JP2010529078A - 成熟樹状細胞における免疫寛容誘発表現型の誘導 - Google Patents

Abstract

本発明は、樹状細胞の機能を調節するＣＤ４５結合分子の使用に関するものである。特に本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶などの疾患または障害の処置に有用な免疫寛容誘発樹状細胞を誘導するＣＤ４５結合分子の使用に関するものである。

Description

発明の分野
本発明は、樹状細胞機能の調節方法に関するものである。特に、本発明は、免疫寛容誘発樹状細胞の生産方法およびかかる方法から導かれ得る使用法に関するものである。本発明は、例えばヒトにおける異常な免疫応答、例えば自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患、アレルギーなどに関連する異常な免疫応答の処置および／または予防に有用性が見出される。さらに本発明は、本明細書記載の方法から得られる医薬および医薬組成物に関する。

背景
Ｔ細胞性(T-cell mediated)応答を抑制し得る新規薬剤の発見は、急性臓器拒絶、移植片対宿主病、自己免疫疾患および慢性炎症を含む幾つかの免疫介在性疾患の処置に有益なものであり得る。

骨髄および臓器移植は、造血および非造血系の両方に端を発する多数の悪性および非悪性疾患および非常に重要な臓器（肝臓、心臓および肺）の末期不全のそれぞれに対する現行の治療法である。しかしながら、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）と呼ばれる、ドナーの免疫系が介在するレシピエントに対する拒絶応答は、依然として骨髄移植における病的状態の主原因となっている。同様に、レシピエントが介在する同種移植拒絶は、臓器移植後の長期移植片生存にとって大きな障害である。免疫抑制剤は、ＧｖＨＤおよび臓器移植拒絶の両方を処置するのに有効であり得る。しかしながら、これらの方法では、一生処置を続けなければならず、非特異的に免疫系全体を抑制するため、患者を感染症および癌罹患の高い危険に曝すことになる。さらに、これらの非特異的治療の長期移植生存に対する有益な影響は限られたものに過ぎない（１）。

同様に、自己免疫疾患において末梢組織の破壊をもたらす自己抗原に対する免疫応答の処置は、現時点では炎症および非特異的免疫抑制の調節に基づいたものである。これらの方法は、感染症および癌を含む免疫抑制の副作用を伴い、一旦薬剤投与を中止すると、病気再発の危険が高くなるため、長期間有効なものではないことが多い。

慢性炎症疾患およびアレルギーでは、病因性および非病因性抗原に対する免疫応答の改変が起こる。これは、エフェクターおよび調節免疫応答間の不均衡に起因し得る。慣用的な抗炎症または免疫抑制治療は、この均衡を回復するには不十分なことが多い。さらに、薬剤投与を中止した後、これらの治療の利点が長く続くことはない。

非特異的免疫抑制法に代わる戦略は、特異的免疫寛容の誘導に基づくものであり、宿主防御機構を無傷に保ちながら、病原性免疫応答を下方制御することを最終目標とする。中枢性寛容は、胸腺におけるＴ細胞個体発生中に起こり、自己反応性Ｔ細胞のクローン消失が介在し、一方で末梢性Ｔ細胞寛容は、生涯を通じて機能的であり、自己抗原および非有害外来抗原、例えば食物抗原に向かう応答を制御するように設計されている。一般的に末梢性寛容に関与する正常な過程は、クローン消失、クローン性不活化（アネルギー）、サイトカイン依存的免疫偏位および抑制である。同種移植拒絶、自己免疫性および炎症における免疫応答の１次メディエーターは、ＴおよびＢ細胞である。それらは両方ともＴおよびＢ細胞受容体を通したシグナリングのみならず、共刺激経路（例、ＣＤ２８またはＣＤ８０−８６およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ）を通したシグナリングも必要とする。Ｔ細胞活性化中におけるこれら２つのシグナルによる干渉は、幾つかの前臨床移植モデルで立証されたところによると、インビトロおよびインビボでＣＤ４＋ Ｔ細胞においてアネルギーを誘導し得る（２−６）。非分裂促進性抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ４ ｍＡｂおよびCampath-1H（抗ＣＤ５２）を含む有望な薬剤は、移植患者で試験されている。一例は非分裂促進性抗ＣＤ３ ｍＡｂであり、これは腎臓移植試験で使用されており、副作用を伴わない（７、８）。さらに、抗ＣＤ３ ｍＡｂによる１クールの治療により、１型糖尿病（９、１０）および乾癬性関節炎（１１）において自己免疫過程の進行が改変される。最近、その枯渇効果（１２）に加えて、Campath-1H は、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおいて最終的に致死ＧｖＨＤを抑制するＴ調節細胞（Ｔｒ細胞）の拡大を誘導することが立証された。

Ｔ細胞共刺激性標的ＣＤ２８およびＣＤ１５４を遮断すると、マウス前臨床モデルにおいて抗原特異的寛容状態が誘導されることが示された（４）。抗ＣＤ１５４ ｍＡｂは、急性腎臓同種移植拒絶を阻止し（１４）、ヒト以外の霊長類で長期にわたる異種移植受容を促進する（１５、１６）。肯定的な前臨床結果にもかかわらず、自己免疫疾患および移植における免疫調節剤として抗ＣＤ１５４ ｍＡｂを試験する臨床試験は、血栓塞栓合併症故に中止された（１７）。これに代わる抗ＣＤ１５４ ｍＡｂが開発され、短クールのシロリムスおよび抗ＣＤ１５４ｍＡｂと関連した一ドナー特異的輸血により、霊長類での同種移植生存が延長され、寛容状態が誘導されることが立証された（１８、１９）。

上記に加えて、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βなどの免疫調節性サイトカインの使用はまた、１種のＴ細胞アネルギー状態を誘導し得る。ＩＬ−１０は、炎症過程の制御、Ｔ細胞応答の抑制、および免疫学的寛容の維持において中心的役割を演じる（（２０）でレビュー）。ＩＬ−１０は、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生を阻害し（２１）、活性化された抗原呈示細胞（ＡＰＣ）、好中球、好酸球およびマスト細胞により産生される、向炎症性サイトカイン類、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびケモカイン類、例えばＩＬ−８およびＭＩＰ１αの産生を阻止する抗炎症効果を有する。さらに、ＩＬ−１０は、ＡＰＣでのＭＨＣクラスII、共刺激性および接着分子（２２〜２４）の発現を下方制御し、それらの刺激能力を調節する（２５）。重要なことに、ＩＬ−１０は、適応性１型Ｔ調節（Ｔｒ１）細胞の分化に非常に重要である（２６）。Ｔｒ１細胞は、特有のサイトカイン分泌プロフィールを特徴とする。ＴＣＲ活性化時、それらは、高レベルのＩＬ−１０、顕著な量のＩＬ−５およびＴＧＦ−β、低レベルのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を分泌するが、ＩＬ−４を分泌することはない（２６）。Ａｇ特異的マウスＴｒ１細胞は、高用量のＩＬ−１０の存在下での反復的ＴＣＲ刺激によりインビトロで生産され得る（２６）。さらに、ＩＬ−１０（およびマウスでのＴＧＦ−β（２７））を混合リンパ球反応（ＭＣＲ）培養物（２８）に加えると、Ｔ細胞アネルギーが惹起される。重要なことに、健康な個体からのアロ反応性Ｔｒ１細胞クローンは、元々制限希釈によりＩＬ−１０アネルギー化ＣＤ４^＋Ｔ−細胞から単離されたものである（２６）。

ヒトＴｒ１細胞がインビボでの末梢寛容の維持に関与するとの最初の提案は、ＨＬＡ不適合同種異系幹細胞の移植が成功した重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）患者における試験から来た。免疫抑制治療を行わなければ、これらの患者はＧｖＨＤを発症しない。興味深いことに、これらの患者の血漿からは高レベルのＩＬ−１０が検出され、宿主ＨＬＡ抗原に特異的であり、高レベルのＩＬ−１０を産生する、顕著な比率のドナー由来のＴ細胞がインビトロで単離され得る（２９）。骨髄移植の前臨床モデルにおいて、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの存在下における宿主ＡＰＣによりエクスビボでアネルギー化されたドナーＣＤ４^＋Ｔ細胞の移行により、ＭＨＣクラスII不適合レシピエントにおいてＧｖＨＤが著しく減少する（２７、３０）。

樹状細胞（ＤＣ）は、古典的には感染時にＡｇ特異的免疫応答を開始させる高度に専門化されたＡＰＣである（３１）。この過程は、典型的には微生物感染に関与する作用因により誘導されるＤＣの最終成熟段階を含む。現時点ではＤＣが免疫原性のみならず寛容性でもあり得ることは明白である。定常状態でＤＣは、未成熟表現型を発現し、Ａｇ特異的エフェクターＴ細胞の消失および／またはＴｒ細胞の分化を介して寛容を誘導し得る（３２〜３６）。同種異系未成熟ＤＣによるナイーブ臍帯血ＣＤ４^＋Ｔ細胞の反復刺激により、ＩＬ−１０産生Ｔｒ細胞の分化が誘発され（３７）、これらが細胞接触依存的機構を介してＴ細胞応答を抑制する。最近我々は、同種異系未成熟ＤＣで刺激された末梢血ナイーブＣＤ^４＋Ｔ細胞が、成熟ＤＣでの再活性化に対してますます低応答性になり、未成熟ＤＣによる３ラウンドの刺激後には、それらは深くアネルギー状態であり、調節機能を獲得していることを報告した。高レベルのＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを分泌し、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β依存的機構を介してＴ細胞応答を抑制し、その誘導が抗ＩＬ１０ＲｍＡｂにより遮断され得るため、これらのＴ細胞は、表現型および機能がＴｒ１細胞と類似している（３８）。

未成熟ＤＣだけでなく免疫寛容誘発ＤＣの専門化サブセットも、Ｔｒ細胞の分化を推進し得る。ＤＣの成熟および機能は、種々のレベルで調節され得る（３９）。薬理学的および生物学的作用物質は、両方とも免疫寛容誘発ＤＣを誘導し得ることが示された（４０）。免疫調節性サイトカイン類、例えばＩＬ−１０単独（４１、４２）またはＴＧＦ−βとの組み合わせ（４３）、および向炎症性サイトカイン類、例えばＩＦＮ−α（４４、４５）およびＴＮＦ−α（４６）は、免疫寛容誘発ＤＣの分化を推進し、抑制活性を伴うアネルギー性Ｔ細胞を誘導し得る。

ＣＤ４５は、Ｔ細胞活性化において非常に重要な役割を演じる。同一の細胞質チロシンホスファターゼドメインを共有しながらも細胞外ドメインのサイズが異なる７種の異なるＣＤ４５アイソフォームは、オルターナティブスプライシングにより生産される。多くのＣＤ４５アイソフォームが個々のリンパ球により同時に発現され得るが、高および低分子量（ＭＷ）アイソフォームは、独特の機能およびサイトカイン産生プロフィールを有するＣＤ４^＋Ｔ細胞のサブセットにおいて示差的に分布している（４７、４８）。ＣＤ４５アイソフォームの発現は、高度に調節されており、動的である。Ｔ細胞活性化は、高分子量アイソフォームの減少およびそれに付随する低分子量アイソフォームの上方制御に随伴している。異なるＴ細胞サブセットにおけるＣＤ４５アイソフォームの調節された発現は、それらの生物学的重要性を強調するものである。ＣＤ４５のチロシンホスファターゼ活性は、ＴＣＲ、インテグリンおよびサイトカイン受容体を介したシグナル伝達を含め、免疫細胞において多くの経路を調節する（４９、５０）。ＴＣＲシグナリングに対するＣＤ４５の機能は非常に刺激性が高く、ＣＤ４５はサイトカインシグナリングにおいて阻害効果を有し得る（４９）。

