JP2010227006A - Activity inhibitor of biodegradable plastic decomposing enzyme - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生分解性プラスチック分解酵素の活性抑制剤、及び該活性抑制剤を使用する生分解性プラスチックの分解抑制方法に関する。 The present invention relates to a biodegradable plastic-degrading enzyme activity inhibitor and a method for inhibiting biodegradable plastic degradation using the activity inhibitor.
農業現場において、プラスチックは必要不可欠な資材としてパイプハウスの被覆やマルチに大量に使用されており、現在、農林業用の使用済プラスチックの排出量は約15万tといわれる。この使用済プラスチックは回収に労力がかかるばかりでなく、燃焼などによりCO2やダイオキシンが発生して地球温暖化などの環境に悪影響を及ぼす。環境に対する負荷の少ない資源を用いる観点からも、近年は生分解性プラスチックの研究が進み、実用化され始めている。
現在、農業資材以外の目的に生産されたものも含めて、生分解性プラスチックの国内生産量は10万tを超えたと推測されている。また、これまでに土壌や汚泥、空気等から採取された微生物から生分解性プラスチック分解酵素が単離されている（特許文献１、２、３）。しかしながら、農業資材に必要な強度と生分解性のバランスは難しく、資材に強度を持たせると生分解性が充分に発揮されないといった問題が存在する。従って、使用中は分解せず、使用後速やかに分解させるように、生分解性プラスチックの分解を制御することが求められている。
Plastics are used in large quantities in pipehouse coverings and mulch as an indispensable material at agricultural sites, and the amount of used plastic for agricultural and forestry is currently estimated to be about 150,000 tons. This used plastic not only takes effort to collect, but it also has an adverse effect on the environment such as global warming due to the generation of CO 2 and dioxins due to combustion. In recent years, biodegradable plastics have been researched and put into practical use from the viewpoint of using resources with low environmental impact.
At present, domestic production of biodegradable plastics, including those produced for purposes other than agricultural materials, is estimated to have exceeded 100,000 tons. In addition, biodegradable plastic-degrading enzymes have been isolated from microorganisms collected from soil, sludge, air, etc. (Patent Documents 1, 2, and 3). However, it is difficult to balance the strength and biodegradability required for agricultural materials, and there is a problem that the biodegradability cannot be sufficiently exhibited if the materials are given strength. Therefore, it is required to control the decomposition of the biodegradable plastic so that it does not decompose during use, but quickly decomposes after use.
本発明は、生分解性プラスチックの分解を制御し、それにより生分解性プラスチックをより利用しやすくする技術を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the technique which controls decomposition | disassembly of biodegradable plastic and thereby makes biodegradable plastic easier to use.
本発明は、クチナーゼ類似構造を有する生分解性プラスチック分解酵素の酵素活性が、臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）以上の濃度の非イオン性界面活性剤により阻害されるという知見に基づくものである。
即ち、本発明は、臨界ミセル濃度以上の濃度で非イオン性界面活性剤を含む、生分解性プラスチック分解酵素の活性抑制剤を提供する。
また、本発明は、生分解性プラスチック物品の表面に前記非イオン性界面活性剤が施されてなるプラスチック物品を提供する。
また、本発明は、前記活性抑制剤を生分解性プラスチック物品の表面に適用し、表面に残存させる工程を含む、生分解性プラスチックの分解を抑制する方法を提供する。
また、本発明は、前記活性抑制剤を生分解性プラスチックの表面に適用し、表面に残存させる工程、及び、前記残存している活性抑制剤を前記生分解性プラスチック物品の表面から取り除く工程を含む、生分解性プラスチックの分解を制御する方法を提供する。
The present invention is based on the finding that the enzymatic activity of a biodegradable plastic degrading enzyme having a cutinase-like structure is inhibited by a nonionic surfactant having a concentration equal to or higher than the critical micelle concentration (cmc).
That is, the present invention provides a biodegradable plastic-degrading enzyme activity inhibitor containing a nonionic surfactant at a concentration equal to or higher than the critical micelle concentration.
The present invention also provides a plastic article obtained by applying the nonionic surfactant to the surface of a biodegradable plastic article.
The present invention also provides a method for suppressing the degradation of the biodegradable plastic, comprising the step of applying the activity inhibitor to the surface of the biodegradable plastic article and allowing it to remain on the surface.
The present invention also includes a step of applying the activity inhibitor to the surface of the biodegradable plastic and leaving it on the surface, and a step of removing the remaining activity inhibitor from the surface of the biodegradable plastic article. A method for controlling the degradation of a biodegradable plastic is provided.
本発明により、生分解性プラスチックの使用中は分解せず、使用後速やかに分解させるように分解を制御し、それにより生分解性プラスチックをより利用しやすくすることができる。 According to the present invention, it is possible to control the decomposition so that the biodegradable plastic is not decomposed during use but is quickly decomposed after use, thereby making the biodegradable plastic easier to use.
生分解性プラスチックの分解は、その化学構造と、分解微生物及びその生産する分解酵素の活性化条件（例えば水、温度、栄養）に依存する。また、植物の葉表面から多様な生分解性プラスチック分解菌が分離される。本願発明者らは、非イオン性界面活性剤が、クチナーゼ類似構造を持つ生分解性プラスチック分解酵素の活性を広く抑制することを見出した。 The degradation of a biodegradable plastic depends on its chemical structure and the activation conditions (eg water, temperature, nutrients) of the degrading microorganisms and the degrading enzymes that it produces. In addition, various biodegradable plastic-degrading bacteria are isolated from the leaf surface of the plant. The present inventors have found that nonionic surfactants broadly suppress the activity of biodegradable plastic-degrading enzymes having a cutinase-like structure.
本発明の活性抑制剤に使用できる非イオン性界面活性剤は特に限定はされず、ポリエチレングリコール型、多価アルコール型を問わず使用することができる。本発明においては、例えば、微生物が生産する糖脂質界面活性剤（バイオサーファクタント）であるマンノシルエリスリトールリピッド（MEL：Morita, T. et al., J Biosci Bioeng 104 (1), 78 (2007)；Morita, T. et al., FEMS Yeast Res 7 (2), 286 (2007)）やソホロリピッド、Triton X100などのアルキルフェノールアルキレンオキシド付加物、Tween 20及びTween80などの、ソルビタン脂肪酸エステルアルキレンオキシドを付加物、N-ドデシルβ-マルトシド、シュークロースモノラウリン酸などのショ糖脂肪酸エステル、n-オクチルβ-D-グルコシド、セロビオースリピッド、ソホロリピッドなどを使用することが可能であり、上記のうち、マンノシルエリスリトールリピッド、ソホロリピッド、Triton X100、Tween 20及びTween80が特に好ましい。ここで、アルキレンオキシドとしてはエチレンオキシド、又は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドの混合物が好ましく、特にエチレンオキシドが好ましい。また、非イオン性界面活性剤のＨＬＢ（Hydrophile-Lipophile Balance）が６〜１８であることが好ましく、８〜１７であることがより好ましい。 The nonionic surfactant that can be used in the activity inhibitor of the present invention is not particularly limited, and can be used regardless of polyethylene glycol type or polyhydric alcohol type. In the present invention, for example, mannosylerythritol lipid (MEL: Morita, T. et al., J Biosci Bioeng 104 (1), 78 (2007); Morita, which is a glycolipid surfactant (biosurfactant) produced by microorganisms; , T. et al., FEMS Yeast Res 7 (2), 286 (2007)), sophorolipid, alkylphenol alkylene oxide adducts such as Triton X100, sorbitan fatty acid ester alkylene oxides such as Tween 20 and Tween 80, N -Sucrose fatty acid esters such as dodecyl β-maltoside and sucrose monolauric acid, n-octyl β-D-glucoside, cellobiose lipid, sophorolipid, etc. can be used, of which mannosyl erythritol lipid, sophorolipid, Triton X100, Tween 20 and Tween 80 are particularly preferred. Here, as the alkylene oxide, ethylene oxide or a mixture of ethylene oxide and propylene oxide is preferable, and ethylene oxide is particularly preferable. Moreover, it is preferable that HLB (Hydrophile-Lipophile Balance) of a nonionic surfactant is 6-18, and it is more preferable that it is 8-17.
