JP4722386B2

JP4722386B2 - Glycolipid and method for producing the same

Info

Publication number: JP4722386B2
Application number: JP2003298081A
Authority: JP
Inventors: 史登松浦; 雅也太田; 正弘玉井; 幸吉田村
Original assignee: Hiroshima Prefecture; Maruzen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hiroshima Prefecture; Maruzen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-08-22
Filing date: 2003-08-22
Publication date: 2011-07-13
Anticipated expiration: 2023-08-22
Also published as: JP2005104837A

Description

本発明は、新規なマンノースとマンニトールを構成要素とする二糖類と脂肪酸が結合した糖脂質及びその発酵製造方法に関するものである。 The present invention relates to a novel glycolipid in which a disaccharide and a fatty acid having mannose and mannitol as constituents are combined and a method for producing the same by fermentation.

糖脂質は、脂質に１〜１０数個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系・免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていること等が明らかにされつつある。一方で、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する物質は界面活性物質と呼ばれている。石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤（バイオサーファクタント）を利用してきたが、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、界面活性剤の生産量は飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となった。しかしながら、その使用量の拡大につれて環境汚染が広がってきた。そこで、安全性が高く、環境に対する負荷を低減するために生分解性の高い界面活性物質の開発が望まれていた。 Glycolipids are substances in which 1 to 10 monosaccharides are bound to lipids, are involved in the transmission of information between cells in vivo, and play an important role in maintaining the functions of the nervous system and immune system. Etc. are being revealed. On the other hand, glycolipids are amphipathic substances that have both hydrophilic properties derived from the properties of sugars and lipophilic properties derived from the properties of lipids. being called. Until the petrochemical industry prospered, surfactants derived from biological components such as lecithin and saponin (biosurfactants) have been used, but synthetic surfactants have been developed due to the development of the petrochemical industry. Production has increased dramatically, making it an indispensable substance in daily life. However, environmental pollution has spread as the amount of use has increased. Therefore, it has been desired to develop a highly biodegradable surfactant in order to reduce safety and the burden on the environment.

現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子化合物系の５つに分類されている。この内の糖脂質系の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母による多くの種類の物質が報告されている。 Currently, surfactants produced by microorganisms are classified into five groups: glycolipids, acylpeptides, phospholipids, fatty acids, and polymer compounds. Of these, the glycolipid-based surfactants have been studied the most, and many types of substances from bacteria and yeast have been reported.

ラムノリピッドは、結核菌の抗生物質としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナスアエルジノーサ）（緑膿菌）の培養液から最初に発見された（非特許文献１参照）。以来、これまでにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属の細菌から４種類の同族体が報告され、当初は数ｇ／Ｌ程度の生産量であったが、現在では１００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献２参照）。 Rhamnolipid was first discovered from a culture solution of Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa) as an antibiotic of Mycobacterium tuberculosis (see Non-Patent Document 1). Since then, four homologs have been reported from bacteria of the genus Pseudomonas (Pseudomonas), and the initial production was about several g / L, but now it is possible to produce over 100 g / L. (Refer nonpatent literature 2).

ソホロースリピッドは、Ｃａｎｄｉｄａ（以前はＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）ｂｏｍｂｉｃｏｌａ（キャンデダボンビコーラ）の培養液から発見された（非特許文献３参照）。これ以外に、Ｃａｎｄｉｄａａｐｉｃｏｌａも生産し、脂肪酸の結合様式によりラクトン型と線状型の２種類が報告されている。現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献４及び５参照）。 Sophorose lipid was discovered from the culture solution of Candida (formerly Torulopsis) bombicola (Candida Bonbicola) (see Non-Patent Document 3). In addition to this, Candida apicola is also produced, and two types, lactone type and linear type, have been reported depending on the fatty acid binding mode. At present, production of 300 g / L or more is enabled (see Non-Patent Documents 4 and 5).

トレハロースリピッドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コリネバクテリウム）等の細胞表層物質として発見された。類似の物質が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（マイコバクテリウム）、Ｎｏｃａｒｄｉａ（ノカルディア）、Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ロドコッカス）属細菌からも報告されている（非特許文献６参照）。一般に、細胞壁に結合しているために生産量は低いが、Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ロドコッカスエリスロポリス）を窒素制限下で培養を行うとサクシノイルトレハロースリピッドを３２ｇ／Ｌ生産することが報告されている（非特許文献７参照）。 Trehalose lipid has been discovered as a cell surface material such as Corynebacterium. Similar substances have also been reported from bacteria belonging to the genus Mycobacterium (Nocodia), Nocardia (Nocardia), and Rhodococcus (see Non-Patent Document 6). In general, production is low due to binding to the cell wall, but it has been reported that when Rhodococcus erythropolis is cultured under nitrogen restriction, 32 g / L of succinoyl trehalose lipid is produced (non-nose). (See Patent Document 7).