マウスにおいてＣＤ４５のＲＢアイソフォームをターゲッティングする抗体は、マウス腎臓、膵島および心臓同種移植片において長期生着およびドナー特異的寛容を誘導し得る（５１）（５２）。抗ＣＤ４５ＲＢｍＡｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇ではなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＣＴＬＡ−４発現の増加に結びついた高ＭＷから低ＭＷへのＣＤ４５アイソフォーム発現における急速なシフトを誘発する（５３）。ＣＴＬＡ−４の上方制御は、抗ＣＤ４５ＲＢ介在による寛容に必要であることが立証された（５４）。抗ＣＤ４５ＲＢｍＡｂは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒ細胞の両方でアネルギーを誘導するが、これらは寛容の維持に必要とされるものである（５５）。抗ＣＤ４５ＲＢｍＡｂによる寛容誘導における新たな胸腺移出細胞の役割については最近調査されたが、結果は論議の的となっている。膵島移植では、胸腺摘出マウスにおける抗ＣＤ４５ＲＢでの処置により早期拒絶は著しく減少したが、それが長期にわたる免疫寛容誘発効果を改変することはなかった（５５）。逆に、心臓移植では、胸腺摘出により、抗ＣＤ４５ＲＢ介在による寛容が完全に阻止された。興味深いことに、抗ＣＤ４５ＲＢｍＡｂは、胸腺からの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の新たな生産を介して寛容を誘導する（５６）。

国際公開第０２／０７２８３２号（この全内容については、出典明示により援用しており、読者は具体的内容についてはそれを参照のこと）において、インビトロＭＬＲにより測定されたところによると、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は、用量依存的に一次アロ免疫応答を阻害することが示された。さらに、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は、エフェクターＴ細胞に対して直接作用し、それらの機能を調節することが立証された。

上記を考慮して、当業界において、潜在的に病気に関連する免疫応答の抑制を促すさらなる方法および医薬を確立することが要望されている。本発明は、免疫系の自然な調節機構を利用する形で免疫細胞機能を調節することにより、この問題に取り組むものである。

発明の要約
一局面において、本発明は、樹状細胞（ＤＣ）機能の調節方法であって、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子に樹状細胞を曝露することを含む方法を提供する。

第２の局面として、本発明は、樹状細胞（ＤＣ）機能の調節方法であって、樹状細胞を結合分子に曝露することを含む方法を提供するが、上記結合分子は、順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、上記ＣＤＲ１はアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(ＮＹＩＩＨ)を有し、上記ＣＤＲ２はアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ)を有し、上記ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ)を有するか、または上記分子はその直接等価物であるものとする。

好ましい態様において、結合分子は、
ａ）順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、上記ＣＤＲ１がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(ＮＹＩＩＨ)を有し、上記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ)を有し、上記ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ)を有するものである第１ドメイン、および
ｂ）順に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、ＣＤＲ１’がアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＱ)を有し、ＣＤＲ２’がアミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (ＳＳＳＥＳＩＳ)を有し、ＣＤＲ３’がアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (ＱＱＳＮＴＷＰＦＴ)を有するものである第２ドメイン；
またはその直接等価物を含む。

好ましくは、結合分子は、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。
すなわち、一態様において、結合分子はヒト化モノクローナル抗体である。別の態様では、結合分子は完全ヒトモノクローナル抗体である。

本発明での使用に適切な結合分子の例には、以下のものがあるが、これらに限定されるわけではない：
（ａ）配列番号１のポリペプチドおよび／または配列番号２のポリペプチドを含む結合分子；
（ｂ）配列番号３のポリペプチドおよび／または配列番号４のポリペプチドを含む結合分子；
（ｃ）配列番号９または配列番号１０のポリペプチドおよび／または配列番号７または配列番号８のポリペプチドを含むヒト化抗体である結合分子；および
（ｄ）配列番号３１または配列番号３２のポリペプチドおよび／または配列番号７または配列番号８のポリペプチドを含むヒト化抗体である結合分子。

一態様では、ＤＣ機能の調節方法をインビトロで遂行する。かかる場合、ＤＣは、生物学的試料から入手されるか（すなわちエクスビボ）または例えば単球の集団を入手し、単球に対しＤＣへのインビトロ分化を誘導することを通じてインビトロで生産され得る。後者の場合、単球の供給源は生物学的試料であり得る。

一態様において、ＤＣ機能の調節方法では、未成熟ＤＣの供給源を得て、本明細書記載の結合分子の存在下において未成熟ＤＣの成熟を誘導する。

ＤＣ機能の調節方法は、ＤＣにおいて免疫寛容誘発表現型を誘導するのに使用される。一態様において、ＤＣ機能の調節方法は、さらにＤＣをインビトロでＴ細胞（例えば、同種異系Ｔ細胞）集団に曝露することにより、上記Ｔ細胞において免疫寛容誘発表現型を誘導する段階を含む。また、上記の免疫寛容誘発Ｔ細胞について、本明細書ではＴｒ細胞と称す。

また、ＤＣ機能の調節方法は、例えば自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防を目的とする、医薬／医薬組成物の製造でも使用される。好ましい態様では、本発明の方法、使用および医薬／医薬組成物は、ヒトにおける乾癬および／または移植拒絶（例えばヒトにおける同種異系移植、例えば膵島移植）の処置に有用である。

したがって、さらなる局面において、本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防方法であって、上記処置および／または予防を必要とするヒト対象に、本明細書記載の結合分子への曝露により調節されたＤＣの有効量を投与することを含む方法を提供する。

別の局面において、本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防方法であって、
（ａ）ヒトドナーから単球集団を入手し、
（ｂ）上記単球のインビトロ分化を誘導することにより、ＤＣの供給源を製造し、
（ｃ）ＤＣが免疫寛容誘発となるようにＤＣをここで定義の結合分子に曝露し、
（ｄ）上記の処置および／または予防を必要とするヒトレシピエントに有効量の免疫寛容誘発ＤＣを投与する
ことを含む方法を提供する。

さらなる局面において、本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防方法であって、
（ａ）ヒトドナーからＤＣの集団を入手し、
（ｂ）ＤＣが免疫寛容誘発となるようにＤＣを本明細書記載の結合分子に曝露し、
（ｃ）上記の処置および／または予防を必要とするヒトレシピエントに有効量の免疫寛容誘発ＤＣを投与する
ことを含む方法を提供する。

一態様において、上記局面のドナーおよびレシピエントは同一個体である。別の態様では、ＤＣがレシピエントに関して同種異系となるように、ドナーおよびレシピエントは異なる個体である。

本発明の別の局面は、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防方法であって、
（ａ）第１ヒトドナーから単球集団を入手し、
（ｂ）上記単球のインビトロ分化を誘導することにより、ＤＣの供給源を製造し、
（ｃ）ＤＣが免疫寛容誘発となるように、ＤＣをここで定義の結合分子に曝露し、
（ｄ）Ｔ細胞が免疫寛容誘発となるように、免疫寛容誘発ＤＣを第２ヒトドナーから入手したＴ細胞集団に曝露し、
（ｅ）上記の処置および／または予防を必要とするヒトレシピエントに有効量の免疫寛容誘発ＤＣおよび／または免疫寛容誘発Ｔ細胞を投与する
ことを含む方法を提供する。

さらに別の局面において、本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防方法であって、
（ａ）第１ヒトドナーから樹状細胞集団を入手し、
（ｂ）樹状細胞が免疫寛容誘発となるように、樹状細胞をここで定義の記載の結合分子に曝露し、
（ｃ）Ｔ細胞が免疫寛容誘発となるように、免疫寛容誘発樹状細胞を第２ヒトドナーから入手したＴ細胞集団に曝露し、
（ｄ）上記の処置および／または予防を必要とするヒトレシピエントに有効量の免疫寛容誘発樹状細胞および／または免疫寛容誘発Ｔ細胞を投与する
ことを含む方法を提供する。

一態様では、第１ドナーおよび／または第２ドナーは、レシピエントと同一の個体である。第１ドナーは第２ドナーと同一の個体であり得るか、あるいは、第１ドナーからのＤＣと第２ドナーからのＴ細胞が互いに関して同種異系となるように、第１および第２ドナーは異なる個体であり得る。一態様では、第１ドナーとレシピエントは同一個体であり、第２ドナーは異なる個体である。この態様は、第２ドナーがレシピエント／第１ドナーへの移植用の移植組織を提供するＧｖＨＤの処置において特に有用である。

好ましくは、上記方法において、ＤＣはＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子へのそれらの曝露前には未成熟ＤＣであり、それに続いてＤＣは結合分子の存在下で成熟ＤＣとなるように誘導される。

さらなる局面において、本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防を目的とする、本明細書記載のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子への曝露の結果として得られる調節されたＤＣ集団および／または上記免疫寛容誘発ＤＣへのＴ細胞の曝露の結果として得られる免疫寛容誘発Ｔ細胞（すなわちＴｒ細胞）集団の使用に関するものである。

別の局面において、本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患を処置および／または予防する医薬の製造を目的とする、本明細書記載のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子への曝露の結果として得られるＤＣ集団および／または上記免疫寛容誘発ＤＣへのＴ細胞の曝露の結果として得られる免疫寛容誘発Ｔ細胞（すなわちＴｒ細胞）集団の使用に関するものである。

本明細書記載のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子への曝露の結果として得られる免疫寛容誘発ＤＣおよび／または上記免疫寛容誘発ＤＣへのＴ細胞の曝露の結果として得られる免疫寛容誘発Ｔ細胞（すなわちＴｒ細胞）は、医薬および医薬組成物として利用される。一態様では、上記医薬／医薬組成物は、さらに本明細書記載のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を含み得る。

