JP2010505449A - ニコチン類縁アルカロイド含量の上昇 - Google Patents
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Abstract
ニコチン非産生細胞を操作して、ニコチンおよび関連化合物を産生させることが出来る。
Description
本発明は、分子生物学の分野およびニコチン類縁アルカロイド合成の制御に関する。したがって、本発明は、とりわけ、タバコ植物においてニコチン類縁アルカロイドの含量を上昇させるための方法およびコンストラクト、ならびに、遺伝子工学的手法を用いなければニコチン類縁アルカロイドおよび関連化合物を生産しない細胞であって、遺伝子工学的手法によりニコチン類縁アルカロイドおよび関連化合物を産生するようになった細胞に関する。
現在、いくつかのニコチン生合成酵素が知られている。例えば、タバコキノリン酸ホスホリボシル基転位酵素 (QPT) 遺伝子がクローニングされており(米国特許第6,423,520号およびSinclair et al., Plant Mol. Biol. 44: 603-17 (2000)参照)、その抑制は、形質転換タバコ植物における顕著なニコチン含量の低下をもたらす(Xie et al.、Recent Advances in Tobbaco Science 30: 17-37 (2004))。同様に、内在性 プトレッシンメチル基転位酵素 (PMT) 配列の抑制は、ニコチン含量を低下させるが、アナタビン含量を約 2から6倍上昇させることが示されている(Hibi et al., Plant Cell 6: 723-35 (1994); Chintapakorn and Hamill, Plant Mol. Biol. 53:87-105 (2003); Steppuhn et al. PLoS Biol 2:8:e217:1074-1080 (2004))。
4つの遺伝子、A622、NBB1、PMTおよびQPTは、タバコ植物におけるニコチン類縁アルカロイド含量を上昇させるため、およびニコチン非産生細胞においてニコチン類縁アルカロイドおよび関連化合物を合成させるために影響されうる。
本発明は、タバコ植物におけるニコチン類縁アルカロイド含量を上昇させること、ならびに、本発明によらなければニコチン類縁アルカロイドを産生しない細胞においてニコチン類縁アルカロイドを産生させることに関する。以下に記載するように、本発明者らは、4つの遺伝子、A622、NBB1、QPTおよびPMTに影響を及ぼすことにより、タバコ植物におけるニコチン類縁アルカロイド含量の上昇を達成することが出来ることを認識した。すなわち、これら4つの遺伝子のいずれかを過剰発現させることによりタバコ(Nicotiana)のニコチン類縁アルカロイド含量が上昇する。さらに、タバコのニコチン類縁アルカロイド含量の上昇は、4つの遺伝子の少なくとも2つ、例えば QPTおよびPMTを同時に過剰発現させることにより達成することが出来る。A622およびNBB1をニコチン非産生植物または細胞に導入することにより、ニコチンまたは関連化合物のそれらによる産生が達成されうる。
A622およびNBB1は以前に同定されたものであるが、本発明の以前には当該技術分野において、タバコ植物においてA622または NBB1の少なくとも1つの過剰発現によりニコチン類縁アルカロイド含量が上昇することはまったく認識されていなかった。したがって、本発明は、A622またはNBB1の少なくとも1つを過剰発現させることによる、タバコ植物におけるニコチン類縁アルカロイド含量を上昇させるための方法およびコンストラクトの両方を包含する。A622およびNBB1の両方の過剰発現はさらにタバコ植物におけるニコチン類縁アルカロイド含量を上昇させる。
A622 はPMTと同じ発現様式を示すことが報告されている(Shoji et al., Plant Cell Physiol. 41: 1072-76 (2000a)、およびPlant Mol. Biol. 50: 427-40 (2002))。A622およびPMTの両方は、根、特に、根および根毛の頂端部の皮層および内皮に特異的に発現している。さらに、A622およびPMTは、NIC 制御およびジャスモン酸メチル刺激に応答して共通の発現様式を有する。A622は地上組織の損傷に応答してタバコ(Nicotiana tabacum)の根において誘導される(Cane et al., Func. Plant Biol. 32: 305-20 (2005))。キダチタバコ(N. glauca))において、A622 はQPT 誘導を導く条件下で損傷を受けた葉において誘導される(Sinclair et al., Func. Plant Biol. 31: 721-29 (2004))。
NBB1配列は、Katoh et al.、Proc. Japan Acad. 79 (Ser. B): 151-54 (2003) のプロトコールにしたがってニコチアナ・シルベストリス-由来cDNA ライブラリーから調製されたcDNAとして同定された。A622と同様に、NBB1は、ニコチン生合成調節座、NIC1および NIC2によって制御される。NBB1およびPMTは、タバコ植物において同じ発現様式を有する。NBB1がニコチン生合成に関与していることは、NBB1が、PMT およびA622と同様に、NIC 遺伝子の制御下にあり、類似の発現様式を示すという事実により示される。
タバコ種におけるニコチン類縁アルカロイド生合成遺伝子の過剰発現を示す唯一の以前の報告は、ニコチアナ・シルベストリス(N. sylvestris)におけるものであり、ここでPMT 過剰発現の結果、葉のニコチン含量が40%程度上昇した(Sato et al.、Proc. Nat’l Acad. Sci . USA 98: 367-72 (2001))。1つの植物種、例えば、ニコチアナ・シルベストリスにおけるニコチン類縁アルカロイド生合成遺伝子の過剰発現の結果、二次代謝産物の蓄積が上昇するとしても、関連種、例えば、タバコ(N. tabacum)においても同様に二次代謝産物の蓄積が起こるとは限らない(Saitoh et al., Phytochemistry 24: 477-80 (1985))。これは特にPMT 過剰発現についていえることであり、というのはタバコ(N. tabacum)は5つの発現したPMT 遺伝子を含んでおり、ニコチアナ・シルベストリスは3つの発現したPMT 遺伝子を含んでいるからである(Hashimoto et al., Plant Mol. Biol. 37: 25-37 (1998); Reichers & Timko, Plant Mol. Biol. 41: 387-401 (1999))。実際、タバコ(N. tabacum)からのPMT 遺伝子を、ズボイシア属(Duboisia)毛状根培養物において過剰発現させた場合、ニコチン、ヒヨスチアミン、およびスコポラミンの含量は有意に上昇しなかった(Moyano et al.、Phytochemistry 59、697-702 (2002))。同様に、ベラドンナ(Atropa belladonna)の形質転換植物および毛状根培養物における同じPMT 遺伝子の過剰発現もヒヨスチアミンおよびスコポラミン含量に影響を及ぼさなかった(Sato et al.、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 98: 367-72 (2001); Rothe et al.、J. Exp. Bot. 54: 2065-070 (2003))。
