JP2010523120A - エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性を検出する方法および装置 - Google Patents
エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性を検出する方法および装置 Download PDFInfo
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Abstract
エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性を測定する方法および装置が提供される。装置は、好ましくはそれぞれが既知濃度のエリスロマイシン及び既知濃度のクリンダマイシンを有する１個又はそれ以上のウェルを含む試験パネルである。試料をウェルに接種しインキュベーションした後、試料がエリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性を発現する微生物を含むかどうかを判定するために、増殖についてウェルを分析する。
Description
本出願は、２００７年４月２日に出願された米国特許仮出願第６０／９０９６６３号の優先権を主張する。
本発明は、エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性を測定するために有用な方法及び装置に関する。本発明の方法及び装置は、抗菌剤感受性試験及び微生物識別装置を組み合わせてもよい。
臨床微生物学並びに感染症の治療及び管理の分野は、ここ数十年にわたって劇的に進展している。しかし、致命的で消耗性の全身性及び局所的な微生物感染は、主要な医療問題として残されている。長期医療施設及び養護施設における乳児、高齢者、免疫抑制の患者では、特に、感染因子に起因する死亡率が依然として高い。さらに、多剤耐性微生物の出現が、入院患者に対する治療の課題を増やしている。薬剤耐性細菌によって引き起こされる病院内感染（院内感染）は、患者に、入院日数の増加、医原性死亡及び医療費増加などの著しい苦痛を与える。
微生物感染の不適切な又は不適正な治療は、多くの院内感染を引き起こす細菌の多剤耐性株を発生させる主たる原因である。薬剤耐性、特に抗生物質耐性は、感染を治療するために使用する抗生物質が、不適正に選択されるか、感染因子を効果的に根絶しない方法で処方される場合に、又は不十分な患者の服薬遵守の結果として、しばしば起こる。更に、効果が無い又は不要な抗生物質が処方された場合、存在している如何なる感染菌も衰えないで増殖し続け、しばしば高価で積極的な治療を必要とする致命的な合併症を引き起こす。それ故、潜在的な感染因子の正確で迅速な診断は、患者治療の改善、医療費の低減化及び抗微生物効果の維持に重要である。
ブドウ球菌属（Staphylococcus）細菌における誘導性クリンダマイシン耐性は、重要な臨床上の問題になっている。ブドウ球菌におけるマクロライド耐性は、ｅｒｍ（Ａ）遺伝子又はｅｒｍ（Ｃ）遺伝子によって誘導されるマクロライド・リンコサミド・ストレプトグラミンＢ（ＭＬＳB）耐性と呼ばれ、マクロライドとクリンダマイシンの両者の活性に影響を及ぼすリボソーム標的の変更による可能性がある。ブドウ球菌属（Staphylococcus）のある種の株は、クリンダマイシンに対して本質的に耐性を示すが、その他はエリスロマイシンによる誘導後にのみ耐性を示す。クリンダマイシンに対して本質的に耐性を示す菌株は、通常は標準感受性試験法によって検出できるが、幾つかの菌株に存在する誘導耐性（ＭＬＳBｉ）は、培養液又は寒天基盤の標準感受性検査法では日常的には検出されない。クリンダマイシンではなく、マクロライドだけに作用する排出ポンプをコードするｍｓｒ（Ａ）遺伝子を含有しているマクロライド耐性株から、ＭＬＳBｉ株を識別することは重要である。
臨床的に重要なブドウ球菌分離株の中からクリンダマイシン耐性を日常的に検出する目的には、２つの狙いがある。第１に、予備的な調査から、ＭＬＳBｉ株に感染した患者が、さまざまな種類の感染用のクリンダマイシンで治療された場合の臨床的失敗の可能性が示されている。しかし、すべてのマクロライド耐性ブドウ球菌をクリンダマイシン耐性と見なすことは、マクロライド排出機構だけを持つ分離株に感染した患者に対する安全で効果的な治療の可能性を否定することになる。ＭＬＳB耐性と比較して、マクロライド排出を示すブドウ球菌の臨床分離株の割合は、地理的位置又は患者群によって大きく変動する。それ故、誘導性クリンダマイシン耐性についての日常的検査の第２の利点は、マクロライド耐性であるにもかかわらずクリンダマイシンに対する感受性を保持するような菌株を明確に識別することである。このような理由で、かつては臨床検査標準委員会（ＮＣＣＬＳ）として知られた臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）によって、ブドウ球菌分離株の誘導性クリンダマイシン耐性に対する日常的検査は推奨されている。
