTGACAGCACTTGGAAGGTAGACCGGAGTGAAAACTATGACAAGTTCATGGAAAAAATGGGTGTTAATATAGTGAAAAGGAAGCTTGCAGCTCATGACAATTTGAAGCTGACAATTACACAAGAAGGAAATAAATTCACAGTCAAAGAATCAAGCGCTTTTCGAAACATTGAAGTTGTTTTTGAACTTGGTGTCACCTTTAATTACAACCTAGCAGACGGAACTGAACTCAGGGGGACCTGGAGCCTTGAGGGAAATAAACTTATTGGAAAATTCAAACGGACAGACAATGGAAACGAACTGAATACTGTCCGAGAAATTATAGGTGATGAACTAGTCCAGACTTATGTGTATGAAGGAGTAGAAGCCAAAAGGATCTTTAAAAAGGATTCTAGAGTCGACGAGCTC.
LEIおよびガレクチン-3をコードする遺伝子は原核生物の発現ベクターpMR78(文献71)にサブクローニングし、L-FABP遺伝子はベクターpET3d(New England Biolabs)にクローニングした。クローニングのために必要な制限サイトは、テンプレートとして、プラスミドpCR2.1 TOPO-LEI、pCR2.1 TOPO-Gal-3およびpCMV6-LFABPを使用して導入された。PCR酵素はプロメガPfu DNAポリメラーゼであり、PCR反応は製造業者の指示により、表2に示されるプライマーで実施した。
表2
LEIまたはガレクチン-3をコードする翻訳領域を含むPCR産物は、EcoRIおよびHindIII制限酵素で消化した。断片は、同じ酵素(プラスミドpMR-LEIおよびpMR-Gal-3)によって制限されたベクターpMR78に導入された。ベクターpMR78はタンパク質が発現されるフレームで6-ヒスチジン配列を含み、それは金属キレート・アフィニティークロマトグラフィーによって精製されることができる。L-FABP PCR産物は、ベクターpET3dに、NcoIおよびBamHI制限サイトで、クローニングした。
アミノアシラーゼ1の場合、TOPOクローニングベクターはacy1翻訳領域を含む1.3kb断片をつくるためにEcoRIおよびHindIIIによって直接消化され、ベクターpStaby1(Eurogentec)に導入された。組換えプラスミドは、pStaby1-ACYと呼ばれている。
I-FABPの場合、Geneart社によって提供されるクローニングベクターはコード配列を含むほぼ400bpの断片を生成するためにEcoRIおよびSalI制限酵素によって消化され、それはベクターpMRCH79(ビオメリューのベクターpMR78に由来する)に導入された。組換えプラスミドは、pMRCH-IFABPと呼ばれている。
GST(グルタチオンSトランスフェラーゼ)と融合されたエズリンおよびI-プラスチンをそれぞれ発現することができるプラスミドpGEX-エズリンおよびpGEX-I-プラスチンはキュリー研究所から提供された。
組換え腫瘍マーカーを産生するための発現プラスミドは、大腸菌BL21バクテリアと派生株(ストラタジーン)に導入される。培養は、振盪により周囲温度で実行される。各々のタンパク質のための正確な培養条件を表3に示す。IPTGは、イソプロピル-β-D-1-チオガラクトシダーゼである。
バクテリアのペレットは、2×PBS(リン酸緩衝生理食塩水)バッファーに溶解され、1.5kbarで、細胞分離器にかけた(コンスタントシステム)。溶菌液は、3000g、4℃で30分間遠心分離される。上澄は可溶性タンパク質を含む。ペレットは、封入体を含む。封入体を可溶化するためのバッファーは、タンパク質によって決まる。
LEIの場合、精製は、5mLのNi-NTA-セファロース樹脂(キアゲン)を含むカラムにより、可溶性分画を使用して実行され、タンパク質は450mMのイミダゾール(pH7.5)を含む2×PBSによって溶出した。
ガレクチン-3の場合、封入体は1Mの尿素を含む2×PBSに溶解されて、5mLのNi-NTA-セファロース樹脂(キアゲン)に通され、Gal-3タンパク質は450mMのイミダゾールと1Mの尿素を含む2×PBS(pH7.5)によって溶出した。
L-FABPの場合、精製は、Macherey-NagelのNi-IDAキットで、可溶性分画を使用して実行される。
表3
GST-エズリンの場合、精製は、GSTアフィニティークロマトグラフィーによって、8Mの尿素と10mMのDTTを含む100mMのトリスバッファーに溶解された封入体を使用して実行される。5mlのグルタチオン・セファロース4ファストフローゲル(アマシャム)を含むカラムが用いられる。平衡化と洗浄バッファーは、0.05%トゥイーン20含有2xPBSである。溶出バッファーは、20mMの還元グルタチオン(pH8)を含む50mMのTris-HClである。
アミノアシラーゼ1の場合、培養の可溶性分画はアマシャムHiTrap Q FFカラムに通され、ACY-1タンパク質は0.3MのNaCl(pH7.5)によって溶出した。いくつかの他のタンパク質がこれらの条件下で共に溶出されたので、疎水性相互作用カラム(HIC Phenyl HP、アマシャム)における精製を行った。ACY-1タンパク質は、0.5MのNaCl(pH7)によって溶出した。
組換えGST-I-プラスチン・タンパク質は、精製された形態でキュリー研究所によって提供された。組換えカルレティキュリン・タンパク質は、工業用プロテウスサービス社(ディジョン、フランス)から提供された。カルレティキュリンをコードしている配列は、化学合成によって得られた。
1. 動物モデル
免疫化実験は、最初の免疫化時に6〜8週であった雌のBALB/c(H-2d)マウスで行った。
2. 免疫原および免疫化
マウスで得られた免疫反応を増強して、モノクローナル抗体を生成することを可能にするために、腫瘍マーカーは実施例1に記載されている手順に従って、組換えタンパク質の形態で産生された。LDHタンパク質は、SciPac社(Cat.No.103-133)から得られた。これらのタンパク質は、良好な免疫原性の能力を有することが知られている油中水型乳剤の形で調製されたフロイントアジュバント(シグマ)と、同体積により混合された。3匹のマウスは、各々の腫瘍マーカーで免疫化された。マウスは、10μgの免疫原を、0、2および4週に3回連続して投与された。全ての注射は、皮下に行われた。最初の注射は完全フロイントアジュバントとの混合物として与えられ、次の2回は不完全フロインドアジュバントとの混合物として与えられる。最初の注射後D50とD70との間に、100μgの組換えタンパク質の静注によって、体液性応答は再刺激された。