現在まで、QPTおよびPMTの過剰発現が、相乗的にニコチン類縁アルカロイド含量を上昇させるという知識はなかった。すなわち、ニコチン含量のさらなる上昇は、QPTまたはPMTのみの過剰発現に比べてQPTおよびPMTの両方の過剰発現によって達成することが出来る。本発明のこの側面にしたがって、QPTおよびPMTの両方を含む核酸コンストラクトがタバコ植物細胞に導入される。
QPTはニコチン生合成において役割を果たしていることがよく認識されているが(WO 98/56923参照)、本発明は、タバコにおいてA622、NBB1、QPTおよびPMTの少なくとも2以上を過剰発現させることによるニコチン合成量のさらなる上昇を意図する。本発明のこの側面にしたがって、A622、NBB1、QPTおよびPMTの少なくとも2つを含む核酸コンストラクトがタバコ植物細胞に導入される。例示的な核酸コンストラクトは、QPTおよびA622の両方を含みうる。
本発明のニコチン含量が上昇している植物は、Wernsman et alによって2 PRINCIPLES OF CULTIVAR DEVELOPMENT: CROP SPECIES (Macmillan 1997)に記載されるように常套の育種または交配によって生産することが出来る。例えば、好適な導入遺伝子を含むタバコ材料から再生された安定な遺伝子工学的手法により操作した形質転換体が、高ニコチン含量形質を望ましい市販の遺伝的背景に移入するのに用いられ、それにより高ニコチン含量とその望ましい背景とを組み合わせて有するタバコ品種または変種が得られる。
A622およびNBB1をニコチン非産生植物または細胞に導入し、それにより本発明によらなければニコチンまたは関連化合物を産生しない生物または細胞においてニコチンまたは関連化合物を産生させることが出来る。多様な生成物をこのように操作された生物および細胞から産生することが出来、例えば、ニコチン、ニコチンアナログおよびニコチン生合成酵素が挙げられる。
最近、ニコチン受容体を標的とし、神経変性疾患および認知障害に対する治療効果を提供するニコチンアナログの合成に大きな関心が払われてきている。例えば、R.J. Reynolds Tobacco Companyからスピンアウトとして形成された医薬品会社であるTargaceptは、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体(NNR)の選択的活性化に基づきニコチンアナログ薬物を開発し商品化しようと試みている。本発明は新規ニコチン生合成酵素を提供するため、NBB1のみ、またはNBB1およびA622を、新規ニコチンアナログの開発のために使用することは価値があり得る。例えば、本発明の方法およびコンストラクトを用いて、細胞培養系においてニコチンアナログ前駆体を提供することによりニコチン類縁アルカロイドアナログを産生することが出来る。
ニコチン類縁アルカロイド生合成遺伝子は、タバコ植物によって例示されるいくつかの植物種において同定されている。したがって、本発明は、植物種のゲノムから単離される、または合成によって生産される、タバコのニコチン類縁アルカロイド生合成量を上昇させるあらゆる核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、mRNA、またはcDNA 分子を包含する。さらに、かかるニコチン類縁アルカロイド生合成配列の発現は、ニコチン非産生細胞、例えば、昆虫細胞においてニコチン類縁アルカロイドを産生させる。DNAまたはRNAは二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖 DNAはセンス鎖としても知られるコード鎖であってもよいし、またはそれはアンチセンス鎖とも称される非コード鎖であってもよい。
本発明の1つの側面によると、ニコチン類縁アルカロイド生合成を上昇させる配列が、植物または細胞の形質転換に好適な核酸コンストラクトに組み込まれる。したがって、かかる核酸コンストラクトは、植物におけるA622、NBB1、PMTおよびQPTの少なくとも1つの過剰発現、ならびに、例えば、ニコチン非産生細胞におけるA622およびNBB1の発現に利用することが出来る。
本発明は、ニコチン類縁アルカロイド合成のための経路における酵素をコードするポリヌクレオチド配列を導入することによるニコチン類縁アルカロイド合成の上昇のためのタバコ植物の遺伝子操作を包含する。さらに、本発明は、ニコチン非産生植物、例えば、シロイヌナズナおよびベラドンナにおいてニコチン類縁アルカロイドおよび関連化合物を生産させる方法を提供する。
本発明は、ニコチン類縁アルカロイドの産生に関与する酵素をコードする核酸配列により「ニコチン非産生細胞」を遺伝子工学的手法により操作することを意図する。ニコチン非産生細胞とは、ニコチンを産生しない生物からの細胞をいう。例示的な細胞としては、これらに限定されないが、植物細胞、例えば、ベラドンナ、シロイヌナズナ、ならびに昆虫、哺乳類、酵母、真菌、藻類、または細菌細胞が挙げられる。好適な宿主細胞はさらにGoeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)において記載されている。
ニコチンはタバコ(N. tabacum)およびタバコ属におけるいくらかのその他の種において主要なアルカロイドであるが、その他の植物もニコチン産生能を有し、例えば、ナス科のズボイシア属、アントセリシス(Anthocericis) およびサルピグレシス(Salpiglessis) 属、ならびにキク科のエクリプタ(Eclipta)およびジニア(Zinnia)属が挙げられる。本発明のコンストラクトおよび方法を用いることにより、ニコチンは、ニコチン非産生植物、例えば、ベラドンナおよびシロイヌナズナ、ならびに例えば、昆虫、真菌、および細菌細胞などの細胞においても産生されうる。