マンノシルエリスリトールリピッドは、Ｕｓｔｉｌａｇｏｎｕｄａ（ウスチラゴヌーダ）とＳｈｉｚｏｎｅｌｌａｍｅｌａｎｏｇｒａｍｍａ（シゾネラメラノグラマ）から発見された（非特許文献８及び９参照）。その後、イタコン酸生産の変異株であるＣａｎｄｉｄａ属酵母（特許文献１及び非特許文献１０参照）、Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ（キャンデダアンダークチカ）（非特許文献１１及び１２参照）、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ（クルツマノマイセス）属（非特許文献１３参照）等の酵母が生産することを報告している。現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている。 Mannosyl erythritol lipid was discovered from Ustilago nuda (Ustyago Nuda) and Shizonella melanogramma (see Non-Patent Documents 8 and 9). Subsequently, Candida genus yeast (see Patent Document 1 and Non-patent Document 10), Candida antarctica (see Candida Andalucica) (see Non-Patent Documents 11 and 12), and Kurtzmanomices (Kurzmanomyces) genus (mutants of itaconic acid production) It is reported that yeast such as Non-Patent Document 13) produces. At present, production of 300 g / L or more is possible.

セロビオースリピッドは、Ｕｓｔｉｌａｇｏｍａｙｄｉｓ（ウスチラゴマイディス）により１５ｇ／Ｌ（非特許文献１４及び１５参照）、オリゴ糖リピッドは、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ（ツカムレラ）属の酵母により３０ｇ／Ｌ生産される（非特許文献１６参照）ことが報告されている。 Cellobiose lipid is produced at 15 g / L (see Non-Patent Documents 14 and 15) by Ustilago maydis (Ustyago Mydis), and oligosaccharide lipid is produced at 30 g / L by yeast belonging to the genus Tsukamurella (see Non-Patent Document 16). It has been reported.

糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及を図るためには、多くの種類のバイオサーファクタントが必要である。しかしながら、現在までに発見されているバイオサーファクタントの種類は、２０数種類と少なく、新規のバイオサーファクタントの発見が望まれている。 Biosurfactants such as glycolipids are said to have high biodegradability, low toxicity, environmental friendliness, and novel physiological functions. For this reason, many types of biosurfactants are required for widespread use in the food industry, cosmetics industry, pharmaceutical industry, chemical industry, environmental fields, and the like. However, there are as few as 20 types of biosurfactants discovered so far, and the discovery of new biosurfactants is desired.

