JP2010516716A - 血管新生阻害剤としてのカテコールアミン及び関連化合物の使用 - Google Patents
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Abstract
β炭素の位置に(S)立体配置を有し(S)−ノルアドレナリンより親油性の高い式(I)のカテコールアミン又は関連化合物、その生理学的に許容される塩、そのプロドラッグ、生理的に機能するその誘導体又はその任意の混合物は、血管新生阻害剤として有用である。β水酸基が修飾されている式(II)のカテコールアミン又は関連化合物も血管新生阻害性である。
【選択図】図2A
【選択図】図2A
Description
[関連出願の相互参照]
[0001]本出願は、2007年1月29日出願の米国特許仮出願第60/897,814号明細書及び2007年5月25日出願の同第60/924,674号明細書の利益を主張するものであり、その両方の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
[0001]本出願は、2007年1月29日出願の米国特許仮出願第60/897,814号明細書及び2007年5月25日出願の同第60/924,674号明細書の利益を主張するものであり、その両方の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
[発明の分野]
[0002]本発明は、血管新生及び関連の疾患を予防及び/又は治療する血管新生阻害剤としてのカテコールアミン及び関連化合物の使用に関する。
[0002]本発明は、血管新生及び関連の疾患を予防及び/又は治療する血管新生阻害剤としてのカテコールアミン及び関連化合物の使用に関する。
[発明の背景]
[0003]血管新生は、細胞外マトリックスのリモデリングを伴う内皮細胞の増殖及び遊走による、既存の血管からの新しい血管の成長に関わる生理的過程である。血管新生は、胚形成中の器官の発達及び分化において、創傷治癒において、並びに子宮及び卵巣においては、正常な過程である。血管新生は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性症、虚血性心障害、関節リウマチ、乾癬、腫瘍発生及び腫瘍成長などの病原性障害にも関与している。
[0003]血管新生は、細胞外マトリックスのリモデリングを伴う内皮細胞の増殖及び遊走による、既存の血管からの新しい血管の成長に関わる生理的過程である。血管新生は、胚形成中の器官の発達及び分化において、創傷治癒において、並びに子宮及び卵巣においては、正常な過程である。血管新生は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性症、虚血性心障害、関節リウマチ、乾癬、腫瘍発生及び腫瘍成長などの病原性障害にも関与している。
[0004]The Angiogenesis Foundationによれば、西欧諸国のみにおいて、少なくとも1億8400万人の患者が何らかの形態の血管新生阻害療法から、又、少なくとも3億1400万人が何らかの形態の血管新生促進療法から恩恵を受けることができるであろうとされている。例えば、血管新生阻害療法は、全ての固形腫瘍(肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌など)に適用される。血管新生阻害療法の市場は、加齢黄斑変性症を治療するラニビズマブ(Ranibizumab)(商標)の2007年度第1四半期の財務報告書により示唆されているとおり巨大である。この薬剤はすでに2007年度の超大型医薬品となっており、年間売上は10億ドル超と推定される。
[0005]血管新生の機序はあまりよく理解されていないが、いくつかの因子が血管新生刺激因子及び同阻害因子として血管新生に関与していることが確認されている。血管新生因子の一部が、線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、アンギオゲニン、インターロイキン−8、血小板由来成長因子、血管内皮成長因子(VEGF)である。中でもVEGFは、病理的な血管新生における最も重要なサイトカインと考えられる。
[0006]潜在的に有効な血管新生阻害剤がいくつか開発され、動物試験、疫学的試験及び臨床試験において調査されてきた(Kyselovaら、2004)。そのような血管新生阻害剤は、VEGF阻害薬、血管内皮成長因子受容体(VEGFR)拮抗薬及びVEGFRチロシンキナーゼ阻害薬に分類し得る。VEGF阻害薬は、VEGF及びVEGFトラップ(VEGFRの可溶性の切断型)のヒト化モノクローナル抗体であってよいと考えられる。VEGFR拮抗薬は、ヒト化モノクローナル抗体又は低分子阻害薬であってよいと考えられる。VEGFRチロシンキナーゼ阻害薬の低分子阻害薬がいくつか開発されており、その中には、VEGFR2及び/又は他のVEGFRに選択的であるものもあれば、それより選択性は低いが癌の成長を標的とするものもある。さらに、血管新生阻害剤としてのドパミンD2受容体作動薬も報告され、併せて、表面にあるVEGFR−2の内在化の機序も示唆された(Basuら、2001)。血管新生の低分子阻害薬は、伝統的な化学療法的治療レジメンと比較して副作用が顕著に少ない潜在的に長期の治療をもたらすことから、このような阻害薬の開発は重要な治療分野と考えられる。
[0007]VEGFの特異的阻害薬3種が市販されている:ベバシズマブ(Bevacizumab)(商標)(Genentech&Roche)、ラニビズマブ(商標)(Genentech&Novartis)及びペガプタニブ(Pegaptanib)(商標)(Pfizer)。しかしながら、その全ては高コストを伴うことから、低コストの血管新生阻害薬の開発が強く望まれる。
[0008]本発明者らは、カテコール、ドパミン及びアドレナリンの強力な糖化阻害活性(Yeboahら、2005)、並びに白内障を予防するためのその適用(Mullick&Konishi、2007)についてこれまでに報告した。アドレナリンの新薬再創出は、(R,S)−アドレナリンのプロドラッグであるジピベフリンが緑内障を治療するための市販の点眼薬であるのと同様、眼の局所施用にとって有利である。そのため、本発明者らは、アドレナリンをベースに、糖尿病性網膜症を予防するための点眼剤を開発した。
[0009]リード化合物の1つは、(S)−イソプロテレノールである。(S)−イソプロテレノールを全身に用いた場合、(R)−イソプロテレノールと比較して、血圧低下、灌流心臓の心拍数低下及び子宮弛緩についての有効性は200から1600分の1であり、β−アドレナリン受容体作動薬としては弱い活性を示した(Landsら、1954)。α2−アドレナリン作動性受容体作動薬により侵害受容作用が典型的に引き起こされる場面で(S)−イソプロテレノールは抗侵害受容作用を示すことから、(S)−イソプロテレノールはα−アドレナリン作動性受容体拮抗薬である(Bentley及びStarr、1986)。
[0010](S)−イソプロテレノールは、ヒトにとって安全と考えられる。マウスにおける(S)−イソプロテレノールの急性静脈内毒性は、(R)−イソプロテレノールの場合のおよそ半分であり、すなわち、(S)−イソプロテレノール及び(R)−イソプロテレノールのLD50値は、それぞれ、113±5mg/kg及び57±2mg/kgであった(Landsら、1954)。さらに、(S)−イソプロテレノールは、(R,S)−イソプロテレノールを用いた市販の気管支拡張薬及び局所用の抗アレルギー薬の不活性成分である。(S)−イソプロテレノールの副作用は、極端に高濃度の場合にのみいくつか報告されている。ヒトにおいて局所施用された10%(S)−イソプロテレノールは、短時間の軽い結膜充血及び刺激を引き起こし、20%(S)−イソプロテレノール点眼剤は、数時間持続する著しい結膜充血及び軽い瞳孔縮小を生じた(Kassら、1976)。しかしながら、ウサギにおいては、17.6%(S)−イソプロテレノール点眼剤を用いた場合でも、心拍数、血圧及び血液化学値又は血清化学値の全身的な効果も剖検時の変化も観察されなかった(Seidehamelら、1975)。さらに、静脈内の大用量の(S)−イソプロテレノールは、血圧及び脈拍数に対し、わずかで一時的な効果のみ有するようであった(Kassら、1976)。
[0011](S)−イソプロテレノールのプロドラッグ形態の1つは、(S)−イソプロテレノールジピバレートである。(S)−イソプロテレノールジピバレートの全身試験は報告されていないが、ラセミ混合物の(R,S)−イソプロテレノールジピバレート(58μg/kg)は、イヌにおいて静脈内注射された。(R,S)−イソプロテレノールジピバレートは、(R,S)−イソプロテレノールの場合と同じ応答、すなわち、心拍数及び心拍出量の大幅な増加、総末梢抵抗の著しい低下、大動脈圧、中心静脈圧及び左心房圧の低下、並びに肺血管抵抗の顕著な変化なしという応答を示した。このような応答は(R,S)−イソプロテレノールの場合より遅く始まり、長く続いた。この結果から、(R,S)−イソプロテレノールジピバレートは不活性であり、(R,S)−イソプロテレノールに加水分解された後で効果を発揮することが示唆される(Wangら、1977)。
[発明の概要]
[0012]驚くべきことに、β炭素の位置にS立体配置を有し(S)−ノルアドレナリンより親油性の高い(S)−アイソフォームのカテコールアミン及び関連化合物は血管新生阻害性であることが、ここに見出された。さらに、β水酸基が修飾されているカテコールアミンも、(S)−アイソフォームであるか(R)−アイソフォームであるかに関わらず、血管新生阻害性であることも見出された。
[0012]驚くべきことに、β炭素の位置にS立体配置を有し(S)−ノルアドレナリンより親油性の高い(S)−アイソフォームのカテコールアミン及び関連化合物は血管新生阻害性であることが、ここに見出された。さらに、β水酸基が修飾されているカテコールアミンも、(S)−アイソフォームであるか(R)−アイソフォームであるかに関わらず、血管新生阻害性であることも見出された。
[0013]したがって、血管新生阻害剤としての、血管新生阻害に有効な量の式(I)
の化合物、その生理学的に許容される塩、そのプロドラッグ、生理的に機能するその誘導体又はその任意の混合物の使用が提供される[式中、R1及びR7はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、若しくは脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すか、又はR1及びR7は結合してC3−7窒素含有複素環を形成し;R2及びR’2はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基若しくはCOOHを表すか、又はR2若しくはR’ 2の一方がR1と結合してC3−7窒素含有複素環を形成し;R3は、OR8、SR8又はNR8R9を表し(式中、R8及びR9はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、又は脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すが、但し、R8及びR9が両方ともアシル基であることはない);R4及びR5はそれぞれ独立に、OY、NHY又はSYを表し(式中、Yは
を表す(式中、R11及びR12はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基又はC3−10シクロアルキル基を表す));R6a、R6b及びR6cはそれぞれ独立に、H、F、Cl、Br、I、OR10又はSR10を表し(式中、R10は、脂肪族酸又は芳香族酸由来のC1−10アシル基を表す);(S)は、この化合物の(S)立体配置を規定するキラル中心を表し;C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、C1−10アシル基、C3−8窒素含有複素環基は、それぞれ独立に、1個又は複数のヘテロ原子N、O又はSを含み又は含まず、独立に、1つ又は複数のC6−10アリール基、C6−18アルカリール基又はC6−18アラルキル基で置換されておらず又は置換されており;但し、R2及びR’2が両方ともHである場合は、R1及びR7が両方ともHであることはない]。YがHを表さないとき、Yはin vivoで加水分解性であり、YがHを表す化合物をもたらす。