「形質転換植物」は、他の生物や種においても存在する、あるいは、他の生物や種由来であって宿主のコドンユーセージに最適化された核酸配列を含む植物をいう。単子葉および双子葉の両方の被子植物または裸子植物の植物細胞を当該技術分野において知られている様々な方法で形質転換することができる。例えば、Klein et al.、Biotechnology 4: 583-590 (1993); Bechtold et al.、C. R. Acad. Sci. Paris 316:1194-1199 (1993); Bent et al.、Mol. Gen. Genet. 204:383-396 (1986); Paszowski et al.、EMBO J. 3: 2717-2722 (1984); Sagi et al.、Plant Cell Rep. 13: 262-266 (1994) を参照。アグロバクテリウム種、例えば、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス(A. tumefaciens)およびアグロバクテリウム・リゾゲネス(A. rhizogenes)を例えば、Nagel et al.、Microbiol Lett 67: 325 (1990)にしたがって用いることが出来る。さらに、植物は、リゾビウム、シノリゾビウムまたはメソリゾビウム形質転換によって形質転換することができる( Broothaerts et al.、Nature 433:629-633 (2005))。
本発明によるコンストラクトは、好適な形質転換技術、例えば、植物細胞のアグロバクテリウム媒介形質転換、パーティクルガン、エレクトロポレーション、およびポリエチレングリコール融合、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはカチオン性脂質媒介トランスフェクションを用いてあらゆる細胞の形質転換に用いることが出来る。
遺伝子工学的手法により操作されている植物および細胞は、ニコチン類縁アルカロイド含量が上昇していることを特徴とする。同様に、形質転換されたニコチン非産生細胞は、ニコチン類縁アルカロイドを産生することを特徴とする。
本発明の遺伝子工学的手法により操作されている植物および細胞は、ニコチン類縁アルカロイド含量および生産量が上昇していることを特徴とする。遺伝子工学的手法により操作されている植物におけるニコチン類縁アルカロイドの産生は好ましくは、ニコチン生合成経路遺伝子、例えば、A622、NBB1、PMT、またはQPTを発現させることにより達成される。
本発明は、ニコチン含量が上昇している遺伝子工学的手法により操作された植物、ならびにニコチンまたは関連化合物を産生する遺伝子工学的手法により操作されたニコチン非産生細胞を提供し、ここで、該細胞は、ニコチンを産生しない生物に由来する。様々な製品がかかる遺伝子工学的手法により操作されている植物から製造されうる。同様に、ニコチンまたは関連化合物の産生のために遺伝子工学的手法により操作されている細胞から製品が製造されうる。
ニコチンは有害生物による損傷からのタバコ植物の保護を助ける天然の殺虫剤として役立つ。常套的に育種または形質転換されたニコチン低含量タバコは昆虫による損傷に対する感受性が上昇しているということが示された(Legg、P.D.、et al.、Can. J. Cyto.、13:287-291 (1971); Voelckel、C.、et al.、Chemoecology 11:121-126 (2001); Steppuhn、A.、et al.、PLoS Biol、2(8): e217: 1074-1080 (2004))。本発明の方法およびコンストラクトを用いて、昆虫およびその他の有害生物による損傷に対する抵抗性が上昇したニコチン含量が上昇している植物を生産することが出来る。同様に、有害生物に対する抵抗性の上昇は、本発明によりニコチンを産生するように遺伝子工学的手法により操作されたニコチン非産生植物、例えば、ベラドンナおよびシロイヌナズナ(A. thaliana)においても達成されうる。
本発明のコンストラクトおよび方法を用いて、例えば、巻きタバコ、葉巻、およびその他の伝統的なタバコ製品、例えば、嗅ぎタバコおよびスヌース(snus)を生産することが出来る。さらに、煙の成分、例えばタールに対する曝露が低減されているが、常套の巻きタバコと同様またはそれより上昇したニコチンを送達できるニコチン含量が上昇した巻きタバコを生産することが出来る。
ニコチン含量が上昇したタバコは、再構成されたシート状タバコ (Recon)および拡張されたタバコまたは膨らんだタバコの生産に使用することもできる。Reconは、以下から生産することが出来る: タバコの灰、茎、小さな葉粒子、タバコ加工処理および巻きタバコ製造のその他の副産物および場合によっては未加工の全葉。製造者よって異なるが、reconプロセスは、典型的な製紙プロセスに非常に類似しており、様々なタバコ画分の加工処理およびそしてreconシートの巻きタバコ(刻みタバコ)に類似のサイズおよび形状への切断を伴う。
伝統的なタバコ製品、例えば、巻きタバコおよびかみタバコに加えて、本発明は、ニコチンおよびニコチンアナログを生産する方法、ならびにニコチンおよびニコチンアナログを合成する酵素を提供する。これら化合物は、遺伝子工学的手法により操作されているニコチン生産性植物およびニコチン非産生細胞によって、ならびに無細胞系/インビトロ系において生産されうる。
ニコチアナ・シルベストリス-由来cDNA ライブラリー(Katoh et al.、Proc. Japan Acad. 79、Ser. B: 151-54 (2003)参照)から調製したcDNA マイクロアレイを用いて、ニコチン生合成調節性 NIC 座によって制御される新規遺伝子を探索した。
タバコ植物におけるNBB1 発現をノザンブロット分析により調べた。
プライマー 1: GGAAAACTAACAACGGAATCTCT
プライマー 2: GATCAAGCTATTGCTTTCCCT。
NBB1 ポリペプチドはハナビシソウのベルベリン架橋酵素 (BBE)に対して25%の同一性および60%の相同性を有する(Dittrich et al.、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 88: 9969-73 (1991))。NBB1 ポリペプチドとEcBBEとのアラインメントを図 2に示す。
NBB1 過剰発現コンストラクトの調製
attB-NBB1 断片を、実施例 1のpGEMT-NBB1cDNAfull ベクターをテンプレートとして、そして2セットの以下のプライマーを用いるPCRにより増幅した;1セットはNBB1のための遺伝子-特異的増幅 (遺伝子特異的プライマー)であり、もう1セットは、 attB 配列を付加するためのものである(アダプタープライマー)。PCR 条件は製造業者によって推奨されているものとした。GATEWAY エントリー(entry)クローン pDONR221-NBB1をattB-NBB1 PCR産物およびpDONR221(Invitrogen)の間のBP 組換え反応により作製した。
NBB1-attB1 5’ AAAAAGCAGGCTCACCATGTTTCCGCTCATAATTCTG
