JP2010507383A - 血栓症の処置のための抗糖タンパク質viscfvフラグメント - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、配列番号1で示される、(Gly4Ser)3ペプチドを介して結合された9O12.2モノクローナル抗体のVHおよびVLドメインとそれに続く「c−myc」フラッグからなる、ヒト糖タンパク質VIに対する単鎖可変フラグメント(scFv 9O12.2)に関する。本発明はまた、同一の重鎖および軽鎖相補性決定領域1、2および3を有する前記scFv 9O12.2フラグメントの機能的変異体、好ましくは、配列番号28または配列番号47で示されるヒト化scFvフラグメントなどのヒト化機能的変異体に関する。本発明はまた、このようなscFvフラグメントをコードする核酸、このようなscFvフラグメントを産生するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこのようなscFvフラグメントの治療的使用に関する。
急性冠動脈および脳血管偶発症候は現在、世界の第一の死因である。さらに、急性冠動脈症候群後の処置の6か月後の再発および死亡の全体の罹患率は依然として8〜15%である。STセグメントの上昇を伴う急性冠動脈症候群の場合、冠動脈血管形成術およびステントの導入による機械的処置は冠動脈流を緊急に回復させるのに極めて効果的であるが、その後6か月に患者の15%で罹患/死亡を防ぐことができない。
発明の開示
配列番号2、配列番号3および配列番号4からなるCDR1、CDR2およびCDR3領域を含んでなるVHドメイン、
ペプチドリンカー、および
配列番号5、配列番号6および配列番号7からなるCDR1、CDR2およびCDR3領域を含んでなるVLドメイン
を含んでなる、ヒト糖タンパク質VIに対する単鎖可変フラグメントに関する。
a)上記のような本発明の宿主細胞を培養すること、および
b)該単鎖可変フラグメントを精製すること
を含む方法に関する。
1.1 試験手順
1.1.1 材料
LB(ルリア−ベルターニ)、DIFCO 402−17;LB−寒天、DIFCO 445−17;2xTY(トリプトン−酵母)、DIFCO 244020;TES:Tris−HCl 30mM、EDTA 1mM、スクロース20%、pH8.5;PBS:NaCl 0,14M、KCl 13mM、KH2PO4 9mM、Na2HPO4 50mM、pH7.4;BBS:ホウ酸50mM、NaCl 150mM、pH7.6;アンピシリン、Euromedex EU−0400C;イソプロピル β−D−チオガラクトシド(IPTG)、Euromedex EU0008−B;ウシ血清アルブミン(BSA)、Sigma B4287;FITC結合抗c−myc IgG、Sigma F−2047;デスオキシリボヌクレアーゼA、アプロチニン:Sigma A−6279;HRP結合抗c−myc IgG、Invitrogen R951−25;オルトフェニルジアミン(OPD):Sigma P8787、Trizol:Invitrogen、コラーゲンホルムタイプI(Collagen Horm type I):Nycomed、pGEMTクローニングベクター、Promega。scFv発現にはpSWlプラスミドを用いた。6H8および9C2を無関連のscFvとして用いた。
用いたオリゴデスオキシリボヌクレオチドを次の表2に挙げる:
ヒト血小板を上述のように調製した(9)
「簡単FITC標識血小板プログラム(Simple FITC labelling of platelets program)」フローサイトメーター Coulter Epics XLを用いた
GPVI−セファロースの調製:
scFv 9O12.2の遺伝的構造:
ヒトGPVIに対する免疫グロブリンG(IgG)9O12.2.2を産生する、新たにサブクローニングしたハイブリドーマ9O12.2.2細胞からmRNAを単離した。RT−PCR後、前記抗体可変領域をコードするcDNAをクローニングし、オーバーラップ伸長によるPCRスプライシングによりscFv 9O12.2遺伝子を作出した。scFv 9O12の製造にはpUC 19[pSW Iベクター(37)]から誘導した発現ベクターを用いた。この発現ベクターは、IPTG誘導性LacZプロモーター、pelBリーダー配列と、下流に、フラッグc−mycと融合されたscFv 9O12.2をコードする遺伝子および組換え細菌を選択するのに用いられるアンピシリン耐性遺伝子を含む。