公衆衛生の専門家は、細菌株の中で耐性の拡大を遅らせるために、臨床医及び医師に対してより狭域スペクトルの抗生物質を処方するように促している。しかし、そうするためには、微生物の同一性及び抗生物質感受性が迅速に測定されなければならない。標準的な培養に基づく方法では、この情報を臨床医に提供するために数週間を要する。抗生物質の誤用は、ほとんどの場合、不適切な処方行為によるよりは、むしろ原因病原菌に関する不十分な情報の結果として起きている。従って、もし、感染因子及びその潜在的抵抗性を数日ではなく数時間で識別できる自動システムがあれば、臨床検査室にとって非常に有益となる。
従って、患者分離株におけるエリスロマイシン誘導のクリンダマイシンに対する耐性を迅速且つ正確に測定するための装置及び方法は、感染症治療を改善し抗生物質耐性を減少させるために必要である。
本発明は、患者分離株におけるエリスロマイシン誘導のクリンダマイシンに対する耐性を迅速且つ正確に測定するための自動化された装置及び方法を提供する。
本発明の１つの態様では、エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性の測定に用いる装置は、増殖培地、既知量のエリスロマイシン及び既知量のクリンダマイシンを含む１個又はそれ以上のウェルを有するパネルを有する。
本発明の別の態様では、エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性を測定するための方法が提供される。その方法には、増殖培地、既知量のエリスロマイシン及び既知量のクリンダマイシンを含む１つ又はそれ以上のウェルを有するパネルを準備すること；微生物の含有が疑われる試料を１つ又はそれ以上のウェルに接種すること；ウェル内の微生物の増殖に好適な条件でパネルをインキュベーションすること；微生物の増殖について、１つ又はそれ以上のウェルを分析すること；そして、ウェル内の微生物の増殖に基づいてエリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性の有無を測定することが含まれる。
本発明の他の特徴は、以下の説明に基づいて当業者には明らかになる。
本発明は、患者分離株におけるエリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性を測定するための方法及び装置を提供する。
本発明の１つの態様によれば、エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性の測定に用いる装置は、概して図１に示される。この実施態様では、装置は、一般に複数の反応チャンバー（又はウェル１４）を備えた平面１２を有する試験パネル１０の形で示される。ウェル１４は、横に１２個のウェルと縦に８個のウェルの合計９６ウェルの配列の中に、長方形の形状の配置で示されるが、本発明のウェルパネルは、この形状に限定されると理解するべきではない。
試験パネル１０は、コントロール区分２０、微生物識別（ＩＤ）区分３０及び抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）区分４０を含む複数の小区分に分けられる。当業者は、本発明を説明するのに必要のない他の小区分がパネルに含まれてもよいことを理解するであろう。コントロール区分２０には、コントロールウェル２２及び増殖ウェル２４が含まれる。増殖ウェル２４は、パネル内で特定の微生物が生育できるかどうかを測定するための増殖培地を含む。増殖ウェル２４は、また、パネルが接種されたことを示す。増殖ウェル内での増殖がない場合、パネルは読み取られない。コントロールウェル２２は接種を受けておらず、パネルが汚染される場合に限り増殖を示す。コントロールウェルに増殖がある場合、パネルは読み取られない。