NBB1-attB2 5’AGAAAGCTGGGTTCATTCACTGCTATACTTGTGC
アダプタープライマー
attB1 アダプター 5’ GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
attB2 アダプター 5’ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT
1,031bpのTobRD2 プロモーター領域 (WO9705261における配列番号5)をBurley 21 ゲノムDNAをテンプレートとして、およびTobRD2 プロモーター特異的 プライマーを用いて増幅し、次いでHindIIIおよびXbaIで消化した。
TobRD2-01F 5’ AAAGCTTGGAAACATATTCAATACATTGTAG
HindIII 部位に下線を施す。
TobRD2-02R 5’ TCTAGATTCTACTACTATTTTATAAGTG
XbaI 部位に下線を施す。
バイナリーベクター pTobRD2-NBB1ox をエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・リゾゲネス 株 15834に導入した。タバコ(Nicotiana tabacum ) cv. K326 野生型植物を、リーフディスク法を用いて、基本的にKanegae et al.、Plant Physiol. 105:2:483-90 (1994)に記載されている方法により、アグロバクテリウム・リゾゲネス(A. rhizogenes)で形質転換した。カナマイシン耐性 (B5 培地中200 mg/L)を、pTobRD2-NBB1ox 形質転換系統 (TN 系統)のための選抜マーカーとして用いた。野生型アグロバクテリウム・リゾゲネスを、コントロール毛状根系統(WT 系統)を生産するために用いた。タバコ毛状根を、B5 液体培地中で27℃、暗条件にて2週間培養し、その後回収した。
NBB1 タンパク質の発現量はイムノブロット分析により分析した。毛状根を液体窒素で凍結させ、すぐに1mM フェニルメチルスルホニルフルオリドおよび200 mM ジチオスレイトールを含有する抽出バッファー (100 mM Tris-HCl pH6.8、4% SDS、20% グリセロール)中で乳鉢と乳棒とを用いてホモジナイズした。ホモジネートの遠心分離の後に、上清中の可溶性タンパク質をSDS-PAGEにより分離した。抗-NBB1 ウサギ 血清を用いてイムノブロット分析を行った。詳細な手順は以前に報告されたものである(Shoji et al.、Plant Mol. Biol.、50、427-440 (2002))。抗-NBB1 抗血清を用いたイムノブロットは、形質転換毛状根系統TN9およびTN17では、NBB1 タンパク質含量が上昇していることを示す。図 5Aを参照されたい。
形質転換毛状根を2週間培養し、収集し、凍結乾燥した。2 mlの 0.1 N 硫酸を19 mgの凍結乾燥サンプルに添加した。この懸濁液を15 分間超音波処理し、ろ過した。水酸化アンモニウム (0.1 ml、 28% NH3; Wako) を1 mlのろ液に添加し、混合物を10 分間15,000 rpmで遠心分離した。上清 (1 ml)のサンプルをExtrelut-1 column (Merck)にかけ、5 分間放置した。アルカロイドを6 mlの クロロホルムで溶出した。溶出したクロロホルム画分を次いで減圧下で37℃でエバポレーター (Taitec Concentrator TC-8)を用いて乾燥させた。乾燥サンプルを0.1% ドデカンを含有する50 μl のエタノール溶液に溶解した。キャピラリーカラム (Rtx-5Amine column, Restec) およびFID 検出器を備えたガスクロマトグラフィー 装置 (GC-14B、Shimadzu)を用いてサンプルを分析した。カラム温度を100 ℃に10分維持し、25 ℃/分で150 ℃まで昇温させ、 150 ℃で1 分保持し、1 ℃/分で170 ℃まで昇温させ、170 ℃で2 分保持し、30 ℃/分で300 ℃まで昇温させ、次いで、300 ℃で10分保持した。注入および検出器の温度は300 ℃とした。精製アルカロイド調製物の1 μlのサンプルを注入し、アルカロイド含量を内部標準方法により測定した。
A622 過剰発現コンストラクトの調製
attB-A622 断片を、テンプレートとしてpcDNAII-A622 ベクター(Hibi et al、Plant Cell 6: 723-35 (1994))、以下のA622-特異的プライマーおよびアダプタープライマーを用いて上記実施例4に記載のように増幅した。
A622-attB1
5’AAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGTTGTATCAGAGAAAAGC A
A622-attB2
5’AGAAAGCTGGGTCCTAGACAAATTTGTTGTAGAACTCGTCG
タバコ(N. tabacum) cv. K326 野生型植物を、上記実施例4に記載のように、pTobRD2-A622ox ベクターを含有するアグロバクテリウム・リゾゲネス 15834で形質転換した。pTobRD2-A622oxからのT-DNAを担持する形質転換毛状根をTA 系統と命名し、上記実施例4に記載のように培養した。
イムノブロット分析を、A622 タンパク質検出のために、抗-A622 マウス 血清を用いる他は、上記実施例4に記載のようにして行った。A622 過剰発現ベクターにより形質転換された毛状根系統、TA11、TA14、TA21 では、A622 タンパク質の含量がより高い。図 5Bを参照されたい。
タバコアルカロイドを、上記実施例4に記載のように、抽出、精製、および分析した。A622 過剰発現ベクターにより形質転換された毛状根系統、TA11、TA14、TA21では、ニコチンおよびノルニコチンの含量がより高い。図 6を参照されたい。
A622およびNBB1 過剰発現コンストラクトの調製
単一の T-DNAからA622およびNBB1 タンパク質の両方を発現させるために、TobRD2-A622 発現カセットおよびTobRD2-NBB1 発現カセットをタンデムにバイナリーベクターにクローニングした。TobRD2-A622 カセットをpTobRD2-A622oxからHindIIIにより切り出し、pTobRD2-NBB1oxにおけるTobRD2 プロモーターの5’末端のHindIII 部位にクローニングした。結果として得られたNBB1およびA622の両方の過剰発現のためのベクターをpTobRD2-A622ox-NBB1oxと命名した。pTobRD2-A622ox-NBB1oxのT-DNA領域の図を図 4Dに示す。