の化合物、その生理学的に許容される塩、そのプロドラッグ、生理的に機能するその誘導体又はその任意の混合物の使用が提供される[式中、R1及びR7はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、若しくは脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すか、又はR1及びR7は結合してC3−7窒素含有複素環を形成し;R2及びR’2はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基若しくはCOOHを表すか、又はR2若しくはR’ 2の一方がR1と結合してC3−7窒素含有複素環を形成し;R3は、OR8、SR8又はNR8R9を表し(式中、R8及びR9はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、又は脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すが、但し、R8及びR9が両方ともアシル基であることはない);R4及びR5はそれぞれ独立に、OY、NHY又はSYを表し(式中、Yは
を表す(式中、R11及びR12はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基又はC3−10シクロアルキル基を表す));R6a、R6b及びR6cはそれぞれ独立に、H、F、Cl、Br、I、OR10又はSR10を表し(式中、R10は、脂肪族酸又は芳香族酸由来のC1−10アシル基を表す);(S)は、この化合物の(S)立体配置を規定するキラル中心を表し;C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、C1−10アシル基、C3−8窒素含有複素環基は、それぞれ独立に、1個又は複数のヘテロ原子N、O又はSを含み又は含まず、独立に、1つ又は複数のC6−10アリール基、C6−18アルカリール基又はC6−18アラルキル基で置換されておらず又は置換されており;但し、R2及びR’2が両方ともHである場合は、R1及びR7が両方ともHであることはない]。YがHを表さないとき、Yはin vivoで加水分解性であり、YがHを表す化合物をもたらす。
[0014]さらに、血管新生阻害剤としての、血管新生阻害に有効な量の式(II)
の化合物、その生理学的に許容される塩、そのプロドラッグ、生理的に機能するその誘導体又はその任意の混合物の使用が提供される[式中、R1及びR7はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、若しくは脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すか、又はR1及びR7は結合してC3−7窒素含有複素環を形成し;R2及びR’2はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基若しくはCOOHを表すか、又はR2若しくはR’2の一方がR1と結合してC3−7窒素含有複素環を形成し;R13は、OR18、SR18又はNR18R19を表し(式中、R18及びR19はそれぞれ独立に、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、又は脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すが、但し、R18及びR19が両方ともアシル基であることはない);R4及びR5はそれぞれ独立に、OY、NHY又はSYを表し(式中、Yは
を表す(式中、R11及びR12はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基又はC3−10シクロアルキル基を表す));R6a、R6b及びR6cはそれぞれ独立に、H、F、Cl、Br、I、OR10又はSR10を表し(式中、R10は、脂肪族酸又は芳香族酸由来のC1−10アシル基を表す);C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、C1−10アシル基、C3−8窒素含有複素環基は、それぞれ独立に、1個又は複数のヘテロ原子N、O又はSを含み又は含まず、独立に、1つ又は複数のC6−10アリール基、C6−18アルカリール基又はC6−18アラルキル基で置換されておらず又は置換されている]。YがHを表さないとき、Yはin vivoで加水分解性であり、YがHを表す化合物をもたらす。
の化合物、その生理学的に許容される塩、そのプロドラッグ、生理的に機能するその誘導体又はその任意の混合物の使用が提供される[式中、R1及びR7はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、若しくは脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すか、又はR1及びR7は結合してC3−7窒素含有複素環を形成し;R2及びR’2はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基若しくはCOOHを表すか、又はR2若しくはR’2の一方がR1と結合してC3−7窒素含有複素環を形成し;R13は、OR18、SR18又はNR18R19を表し(式中、R18及びR19はそれぞれ独立に、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、又は脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すが、但し、R18及びR19が両方ともアシル基であることはない);R4及びR5はそれぞれ独立に、OY、NHY又はSYを表し(式中、Yは
を表す(式中、R11及びR12はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基又はC3−10シクロアルキル基を表す));R6a、R6b及びR6cはそれぞれ独立に、H、F、Cl、Br、I、OR10又はSR10を表し(式中、R10は、脂肪族酸又は芳香族酸由来のC1−10アシル基を表す);C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、C1−10アシル基、C3−8窒素含有複素環基は、それぞれ独立に、1個又は複数のヘテロ原子N、O又はSを含み又は含まず、独立に、1つ又は複数のC6−10アリール基、C6−18アルカリール基又はC6−18アラルキル基で置換されておらず又は置換されている]。YがHを表さないとき、Yはin vivoで加水分解性であり、YがHを表す化合物をもたらす。
[0015]さらに、対象における血管新生を治療及び/又は予防する方法であって、血管新生阻害に有効な量の上述の血管新生阻害剤を対象に投与することを含む方法が提供される。
[0016]さらに、対象における血管新生を治療及び/又は予防するための医薬を調製するための、血管新生阻害に有効な量の上述の血管新生阻害剤の使用が提供される。
[0017]さらに、血管新生阻害に有効な量の上述の血管新生阻害剤を、対象における血管新生の治療及び/又は予防において使用するための取扱説明書と共に含む市販用パッケージ品も提供される。
[0018]R7は、好ましくはHを表す。R1は、好ましくはC1−10アルキル基を表す。好ましくは、R2及びR’2は両方ともHを表すか、又はR2はHを表し、R’2は−CH2CH3を表す。R4及びR5は、好ましくはそれぞれ独立にOYを表し、各Yは、好ましくは独立に、H、ピバロイル、アセチル、プロピオニル、ブタノイル、イソブタノイル、ペンタノイル、2−ブテノイル、シクロプロパノイル、シクロヘキサノイル、ベンゾイル、4−メチルベンゾイル、4−ニトロベンゾイル、フェナセチル、4−メチルフェナセチル、メトキシアセチル又はN,N−ジメチルアミドを表す。より好ましくは、R4及びR5はそれぞれOYを表し、各YはH又はピバロイルを表す。Yは、最も好ましくはHである。好ましくは、R6a、R6b及びR6cはそれぞれHを表す。式(I)の化合物において、R3は好ましくはOR8を表し、R8は好ましくはC1−10アルキル基を表す。式(II)の化合物において、R13は好ましくはOR18を表し、R18は、好ましくはC1−10アルキル基、より好ましくは−CH3を表す。本明細書で述べるアルキル基は、直鎖でも分枝鎖でもよい。
[0019]式(I)の化合物の場合、この化合物は、好ましくは、(S)−イソプロテレノール、(S)−N−エチルノルアドレナリン、(S)−N−tert−ブチルノルアドレナリン、(S)−N−n−ブチルノルアドレナリン、(S)−N−n−プロピルノルアドレナリン、1−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−2−(イソプロピルアミノ)−1(S)−ブタノール、エリスロ−(D,L)−ドパセリン(dopaserine)、デキストロノルデフリン(dextronordefrin)、(S)−ジオキシフェドリン、(S)−ジオキセテドリン、(S)−ノルブドリン、(S)−4−(ヒドロキシ−2−ピペリジニルメチル)−1,2−ベンゼンジオール、(S)−ピプラテコール、(S)−アルブタミン、(S)−プロトキロール、(S)−テオドレナリネル(theodrenalinel)、(S,S’)−ヘキソプレナリン又は(S)−PTFMAである。より好ましくは、この化合物は、(S)−イソプロテレノール、(S)−N−エチルノルアドレナリン、(S)−N−tert−ブチルノルアドレナリン、(S)−N−n−ブチルノルアドレナリン、(S)−N−n−プロピルノルアドレナリン、1−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−2−(イソプロピルアミノ)−1(S)−ブタノール、エリスロ−(D,L)−ドパセリン、デキストロノルデフリン、(S)−ジオキシフェドリン、(S)−ジオキセテドリン又は(S)−ノルブドリンである。さらにより好ましくは、この化合物は(S)−イソプロテレノールである。
[0020]式(I)の化合物をベースにした血管新生阻害剤の場合、その化合物の光学純度は、特定の化合物に依存する。(R)−異性体の混入は、(S)−異性体の血管新生阻害活性が、対応する(R)−異性体の一切の血管新生活性を上回るように、十分低くなければならない。好ましくは、この血管新生阻害剤の光学純度は、50重量%以上、より好ましくは95%以上、さらにより好ましくは97%以上、さらに一層より好ましくは99%以上、それよりさらに一層より好ましくは99.9%以上、それよりさらに尚一層より好ましくは99.99%以上である。局所施用の場合、光学純度は好ましくは97重量%以上、より好ましくは99.9%以上であり、全身施用の場合は、光学純度は好ましくは99.9重量%以上、より好ましくは99.99%以上である。高純度であれば、血管新生阻害剤の血管新生阻害効果が増すと共に、短期及び/又は長期の使用において(R)−アイソフォーム不純物が有する可能性のあるβ2−アドレナリン作動性受容体作動薬としての効果も低下する。さらに、β2−アドレナリン作動性受容体作動薬は一般に血管新生性であり(Thakerら、2006)、そのことは、本発明において使用する(S)−異性体の血管新生阻害効果に対し逆効果となると考えられる。
[0021]式(II)の化合物の場合、この化合物は、好ましくは、(S)−アイソフォーム、(R)−アイソフォーム又はその混合物としての1−(N−イソプロピル)−3−メトキシドパミンである。
[0022]生理学的に許容される塩の例としては、塩酸塩、酒石酸水素塩、酢酸塩、炭酸塩、タンニン酸塩、硫酸塩、ステアリン酸塩及びクエン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。塩酸塩形態が好ましい。
[0023]プロドラッグ又は生理的に機能する誘導体の例としては、脂肪族酸若しくは芳香族酸由来の少なくとも1つのC1〜10アシル基を含む化合物が挙げられるが、これに限定されない。アシル基としては、例えば、ピバロイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブタノイル基、イソブタノイル基、ペンタノイル基、シクロプロパノイル基、シクロヘキサノイル基、ジベンゾイル基及びジ(4−メチルベンゾイル)基が挙げられる(Jarvinen&Jarvinen、1996)。ピバロイル(トリメチルアセチル)基は、とりわけ好ましいアシル基である。そのようなアシル基を有する化合物は、有利なことに、治療上有効な濃度の化合物を標的組織へ(例えば、糖尿病性網膜症を治療するために網膜へ)より効率的に送達することとなり、細胞膜に有効に浸透するための親油性を高め、酸化による劣化から当該化合物を保護し、且つ、保管中のラセミ化から当該化合物を保護する。