ＣｈＡ６ ｍＡｂは、ＤＣ成熟に影響を及ぼさない。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦでの５日間の分化後、単球由来のＤＣは、未成熟なままであるかまたは４８時間ｃｈＡ６ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下でＣＤ４０Ｌの活性化を介して成熟に達した。次いで、ＤＣをフローサイトメトリーで分析することにより、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現レベルを測定した。数値は、陽性細胞のパーセンテージを示す。２０回の独立実験を代表する１実験の結果を示す。 ＣｈＡ６ ｍＡｂ処置は、成熟ＤＣにおけるＰＤＬ−２およびＣＤ４５ＲＢの発現を調節する。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦにおける５日間の分化後、単球由来のＤＣは未成熟なままであるか、または４８時間ｃｈＡ６ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下でＣＤ４０Ｌの活性化を介して成熟に達した。次いで、ＤＣをフローサイトメトリーで分析することにより、示されたマーカーのレベルを測定した。示された独立実験で検出された平均±ＳＥＭ量を提示している。Ｐ値をＴ検定により計算した：成熟／ｃｈＡ６ ＤＣおよび成熟ＤＣ間の^＊Ｐ比較および成熟／ｃｈＡ６ ＤＣおよび未成熟ＤＣ間の＄Ｐ比較（^＊Ｐまたは＄Ｐ≦０.０５、^＊＊Ｐまたは＄＄Ｐ≦０.００５）。 ＣｈＡ６ ｍＡｂは、成熟ＤＣによるサイトカイン分泌に影響を及ぼさない。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦにおける５日間の分化後、単球由来のＤＣは、４８時間ｃｈＡ６ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下におけるＣＤ４０の活性化により成熟に達した。成熟（ｍＤＣ）およびｃｈＡ６調節成熟ＤＣ（ｃｈＡ６ ｍＤＣ）を培養し、上清を４８時間後に集めた。分泌されたＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２のレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。１０回の独立実験で検出された平均±ＳＥＭ量を提示している。統計的差異は全く観察されなかった。 ＣｈＡ６調節成熟ＤＣは、低応答性Ｔ細胞を誘導する。末梢ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞を、３ラウンドの刺激の間、未成熟（Ｔｉｍｍ）、成熟（Ｔｍａｔ）または成熟／ｃｈＡ６（ＴｃｈＡ６ ｍａｔ）同種異系ＤＣで反復的に活性化した。第３ラウンドの刺激後、Ｔ細胞株を同種異系ｍＤＣに応じたそれらの増殖能力について試験した（Ａ）。さらに、第３ラウンドの活性化後、ポリクローナル活性化に対するそれらの増殖応答を、可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の非存在または存在下、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）での刺激により試験した（Ｂ）。４８時間の培養後、さらに１６時間［３Ｈ］−チミジンを加えた。結果は、１７回（Ａ）および３回（Ｂ）の独立実験を代表するものである。 ＣｈＡ６調節成熟ＤＣは、Ｔｒ細胞を誘導する。末梢ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞を、３ラウンドの刺激の間、未成熟（Ｔｉｍｍ）、成熟（Ｔｍａｔ）または成熟／ｃｈＡ６（ＴｃｈＡ６ ｍａｔ）同種異系ＤＣで反復的に刺激した。第３ラウンドの刺激後、Ｔ細胞株を、２、３および４日の培養後の同種異系ｍＤＣに応答したそれらの増殖能力（白い記号）、およびｍＤＣで活性化されたオートロガスＣＤ４＋Ｔ細胞の応答に対するそれらの抑制能力（黒い記号）について試験した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ−細胞を、成熟ＤＣ単独（ＭＬＲ）により、または１：１比でのＴｉｍｍ、ＴｍａｔおよびＴｃｈＡ６ ｍａＴ−細胞株の存在下で刺激した。［３Ｈ］−チミジンをさらに１６時間示された時点で加えた。１７回の独立実験を代表する１実験の結果を示す。 ｃｈＡ６−調節ＤＣにより誘導されたＴｒ１細胞が介在する抑制におけるＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの役割。成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでの３ラウンドの活性化後、Ｔ（ｃｈＡ６ｍａｔ）細胞を、抗ＩＬ−１０Ｒ（３０μｇ／ｍｌ）および抗ＴＧＦ−β（５０μｇ／ｍｌ）ｍＡｂの非存在または存在下において、同種異系単球に応答したＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対するそれらの抑制能力について試験した。［３Ｈ］−チミジンをさらに１６時間示された時点で加えた。結果は、３回の独立実験を代表するものである。 ＰＤＬ−２を通したシグナルは、ｃｈＡ６調節ＤＣにより誘導されるＴｒ１細胞の分化に必要とされる。末梢血ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞に、抗ＰＤＬ−２または対照ＩｇＧｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）の非存在または存在下、ｃｈＡ６調節同種異系ＤＣで刺激を加えた。３ラウンドの刺激後、Ｔ細胞を集め、成熟ＤＣに応答したそれらの増殖能力およびオートロガスＣＤ４＋Ｔ細胞の応答に対するそれらの抑制能力について試験した。［３Ｈ］−チミジンをさらに１６時間示された時点で加えた。結果は、３回の独立実験を代表するものである。

発明の詳細な記載
本発明は、ＣＤ４５のＲＯおよびＲＢアイソフォームに結合する分子が、樹状細胞において免疫寛容誘発表現型を誘導し得るという認識に基づくものである。我々は、以後「ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子」とも称する、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢに結合するポリペプチド配列を含む結合分子が、一次Ｔ細胞応答を阻害し、Ｔ細胞寛容を誘導するべく機能し得る免疫寛容誘発樹状細胞を誘導し得ることを見出した。本明細書では、抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢモノクローナル抗体が、単球由来の樹状細胞の成熟および活性化を阻止することはないが、成熟ＤＣにおけるＰＤ−Ｌ２およびＣＤ４５ＲＢの発現を上方制御することを立証している。ナイーブ末梢血ＣＤ４^＋Ｔ細胞を同種異系ＤＣに繰り返し曝露することにより、我々は、ＤＣが、Ｔｒ１細胞と表現型および機能が類似しているＴｒ細胞の集団への末梢血ＣＤ４^＋Ｔ細胞の分化を誘導する形で、抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢモノクローナル抗体がＤＣ機能を調節することを立証した。Ｔｒ１細胞と同様に、これらのＴｒ細胞は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを産生し、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β依存的機構を介してＴ細胞応答を抑制する。さらに、我々は、ＰＤＬ−２を通したシグナリングが、抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ調節ＤＣにより誘導されるＴｒ分化にとって根本的なものであることを立証した。結論として、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は、エフェクターＴ細胞の消失および樹状細胞の調節によるＴｒ細胞の誘導を含む、少なくとも幾つかの作用モードを通した免疫モジュレーターとして機能することが立証された。

「ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子」とは、単独でまたは他の分子と会合してＣＤ４５抗原のＣＤ４５ＲＢおよびＣＤ４５ＲＯアイソフォームに特異的に結合し得る分子を意味する。結合反応は、例えば、特定ＣＤ４５アイソフォームを発現する細胞への分子の結合が可視化できるあらゆる種類の結合検定法、例えば蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析と組み合わせた直接または間接的免疫蛍光法、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイを含む標準方法（定性的検定法）により示され得る。さらに、この分子の結合により、これらのアイソフォームを発現する細胞の機能の改変が誘発され得、例えば１次または２次混合リンパ球応答（ＭＬＲ）の阻害は、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の存在下および非存在下における１次または２次ＭＬＲの阻害を測定し、１次ＭＬＲ阻害の差異を測定するインビトロ検定法またはバイオアッセイで測定され得る。上記検定法の一例は以下の通りである：

ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはヒトＣＤ３＋またはＣＤ４＋細胞を、本明細書記載のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の存在下、または例えばマウス免疫グロブリン−１などの対照分子の存在下、９６ウェル培養プレートの各ウェルにおいて照射同種異系ＰＢＭＣまたはＴ細胞枯渇照射（５０００ｒａｄ）ＰＢＭＣと混合する。細胞混合物を、５％ＣＯ２中３７℃で４または５日間培養し、培養の最後の１６〜２０時間細胞を３Ｈ−チミジンでパルスすることにより、増殖を測定する。１次ＭＬＲの阻害パーセンテージを、対照分子の存在下における細胞増殖との比較で算出する。また、２次ＭＬＲ阻害についても評価し得る。

あるいは、例えばＭＬＲでの細胞活性化後、または特異的抗原、例えば破傷風トキソイドまたは他の抗原、またはポリクローナル刺激物質、例えばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体またはホルボールエステルおよびＣａ＋＋イオノホアでの刺激後、ＰＢＭＣまたはＴ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、サイトカインの産生、細胞表面分子の発現の変化を測定することにより、インビトロ機能調節効果を測定することも可能である。同種異系細胞の代わりに刺激物質として例えば上記で挙げたものなどの可溶性抗原またはポリクローナル刺激物質を使用すること以外、培養物をＭＬＲについて記載した方法と同様にして設定する。好ましくは上記要領で３Ｈ−チミジン取り込みによりＴ細胞増殖を測定する。サイトカイン捕獲抗体で９６ウェルトレイの表面をコーティングし、培養物からの上清を加え、室温で１時間インキュベーションし、次いで特定サイトカインに特異的な検出抗体を加え、酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした第２段階抗体、次いで対応する基質を加えた後、プレートリーダーで吸光度を測定するサンドイッチＥＬＩＳＡによりサイトカイン産生を測定する。特定細胞表面分子に特異的な抗体で標的Ｔ細胞を染色した後、直接または間接免疫蛍光により細胞表面分子の変化を測定する。抗体を蛍光色素で直接標識するか、または第１抗体に特異的な蛍光標識第２段階抗体を使用し得、細胞を細胞蛍光分析計で分析する。

本発明で使用する結合分子は、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢの両方（「ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合分子」）について結合特異性を有する。

好ましくは、結合分子は、（Ｋｄ）＜２０ｎＭ、好ましくはＫｄ＜１５ｎＭまたは＜１０ｎＭ、または好ましくはＫｄ＜５ｎＭの解離定数でＣＤ４５ＲＯアイソフォームに結合する。好ましくは、結合分子は、Ｋｄ＜５０ｎＭ、好ましくはＫｄ＜１５ｎＭまたは＜１０ｎＭ、さらに好ましくはＫｄ＜５ｎＭでＣＤ４５ＲＢアイソフォームに結合する。

さらに別の好ましい態様において、本発明で使用される結合分子は、
１）ＣＤ４５分子のＡおよびＢエピトープを含むが、Ｃエピトープは含まず、および／または
２）ＣＤ４５分子のＢエピトープは含むが、ＡエピトープもＣエピトープも含まず、および／または
３）ＣＤ４５分子のＡ、ＢまたはＣエピトープのいずれも含まない
ＣＤ４５アイソフォームと結合する。

さらに別の好ましい態様において、結合分子は、
１）ＣＤ４５分子のＡ、ＢおよびＣエピトープの全部、および／または
２）ＣＤ４５分子のＡエピトープではなくＢおよびＣエピトープの両方
を含むＣＤ４５アイソフォームとは結合しない。

さらに別の好ましい態様において、結合分子は、
１）メモリーおよびインビボアロ活性化Ｔ細胞を認識し、そして／または
２）ヒトＴ細胞、例えばＰＥＥＲ細胞上のその標的に結合し、その場合結合は、好ましくはＫｄ＜１５ｎＭ、さらに好ましくはＫｄ＜１０ｎＭ、最も好ましくはＫｄ＜５ｎＭであるものとし、そして／または
３）インビトロアロ反応性Ｔ細胞機能を、好ましくは約１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭまたは３０ｎＭ未満のＩＣ_５０、さらに好ましくは約１０または５ｎＭのＩＣ_５０、最も好ましくは約０.５ｎＭまたは０.１ｎＭのＩＣ_５０で阻害し、そして／または
４）ヒトＴリンパ球においてアポトーシスによる細胞死を誘導し、そして／または
５）インビトロでアロ抗原特異性Ｔ細胞寛容を誘導し、そして／または
６）有効量で投与されたときに、ヒトＰＢＭＣの注射によりＳＣＩＤマウスで誘導された致命的な異種間移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を阻止し、そして／または
７）Ｔリンパ球、単球、幹細胞、ナチュラルキラー細胞および／または顆粒球には結合するが、血小板またはＢリンパ球には結合せず、そして／または
８）特徴的なＴ調節細胞（Ｔｒｅｇ）表現型をもつＴ細胞の分化を促し、そして／または
９）ナイーブＴ細胞活性化を抑制し得るＴ調節細胞を誘導し、そして／または
１０）ヒト同種移植皮膚拒絶を伝達する炎症過程を抑制し、特にヒト皮膚が移植され、単核脾臓細胞が生着したＳＣＩＤマウスにおけるインビボでのヒト同種移植皮膚拒絶を伝達する炎症過程を抑制し、そして／または
１１）ｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルにおいてヒト膵島同種移植片の生存を延長する。

さらなる好ましい態様において、本発明で使用する結合分子は、Aversa et al., Cellular Immunology 158、314-328（1994）に報告されたモノクローナル抗体「Ａ６」と同じエピトープに結合する。この全内容については、出典明示で援用しており、読者は具体的にはそれを参照のこと。

上記結合特性および生物活性故に、本発明で使用する結合分子は、医療、例えば治療および／予防に特に有用である。さらに、上記結合分子は、ＤＣが免疫寛容誘発表現型を呈するように、エクスビボでＤＣ機能を調節するのに特に有用である。これらの免疫寛容誘発ＤＣは、治療および／または予防に有用であると考えられる。結合分子および／または調節ＤＣが特に有用である疾患には、下記に示す、自己免疫疾患、移植拒絶、皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患および／またはアレルギーがある。

配列番号１のポリペプチドおよび配列番号２のポリペプチドを含む分子は、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子である。配列番号１のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子における超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’は、以下の通り、アミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＱ)（配列番号１９）を有するＣＤＲ１’、アミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(ＳＳＳＥＳＩＳ)（配列番号２０）を有するＣＤＲ２’、アミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(ＱＱＳＮＴＷＰＦＴ)（配列番号２１）を有するＣＤＲ３’である。