タバコ(Nicotiana tabacum ) cv. K326 野生型植物を、上記実施例4に記載のように、pTobRD2-A622ox-NBB1ox ベクターを含有するアグロバクテリウム・リゾゲネス 15834により形質転換した。pTobRD2-A622ox-NBB1oxからのT-DNAを担持する形質転換毛状根をTNA 系統と命名し、上記実施例4に記載のように培養した。
イムノブロット分析をタンパク質検出のために抗-A622 マウス 血清と抗-NBB1 ウサギ 血清との両方を用いる他は、上記実施例4に記載のように行った。毛状根系統 TNA8において、 NBB1 (図 5Aを参照されたい)およびA622 (図 5Bを参照されたい)の両方の発現量が、野生型毛状根系統と比較して上昇している。
タバコアルカロイドを毛状根系統 TNA8から上記実施例4に記載のように、抽出、精製、および分析した。ニコチンおよびノルニコチンの含量は、系統 TNA8において野生型毛状根系統におけるよりも高い(図 6を参照されたい)。
ベラドンナは、N-メチルピロリニウムカチオンに由来するトロパンアルカロイドである、ヒヨスチアミンおよびスコポラミンを産生するが、おそらくはNBB1およびA622 遺伝子の非存在のためにニコチンアルカロイドを含有しない。
バイナリーベクター pGA-A622をエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス(A. tumefaciens)株 EHA105に導入した。ベラドンナ植物を、基本的に Kanegae et al.、(Plant Physiol. 105(2):48390 (1994))に記載のようにして、リーフディスク法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスで形質転換した。カナマイシン耐性 (MS/B5 培地中200 mg/L)をpGA-A622 形質転換についての選抜マーカーとして用いた。形質転換 35S-A622 植物をリーフディスクから再生し、22 ℃で連続光の下、グロースチャンバーにて栽培した。
総タンパク質を上記実施例5に記載のように、野生型および35S-A622 T1 植物の葉から抽出した。イムノブロット分析を、抗-A622 マウス血清を用いて行った。多量のA622 タンパク質を含む自家受粉T1 世代植物、例えば 系統 C1#3 (図 7を参照されたい)の葉組織を、アルカロイド分析のために用いた。
形質転換ベラドンナ植物中のニコチン類縁アルカロイドを1M H2SO4により抽出し、基本的に記載されているようにして精製した(Hashimoto et al.、1992)。アルカロイドを、ガスクロマトグラフィー-質量分析 (GC-MS) (HP-5ms カラムを備える、Hewlett Packard 5890 series II/JEOL MStation JMS700)により、それらの質量スペクトルの標準標品の質量スペクトルとの比較の後に同定した。カラム温度を100 ℃で10分維持し、25 ℃/分で150 ℃に昇温し、150 ℃で1 分保持し、1 ℃/分で170 ℃に昇温し、170 ℃で 2 分保持し、30 ℃/分で300 ℃に昇温し、次いで300 ℃で10分保持した。A622のみのベラドンナへの導入の結果、ニコチンまたはその他のニコチンアルカロイドは蓄積しなかった。
NBB1 過剰発現コンストラクトの調製
NBB1およびA622の組合せがニコチン類縁アルカロイドのカップリング反応に十分であるかどうかを試験するために、本発明者らは、実施例 7のA622を発現するベラドンナ植物の葉を、NBB1 発現ベクターを担持するアグロバクテリウム・リゾゲネス 株 15834で形質転換することによりA622およびNBB1の両方を発現する形質転換ベラドンナ毛状根を生産した。
重複したエンハンサー(El2)およびタバコモザイクウイルス (Ω)の5’-上流配列を有するCaMV35S プロモーターを担持するバイナリーベクター pBE2113を、National Institute of Agrobiological Resources (Tsukuba、Japan)のDr. Yuko Ohashiから譲り受け(Plant Cell Physiol. 37: 49-59 (1996)を参照されたい)、これを、ccdB 遺伝子に隣接するattR 組換え部位およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するGATEWAY カセットを、ベクターのXbaIおよびSacI 部位の間にクローニングした後に、GATEWAY目的ベクターに変換し、これによりβ-グルクロニダーゼ 遺伝子がGATEWAY カセットにより置換された。結果として得られた目的バイナリーベクターをHindIIIおよびSacIで消化し、El2-35S-Ω-GATEWAY カセットを含有するHindIII-SacI 断片をpBI101H中のHindIIIおよびSacI 部位の間にクローニングした。結果として得られた目的バイナリーベクターをpBI101H-E2113-DESTと命名した。pBI101H-E2113-DESTのT-DNA領域の図を図 4Eに示す。
バイナリーベクター pEl235SΩ-NBB1を、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム・リゾゲネス 株 15834に導入した。A662を発現する35S-A622 カセットを含有するT1 世代植物(系統 C1#3)の葉組織を基本的にKanegae et al. (Plant Physiol. 105(2):483-90 (1994))によって記載されているようにしてリーフディスク法を用いてpEl235SΩ-NBB1を担持するアグロバクテリウム・リゾゲネスで形質転換した。ハイグロマイシン耐性 (B5 培地中30 mg/L)を選抜マーカーとして用いた。pEl235SΩ-NBB1 からのT-DNA を担持する形質転換毛状根(系統 E)および、コントロールとしてのT-DNA を有さない野生型アグロバクテリウム・リゾゲネスで感染した形質転換毛状根(WT 系統)をMS/B5 液体培地で2週間培養し、次いで収集した。
総タンパク質を抽出し、イムノブロット分析を上記実施例4に記載のように行った。抗-A622 マウス 血清をA622 タンパク質の検出に用い、抗-NBB1 ウサギ 血清をNBB1 タンパク質の検出に用いた。形質転換ベラドンナ毛状根系統 (E2)はNBB1およびA622の両方のタンパク質を多量に発現する(図 8を参照されたい)。
形質転換ベラドンナ E2 およびWT 毛状根を、100mg/lのニコチン酸を含有する100 mlの MS/B5 液体培地中で3 週間培養した。E2およびWT 毛状根中のニコチンアルカロイドを1M H2SO4で抽出し、基本的に記載されているようにして精製した(Hashimoto et al.、1992)。アルカロイドを、それらの質量スペクトルを標準標品の質量スペクトルと比較した後にガスクロマトグラフィー-質量分析 (GC-MS) (HP-5ms カラムを備えるHewlett Packard 5890 series II/JEOL MStation JMS700)により同定した。カラム温度を100 ℃で10分維持し、25 ℃/分で150 ℃に昇温し、150 ℃で1 分保持し、1 ℃/分で170 ℃に昇温し、170 ℃で2 分保持し、30 ℃/分で300 ℃に昇温し、次いで300 ℃で10 分保持した。