[0024]活性のある血管新生阻害剤は、薬理学上許容される組成物の形で製剤してよい。本発明による活性のある血管新生阻害剤に加え、この組成物は、1つ又は複数の薬理学上耐容性のある成分、例えば、担体(例えば溶媒)、緩衝液、粘度調節剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤、滑沢剤、オスモル濃度調節剤、結合剤、流動促進剤、抗粘着剤、希釈剤、甘味剤、着色料、フレーバー剤、他の薬理学上活性のある作用剤又はその混合物をさらに含んでよい。
[0025]本発明による眼の局所投与のための組成物は、溶液、懸濁液又は乳剤など、眼用の局所送達に適した任意の剤形で製剤してよい。中でも、眼用の水溶液が好ましい。血管新生阻害剤以外に、この組成物は、抗微生物保存剤(複数も)、薬物及びプロドラッグの保持を高めるための粘度増加剤(複数も)、緩衝剤(複数も)、オスモル濃度調節剤(複数も)、界面活性剤(複数も)、抗酸化剤(複数も)又はその混合物など慣習的な眼用の添加剤及び賦形剤を、必要又は適切であれば、さらに含有してよい。眼の局所治療は、点眼又は硝子体内注射であってよいが、これに限定されない。この組成物は、ソフトコンタクトレンズ中に染み込ませるなど、他の方法により施用することもでき、これにより、長期継続する場合の薬物又はプロドラッグの有効濃度を低下させ得る。
[0026]本発明による全身投与用の組成物は、経口投与、吸入、舌下投与、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、骨内注入又はデポ注射であってよいが、これらに限定されない。活性のある血管新生阻害剤に加え、薬理学上許容される成分としては、分散媒、結合剤、希釈剤、滑沢剤、抗粘着剤、流動促進剤、崩壊剤、保存剤、香味料、抗酸化剤、甘味料、着色料、フレーバー剤又はその混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
[0027]in vitroでの血管新生阻害活性は、約100μM未満、特に約50μM未満、それより特に約30μM未満の濃度で示される。血管新生及び細胞浸潤を予防/遅延/治療するための治療上有効な用量は、局所施用の場合、好ましくは約0.01から10%w/v、特に好ましくは0.01から5%w/v、とりわけ0.01から1%w/v、特に0.1から0.5%w/vである。活性のある血管新生阻害剤は、単位剤形の形態で製剤できる。例えば、点眼製剤において、単位用量は、好ましくは5〜200μL、さらにとりわけ10〜100μL、特に30〜50μLであり、この場合、約50μLが1点眼当りの典型的な体積であり、すなわち、200μL及び100μLは、1回用量で4点眼及び2点眼に相当する。市販の点眼剤製品の中には、1回用量で2から3点眼を推奨しているものもある。全身に治療を施す場合の投与量は、約0.1から500mg/kg/day、例えば、1から200mg/kg/day、とりわけ50から100mg/kg/dayの範囲であってよい。特定のレジメンにとって最も有効な用量は、当業者により容易に決定される。
[0028]本発明による血管新生阻害剤の使用により、いくつかの疾患状態、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性症、虚血性心障害、関節リウマチ、乾癬、腫瘍発生、転移及び/又は腫瘍成長の治療及び/又は予防が可能になる。哺乳動物対象、例えば、ヒト、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、モルモット及びマウスが好ましい。
[0029]本発明のさらなる特徴は、以下の詳細な説明の中で記載され、又は明らかになるであろう。
[0030]本発明がより明確に理解できるように、添付の図面を参照しながら、実施例を用いて、本発明の実施形態をここに詳細に記載する。
[好ましい実施形態の説明]
[0041]材料及び方法:
[0041]材料及び方法:
[0042]化学薬品:(S)−イソプロテレノールL−ビタルトレート、(S)−ノルアドレナリンL−ビタルトレート、D−マンニトール、塩化ベンザルコニウム、塩化ピバロイル(塩化トリメチルアセチル)、ヨードエタン、1−ヨードプロパン、1−ヨードブタン、水素化ホウ素ナトリウム、トリフルオロメタンスルホン酸メチル、2−クロロ−3,4−ジヒドロキシアセトフェノン、1,4−ジオキサン、p−塩化トルオイル、硫酸二ナトリウム、クロロブタノール、アミノカプロン酸、過塩素酸ナトリウム、[Glu1]−フィブリノペプチドB、(R)−イソプロテレノールヒドロクロリド、メシル酸イソエタリン、ジ−tert−ブチルジカーボネート、トリエチルアミン、塩化アセチル、2−プロパノール、ジメチルホルムアミド、tert−ブチルアミン、塩化イソブチリル、塩化ベンゾイル、塩化セチルピリジニウム及びポビドン(K30)を、Sigma−Aldrich(Oakville、Ontario、カナダ)から入手した。アセトン、塩化メチレン、酢酸エチル、氷酢酸、炭酸二ナトリウム、塩化ナトリウム及びNaOHを、EMD Science(Gibbstown、New Jersey、USA)から得た。エデト酸二ナトリウム、トリフルオロ酢酸(TFA)及び水を、J.T.Baker(Phillipsburg、New Jersey、USA)から購入した。1.0M HClを、VWR(Montreal、Quebec、カナダ)から入手した。質量分析用の水をAnachemia(Lachine、QC、カナダ)から購入した。ギ酸をRiedel de Haen(Oakville、Ontario、カナダ)から購入した。アセトニトリル及びヘキサンを、Fisher Scientific(Nepean、Ontario、カナダ)から得た。AG(登録商標)4−X4樹脂、100〜200メッシュ、遊離塩基型を、BIO−RAD Laboratories,Inc(Hercules、CA、USA)から購入した。全ての化学薬品は、さらに精製することなく使用した。
[0043]塩化セチルピリジニウムからトリフルオロ酢酸セチルピリジニウムを調製した。メタノール中のトリフルオロ酢酸ナトリウム溶液に、トリフルオロ酢酸を加えた。次に、この結果得られたTFA−Naのメタノール溶液を、エタノール中の塩化セチルピリジニウムの溶液に、撹拌しながら、液滴として加えた。30分後、沈殿したNaClを濾過して取り除き、回転式の蒸発装置を用いて蒸発させた(<40℃)。残留物をジクロロメタン中に溶解させてから、溶解しない成分を濾過して取り除いた。蒸発後、tert−ブタノールを加えてから凍結乾燥させて、白色の結晶を得た。
[0044]塩化セチルピリジニウムから酢酸セチルピリジニウムを調製した。塩化セチルピリジニウムをメタノール中に溶解させてから、酢酸及び酢酸ナトリウムを加えた。溶媒を蒸発させた後、残留物を塩化メチレン中で溶解させた。酢酸セチルピリジニウムは塩化メチレン中で溶解したが、塩化ナトリウムは沈殿したため、濾過により除去した。溶媒を蒸発させた後、生成物に硝酸銀溶液を加えたときに沈殿物が形成されなかったことから、塩化物イオンが存在しないことを確認した。
[0045](S)−ノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリドの合成:
[0046]この化合物は、(S)−N−エチルノルアドレナリンヒドロクロリド、(S)−N−プロピルノルアドレナリンヒドロクロリド及び(S)−N−ブチルノルアドレナリンヒドロクロリドの合成において使用する。
[0047](S)−N−Boc−ノルアドレナリン
[0048]テトラヒドロフラン(THF)−水100mL(1:1 v/v)中の(S)−ノルアドレナリンビタルトレート(3.83g、12mmol)の溶液に、炭酸水素ナトリウム(3.3g、40mmol)を加え、勢いよく撹拌した。次に、THF(10mL)中のジ−tert−ブチルジカーボネート(2.9g、13.2mmol)を室温で液滴として加えた。この反応混合物を3時間撹拌した。生成物の(S)−N−Boc−ノルアドレナリンをジクロロメタン(DCM)50mLで3回抽出した。合わせた抽出物を水(50mL)及び鹹水(50mL)で洗浄した。生成溶液を、硫酸ナトリウムを介して乾燥させ、濾過してから、蒸発により乾燥させて所望の生成物を得た。この生成物はHPLCプロファイル(Waters製の分析用HPLC(Watersシンメトリーシールド(SymmetryShield)(商標)3.5μm、4.6×50mm C18−逆相カラム)によれば、95%を超える純度を示した。勾配10〜90%の水中アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)、流速2mL/分で9分間(A系)を用いた。この生成物は、精製せずにさらに使用した。
[0049]C13H19NO5、白色の固形物、Rt=4.9分(A系)。HRMS:[M+H+]の計算値=270.1341、実測値=270.1342。ESI−MS/MS(衝突エネルギー(CE)=2):m/z(相対強度 %):270(M+H+,94)、252(100)、214(1.3)、196(51)。NMR:1H NMR(500MHz,CD3OD):δ 6.80(s,1H)、6.73(d,J=8Hz,1H)、6.67(d,J=7Hz,1H)、4.54(dd(br),J=5,7Hz,1H)、3.24(dd,J=5,13Hz,1H)、3.16(dd,J=7,14Hz,1H)、1.43(s,9H)。
[0050](S)−N−Boc−ノルアドレナリンジピバレート
[0051]DCM(100mL)中の(S)−N−Boc−ノルアドレナリン(3.0g、11mmol)とトリエチルアミン(5mL、36mmol)との混合物に、窒素下にて0℃で塩化ピバロイル(2.9mL、24mmol)をゆっくり加えた。この反応混合物を0℃で15分間、次いで室温で2時間撹拌した。この生成溶液を、水(50mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムを介して乾燥させてから濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(勾配が20〜40%の酢酸エチル/ヘキサンを使用)により、粘性のある液体としての純粋な生成物(2.40g、(S)−ノルアドレナリンビタルトレートからの収率46%)を得た。
[0052]C23H35NO7、粘性のある液体、Rt=9.0分(A系)。HRMS:[M+H+]の測定値=438.2492、実測値=438.2482。ESI−MS/MS(CE=2):m/z(相対強度 %):438(M+H+,100)、420(2.3)、382(86)。NMR:1H NMR(500MHz,CD3OD):δ 7.29(d,J=7Hz,1H)、7.17(s,1H)、7.14(d,J=9Hz,1H)、4.74(t(br),J=8Hz,1H)、3.28(dd,1H)、3.22(dd,J=8,15Hz,1H)、1.44(s,9H)、1.36(s,9H)、1.34(s,9H)。
[0053](S)−ノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド
[0054]乾燥メタノール(100mL)中の(S)−N−Boc−ノルアドレナリンジピバレート(2.4g、5.5mmol)の溶液に塩化アセチル(8mL、110mmol)を0℃で液滴として加えた。この反応混合物を0℃、次いで室温で、15分間撹拌した。TLCにより反応をモニターした。反応(3時間)の完了後、溶媒を減圧下で蒸発させてから、高性能置換クロマトグラフィー(HPDC)(0.1%TFA/水、トリフルオロ酢酸セチルピリジニウム4g/Lを溶出剤として)により生成物を精製した。この生成物は、以下に記載の(S)−N−エチルノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド、(S)−N−プロピルノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド及び(S)−N−ブチルノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリドの調製においてさらに使用した。
[0055]C18H28NO5Cl、白色の固形物、Rt=6.0分(A系)。HRMS:[C18H27NO5+H+]の計算値=338.1967、実測値=338.1983。ESI−MS/MS(CE=13):m/z(相対強度 %):338(M+H+,5.9)、320(100)、236(26)。NMR:1H NMR(500MHz,CD3OD):δ 7.36(dd,J=2,8Hz,1H)、7.27(d,J=2Hz,1H)、7.20(d,J=8Hz,1H)、4.94(dd,J=4,9Hz,1H)、3.20(dd,J=4,13Hz,1H)、3.04(dd,J=9,13Hz,1H)、1.36(s,9H)、1.35(s,9H)。
[0056](S)−N−エチルノルアドレナリンヒドロクロリドの合成:
[0057](S)−N−エチルノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド(プロドラッグ)
[0058]乾燥ジメチルホルムアミド(DMF)10mL中の(S)−ノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド(0.37g、1.0mmol)及びトリエチルアミン(0.4mL、3.0mmol)の溶液に、ヨードエタン(0.12mL、1.5mmol)を加えた。この反応混合物を窒素下にて室温で24時間撹拌してから凍結乾燥させた。この混合物を酢酸エチル(30mL)中に取り、NaH2PO3緩衝液(4×20mL、pH3)を用いて抽出した。有機層を水(3×20mL)で再度抽出した。1.0N NaOHを用いて、緩衝液抽出物及び水抽出物を合わせたものをpH11に調節してから、酢酸エチル(3×20mL)で抽出した。分離された有機相を水(20mL)及び鹹水(20mL)でさらに洗浄し、硫酸ナトリウムを介して乾燥させてから濃縮した。HPDC(0.1%TFA/水、トリフルオロ酢酸セチルピリジニウム4g/Lを溶出剤として)を用いて、未精製混合物を精製した。単離された化合物を過剰な1.0N HClで処理してから凍結乾燥させて、固形のモノエチル化生成物(0.11g、収率27%)を得た。
[0059]C20H32NO5Cl(モノエチル化)、白色の固形物、Rt=6.2分(A系)。HRMS:[C20H31NO5+H+]の測定値=366.2280、実測値=366.2268。ESI−MS/MS(CE=15):m/z(相対強度 %):366(M+H+,55)、348(100)、264(24)。NMR:1H NMR(500MHz,CD3OD):δ 7.37(dd,J=2,8Hz,1H)、7.27(d,J=2Hz,1H)、7.20(d,J=8Hz,1H)、4.98(dd,J=3,10Hz,1H)、3.24(dd,J=3,13Hz,1H)、3.12(m,3H)、1.36(s,9H)、1.35(s,9H)、1.34(t,J=7Hz,3H)。
[0060](S)−N−エチルノルアドレナリンヒドロクロリド
[0061]乾燥メタノール(3mL)中の(S)−N−エチルノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド(50mg、125μmol)の溶液に、過剰な固形の水素化ホウ素ナトリウムを加え、未反応の出発物質が残らなくなるまで、HPLCを用いてその反応混合物をモニターした。乾燥するまで溶媒を蒸発させると、白色の固形物を得た。溶出剤として0.1%TFA/水を用いる調製用HPLCにより、未精製混合物を精製した。残留物を過剰な1.0N HClで処理してから凍結乾燥させると、白色の固形物としての所望の生成物(22mg、収率76%)を得た。
[0062]C10H16NO3Cl、白色の固形物、Rt=0.53分(A系)。HRMS:[C10H15NO3+H+]の計算値=198.1130、実測値=198.1128。ESI−MS/MS(CE=8):m/z(相対強度 %):198(M+H+,48)、180(100)。NMR:1H NMR(500MHz,DMSO−d6):δ 8.99(s(br),1H)、8.96(s(br),1H)、6.79(s,1H)、6.72(d,J=8Hz,1H)、6.61(d,J=9Hz,1H)、5.92(s(br),1H)、4.77(d,J=10Hz,1H)、2.94(m(br),3H)、2.87(t,J=12Hz,1H)、1.21(t,J=7Hz,3H)。
[0063](S)−N−プロピルノルアドレナリンヒドロクロリドの合成:
[0064](S)−N−プロピルノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド(プロドラッグ)
[0065]乾燥DMF(10mL)中の(S)−ノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド(0.37g、1.0mmol)及びトリエチルアミン(0.4mL、3.0mmol)の混合物にヨードプロパン(0.15mL、1.5mmol)を加え、窒素下にて室温で24時間撹拌した。その結果得られた混合物を凍結乾燥させた。この混合物を酢酸エチル(30mL)中に取り、NaH2PO3緩衝液(4×20mL、pH3)で抽出した。有機層を水(3×20mL)で再度抽出した。1.0N NaOHを用いて、緩衝液抽出物と水抽出物とを合わせたものをpH11に調節してから、酢酸エチル(3×20mL)で抽出した。分離された有機相を水(20mL)及び鹹水(20mL)でさらに洗浄し、硫酸ナトリウムを介して乾燥させてから濃縮した。HPDC(0.1%TFA/水、トリフルオロ酢酸セチルピリジニウム4g/Lを溶出剤として)により、未精製混合物を精製した。単離された化合物を過剰な1.0N HClで処理してから凍結乾燥させると、固形生成物(0.09g、収率22%)を得た。
[0066]C21H34NO5Cl、白色の固形物、Rt=6.4分(A系)。HRMS:[C21H33NO5+H+]の計算値=380.2437、実測値=380.2421。ESI−MS/MS(CE=15):m/z(相対強度 %):380(M+H+,78)、362(100)、278(20)、250(0.9)。NMR:1H NMR(500MHz,CD3OD):δ 7.38(d,J=8Hz,1H)、7.28(s,1H)、7.20(d,J=8Hz,1H)、5.01(dd,J=3,10Hz,1H)、3.26(d,J=13Hz,1H)、3.14(t,J=10Hz,1H)、3.03(t,J=8Hz,2H)、1.76(m(br),2H)、1.36(s,9H)、1.35(s,9H)、1.04(t,J=7Hz,3H)。
[0067](S)−N−プロピルノルアドレナリンヒドロクロリド
[0068]乾燥メタノール(3mL)中の(S)−N−プロピルノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド(40mg、96μmol)の溶液に、過剰な固形の水素化ホウ素ナトリウムを加え、未反応の出発物質が残らなくなるまで、HPLCによりこの反応混合物をモニターした。乾燥するまで溶媒を蒸発させると、白色の固形物を得た。溶出剤として0.1%TFA/水を用いる調製用HPLCにより、未精製混合物を精製した。残留物を過剰な1.0N HClで処理してから凍結乾燥させると、白色の固形物としての所望の生成物(15mg、収率63%)を得た。
[0069]C11H18NO3Cl、白色の固形物、Rt=0.57分(A系)。HRMS:[C11H17NO3+H+]の計算値=212.1286、実測値=212.1280。ESI−MS/MS(CE=8):m/z(相対強度 %):212(M+H+,63)、194(100)。NMR:1H NMR(500MHz,DMSO−d6):δ 8.96(s(br),1H)、8.93(s(br),1H)、6.78(s,1H)、6.72(d,J=8Hz,1H)、6.62(d,J=9Hz,1H)、5.93(d(br),J=3Hz,1H)、4.76(d,J=9Hz,1H)、2.99(m(br),1H)、2.87(m(br),2H)、2.72(m(br),1H)、1.65(m,2H)、0.89(m,3H)。
[0070](S)−N−ブチルノルアドレナリンヒドロクロリドの合成:
[0071](S)−N−ブチルノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド(プロドラッグ)
[0072]乾燥DMF(15mL)中の(S)−ノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド(0.56g、1.5mmol)及びトリエチルアミン(0.6mL、4.5mmol)の混合物に、ヨードブタン(0.26mL、2.25mmol)を加え、窒素下にて室温で24時間撹拌した。その結果得られた混合物を凍結乾燥させた。この混合物を酢酸エチル(40mL)中に取り、NaH2PO3緩衝液(4×20mL、pH3)で抽出した。有機層を水(3×20mL)で再度抽出した。1.0N NaOHを用いて、緩衝液抽出物と水抽出物とを合わせたものをpH11に調節してから、酢酸エチル(3×20mL)で抽出した。分離された有機相を水(20mL)及び鹹水(20mL)でさらに洗浄し、無水の硫酸ナトリウムを介して乾燥させてから濃縮した。HPDC(0.1%TFA/水、トリフルオロ酢酸セチルピリジニウム4g/Lを溶出剤として)により、未精製混合物を精製した。単離された化合物を過剰な1.0N HClで処理してから凍結乾燥させると、固形生成物(0.22g、収率34%)を得た。
[0073]C22H36NO5Cl、白色の固形物、Rt=6.7分(A系)。HRMS:[C22H35NO5+H+]の計算値=394.2593、実測値=394.2582。ESI−MS/MS(CE=15):m/z(相対強度 %):394(M+H+,100)、376(34)、292(4)。NMR:1H NMR(500MHz,CD3OD):δ 7.37(dd,J=2,8Hz,1H)、7.28(d,J=2Hz,1H)、7.21(d,J=8Hz,1H)、5.00(dd,J=3,10Hz,1H)、3.25(dd,J=3,12Hz,1H)、3.14(dd,J=10,12Hz,1H)、3.06(t,J=8Hz,2H)、1.71(m(br),2H)、1.46(m,2H)、1.36(s,9H)、1.35(s,9H)、1.01(t,J=7Hz,3H)。
[0074](S)−N−ブチルノルアドレナリンヒドロクロリド
[0075]乾燥メタノール(3mL)中の(S)−N−ブチルノルアドレナリンジピバレートヒドロクロリド(50mg、120μmol)の溶液に、過剰な固形の水素化ホウ素ナトリウムを加え、未反応の出発物質が残らなくなるまで、HPLCによりこの反応混合物をモニターした。乾燥するまで溶媒を蒸発させると、白色の固形物を得た。この固形物にTHF(10mL)及び飽和NaCl溶液(10mL)を加え、THF(4×15mL)で抽出した。有機抽出物を合わせたものを、無水の硫酸ナトリウムを介して乾燥させ、濾過し、真空中で乾燥させた。残留物を過剰な1.0N HClで処理してから凍結乾燥させると、白色の固形物としての所望の生成物(25mg、収率80%)を得た。
[0076]C12H20NO3Cl、白色の固形物、Rt=0.84分(A系)。HRMS:[C12H19NO3+H+]の計算値=226.1443、実測値=226.1437。ESI−MS/MS(CE=8):m/z(相対強度 %):226(M+H+,78)、208(100)。NMR:1H NMR(500MHz,DMSO−d6):δ 8.95(s(br),1H)、8.93(s(br),1H)、6.78(d,J=2Hz,1H)、6.72(d,J=9Hz,1H)、6.62(dd,J=2,9Hz,1H)、5.93(d(br),J=3Hz,1H)、4.75(d,J=9Hz,1H)、2.99(dd,J=3,13Hz,1H)、2.89(m,3H)、1.61(m,2H)、1.31(m,2H)、0.89(t,J=8Hz,3H)。
[0077](R)−O−メチルイソプロテレノールヒドロクロリドの合成:
[0078]メタノール(5mL)中の(R)−イソプロテレノールヒドロクロリド(123.6mg、0.5mmol)の溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸メチル(220μl、2.0mmol)を室温で加え、一晩撹拌した。さらなるトリフルオロメタンスルホン酸メチル(220μl、2.0mmol)を加えた後、この溶液を再度、一晩撹拌した。蒸発装置を用いて溶媒を除去した。次に、調製用HPLC(Vydac C18、5×25cmカラム、均一濃度の溶媒(5%アセトニトリル/水中の0.1%TFA)、流速20ml/分)により、残留物を精製した。精製した生成物を0.05N HCl(10mL)で処理してから凍結乾燥させると、淡褐色の固形物としての(R)−O−メチルイソプロテレノールヒドロクロリド(62.3mg、0.24mmol、収率48%)を得た。
[0079]C12H20NO3Cl、淡褐色の固形物、Rt=4.6分(B系)。HRMS:[C12H19NO3+H+]の計算値=226.1443、実測値=226.1440。ESI−MS/MS(CE=10):m/z(相対強度 %):226(M+H+,23)、194(100)。NMR:1H NMR(500MHz,CD3OD):δ 6.79(m,2H)、6.69(dd,J=3,8Hz,1H)、4.34(dd(br),J=3,10Hz,1H)、3.40(七重線,J=6Hz,1H)、3.23(s,3H)、3.04〜3.16(m,2H)、1.34(d,J=6Hz,3H)、1.32(d,J=6Hz,3H)。