抗体の出現を監視するために、血液サンプルは定期的にマウスから採取される。抗腫瘍マーカー抗体の存在は、ELISAを使用して試験される。興味があるタンパク質が、捕捉(1μg/ウェル)のために用いられる;飽和の後に、抗原は、テスト血清のさまざまな希釈物と反応させられる(37℃で1時間のインキュベーション)。血清に存在する特異的抗体は、アルカリホスファターゼ(H+L、ジャクソンイムノリサーチ、Cat no.115-055-146)にコンジュゲートされており、求める抗体と結合するAffiniPureヤギ抗マウスIgG抗体によって検出される(0.1μg/ウェル)。
最後の注射の3日後に、各腫瘍マーカーごとに、免疫マウスのうちの1匹を解剖した。血液および脾臓が取り出された。KohlerおよびMilstein(文献72、73)によって記載されたプロトコルに従って、脾臓から得られた脾細胞は、バラバラにされ、不死化するために、Sp2/0-Ag14ミエローマ細胞によって培養された。
12−14日のインキュベーション期間の後に、得られたハイブリドーマの上澄は、この実施例のポイント3に記載されたELISAアッセイを使用して、抗-腫瘍マーカー抗体の存在を決定するためにスクリーニングされた。免疫原としてGST融合タンパクが使われた場合、GSTに向かうクローンは、捕捉のために、連結していないGSTを有するELISAスクリーニングを実行することによって除去される。陽性のハイブリドーマ・コロニーは、当業者にとって周知である限界希釈法技術に従って、二回サブクローンをつくった。
さまざまな腫瘍マーカーに対して得られたモノクローナル抗体のリストを表4に示す。これらのモノクローナル抗体は、ウェスタン・ブロット法によって分析された。
表4
Caco-2およびHT-29株の細胞培養抽出物は、8.3Mの尿素と2Mのチオ尿素と4%の3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート (CHAPS)と100mMのDTTと2%のセルバライト 4-9(Serva、ハイデルベルク、ドイツ)と0.1g/lのオレンジGの水溶液の600μlで直接溶解し、次にNuPAGE Novexゲル試料調整プロトコル(インビトロゲン)に従って処理した。
組織の抽出物を得るために、患者GHBD001、GHBD004およびCLSP109の腫瘍と粘膜生検をメスで切り出し、次に2.5mMのEDTAとプロテアーゼインヒビター(錠剤、ロシュ)を含む1mlのPBSバッファーで50-μm Mediconsを使用するMedimachineシステム(ベクトン・ディキンソン)において、10サイクルの抽出にかけた。これらの細胞懸濁液の10mlをプールし、25mlにし、次に600gで15分間遠心分離した。上澄が、NuPAGE Novexゲル試料調整プロトコルに従って処理された組織抽出物に該当する。最終全タンパク質濃度0.4mg/mlに濃縮された試料が使用される。デポジット体積は、MOPS泳動バッファーのNuPAGE Novexビス‐トリス4−12%ゲル上にウェルごとに20μlである。泳動(200V、1時間)およびPVDF膜(400mA、45分間)上への移動後、移動の質はアミドブラックによる染色法によって評価される。
膜は、1時間の周囲温度で、TNT(15mMのトリス、0.14MのNaCl、0.5%トゥイーン20、pH8)の溶液において5%脱脂乳(Regilait)で飽和する。飽和後、膜は、飽和溶液で10μg/mlに希釈されたさまざまなテスト抗体で1時間インキュベートされる。TNTでリンスした後、膜は、飽和溶液で1:5000まで希釈された抗-マウス-西洋わさびペルオキシダーゼ(Cat No.115-035-062,ジャクソンイムノリサーチ)のコンジュゲートと共に、周囲温度で1時間インキュベートされる。リンス後、発現は、Substrate Supersignal West Dura Extendedキット(Cat No.34076,Pierce)により、使用に推奨された情報に従って実施する。
膜上の化学発光シグナルは、Biorad社のVersaDocイメージングシステムによって測定された。ウエスタンブロットのイメージに基づいて、さまざまな腫瘍マーカーに該当するバンドの体積は、QuantityOneソフトウェア(バイオラド)によって数値を求められた。体積は、バンドの表面積によって増大する化学発光シグナルの強度に該当する。
ウェスタンブロッティング結果は表5に示す。それは、試験されるさまざまな試料に関して、ウェスタン・ブロット解析における、興味がある腫瘍マーカーに対応するバンドの体積を与える。これらの結果は、試験される腫瘍マーカーがCaco-2およびHT-29大腸癌株で実際に発現していること、および患者から得られた腫瘍および粘膜の抽出物で示されるように組織においても実際に発現していることを示す。試料上の抗体によって得られたシグナルの強度は、他の試料および同じ抗体によって得られたシグナルと比較することができる。使用する技術は、組織(非遠隔試料)中のマーカーの有無、およびマーカーについての抗体の特異性を確認することを可能にする。この技術は、遠隔試料のこの実施例においては使用されなかった。
遠隔試料中の腫瘍マーカーの有無に関して結論を出すことができず、また前記腫瘍マーカーの濃度が前記試料において増減するかどうかについても決定できないためである。さらに、使用する実験スキームは、1つの抗体の反応性をもう一方と比較することを可能にするものではない。
表5
患者GHBD004において、8C8C5抗体は、I-プラスチンに相当するバンドを光らせないか、又は非常に弱く光らせた。これらの試料のI-プラスチンの存在は、例えば、ブロッティングのI-プラスチンに対してより良い親和性を有する8G2D2抗体を使用して証明されてもよい。