pA622pro-DESTの説明
pA622pro-DESTは、NPTII 遺伝子発現カセットおよびHPT 遺伝子発現カセットを選抜マーカーとして有する。1,407 bpのA622 プロモーターを、A622 プロモーターを含有するベクターをテンプレートとして、そして以下に示すA622 プロモーター特異的プライマーを用いて増幅し(Shoji et al.、Plant Mol. Biol. 50、427-440 (2002))、HindIIIおよびXbaIで消化した。結果として得られた断片を、pBI101H中のHindIIIおよびXbaI 部位の間にクローニングした。ccdB 遺伝子に隣接するattR 組換え部位およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するGATEWAY カセットをバイナリーベクター中のXbaIおよびSacI 部位の間にクローニングした後に、バイナリーベクターを GATEWAY目的ベクターに変換した。図 11Aを参照されたい。
A622pro-01F 5’ AAAAGCTTAGATCTCTCTTATGTTTCATG
HindIII 部位を下線で示す。
A622pro-02R 5’ TCTAGATTTACTCCTAGGGGAAGAAAAAAAGTAGC
XbaI 部位を下線で示す。
attB-PMT 断片を、PMT ORF (NCBI 受入番号; D28506) がpcDNAII (Invitrogen) (配列番号7Bを参照されたい) のBstXI 部位にクローニングされているタバコ PMT ベクターをテンプレートとして、以下の遺伝子特異的プライマー、およびattB 配列 アダプタープライマーを用いて、上記実施例4に記載のように増幅した。GATEWAY エントリークローン pDONR221-PMTを、attB-PMT PCR産物およびpDONR221 (Invitrogen)の間のBP 組換え反応により作成した。
PMT-attB1 5’ AAAAAGCAGGCTCAAAAATGGAAGTCATATC
PMT-attB2 5’ AGAAAGCTGGGTTTAAGACTCGATCATACTTC
pA622pro-PMToxをアグロバクテリウム・ツメファシエンス 株 EHA105に形質転換し、これを野生型 K326 葉の形質転換に用いた。形質転換 T0 シュートを再生させ、発根培地に移した。いくつかの発根した形質転換植物を土壌に移した。
アルカロイドを上記実施例4に記載のように形質転換タバコ葉から抽出し、分析した。土壌に移した後36日目にサンプリングした植物の葉におけるニコチン含量を分析した。pA622pro-PMToxで形質転換したいくつかの形質転換系統は、野生型 K326 植物がAG-GUS カセットで形質転換されたものであるコントロール 系統よりもより多量のニコチン蓄積を示した。図 12を参照されたい。
PMT 過剰発現コンストラクトの調製
PMT ORFをLR 反応によりpDONR221-PMT ベクターからGATEWAY バイナリーベクター pTobRD2-DESTへと移した(図 4Aを参照されたい)。遺伝子発現ベクターをpTobRD2-PMToxと命名した。図 11Cを参照されたい。
pTobRD2-PMToxをアグロバクテリウム・ツメファシエンス 株 EHA105に形質転換し、これを野生型 K326 葉の形質転換に用いた。形質転換 T0 シュートを再生させ、発根培地に移した。いくつかの発根した形質転換植物を土壌に移した。
アルカロイドを上記実施例4に記載のように形質転換タバコ葉から抽出し、分析した。土壌に移した後36日目にサンプリングした植物の葉におけるニコチン含量を分析した。いくつかの形質転換系統は、野生型 K326 植物がTobRD2-GUS カセットで形質転換されたコントロール系統よりも多量のニコチン蓄積を示した。図 13を参照されたい。
QPT 過剰発現コンストラクトの調製
QPT ORF 断片 (配列番号5B)を、pBJY6 ベクター (Nagoya University、JapanのDr. Kenzo Nakamuraから譲り受けた)をテンプレートとして、以下に示す遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。GATEWAY エントリー クローン pENTR-QPT をTOPO クローニング反応により作成した。
QPT-F 5’CACCATGTTTAGAGCTATTCC
QPT-R 5’TCATGCTCGTTTTGTACGCC
pA622pro-QPToxをアグロバクテリウム・ツメファシエンス 株 EHA105に形質転換し、これを野生型 K326 葉の形質転換に用いた。形質転換 T0 シュートを再生させ、発根培地に移した。いくつかの発根した形質転換植物を土壌に移した。
アルカロイドを上記実施例4に記載のように、形質転換タバコ葉から抽出し、分析した。土壌へ移した後36日目にサンプリングした植物の葉におけるニコチン含量を分析した。いくつかの形質転換系統は、野生型 K326 植物がA622-GUS カセットにより形質転換されたコントロール系統よりも多いニコチン蓄積を示した。図 14を参照されたい。
QPT 過剰発現コンストラクトの調製
QPT ORFをLR 反応によりpDONR221-QPT ベクターからGATEWAY バイナリーベクター pTobRD2-DESTに移した(図 4Aを参照されたい)。遺伝子発現ベクターをpTobRD2-QPToxと命名した。図 11Eを参照されたい。
pTobRD2-QPToxをアグロバクテリウム・ツメファシエンス 株 EHA105に形質転換し、これを野生型 K326 葉の形質転換に用いた。形質転換 T0 シュートを再生させ、発根培地に移した。いくつかの発根した形質転換植物を土壌に移した。
アルカロイドを上記実施例4に記載のように、形質転換タバコ葉から抽出し、分析した。土壌へ移した後36日目にサンプリングした植物の葉におけるニコチン含量を分析した。いくつかの形質転換系統は、野生型 K326 植物がTobRD2 -GUS カセットにより形質転換されたコントロール系統よりも多いニコチン蓄積を示した。図 15を参照されたい。
pBI221-A622pro-DEST の説明