ここで、バイオサーファクタント（以下、BSとも呼ぶ）とは、微生物が植物油や糖質などの各種バイオマスを原料として生産・分泌する両親媒性脂質の一種である。糖型ＢＳは、その分子中に親水基として糖鎖構造を有し、疎水基として各種の中鎖および長鎖脂肪酸（飽和、不飽和、分枝、ヒドロキシ型など）が上記親水基に結合した分子構造をとっている。各種BSの中でも糖型ＢＳは、生産性に優れることから最もよく研究され、細菌及び酵母によって生産される多くの種類の物質が報告されている。 Here, biosurfactant (hereinafter also referred to as “BS”) is a kind of amphipathic lipid that microorganisms produce and secrete from various biomass such as vegetable oil and carbohydrate. The sugar type BS has a sugar chain structure as a hydrophilic group in the molecule, and various medium chain and long chain fatty acids (saturated, unsaturated, branched, hydroxy type, etc.) are bound to the hydrophilic group as a hydrophobic group. Has a molecular structure. Among various BSs, glycosylated BSs are best studied because of their excellent productivity, and many types of substances produced by bacteria and yeasts have been reported.
バイオサーファクタントとしては、ラムノリピッド、ソホロリピッド、マンノシルエリスリトールリピッド、トレハロースリピッド、セロビオースリピッド、オリゴ糖リピッドなどバイオサーファクタントなどが知られているが、本発明においては、上記の中でも、特にマンノシルエリスリトールリピッドが好ましく使用される。マンノシルエリスリトールリピッドは、草花や土壌など身近な環境に広く分布する、シュードザイマ（Pseudozyma）属やウスチラゴ（Ustilago）属などの酵母によって生産されることから、高い安全性が見込まれる。例えばシュードザイマ・アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）及びシュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）に属する微生物由来のMELを使用することが可能であり、特にシュードザイマ・アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）に属する微生物は、MELの生産性に優れることから、これから得られるマンノシルエリスリトールリピッドを用いることが望ましい。 As biosurfactants, biosurfactants such as rhamnolipid, sophorolipid, mannosyl erythritol lipid, trehalose lipid, cellobiose lipid, oligosaccharide lipid and the like are known. The Mannosylerythritol lipid is widely distributed in the immediate environment, such as flowers, soil, from being produced by Pseudozyma (Pseudozyma) or the genus Ustilago (Ustilago) yeast belonging to the genus, such as, high safety is expected. For example Pseudozyma antarctica (Pseudozyma antarctica) and Pseudozyma tsukubaensis it is possible to use a MEL from a microorganism belonging to the (Pseudozyma tsukubaensis), microorganisms belonging particularly Pseudozyma antarctica (Pseudozyma antarctica) is, MEL Therefore, it is desirable to use mannosyl erythritol lipid obtained from this.
本発明に用いるマンノシルエリスリトールリピッド（以下、MELとも呼ぶ）は、MEL生産微生物の培養によって得られ、その化学構造の代表例は以下の式（１）に示され、４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−エリスリトールをその基本構造とするものである。
ただし、上記式（１）中、Ｒ1は炭素数２〜２４、好ましくは６〜１８の脂肪族アシル基であり、直鎖あるいは分岐状の飽和または不飽和脂肪族アシル基を含む。Ｒ2は、水素またはアセチル基を表す。Ｒ3は水素または炭素数２〜２４、好ましくは２〜１８の脂肪族アシル基であり、直鎖あるいは分岐状の飽和または不飽和脂肪族アシル基を含む。２箇所あるＲ2及びＲ3は同一であっても異なっていてもよい。上記置換基Ｒ1及びＲ3の脂肪族アシル基の種類及びその炭素数は、ＭＥＬ生産培地に含有させる油脂類中の脂肪酸に基本的には依存するが、その炭素数は使用するＭＥＬ生産菌の脂肪酸の資化の程度により変化する。したがって、得られる各ＭＥＬは、通常、置換基Ｒの脂肪酸残基部分が異なる化合物の混合物の形態である。
ＭＥＬの代表例としてＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃ、ＭＥＬ−Ｄの４種類が知られている（北本大、薬学雑誌、128、695 (2008)）。その化学構造を以下に示す。
As representative examples of MEL, four types of MEL-A, MEL-B, MEL-C, and MEL-D are known (Kitamoto Univ., Pharmaceutical Journal, 128, 695 (2008)). Its chemical structure is shown below.
これら式中、Ｒ1は上記式（１）と同様の基であり、Ａｃはアセチル基を表す。
上述のシュードザイマ・アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）に属する微生物は、MEL-A、-B、-Cを混合物として生産することが知られており、その主成分はMEL-Aである。これらはシリカゲルカラムクロマトグラフィーなど、一般的に用いられる分離生成方法によって単離精製することができる。本発明では混合物のまま用いても良いし、単離されたものを用いてもよい。
In these formulas, R 1 is the same group as in the above formula (1), and Ac represents an acetyl group.
Microorganisms belonging to the above-mentioned Pseudozyma antarctica are known to produce MEL-A, -B and -C as a mixture, and the main component is MEL-A. These can be isolated and purified by commonly used separation and production methods such as silica gel column chromatography. In the present invention, the mixture may be used as it is, or an isolated one may be used.
ソホロリピッドは、ソホロース（β１→２結合した２分子のブドウ糖からなる糖）あるいはヒドロキシル基が一部アセチル化したソホロースと、ヒドロキシ脂肪酸（構造中にヒドロキシル基を有する脂肪酸）とからなる糖脂質であり、ヒドロキシ脂肪酸のカルボキシル基が遊離した酸型と、分子内のソホロースと結合したラクトン型と、に大別される。一般的に、発酵生産によって得られるＳＬは、ラクトン型と酸型の混合物として得られ、通常、ラクトン型を５０％以上含む。
ただし、上記式（１）中、Ｒ1、Ｒ2は、水素またはアセチル基を表し、同一であっても異なっていてもよい。また、ｎは９〜１７の整数である。発酵生産によって得られるSLは、酸型、ラクトン型の含有比、Ｒ1、Ｒ2のアセチル基含有率、及び脂肪酸の炭素数（ｎ）が、使用するSＬ生産菌により変化する。したがって、得られる各SＬは、通常、アセチル基、脂肪酸鎖長部分の組成が異なる酸型、ラクトン型SLの混合物の形態である。 However, in said formula (1), R < 1 >, R < 2 > represents hydrogen or an acetyl group, and may be same or different. Moreover, n is an integer of 9-17. In SL obtained by fermentation production, the content ratio of acid type and lactone type, the content of acetyl groups of R 1 and R 2 , and the carbon number (n) of fatty acids vary depending on the SL-producing bacteria used. Therefore, each obtained SL is usually in the form of a mixture of acid type and lactone type SL having different compositions of acetyl group and fatty acid chain length.