我々はまた、配列番号２のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子における超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、すなわちアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(ＮＹＩＩＨ)（配列番号２２）を有するＣＤＲ１、アミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ)（配列番号２３）を有するＣＤＲ２およびアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ)（配列番号２４）を有するＣＤＲ３を見出した。

ＣＤＲは、本質的に抗原結合特性を決定する超可変領域とも呼ばれる３つの特異的な相補性決定領域である。これらのＣＤＲは、例えば配列番号１または配列番号２のそれぞれの可変領域の一部であり、これらのＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）、例えば定常領域と交互に位置する。キメラ抗体において、配列番号１は、例えば配列番号３の軽鎖の一部であり、配列番号２は、例えば配列番号４の重鎖の一部である。重鎖のＣＤＲは、会合した軽鎖のＣＤＲと一緒になって、本質的に本発明で使用する分子の抗原結合部位を構成する。結合のエネルギー特性に対する軽鎖可変領域の貢献度は、会合した重鎖可変領域の場合と比べると小さいこと、および単離された重鎖可変領域はそれら自体に抗原結合活性を有することが知られている。上記分子は、一般に単一ドメイン抗体と称される。

本発明の一態様では、使用される結合分子は、少なくとも１個の抗原結合部位を含むもので、例えばＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子があり、順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、すなわちアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(ＮＹＩＩＨ)（配列番号２２）を有するＣＤＲ１、アミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ)（配列番号２３）を有するＣＤＲ２およびアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ)（配列番号２４）を有するＣＤＲ３を含む。さらに別の態様では、結合分子は、構造的に上記で特定した結合分子の直接等価物である。

別の局面において、本発明は、
ａ）順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、上記ＣＤＲ１がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His (ＮＹＩＩＨ)（配列番号２２）を有し、上記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ)（配列番号２３）を有し、上記ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ)（配列番号２４）を有するものである第１ドメイン、および
ｂ）順に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、ＣＤＲ１’がアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＱ)（配列番号１９）を有し、ＣＤＲ２’がアミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (ＳＳＳＥＳＩＳ)（配列番号２０）を有し、ＣＤＲ３’がアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (ＱＱＳＮＴＷＰＦＴ)（配列番号２１）を有するものである第２ドメイン
を含む、少なくとも１個の抗原結合部位を含む分子、例えばＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を使用する。別の態様において、本発明は、上記で直接的に特定した結合分子の直接等価物である結合分子を使用する。

好ましい態様において、順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む第１ドメインは、免疫グロブリン重鎖であり、順に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む第２ドメインは、免疫グロブリン軽鎖である。

さらなる局面において、本発明は、配列番号１のポリペプチドおよび／または配列番号２のポリペプチドを含む、好ましくは１ドメインに配列番号１のポリペプチドおよび別のドメインに配列番号２のポリペプチドを含む分子、例えばＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子、例えばキメラモノクローナル抗体を使用する。別の局面において、本発明は、配列番号３のポリペプチドおよび／または配列番号４のポリペプチドを含む、好ましくは１ドメインに配列番号３のポリペプチドおよびもう１つのドメインに配列番号４のポリペプチドを含む分子、例えばＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子、例えばキメラモノクローナル抗体を使用する。抗原結合部位が第１および第２の両ドメインまたは配列番号１または配列番号３のポリペプチドおよび配列番号２または配列番号４のポリペプチドをそれぞれ含むとき、これらは同一ポリペプチドに位置し得るか、または好ましくは、各ドメインは、異なる鎖に位置し得、例えば第１ドメインは重鎖、例えば免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメントの一部であり、第２ドメインは軽鎖、例えば免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメントの一部である。

上記の記載から明らかな通り、好ましい態様において、本発明により使用されるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であって、結合活性は、主に上記ＣＤＲ領域により決定されるものとし、例えば上記ＣＤＲ領域は、結合特異性を伴わずに実質的にヒトに由来する他の分子、例えばフレームワーク、例えば定常領域と会合している。好ましい態様において、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は、ＩｇＧ１アイソフォームのモノクローナル抗体である。

本発明は、Aversa et al., Cellular Immunology 158、314-328（1994）に報告されたモノクローナル抗体「Ａ６」であるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を利用してよく、Ａ６の特性を明らかにする節について出典明示で援用する。
別の局面において、本発明は、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子を使用する。

ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の例には、例えばＢ細胞またはハイブリドーマにより産生される抗体および／またはそのフラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメント、並びに単鎖または単一ドメイン抗体から誘導されたキメラまたはヒト化抗体がある。単鎖抗体は、通常１０〜３０アミノ酸、好ましくは１５〜２５アミノ酸から成る、ペプチドリンカーにより共有結合された抗体重および軽鎖の可変領域により構成される。したがって、かかる構造は重および軽鎖の定常部分を含まないものであり、小さいペプチドスペーサーは定常部分全体より当然抗原性が低いと考えられる。キメラ抗体とは、重および軽鎖その両方の定常領域がヒトに由来し、重および軽鎖の両方の可変ドメインがヒト以外（例えば、マウス）の起源を有する抗体を意味する。ヒト化抗体とは、超可変領域（ＣＤＲ）がヒト以外（例えば、マウス）の起源に由来し、他の部分の全てまたは実質的に全て、例えば定常領域および可変領域の高度保存部分がヒトに由来する抗体を意味する。しかしながら、ヒト化抗体は、超可変領域に隣接した可変領域の一部分にマウス配列の数個のアミノ酸を保持し得る。

超可変領域、すなわちＣＤＲ’は、いかなる種類のフレームワーク領域、例えばヒトに由来する軽および重鎖の定常部分とも会合し得る。適切なフレームワーク領域は、例えば“Sequences of proteins of immunological interest”、Kabat, E.A. et al.（米国保健福祉省、公衆衛生総局、国立衛生研究所）に記載されている。好ましくは、ヒト重鎖の定常部分は、サブタイプを含むＩｇＧ１型に属し、好ましくは、ヒト軽鎖の定常部分はκまたはλ型、さらに好ましくはκ型に属し得る。好ましくは、上記重鎖は１個以下のグリコシル化部位を含み、最も好ましくは、グリコシル化部位はＮ−グリコシル化部位であり、最も好ましくは、１グリコシル化部位は、重鎖の定常部分に位置する。最も好ましくは、グリコシル化部位は可変領域に存在せず、好ましくは、フレームワーク領域にグリコシル化部位は存在しない。

重鎖の好ましい定常部分は、配列番号４（上記で具体的に示したＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’配列部分は伴わない）のポリペプチドであり、軽鎖の好ましい定常部分は、配列番号３（上記で具体的に示したＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列部分は伴わない）のポリペプチドである。

一態様では、上記ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含むアミノ酸配列番号７またはアミノ酸配列番号８の軽鎖可変領域および／または上記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列番号９または配列番号１０の重鎖可変領域を含むヒト化抗体が使用される。

さらなる態様では、上記ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含むアミノ酸配列番号７またはアミノ酸配列番号８の軽鎖可変領域および／または上記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列番号３１または配列番号３２の重鎖可変領域を含む別のヒト化抗体が使用される。

さらに別の態様において、本発明は、配列番号９または配列番号１０のポリペプチドおよび配列番号７または配列番号８のポリペプチドを含むヒト化抗体を使用する。さらに別の態様において、本発明は、配列番号３１または配列番号３２のポリペプチドおよび配列番号７または配列番号８のポリペプチドを含むヒト化抗体を使用する。

さらなる態様において、本発明は、
−配列番号９のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド（例えばＶＨＥ／ｈｕｍＶ２）、
−配列番号９のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド（例えばＶＨＥ／ｈｕｍＶ１）、
−配列番号１０のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド（例えばＶＨＱ／ｈｕｍＶ２）、
−配列番号１０のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド（例えばＶＨＱ／ｈｕｍＶ１）、
−配列番号３１のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド（例えばＶＨＥＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ２）、
−配列番号３１のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド（例えばＶＨＥＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１）、
−配列番号３２のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド（例えばＶＨＱＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ２）、または
−配列番号３２のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド（例えばＶＨＱＮ７３Ｄ／ｈｕｍＶ１）、
を含むヒト化抗体を使用する。

例えば本明細書で具体的に示した配列、例えばＣＤＲ１（配列番号２２）、ＣＤＲ２（配列番号２３）、ＣＤＲ３（配列番号２４）、ＣＤＲ１’（配列番号１９）、ＣＤＲ２’（配列番号２０）、ＣＤＲ３’（配列番号２１）、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号３１または配列番号３２を有する本発明により使用されるポリペプチドへの言及は、上記（ポリ）ペプチド（配列）の直接等価物も包含し、例えば上記ポリペプチドの機能的誘導体を含む。上記機能的誘導体は、特定された配列の共有結合修飾形態を含み得、そして／または上記機能的誘導体は、特定された配列のアミノ酸配列変異型を包含し得る。

「ポリペプチド」は、特に断らなければ、ペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸を含み、Ｎ末端先端部から始まり、Ｃ末端先端部で終わるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質を包含する。好ましくは、本発明で使用されるポリペプチドは、モノクローナル抗体である。さらに好ましくは、ポリペプチドは、キメラ（Ｖ移植）またはヒト化（ＣＤＲ移植）モノクローナル抗体である。ヒト化（ＣＤＲ移植）モノクローナル抗体は、アクセプター抗体のフレームワーク（ＦＲ）配列へ導入されたさらなる突然変異を含んでも含まなくてもよい。好ましくは、ヒト化またはキメラ抗体は、１個以下のグリコシル化部位を含む。最も好ましくは、上記の１グリコシル化部位はＮ−グリコシル化部位である。最も好ましくは、可変領域にグリコシル化部位は存在せず、さらに好ましくは、グリコシル化部位は重鎖の可変領域に存在せず、最も好ましくは、フレームワーク領域（ＦＲ）にグリコシル化部位は存在しない。

本発明で使用されるポリペプチドの機能性誘導体は、本発明で使用されるポリペプチドと共通した質的な生物活性を有する、すなわちＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの結合能を有する分子を含む。本発明により使用される機能性誘導体は、本発明により使用されるポリペプチドのフラグメントおよびペプチド類似体を含む。フラグメントは、例えば特定された配列を有する、ポリペプチドの配列内にある領域を含む。「誘導体」の語は、例えば特定された配列を有する、本発明で使用されるポリペプチドのアミノ酸配列変異型および共有結合修飾形態を定義するのに使用される。例えば特定された配列を有する、本発明により使用されるポリペプチドの機能性誘導体は、例えば特定された配列を有する、構造的に上記で特定したポリペプチドのアミノ酸配列と好ましくは少なくとも約６５％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５％の全体的配列相同性を有し、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの結合能を実質的に保持している。

好ましくは、機能性誘導体は、少なくとも配列番号１のポリペプチドおよび／または配列番号２のポリペプチドを含む結合分子、配列番号９または配列番号１０のポリペプチドおよび／または配列番号７または配列番号８のポリペプチドを含むヒト化抗体、または配列番号３１または配列番号３２のポリペプチドおよび／または配列番号７または配列番号８のポリペプチドを含むヒト化抗体の結合親和力を有する。

「共有結合修飾」の語は、有機タンパク質性または非タンパク質性誘導体化剤による、例えば特定された配列を有する、本明細書記載のポリペプチドまたはそのフラグメントの修飾、異種ポリペプチド配列との融合、および翻訳後修飾を含む。例えば特定された配列の共有結合修飾ポリペプチドは、架橋によるＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの結合能を依然として有している。共有結合修飾は、ターゲッティングされたアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることにより、または選択された組換えｈｏｓＴ細胞において機能する翻訳後修飾機構を利用することにより伝統的手法で導入される。ある種の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組換えｈｏｓＴ細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に翻訳後脱アミド化されることが多い。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル、チロシンまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化があり、例えば T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., サンフランシスコ、79-86頁（1983）参照。例えば、共有結合修飾は、例えば特定された配列を有する、本明細書記載のポリペプチドを含む融合タンパク質およびそれらのアミノ酸配列変異型、例えば免疫アドヘシン、および異種シグナル配列へのＮ−末端融合体を含む。