I-プラスチンが70%以上の相同性を有する2つの他のイソフォーム(L-プラスチンとT-プラスチン)を含むタンパク質のファミリーのメンバーであるので、GST-プラスチン-LとGST-プラスチン-Tタンパク質(キュリー研究所によって提供された)に関するそれらの反応性について、得られたモノクローナル抗体の全てのクローンを試験した。このスクリーニング終了後、ファミリーの他のメンバーと交差反応性を何ら呈しないクローン3D11D10、8C8C5、3A3H2および8G2D2を選択した。これらの抗体は、I-プラスチン・イソフォームに実際に特異的である。
1. 患者および標本
血液サンプルは、2つのHuriet法規約の背景において、フランスに分布する8つの臨床センターのネットワークから収集される。血清を得るために、血液サンプルは、乾燥管に採取される。血漿を得るために、血液サンプルは、EDTA管に採取される。凝固の後、管は1000gで10分間遠心分離され、血清が除去され、等分されて、−80℃で保存される。血漿の管は、1000gで10分間直接遠心分離され、血漿は除去され、等分され、−80℃で保存される。試料は、患者の病歴について完全に文書化される。
LEIタンパク質は、実施例2に記載された抗体およびVidas(登録商標)自動化装置(ビオメリュー)を使用するELISAアッセイを使用して分析された。これを行うために、ELISAアッセイは、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットの試薬を使用して構成された(ビオメリュー、Cat.No.30315)。試薬は、付随の情報シートの記載(ref.11728D-FR-2005/05)に従い、以下の変更を加えて使用した:
1.コーンは、10μg/mlの濃度で、捕捉抗体10E1H1と感作させた。
2.HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルの内容物を、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラキットの第2ウェルのバッファー(ヤギ血清及び1g/lのアジ化ナトリウムのバッファー)で1μg/mlにまで希釈された、ビオチン結合検出用抗体21B10A5の300μlに置き換えた。
3.血清、血漿または糞便試料(50μl)は、HBs Agウルトラキットの第2ウェルのバッファー(ヤギ血清及び1g/lのアジ化ナトリウムのバッファー)に1/20まで前もって希釈した後に、あるいはそのまま、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルのバッファーに直接希釈された。
4.ELISA反応は、Vidas(登録商標)自動化装置及びHBs Agウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
5.結果は、バックグラウンド・ノイズ(反応前の基質の読取値)の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
分析された患者で得られた量は、図1に報告される。この図において、ステージIVの結腸大腸癌を有する患者の3つの血清及びステージIIIの結腸大腸癌を有する患者の1つの血清は、血清LEIの量においてはっきりした増加を示す。
エズリン・タンパク質は、実施例2に記載された抗体及びVidas(登録商標)自動化装置(ビオメリュー)を使用したELISAアッセイを使用して分析した。これを行うため、ELISAアッセイは、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットの試薬を使用して構築された(ビオメリュー、Cat.No.30315)。試薬は、付随の情報シートに記載(ref.11728D-FR-2005/05)に従い、以下の変更を加えて使用した:
1.コーンは、30μg/mlの濃度で、捕捉抗体4A9H5と反応させた。
2.HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルの内容物を、ビオチンに結合した、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラキットの第2ウェルのバッファー(ヤギ血清及び1g/lのアジ化ナトリウムのバッファー)で1μg/mlにまで希釈された300μlの検出用抗体4A7A6C1に置き換えた。
3.血清、血漿または糞便試料(50μl)は、HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルのバッファーに直接希釈された。
4.ELISA反応は、試料を捕獲及び検出抗体とインキュベートする工程を100サイクル行うVidas自動化装置及びVidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
5.結果は、バックグラウンド・ノイズ(反応の前の基質の読取値)の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
分析された患者で得られた量は、図2に報告されている。この図において、ステージIVの結腸大腸癌を有する患者の3つの血清は、血清エズリンの量においてはっきりした増加を示すことに注目されたい。
アミノアシラーゼ1タンパク質は、実施例2に記載されている抗体及びVidas(登録商標)自動化装置(ビオメリュー)を使用したELISAアッセイを使用して分析された。これを行うため、ELISAアッセイは、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットの試薬を使用して構築された(ビオメリュー、Cat.No.30315)。試薬は、付随の情報シートに記載(ref.11728D-FR-2005/05)に従い、以下の修飾を加えて使用した:
1.コーンは、20μg/mlの濃度で、捕捉抗体2A7F6と反応させた。
2.HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルの内容物を、ビオチンに結合した、HBs Agウルトラキットの第2ウェルのバッファー(ヤギ血清及び1g/lのアジ化ナトリウムのバッファー)で1μg/mlにまで希釈された300μlの検出用抗体11H7D9に置き換えた。