リーダー配列pelBは、組換えscFv 9O12.2を、発現ベクターpSW scFv 9O12.2mycで形質転換した細菌の周縁質に向けることを可能にする。scFv 9O12.2を作製するために、細菌Toppl(登録商標)(非K12、Rif、F’、proAB、lacIqZΔM15、Tn10、tetr)(Stratagene, La Jolla, USA)、コロニー55Tlを用いる。
タンパク質解析を、LaemmliによるSDSの存在下でのポリアクリルアミドスラブゲルでの電気泳動により;タンパク質のニトロセルロースへの転写、HRP結合抗c−myc抗体とのインキュベーションおよび4クロロナフトールを用いた検出後の免疫ブロット法により行った。
精製scFvのMrをマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)質量分析計(Voyager DE-PRO; PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA)で測定する。50%アセトニトリルおよび0.1%TFA中のα−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸飽和溶液をマトリックスとして用い、外部標準ペプチド混合物を用いて分光計を較正する。
精製scFv調製物を、既知分子量の標準を用いて較正したSuperdex 75 HRカラムでのサイズ排除拡散クロマトグラフィーにより分離した。200μLのサンプルを0.5mL/分の速度で注入した。紫外線検出器を用いて226nmで検出をモニタリングする。解析には画分をそのまま用いた。
マイクロタイタープレートをGPVI−Fc(10μg/mL、1ウェルにつき100μL)にて4℃で一晩コーティングする。ウェルを100μL BSAにて室温で2時間飽和させる。次に、これらのウェルに漸増濃度のscFv 9O12を2時間加える。HRP結合抗c−myc−抗体(PBS中1/750)とともに室温で2時間のインキュベーション後、結合したscFvを検出する。その後、これらのウェルに基質溶液(OPD)を5分間加え、492nmで吸光度を読み取る。2つの対照:scFv 9O12.2の代わりに無関連のscFvを用いる第一の対照およびGPVI−Fcでのコーティングを省いた第二の対照を行う。中間工程ごとに0.05% Tweenおよび0.1mg/mL BSAを含有するPBSで5回洗浄を行う。
scFv 9O12.2をヒト化するアプローチはCDRグラフト技術9から適応させた。ネズミ9O12.2抗体のCDRをヒト可変鎖フレームワークにグラフトした。ヒト抗体の選択は次の判定基準を用いて行った:結晶構造が解明されており(pdbライブラリーのIVGE);ヒト抗体IVGEの可変領域が9O12.2の可変領域と高度の配列相同性(VH 60.6%;VL 55.4%)を示し;候補ヒト抗体IVGEと9O12.2の可変領域のモデルとの結晶学的データの構造比較が行われ、それにより本発明者らがヒトアクセプタースキャフォールドIVGEの選択の正当性を立証することが可能であった。この戦略はVHドメインとVLドメインの相互作用の安定性を低下させる危険性を最小限にしながら、CDRの適正な折りたたみに必要なスキャフォールドを保存し、抗原に対して高い親和性を保存する。これらの解析に基づいて選択されたヒト抗体IVGEにより本発明者らはヒト化9O12.2 scFvを構築することができた。ヒト化scFv 9O12.2をコードするヌクレオチド配列には至適化を行った。最初に、最適な結合特性を提供するために調整することができるように、CDR領域間に制限部位を挿入した。さらに、原核生物発現系大腸菌においてヒト化scFvを発現させるために、細菌コドン使用頻度を用いて至適化を行った。
scFv9O12.2(100μg/ml)を漸増濃度の9O12.2 IgGと混合した後、GVI−Fcでコーティングしたマイクロタイトレーションウェルに加えた。結合したscFvを上記のとおり検出した。
コラーゲンとのGPVIの結合に対する抗体の効果:
抗GPVI scFvと組換えGPVI−Fcとの結合をBIAcore 2000システム(Uppsala, Sweden)を用いた表面プラズモン共鳴により解析する。scFv 9O12、タンパク質加水分解Fabおよび親IgGについて結合研究を行う。
洗浄したヒト血小板(2.107/mL)を0〜100μg/mlの精製scFv 9O12とともに室温で30分間インキュベートし、その後、5μLのFITC結合抗c−myc IgG(希釈溶液1:60)とともに暗所にて室温で30分間再びインキュベートする。細胞蛍光をフローサイトメーター(Epics XL、Coulter)を用いて測定する。scFv 9O12.2の代わりに無関連のscFvを用いることによりバックグラウンドを測定する。
洗浄したヒト血小板(3x108/mL)を、PBS、scFv 9O12.2またはFab 9O12.2とともに攪拌せずに37℃で5分間プレインキュベートする。タイプIコラーゲンを加えることによって凝集を開始させ、光透過率の変化を連続記録する(Chronolog社製血小板凝集計)。
フロー条件下でのコラーゲンへの血小板粘着を、基本的には別記のとおり(9)測定した。ガラスカバースリップを繊維状タイプIコラーゲン(50μg・mL−1)でコーティングした。健康なボランティアの血液を40μM PPACKで採取し、DIOC−6(1μM)で標識した。血液アリコートを、バッファーまたは終濃度50μg・mL−1の精製抗体フラグメント(Fab 9O12、mscFv9O12、scFv 9C2)とともに室温で15分間インキュベートした。次に、この混合物を、フローチャンバー内に挿入した、コラーゲンでコーティングしたカバースリップに1500秒−1で5分間散布した。透過率および蛍光画像を蛍光顕微鏡を用いて実時間で記録した。蛍光画像は、散布終了時に任意選択された少なくとも10の異なるコラーゲン含有顕微鏡視野から得られた。蛍光画像の領域カバレージをHistolabソフトウエア(Microvision, Evry, France)を用いてオフラインで解析した。
トロンボグラム法を用いて上述のとおりに(38)多血小板血漿(PRP)中でトロンビン生成を連続測定した。要するに、クエン酸PRP(1.5x108血小板 mL−1)を抗体フラグメントとともに37℃で10分間インキュベートした後、コラーゲンを加えた。10分後、組織因子(0.5pM)の入ったマイクロタイトレーションプレートのウェルにサンプルを入れることによってトロンビン生成を開始させた。37℃で5分後、CaCl2含有バッファーおよび蛍光トロンビン基質Z−GGR−AMC(Stago, Asnieres, France))を加えることによって反応を開始させた。開裂された基質の蛍光蓄積を励起波長および発光波長それぞれ390nmおよび460nmにおいて連続測定した。蛍光蓄積の一次導関数曲線を、トロンビン較正装置を用いてトロンビン濃度曲線に変換した(39)。ピーク高さはトロンビン形成最大速度の指標であり、血小板活性化に影響を受ける。
1.2.1 ネズミ9O12.2 scFv(mscFv 9O12.2)
抗体9O12.2.2 VH cDNAおよびVL cDNAのクローニング
9O12.2はネズミIgG1(κ鎖)である。全RNAを、新たにサブクローニングしたハイブリドーマ細胞 約5.108からTrizolを用いて一段階法により抽出した。このRNA調製物を一本鎖cDNA合成の鋳型として用いた。次に、IgG 9O12.2.2 VHドメインおよびVLドメインをコードする二本鎖cDNAを、プライマーセット(VHRev、VHFor)および(MKRevU、MKC5For)それぞれを用いたPCRにより増幅した。VH cDNA配列はユニークであり、これはpGEMTへのクローニング後のcDNAの配列決定により確認された。VLドメインに対応するPCR産物の配列をスクランブルした。pGEMTへクローニングし、数クローンを配列決定した後、2つのVL配列を同定した。fasta解析を用いたデータ解析により、それらのVL配列の1つが内因性の異常な非機能性Vk mRNA(Gene bank受託番号M35669)を発現するMOPC−21クローンに由来することが分かった。scFv 9O12.2の一部として、もう一方のVL遺伝子およびVH遺伝子のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図2に示している。