[0080](S)−O−メチルイソプロテレノールヒドロクロリドの合成:
[0081]メタノール(1mL)中の(S)−イソプロテレノールビタルトレート(361mg、1.0mmol)の溶液に、室温でトリフルオロメタンスルホン酸メチル(1mL、8.0mmol)をゆっくり加え、4時間撹拌した。蒸発装置を用いて溶媒を速やかに除去してから、次いで調製用HPLC(Vydac C18、5×25cmカラム、勾配溶離(0〜40%、アセトニトリル/水(0.1%TFA)、流速20mL/分)により生成物を精製した。精製した化合物を0.1N HCl(10mL)で処理してから凍結乾燥させると、白色の固形物としての(S)−O−メチルイソプロテレノールヒドロクロリドを得た。この生成物を、Waters製の分析用HPLC(Watersシンメトリーシールド(商標)3.5μm、4.6×50mm C18−逆相カラム)により分析した。勾配0〜90%の水中アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)、12分間、流速2mL/分(B系)を用いた。
[0082] C12H20NO3Cl、白色の固形物、Rt=4.6分(B系)。HRMS:[C12H19NO3+H+]の計算値=226.1443、実測値=226.1432。ESI−MS/MS(CE=10):m/z(相対強度 %):226(M+H+,17)、194(100)。NMR:1H NMR(500MHz,CD3OD):δ 6.75(m(br),2H)、6.64(d(br),J=6Hz,1H)、4.33(d(br),J=8Hz,1H)、3.36(m(br),1H)、3.19(s,3H)、3.00〜3.12(m,2H)、1.29(t(br),J=7Hz,6H)。
[0083](R,S)−N−tert−ブチルノルアドレナリンの合成:
[0084]ω−tert−ブチルアミノ−3,4−ジヒドロキシアセトフェノンヒドロクロリド
[0085]ジオキサン(10mL)中のω−クロロ−3,4−ジヒドロキシアセトフェノン(5g、26.8mmol)の溶液に、tert−ブチルアミン(8.4mL、80mmole)を加え、70〜80℃で3時間撹拌した。未反応の出発物質が残らなくなるまで、HPLCによりこの反応混合物をモニターした。生成物のアミノケトン基に10%HClを加えた。室温で一晩冷却した後、固形物を濾過し、アセトンで洗浄してから乾燥させると、アミノケトンヒドロクロリドを得た(5.62g、収率81%、m.p.233〜235℃)。
[0086]N−tert−ブチルノルアドレナリン
[0087]メタノール(20mL)中のω−tert−ブチルアミノ−3,4−ジヒドロキシアセトフェノンヒドロクロリド(900mg、3.5mmol)の撹拌溶液に、室温でNaBH4(266mg、7mmol)をゆっくり加えた。未反応の出発物質が残らなくなるまで、HPLCによりこの反応混合物をモニターした(4時間)。溶媒を蒸発させてから生成物をさらに凍結乾燥させると、未精製の遊離塩基(1.32g)を得た。この未精製の遊離塩基(500mg)を、水2.5mL中に溶解させてから10%HClを用いてpH9〜10に調節した。濾過後、結果として得られた褐色の溶液を、RP−18カラムクロマトグラフィー上で40%メタノール/水を用いて溶出させた。収集した画分を合わせて真空中で乾燥させると褐色の生成物が得られ、これを、溶出剤として純水を用いるAG(登録商標)4−X4樹脂(100〜200メッシュ)カラムクロマトグラフィーにかけた。凍結乾燥後、黄色がかった結晶としての純粋なN−tert−ブチル−ノルアドレナリンを得た。
[0088] C12H19NO3、黄色がかった結晶、Rt=4.5分(B系)。HRMS:[C12H19NO3+H+]の計算値=226.1443、実測値=226.1432。ESI−MS/MS(CE=10):m/z(相対強度 %):226(M+H+,100)、208(60)、152(9)。NMR:1H NMR(500MHz,CD3OD):δ 6.63(d,J=2Hz,1H)、6.50〜6.60(m,2H)、4.66(t,J=7Hz,1H)、3.00(d,J=7Hz,2H)、1.33(s,9H)。
[0089](S)−イソプロテレノールジイソブチレート(プロドラッグ)の合成
[0090](S)−N−Boc−イソプロテレノール
[0091]DMF(15mL)中の(S)−イソプロテレノールビタルトレート(1.0g、3mmol)の溶液に、トリエチルアミン(1.25mL、9mmol)及びBoc2O(0.67g、3mmol)を室温で加えた。この混合物を勢いよく一晩撹拌し、HPLCにより反応をモニターした。未精製物質をDCM(3×50mL)で抽出した。抽出物を合わせたものを、水(3×50mL)及び鹹水(50mL)で洗浄してから、無水の硫酸ナトリウムを介して乾燥させた。その結果得られた残留物を蒸発により乾燥させると、淡褐色の固形物0.96gを得た。この生成物は、精製せずにさらに使用した。
[0092](S)−N−Boc−イソプロテレノールジイソブチレート
[0093]DCM(10mL)中の(S)−N−Boc−イソプロテレノール(0.96g、3mmol)及びトリエチルアミン(0.98mL、7mmol)の混合物に、窒素下にて0℃で10分かけて塩化イソブチリル(0.65mL、6mmol)を液滴として加えてから、室温で2時間撹拌した。未精製物質をDCM(3×50mL)で抽出し、水(3×50mL)及び鹹水(50mL)で洗浄してから、無水の硫酸ナトリウムを介して乾燥させた。その結果得られた溶液を蒸発により乾燥させると、白色の結晶としての(S)−N−Boc−イソプロテレノールジイソブチレート(1.2g)を得、これを精製せずにさらに使用した。
[0094](S)−イソプロテレノールジイソブチレートヒドロクロリド
[0095]イソプロパノール(10mL)中の(S)−N−Boc−イソプロテレノールジイソブチレート(1.2g、2.6mmol)の溶液に、塩化アセチル(1.88mL、26mmol)を0℃で加え、室温で1.5時間撹拌した。HPLCにより反応をモニターした。溶媒を除去した後、HPDC(0.1%TFA/水、トリフルオロ酢酸セチルピリジニウム4g/Lを溶出剤として)により、生成物の(S)−イソプロテレノールジイソブチレートを精製すると、319mg(全収率32%)を得た。
[0096]C19H30NO5Cl、白色の固形物、Rt=5.8分(A系)。HRMS:[C19H29NO5+H+]の計算値=352.2124、実測値=352.2119。NMR:1H NMR(CD3OD):δ 7.40(d,J=8Hz,1H)、7.34(brs,1H)、7.24(d,J=8Hz,1H)、5.02(dd,J=3,11Hz,1H)、3.47(m,1H)、3.25(dd,J=3,12Hz,1H)、3.13(dd,J=10,12Hz,1H)、2.83(m,2H)、1.37(d,J=7Hz,6H)、1.30(d,J=3Hz,12H)。
[0097](S)−イソプロテレノールジベンゾイレート(プロドラッグ)の合成:
[0098](S)−N−Boc−イソプロテレノール
[0099]DMF15mL中の(S)−イソプロテレノールビタルトレート(1.0g、3mmol)の溶液に、トリエチルアミン(1.25mL、9mmol)及びBoc2O(0.67g、3mmol)を室温で加えた。この混合物を勢いよく一晩撹拌し、HPLCによりこの反応をモニターした。生成物をDCM(3×50mL)で抽出し、水(3×50mL)及び鹹水(50mL)で洗浄してから、無水の硫酸ナトリウムを介して乾燥させた。残留物をさらに蒸発により乾燥させると、淡褐色の固形物0.85gを得た。この生成物は、精製せずにさらに使用した。
[00100](S)−N−Boc−イソプロテレノールジベンゾイレート
[00101]DCM(10mL)中の(S)−N−Boc−イソプロテレノール(0.85g、2.7mmol)及びトリエチルアミン(0.89mL、6.4mmol)の混合物に、塩化ベンゾイル(0.63mL、5.4mmol)を、窒素下にて0℃で10分かけて液滴として加え、室温で2時間撹拌した。生成物をDCM(3×50mL)で抽出し、水(3×50mL)及び鹹水(50mL)で洗浄してから、無水の硫酸ナトリウムを介して乾燥させた。その結果得られた溶液を蒸発により乾燥させると、白色の結晶としての(S)−N−Boc−イソプロテレノールジベンゾイレート(1.43g)を得た。
[00102](S)−イソプロテレノールジベンゾイレート
[00103]イソプロパノール(10mL)中の(S)−N−Boc−イソプロテレノールジベンゾイレート(1.43g)の溶液に、塩化アセチル(2.01mL、28mmol)を0℃で加え、室温で1.5時間撹拌した。溶媒を除去した後、HPDC(0.1%TFA/H2O、トリフルオロ酢酸セチルピリジニウム4g/Lを溶出剤として)により、所望の(S)−イソプロテレノールジベンゾイレートを精製すると、806mg(全収率64%)を得た。
[00104]C25H26NO5Cl、白色の固形物、Rt=6.3分(A系)。HRMS:[C25H25NO5+H+]の計算値=420.1811、実測値=420.1815。NMR:1H NMR(CD3OD):δ 8.03(m,4H)、7.63(m,2H)、7.60(d,J=6.6Hz,1H)、7.49(d,J=7.8Hz,1H)、7.49(brs,1H)、7.44(m,4H)、5.14(dd,J=3,10Hz,1H)、3.53(m,1H)、3.33(dd,J=16.6Hz,1H)、3.21(dd,J=10,12Hz,1H)、1.41(d,J=6.7Hz,6H)。
[00105](S)−イソプロテレノールジトルオイレート(プロドラッグ)の合成:
[00106](S)−N−Boc−イソプロテレノール
[00107]DMF15mL中の(S)−イソプロテレノールビタルトレート(1.0g、3mmol)の溶液に、トリエチルアミン(1.25mL、9mmol)及びBoc2O(0.67g、3mmol)を室温で加えた。この混合物を勢いよく一晩撹拌し、HPLCにより反応をモニターした。(S)−N−Boc−イソプロテレノールをDCM(3×50mL)で抽出し、水(3×50mL)及び鹹水(50mL)で洗浄してから、無水の硫酸ナトリウムを介して乾燥させた。乾燥するまで溶媒を蒸発させると、淡褐色の固形物0.91gを得た。
[00108](S)−N−Boc−イソプロテレノールジトルオイレート
[00109]DCM(10mL)中の(S)−N−Boc−イソプロテレノール(0.91g、2.9mmol)とトリエチルアミン(0.94mL、6.8mmol)との混合物に塩化トルオイル(0.77mL、5.4mmol)を窒素下にて0℃で10分かけて液滴として加え、室温で2時間撹拌した。生成物をDCM(3×50mL)で抽出し、水(3×50mL)及び鹹水(50mL)で洗浄してから、無水の硫酸ナトリウムを介して乾燥させた。この溶液を蒸発により乾燥させると、白色の結晶としての(S)−N−Boc−イソプロテレノールジトルオイレート(1.52g)を得た。
[00110](S)−イソプロテレノールジトルオイレート
[00111]イソプロパノール(10mL)中の(S)−N−Boc−イソプロテレノールジトルオイレート(1.52g)の溶液に、塩化アセチル(2.04mL、28mmol)を0℃で加え、室温で1.5時間撹拌した。溶媒を除去した後、HPDC(0.1%TFA/H2O、トリフルオロ酢酸セチルピリジニウム4g/Lを溶出剤として)により所望の(S)−イソプロテレノールジトルオイレートを精製すると、715mg(全収率55%)を得た。
[00112]C27H30NO5Cl、白色の固形物、Rt=6.8分(A系)。HRMS:[C27H29NO5+H+]の計算値=448.2124、実測値=448.2109。NMR:1H NMR(CD3OD):δ 7.89(d,J=8Hz,4H)、7.53(d,J=8Hz,1H)、7.50(d,J=8Hz,1H)、7.45(brs,1H)、7.24(d,J=7Hz,4H)、5.06(dd,J=3,10Hz,1H)、3.49(m,1H)、3.31(dd,J=10Hz,1H)、3.19(dd,J=10,13Hz,1H)、2.38(s,6H)、1.38(d,J=7Hz,6H)。
[00113]イソエタリンジピバレートヒドロクロリド(プロドラッグ)の合成:
[00114]アセトン(25mL)中のメシル酸イソエタリン(1.68g、5mmol)の溶液に、1.0N NaOH(25mL、25mmol)を室温で加え、10秒間撹拌してから、塩化ピバロイル(2.47mL、20mmol)を一度に加えた。この反応溶液をさらに15秒間撹拌してから、1.0N HCl(20mL)を用いて反応停止させた。生成物をDCM(3×100mL)で抽出し、10%炭酸水素ナトリウム(100mL)及び鹹水(50mL)で洗浄し、無水の硫酸ナトリウムを介して乾燥させ、濾過してから真空中で濃縮した。HPDC(0.1%TFA/水、トリフルオロ酢酸セチルピリジニウム4g/Lを溶出剤として)により未精製の生成物を精製すると、白色の固形物(1.0g、収率45%)を得た。