微生物識別区分３０には複数のＩＤウェル３２が含まれ、それぞれは増殖培地２４、及びインディシア（indicia）３４によって識別される単一の抗菌化合物を含む。それぞれのＩＤウェル３２は接種され、そして試料中の微生物が各ウェル内の特定の抗菌性化合物に耐性ではない場合にのみ増殖を示す。これらの感受性検査結果の総計は、試料中の微生物を同定するためのアルゴリズムに使用できる。そのようなアルゴリズムは当業者には公知であり、議論する必要はない。当業者は、抗菌性化合物がこの区分に含まれる可能性があること、及び本明細書に開示されるそれらの化合物は、単に例示であることを認識するであろう。
典型的な試験パネル１０で示される抗菌剤感受性試験の区分４０は、抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）のために、ウェル４２、４６及び５０の、それぞれが６個のウェルを含む、３つの系列又はセットを含む。当業者は、本発明の他の実施態様が、より多い又はより少ないウェルの系列、及びそれぞれのセットにより多い又はより少ない個数のウェルを含んでもよいことを認識するであろう。第１セットのウェル４２は、それぞれが増殖培地及び既知量のエリスロマイシンを含む。エリスロマイシンの既知量は、系列内の各ウェルで異なり、インディシア４４（本明細書ではμｇ／ｍＬ単位で示される）によって表示される。好ましくは、ウェル４２のそれぞれからはクリンダマイシンを除外する。第２セットのウェル４６は、それぞれが増殖培地及び既知量のクリンダマイシンを含む。クリンダマイシンの既知量は、系列内の各ウェルで異なり、インディシア４８（本明細書ではμｇ／ｍＬ単位で示される）によって表示される。好ましくは、ウェル４６のそれぞれからはエリスロマイシンを除外する。第３セットのウェル５０は、それぞれが増殖培地及び既知量のエリスロマイシン及び既知量のクリンダマイシンを含む。クリンダマイシンの既知量は、ウェル５０の各ウェルについて異なり、インディシア５２（本明細書ではμｇ／ｍＬ単位で示される）によって表示される。エリスロマイシンの既知量は、ウェル５０の各ウェルについて一定であるか、又はウェル５０の各ウェルについて異なってもよい。１つの実施態様では、エリスロマイシンの既知量は、それぞれのウェル５０内のクリンダマイシンの既知量より少ない。
当業者は、ウェル４２、４６及び５０のそれぞれに使われてもよい種々の濃度を認識しているであろう。典型的には、ウェル４２は、約０．２５μｇ／ｍＬから約１６．０μｇ／ｍＬの範囲の既知量のエリスロマイシンを含む。ウェル４６は、典型的には、約０．２５μｇ／ｍＬから約１６．０μｇ／ｍＬの既知量のクリンダマイシンを含む。ウェル５０は、典型的には、約０．２５μｇ／ｍＬから約１６．０μｇ／ｍＬのクリンダマイシン及び約０．１μｇ／ｍＬから約８．０μｇ／ｍＬのエリスロマイシンを含む。
本発明の別の態様によれば、試験パネルは、好ましくは、エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性の測定方法に使用される。その方法は、微生物の含有が疑われる試料をパネル１０に接種すること；ウェル４２、４６及び５０内の微生物の増殖に好適な条件でパネルをインキュベーションすること；微生物の増殖について、ウェル４２、４６及び５０を解析すること；そして、ウェル４２、４６及び５０内の微生物の増殖に基づいてエリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性の有無を測定することを含む。
微生物が第１セットのウェル４２内で増殖する場合、又はその最小阻止濃度が閾値よりも高く（即ち、ＭＩＣ＞４μｇ／ｍＬ）、ウェル４２のセットのうちの十分な数で増殖が示された場合、微生物はエリスロマイシン耐性であると言われる。そのエリスロマイシン耐性分離株がクリンダマイシン単独の入ったウェル４６内で増殖しない場合、又はそれらの殆どで増殖しなかった場合（即ち、ＭＩＣ≦０．５μｇ／ｍＬ）、その微生物はクリンダマイシン感受性であると言われる。次に、微生物がウェル５０内で増殖する場合、又はその最小阻止濃度が閾値よりも高く（即ち、ＭＩＣ＞２μｇ／ｍＬ）、十分な数のウェルで増殖が示された場合、その分離株はクリンダマイシンに対する誘導耐性を有すると報告される。分離株がエリスロマイシンとクリンダマイシンの組み合わせ（ウェル５０）内で増殖しない場合、クリンダマイシンに感受性である、即ち、ｍｓｒＡ遺伝子を含むとして報告される。閾値は、業界に周知の方法に従って設定することができる。
なお、本発明の１つの実施態様では、微生物がエリスロマイシン耐性であってクリンダマイシン感受性であることが既に分っている場合、その微生物がエリスロマイシン誘導のクリンダマイシンに対する耐性を有するかどうかを決定するためには、第３系列のウェル５０だけが必要である。