これらの配列をいくつかのデータバンク(UNIPROT UNIREF100 UNIREF90 UNIREF50 UNIPARC SWISSPROT IPI PRINTS SGT PDB IMGTHLAP, PATENT: epop jpop uspop)(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/)(DNA banks: EMBL, Human, MOUSE, SYNTHETIC, PATENT)に登録された免疫グロブリン可変領域配列と比較した。これにより、本発明者らはVH領域およびVL領域の相補性決定領域に相当する3つのループならびにカノニカル構造に関与するアミノ酸残基を同定することができた。
・CDR−L1:
開始−およそ残基24
前の残基は常にCysである
後の残基は常にTrpである。典型的にはTRP−TYR−GLN、同様に、TRP−LEU−GLN、TRP−PHE−GLN、TRP−TYR−LEU
長さ 10〜17残基
・CDR−L2:
開始−常にL1後16残基
前の残基 一般的にはILE−TYR、同様に、VAL−TYR、ILE−LYS、ILE−PHE
長さ 常に7残基。
・CDR−L3:
開始−常にL2後33残基
前の残基は常にCysである
後の残基 常にPHE−GLY−XXX−GLY
長さ 7〜11残基
・CDR−H1:
開始−およそ残基26(常にCYS後4残基)[Chothia/AbM定義] Kabat定義では5残基後に開始する
前の残基 常にCYS−XXX−XXX−XXX
後の残基 常にTRP。典型的にはTRP−VAL、同様に、TRP−ILE、TRP−ALA
長さ 10〜12残基(AbM定義) Chothia定義では最後の4残基を排除する
・CDR−H2:
開始−常にCDR−H1の後15残基Kabat/AbM定義)
前の残基 典型的にはLEU−GLU−TRP−ILE−GLY、同様に多数の変化物
後の残基 LYS/ARG−LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA−THR/SER/ILE/ALA
長さ Kabat定義 16〜19残基(AbM定義では7残基前に終わる)
・CDR−H3:
開始−常にCDR−H2後33残基(常にCYS後2残基)
前の残基 常にCYS−XXX−XXX(典型的にはCYS−ALA−ARG)
後の残基 常にTRP−GLY−XXX−GLY
長さ 3〜25残基
scFv 9O12.2のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図2に示している。scFvは266アミノ酸長であり、[G4S]3リンカーによって互いに結合されたVHおよびVL配列とそれに続く短いスペーサー(8残基)およびc−mycフラッグ配列(11残基)からなる。
scFvの理論分子量は、ProtParamソフトウエアを用いて決定されるように28393.5である。そのpIは6.92であり、その吸光係数は280nmにおいて49640M−1cm−1である(表3)。
鋳型として用いたネズミ可変領域のPdbファイルは:
VHドメインについては:1PLG:H;1MNU:H;1A5F:H;1IGI:H、
VLドメインについては:1PLG:L;1IGI:L;1MNU:L;1AXT:Lである。
可変領域のモデリングにはModeler 3.0.ソフトウエアを用いた。各ドメインにつき20のモデルを設計し、RMSD値:VH(RMSD:0.13Å);VL(RMSD:0.703Å)に基づいて最適なものを選択した。このモデルを図3に示している。
scFvが予測される抗GPVI活性を有するかどうかを評価するために、周縁質抽出物を、ヒト血小板およびFITC結合抗c−myc IgGを用いて試験した。図4は、9O12.2 scFvの存在下で血小板蛍光が右側へシフトし(40%陽性血小板)、無関連のscFvの存在下ではそれが起こらない(0.17%陽性血小板)ことを示している。さらに、周縁質抽出物を、固定した組換え可溶性GPVIとともにインキュベートしたときには、scFv 9O12.2の結合だけが検出された。これらの結果を合わせて、9O12.2 scFvは抗GPVI特性を保有することが示される。