[00115]C23H38NO5Cl、白色の固形物、Rt=6.6分(A系)。HRMS:[C23H37NO5+H+]の計算値=408.2750、実測値=408.2732。ESI−MS/MS(CE=15):m/z(相対強度 %):408(M+H+,100)、390(16)、348(0.8)、306(2.3)。NMR:1H NMR(500MHz,CD3OD):δ 7.39(dd,J=2,9Hz,1H)、7.32(d,J=2Hz,1H)、7.21(d,J=9Hz,1H)、5.17(d,J=4Hz,1H)、3.60(七重線,J=6Hz,1H)、3.42(m,1H)、1.69(m,1H)、1.59(m,1H)、1.44(s,3H)、1.43(s,3H)、1.36(s,9H)、1.35(s,9H)、0.87(t,J=7Hz,3H)。
[00116]Waters製の分析用HPLCシステム(600−MSコントローラー、600Eポンプ、717自動サンプラー、996フォトダイオードアレイ検出器)により、(S)−イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドの純度を調べた。別のWaters製HPLCシステム(600コントローラー、600Eポンプ、717自動サンプラー及び2996フォトダイオードアレイ検出器)を用いることにより、(S)−イソプロテレノールビタルトレート及び(S)−イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドの光学純度を調べた。後者のシステムを用いることにより、高性能置換クロマトグラフィー(HPDC)も実施した。Bruker Avance 500MHz NMRにより、NMRスペクトルを測定した。MicroMass Waters Q−Tofウルティマ(Ultima)(商標)グローバル(GLOBAL)質量分光計(Mississauga、Ont、カナダ)をNanoLockspray(対照化合物としての[Glu1]−フィブリノペプチドB)と共に用いて、高分解能質量スペクトルを測定した。
[00117]Cedarlane Laboratories(Burlington、カナダ)からHUVECsを購入し、EGM−2成長因子混合物(Clonetics)及び2%ウシ胎児血清を添加した内皮細胞基本培地−2(EBM−2)中で維持した。この細胞を、空気とCO2との95%/5%(v/v)の加湿した混合気体下にて37℃で培養した。
[00118]BD マトリゲル(商標)(Becton,Dickinson)を用いて、マトリゲル内皮細胞管形成アッセイを実施した。BD マトリゲル(商標)を4℃で解凍し、150μLを48ウエルプレートの各ウエルに速やかに加えてから、37℃で60分間凝固させた。EC基本培地−2(EBM−2)中のHUVECs(7×104細胞/mL)を、テスト対象の化合物が存在する条件の固形のBD マトリゲル(商標)の表面上に、1ウエル当り250μL播種した。細胞を5%CO2インキュベーター中に入れて37℃で22時間インキュベートした。Leitz Labovert(Leitz、Wetzlar、ドイツ)製の倒立顕微鏡を用いることにより、管形成をモニターした。無作為に選んだ顕微鏡視野2箇所をデジタルカメラ(Nikon、COOLPICKS995)で撮影した。各写真に写っている管構造の全長を、フリーソフトウェアのイメージJ(商標)(http://rsb.info.nih.gov/ij/)を用いて測定し、テスト化合物を含まない対照の測定値を用いて正規化した。報告する各値は、3つの独立した実験から得た合計6枚の写真の平均を表すものである。
[00119]BDバイオコート(BioCoat)(商標)成長因子低減マトリゲル(商標)浸潤チャンバー(Beckton−Dickinson、孔径8mm)を用いて、内皮細胞の浸潤を測定した。EBM−2培地(各500μL)を下の方のウエル中に置いた。EBM−2無血清培地(500μL)中のHUVECs(2.5×104)を上の方のウエルそれぞれの中に播種し、テスト化合物の存在下でインキュベートした。空気95%/CO2 5%の雰囲気中にて37℃で36時間、HUVECsを遊走させた。フィルターの上表面上に残ったHUVECsを、綿のスワブを用いて除去した。フィルターの下表面に遊走していたHUVECsを、メタノールで固定し、0.1%クリスタルバイオレット/20%(v/v)メタノールで染色してからスライド上に載せた後で、Leitz Labovert(Leitz、Wetzlar、ドイツ)製の倒立顕微鏡を用いて調べた。無作為に選んだ顕微鏡視野3箇所を、Nikon製のクールピクス(COOLPICKS)(商標)995デジタルカメラを用いてデジタル画像としてとらえ、各写真に写っているHUVECsの数を直接数えた。報告する各値は、2つの独立した実験から得た合計4枚の写真の平均及び標準偏差を表すものである。
[00120]動物試験において使用する(S)−イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドを、(S)−イソプロテレノールビタルトレートから合成した。塩化ピバロイル(塩化トリメチルアセチル)(4.1mmol、500mL)を、50% 1.0N NaOH水溶液/アセトン(5.5ml/5.5mL)中の(S)−イソプロテレノールビタルトレート(1.0mmol、361.3mg)の溶液に加えた。この混合物を室温で1時間反応させた。1.0N HClを用いて、この溶液をpH3〜5に酸性化した。n−ヘキサン(Fisher、Nepean、Ontario、カナダ)で洗浄した後、この溶液をDCMで抽出した。有機層を、10%Na2CO3水溶液で洗浄し、無水の硫酸ナトリウムを介して乾燥させてから、減圧下で濃縮した。高性能置換クロマトグラフィー(カラムは、Shiseidoカプセル(Capcell)(商標)パック(PAK)C18 AQ 5μm、250×4.6mm、4.0mg/mLの酢酸セチルピリジニウムの水中0.1%酢酸溶液、流速1.0mL/分)により残留物を精製した。この生成物を、置換剤である、4.0mg/mlの酢酸セチルピリジニウムの水中0.1%酢酸溶液により外に溶出させた。0.1N HClを用いて塩を交換させ凍結乾燥させた後、収率32±4%、及び以下に記載の不純物の定量化に基づく純度97.2±0.7%で、(S)−イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドを得た。
[00121]C21H34NO5Cl、白色の固形物、Rt=6.6分(A系)。HRMS:[C21H33NO5+H+]の計算値=380.2437、実測値=380.2426。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ 7.33(dd,7.2,1.9Hz,1H)、7.24(d,1.9Hz,1H)、7.15(d,7.2Hz,1H)、4.96(dd,9.9,3.1Hz,1H)、3.40(m,1H,)、3.18(dd,12.3,3.1Hz,1H)、3.07(dd,12.62,9.9Hz,1H)、1.32(d,7.0Hz,6H)、1.30(s,9H)、1.29(s,9H)。
[00122](S)−イソプロテレノールビタルトレート及び(S)−イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドの光学異性体を、Shiseido製のキラルCD−Phカラム(250×4.6mm、5μm、均一濃度の60:40の0.5M過塩素酸ナトリウム/水及びアセトニトリル、流速1.0mL/分)を用いたHPLCにより分離した。イソプロテレノールビタルトレートについては223nm、イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドについては264nmでの吸収により、溶出プロファイルをモニターした。イソプロテレノールビタルトレートについては223nm、イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドについては264nmでの吸光度により、及び、カーブフィッティングソフトウェアのTABLECurve2D(Systat)を用いることにより、光学的不純物を定量化した。(R)−イソプロテレノールビタルトレート及び(R)−イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドの不純物を、それぞれ、2.0±0.3%及び3.3±0.2%と推定した。したがって、合成及び精製の間に引き起こされたラセミ化は、生じたとしても最低限であった。
[00123]in vitro試験で使用する(S)−イソプロテレノールヒドロクロリド及び(S)−イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドの光学純度は、99.9%以上である。
[00124]in vivo試験:(S)−イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドは、ラットモデルにおける糖尿病性網膜症を試験するために使用した。アドレナリンの別の利点は製剤であり、すなわち、市販の点眼剤であるジピベフリンは(R,S)−アドレナリンのプロドラッグである。ジピベフリンはアドレナリンより親油性が高く、さらに、点眼剤溶液中で水に溶解し安定である。アドレナリンは角膜を通過する際に放出され、保護基の切断型であるピバリン酸は、高用量の経口投与の場合でも安全域が広い。ジピベフリンは、アドレナリンより17倍良好に眼の吸収を高めるため、1回用量の量及び副作用の可能性を減少させることが可能になる(Mandellら、1978)。同様の製剤のプロドラッグは、イソプロテレノールに首尾よく適用された(Hussain&Truelove、1975)。そのため、製剤した(S)−イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドがラットモデルの糖尿病性網膜症に及ぼす影響を調べた。
[00125]点眼剤中の活性成分は(S)−イソプロテレノールジピバレートヒドロクロリドが0.10%(w/v)であり、不活性成分は、D−マンニトールが1.84%(w/v)、エデト酸二ナトリウムが0.005%(w/v)、クロロブタノールが0.10%(w/v)、ε−アミノカプロン酸が0.16%(w/v)、塩化ナトリウムが0.5%(w/v)、塩化ベンザルコニウムが0.003%(w/v)、及びポビドンが0.20%(w/v)である。点眼剤のpHは、1.0N HClを用いて5.5に調節した。対照点眼剤は同様の不活性成分を有するが、活性成分を欠く。この点眼薬を毎月新たに調製し、4℃で保管した。4℃で1カ月の保管後、成分のHPLCプロファイルによれば、活性/不活性勾配の崩壊は検出されなかった。各点眼剤の体積は50μLであった。
[00126]ラットモデルを用い、(S)−イソプロテレノールジピバレート点眼剤による糖尿病性網膜症の予防について試験した。生後2カ月のオスのSprague−DawleyラットをCharles River、カナダから購入した。このラットを、Biotechnology Research Institute(BRI)の動物施設に収容した。収容設備及び全ての実験的操作は、Canadian Council of Animal Careのガイドラインの下に機能するBRI Animal Care Committeeにより承認された。体重およそ200から250gのオスのSprague−Dawleyラットにおいて、体重1kg当り、0.1Mクエン酸緩衝液(pH4.5)中60mgの用量で、β細胞毒のストレプトゾトシン(STZ)(Sigma、St.Louis、MI)の単回の腹腔内注射により糖尿病を誘発させた。非糖尿病の対照ラットには、クエン酸緩衝液のみを投与した。
[00127]糖尿病誘発の1週間後、血糖モニタリングシステム(Ascensia ELITE Blood Glucose Meter、Bayer Inc、Toronto、ON、カナダ)を用い、尾静脈から採取した血液中の血糖値を定量した。血糖計の検出限度が33mMであったため、それを超える値は全て、最大値の35mMとした。血糖値が15mMを超える動物のみを試験に留めた。そのようにして、動物を、I群(nはおよそ20):非糖尿病ラット、ビヒクル投与;II群(nはおよそ20):非糖尿病ラット、(S)−イソプロテレノールジピバレートを含有する点眼剤投与;III群(nはおよそ20):糖尿病ラット、ビヒクル投与;IV群(nはおよそ20):糖尿病ラット、(S)−イソプロテレノールジピバレートを含有する点眼剤投与の4群の1つに割り当てた。