本発明は、日常的なＭＩＣ試験を行うことの他にｅｒｍ遺伝子又はｍｓｒ遺伝子についての試験を行わなければならないこと、又はエリスロマイシン及びクリンダマイシン・ディスクを用いたディスク拡散試験を行わなければならないことを排除する。
試験パネルのウェルは、手動で又は自動システムの部分として読み取ることができる。典型的な自動アッセイシステムは、Dade Behring lnc、MicroScan（登録商標）Systems（West Sacramento, CA）から入手可能なWALKAWAY（登録商標）システムである。WALKAWAY（登録商標）システムは、マイクロタイターの識別及び抗菌剤感受性試験パネルを含む自動システムであり、光度測定又は蛍光読み取り器を使って生化学的結果を読み取り、そして病院メインフレーム情報システムに連結することができる結果を生み出す。WALKAWAY（登録商標）システム及びその構成要素の複数の実施態様は、米国特許第５，８８８，７６０号、同第５,６４５,８００号、同第５,５１８,６８６号、同第４,６７６,９５１号、同第４，６４３，８７９号、同第４，６８１，７４１号及び同第４，４４８，５３４号並びに２００４年１０月１５日出願の同時係属米国特許出願第１０／９６７，０６２号に開示されている。しかし、本発明の方法は、同様に他のシステムに対しても容易に適応させることができると理解されるべきである。
エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性のウェルは、MicroScan（登録商標）ＡＳＴパネルのような、標準の半自動抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）パネルに含められてもよく、そして、利用可能なエリスロマイシン及びクリンダマイシンに対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）値として、結果を同時に提供する。
抗菌剤感受性試験は、培養液希釈感受性検査の変法であり縮小型である。本発明の1つの実施態様では、種々の抗菌剤は、臨床的に関心のある範囲を埋める濃度にオートクレーブ滅菌した蒸留水で連続希釈される。変法（改変）Mueller-Hinton培養液中の標準化した微生物懸濁液を接種した後、WALKAWAY（登録商標）System内で、３５℃で３．５から２４時間インキュベーションする。
パネルの感受性区分は、適切な自動アッセイ装置（例えば、WALKAWAY（登録商標））の比色計を用い、１つ又はそれ以上の異なる光の波長、例えば、４０５、５０５及び６２０ナノメータ（ｎｍ）を用いて、３０分から２４時間の特定した時間に、分光光度法で読み取られる。しかし、本明細書に記載された時間及び波長は、解説のためのものであり限定するものではない。読み取り時間及び／又は数並びに使用される波長の種類は、測定の正確さ及び速さを高めるために容易に調整することができる。
濁度が読み取られた後、生データはアッセイシステムに搭載されて処理される。それぞれの時点で、さらなるインキュベーションが必要か又は感受性検査の結果が報告できるかを判断するために、関連ソフトウェア（例えば、MicroScan（登録商標）Data Management
Systemソフトウェア（Dade Behring Inc., West Sacramento, CA））によって、生データに対して具体的な質問がなされる。例えば、６．５時間の読み取りにおいて、ＭＩＣが測定できるか又はさらにインキュベーションが必要かを判断するために、４．５時間及び５．５時間の読み取りからのデータが使用される。
Systemソフトウェア（Dade Behring Inc., West Sacramento, CA））によって、生データに対して具体的な質問がなされる。例えば、６．５時間の読み取りにおいて、ＭＩＣが測定できるか又はさらにインキュベーションが必要かを判断するために、４．５時間及び５．５時間の読み取りからのデータが使用される。
本発明は、広範な実用及び活用が可能であることは、当業者によって容易に理解されるべきである。本明細書に記載されたもの以外の、本発明の多くの実施態様及び適応、並びに多くの変形、改変及び等価の配置は、本発明及び上述のその記述によって、本発明の要旨又は範囲を逸脱することなく、明白になり又は合理的に示唆されるであろう。