天然ポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する「相同性」については、配列を整列させ、必要ならば、最大相同性パーセントを達成するため、ギャップを導入した後における、対応する天然ポリペプチドの残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書では定義し、配列同一性の一部として同類置換を考慮に入れることはしない。Ｎ末端またはＣ末端の伸長または挿入のいずれも、同一性または相同性を減じるものとはみなされない。アラインメントに関する方法およびコンピュータープログラムは公知である。

「アミノ酸」は、例えば、そしてＤ−アミノ酸を含め、全ての天然に存するＬ−α−アミノ酸を包含する。アミノ酸は、公知の１文字または３文字名称により識別される。

「アミノ酸配列変異型」の語は、例えば特定された配列を有する、本明細書記載のポリペプチドとの比較において何らかのアミノ酸配列の差異を示す分子を包含する。例えば特定された配列を有する、本明細書記載のポリペプチドのアミノ酸配列変異型は、依然としてＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの結合能を有している。

置換変異型は、例えば特定された配列を有する、本明細書記載のポリペプチドにおいて、少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その代わりに同一位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。これらは、分子中の１アミノ酸のみが置換された場合、単一置換型であり得、または２個またはそれ以上のアミノ酸が同一分子中で置換された場合にはそれらは複数置換型であり得る。挿入変異型は、１個またはそれ以上のアミノ酸が、例えば特定された配列を有する、本明細書記載のポリペプチドの特定位置にあるアミノ酸に隣接して挿入されたものである。アミノ酸に隣接しているということは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基に連結されていることを意味する。欠失変異型は、例えば特定された配列を有する、本発明によるポリペプチド中の１個またはそれ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異型では、分子の特定領域において１個または２個のアミノ酸が欠失している。

また、本明細書では、以下のポリヌクレオチド配列を記載している：
− ＣＤＲ１のアミノ酸配列をコード化する、ＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＣＡＴＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡＣＡＧＴＧ（配列番号２５）；
− ＣＤＲ２のアミノ酸配列をコード化する、ＴＴＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＧ（配列番号２６）；
− ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコード化する、ＡＣＡＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＴＣＡＣＧＴＴ（配列番号２７）；
− ＣＤＲ１’のアミノ酸配列をコード化する、ＴＴＡＴＡＴＴＡＴＣＣＡＣＴＧ（配列番号２８）；
− ＣＤＲ２’のアミノ酸配列をコード化する、ＴＴＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＡＣＴＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧ（配列番号２９）；
− ＣＤＲ３’のアミノ酸配列をコード化する、ＡＧＧＡＣＣＣＴＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＧＡＣＡＣＣＴＧ（配列番号３０）；
− 配列番号１のポリペプチド、すなわち本発明により使用されるｍＡｂの軽鎖の可変領域をコード化する配列番号５；
− 配列番号２のポリペプチド、すなわち本発明により使用されるｍＡｂの重鎖の可変領域をコード化する配列番号６；
− 配列番号９のポリペプチド、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域をコード化する配列番号１１；
− 配列番号１０のポリペプチド、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域をコード化する配列番号１２；
− 配列番号７のポリペプチド、すなわちＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む軽鎖可変領域をコード化する配列番号１３；
− 配列番号８のポリペプチド、すなわちＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む軽鎖可変領域をコード化する配列番号１４；
− 配列番号８のポリペプチド、すなわちＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む軽鎖可変領域をコード化する配列番号３３；
− 配列番号３１のポリペプチド、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域をコード化する配列番号３４；および
−配列番号３２のポリペプチド、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域をコード化する配列番号３５；

ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子をコード化する、例えば本明細書記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチドおよび／または本明細書記載のＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’のアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、本発明により使用される結合分子生成用の供給材料として使用され得る。上記ポリヌクレオチドは、上記で列挙したものおよび次の通り下記に示したものを含む：

配列番号５のポリヌクレオチドおよび／または、好ましくはおよび、配列番号６のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；

配列番号７または配列番号８のポリペプチドおよび／または、好ましくはおよび、配列番号９または配列番号１０のポリペプチドをコード化する、例えば
− 配列番号７のポリペプチドおよび配列番号９のポリペプチド、
− 配列番号７のポリペプチドおよび配列番号１０のポリペプチド、
− 配列番号８のポリペプチドおよび配列番号９のポリペプチド、または
− 配列番号８のポリペプチドおよび配列番号１０のポリペプチド、
をコード化するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；

配列番号１１または配列番号１２のポリヌクレオチドおよび／または、好ましくはおよび、配列番号１３のポリヌクレオチドまたは配列番号１４のポリヌクレオチドを含む、好ましくは
− 配列番号１１のポリヌクレオチドおよび配列番号１３のポリヌクレオチド、
− 配列番号１１のポリヌクレオチドおよび配列番号１４のポリヌクレオチド、
− 配列番号１２のポリヌクレオチドおよび配列番号１３のポリヌクレオチド、または
− 配列番号１２のポリヌクレオチドおよび配列番号１４のポリヌクレオチド、
を含むポリヌクレオチド；

配列番号３１または配列番号３２のポリペプチドおよび／または、好ましくはおよび、配列番号７または配列番号８のポリペプチドをコード化する、例えば
− 配列番号３１のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド、
− 配列番号３１のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド、
− 配列番号３２のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド、または
− 配列番号３２のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド、
をコード化するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および

配列番号３４または配列番号３５のポリヌクレオチドおよび／または、好ましくはおよび、配列番号３３、配列番号１４または１３のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
− 配列番号３４のポリペプチドおよび配列番号３３のポリペプチド、
− 配列番号３４のポリペプチドおよび配列番号１４のポリペプチド、
− 配列番号３４のポリペプチドおよび配列番号１３のポリペプチド、
− 配列番号３５のポリペプチドおよび配列番号３３のポリペプチド、
− 配列番号３５のポリペプチドおよび配列番号１４のポリペプチド、
− 配列番号３５のポリペプチドおよび配列番号１３のポリペプチド。

本明細書において特に断らなければ、「ポリヌクレオチド」は、限定するわけではないが、１本および２本鎖ＲＮＡ、および１本および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡを含め、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得るポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを包含する。

例えばキメラ、ヒト化または完全ヒト抗体であるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は、組換えＤＮＡ技術により製造され得る。すなわち、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢをコード化する１個またはそれ以上のＤＮＡ分子を構築し、適切な制御配列下に置き、適切なベクターによる発現に適した宿主（生物体）へ（例えば、トランスフェクションにより）移入することが可能である。

上記ポリヌクレオチドは、例えばＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子の単一重および／または軽鎖をコード化し得る。

ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は、本明細書で提供した情報、例えば超可変または可変領域のアミノ酸配列およびこれらの領域をコード化するポリヌクレオチド配列の情報と併せて慣用的方法により得られる。可変ドメイン遺伝子の構築方法は、例えば欧州特許第２３９４００号に記載されており、簡単には次のとおり要約できる：いかなる特異性のものにせよ、ｍＡｂの可変領域をコード化する遺伝子がクローン化され得る。フレームワークおよび超可変領域をコード化するＤＮＡセグメントを決定し、超可変領域をコード化するＤＮＡセグメントを除去する。２本鎖合成ＣＤＲカセットを、本明細書記載のＣＤＲおよびＣＤＲ’配列に従ってＤＮＡ合成により調製する。これらのカセットは、それらがヒト起源の所望のフレームワークの接合点でライゲーションされ得るように付着末端を伴った形で提供される。また単鎖抗体をコード化するポリヌクレオチドは、例えば慣用的方法に従って、例えば類似手順で製造され得る。本発明で使用されるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、好都合には適切な発現ベクターへ移入され得る。

適切な細胞株（例えばＣＨＯ細胞株、例、ＤＧ４４および他のＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞、Ｓｐ／２またはＮＳ／０細胞株）は、慣用的方法に従って使用され得る。例えば適切なプロモーター（複数も可）および重および軽鎖定常部分をコード化する遺伝子を含む発現ベクターは、公知であり、例えば市販されている。適切な宿主（細胞培養物またはトランスジェニック動物を含む）は、公知であるかまたは慣用的方法に従って見出され得る。

適切な発現ベクターは、例えば配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１の、本明細書に記載されたＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子をコード化するポリヌクレオチドを含む。

上記で述べた通り、本発明により使用されるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は、ＤＣ表現型の調節を通して免疫抑制および免疫寛容誘発効果を発揮する。ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子が呈するこれらの以前には評価されなかった特性により、それらは、アロ抗原、自己抗原、アレルゲンおよび細菌叢抗原に対するインビボおよびエクスビボの両方での寛容誘導に有用なものとなっている。例えば、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子は、例えば自己免疫疾患、例えば、限定されるわけではないが、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス病、Ｉ型およびII型糖尿病、多発性硬化症、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、自己免疫性胃炎、糸球体腎炎、移植拒絶、例えば、限定されるわけではないが、臓器および組織の同種移植および異種移植拒絶を含む疾患の処置および予防を目的として、例えば心臓、肺、心肺同時、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚または角膜移植の例えばレシピエントの処置を目的として、例えば骨髄移植後の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、および／または膵島Ｔ細胞移植拒絶、および／または乾癬、皮膚炎、例えばアレルギー性接触皮膚炎を含むアトピー性および接触皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギー性喘息を含むアレルギーの処置を目的として、上記結合分子への曝露後、処置を必要とする宿主へ導入され得る免疫寛容誘発ＤＣのエクスビボ誘導に有用であり得る。好ましい態様では、本発明の方法および組成物は、乾癬および移植拒絶の（例えば移植された同種異系細胞、例えば膵島細胞のヒトレシピエントによる拒絶の改善における）処置および／または予防に関するものである。

本明細書記載のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子への曝露により調節されたＤＣは、例えば自己免疫疾患、移植拒絶、例えば膵島Ｔ細胞移植拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギーの処置および／または予防を目的とする有用な医薬／薬剤となると考えられる。

本明細書で使用しているＤＣおよび／またはＴｒ細胞の「有効量」は、直接的または間接的に、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギーから生じる１つまたはそれ以上の症状の軽減、上記疾患の患者の生活の質の向上、上記疾患の処置に必要とされる他の医薬の用量の低減化、別の薬物療法の効果の促進、病気の進行の遅延および／または患者の延命などの臨床結果を含む有益な、または所望の結果をもたらすのに十分な量である。

有効量を１回以上の投与回数で投与でき、別の薬剤、化合物または医薬組成物と共に達成させてもさせなくてもよい。すなわち、「有効量」は、１種以上の治療剤を投与する状況で考慮され得るもので、１種またはそれ以上の他の薬剤と共に、望ましい成果が達成され得るかまたは達成される場合、単剤を有効量で与えることも考えられ得る。

本発明により調節されたＤＣおよび／または調節されたＤＣへのＴ細胞の曝露から生じるＴｒは、例えば自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギーに関連する疾患の処置または予防を目的として、単独有効成分（複数も可）として、または免疫調節治療計画における他の薬剤または他の抗炎症剤と一緒に投与され得る。例えば、ＤＣおよび／またはＴｒは、カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡ、シクロスポリンＧ、ＦＫ−５０６、ＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５、ＡＰ２３８４１、ＴＡＦＡ−９３、バイオリムス−７またはバイオリムス(bioimus)−９、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキセート、Ｓ１Ｐ受容体アゴニスト、例、ＦＴＹ７２０またはその類似体、レフルノミドまたはその類似体、ミゾリビン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、１５−デオキシスペルグアリンまたはその類似体、免疫抑制モノクローナル抗体、例、白血球受容体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２７、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＯＸ４０、４−１ＢＢまたはそれらのリガンド、例えばＣＤ１５４に対するモノクローナル抗体、または他の免疫調節化合物、例えばＣＴＬＡ４またはその突然変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部分、例えば非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合させたＣＴＬＡ４またはその突然変異体の少なくとも細胞外部分を有する組換え結合分子、例、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（例、ＡＴＣＣ６８６２９と称す）またはその突然変異体、例、ＬＥＡ２９Ｙ、または他の接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−１アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニストおよびＶＬＡ−４アンタゴニストを含むｍＡｂまたは低分子量阻害剤と組み合わせて使用され得る。