本発明に用いるソホロリピッドは、生産する微生物、製造法に依らず用いることができる。ＳＬを生産する微生物の例としては、例えばスターメレラ（キャンディダ）・ボンビコーラ（Starmerella（Candida） bombicola）、キャンディダ・ボゴリエンシス（Candida bogoriensis）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）、またはキャンディダ・アピコーラ（Candida apicola）等に属する微生物が挙げられ、このうち特に、スターメレラ（キャンディダ）・ボンビコーラに属する微生物が生産性に優れることから好ましい。
これらは保存機関から分譲された菌株、あるいはその継代培養菌株であってもよい。
The sophorolipid used in the present invention can be used regardless of the microorganism to be produced and the production method. Examples of microorganisms producing SL, e.g. Sutamerera (Candida) Bonbikora (Starmerella (Candida) bombicola), Candida & Bogorienshisu (Candida bogoriensis), Candida & Magnolie (Candida magnoliae), or Candida-Apikora ( Candida apicola ) and the like, and among these, microorganisms belonging to Starmella (Candida) and Bonbicola are particularly preferred because of their excellent productivity.
These may be strains handed over from a storage organization, or subcultures thereof.
酸型、及びラクトン型ソホロリピッドは、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなど、一般的に用いられる分離生成方法によって単離精製することができる。上記のうち、本発明では非イオン型界面活性剤であるラクトン型ソホロリピッドを使用することが可能であり、ラクトン型ソホロリピッド単離して用いることがより望ましいが、これを主成分として含む混合物を用いても良い。 Acid type and lactone type sophorolipids can be isolated and purified by a commonly used separation and production method such as silica gel column chromatography. Among the above, in the present invention, it is possible to use a lactone type sophorolipid which is a nonionic surfactant, and it is more preferable to use the lactone type sophorolipid isolated, but using a mixture containing this as a main component Also good.
上記の非イオン性界面活性剤の種類は、例えば活性を抑制したい生分解性プラスチック分解酵素の種類などに応じて決定することが可能であり、前記酵素の活性を最も効率的に抑制できる組合せが明らかになれば、それを用いることができる。また、MELのように臨界ミセル濃度の値が低く、水溶解性が低い界面活性剤は散布量が少なくて済み、屋外や浴室等の水濡れの多い場面で用いやすいことから、用いる場面に応じた界面活性剤を選ぶことにより、効果的かつ長期間に渡り分解を抑制することができる。 The type of the nonionic surfactant can be determined according to, for example, the type of biodegradable plastic degrading enzyme whose activity is to be suppressed, and the combination that can most effectively suppress the activity of the enzyme is If it becomes clear, it can be used. In addition, surfactants with low critical micelle concentration and low water solubility, such as MEL, require only a small amount of application, and are easy to use in wet and wet scenes such as outdoors and bathrooms. By selecting a surfactant, the decomposition can be effectively suppressed over a long period of time.
本発明の活性抑制剤は臨界ミセル濃度以上の濃度で上記の非イオン性界面活性剤を含む。ここで、臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）とは当業者に知られる通り、界面活性剤の使用時にミセルを形成するのに必要な最低限の界面活性剤濃度を意味する。本発明の活性抑制剤は、上記の非イオン性界面活性剤を当業者がその使用の態様に応じて、例えば20mMトリス塩酸バッファーpH6.8等の溶媒に溶解し、必要により粘度調整剤等の既知の添加剤を加えて使用することができる。 The activity inhibitor of the present invention contains the above-mentioned nonionic surfactant at a concentration equal to or higher than the critical micelle concentration. Here, the critical micelle concentration (cmc) means the minimum surfactant concentration necessary for forming micelles when a surfactant is used, as known to those skilled in the art. The activity inhibitor of the present invention can be prepared by, for example, dissolving a nonionic surfactant in a solvent such as 20 mM Tris-HCl buffer pH 6.8 according to the mode of use by a person skilled in the art. Known additives can be added and used.
本発明の活性抑制剤は広く生分解性プラスチック分解酵素の活性を抑制することが可能であり、生分解性プラスチック分解酵素の種類は特に限定されないが、本発明においては、生分解性プラスチック分解酵素はクチナーゼ類似構造を有するものであることが好ましい。このような生分解性プラスチック分解酵素は、植物の葉の表面に生息できる微生物が多く生産することが知られ、例えば、イネから分離される酵母Pseudozyma antarctica（シュードザイマ・アンタークティカ）が生産する生分解性プラスチック分解酵素(PaE)や、ムギから単離される生分解性プラスチック分解糸状菌、および麹菌の生分解性プラスチック分解酵素は、いずれもクチナーゼ（クチン分解酵素）類似の構造を示す。本発明においては、酵母Pseudozyma antarctica JCM10317の生産する生分解性プラスチック分解酵素であるPaEや、糸状菌47-9（受託番号NITE P-753：特願2008-250869）の培養液に含まれる糸状菌由来の生分解性プラスチック分解酵素を好ましく使用することができる。 The activity inhibitor of the present invention can broadly suppress the activity of biodegradable plastic degrading enzyme, and the type of biodegradable plastic degrading enzyme is not particularly limited. Preferably has a cutinase-like structure. Such biodegradable plastic-degrading enzymes are known to produce many microorganisms that can inhabit the leaf surface of plants. For example, the yeast Pseudozyma antarctica (Pseudozyma antarctica ) isolated from rice produces Biodegradable plastic-degrading enzymes (PaE), biodegradable plastic-degrading filamentous fungi isolated from wheat, and koji mold biodegradable plastic-degrading enzymes all have a structure similar to cutinase (cutting enzyme). In the present invention, PaE , which is a biodegradable plastic-degrading enzyme produced by the yeast Pseudozyma antarctica JCM10317, and a filamentous fungus contained in the culture solution of filamentous fungus 47-9 (accession number NITE P-753: Japanese Patent Application No. 2008-250869). The derived biodegradable plastic-degrading enzyme can be preferably used.