特公昭６０−２４７９７号公報Japanese Patent Publication No. 60-24797 エフ．ジー．ジャービス（Ｆ．Ｇ．Ｊａｒｖｉｓ），エム．ジョンソン（Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ），「ジャーナルオブザアメリカンケミカルソサイティ（Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」，７１巻，ｐ４１２４−４１２６（１９４９）．F. Gee. FG Jarvis, M.C. Johnson, "Journal of the American Chemical Society", 71, p4124-4126 (1949). エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ），ディ．ウルブラント（Ｄ．Ｗｕｌｌｂｒａｎｄｔ）「アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，５１巻，ｐ２２−３２（１９９９）．S. Lang, S. Lang. D. Wollbrandt, “Applied Microbiology and Biotechnology”, Vol. 51, p22-32 (1999). ピー．エー．ゴーリン（Ｐ．Ａ．Ｇｏｒｉｎ），ジェイ．エフ．ティ．スペンサー（Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ），エイ．ピー．ツロテェ（Ａ．Ｐ．Ｔｕｌｌｏｃｈ），「カナデアンジャーナルオブケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）」，３９巻,ｐ８４６−８５５（１９６１）．Pee. A. Gorin, Jay. F. Tee. Spencer (J. F. Spencer), A. Pee. T. Tulloch, “Canadian Journal of Chemistry”, 39, p846-855 (1961). エイ．エム．ダビラ（Ａ．Ｍ．Ｄａｖｉｌａ），アール．マークバル（Ｒ．Ｍａｒｃｂａｌ），ジェイ．ピー．バンデカテーレ（Ｊ．−Ｐ．Ｖａｎｄｅｃａｔｅｅｌｅ），「アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，４７巻，ｐ４９６−５０１（１９９７）．A. M. D. Davila, Earl. R. Marcbal, Jay. Pee. Bandecatele (Appl. Microbiol. Biotechnol.), 47, pp. 506-501 (1997). エイチ．ジェイ．ダニエル（Ｈ．−Ｊ．Ｄａｎｉｅｌ），エム．リュッシ（Ｍ．Ｒｅｕｓｓ），シー．シィルダック（Ｃ．Ｓｙｌｄａｔｋ），「バイテクノロジーレターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，２０巻，ｐ１１５３−１１５６（１９９８）．H. Jay. Daniel (H.-J. Daniel), M.M. M. Reuss, See. C. Syldak, “Biotechnol. Lett.”, 20, p1153-1156 (1998). エヌ．コサリック（Ｎ．Ｋｏｓａｒｉｃ），ダブリュ．エル．ケルン（Ｗ．Ｌ．Ｃａｉｒｎｓ），エヌ．シー．シー．グレイ（Ｎ．Ｃ．Ｃ．Ｇｒａｙ），「バイオサーファクタントアンドバイオテクノロジー（ＢｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），マーシャルデッカーインコーポレーションニューヨーク（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）（１９８７）．N. N. Kosaric, W. El. Cologne (W. L. Cairns), N.C. Sea. Sea. Gray (NCC Gray), “Biosurfactant and Biotechnology”, (USA), Marshall Decker, Inc. New York (1987). ジェイ．エス．キム（Ｊ．−Ｓ．Ｋｉｍ），エム．ポワラ（Ｍ．Ｐｏｗａｌｌａ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ），エフ．ワーグナー（Ｆ．Ｗａｇｎｅｒ），エイチ．ランスドルフ，ブイ．レイ（Ｖ．Ｗｒａｙ），「ジャーナルオブバイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（英国），１３巻，ｐ２５７−２６６（１９９０）．Jay. S. Kim (J.-S. Kim), M.M. M. Powalla, S. Lang, S.L. W. Wagner, H. Lancedorf, buoy. V. Wray, “J. Biotechnol.” (UK), 13, p 257-266 (1990). アール．エイチ．ハスキンス（Ｒ．Ｈ．Ｈａｓｋｉｎｓ），ジェイ．エイ．トーン（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｒｎ），Ｂ．Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄ，「カナデアンジャーナルオブケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，１巻，ｐ７４９−７５６（１９５５）．R. H. RH Haskins, Jay. A. Tone (JA Thorn), B.M. Boothroyd, “Canadean Journal of Chemistry”, Volume 1, p 749-756 (1955). ジー．デム（Ｇ．Ｄｅｍｌ），ティ．アンケ（Ｔ．Ａｎｋｅ），エフ．オーバーウインカー（Ｆ．Ｏｂｅｒｗｉｎｋｌｅｒ），ビー．エム．ジアネッティー（Ｂ．Ｍ．Ｇｉａｎｎｅｔｔｉ），ダブリュ．ステグリッチ（Ｗ．Ｓｔｅｇｌｉｃｈ），「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９巻，ｐ８３−８７（１９８０）．Gee. Dem (G. Deml), Tee. Anke (T. Anke), EF. Overwinker (F. Oberwinkler), Bee. M. Gianetti, W. Steglich, “Phytochemistry”, Vol. 19, p83-87 (1980). ティ．ナカハラ（Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ），エイチ．カワサキ（Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ），ティ．スギサワ（Ｔ．Ｓｕｇｉｓａｗａ），ワイ．タカモリ（Ｙ．Ｔａｋａｍｏｒｉ），テイ．タブチ（Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ），「ジャーナルオブファーメンテーションテクノロジー（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（日本），日本発酵工学会，６１巻，ｐ１９−２３（１９８３）．Tee. T. Nakahara, H. H. Kawasaki, T. T. Sugisawa, Wy. Y. Takamori, Tei. T. Tabuchi, “Journal of Fermentation Technology (J. Ferment. Technol.)” (Japan), Japan Fermentation Engineering Society, Vol. 61, p19-23 (1983). ディ．キタモト（Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ），エス．アキバ（Ｓ．