投与は、注射を含む慣用的経路により、または長時間の徐々の注入により行われ得る。投与は、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、局所または経皮経路によるものであり得る。「共投与」とは、同一賦形剤または別々の賦形剤中で、一緒に、または実質的に同時に成分を投与することをいう。

好ましくは、複数成分は固定された組み合わせ剤として投与される。
本発明の医薬および医薬組成物は、少なくとも１種の医薬上許容される担体または希釈剤を含み得る。

本明細書で使用する「医薬上許容される担体または希釈剤」の語は、ヒトを含む哺乳類への投与に適切である１種以上の適合性のある固体または液体充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。「担体」の語は、有効成分と組み合わせることにより適用し易くする天然または合成の有機または無機成分を意味する。

「医薬上許容される」の語は、有効成分の生物活性の有効性を妨げることのない非毒性材料について用いる。上記調製物は、常用的に医薬上許容される濃度の塩類、緩衝剤、保存剤、適合性のある担体、補充的免疫増強剤、例えばアジュバントおよびサイトカイン類および所望による他の治療剤、例えば化学療法剤を含み得る。

医薬で使用する場合、塩類は当然医薬上許容され得るものであるが、医薬上許容されない塩類でも、好都合にはその医薬上許容される塩類の製造に使用され得る。
医薬組成物は、塩中に酢酸、塩中にクエン酸、塩中にホウ酸、および塩中にリン酸を含む、適切な緩衝剤を含有し得る。
医薬組成物はまた、所望により、適切な保存剤、例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン類およびチメロサールを含有し得る。

対象に投与されるＤＣおよび／またはＴｒ細胞の用量は、種々のパラメーターに従って、特に使用される投与方式および対象の状態に従って選択され得る。他の因子には、所望の処置期間がある。対象における応答が初回適用量では不十分な事象の場合、さらに高用量（または異なる、さらに局所的な送達経路による効果的高用量）が、患者耐容性が許容する範囲まで使用され得る。

本発明の医薬組成物／医薬は、さらに例えば有効成分、例えば他の免疫調節抗体、例えば制限されるわけではないが本明細書記載のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１５４、抗ＣＤ１３４Ｌまたは組換えタンパク質、例えば、制限されるわけではないが、ｒＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ｒＯＸ４０（ＣＤ１３４）、または抗炎症剤または免疫調節化合物、例えば制限されるわけではないが、上記と同様、シクロスポリンＡ、ＦＴＹ７２０、ＲＡＤ、ラパマイシン、ＦＫ５０６、１５−デオキシスペルグアリン、ステロイド類などを含み得る。

本発明組成物は、自由な組み合わせとして投与され得るか、または一定の組み合わせ剤に調合され得る。絶対的投薬量は、多数の因子、例えば個体、投与経路、所望の持続時間、有効成分放出速度および処置される状態の性質および重症度により変動する。本発明の方法および使用法に従って処置される上記で概説した疾患には、限定されるわけではないが、例えば、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス病、Ｉ型およびII型糖尿病、多発性硬化症、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、自己免疫性胃炎および糸球体腎炎を含む自己免疫疾患、移植拒絶、例えば、限定されるわけではないが、臓器および組織の同種移植および異種移植拒絶、例えば心臓、肺、心肺同時、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚または角膜移植のレシピエントの例えば処置を要する場合、例えば骨髄移植後の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、および／または膵島Ｔ細胞移植拒絶、乾癬、皮膚炎、例えばアレルギー性接触皮膚炎を含むアトピー性および接触皮膚炎、炎症性腸疾患および／またはアレルギー性喘息を含むアレルギーがある。

実施例
以下の実施例を参照することにより、本発明に対する理解はさらに深まるはずである。これらの実施例は、説明を目的とするものであって、本発明の範囲を制限するものとしてみなすべきではない。

ｃｈＡ６ ｍＡｂとして本明細書で称する抗体は、配列番号３の軽鎖および配列番号４の重鎖を含むキメラ抗体である。

統計的有意差についての分析は全て、スチューデントの両側ｔ検定により遂行したものである。０.０５未満のｐ値を有意であるとみなした。培養は全てトリプリケイトで実施し、エラーバーはＳＤを表す。

キメラＡ６抗体（ｃｈＡ６）の作製
ＲＴ−ＰＣＲによりクローン化したｍＡｂ Ａ６（５８）の可変領域を、ヒトガンマ−１重鎖およびヒトカッパ軽鎖定常領域と連結することにより、ｃｈＡ６を作製した。ＳＰ２／０細胞へトランスフェクションし、Ｇ４１８およびメトトレキセートを用いてクローンを選択した後、抗体をヤギ抗ヒトＩｇＧに対するアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ACTICLEAN ETOX（Sterogene、２７０５−０１）を用いて内毒素を除去した。最終内毒素レベルはタンパク質１ｍｇにつき３０ｐｇ未満であった。

ＤＣの分化
健康なドナーからのＰＢＭＣを、フィコール−ハイパーク勾配（Nycomed Amersham）により遠心分離した。３７℃で１０％ＦＣＳ（Biowhittaker）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Bristol-Myers Squibb）および５０μＭの２−メルカプトエタノール（BioRad）を補ったＲＰＭＩ１６４０（Biowhittaker）（ＤＣ培地）中において１時間インキュベーションした後、接着画分としてＣＤ１４^＋単球を単離した。十分に洗浄した後、接着した単球を、ＤＣ培地中１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−４（R & D Systems）および１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Immunotools）での培養によりＤＣへ分化させた。５日後、ＤＣを刺激しないまま置いておくか、またはヒトＣＤ４０Ｌを発現する照射（１００００ＲＡＤＳ）した３Ｔ３線維芽細胞を含むウェルへ移すことにより、成熟を誘導した。ＤＣ成熟中、抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ（ｃｈＡ６）ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で細胞を培養した。２日後、未成熟、成熟および成熟／ｃｈＡ６ ＤＣを集め、照射（６０００ＲＡＤＳ）し、Ｔ細胞の刺激に使用し、冷凍し、刺激の各ラウンドの前に解凍した。ＤＣの純度および成熟状態を常用手順でフローサイトメトリー分析によりチェックして、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ８３およびＨＬＡ−ＤＲの発現を測定した。典型的には、培養物は、＞９０％の率でＣＤ１ａ^＋ＣＤ１４⁻細胞を含んでいた。幾つかの実験では、未成熟、成熟およびｃｈＡ６調節（成熟／ｃｈＡ６）ＤＣを、共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６、ＩＣＯＳ−リガンド、ＩＬＴ−４（Gregorio Aversaから寄贈）、ＩＬＴ−３（Immunotech）、ＰＤＬ−１、ＰＤＬ−２（eBioscience）、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢ（BD bioscience）およびＳＬＡＭ（Gregorio Aversaから寄贈）発現の発現レベルについても試験した。

Ｔ細胞の精製
製造業者の使用説明書に従って、ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotech）を用いるネガティブ選択によりＣＤ４^＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから精製した。得られたＣＤ４^＋Ｔ細胞の一部分を、後で使用するため低温保存し、残りについては、抗ＣＤ４５ＲＯ結合磁気ビーズおよびＬＤネガティブ選択カラム（Miltenyi Biotech）を用いることによりＣＤ４５ＲＯ^＋細胞を枯渇させた。得られた細胞は、必ず９０％を超える割合のＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＯ⁻ＣＤ４５ＲＡ^＋であった。

Ｔ細胞分化
１×１０^５ＤＣを、５％プールＡＢヒト血清（Biowhittaker）および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Bristol-Myers Squibb）を補った２ｍｌのX-vivo 15 培地（Biowhittaker）中で１×１０^６の同種異系ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＯ⁻Ｔ細胞と共に培養した。６または７日後、ｒｈＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）（Chiron）を添加し、細胞をさらに７〜８日間拡大させた。培養開始の１４日後、Ｔ細胞を集め、洗浄し、１次培養で使用した同じ同種異系ドナーからの未成熟、成熟または成熟／ｃｈＡ６ＤＣで再刺激した。３日後、ｒｈＩＬ−２を添加した。２回目の刺激後、Ｔ細胞を集め、洗浄し、それらの増殖性および抑制能力について試験した。幾つかの実験では、中和性抗ＰＤＬ２（ＭＩＨ１８、１０μｇ／ｍｌ、eBioscience）ｍＡｂを刺激の各ラウンドの開始時に添加し、毎回細胞を分離した。未成熟ＤＣで反復刺激されたＴ細胞をＴ（ｉｍｍ）、成熟ＤＣで反復刺激されたＴ細胞をＴ（ｍａｔ）および成熟／ｃｈＡ６ ＤＣで反復刺激されたＴ細胞をＴ（ｃｈＡ６ ｍａｔ）と称す。

Ｔ細胞の増殖および抑制
Ｔ（ｉｍｍ）、Ｔ（ｍａｔ）またはＴ（ｃｈＡ６ ｍａｔ）細胞が増殖および／またはサイトカイン産生を抑制する能力を試験するため、オートロガスＣＤ４^＋Ｔ細胞を解凍し、同種異系成熟ＤＣ（１０：１、Ｔ：ＤＣ）または単球（ＣＤ３枯渇ＰＢＭＣ、６０００ＲＡＤＳ照射）（１：１、Ｔ：単球）で刺激した。ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、９６ウェルの丸底プレートにおいて最終容量２００μｌの完全培地中、単独またはＴ（ｉｍｍ）、Ｔ（ｍａｔ）またはＴ（ｃｈＡ６ ｍａｔ）細胞（１：１比）の存在下で刺激した。幾つかの培養物では、抗ＩＬ−１０Ｒ（３０μｇ／ｍｌ、３Ｆ９）および／または抗ＴＧＦ−β（５０μｇ／ｍｌ、１Ｄ１１、R & D systems）ｍＡｂを添加した。示された時間後、ウェルを１６時間１μＣｉ／ウェルの^３Ｈ−チミジンでパルスするか、またはＩＦＮ−γ産生の分析用に上清を集めた。

ＥＬＩＳＡ
Ｔ（ｉｍｍ）、Ｔ（ｍａｔ）またはＴ（ｃｈＡ６ ｍａｔ）を、１０：１（Ｔ：ＤＣ）の割合で成熟同種異系ＤＣにより刺激した。ＩＬ−２およびＩＬ−４については２４時間後、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γについては４８時間後、およびＴＧＦ−βについては７２時間後に上清を集めた。未成熟、成熟および成熟／ｃｈＡ６ ＤＣにより産生されたサイトカインの量を評価するため、ＤＣを単独で培養した。４８時間後、上清を採取した。製造業者の使用説明書（BD Biosciences）に従って、捕獲ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのレベルを測定した。酸性化上清におけるＴＧＦ−βのレベルを、製造業者の使用説明書（R & D systems）に従って捕獲ＥＬＩＳＡにより測定した。検出限界は次の通りであった：ＩＬ−２：２０ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−４：２０ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１０：２０ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１２：３０ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−６：３０ｐｇ／ｍｌ、ＴＮＦ−α：２０ｐｇ／ｍｌ、ＩＦＮ−γ：６０ｐｇ／ｍｌ；ＴＧＦ−β：６０ｐｇ／ｍｌ。