[00128]点眼剤又はビヒクルは、1日2回、1週間に7日、2回の処置間に最低7時間の間隔をあけて、異なるラット群の角膜上に投与した。体重増加を促進し高血糖を制限するために、糖尿病ラットに2IUのウルトラレンテインスリン(Humulin、Eli Lilly、Toronto、ON、カナダ)を1週間に3回、皮下注射した。動物の体重を毎週モニターした。
[00129]レクチンに対する抗体で網膜毛細血管を染色することにより、(S)−イソプロテレノールが糖尿病性網膜症に及ぼす影響を試験した。ヒトの眼の黄斑に相当する網膜の中心部での毛細血管密度を分析した。
[00130]糖尿病は、網膜において糖化を誘発する。(S)−イソプロテレノールは強力な糖化阻害剤であるため、(S)−イソプロテレノールが浸透すると、糖尿病の網膜毛細血管中の糖化が低減する。そのことから、レクチンに対する抗体で染色した網膜を、糖化したウシ血清アルブミンに対する抗体でも染色して、網膜毛細血管の糖化の程度を分析した。
[00131]結果:
[00132]マトリゲルアッセイにおいてHUVECsの毛細血管形成を阻害することにより、カテコールアミン及び関連化合物の血管新生阻害活性を測定した(図1)。図1において使用した血管新生アッセイの条件下では、(S)−イソプロテレノールの効力は10μM近辺である。ドパミンは、同じアッセイにおいて同程度の効力を示し(図2A)、1μMで有効な血管新生阻害活性を示した(Basuら、2001)ことから、(S)−イソプロテレノールのin vivoでの効力は10μM未満と考え得る。
[00133]本発明のいくつかの血管新生阻害剤の血管新生阻害性を表1Aに掲載する。表1Bには、ドパミン、公知の血管新生阻害化合物、及び血管新生阻害効果を示さないいくつかのカテコールアミンを掲載する。図2Aは、これらの化合物の血管新生阻害性を定量的に表したものであり、図2Bは、分析において使用した写真のうちの数枚である。
[00134]ドパミンは、ドパミンD2受容体を介した血管新生阻害剤であり(Basuら、2001)、一方、(R)−アドレナリン(カテコールアミン系の化合物に属する)は、β2−アドレナリン作動性受容体を介して血管を新生する(Thakeら、2006)。構造上はドパミンと類似している(S)−ノルアドレナリンが血管新生阻害性でないのに対し、(S)−ノルアドレナリンと比較してドパミンとの類似性は低い(S)−イソプロテレノールが血管新生阻害性であるということは、驚くべき、且つ、予想外のことであった。そのうえ、類似性のさらに低い(R,S)−N−tert−ブチルノルアドレナリンは、(R)−N−tert−ブチルノルアドレナリンがβ2−アドレナリン作動性受容体作動薬であるにもかかわらず、血管新生阻害性であった(Walkerら、1985)。結果的に、表1Aに掲載した化合物の血管新生阻害活性は、予想外のものである。
[00135](R)−イソプロテレノールは、血管新生性であることが知られており、ラセミ混合物(R,S)−イソプロテレノールは血管新生阻害活性を示さなかったことから、(S)−イソプロテレノールの血管新生阻害活性と競合している。そのことから、血管新生阻害活性を発現するために必要な(S)−イソプロテレノールの光学純度を、多様な光学純度の(S)−イソプロテレノールを用いて調べた(図3)。(S)−イソプロテレノールの光学純度が97重量%以上である場合には血管新生阻害活性が観察されたが、光学的な純粋性が95重量%の(S)−イソプロテレノールは、血管新生阻害性ではない状態から血管新生阻害性への移行途中であった。したがって、光学純度が少なくとも97重量%の(S)−イソプロテレノールが好ましく、より好ましくは少なくとも99.9重量%、さらにより好ましくは少なくとも99.99重量%であるが、その理由は、標的組織中のβ2−アドレナリン作動性受容体のin vivoでの発現率は、アッセイにおいて使用したHUVECsにおける発現率より高い可能性があるからであり、そのため、薬物中の(R)−イソプロテレノールのさらなる排除が必要となる。
[00136]表1A及び1Bに掲載したいくつかの(S)−アドレナリンは、(S)−ノルアドレナリン、(R,S)−アドレナリン、(S)−N−エチルノルアドレナリン、(S)−N−プロピルノルアドレナリン、(S)−N−ブチルノルアドレナリン、(R,S)−N−tert−ブチルノルアドレナリン(Colterol)及びイソエタリンである。親油性が最も低い(S)−ノルアドレナリンは血管新生阻害性ではなかったが、より親油性の高い(S)−N−エチルノルアドレナリン、(S)−N−プロピルノルアドレナリン、(S)−イソプロテレノール、(S)−N−ブチルノルアドレナリンは、血管新生阻害活性を示した。ラセミ混合物においては、比較的親油性の(R,S)−アドレナリン及び(R,S)−イソプロテレノールは、血管新生阻害活性を示さなかった。しかしながら、より親油性の高い(R,S)−N−tert−ブチルノルアドレナリン及びイソエタリンは、血管新生阻害活性を示した。これらのアドレナリンの(R)−アイソフォームは、それらのβ2−アドレナリン作動性受容体作動薬の活性により血管を新生するため、これらのアドレナリンの(S)−アイソフォームの血管新生阻害活性は、それらの親油性が増すにつれて高まると考え得る。本発明において有用な他のいくつかの(S)−アドレナリンの例を図7に掲載する。
[00137](S)−イソプロテレノール及びその類似体が糖化阻害剤であり(Yeboahら、2005)、それらは血管新生阻害性であると本発明者らが今回見出したことから、糖化及び血管新生が両方とも、疾患、例えば糖尿病性網膜症の一因となっている場合には、これらの活性は相乗効果を示すと考えられる。そのような用途の場合は、糖化阻害活性及び血管新生阻害活性は有するがアドレナリン作動活性をもたない化合物及びそのプロドラッグが好ましい。より具体的には、(S)−イソプロテレノール及びそのプロドラッグがとりわけ興味深い。図9に掲載した数種のプロドラッグは、(S)−N−エチルアドレナリンジピバレート、(S)−N−プロピルノルアドレナリンジピバレート、(S)−N−n−ブチルノルアドレナリンジピバレート、(S)−イソプロテレノールジピバレート、(S)−イソプロテレノールジイソブチレート、(S)−イソプロテレノールジベンゾイレート、(S)−イソプロテレノールジトルオイレート及びイソエタリンジピバレートである。数種のプロドラッグについて血管新生阻害活性を測定した結果、図10に示すとおり、血管新生阻害活性は全くないか、又は弱かった。数種のプロドラッグの一部は、22時間のインキュベーション期間中に加水分解されて血管新生阻害性の(S)−イソプロテレノールになる可能性があることを考えると、図11のプロドラッグは、血管新生阻害性がないか、又は非常に弱い血管新生阻害剤である可能性がある。
[00138]腫瘍細胞浸潤は、腫瘍が1つの組織から他の組織へ遊走する、癌発生の後期段階に含まれる過程である。本発明は、腫瘍細胞浸潤を予防する、(S)−イソプロテレノールの新規の活性を提供する。図3は、(S)−イソプロテレノール(20μM)がマトリゲル中のHUVECsの浸潤を60%低減させたことを示すものである。対照的に、その光学異性体である(R)−イソプロテレノールは、浸潤阻害活性を一切示さなかった。血管新生阻害活性と共に、(S)−イソプロテレノールは、腫瘍転移を治療するための二重の活性を有する。
[00139]本発明は、成分の血管新生阻害活性がβ2−アドレナリン作動性の作動薬要素(複数も)の血管新生活性を上回り、β2−アドレナリン作動活性が本発明の治療効果を妨げず、アドレナリン作動性の有害作用をもたらさないということでない限り、(R)−イソプロテレノールなどβ2−アドレナリン作動性の作動薬活性を有する化合物の使用を除外するが、それは、β2−アドレナリン作動性の作動薬が血管新生性だからである(Thakerら、2006)。
[00140]本発明は、芳香族ヒドロキシル基(複数も)が修飾されている(S)−イソプロテレノール及びその類似体のプロドラッグの使用を含む。このプロドラッグは、親油性が高いため、組織への吸収及び浸透を向上及び加速させると考えられる。さらに、このプロドラッグは、保管中の酸化などの化学反応から芳香族ヒドロキシル基(複数も)を保護もする。さらに、このプロドラッグは、対応する薬物と比較した場合、紫外光感受性が低い。
[00141]血管新生阻害活性のため、又、アドレナリン作動性の有害作用を最小化するために高い光学純度が望ましい場合には、プロドラッグは、保管中のラセミ化を低減させる。表2には、多様な点眼製剤中において55℃で10日間インキュベーションした後の(S)−イソプロテレノール及び(S)−イソプロテレノールジピバレートの光学純度を記載し、インキュベーション前のものと比較してある。55℃で10日間のインキュベーションは、22℃で167日間のインキュベーションに相当する。
[00142]55℃で10日インキュベートした後の(S)−イソプロテレノールの平均光学純度は97.35±0.52%であり、結果として、(S)−イソプロテレノールの2.55%が(R)−イソプロテレノールに変換したことになる。このことは、室温での655日の保管後に、(S)−イソプロテレノールの光学純度が99.90%から90%に低下したことに相当する。これに反し、55℃で10日インキュベートした後の(S)−イソプロテレノールジピバレートの平均光学純度はおよそ99.85±0.08%であり、結果として、(S)−イソプロテレノールジピバレートの0.02%が、対応する(R)−アイソフォームに変換したことになる。このことは、(S)−イソプロテレノールジピバレートの光学純度は、室温で2年保管した後は、99.87%から99.78%に低下することを示唆するものである。(S)−イソプロテレノールの高い光学純度は、血管新生阻害活性にとって非常に望ましいことから、プロドラッグ製剤が好ましい。プロドラッグ製剤は、ピバレートエステルに限定されない。芳香族ヒドロキシル基の保護基の例をいくつか図8に掲載する。
[00143]ストレプトゾトシンを用いて、ラットにおいて糖尿病を誘発させた。非糖尿病ラット及び糖尿病ラットについて、1週間に1回、27週の期間にわたり血糖値をモニターした。対照である非糖尿病動物(黒菱形)のI群(ビヒクル投与)及びII群(プロドラッグ投与)は、それぞれ、5.1±0.4mM及び5.1±0.4mMの一定した血糖値を有する。III群(ビヒクル投与)及びIV群(プロドラッグ投与)の糖尿病ラットについては、糖尿病誘発の最初の2週間の間に血糖値の上昇が認められた。その後、血糖値は、それぞれ、28±4mM及び27±5mMで安定した。5mM前後の血糖値を正常とみなすことから、I群及びII群のラットは非糖尿病である。血糖値が15mMを超える場合は、ラットを糖尿病とみなす。したがって、III群及びIV群のラットは全て糖尿病である。I群とII群との間、及びIII群とIV群との間の血糖値が一致していることから、(S)−イソプロテレノールは血糖値及び糖尿病に影響しないことが示される。
[00144](S)−イソプロテレノールが体重の減少/増加に及ぼす可能性がある別の有害作用をモニターした。実験期間中の体重増加は、図5AのI群(ビヒクル投与の非糖尿病ラット)と図5BのII群(プロドラッグ投与の非糖尿病ラット)との間で本質的に同じであり、このことから、非糖尿病ラットの体重の増加/減少において(S)−イソプロテレノールの影響はないことが示唆される。体重増加は、非糖尿病ラットの場合と比較して糖尿病ラットにおいてはるかに少ない(Chenら、2004)が、図5AのIII群(ビヒクル投与の糖尿病ラット)の体重増加は、図5BのIV群(プロドラッグ投与の糖尿病ラット)の場合と本質的に同じであり、このことから、糖尿病ラットの体重の増加/減少において(S)−イソプロテレノールの影響はないことが示される。