pBI221-A622pro-DESTは複数遺伝子発現バイナリーベクターの構築のための基礎ベクターであった。1,407 bp のA622 プロモーターをpUC19-A622profull-LUC ベクターをテンプレートとして、そして、A622 プロモーター特異的プライマーを用いて増幅し、HindIII およびXbaIで消化した。結果として得られた断片を、pBI221 (Clontech)のHindIIIおよびXbaI 部位の間にクローニングし、これによりCaMV 35S プロモーターをA622 プロモーターで置換した。ベクターを、ccdB 遺伝子に隣接するattR 組換え部位およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するGATEWAY カセットを、ベクターのXbaIおよびSacI 部位の間にクローニングした後にGATEWAY 目的ベクターに変換し、これによりB-グルクロニダーゼ 遺伝子をGATEWAY カセットで置換した。次いで、HindIII-EcoRI アダプターをNos ターミネーターの3’末端のEcoRI 部位に挿入し、その結果pBI221-A622pro-DESTが得られた。
PMTおよびQPT タンパク質の両方を過剰発現させるために、A622pro-PMT 発現カセットおよびA622pro-QPT 発現カセットを、バイナリーベクターにタンデムにクローニングした。まず、PMT ORFをLR 反応によりpDONR221-PMT ベクターからGATEWAY バイナリーベクター pBI221-A622pro-DESTに移した。遺伝子発現ベクターをpBI221-A622pro-PMTと命名した。pBI221-A622pro-PMTをHindIIIで消化し、pA622pro-QPTox ベクターのA622 プロモーターの5’末端のHindIII 部位にクローニングした。結果として得られた PMT-QPT 発現ベクターをpA622pro-PMTox-QPToxと命名した。pA622pro-PMTox-QPTox のT-DNA領域の図を図 11Fに示す。
pA622pro-PMTox-QPToxをアグロバクテリウム・ツメファシエンス 株 EHA105に形質転換し、これを野生型 K326 葉の形質転換に用いた。形質転換 T0 シュートを再生させ、発根培地に移した。いくつかの発根した形質転換植物を土壌に移した。
アルカロイドを上記実施例4に記載のように、形質転換タバコ葉から抽出し、分析した。土壌へ移した後36日目にサンプリングした植物の葉におけるニコチン含量を分析した。A622pro-PMTox-QPToxで形質転換されたいくつかの系統は、野生型 K326 植物がA622-GUS カセットで形質転換されたコントロール系統よりも多いニコチン蓄積を示した。図 16を参照されたい。
PMT-QPT 過剰発現コンストラクトの調製
TobRD2の制御下でPMTおよびQPT タンパク質の両方を過剰発現させるために、TobRD2-PMT 発現カセットおよびTobRD2-QPT 発現カセットをタンデムにバイナリーベクターにクローニングした。まず、PMT ORFをLR 反応によりpDONR221-PMT ベクターからGATEWAY バイナリーベクター pBI221-TobRD2-DESTに移した。遺伝子発現ベクターをpBI221-TobRD2-PMTと命名した。pBI221-TobRD2-PMTをHindIIIで消化し、次いでpTobRD2-QPTox中のTobRD2 プロモーターの5’末端のHindIII 部位にクローニングした。結果として得られた PMT-QPT 発現ベクターをpTobRD2-PMTox-QPToxと命名した。図 11Gを参照されたい。
pTobRD2-PMTox-QPToxをアグロバクテリウム・ツメファシエンス 株 EHA105に形質転換し、これを野生型 K326 葉の形質転換に用いた。形質転換 T0 シュートを再生させ、発根培地に移した。いくつかの発根した形質転換植物を土壌に移した。
アルカロイドを上記実施例4に記載のように、形質転換タバコ葉から抽出し、分析した。土壌へ移した後36日目にサンプリングした植物の葉におけるニコチン含量を分析した。TobRD2-PMTox-QPToxで形質転換されたいくつかの形質転換系統は、野生型 K326 植物がTobRD2-GUS カセットで形質転換されたコントロール系統よりも多いニコチン蓄積を示した。図 17を参照されたい。
シロイヌナズナ植物はニコチン類縁アルカロイドを産生しない。しかし、多数のニコチン類縁アルカロイドの前駆体であるニコチン酸は、一般的な代謝産物である。シロイヌナズナにおけるNBB1およびA622の両方の発現の効果を試験した。ニコチンは特に興味深いアルカロイドであるため、PMTの発現を、ニコチンにおけるピロリジン環の前駆体であるメチルプトレッシンの入手可能性を上昇させるために含めた。
最初のATGにおいて導入されたNcoI 部位を含むタバコ A622 cDNA (Hibi et al.、1994)を、pcDNAII (Invitrogen) からNcoI-BamHI 断片として切り出し、pRTL2 (Restrepo et al.、Plant Cell 2:987-98 (1990))に重複したエンハンサーを有するCaMV35S プロモーターの制御下となるようにクローニングした。このA622 過剰発現カセットをHindIII により切り出し、バイナリーベクター pGA482 (Amersham)にクローニングし、A622 発現ベクター pGA-A622を作成した。
バイナリーベクター pGA-A622 をエレクトロポレーションによりアグロバクテリウム・ツメファシエンス 株 LBA4404に導入した。シロイヌナズナ植物 (生態型: Wassilewskija (WS))を、基本的にAkama et al.、Plant Cell Reports 12: 7-11 (1992)に記載されているようにカルス誘導-植物再生方法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスにより形質転換した。カナマイシン耐性 (シュート-誘導培地上50 mg/L)をpGA-A622 形質転換についての選抜マーカーとして用いた。形質転換植物をカルスから再生させ、グロースチャンバー中で23 ℃で16時間明期/8時間暗期の条件にて栽培した。
NBB1 ORF (配列番号1B)をLR 反応によりpDONR221-NBB1-2 ベクターからGATEWAY バイナリーベクター pGWB2に移した(図 18Aを参照されたい)。NBB1がCAMV 35S プロモーターに連結している遺伝子発現ベクターをp35S-NBB1と称する。図 18Bを参照されたい。同様に、PMT ORFをLR 反応によりpDONR221-PMT ベクター からpGWB2に移した。遺伝子発現ベクターをp35S-PMTと称する。図 18Cを参照されたい。