ｃｈＡ６ ｍＡｂ調節成熟ＤＣの表現型
ｃｈＡ６ ｍＡｂの存在下で生産された成熟ＤＣは、典型的には成熟ＤＣおよび未成熟ＤＣに類似した細胞に存する細胞の混合集団を含む。ｃｈＡ６処置により成熟ＤＣの分化および成熟状態が調節されるか否かを測定するため、細胞の表現型分析を実施した。５日間ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下でＤＣをＣＤ１４^＋単球から分化させ、次いで刺激せずに置いておくか、または可溶性ｃｈＡ６ ｍＡｂの存在または非存在下で４８時間ＣＤ４０Ｌを発現するマウス線維芽細胞との共培養により活性化した。予想通り、通常の手順によると、未成熟、成熟および成熟／ｃｈＡ６ ＤＣの培養物は共に、＞９０％の割合でＣＤ１ａ^＋ＣＤ１４⁻であった（図１）。
未成熟ＤＣは、ＣＤ８３陰性およびＨＬＡ−ＤＲ^lowであった。ＤＣ活性化中にｃｈＡ６ ｍＡｂを添加しても、ＣＤ８３およびＨＬＡ−ＤＲの発現は改変されず、それらは成熟ＤＣで上方制御された（図１）。成熟／ｃｈＡ６および成熟ＤＣは、同等レベルの共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現した。

ｃｈＡ６ ｍＡｂは、成熟ＤＣでのＰＤＬ−２およびＣＤ４５ＲＢの発現を改変した
次に、我々は、免疫寛容誘発ＤＣと予め会合させた分子が成熟／ｃｈＡ６ ＤＣにより発現されるか否かを測定した。ＩＬＴ３およびＩＬＴ４の発現は、成熟／ｃｈＡ６ ＤＣおよび成熟ＤＣでは類似しており、予想通り、それらは未成熟ＤＣと比べて低かった（図２Ａ）。ＩＴＬ３のＭＦＩは、成熟ＤＣでの１３.６±６.４（ｎ＝５、ｐ＝ｎｓ）および未成熟ＤＣでの１８.４±９.２（ｎ＝５、ｐ＝ｎｓ）に対しｃｈＡ６成熟ＤＣでは１２.８±６.４であった。ＩＬＴ４のＭＦＩは、成熟ＤＣでの１２.４±４.１（ｎ＝８、ｐ＝ｎｓ）および未成熟ＤＣでの２２.１±７.４（ｎ＝５、ｐ＝０.０５）に対し成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでは１４.７±４.９であった。ＩＣＯＳ−Ｌの発現は、成熟および未成熟ＤＣと比べて成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでは僅かに増加していた：ＩＣＯＳ−ＬのＭＦＩは、成熟ＤＣでの２０±１１.５（ｎ＝４、ｐ＝ｎｓ）および未成熟ＤＣでの３１.４±１８.１（ｎ＝４、ｐ＝ｎｓ）に対し成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでは４０.１±２３.２であった。成熟／ｃｈＡ６ ＤＣおよび成熟ＤＣは、類似レベルのＳＬＡＭを発現し、ＭＦＩは、成熟ＤＣでの１８.９±１０.９（ｎ＝４、ｎｓ）に対し成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでは２１.５±３.９であり、未成熟ＤＣ（８.９±５.１、ｎ＝４、ｐ＝０.０５）と比べると著しく高かった。成熟／ｃｈＡ６ ＤＣおよび成熟ＤＣ間において、接着分子ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１の発現に差異は観察されなかった：ＩＣＡＭ−１のＭＦＩは、成熟ＤＣでの４７２.１±１９２.７（ｎ＝５、ｐ＝ｎｓ）に対し成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでは４７１.５±１９２.５であり、未成熟ＤＣ（１３６.８±５５.９、ｎ＝５、ｐ＝０.０２）と比べて著しく高かった。ＬＦＡ−１のＭＦＩは、成熟ＤＣでの５３.３±２６.６（ｎ＝５、ｐ＝ｎｓ）に対し成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでは５０.３±２５.２であり、未成熟ＤＣ（４３.７±２１.９、ｎ＝５、ｐ＝ｎｓ）と比べて僅かに増加していた。ＰＤＬ−１の発現は、成熟／ｃｈＡ６および成熟ＤＣでは同等であり、以前に報告した通り（５９）、未成熟ＤＣと比べて著しく高かった。成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでのＰＤＬ−１のＭＦＩは、成熟ＤＣでの４７.９±１８.１（ｎ＝８、ｐ ｎｓ）および未成熟ＤＣでの２５.９±９（ｎ＝８、ｐ≦０.００１）と比べて４３.８±１６.６であった。ＤＣ−ＳＩＧＮの発現は、成熟／ｃｈＡ６および成熟ＤＣでは同等であったが、未成熟ＤＣと比べると僅かに高かった。ＤＣ−ＳＩＧＮのＭＦＩは、成熟／ｃｈＡ６、成熟および未成熟ＤＣではそれぞれ３４.４±９.６、３４.３±７.８および２５.２±５.８であった。対照的に、ＰＤＬ−２の発現は、成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでは著しく高かった（図２）。成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでのＰＤＬ−２のＭＦＩは、成熟ＤＣでの１６.８±５.６（ｎ＝１０、ｐ＝０.００９）および未成熟ＤＣでの１９.７±６.６（ｎ＝１０、ｐ＝ｎｓ）に対し２５.８±８.６であった。我々はまた、ＣＤ４５ＲＢの発現が、ｃｈＡ６ ｍＡｂの存在下で成熟させたＤＣでは高くなることを立証した。ＣＤ４５ＲＢのＭＦＩは、成熟ＤＣでの１０.７±４.４（ｎ＝６、ｐ＝０.０５）および未成熟ＤＣでの２４.８±１０.１（ｎ＝６、ｐ＝０.０４）に対し２２.６±９.２であった。対照的に、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢアイソフォームの発現は、成熟および未成熟ＤＣと比べて成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでは著しく低かった。ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢのＭＦＩは、成熟ＤＣでの４１.９±９.６（ｎ＝２０、ｐ＝０.０１）および未成熟ＤＣでの６０.６±１３.９（ｎ＝２０、ｐ＝０.０２）に対し成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでは３４.１±７.８であった。２次抗体による成熟／ｃｈＡ６ ＤＣの染色は、アイソフォーム対照による染色と類似していたため（データは示さず）、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢアイソフォームの下方制御は、ｃｈＡ６ ｍＡｂの存在に起因するものではなかった。ＣＤ４５ＲＯアイソフォームの発現は、ＤＣの３サブセットの間では同等であった。ＣＤ４５ＲＯのＭＦＩは、未成熟、成熟および成熟／ｃｈＡ６ ＤＣではそれぞれ２７.３±１０.３、２０.５±７.８および２０.４±７.７であった。

ｃｈＡ６ ｍＡｂ処置は、成熟ＤＣのサイトカイン産生プロフィールを改変しない
次に我々は、ＤＣのサイトカイン分泌プロフィールを調べた。未成熟、成熟および成熟／ｃｈＡ６ ＤＣを培養７日後に洗浄し、さらに２日間再び平板培養した。成熟／ｃｈＡ６ ＤＣは、成熟ＤＣとの比較において類似量のＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αを分泌した（図３）。これらの結果を考え合わせると、ＤＣの成熟中にｃｈＡ６を添加しても、生じた成熟ＤＣのサイトカイン産生は改変されないことがわかる。これらの結果は、我々が分析しなかった他のサイトカインの発現および分泌がｃｈＡ６ ｍＡｂにより調節され得るという可能性を排除するものではない。

ｃｈＡ６ ｍＡｂは免疫寛容誘発ＤＣを誘導する
次いで、我々は、成熟／ｃｈＡ６ ＤＣが、Ｔｒ細胞のインビトロ生産において未成熟ＤＣと同程度に有効であるか否かを調べた。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞に、我々の標準化プロトコル（３８）を用いて、１０：１比で同種異系成熟／ｃｈＡ６ ＤＣにより繰り返し刺激を与え（３ラウンドの刺激）、それに続いて成熟ＤＣに応答するそれらの増殖能について試験した。驚くべきことに、３ラウンドの刺激後、同種異系成熟／ｃｈＡ６ ＤＣにより刺激されたＴ細胞は、完全成熟ＤＣによる再活性化に対し低応答性であった（図４）。Ａｇ誘導増殖における５７.２３％（ｎ＝１７、ｐ＝０.００９）の平均低下が、成熟ＤＣで刺激されたＴ細胞との比較において観察された。予想通り、同種異系未成熟ＤＣにより刺激されたＴ細胞は、同種異系成熟ＤＣによる再活性化に対し低応答性であり、成熟ＤＣにより反復刺激されたＴ細胞との比較において７５±１７％（ｎ＝２３、ｐ＝０.０００９）の増殖の平均低下を示した。同様の結果は、ポリクローナル活性化に対する応答でも得られ（図４Ｂ）、成熟／ｃｈＡ６ ＤＣによる３ラウンドの活性化後には６２.６±１６.５％（ｎ＝３）および未成熟ＤＣでは７８.７±２０％（ｎ＝３）の増殖の平均低下を示した。抗ＣＤ２８ ｍＡｂおよび外因性ＩＬ−２を添加することにより、この低い応答性を立て直すことができた（図４Ｂ）。

成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでの末梢血ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞の反復的インビトロ刺激により、極めて低応答性のＴ細胞がもたらされるという発見は、これらの細胞もまた抑制能力を獲得した可能性があることを示唆している。したがって、我々は、成熟／ｃｈＡ６ ＤＣにより生産されたＴ細胞が、同種異系成熟ＤＣでの攻撃時にナイーブオートロガスＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を抑制する能力について試験した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、成熟ＤＣ単独で、またはＴ（ｃｈＡ６ ｍａｔ）またはＴ（ｍａｔ）細胞（１：１比）の存在下で刺激し、培養開始の２、３または４日後に増殖を評価した。対照として、成熟ＤＣで刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔ（ｉｍｍ）細胞と共培養した。成熟ＤＣで刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、１次応答の速度論を示し、４日間培養後に増殖はピークに達した（図５）。予想通り、成熟ＤＣにより生産されたＴ（ｍａｔ）細胞は、同一ドナーからのＤＣによる再攻撃時に２次応答の速度論を示し、増殖は２日目にピークに達した。Ｔ（ｃｈＡ６ ｍａｔ）細胞は、時間経過の全体を通して低応答性のままであった。１次ＭＬＲにＴ（ｍａｔ）細胞を加えることにより、２日目に増殖は高められた。重要なことに、Ｔ（ｃｈＡ６ ｍａｔ）またはＴ（ｉｍｍ）の両細胞を添加することにより、成熟ＤＣに応じたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は抑制された。Ｔ（ｃｈＡ６ ｍａｔ）細胞およびＴ（ｉｍｍ）細胞のそれぞれとの培養４日後に評価した時、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖における７６±２３％および８７±１０％（ｎ＝１３）の平均低下が観察された。これらの結果を考え合わせると、ｃｈＡ６ ｍＡｂの存在下でＤＣを活性化することにより、インビトロでＴｒ細胞を誘導する免疫寛容誘発ＤＣが生産されることがわかる。