本発明においては、上記の活性抑制剤を生分解性プラスチック物品の表面に適用し、表面に残存させることにより、生分解性プラスチック分解酵素の分解活性を抑制し、それにより生分解性プラスチックの分解を抑制することができる。また、上記の方法により、生分解性プラスチック物品の表面に前述の非イオン性界面活性剤が施されてなるプラスチック物品が得られる。
本発明の活性抑制剤が適用される生分解性プラスチック物品特に限定はされないが、使用される期間にわたって外部環境の中で一定の強度が要求される、例えばパイプハウスの被覆やマルチなどの農林業用の物品が好ましい。
本発明の活性抑制剤が適用される生分解性プラスチック物品を構成する生分解性プラスチックの種類は特に限定はされず、任意のものを使用することができる。本明細書において、生分解性プラスチックとは、例えば、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、およびポリコハク酸ブチレン、ポリ乳酸等のポリエステルなど、当該技術分野において一般に生分解性プラスチックとして認識されているものに限定はされず、一部の特殊な酵素のみが分解することが可能である他のプラスチックも含まれる。このようなプラスチックの例としては、例えばエステル結合を含むプラスチック（例えばポリウレタンなどのポリエステル）や、エステル結合を含む可塑剤を混合したプラスチック（例えばフタル酸エステル、アジピン酸エステル、リン酸エステルなど）などが挙げられる。本発明においては、コハク酸系ポリエステル[ポリブチレンサクシネート(PBS)およびポリブチレンサクシネートアジペート(PBSA)との混合物]及びポリ乳酸(PLA)が好ましい。
In the present invention, the activity inhibitor is applied to the surface of the biodegradable plastic article and left on the surface, thereby suppressing the degradation activity of the biodegradable plastic degrading enzyme, thereby degrading the biodegradable plastic. Can be suppressed. Further, by the above method, a plastic article obtained by applying the above-mentioned nonionic surfactant to the surface of the biodegradable plastic article can be obtained.
The biodegradable plastic article to which the activity inhibitor of the present invention is applied is not particularly limited, but is required to have a certain strength in the external environment over the period of use, for example, for agricultural and forestry industries such as pipe house covering and mulch The article is preferred.
The kind of the biodegradable plastic composing the biodegradable plastic article to which the activity inhibitor of the present invention is applied is not particularly limited, and any one can be used. In the present specification, the biodegradable plastic is limited to those generally recognized as biodegradable plastics in the technical field, such as polyesters such as polyhydroxybutyric acid, polycaprolactone, butylene polysuccinate, and polylactic acid. Other plastics that can only be degraded by some special enzymes are also included. Examples of such plastics include plastics containing ester bonds (for example, polyesters such as polyurethane), plastics mixed with plasticizers containing ester bonds (for example, phthalic acid esters, adipic acid esters, and phosphoric acid esters). Is mentioned. In the present invention, succinic polyester [mixture of polybutylene succinate (PBS) and polybutylene succinate adipate (PBSA)] and polylactic acid (PLA) are preferable.
また、本発明の活性抑制剤を生分解性プラスチック物品の表面に適用し、表面に残存させる様式も特に限定はされず、使用する非イオン性界面活性剤の種類や性質、生分解性プラスチック物品の種類や形状に応じて当業者が最適の方法を適宜決定することができる。例えば、水やトリス塩酸バッファーに非イオン性界面活性剤を溶解し、そこに生分解性プラスチック物品を浸漬させることにより十分な効果を得ることが可能である。その他、塗布または散布用の形態（スプレー剤等）により生分解性プラスチック物品に適用することも可能である。 Further, the manner in which the activity inhibitor of the present invention is applied to the surface of the biodegradable plastic article and left on the surface is not particularly limited, and the type and properties of the nonionic surfactant used, the biodegradable plastic article A person skilled in the art can appropriately determine an optimum method according to the type and shape of the device. For example, it is possible to obtain a sufficient effect by dissolving a nonionic surfactant in water or Tris-HCl buffer and immersing the biodegradable plastic article therein. In addition, it is also possible to apply to biodegradable plastic articles by a form for application or spraying (spray agent or the like).
また、上記の方法に、前記残存している活性抑制剤を前記生分解性プラスチック物品の表面から取り除く工程を組み合わせることにより、生分解性プラスチックの分解を制御することが可能となる。即ち、生分解性プラスチック物品の表面に前述の非イオン性界面活性剤を施すことにより生分解性プラスチックの分解を抑制し、また、界面活性剤を剥離することで分解を促進させることの組み合わせにより、生分解性プラスチックの使用中、及び使用後に、その分解速度を制御することが可能になる。
活性抑制剤を生分解性プラスチック物品の表面から取り除く工程は、例えば、使用した非イオン性界面活性剤が溶解する溶媒（例えば脂溶性が高いMELの場合はエタノールなど）や、非イオン性界面活性剤が分解する溶液（例えば糖脂質系のMELなどでは、エタノール、希アルカリ溶液、0.5M程度のトリス塩酸バッファーpH8.8や、尿素溶液など）に浸漬、散布、塗布する方法を用いることができる。さらに、非イオン性界面活性剤が分解するような生物的処理を用いることもできる。例えば、MEL等の糖脂質を分解する方法としては、油分解酵素であるリパーゼや、リパーゼ生産微生物による処理が考えられる。また、細菌などが生産するリパーゼがTween 20を分解することが知られており（Saeed HM, et. al., Biotechnology 5 (1), 62, (2006)）、この知見に基づきリパーゼを使用して生分解性プラスチックの表面上のTween 20を取り除くことも可能である。
Moreover, it becomes possible to control decomposition | disassembly of a biodegradable plastic by combining the process of removing the said remaining activity inhibitor from the surface of the said biodegradable plastic article in said method. That is, by combining the above-described nonionic surfactant on the surface of the biodegradable plastic article to suppress the decomposition of the biodegradable plastic, and by promoting the decomposition by peeling the surfactant. It is possible to control the rate of degradation during and after use of the biodegradable plastic.
The step of removing the activity inhibitor from the surface of the biodegradable plastic article is, for example, a solvent in which the used nonionic surfactant is dissolved (for example, ethanol in the case of MEL with high fat solubility), nonionic surfactant It is possible to use a method in which the agent decomposes (for example, in the case of glycolipid-based MEL, it is immersed, sprayed and applied in ethanol, dilute alkaline solution, about 0.5M Tris-HCl buffer pH 8.8, urea solution, etc.) . In addition, biological treatments that degrade the nonionic surfactant can be used. For example, as a method for degrading glycolipids such as MEL, treatment with a lipase that is an oil-degrading enzyme or a lipase-producing microorganism can be considered. In addition, it is known that lipases produced by bacteria and the like degrade Tween 20 (Saeed HM, et. Al., Biotechnology 5 (1), 62, (2006)). It is also possible to remove Tween 20 on the surface of the biodegradable plastic.
さらに、糸状菌によるプラスチックの分解（浸食）の多くが、ポリエステルの分解によって生じることが知られており、本発明の活性抑制剤でポリエステル分解酵素の分解活性を抑制することで、プラスチックに生えるカビを抑えることも可能となる。
また、植物病原性真菌による植物への侵入にもクチナーゼが必要であるころが知られており、本発明の活性抑制剤でその活性を抑えることにより植物の病害防除に用いることも可能となる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
Furthermore, it is known that most of the degradation (erosion) of plastics caused by filamentous fungi is caused by the degradation of polyester, and the mold that grows on plastics by suppressing the degradation activity of the polyester-degrading enzyme with the activity inhibitor of the present invention. It is also possible to suppress this.