3.血清、血漿または糞便試料(100μl)は、HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルのバッファーに直接希釈された。
4. ELISA反応は、試料を捕獲及び検出抗体とインキュベートする工程を100サイクル行うVidas自動化装置及びVidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
5.結果は、バックグラウンド・ノイズ(反応の前の基質の読取値)の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
表6
表6の続き
分析された患者で得られた値は、図3に報告する。この図において、ステージIIの結腸大腸癌を有する患者の1つの血清、ステージIIIの結腸大腸癌を有する患者の1つの血清、及びステージIVの結腸大腸癌を有する患者の2つの結成は血清アミノアシラーゼ1の量がはっきりと増加していることに注目されたい。
我々は、ヒトL-FABPタンパク質を分析するために、Hycult Biotechnology社から市販されているELISAキット(Cat.No.HK404)を使用した。このキットは、肝臓の病変の存在を決定するために、細胞培養上清のまたは血清、血漿または尿のL-FABPタンパク質を定量化することを可能にする。我々は、製造業者によって推奨される手順に従ったが、2つの変更を加えた:インキュベーションは周囲温度でなく、37℃で実施し、血清は分析の前に1/10に希釈した。L-FABPタンパク質の分析は、当業者に周知の代替技術によって実施されてもよい。
図4に、この分析の結果を示す。我々が試験した血清パネルにおいて、結腸直腸癌を有する141人中の41人の患者は17ng/mlを超える血清L-FABP濃度を有するが、対照群ではこの値を上回る個体はなかった。これらの41人の患者は、ステージIの結腸直腸癌をもつ8人、ステージIIの結腸直腸癌を有する8人、ステージIIIの結腸直腸癌を有する13人およびステージIVの結腸直腸癌を有する12人の患者である。141人の結腸直腸癌患者で観察される平均血清L-FABP濃度は、16.6±1.3ng/mlであった。112人の正常な個体(ネガティブ・コントロール)の平均値は、6.6±0.2ng/mlである。この違いは、統計学的に有意である(P<0.0001、不等分散のためのウェルチの修正による片側t検定)。
我々は、ヒトI-FABPタンパク質を分析するために、Hycult Biotechnology社から市販されているELISAキット(Cat.No.HK406)を使用した。このキットは、小腸の虚血性の病変の存在を決定するために、細胞培養上清のまたは血清、血漿または尿のI-FABPタンパク質を定量化することを可能にする。製造業者によって推奨される手順に従った。I-FABPタンパク質の分析は、当業者に周知の代替技術によって実施されてもよい。
図5に、この分析の結果を示す。我々が試験した血清パネルにおいて、結腸直腸癌を有する40人中の15人の患者は40pg/mlを超える血清I-FABP濃度を有するが、対照群ではこの値を上回たのは24個体中2個体だけだった。より明らかには、ステージIの結腸直腸癌を有する患者の3つの血清、ステージIIIの結腸直腸癌を有する患者の2つの血清およびステージIVの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清が、100pg/mlを超える血清I-FABP濃度を有する。この値より上の濃度は、CRC−対照群では見られなかった。
血清アポリポタンパクAIの分析は、2つの異なるイムノアッセイ技術によって実施された。まず、マイクロプレート・サンドイッチELISAを使用した。96ウェル・プレートは、抗-Apo AIモノクローナル抗体のクローン1404(Biodesign Cat.No.H45404)により、ウェルにつき1μgで被覆された。PBS-0.05%トゥイーン20(PBS−T)によって3回洗浄した後、PBS−T中の10%ミルクにより、37℃で1時間飽和させた。プレートはPBS−Tで更に3回洗浄され、試験血清試料の1/100000希釈液の100μl又は基準範囲の希釈の100μlがプレート上へ置かれて、そのプレートは37℃で2時間インキュベートされた。基準範囲は、Apo AIタンパク質(Biodesign Cat.No.A50620H)をPBS−T(BSA1%)(1.6〜100ng/ml)に希釈することによって調製された。PBS−Tによる3回の洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Biodesign Cat.No.K45452P)に結合するポリクローナル検出抗体をウェルにつき0.1μg加えて、そのプレートを37℃で2時間インキュベートした。更に3回のPBS−Tによる洗浄後、OptEIA基質(BD)を100μl/ウェルで加えた。20分後に、発色が起こった時に、反応を2Nの硫酸で停止して、450nMの吸光度を測定した。
図6Bは、この分析の結果を示す。CRCを有する患者のApo AIの血清濃度の減少は、この第2の技術によって確認される。ステージIからIVのCRCを有する34個体のApo AIの平均濃度は768±30μg/mlであるが、正常な17個体においてはこれより非常に高い:1194±51μg/ml。この違いは、統計学的に非常に有意である(P<0.0001、片側t検定)。
血清アポリポタンパクAIIの分析は、Lincoマルチプレックス・キットにより実施した。図7は、この分析の結果を示す。我々は、結腸直腸癌を有する個体のApo AIIの血清濃度の減少を証明した。ステージIからIVのCRCを有する34個体におけるApo AIIの平均濃度は170±11μg/mlであるが、正常な17個体(対照)ではこれより非常に高い277±16μg/ml。この相違は、統計学的に非常に有意である(P<0.0001、片側t検定)。