[00145]ラットは、血管新生阻害性を直接試験するのに適切なモデル生物ではないが、薬物が眼の網膜に浸透する能力を試験するにはラットを使用し得る。(S)−イソプロテレノールが強力な糖化阻害剤であることは公知である(Yeboahら、2005)。(S)−イソプロテレノールジピバレート点眼剤を用いて網膜糖化を阻害することにより、網膜中に(S)−イソプロテレノールが送達されることを実証した。糖化したウシ血清アルブミンに対する抗体は、糖化した網膜タンパク質を赤色蛍光に染色した。上述の糖化阻害抗体の赤色蛍光を抗レクチン抗体の緑色蛍光と重ねることにより網膜毛細血管の糖化を評価した結果、糖化度の低い健康な網膜毛細血管は緑色から明るいオレンジ色の蛍光に、又、高度に糖化した網膜毛細血管は赤色蛍光になった。糖化の度合いの最も低い非糖尿病ラットの眼の網膜毛細血管は、緑色から明るいオレンジ色の蛍光を示した。(S)−イソプロテレノールジピバレートを投与した糖尿病ラットの眼では、同様の健康な毛細血管が観察された。ビヒクルを投与した糖尿病ラットの眼の網膜毛細血管は赤色蛍光に染色され、又、少なめの数の毛細血管が染色されたことから、網膜毛細血管は損傷を受けてもいた。図6は、網膜毛細血管の密度によりAGEの赤色蛍光の強さを正規化することにより効果を定量化したもので、結果は、非糖尿病ラット、(S)−イソプロテレノールジピバレート治療を施した糖尿病ラット及びビヒクル投与の糖尿病ラットについて、それぞれ、0.43±0.15、0.44±0.17及び0.76±0.14であった。P値は、非糖尿病ラット対ビヒクル投与の糖尿病ラット、(S)−イソプロテレノールジピバレート投与の糖尿病ラット対ビヒクル投与の糖尿病ラット、及び非糖尿病ラット対(S)−イソプロテレノールジピバレート投与の糖尿病ラットについて、それぞれ、0.052、0.068及び0.971である。ビヒクルを投与した糖尿病の網膜に豊富な無細胞の毛細血管は高度に糖化されると予想されるため、ビヒクル投与の糖尿病ラットについての糖化度は図6における0.76±0.14より高いと考えられ、したがって、(S)−イソプロテレノールジピバレートは(S)−イソプロテレノールを網膜中に有効に送達し、網膜毛細血管における糖化を顕著に低減させたことが実証される、という点に注目すべきである。(S)−イソプロテレノールは、その血管新生阻害効果を発揮できる眼の網膜に有効に送達できるため、この物質は、糖尿病性網膜症の治療及び/又は予防において有用と予想される。
[00146]好ましい一実施形態では、本発明は、血管新生及び/又は浸潤に関する疾患を予防及び/又は治療するための、イソプロテレノールの(S)−アイソフォーム及びその類似体の新規の使用を提供する。これらの化合物は、本出願にとって重要ないくつかの規準を満たす。まず、(S)−イソプロテレノール及びその類似体の血管新生阻害活性が高いことである。細胞レベルでの血管新生阻害活性は、1mM以下、好ましくは100μM以下、より好ましくは20μM以下で観察できなくてはならない。2番目に、(R)−アイソフォームの特徴であるアドレナリン作動活性が(S)−アイソフォームに対して意味をもたないことである。アドレナリンの(S)−アイソフォームのアドレナリン作動活性は、対応する(R)−アイソフォームのものよりはるかに低い(Patilら、1974)。とりわけ、最大20%の(S)−イソプロテレノールヒドロクロリドを局所投与しても、ヒトの眼における眼内圧低下の兆候は一切示されなかった(Kassら、1976)。
[00147]イソプロテレノールの(S)−アイソフォーム及びその類似体は、アドレナリン作動性としては不活性で、局所投与及び全身投与用として安全であると考えられる。アドレナリン作動性の作動薬の最も多い市販薬はラセミ混合物であるという証拠は、(S)−異性体が不活性であることについての強い実際上の理由となる(Boulton&Fawcett、2002)。本発明の好ましい一実施形態による調製物は、アドレナリン作動性受容体を刺激することによる有害作用の可能性を低減させるため、イソプロテレノールの(S)−アイソフォーム及びその類似体のみを含有する。
[00148]イソプロテレノールは、1日2回投与など無理のない頻度の投与に向く、十分長い持続時間を有することが公知であり、例えば、2.47%の(R,S)−イソプロテレノールを正常なヒトの眼に滴下すると眼圧が20%低下することが観察され、それが少なくとも12時間続いた(Ross&Drance、1970)。
[00149](S)−イソプロテレノールは、一旦血液循環系中に入ると代謝されて3−メチル−(S)−イソプロテレノールとなり、その血漿の半減期は3.0から4.1分の範囲であり(Conwayら、1968)、(S)−イソプロテレノールの一切の全身有害作用の可能性は最小限である。
[00150]参考文献:これを参照することにより、各文献の全体の内容が組み込まれる。
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[00151]この構造に固有の他の利点は、当業者には自明である。実施形態は、例証として本明細書に記載するものであり、特許請求する本発明の範囲を限定することを意図したものではない。前述の実施形態の変形は当業者には明白であり、本発明者は、以下の特許請求の範囲によりこれらが包含されることを意図するものである。
Claims (24)
- 血管新生阻害剤としての、血管新生阻害に有効な量の式(I)
の化合物、その生理学的に許容される塩、そのプロドラッグ、生理的に機能するその誘導体又はその任意の混合物の使用であって、
前記血管新生阻害剤の親油性が(S)−ノルアドレナリンより高く、式中、
R1及びR7はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、若しくは脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すか、又はR1及びR7は結合してC3−7窒素含有複素環を形成し、
R2及びR’2はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基若しくはCOOHを表すか、又はR2若しくはR’2の一方がR1と結合してC3−7窒素含有複素環を形成し、
R3は、OR8、SR8又はNR8R9を表し(式中、R8及びR9はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、又は脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すが、但し、R8及びR9が両方ともアシル基であることはない)、
R4及びR5はそれぞれ独立に、OY、NHY又はSYを表し(式中、Yは
を表す(式中、R11及びR12はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基又はC3−10シクロアルキル基を表す))、
R6a、R6b及びR6cはそれぞれ独立に、H、F、Cl、Br、I、OR10又はSR10を表し(式中、R10は、脂肪族酸又は芳香族酸由来のC1−10アシル基を表す)、
(S)は、前記化合物の(S)立体配置を規定するキラル中心を表し、
C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、C1−10アシル基、C3−8窒素含有複素環基は、それぞれ独立に、1個又は複数のヘテロ原子N、O又はSを含み又は含まず、独立に、1つ又は複数のC6−10アリール基、C6−18アルカリール基又はC6−18アラルキル基で置換されておらず又は置換されており、
但し、R2及びR’2が両方ともHである場合は、R1及びR7が両方ともHであることはない、使用。 - 前記化合物の光学純度が95%以上である、請求項1に記載の使用。
- 前記化合物の光学純度が97%以上である、請求項1に記載の使用。
- 前記化合物の光学純度が99%以上である、請求項1に記載の使用。
- R3がOR8を表す、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- R8がHを表す、請求項5に記載の使用。
- 血管新生阻害剤としての、血管新生阻害に有効な量の式(II)
の化合物、その生理学的に許容される塩、そのプロドラッグ、生理的に機能するその誘導体又はその任意の混合物の使用であって、
式中、
R1及びR7はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、若しくは脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すか、又はR1及びR7は結合してC3−7窒素含有複素環を形成し、
R2及びR’2はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基若しくはCOOHを表すか、又はR2若しくはR’2の一方がR1と結合してC3−7窒素含有複素環を形成し、
R13は、OR18、SR18又はNR18R19を表し(式中、R18及びR19はそれぞれ独立に、C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、又は脂肪族酸若しくは芳香族酸由来のC1−10アシル基を表すが、但し、R18及びR19が両方ともアシル基であることはない)、
R4及びR5はそれぞれ独立に、OY、NHY又はSYを表し(式中、Yは
を表す(式中、R11及びR12はそれぞれ独立に、H、C1−10アルキル基又はC3−10シクロアルキル基を表す))、
R6a、R6b及びR6cはそれぞれ独立に、H、F、Cl、Br、I、OR10又はSR10を表し(式中、R10は、脂肪族酸又は芳香族酸由来のC1−10アシル基を表す)、
C1−10アルキル基、C3−10シクロアルキル基、C1−10アシル基、C3−8窒素含有複素環基は、それぞれ独立に、1個又は複数のヘテロ原子N、O又はSを含み又は含まず、独立に、1つ又は複数のC6−10アリール基、C6−18アルカリール基又はC6−18アラルキル基で置換されておらず又は置換されている、使用。 - R13がOR18を表す、請求項7に記載の使用。
- R18がC1−10アルキル基を表す、請求項8に記載の使用。
- R18が−CH3を表す、請求項8に記載の使用。
- R7がHを表す、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。
- R1がC1−10アルキル基を表す、請求項1〜11のいずれか一項に記載の使用。
- R2及びR’2が両方ともHを表す、請求項1〜12のいずれか一項に記載の使用。
- R2がHを表し、R’2が−CH2CH3を表す、請求項1〜12のいずれか一項に記載の使用。
- R6a、R6b及びR6cがそれぞれHを表す、請求項1〜14のいずれか一項に記載の使用。
- R4及びR5がそれぞれ独立にOYを表し、各Yが独立に、H、ピバロイル、アセチル、プロピオニル、ブタノイル、イソブタノイル、ペンタノイル、2−ブテノイル、シクロプロパノイル、シクロヘキサノイル、ベンゾイル、4−メチルベンゾイル、4−ニトロベンゾイル、フェナセチル、4−メチルフェナセチル、メトキシアセチル又はN,N−ジメチルアミドを表す、請求項1〜15のいずれか一項に記載の使用。
- R4及びR5がそれぞれOYを表し、各Yがピバロイルを表す、請求項1〜15のいずれか一項に記載の使用。
- R4及びR5がそれぞれOYを表し、各YがHを表す、請求項1〜15のいずれか一項に記載の使用。
- 前記化合物が、(S)−イソプロテレノール、(S)−N−エチルノルアドレナリン、(S)−N−tert−ブチルノルアドレナリン、(S)−N−n−ブチルノルアドレナリン、(S)−N−n−プロピルノルアドレナリン、1−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−2−(イソプロピルアミノ)−1(S)−ブタノール、エリスロ−(D,L)−ドパセリン、デキストロノルデフリン、(S)−ジオキシフェドリン、(S)−ジオキセテドリン又は(S)−ノルブドリンである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 前記化合物が、(S)−4−(ヒドロキシ−2−ピペリジニル−メチル)−1,2−ベンゼンジオール、(S)−ピプラテコール、(S)−アルブタミン、(S)−プロトキロール、(S)−テオドレナリネル、(S、S')−ヘキソプレナリン又は(S)−PTFMAである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 前記化合物が、(S)−イソプロテレノール又は(S)−イソプロテレノールジピバレートである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 前記化合物が1−(N−イソプロピル)−3−メトキシドパミンである、請求項7に記載の使用。
- 前記化合物が、(S)−N−エチルアドレナリンジピバレート、(S)−N−プロピルノルアドレナリンジピバレート、(S)−N−n−ブチルノルアドレナリンジピバレート、(S)−イソプロテレノールジピバレート、(S)−イソプロテレノールジイソブチレート、(S)−イソプロテレノールジベンゾイレート、(S)−イソプロテレノールジトルオイレート又はイソエタリンジピバレートである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 対象における血管新生を治療及び/又は予防する方法であって、血管新生阻害に有効な量の請求項1〜23のいずれか一項に記載の血管新生阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
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