In addition, it is known that cutinase is also necessary for plant invasion by phytopathogenic fungi, and it can be used for controlling diseases of plants by suppressing its activity with the activity inhibitor of the present invention.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
１．酵母シュードザイマアンタークティカJCM10317由来の生分解性プラスチック分解酵素活性に対する非イオン性界面活性剤の影響
PBSAエマルジョン（昭和高分子 ビオノーレEM-301)を含む20mM トリス塩酸緩衝液 pH6.8 1.9mlに各種濃度の界面活性剤 10μlを加え、生分解性プラスチック分解酵素溶液20μl〜100μl（酵母シュードザイマアンタークティカJCM10317培養液から調製したもの）を加え、PBSAエマルジョン水溶液の吸光度(OD600)を測定した。酵素によるPBSAエマルジョン分解に伴う吸光度の減少量が界面活性剤の種類と濃度でどの程度変化するのか解析した。従って、グラフ中の線の傾きが大きく下がるものは、生分解性プラスチック分解酵素によりエマルジョンが分解していることを示し、線の傾きが緩いものは分解酵素による分解が抑制されていることを示している（図１、図２）。また、図３、図４に示す実験では、全体の液量を1/10 (200μl)にし、96穴マイクロプレート内で反応させた。
1. Effect of nonionic surfactants on biodegradable plastic-degrading enzyme activity from yeast pseudozyma antarctica JCM10317
10 μl of various concentrations of surfactant is added to 1.9 ml of 20 mM Tris-HCl buffer pH6.8 containing PBSA emulsion (Showa Polymer Bionore EM-301), and 20 μl to 100 μl of biodegradable plastic degrading enzyme solution (Yeast Pseudozyma Antak) (Prepared from Tika JCM10317 culture solution) was added, and the absorbance (OD 600 ) of the PBSA emulsion aqueous solution was measured. We analyzed how the amount of decrease in absorbance due to enzyme degradation of PBSA emulsion changes with the type and concentration of surfactant. Therefore, when the slope of the line in the graph is greatly reduced, it indicates that the emulsion has been degraded by the biodegradable plastic degrading enzyme, and when the slope of the line is slow, it indicates that degradation by the degrading enzyme is suppressed. (FIGS. 1 and 2). In the experiments shown in FIGS. 3 and 4, the total liquid volume was reduced to 1/10 (200 μl) and reacted in a 96-well microplate.
（図１）
・反応液中の界面活性剤 250mg/L
・各界面活性剤のcmc濃度(mg/L)
N-ドデシル-β-D-マルトシド 87
シュークロースモノラウリン酸 210
（図２）
・界面活性剤 cmc濃度(mg/L) 反応液中の濃度(mg/L)
Tween20 74 250
Tween80 16 250
TritonX100 151 250
N-オクチルグルコシド 7300 10000
(Figure 1)
・ Surfactant in reaction solution 250mg / L
・ Ccm concentration of each surfactant (mg / L)
N-dodecyl-β-D-maltoside 87
Sucrose monolauric acid 210
(Figure 2)
・ Surfactant cmc concentration (mg / L) Concentration in reaction solution (mg / L)
Tween20 74 250
Tween80 16 250
TritonX100 151 250
N-octylglucoside 7300 10000
（図３：ソホロリピッドによる阻害）
使用した界面活性剤の詳細は以下の通り。
・SL-mix（SL-lacとSL-acの混合物）
グルコース、オリーブ油、オレイン酸を原料として、スターメレラ（キャンディダ）ボンビコーラを培養した結果得られた培養液から、酢酸エチルで油溶性成分を抽出し、抽出液についてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで原料由来の油脂、脂肪酸などを除去して回収したMEL混合物。酸型（３４％）、ラクトン型（６６％）。脂肪酸組成は、C18（９３％）、C16（２％）。
・SL-lac（非イオン性界面活性剤）
上記SL混合物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製して得られたラクトン型SL。脂肪酸組成は上記に同じ。
・SL-ac（陰イオン性界面活性剤）
上記SL混合物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製して得られた酸型SL。脂肪酸組成は上記に同じ。
各界面活性剤のcmc濃度(mg/L)は以下の通り。
SL（ソホロリピッド Lac:ラクトン型） 11
SL（ソホロリピッド ac:酸化型） 95
mix:混合物 17
(Figure 3: Inhibition by sophorolipid)
Details of the surfactant used are as follows.
・ SL-mix (a mixture of SL-lac and SL-ac)
Glucose, olive oil, and oleic acid as raw materials, from the culture solution obtained as a result of culturing star melera (Candida) Bonbicola, oil-soluble components are extracted with ethyl acetate, and the oil and fat derived from the raw materials by silica gel column chromatography for the extract, MEL mixture recovered by removing fatty acids. Acid type (34%), lactone type (66%). The fatty acid composition is C18 (93%), C16 (2%).
・ SL-lac (nonionic surfactant)
Lactone type SL obtained by separating and purifying the above SL mixture by silica gel column chromatography. The fatty acid composition is the same as above.
・ SL-ac (anionic surfactant)
Acid SL obtained by separating and purifying the SL mixture by silica gel column chromatography. The fatty acid composition is the same as above.
The cmc concentration (mg / L) of each surfactant is as follows.
SL (Sophorolipid Lac: lactone type) 11
SL (Sophorolipid ac: oxidized type) 95
mix: Mixture 17
ソホロリピッドでは、非イオン界面活性剤であるSL-Lacを用いた場合に、5mg/L以上の濃度で生分解性プラスチック分解を抑制する効果が得られる。一方、陰イオン性界面活性剤であるac型では、125mg/Lの濃度であっても抑制効果が無い。また、SL-LacとSL-acが混合されたSL-mixでは、SL-Lacに比べると少し弱いが、12.5mg/L以上の濃度で生分解性プラスチック分解を抑制する効果を得ることができる。 Sophorolipid has the effect of suppressing biodegradable plastic degradation at a concentration of 5 mg / L or more when SL-Lac, which is a nonionic surfactant, is used. On the other hand, ac type which is an anionic surfactant has no inhibitory effect even at a concentration of 125 mg / L. In addition, SL-mix in which SL-Lac and SL-ac are mixed is slightly weaker than SL-Lac, but it can achieve the effect of suppressing biodegradable plastic degradation at a concentration of 12.5 mg / L or higher. .
（図４：マンノシルエリスリトールリピッドによる阻害）
使用した界面活性剤の詳細は以下の通り。
・MEL
大豆油を原料として、シュードザイマ・アンタークティカを培養した結果得られた培養液から、酢酸エチルで油溶性成分を抽出し、抽出液についてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで原料由来の油脂、脂肪酸などを除去して回収したMEL混合物。
MEL-A、MEL-B、MEL-Cの混合物であり、その組成はMEL-Aが７０％。２本ある脂肪酸の鎖長は、C8（３０％）、C10（５４％）、C12（１０％）の組成。
cmc濃度：1.8 (mg/L)。
・MEL-A、MEL-B、MEL-C
上記MEL混合物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製したもの。
脂肪酸組成は上記に同じ。構造式は前述の通り（脂肪酸鎖R1はC8〜C12が主成分）。
・MEL-Bｔ
シュードザイマ・ツクバエンシスが生産したMEL-Bの精製物（T. Fukuoka, et al., Carbohyd. Res., 343, 555 (2008)）。脂肪酸組成はC8（２９％）、C10（４％）、C12（２４％）、C14（３６％）。構造式は前述のMEL-B（脂肪酸鎖R1はC8〜C1４が主成分）。
(FIG. 4: Inhibition by mannosyl erythritol lipid)
Details of the surfactant used are as follows.