周縁質抽出物、流出画分およびGPVI−セファロースカラムからの溶出画分中に含まれるタンパク質をSDS−PAGEにより、そしてイムノブロットにより解析した(図5Aおよび5B)。溶出画分は、理論質量に一致する〜28kDaの主要なバンドとして現われる。このバンドは、抗c−myc抗体を用いたイムノブロットによっても検出される。これらの結果は、アフィニティークロマトグラフィーによってかなり純粋なscFv画分を得ることができることを示している。
scFvの精製調製物をSuperdex 75 HR 10/30カラムに適用したときに、〜25kDの1つの主要なピーク(モノマーscFvに相当する)が観察された(図6)。このピークは、45kDaおよび68kDaにおける2つのあまり重要でないピーク(二量体およびオリゴマーscFvに相当する)より先に生じた。
精製scFvはマイクロタイトレーションプレート上に固定されているGPVI−Fcと用量依存的に結合した(図7A)。結合特異性は、無関連のscFvが同じ条件でGPVIと結合しなかったという事実によって示される。
表面プラズモン共鳴によって確認されたGPVI−Fcに対する9O12.2 IgGの親和性およびパパイン消化後に調製されたそのFab(pFab)の親和性は高く、Kdはそれぞれ6.5 10−9Mおよび4.5 10−9Mである。scFvのKdは2.5 10−9Mである(図8)。
9O12.2 scFvは、固定されている繊維状コラーゲンタイプIとのGPVI−Fcの結合を用量依存的に阻害した(図9)。その阻害能力は9O12.2 pFabのものに近い。
さらに、コラーゲンへの血小板粘着および凝集に対するmscFv 9O12の効果を動脈流条件下で調査し、Fab 9O12および無関連のscFvの結果と比較した(図12参照)。この場合もコラーゲンによって誘導される血小板凝集が阻害された。scFvまたはFabの存在下では、前の結果と一致してコラーゲン繊維と結合した分離血小板だけが観察され(9,41)、対照条件とは対照的に、大きな血小板集塊は観察されなかった。
Fab 9O12はコラーゲンによる刺激を受ける血小板の表面におけるトロンビン生成を阻害することが知られていることから、精製mscFv 9O12の効果を、トロンボグラム法を用いて試験した(図13)。mscFv 9O12およびFab 9O12は、トロンビンピークを同様の程度まで下げ、トロンビン生成を遅らせた。このことから、mscFv 9O12はコラーゲン誘導血小板凝血促進活性の阻害においてFab 9O12と同程度有効であることが示される。
次に、本発明者らは、第1.1.2段に記載のようにネズミ9O12.2 scFvフラグメントをヒト化した。ヒト化VHおよびVLドメインならびに第一ヒト化9O12.2 scFvフラグメント(hscFv 9O12.2(1))のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図14に示している。次に、このhscFv 9O12.2(1)フラグメントを、GPVIセファロースとの親和性結合を用いてさらに特性決定した:組換え細菌の周縁質画分をGPVIセファロースカラム上にのせた。保持されたタンパク質を抗c−myc IgG、続いてHRPと結合した抗マウス抗体を用いたウエスタンブロットおよびECLによる検出によって解析した。ヒト化scFvについて予想されたとおりに、分子量28.5kDaの単一バンドが検出される(図15)。
上記の結果は、本発明者らによって9O12.2モノクローナル抗体から作製されたネズミ9O12.2 scFvが、本質的な構造修飾にもかかわらず、ヒトGPVIと特異的に高親和性で結合することをはっきりと示している。さらに、そのネズミ9O12.2 scFvはコラーゲンとのGPVIの結合を阻害し、コラーゲン誘導血小板凝集を抑制するため、GPVI機能を阻害する。
さらに、本発明者らは、新たな本質的な構造修飾にもかかわらず、同様にヒトGPVIと高親和性で結合する第一ヒト化型9O12.2 scFvフラグメントも作製した(hscFv 9O12.2(1))。
実施例2 ヒト糖タンパク質VIに対する第二の至適化されたヒト化単鎖可変フラグメントhscFv 9O12.2(2)の合成および活性
第二のヒト化scFvフラグメント(hscFv 9O12.2(2))の構築