バイナリーベクター、p35S-NBB1 およびp35S-PMTをエレクトロポレーションによりアグロバクテリウム・ツメファシエンス 株 EHA105に導入した。pGA-A622を担持するT1 世代 植物を基本的にClough et al.、Plant J. 16: 735-43 (1998)に記載されているようにfloral dip法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスにより形質転換した。ハイグロマイシン耐性 (シュート-誘導培地上25 mg/L)をp35S-NBB1およびp35S-PMT 形質転換についての選抜マーカーとして用いた。形質転換植物をグロースチャンバー中で23 ℃で16時間明期/8時間暗期の条件にて栽培した。その結果得られた形質転換植物を、35S プロモーター プライマーおよびNBB1- またはPMT-遺伝子特異的プライマーを用いるゲノムPCRによりスクリーニングした。
35S-F 5’ACCCTTCCTCTATATAAGGAAG
NBB1-l140 5’TGAGCCCAAGCTGTTTCAGAATCC
35S-A622-35S-PMT 植物のスクリーニングのためのプライマー
35S-F 5’ACCCTTCCTCTATATAAGGAAG
PMT-01R 5’CGCTAAACTCTGAAAACCAGC
NBB1およびA622を発現する形質転換系統を選抜し、アルカロイド分析のために用いた。アルカロイドを上記実施例4に記載のように形質転換タバコ葉から抽出し、分析した。図 20に示すように、ニコチンの溶出時間に対応する新しいピークがNBB1-A622-PMT 系統にみられたが、A622-PMT 系統にはみられなかった。これは、NBB1およびA622の両方の発現がA622のみの発現よりも、通常はアルカロイドを産生しない植物におけるニコチン類縁アルカロイドの産生のために有効であることを示す。
昆虫細胞-バキュロウイルス発現系であるBac-to-Bac Expression System (Invitrogen)を、昆虫細胞における6xHis タグを有するNBB1およびA622 タンパク質の発現のために用いた。発現クローンを作成するために、NBB1およびA622 ORF(それぞれ配列番号1Bおよび3B)を、LR 反応によりそれぞれのDONR ベクター(pDONR-NBB1-2、pDONR-A622)からGATEWAY ベクター pDEST10 (Invitrogen)に移した。その結果得られた発現クローンをpDEST10-NBB1およびpDEST10-A622と命名した。
配列表
Claims (26)
- コントロール植物と比較してA622およびNBB1の少なくとも一方を過剰発現させることを含む、タバコ植物におけるニコチン含量を上昇させる方法。
- A622を過剰発現させる、請求項 1の方法。
- NBB1を過剰発現させる、請求項 1の方法。
- A622およびNBB1を過剰発現させる、請求項 1の方法。
- QPTおよびPMTの少なくとも一方を過剰発現させることをさらに含む、請求項 4の方法。
- QPTおよびA622を過剰発現させる、請求項 5の方法。
- 請求項1-5のいずれかの方法によって生産された、ニコチン含量が上昇している植物。
- 請求項 7の植物から生産された、ニコチン含量が上昇している製品。
- 巻きタバコ、医薬品、および栄養補助食品からなる群から選択される、請求項 8の製品。
- NBB1およびA622を異種発現させなければニコチン類縁アルカロイドを産生しない植物または細胞においてNBB1およびA622を異種発現させることを含む、ニコチン類縁アルカロイドの生産方法。
- NBB1およびA622の発現が、細菌、酵母、糸状菌、藻類、哺乳類、および昆虫細胞からなる群から選択される細胞において起こる、請求項 10の方法。
- 請求項 10の方法によって生産された、ニコチン類縁アルカロイド含量が上昇している植物。
- 請求項 10の方法によって生産された、ニコチン類縁アルカロイド製品。
- (a) A622およびNBB1を発現する複数の細胞を提供する工程、および、
(b)該複数の細胞からニコチン類縁アルカロイドを得る工程、
を含む、ニコチン類縁アルカロイドの生産方法。 - コントロール植物と比較して、 PMTおよびQPTを過剰発現させることを含む、植物におけるニコチン含量を上昇させる方法。
- 請求項 15の方法によって生産された、ニコチン含量が上昇している植物。
- 請求項 15の植物から生産された、ニコチン含量が上昇している製品。
- NBB1をコードする単離核酸分子により細胞を形質転換する工程、および、
NBB1 酵素が産生される条件下で形質転換細胞を培養する工程、
を含む、NBB1 酵素の生産方法。 - 形質転換細胞が、細菌、酵母、糸状菌、藻類、緑色植物、および哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項 18の方法。
- (a) ニコチン含量が上昇しているタバコ植物と多生産タバコ植物とを交配する工程; および、
(b)ニコチン含量が上昇し、かつ、高生産量である子孫植物を選抜する工程、
を含む、タバコ植物におけるニコチン含量および生産量を上昇させる方法。 - 該ニコチン含量が上昇している植物が以下によって生産される、請求項 20の方法:
(a) 5’から3’の方向にて、ニコチン合成を上昇させる酵素をコードする異種核酸に作動可能に連結したプロモーター、および、ニコチン合成を上昇させる酵素をコードする異種核酸を含むコンストラクトによりタバコ植物を形質転換する工程;
(b)形質転換植物から形質転換タバコ植物を再生させる工程;および、
(c)コントロール植物と比較してニコチン含量が上昇した形質転換タバコ植物を選抜する工程。 - 該核酸が、QPT、PMT、A622およびNBB1からなる群から選択される、請求項 21の方法。
- 請求項 20の方法によって生産された、ニコチン含量および生産量が上昇した植物。
- (a) (i) 5’から3’の方向にて、ニコチン合成を上昇させる酵素をコードする異種核酸に作動可能に連結したプロモーター、および、ニコチン合成を上昇させる酵素をコードする異種核酸を含む第1のコンストラクト;および
(ii) 5’から3’の方向にて、生産量を上昇させる酵素をコードする異種核酸に作動可能に連結したプロモーター、および、生産量を上昇させる酵素をコードする異種核酸を含む第2のコンストラクト;
によりタバコ植物を形質転換する工程、
(b)形質転換タバコ植物を形質転換植物から再生させる工程;および、
(c)コントロール植物と比較して、ニコチン含量が上昇し、かつ生産量が上昇した形質転換タバコ植物を選抜する工程、
を含む、タバコ植物におけるニコチン含量および生産量を上昇させる方法。 - 該第1のコンストラクトが、QPT、PMT、A622およびNBB1からなる群から選択される酵素をコードする核酸を含む、請求項 24の方法。
- コントロール植物と比較してPMT を過剰発現させることを含む、タバコ(N. tabacum)におけるニコチン含量を上昇させる方法。
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