ｃｈＡ６調節ＤＣにより生産されたＴ細胞は、Ｔｒ１細胞と表現型および機能が均等内容である
次に、我々は、成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでの反復刺激により誘導されたＴｒ細胞がＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞と類似しているか否かを調べた。まず、我々は、成熟ＤＣによる活性化後のＴ（ｃｈＡ６ｍａｔ）細胞のサイトカイン産生プロフィールを測定し、それらのサイトカイン産生プロフィールをＴ（ｉｍｍ）またはＴ（ｍａｔ）細胞と比較した。表１に示す通り、Ｔ（ｍａｔ）細胞は試験したサイトカインを全て産生した。対照的に、Ｔ（ｃｈＡ６ｍａｔ）細胞は、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−βを産生したが、顕著なレベルのＩＬ−２またはＩＬ−４を産生することはなかった。Ｔ（ｉｍｍ）細胞と同様に、Ｔ（ｃｈＡ６ｍａｔ）細胞は、Ｔ（ｍａｔ）細胞と比べて僅かに低量のＩＬ−１０を産生し、ＴＧＦ−βのレベルはそれほど異ならなかった。Ｔ（ｃｈＡ６ｍａｔ）細胞はＩＦＮ−γを産生したが、Ｔ（ｍａｔ）細胞による分泌量と比べてせいぜい１０分の１程度であった。したがって、Ｔ（ｃｈＡ６ｍａｔ）細胞は、Ｔｒ１細胞の場合と類似したサイトカイン産生プロフィールを示す。

表１：Ｔｉｍｍ、ＴｍａｔおよびＴｃｈＡ６ｍａＴ−細胞のサイトカイン産生プロフィール。
未成熟、成熟およびｃｈＡ６／成熟ＤＣによる３ラウンドの刺激の終わりに、Ｔ細胞株をｍＤＣにより活性化し、培養の２４時間（ＩＬ−２の場合）、４８時間（ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−βの場合）後に上清を集めた。示されたサイトカインのレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。８回の独立実験で検出された平均±ＳＥＭ量を示している。

次に、我々は、Ｔ（ｃｈＡ６ ｍａｔ）細胞による増殖の抑制が、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−βの産生により伝えられるか否かを調べた。我々は、同種異系単球を用いてナイーブＴ細胞の増殖を誘導する抑制実験を実施した。これらの条件下において、中和性抗ＩＬ−１０Ｒおよび抗ＴＧＦ−β ｍＡｂの添加により、Ｔ（ｃｈＡ６ｍａｔ）細胞が伝える増殖の抑制は完全に打ち消された（図６）。これらのデータを考え合わせると、成熟／ｃｈＡ６ ＤＣでの反復刺激により生産されるＴｒ細胞は、Ｔｒ１細胞と表現型および機能が均等内容であることがわかる。

ｃｈＡ６成熟ＤＣによるＴｒ１細胞の分化は、ＰＤＬ−２／ＰＤ−１相互作用を必要とする
我々は、試験した免疫寛容誘発マーカーの中で、ＰＤＬ−２が、ｃｈＡ６ ｍＡｂで処理された成熟ＤＣで著しく上方制御されることを示した。ＰＤＬ−２は、ＤＣにより選択的に発現される（５９）、阻害性受容体であることが知られている。したがって、我々は、ＰＤＬ−２／ＰＤ−１相互作用が、成熟／ｃｈＡ６ ＤＣにより誘導されるＴｒ１細胞の生産に必要とされるか否かを調べた。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞を、中和性抗ＰＤＬ−２または対照ＩｇＧ ｍＡｂの非存在または存在下において、成熟／ｃｈＡ６ ＤＣで反復刺激した。図８Ａで示す通り、中和性抗ＰＤＬ−２ ｍＡｂの存在下におけるＴ細胞の分化は、成熟／ｃｈＡ６ ＤＣにより誘導される低応答性状態を完全に打ち消した。さらに、ＰＤＬ−２阻害はまた、抑制活性を伴うＴｒ細胞の誘導を阻止した（図８Ｂ）。

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54. Ariyan, C., P. Salvalaggio, S. Fecteau, S. Deng, L. Rogozinski, D. Mandelbrot, A. Sharpe, M.H. Sayegh, G.P. Basadonna, and D.M. Rothstein. 2003. Cutting edge: transplantation tolerance through enhanced CTLA-4 expression. J Immunol 171:5673-5677.
55. Salvalaggio, P.R., G. Camirand, C.E. Ariyan, S. Deng, L. Rogozinski, G.P. Basadonna, and D.M. Rothstein. 2006. Antigen exposure during enhanced CTLA-4 expression promotes allograft tolerance in vivo. J Immunol 176:2292-2298.
56. Deng, S., D.J. Moore, X. Huang, M. Mohiuddin, M.K.t. Lee, E. Velidedeoglu, M.M. Lian, M. Chiaccio, S. Sonawane, A. Orlin, J. Wang, H. Chen, A. Caton, R. Zhong, and J.F. Markmann. 2006. Antibody-induced transplantation tolerance that is dependent on thymus-derived regulatory T-cells. J Immunol 176:2799-2807.
57. Gregori, S., P. Mangia, R. Bacchetta, E. Tresoldi, F. Kolbinger, C. Traversari, J.M. Carballido, J.E. de Vries, U. Korthauer, and M.G. Roncarolo. 2005. An anti-CD45RO/RB monoclonal antibody modulates T-cell responses via induction of apoptosis and generation of regulatory T-cells. J Exp Med 201:1293-1305.
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Claims (33)

1. 樹状細胞（ＤＣ）機能の調節方法であって、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合分子に樹状細胞を曝露することを含む方法。
2. 樹状細胞（ＤＣ）機能の調節方法であって、樹状細胞を結合分子に曝露することを含み、上記結合分子が、順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、上記ＣＤＲ１がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(ＮＹＩＩＨ)を有し、上記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ)を有し、上記ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ)を有するか、または上記分子がその直接等価物である方法。
3. 結合分子が、
   ａ）順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、上記ＣＤＲ１がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(ＮＹＩＩＨ)を有し、上記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ)を有し、上記ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(ＳＧＰＹＡＷＦＤＴ)を有するものである第１ドメイン、および
   ｂ）順に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、ＣＤＲ１’がアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＱ)を有し、ＣＤＲ２’がアミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(ＳＳＳＥＳＩＳ)を有し、ＣＤＲ３’がアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(ＱＱＳＮＴＷＰＦＴ)を有するものである第２ドメイン；
   またはその直接等価物を含む、請求項１または２記載の方法。
4. 結合分子がキメラまたはヒト化分子である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 結合分子が、例えばＩｇＧ１アイソフォームのキメラまたはヒト化モノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 結合分子が、配列番号１のポリペプチドおよび／または配列番号２のポリペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 結合分子が、配列番号３のポリペプチドおよび／または配列番号４のポリペプチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 結合分子が、配列番号９または配列番号１０のポリペプチドおよび／または配列番号７または配列番号８のポリペプチドを含むヒト化抗体である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 結合分子が、配列番号３１または配列番号３２のポリペプチドおよび／または配列番号７または配列番号８のポリペプチドを含むヒト化抗体である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 結合分子が、
    （ａ）配列番号９のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド、
    （ｂ）配列番号９のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド、
    （ｃ）配列番号１０のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド、
    （ｄ）配列番号１０のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド、
    （ｅ）配列番号３１のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド、
    （ｆ）配列番号３１のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド、
    （ｇ）配列番号３２のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド、または
    （ｈ）配列番号３２のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド
    を含むヒト化抗体である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
11. 本方法をインビトロで実施する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. 免疫寛容誘発表現型を呈するように樹状細胞を誘導する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
13. （ａ）未成熟樹状細胞の供給源を入手し、
    （ｂ）結合分子の存在下において未成熟樹状細胞の成熟を誘導する
    ことを含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
14. 樹状細胞が生物試料に由来する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
15. 例えば生物試料から単球供給源のインビトロ分化を誘導することにより樹状細胞を得る、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
16. さらに、インビトロで樹状細胞をＴ細胞集団に曝露することにより、Ｔ細胞において免疫寛容誘発表現型を誘導する段階を含む、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
17. Ｔ細胞が樹状細胞に関して同種異系である、請求項１６記載の方法。
18. 自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防方法であって、上記処置および／または予防を必要とするヒト対象に、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法により得られた樹状細胞および／または請求項１６または請求項１７記載の方法から得られたＴ細胞の有効量を投与することを含む方法。
19. 自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防方法であって、
    （ａ）ドナーから単球集団を入手し、
    （ｂ）上記単球のインビトロ分化を誘導することにより、樹状細胞の供給源を製造し、
    （ｃ）樹状細胞が免疫寛容誘発となるように樹状細胞を請求項１〜１０のいずれか１項記載の結合分子に曝露し、そして
    （ｄ）上記の処置および／または予防を必要とするレシピエントに有効量の免疫寛容誘発樹状細胞を投与する
    ことを含む方法。
20. 自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防方法であって、
    （ａ）ドナーから樹状細胞集団を入手し、
    （ｂ）樹状細胞が免疫寛容誘発となるように樹状細胞を請求項１〜１０のいずれか１項記載の結合分子に曝露し、
    （ｃ）上記の処置および／または予防を必要とするレシピエントに有効量の免疫寛容誘発樹状細胞を投与する
    ことを含む方法。
21. 自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防方法であって、
    （ａ）第１ドナーから単球集団を入手し、
    （ｂ）上記単球のインビトロ分化を誘導することにより、樹状細胞の供給源を製造し、
    （ｃ）樹状細胞が免疫寛容誘発となるように、樹状細胞を請求項１〜１０のいずれか１項記載の結合分子に曝露し、
    （ｄ）Ｔ細胞が免疫寛容誘発となるように、免疫寛容誘発樹状細胞を第２ドナーから入手したＴ細胞集団に曝露し、そして
    （ｅ）上記の処置および／または予防を必要とするレシピエントに有効量の免疫寛容誘発樹状細胞および／または免疫寛容誘発Ｔ細胞を投与する
    ことを含む方法。
22. 自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防方法であって、
    （ａ）第１ドナーから樹状細胞集団を入手し、
    （ｂ）樹状細胞が免疫寛容誘発となるように、樹状細胞を請求項１〜１０のいずれか１項記載の結合分子に曝露し、
    （ｃ）Ｔ細胞が免疫寛容誘発となるように、免疫寛容誘発樹状細胞を第２ドナーから入手したＴ細胞集団に曝露し、そして
    （ｄ）上記の処置および／または予防を必要とするレシピエントに有効量の免疫寛容誘発樹状細胞および／または免疫寛容誘発Ｔ細胞を投与する
    ことを含む方法。
23. ドナーおよびレシピエントが同一個体である、請求項１９または請求項２０記載の方法。
24. ドナーおよびレシピエントが異なる個体であり、所望により本方法が移植拒絶の処置および／または予防を目的とするものであり、樹状細胞を移植ドナーから入手してもよい、請求項１９または請求項２０記載の方法。
25. 第１ドナーおよび／または第２ドナーがレシピエントと同一個体である、請求項２１または請求項２２記載の方法。
26. 第２ドナーが第１ドナーおよび／またはレシピエントに関して同種異系である、請求項２１または２２記載の方法。
27. 結合分子への曝露前には樹状細胞が未成熟樹状細胞であり、それに続いて結合分子の存在下で成熟するように樹状細胞を誘導する、請求項１９〜２６のいずれか１項記載の方法。
28. 自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患の処置および／または予防を目的とする、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法から得られる樹状細胞集団および／または請求項１６または１７記載の方法から得られる免疫寛容誘発Ｔ細胞集団の使用。
29. 自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに関連する疾患を処置および／または予防する医薬の製造を目的とする、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法から得られる樹状細胞集団および／または請求項１６または１７記載の方法から得られる免疫寛容誘発Ｔ細胞集団の使用。
30. 免疫寛容誘発樹状細胞および／または免疫寛容誘発Ｔ細胞を含む医薬の製造を目的とする、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
31. 医薬として使用される、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法から得られる免疫寛容誘発樹状細胞集団および／または請求項１６または１７記載の方法から得られる免疫寛容誘発Ｔ細胞集団。
32. 請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法から得られる免疫寛容誘発樹状細胞集団および／または請求項１６または１７記載の方法から得られる免疫寛容誘発Ｔ細胞集団を含む、医薬組成物。
33. さらに請求項１〜１０のいずれか１項記載の結合分子を含む、請求項３２記載の医薬組成物。

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