・ MEL
Oil-soluble components are extracted with ethyl acetate from the culture solution obtained by cultivating Pseudozyma antarctica using soybean oil as a raw material, and the oil and fat and fatty acids derived from the raw material are removed from the extract by silica gel column chromatography. Recovered MEL mixture.
It is a mixture of MEL-A, MEL-B and MEL-C, and its composition is 70% of MEL-A. The chain length of the two fatty acids is C8 (30%), C10 (54%), and C12 (10%).
cmc concentration: 1.8 (mg / L).
・ MEL-A, MEL-B, MEL-C
The above MEL mixture is separated and purified by silica gel column chromatography.
The fatty acid composition is the same as above. The structural formula is as described above (the fatty acid chain R 1 is mainly composed of C8 to C12).
・ MEL-Bt
A purified product of MEL-B produced by Pseudozyma Tsukubaensis (T. Fukuoka, et al., Carbohyd. Res., 343, 555 (2008)). The fatty acid composition is C8 (29%), C10 (4%), C12 (24%), C14 (36%). The structural formula is the aforementioned MEL-B (the fatty acid chain R 1 is mainly composed of C8 to C14).
マンノシルエリスリトールリピッドは、今回用いたMEL-A、MEL-B、MEL-C、これらの混合物であるMEL、MEL-Btは、いずれも5mg/L以上の濃度で生分解性プラスチック分解を抑制する効果を得ることができる。これらの中で、特に、混合物であるMELから精製されたMEL-CおよびMEL-Bでは、混合物に比べて生分解性プラスチックによる分解抑制効果が高く、MEL-CはMEL-Bよりもさらに高い抑制効果を得ることができる。シュードザイマ・ツクバエンシス由来のMEL-Btは、MEL-AやMEL(混合物)に比べると少し弱いが、5mg/L以上の濃度で生分解性プラスチック分解を抑制する効果を得ることができる。 Mannosyl erythritol lipid has the effect of suppressing biodegradable plastic degradation at concentrations of 5 mg / L or more for MEL-A, MEL-B, and MEL-C, and their mixtures, MEL and MEL-Bt. Can be obtained. Among these, in particular, MEL-C and MEL-B purified from the mixture MEL have a higher effect of inhibiting degradation by biodegradable plastics than the mixture, and MEL-C is even higher than MEL-B. An inhibitory effect can be obtained. MEL-Bt derived from Pseudozyma tsukubaensis is slightly weaker than MEL-A or MEL (mixture), but can obtain an effect of suppressing biodegradable plastic degradation at a concentration of 5 mg / L or more.
２．糸状菌47-9（受託番号NITE P-753）由来の生分解性プラスチック分解酵素活性に対する界面活性剤の影響
PBSAエマルジョン（昭和高分子 ビオノーレEM-301)を含む20mM トリス塩酸緩衝液 pH6.8 1.9mlに各種濃度の非イオン性界面活性剤（MEL及びTween20）10μlを加え、生分解性プラスチック分解酵素溶液20μl〜100μl（糸状菌47-9培養液から調製したもの）を加え、PBSAエマルジョン水溶液の吸光度(OD600)を測定した。酵素によるPBSAエマルジョン分解に伴う吸光度の減少量が界面活性剤の種類と濃度でどの程度変化するのか解析した（図５）。
2. Effect of surfactants on biodegradable plastic-degrading enzyme activity from filamentous fungus 47-9 (Accession number NITE P-753)
10μl of non-ionic surfactants (MEL and Tween20) of various concentrations are added to 1.9ml of 20mM Tris-HCl buffer pH6.8 containing PBSA emulsion (Showa Polymer Bionore EM-301), and 20μl of biodegradable plastic degrading enzyme solution ˜100 μl (prepared from the culture solution of filamentous fungus 47-9) was added, and the absorbance (OD 600 ) of the PBSA emulsion aqueous solution was measured. We analyzed how much the amount of decrease in absorbance due to enzyme degradation of PBSA emulsion changes with the type and concentration of surfactant (FIG. 5).
糸状菌47-9由来の生分解性プラスチック分解酵素は、PaEとは異なる構造と基質特異性を有する（特願2008-250869）が、MELやTween80ではcmc値を超える5mg/L以上の濃度で生分解性プラスチックの分解が抑制された。 The biodegradable plastic degrading enzyme derived from filamentous fungus 47-9 has a structure and substrate specificity different from PaE (Japanese Patent Application No. 2008-250869), but at a concentration of 5 mg / L or more exceeding the cmc value in MEL and Tween80 Degradation of biodegradable plastic was suppressed.
以上の１、２に示す通り、酵母シュードザイマアンタークティカJCM10317及び糸状菌47-9由来の生分解性プラスチック分解酵素の活性阻害実験の結果より、マンノシルエリスリトールリピッド、ソホロリピッド、Triton X100、Tween 20、Tween 80、N-ドデシル-β-D-マルトシド、シュークロースモノラウリン酸は、いずれもcmc濃度以上で、生分解性プラスチック分解酵素の活性を阻害することが確認された。
以上より、非イオン性界面活性剤は、cmc値以上の条件下で、クチナーゼ類似構造を有する生分解性プラスチック分解酵素のエステル結合分解活性阻害剤として用いることができることが分かった。
As shown in the above 1 and 2, from the results of the activity inhibition experiment of the biodegradable plastic degrading enzyme derived from yeast pseudozyma antarctica JCM10317 and filamentous fungus 47-9, mannosyl erythritol lipid, sophorolipid, Triton X100, Tween 20, It was confirmed that Tween 80, N-dodecyl-β-D-maltoside, and sucrose monolauric acid all inhibit the activity of the biodegradable plastic degrading enzyme at a cmc concentration or higher.
From the above, it was found that the nonionic surfactant can be used as an ester bond degradation activity inhibitor of a biodegradable plastic degrading enzyme having a cutinase-like structure under conditions of a cmc value or more.
３．非イオン性界面活性剤による生分解性プラスチック分解の阻害
PBSA膜（ビオノーレ3020から100mg/27cm2となるように自作したものを1cm角に切断したもの）を0.8%MELを含む20mMトリス塩酸バッファーpH6.8 内に１分間浸漬後、膜を取り出して、2ml の20mMトリス塩酸バッファーpH6.8で２回洗浄した。また、8%MEL100μlをガラス試験管に入れ、エタノールを蒸発させた。前処理をしないPBSA膜、MEL処理済PBSA膜を各々ガラス試験管に入れたもの、前処理をしないPBSA膜を、MEL処理をしたガラス試験管に入れた物３種類を用意し、各々20mMトリス塩酸バッファーpH6.8 2ml、酵母シュードザイマアンタークティカJCM10317培養液から精製した生分解性プラスチック分解酵素(PaE)100μlを加え、３０℃で一夜振とうした。その結果、水に溶解したMELにPBSA等の生分解性プラスチック膜を数秒間浸すだけで、生分解性プラスチックは生分解性プラスチック分解酵素で分解されなくなった（図６）。
3. Inhibition of biodegradable plastic degradation by nonionic surfactants
1 minute after immersion in PBSA film (Bionolle 3020 that cut what you own so that 100 mg / 27cm 2 to 1cm square of) the in 20mM Tris-HCl buffer pH6.8 containing 0.8% MEL, take out the film, Washed twice with 2 ml of 20 mM Tris-HCl buffer pH 6.8. Further, 100 μl of 8% MEL was put in a glass test tube to evaporate ethanol. Prepare 3 types of PBSA membrane without pre-treatment and MEL-treated PBSA membrane each in a glass test tube and PBSA membrane without pre-treatment in a glass test tube with MEL treatment, each 20 mM Tris 2 ml of hydrochloric acid buffer pH6.8, 100 μl of biodegradable plastic degrading enzyme (PaE) purified from the culture solution of yeast pseudozyma antarctica JCM10317 was added and shaken at 30 ° C. overnight. As a result, the biodegradable plastic was not decomposed by the biodegradable plastic-degrading enzyme only by immersing a biodegradable plastic film such as PBSA for several seconds in MEL dissolved in water (FIG. 6).