I-プラスチン・タンパク質は、実施例2に記載の抗体およびVidas(登録商標)自動化装置(ビオメリュー)を使用して分析された。これを行うために、ELISA分析は、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラ・キットの試薬を使用して構成された(ビオメリュー、Cat.No.30315)。試薬は、付随の情報シートの記載(ref.11728D-FR-2005/05)に従い、以下の修飾を加えて使用した:
1.コーンは、15μg/mlの濃度で、捕捉抗体3D11D10と感作させた。
2.HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルの内容物を、Vidas(登録商標)HBs Agウルトラキットの第2ウェルのバッファー(ヤギ血清及び1g/lのアジ化ナトリウムのバッファー)で1μg/mlにまで希釈されたビオチン結合した検出用抗体8C8C5の300μlに置き換えた。
3.血清、血漿または糞便試料(100μl)は、HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルのバッファーに直接希釈された。
4.ELISA反応は、Vidas(登録商標)自動化装置及びHBs Agウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。
5.結果は、バックグラウンド・ノイズ(反応前の基質の読取値)の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
分析された患者で得られた量を図8に示す。試験された結腸直腸癌を有する患者の2つの血清は、血清I-プラスチン量のはっきりした増加を示す。
β2-ミクログロブリン、CEA、CA19-9およびテストステロン腫瘍マーカーを、出願人のアッセイキット、それぞれVidas(登録商標)β2-ミクログロブリン, Vidas(登録商標)CEA, Vidas(登録商標)CA19-9TMおよびVidas(登録商標)テストステロンを使用して、各々のキットに特有の手順に従って分析した。
E-カドヘリン・タンパク質は、キットの手順に従ってE-カドヘリンEIAキット(タカラ・バイオケミカルズ、東京、日本)を使用して分析された。
再生膵島由来タンパク質3αタンパク質、別名膵臓炎関連タンパク質(PAP1)は、PANCREPAP ELISAキット(DynaBio、マルセーユ、フランス)を使用して、キットの手順に従って分析した。
1.コーンは、5から30μg/mlの間の濃度で、捕捉抗体と感作させた。
2.HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルの内容物を、ヤギ血清と1g/lのアジ化ナトリウムのバッファーに1μg/mlにまで希釈された、ビオチンに結合した300μlの検出用抗体に置き換えた。
3.血清、血漿または糞便試料は、HBs Agウルトラ・カートリッジの第2ウェルのバッファーに直接希釈された。
4. ELISA反応は、Vidas(登録商標)自動化装置及びHBs Agウルトラ・キットのプロトコルを使用して実施された。捕捉および検出抗体と共に試料をインキュベートする工程は、14と100サイクルとの間である。
5.結果は、バックグラウンド・ノイズ(反応前の基質の読取値)の減算の後、粗分析の値の形で得られた。
分析される体液(血液、血清、血漿、糞便)に存在する腫瘍マーカーの濃度は、LEIを分析することに関してパラグラフ2に記載されている手順に従って算出された。さまざまな腫瘍マーカーのためのアッセイ条件を表7に記載する。
表7
結腸直腸癌を有する患者の3つの血清は、血清β2-ミクログロブリンの量の増加を示す。結腸直腸癌を有する患者の10の血清は、血清CEAの量の増加を示す。より明確には、ステージIIIの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清およびステージIVの結腸直腸癌を有する患者の7つの血清が、血清CEA量の相当な増加を示す。
結腸直腸癌を有する患者の9つの血清は、血清CA19-9の量の増加を示す。より明確には、ステージIIIの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清およびステージIVの結腸直腸癌を有する患者の7つの血清が、血清CA19-9量の相当な増加を示す。
結腸直腸癌を有する患者の10の血清は、血清テストステロンの量の減少を示す。より明らかには、ステージIIの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清、ステージIIIの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清およびステージIVの結腸直腸癌を有する患者の2つの血清が、血清テストステロン量の下落を示す。
結腸直腸癌を有する患者の2つの血清は、血清再生膵島由来タンパク質3αの量の増加を示す。
ステージIVの結腸直腸癌を有する患者の4つの血清、ステージIIIの結腸直腸癌を有する患者の2つの血清およびステージIIの結腸直腸癌を有する患者の1つの血清は、血清ガレクチン-3の量の明確な増加を示す。
出願人は、結腸直腸癌を有する特定の患者の血流において、腫瘍マーカーの異常に上昇した量または異常に減少した量が観察されことを実施例3で示した。驚くべきことに、血液において、2つの所与のマーカー量の増加または減少は、同じ患者において体系的に観察されない。その結果、いくつかの腫瘍マーカーの組合せは、結腸直腸癌を有すると同定される患者数を増加させることが可能である。したがって、患者Aは一つ以上の腫瘍マーカー(グループX)の減少又は増加を示すが、患者BではグループXの前記マーカーで正常である場合がある;この同じ患者Bで、一つ以上の他の腫瘍マーカー(グループY)は、上昇または減少する場合があり、患者AではグループYの前記マーカーで正常である場合がある。出願人によって分析されるさまざまな腫瘍マーカーは、したがって、当業者によく知られているさまざまな数学的アルゴリズムによって結合されることができる。網羅的な例ではないが、具体的には、以下の方法が実施された:
1.各々の腫瘍マーカーについて、限界値が設定された。
2.結腸直腸癌のケースで血液中の腫瘍マーカーの量が増加した場合、所与の患者で得られた血液の量はその限界値によって分割された。結腸直腸癌のケースで血液中の腫瘍マーカーの量が減少した場合、所与の患者で得られた血液の量は逆数にされて、その限界値をかけられた。