従って、本発明は、本明細書において、具体的な実施態様に関連させて詳細に説明されたが、この開示は、単に本発明を説明し例示するためであり、単に本発明の完全で有効な開示を提供する目的のために為されると理解されるべきである。以上の開示は、本発明を限定すること、又はそうでなければいずれかのその様な別の実施態様、適応、変形、改変及び等価の配置を除外することを意図したり又はその様に解釈されべきものではなく、本発明は、本明細書に添付される特許請求の範囲及びその同等物によってのみ制限される。
Claims (16)
- エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性の測定に用いる装置であって、増殖培地、既知量のエリスロマイシン、及び既知量のクリンダマイシンを含有する少なくとも１つの第１のウェルを有するパネルを含む装置。
- パネルが、増殖培地及び既知量のクリンダマイシンを含有する少なくとも１つの第２のウェルをさらに含む、請求項１に記載の装置。
- 少なくとも１つの第２のウェルが抗菌有効量のエリスロマイシンを除外する、請求項１に記載の装置。
- 少なくとも１つの第１のウェル内のエリスロマイシンの既知量が、該少なくとも１つの第１のウェル内のクリンダマイシンの既知量よりも少ない、請求項１に記載の装置。
- 少なくとも１つの第１のウェルが複数の第１のウェルを含み、複数の第１のウェルのそれぞれが異なる既知量のクリンダマイシンを有する、請求項１に記載の装置。
- 少なくとも１つの第２のウェルが複数の第２のウェルを含み、複数の第２のウェルのそれぞれが異なる既知量のクリンダマイシンを有する、請求項２に記載の装置。
- 増殖培地及び既知量のエリスロマイシンを含有する少なくとも１つの第３のウェルをさらに含む、請求項３に記載の装置。
- 少なくとも１つの第３のウェルが抗菌有効量のクリンダマイシンを除外する、請求項７に記載の装置。
- 少なくとも１つの第３のウェルが複数の第３のウェルを含み、複数の第３のウェルのそれぞれが異なる既知量のエリスロマイシンを有する、請求項７に記載の装置。
- エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性を測定する方法であって：
増殖培地、既知量のエリスロマイシン及び既知量のクリンダマイシンを含む少なくとも１つのウェルを有するパネルを準備すること；
微生物の含有が疑われる試料を該少なくとも１つのウェルに接種すること；
ウェル内の微生物の増殖に好適な条件でパネルをインキュベーションすること；
微生物の増殖について、該少なくとも１つのウェルを分析すること；そして
該少なくとも１つのウェル内の微生物の増殖に基づいてエリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性の有無を測定すること；
を含む方法。 - 少なくとも１つのウェル内のエリスロマイシンの既知量が、該少なくとも１つのウェル内のクリンダマイシンの既知量よりも少ない、請求項１０に記載の装置。
- 少なくとも１つの第１のウェルが複数のウェルを含み、複数のウェルのそれぞれが異なる既知量のクリンダマイシンを有する、請求項１０に記載の装置。
- 微生物がブドウ球菌属（Staphylococcus）の菌株である、請求項１０に記載の方法。
- エリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性を測定する方法であって：
増殖培地、既知量のエリスロマイシン及び既知量のクリンダマイシンを含む少なくとも１つの第１のウェル、並びに増殖培地及び既知量のクリンダマイシンを含む少なくとも１つの第２のウェルを有するパネルを準備すること；
微生物の含有が疑われる試料を該少なくとも１つの第１のウェル及び該少なくとも１つの第２のウェルに接種すること；
ウェル内の微生物の増殖に好適な条件で該パネルをインキュベーションすること；
微生物の増殖について、該少なくとも１つの第１のウェル及び該少なくとも１つの第２のウェルを分析すること；そして
該少なくとも１つの第１のウェル及び該第２のウェル内の微生物の増殖に基づいてエリスロマイシン誘導のクリンダマイシン耐性の有無を測定すること；
を含む方法。 - 少なくとも１つの第２のウェルが抗菌有効量のエリスロマイシンを除外する、請求項１４に記載の装置。
- 少なくとも１つの第２のウェルが複数の第２のウェルを含み、複数の第２のウェルのそれぞれが異なる既知量のクリンダマイシンを有する、請求項１４に記載の装置。
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