次に、上記と同様にPBSA膜（ビオノーレ3020から100mg/27cm2となるように自作したものを1cm角に切断したもの）を作成し、MEL(0.8-0.0008%)を含む20mMトリス塩酸バッファーpH6.8 内に１分間浸漬後、膜を取り出して、2ml の20mMトリス塩酸バッファーpH6.8で２回洗浄した。20mMトリス塩酸バッファーpH8.8 1ml中に酵母シュードザイマアンタークティカJCM10317培養液から精製した生分解性プラスチック分解酵素25μlを加え、25℃で1時間振とうした。その結果、上記の阻害活性はMEL濃度依存的であることが分かった（図７）。 Next, in the same manner as above, a PBSA membrane (made from Bionore 3020 to 100 mg / 27 cm 2 and cut into 1 cm square) was prepared, and 20 mM Tris-HCl buffer pH 6 containing MEL (0.8-0.0008%) After soaking in .8 for 1 minute, the membrane was removed and washed twice with 2 ml of 20 mM Tris-HCl buffer pH 6.8. 25 μl of biodegradable plastic degrading enzyme purified from the culture solution of yeast pseudozyma antarctica JCM10317 was added to 1 ml of 20 mM Tris-HCl buffer pH 8.8, and shaken at 25 ° C. for 1 hour. As a result, it was found that the above inhibitory activity was MEL concentration-dependent (FIG. 7).
４．PBSA膜への蛍光MELの結合
蛍光MEL（NDB結合MEL（Ueno Y, et. al. J. Controlled Realease 123, 247 (2007))を水に懸濁し、PBSA膜（ビオノーレ3001 0.2μm)上に10μl滴下した。風乾後、1mlの20mMトリス塩酸バッファーpH6.8で２回洗浄した場合と、洗浄前に100%エタノールで１回洗浄後、バッファーで洗浄したものを作成し、蛍光顕微鏡（BP485/20フィルター）で蛍光MELのスポットを観察したところ、MELによる皮膜が生分解性プラスチック表面を覆い、水（緩衝液）による洗浄では、MELが剥離しないことが確認された（図８）。
4). Binding of fluorescent MEL to PBSA membrane Fluorescent MEL (NDB-bound MEL (Ueno Y, et. Al. J. Controlled Realease 123, 247 (2007)) was suspended in water and 10 μl on PBSA membrane (Bionore 3001 0.2 μm) Air-dried, washed twice with 1 ml of 20 mM Tris-HCl buffer pH 6.8, and washed once with 100% ethanol before washing, then washed with buffer, and prepared with a fluorescence microscope (BP485 / 20 When a fluorescent MEL spot was observed with a filter, it was confirmed that the MEL film covered the biodegradable plastic surface, and that MEL did not peel off when washed with water (buffer solution) (FIG. 8).
５．抑制剤を取り除くことによる生分解性プラスチック分解性の回復
PBSA膜（ビオノーレ3001 0.2μm)およびPBS膜（ビオノーレ1001 0.2μm)を2cm角に切断した。0.8%MELを含む20mMトリス塩酸バッファーpH6.8 内に１分間浸漬後、膜を取り出して、2ml の20mMトリス塩酸バッファーpH6.8で２回洗浄した。または、MEL処理後、100%エタノールで１分間または、0.5Mトリス塩酸バッファーpH8.8で１時間浸浸後、トリス塩酸バッファーpH6.8で２回洗浄した。生分解性プラスチック分解活性が確認されている酵母シュードザイマアンタークティカJCM10317を、寒天培地*1の表面に塗布後、３０℃一夜培養した上に、これらの膜を乗せて、３０℃で培養を継続させた。PBSAは１，２日間PBSは５，７日培養後、膜を取り出し、残存する膜の量を輝度増加量*2から算出した（図９）。
5). Recovery of biodegradable plastic degradability by removing inhibitors
PBSA membrane (Bionore 3001 0.2 μm) and PBS membrane (Bionore 1001 0.2 μm) were cut into 2 cm squares. After immersing in 20 mM Tris-HCl buffer pH 6.8 containing 0.8% MEL for 1 minute, the membrane was taken out and washed twice with 2 ml of 20 mM Tris-HCl buffer pH 6.8. Alternatively, after MEL treatment, the sample was immersed in 100% ethanol for 1 minute or 0.5 M Tris-HCl buffer pH 8.8 for 1 hour, and then washed twice with Tris-HCl buffer pH 6.8. After applying yeast Pseudozyma antarctica JCM10317, which has been confirmed to have biodegradable plastic degrading activity, to the surface of an agar medium * 1 , culture it at 30 ° C overnight, place these membranes on it, and culture at 30 ° C. Continued. PBSA was cultured for 1 or 2 days after PBS was cultured for 5 or 7 days, the membrane was taken out, and the amount of the remaining membrane was calculated from the increase in luminance * 2 (FIG. 9).
*1
培地組成 酵母用誘導型酵素生産株選択培地 (FMM: Fungi Minimum Medium)
下層
NaNO3 0.2 (%)
KH2PO4 0.02
MgSO4・7H2O 0.02
酵母エキス(ディフコ社) 0.1
水道水
寒天 1.5
上層B PBSAエマルジョン* 1.0 (%)
[ビオノーレエマルジョンEM-301 (PBSA)]
大豆油（和光純薬） 1.0
寒天 1.5
* 1
Medium composition Inducible enzyme production strain selection medium for yeast (FMM: Fungi Minimum Medium)
Underlayer
NaNO 3 0.2 (%)
KH 2 PO 4 0.02
MgSO 4・ 7H 2 O 0.02
Yeast extract (Difco) 0.1
Tap water
Agar 1.5
Upper layer B PBSA emulsion * 1.0 (%)
[Bionole emulsion EM-301 (PBSA)]
Soybean oil (Wako Pure Chemical Industries) 1.0
Agar 1.5
*2 画像解析は以下のプロトコールに従った。
市販のスキャナー透過原稿ポジフィルムモードで膜をスキャンする。解析にAquacosmos ver2.0（浜松ホトニクス）を用いる場合は、画像をTIFFファイル（グレースケール）で保存する。Aquacosmos上でファイルを開き、計測ウインドウでツールバーを選択して、ドラッグでプラスチック膜の絵を一枚囲う。「前回と同じ計測ウインドウを作成」を選んで、取り込んだ画像上の全ての膜を、同じ大きさの独立した計測ウインドウとして選定する。また、この時に未処理の膜および、膜のない白色に抜けた場所も、コントロールとして同じように囲う。解析メニュー内の「領域解析」から各領域の輝度の計算を行う。コントロールをもとに、膜の分解量を計算する。
（計測した膜の輝度−未分解膜の輝度）／（白い画面の輝度−未分解膜の輝度）X100＝分解(%)
* 2 Image analysis followed the following protocol.