3.「限界値によって分割された血液中の量」の比率が1より大きい場合、比率は係数(例えば10)をかけられた。したがって得られる値は、研究される患者について、考慮中の腫瘍マーカーのための「スコア」と呼ばれた。
4.さまざまな腫瘍マーカーで得られたスコアは、各々のマーカーに特異的な係数によって重み付けされて加えられた。下記の実施例の場合、全ての重み付けの係数は1にセットした。
5.スコアの合計は加えられるスコアの総数によって分割され、こうして得られる値に「トータルスコア」という名前をつけた。
6.彼または彼女のトータルスコアが限界値スコアに比例して増加している場合、患者は結腸直腸癌を有すると診断される。
アミノアシラーゼ−1を含む2、4および8つのマーカーの選択のトータルスコアを表8に示す。
アミノアシラーゼ−1とプロテアソーム20Sの腫瘍マーカーの組合せは、22人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する9人の患者でトータルスコア「2」をえられる一方で、アミノアシラーゼ−1又はプロテアソーム20S単独の分析ではそれぞれ4人および7人の患者のみでの増加が示された。
アミノアシラーゼ1、β2−ミクログロブリン、プロテアソーム20SおよびCA19−9腫瘍マーカーの組合せは、22人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する13人の患者でトータルスコア「4」をえられる一方で、アミノアシラーゼ−1、β2−ミクログロブリン、プロテアソーム20S又はCA19−9単独の分析ではそれぞれ4人、3人、7人および8人の患者のみでの増加が示された。
アミノアシラーゼ1、β2−ミクログロブリン、プロテアソーム20、CA19−9、L−FABP、PAP、E−カドヘリンおよびCEA腫瘍マーカーの組合せは、22人の患者の同じ群について、結腸直腸癌を有する18人の患者で増加したトータルスコア「8」をえられる一方で、アミノアシラーゼ−1、β2−ミクログロブリン、プロテアソーム20、CA19−9、L−FABP、PAP、E−カドヘリン又はCEA単独の分析ではそれぞれ4人、3人、7人、8人、6人、2人、1人及び10人の患者のみでの増加が示された。
表8
表8のつづき
糞便は重さ約1gの破片を使用して抽出され、それは1g/lアジ化合物を含む100mMのリン酸ナトリウム・バッファー(pH7.2)の10mlに加えられる。混合物は、1分間のボルテックスで均質にされる。次に、試料を氷上で7秒間4サイクルの超音波にかける。不溶性分画は4℃で10分間、2000gで遠心分離により取り除かれる。上澄は分析されるまで−30℃で保存される。実施例3に記載のELISAアッセイが、必要に応じて、HBs Agウルトラ・カートリッジの第1ウェルのバッファーに糞便を適切に希釈した後に糞便の腫瘍マーカーを分析するために使用された。
アミノアシラーゼ1、ガレクチン-3およびプロテアソーム20Sによる試験の分析定量は、それぞれ図18から20に表わされる。アミノアシラーゼ1、ガレクチン-3およびプロテアソーム20Sの量の増加が、それぞれ結腸直腸癌を有する患者の10、14、および8つの糞便で観察された。
1. 細胞培養
LnCAP前立腺癌株は、2mMのL-グルタミンと10mMのHEPESと1mMピルビン酸ナトリウムと10%FCSを添加したRPMI1640培地で培養される(全てギブコ)。細胞はネガティブコントロールとして使用される。
Caco-2結腸大腸癌株は、FCSを含まず2mMのL-グルタミンを含むDMEM培地で培養される(全てギブコ)。
HT-29結腸直腸癌株は、10%FCSおよび2mMのL-グルタミンを含むDMEM培地で培養される(全てギブコ)。
HT-29/B6結腸直腸癌株は、FCSを含まず4mMのL-グルタミンを含むDMEM培地で培養される(全てギブコ)。
細胞は、5%のCO2を有するインキュベーターで37℃に保たれる。
この手順は、タンパク質を分泌している細胞数を決定することを可能にする。PVDF膜(マルチスクリーンIP、ミリポア)を有する96ウェルELISPOTプレートは、10μg/mlでマウス抗-腫瘍マーカー・モノクローナル抗体(捕捉抗体、ELISPOTで使用した抗体を示す下の表9を参照されたい)で、ウェルにつき100μlで、滅菌PBS中で、+4℃で一晩、被覆する。次にプレートはPBSによって洗われて、10%FCSを含む培地で飽和する。平行して、細胞は、トリプシン処理され、計数されて、次に105細胞/mlまで希釈した。この保存溶液のカスケード希釈として、この細胞懸濁液の200μlはウェルに分配された。次に、プレートは5%CO2の湿性雰囲気において37℃で20時間インキュベートされ、次に0.05%のTween-20含有PBSによって洗浄した。次に残りの細胞は10分間の氷冷水による処理によって溶解され、次にプレートは再び洗われる。検出抗体(分析される腫瘍マーカーに向かうビオチン化モノクローナル(表9))は、0.1μg/ウェルで加えられる(周囲温度で2時間インキュベート)。スポットは、extravidin-アルカリホスファターゼ(シグマ)と基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル・ホスフェート/ニトロ・ブルーテトラゾリウム(BCIP/NBT、Biorad)を加えることによって検出される。バックグラウンド・ノイズは、LnCapウェルで測定されるスポット数に相当し、使用した読み取り条件下では0から8スポットの間で変化する。非特異的なスポットの平均数は、特異的なシグナルから減算された。
表9
インキュベートされた細胞100万に対する、興味がある腫瘍マーカーを分泌しているCaco-2、HT-29およびHT-29/B6細胞の数を、図21に示す。ELISPOT技術は、大腸癌株による腫瘍マーカーの放出または分泌を確認することを可能にする。出願人による特許出願WO03/076942の方法に従い、この技術を使用して患者の循環腫瘍細胞について調査を実施することが可能であろう。
1. 方法論