本発明者らは、元のネズミCDRとヒトアクセプターフレームワークの間の予測されない構造的不和合性がV−ドメインの不適切な折りたたみならびに細菌の細胞質に隔離されて留まる不溶性の封入体の形成をもたらしたのではないかと仮定した。これらの困難を克服するため、いくつかの微細な精密化を行った。
第二のhscFv 9O12.(2)フラグメントを特性決定するための他の総ての試験手順は実施例1に記載の通りに行った。
hscFv9O12.2(2)の製造は、hscFv9O12.2(1)のものより良好であった。
hscFv9O12.2(1)に関して、ヒト化により通常を影響を受ける主要なパラメーターはhscFv9O12.2(2)でよく保存されていた。アフィニティー精製されたhscFv9O12.2(2)は十分機能的であり、生物学的適用の主要な点であるGPVIに対する高い親和性を有していた。FACS分析はまた、hscFv9O12.2(2)は、その結合が1モル過剰のFab 9O12の存在下で特異的に遮断されたことから、ヒト血小板においてマウスFab 9O12と同じエピトープを認識することを示した。
Claims (16)
- 配列番号2、配列番号3および配列番号4からなるCDR1、CDR2およびCDR3領域を含んでなるVHドメイン、
ペプチドリンカー、および
配列番号5、配列番号6および配列番号7からなるCDR1、CDR2およびCDR3領域を含んでなるVLドメイン
を含んでなる、ヒト糖タンパク質VIに対する単鎖可変フラグメント。 - ペプチドタグおよび所望により短いペプチドスペーサーをさらに含んでなる、請求項1に記載の単鎖可変フラグメント。
- 配列番号1と少なくとも95%の同一性を有する266アミノ酸の配列を含んでなる、またはからなり、その266アミノ酸の配列のアミノ酸26〜35、50〜66、99〜109、159〜174、190〜196および229〜237がそれぞれ配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号7からなる、請求項2に記載の単鎖可変フラグメント。
- 配列番号1を含んでなる、またはからなる、請求項3に記載の単鎖可変フラグメント。
- VHおよびVLドメインのフレームワーク領域がヒト抗体のフレームワーク領域を有するVHおよびVLドメインに置き換えられている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメント。
- 配列番号28または配列番号47を含んでなる、あるいはからなる、請求項5に記載のヒト化単鎖可変フラグメント。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントをコードする核酸配列。
- 配列番号29を含んでなる、またはからなる、請求項7に記載の核酸配列。
- 配列番号30または配列番号49を含んでなる、あるいはからなる、請求項7に記載の核酸配列。
- 請求項7〜9のいずれか一項に記載の核酸配列を含んでなる、発現ベクター。
- 請求項10に記載の発現ベクターを含んでなる、宿主細胞。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントを作製する方法であって、
a)請求項11に記載の宿主細胞を培養すること、および
b)前記単鎖可変フラグメントを精製すること
を含む、方法。 - 薬剤としての、請求項1〜6のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメント。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントと薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
- 動脈および静脈血栓、再狭窄、急性冠動脈症候群ならびにアテローム性動脈硬化症による脳血管偶発症候から選択される心血管疾患の治療および/または予防を目的とした薬剤を製造するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントの使用。
- 前記心血管疾患が血栓症である、請求項15に記載の使用。
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