The film is scanned in a commercial scanner transparency original positive film mode. When using Aquacosmos ver2.0 (Hamamatsu Photonics) for analysis, save the image as a TIFF file (grayscale). Open the file on Aquacosmos, select the toolbar in the measurement window, and drag to enclose a piece of plastic film. Select “Create same measurement window as last time” and select all the films on the captured image as independent measurement windows of the same size. At this time, the untreated film and the white spot without film are also enclosed in the same manner as a control. The brightness of each region is calculated from “Area Analysis” in the analysis menu. Based on the control, calculate the amount of membrane degradation.
(Measured film brightness-brightness of undegraded film) / (white screen brightness-brightness of undegraded film) X100 = decomposition (%)
図７より、生分解性プラスチック分解菌を培養している表面に生分解性プラスチック(PBSA)のフィルムを接触させると、３０℃で通常は翌日からPBSAが分解されるが、MELで処理したフィルムは分解されなかった。MELはエタノールによく溶解する。また、MELは糖と脂質がエステル結合した構造を持ち、エステル結合は一般的にアルカリ条件下で切断されやすい。MELを剥離させる方法を検討した結果、エタノールや希アルカリ溶液で膜を洗浄することで、生分解性プラスチック分解活性が高まることが明らかになった。
また、酵母シュードザイマアンタークティカのリパーゼ（Lipozyme CALBL ノボザイム社）がTween 20を分解することが確認されているため（図１０）、このリパーゼはTween 20 を適用した生分解性プラスチックの分解性を回復させるために使用させることができると考えられる。
According to FIG. 7, when a biodegradable plastic (PBSA) film is brought into contact with the surface on which biodegradable plastic-degrading bacteria are cultured, PBSA is usually degraded at 30 ° C. from the next day. Was not decomposed. MEL dissolves well in ethanol. MEL has a structure in which sugar and lipid are ester-bonded, and the ester bond is generally easily cleaved under alkaline conditions. As a result of investigating the method of peeling MEL, it became clear that the biodegradable plastic degradation activity is enhanced by washing the membrane with ethanol or dilute alkaline solution.
In addition, since it has been confirmed that the yeast Pseudozyma antarctica lipase (Lipozyme CALBL Novozyme) degrades Tween 20 (Fig. 10), this lipase exhibits the degradability of biodegradable plastics to which Tween 20 is applied. It can be used to recover.
６．ポリ乳酸及びポリウレタンの分解の抑制
（ポリ乳酸の分解抑制）
10穴ガラスプレートの各ウェルにポリマー20μL（1%となるようジクロロメタンに溶解）をのせ、溶媒を揮発させて膜を形成させた。そのうち半数のウェルには、10μLの0.8% MEL溶液をのせて５分間処理した後ミリQ水にて洗浄し風乾した。各ポリマー膜にPaE粗酵素溶液（20 mM Tris pH8.8にて希釈）を50μLずつのせて30℃で２日間反応させた。
反応後の溶液を回収し20ｍLミリQ水にて希釈した後、0.45μmのテフロン（登録商標）フィルターにて濾過した後、溶液中の全有機炭素量をTOC-V（SHIMADZU）にて測定した。実験は３連で行いその平均値から、酵素を入れないものおよび酵素のみの値を対照値とし、それらを差し引いてTOC値とした。
6). Suppression of polylactic acid and polyurethane degradation (inhibition of polylactic acid degradation)
20 μL of polymer (dissolved in dichloromethane to 1%) was placed in each well of a 10-well glass plate, and the solvent was evaporated to form a film. Half of the wells were treated with 10 μL of 0.8% MEL solution for 5 minutes, washed with milliQ water and air-dried. 50 μL of PaE crude enzyme solution (diluted with 20 mM Tris pH 8.8) was placed on each polymer membrane and reacted at 30 ° C. for 2 days.
The solution after the reaction was collected and diluted with 20 mL milliQ water, filtered through a 0.45 μm Teflon (registered trademark) filter, and the total amount of organic carbon in the solution was measured with TOC-V (SHIMADZU). . The experiment was performed in triplicate, and from the average value, the value without the enzyme and the value of the enzyme alone were taken as control values, and these were subtracted to obtain the TOC value.
（PaE酵素によるポリウレタンの分解）
10穴ガラスプレートの各ウェルにポリマー10μLをのせ、溶媒を揮発させて膜を形成させた。各ポリマー膜にPaE粗酵素溶液（20 mM Tris pH8.8にて希釈）を50μLずつのせて30℃で40時間間反応させた。
反応後の溶液を回収し20ｍLミリQ水にて希釈した後、0.45μmのテフロン（登録商標）フィルターにて濾過した後、溶液中の全有機炭素量をTOC-V（SHIMADZU）にて測定した。実験は３連で行いその平均値から、酵素を入れないものおよび酵素のみの値を対照値とし、それらを差し引いてTOC値とした。
(Degradation of polyurethane by PaE enzyme)
10 μL of polymer was placed in each well of a 10-well glass plate, and the solvent was volatilized to form a film. 50 μL of PaE crude enzyme solution (diluted with 20 mM Tris pH 8.8) was placed on each polymer membrane and reacted at 30 ° C. for 40 hours.
The solution after the reaction was collected and diluted with 20 mL milliQ water, filtered through a 0.45 μm Teflon (registered trademark) filter, and the total amount of organic carbon in the solution was measured with TOC-V (SHIMADZU). . The experiment was performed in triplicate, and from the average value, the value without the enzyme and the value of the enzyme alone were taken as control values, and these were subtracted to obtain the TOC value.
PBSA膜もPBS膜もMEL処理によりシュードザイマ・アンタークティカ生分解性プラスチック分解酵素（PaE）による分解活性が抑制された。PaEはポリ乳酸(PLA)を分解することができるが、その分解活性も同様にMEL処理により抑えられた（図１１）。また、PaEはポリウレタンも分解しすることも確認されており（図１２）、同様にMELはポリウレタンの分解を抑制すると考えられる。 In both PBSA and PBS membranes, degradation activity by Pseudozyma antarctica biodegradable plastic degrading enzyme (PaE) was suppressed by MEL treatment. PaE can degrade polylactic acid (PLA), but its degradation activity was similarly suppressed by MEL treatment (FIG. 11). In addition, it has been confirmed that PaE also decomposes polyurethane (FIG. 12), and similarly, MEL is considered to suppress the decomposition of polyurethane.
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|---|---|---|---|---|
| JPH05184390A (en) * | 1992-01-16 | 1993-07-27 | Fujitsu Ltd | Method for stopping enzyme reaction |
| JPH10210999A (en) * | 1997-01-29 | 1998-08-11 | Eiken Chem Co Ltd | Inhibition of activity of esterase |
| JP2006255290A (en) * | 2005-03-18 | 2006-09-28 | Seiko Pmc Corp | Surfactant, deodorizer, deodorization material, and deodorization method |
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