第1に、組織マイクロアレイ・スライドは、脱パラフィンされる。このために、それらは次の溶液バットにおいて、10分間、連続的にインキュベートされる:メチルシクロヘキサン(2回)、100%エタノール、95%エタノール、70%エタノールおよび水。次にスライドは、0.1%のトゥイーン20を含むTBSで、10分間、撹拌しながら、リンスした。抗原は、10mMのクエン酸バッファー中で、40分間、90℃まで加熱することによって再活性化し、次に30分間、周囲温度まで冷却させた。内因性ペルオキシダーゼは3%のH2O2を含むTBS−T中でのインキュベートによって阻害される。次に、スライドは37℃で1時間、湿潤なチャンバーにおいて、3%BSAのTBS−Tで飽和する。
次に、スライドは、3%BSA含有TBS−Tに10μg/mlに希釈した抗-白血球エラスターゼ・インヒビター(クローン3D9C2)、抗-エズリン(クローン5G2D12)、抗-アミノアシラーゼ1(クローン8A8A10)または抗-I-プラスチン(クローン8D6A3)一次抗体と共に2時間インキュベートする。TBS−T中で10分間3回洗浄後、スライドは、飽和溶液で1/400に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた抗-マウス二次抗体(Cat.No.115-035-003 Jackson Immunoresearch)と共に、湿潤チャンバーにおいて、37℃で2時間インキュベートする。スライドは、TBS−T中で10分間3回洗浄され、次にPBS中で10分間3回洗浄する。スライドは、シグマFast substrate(Cat.No.D-4168,シグマアルドリッチ)によって5分間、発現させる。染色は、PBSでの洗浄によって停止させる。ハリス・ヘマトキシリン(Cat.No.MHS16、シグマアルドリッチ)による対比染色は、30秒間実施する。水およびPBSによる洗浄後、スライドは顕微鏡下に観察のために置かれる。
免疫組織化学の標識化のために使用する抗体は、特に本出願のために、ELISAでの又はウエスタンブロッティングでのそれらの反応性に独立に選択された。
組織マイクロアレイスライドは、多数の試料をスクリーニングするために用いた。これらの試料は、スライド上へ配置される結腸組織である。患者の特徴(結腸直腸癌の組織マイクロアレイに存在する結腸組織スポットの特徴)、更には抗-白血球エラスターゼ・インヒビター抗体による免疫標識の結果を、表10に示す。
表10
表の結果は正常な結腸粘膜生検において、標識化されたものがないことを示す(10の陰性)。標識は、また、腺腫においても陰性である(1/1)。標識は、結腸腺癌の上皮細胞において陽性である(8/11の患者で+)。間質では標識されたものがない。
組織マイクロアレイ・スライドは、多数の試料をスクリーニングするために使用した。これらの試料は、スライド上へ配置される結腸組織である。結腸腺癌を有する各患者について、3つの試料は腫瘍の中央から採取され、3つの試料は浸潤前面から採取され、3つの試料は正常な組織から採取された。表11は、抗-エズリン抗体による免疫標識の結果を示す;示した標識のレベルは、分析した3つの試料についての最大強度である。
表11
30人の患者の試料において、25試料は隣接した正常な組織と比較して、腫瘍(腫瘍中心または浸潤前面)においてエズリンの過剰発現を示す。
組織マイクロアレイスライドは、多数の試料をスクリーニングするために用いた。これらの試料は、スライド上へ配置される結腸組織である。結腸腺癌を有する各患者について、3つの試料は腫瘍中央から採取され、3つの試料は浸潤前面から採取され、3つの試料は正常な組織から採取された。表12は、抗-アミノアシラーゼ抗体による免疫標識の結果を示す;示した標識のレベルは、分析した3つの試料についての最大強度である。
表12
30人の患者の試料において、21試料は隣接した正常な組織と比較して、腫瘍(腫瘍中心または浸潤前面)においてアミノアシラーゼの過剰発現を示す。
組織マイクロアレイ・スライドを、多数の試料をスクリーニングするために用いた。これらの試料は、スライド上へ配置された結腸と直腸の組織である。患者の特徴(結腸直腸癌の組織マイクロアレイに存在する結腸組織スポットの特徴)、更には抗-I-プラスチン抗体による免疫標識の結果を、表13に示す。
表13
表13のつづき
表の結果は:
正常な結腸粘膜生検において、8試料(+)において標識は弱く、2試料は++である。また、標識は結腸腺腫(1/1)において弱い(+)。標識は、結腸腺癌の上皮細胞において強い陽性++である(結腸コロイド腺癌を含めて、6/9の患者で++であり、3人の患者で弱い+)。間質では標識されたものがない;
正常な直腸粘膜生検において、標識は、非特異的に表面上皮に(3/4)および1試料で++レベルで存在する。標識は、直腸腺腫で強い陽性++(5/9)または弱い+(4/9)である。さらに、標識は、直腸腺癌の上皮細胞で強い++である(3/4患者において++、1患者で弱い+)。間質では標識されたものがない
ことを示す。
1.方法論
検出限界を数ng/mlまで下げることを可能にするために、改良されたMRM-MS方法が用いられた。この方法の連続した工程は:1)大量のタンパク質の免疫除去、2)トリプシン消化、3)ペプチドのSPE(固相抽出)分画化、4)MRM-MSと組合わせた液体クロマトグラフィー(LC)である。
セッティングは、10〜250ng/mlの濃度でACY、エズリン、L-FABP、PDI又はI-プラスチン組換えタンパク質を、対照血清プールに加えることによって、スパイク試料上で実施された。アポリポタンパクA1とA2は、血清に天然に存在する。
免疫除去
血清中の大量のタンパク質の除去は、ビバサイエンスのVivapure抗-HSAキットを使用して実施された。あるいは、CalbiochemのProteoextract アルブミン/IgGおよびバイオラドのAurumTM血清タンパク質ミニキットを使用した。製造業者の指示に従って、CNBr活性化セファロース4B樹脂(アマシャム・バイオサイエンス)に、除去するタンパク質に向かうモノクローナル抗体を結合させることによって、実験室で特異的樹脂を製造することもできる。
酵素消化
除去された血清試料は、30mMのジチオスレイトールを含有する6M尿素の10mMトリス溶液(pH8)で、40℃で40分間変性され、次に40分間、暗所、周囲温度で、50mMのヨードアセトアミドでアルキル化される。それらは水で6倍希釈され、トリプシン消化は1:30の酵素/基質比率を使用して37℃で一晩実施される(プロメガ)。消化は、0.5%の最終濃度でギ酸を加えることによって停止される。消化された試料は、オアシスHLB 3cc 逆相カートリッジ(60mg)(Waters)を使用して固相抽出(SPE)によって脱塩される。試料の適用の後、カートリッジを0.1%のギ酸1mlによって洗浄し、次に溶出は0.1%のギ酸を含むメタノール/水混合液(80/20 v/v)で実施される。溶出液は減圧下で乾燥される。
SPE分画
乾燥試料は、1mlの酢酸バッファーに溶解され、酢酸バッファーとメタノールで前もって平衡化されたオアシスMCX(混合陽イオン交換)60mg混合カートリッジ(疎水性および陽イオン交換)(Waters)上にロードされる。カートリッジは、1mlの酢酸バッファーと1mlのメタノールによって洗浄される。興味があるペプチド(表14)は、メタノール/酢酸バッファー混合物(50/50 v/v)の1mlによって溶出される。酢酸バッファーのpHは、興味があるペプチドの等電点に応じて選択される。溶出液は減圧下で乾燥され、0.1%のギ酸を含むアセトニトリル/水(3/97 v/v)溶液の200μlに溶解する。50μlのアリコートは、MS-MSシステムに接続するLCに注入された。
液体クロマトグラフィーおよび質量分析法
LC-MS分析は、Sciex API2000トリプル四重極、またはより感受性のよいSciex API4000Qtrap(複合型トリプル四重極-イオントラップMS)(MDS Sciex)のどちらかの質量分析計に接続されている、バイナリーポンプとインジェクター(Agilent Technologies)を有するHP1100シリーズ高圧クロマトグラフィーシステム(HPLC)において実施された。LC分離は、300μl/分の溶出流速で、C18シンメトリーカラム(Waters)において実施した。(溶出液A=0.1%ギ酸水溶液、溶出液B=0.1%のギ酸アセトニトリル溶液、25分間で5%Bから50%B、次に3分間で50%Bから100%Bの直線濃度勾配)。MS分析は5500V電圧で陽性イオン化法で実施され、ニードル電位として適応され、源のイオン化を可能にする。計測器照合とデータ収集は、アナリスト1.4.1ソフトウェアにより実施された。霧状ガス(空気)およびカーテン・ガス(窒素)流は、それぞれ30と20psiである。ターボVTMイオン源は400℃に、補助窒素流は40psiに合わせる。各ペプチドで記録されたMRM遷移を表14に示す。衝突エネルギー(CE)、デクラスタリング・ポテンシャル(DP)およびコリジョンセルエクジットポテンシャル(CXP)は、選択されたMRM遷移について最適化される。
各々の腫瘍マーカー(表14のタンパク質)について、理論上のMRM遷移のリストは、MIDAS(MRM-initiated検出およびシークエンシング)ソフトウェアを使用して生成された。このリストは、800から3000Daの質量範囲および全てのあり得るyまたはb型の断片イオンの、理論上のトリプシンペプチドの全ての二重荷電あるいは三重荷電親イオンを含む。各タンパク質について、各々の可能な遷移は、最も感受性があり、最も特異的な遷移を決定するために試験された。この選択の結果を表14に示す。AQUA型の重ペプチド(シグマ)、あるいは、重組換えタンパク質をアッセイ基準として使用して、複雑な生物媒質において興味がある腫瘍マーカーを絶対値で定量化することが可能である。
表14
表14のつづき
表14のつづき
表14のつづき
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Claims (5)
- 結腸直腸癌を有することが疑われる患者から得られた生物試料におけるアミノアシラーゼ1マーカーの存在を決定することによる結腸直腸癌のインビトロ診断方法。
- 生物試料が腫瘍から離れた試料であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 白血球エラスターゼ・インヒビター、エズリン、肝臓脂肪酸結合タンパク質、腸脂肪酸結合タンパク質、アポリポタンパク質AI、アポリポタンパク質AII及びI-プラスチンマーカーから選択される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーの存在を更に決定することを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- β2-ミクログロブリン、プロテアソーム20S、ガレクチン-3、L-乳酸脱水素酵素B鎖、カルレティキュリン、再生膵島由来タンパク質3α、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー1、II型ケラチンCytoskeletal8、I型ケラチンCytoskeletal18、I型ケラチンCytoskeletal19、上皮カドヘリン、CEA、ビリン、CA19-9、CA242、CA50、CA72-2、テストステロン、TIMP-1、Cripto-1、インテレクチン-1、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、サイトケラチン20、翻訳的に制御された腫瘍タンパク質、(プロ)デフェンシン-A5、好ましくはAXL4遺伝子のメチル化DNAまたはセプチン-9遺伝子のメチル化DNAのような血液中のメチル化DNAの検出、糞便DNAの特異的な変異又は糞便DNAのメチル化プロフィールの特異的な修正のような糞便DNA断片の特異的な修正の検出、及びヒト糞便のヘモグロビンの検出から選択される少なくとも一つの他の腫瘍マーカーの存在の決定を更に含むことを特徴とする、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 結腸直腸癌に関する早期診断、スクリーニング、フォローアップ治療及び予後診断のための、請求項1から4の何れか一項に記載の方法の使用。
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