Ａｋｉｂａ），シー．ヒオキ（Ｃ．Ｈｉｏｋｉ），ティ．タブチ（Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ）「アグリカリチュラルアンドバイオロジカルケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」，（日本），日本農芸化学会，５４巻．ｐ３１−３６（１９９０）．Di. Kitamoto, S. et al. Akiba, See. C. Hioki, T. T. Tabuchi, “Agricultural and Biological Chemistry” (Japan), Japan Society for Agricultural Chemistry, Vol. 54. p31-36 (1990). エイチ．エス．キム（Ｈ．−Ｓ．Ｋｉｍ），ビー．ディ．ユーン（Ｂ．−Ｄ．Ｙｏｏｎ），ディ．エイチ．チョン（Ｄ．−Ｈ．Ｃｈｏｕｎｇ），エイチ．エム．オー（Ｈ．−Ｍ．Ｏｈ），ティ．カツラギ（Ｔ．Ｋａｔｓｕｒａｇｉ），ワイ．タニ（Ｙ．Ｔａｎｉ）「アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５２巻，ｐ７１３−７２１（１９９９）．H. S. Kim (H.-S. Kim), Bee. Di. Yoon (B.-D. Yoon), Di. H. Chung (D.-H. Chouung), H. M. Oh (H.-M. Oh), Tee. T. Katsuragi, Wye. Yani, “Applied Microbiology and Biotechnology”, (Germany), Springer-Verlag, Vol. 52, p 713-721 (1999). 角川（Ｋ．ｋａｋｕｋａｗａ），玉井（Ｍ．Ｔａｍａｉ），今村（Ｋ．Ｉｍａｍｕｒａ），宮本（Ｋ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ），三好（Ｓ．Ｍｉｙｏｓｈｉ），森永（Ｙ．Ｍｏｒｉｎａｇａ），鈴木（Ｏ．Ｓｕｚｕｋｉ），宮川（Ｔ．Ｍｉｙａｋａｗａ）「バイオサイエンス，バイオテクノロジーアンドバイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」，（日本），日本農芸化学会，６６巻，ｐ１８８−１９１（２００２）．K. Kakukawa, M. Tamai, K. Imamura, K. Miyamoto, S. Miyoshi, Y. Morinaga, Suzuki (O. Suzuki), Miyagawa (T. Miyakawa) “Bioscience, Biotechnology and Biochemistry” (Japan), Japanese Society of Agricultural Chemistry, 66, p188-191 (2002). ビー．フラッツ（Ｂ．Ｆｒａｕｔｚ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ），エフ．ワーグナー（Ｆ．Ｗａｒｇｎｅｒ）「バイオテクノロジーレターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，（オランダ），クルーワーアカデミックパブリッシャー（ＫＬＵＷＥＲＡＣＡＤＥＭＩＣＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ），８巻，ｐ７５７−７６２（１９８６）．Bee. Flats, B. Frautz. Lang, S.L. F. Warner, “Biotechnol. Lett.”, (Netherlands), Kluwer Academic Publishers, Vol. 8, p757-762 (1986). エス．スペンサー（Ｓ．Ｓｐｏｅｃｋｎｅｒ），ブイ．レイ（Ｖ．Ｗｒａｙ），エム．ニミッツ（Ｍ．Ｎｉｍｔｚ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ）「アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５１巻，ｐ３３−３９（１９９９）．S. Spencer, buoy. Ray (V. Wray), M.M. N. Mimtz, S.M. Lang, “Applied Microbiology and Biotechnology”, (Germany), Springer-Verlag, 51, p33-39 (1999). イー．ボルブレクト（Ｅ．Ｖｏｌｌｂｒｅｃｈｔ），ユー．ラウ（Ｕ．Ｒａｕ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ）「フェット／リピッド（Ｆｅｔｔ／Ｌｉｐｉｄ．）」，１０１巻，ｐ３８９−３９４（１９９９）．E. E. Vollbrecht, You. U. Rau, S .; Lang (S. Lang) "Fett / Lipid.", 101, p389-394 (1999).

本発明は上記事情に鑑みなされたもので、分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つ糖脂質等のバイオサーファクタントを、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、新規のバイオサーファクタントとなる糖脂質及びその製造方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and biosurfactants such as glycolipids having high degradability, low toxicity, environmental friendliness, and novel physiological functions are used in the food industry, cosmetic industry, pharmaceutical industry, chemical industry, An object of the present invention is to provide a glycolipid that becomes a novel biosurfactant and a method for producing the same in order to widely spread in the environmental field and the like.

本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、バイオサーファクタントは、自然界に広く存在する微生物自身が生存するために生産している物質であって、今までに発見されてきたバイオサーファクタント生産微生物は、自然界から分離されているという事実に基づき、日本各地から各種の試料を採取し、バイオサーファクタントを生産する微生物を分離し培養方法を検討することにより、新規な糖脂質を得ることを知見し、本発明をなすに至ったものである。 As a result of intensive investigations to achieve the above object, the present inventor has discovered that biosurfactants are substances produced for the survival of microorganisms that exist widely in nature, and have been discovered so far. Based on the fact that production microorganisms have been separated from nature, it is possible to obtain new glycolipids by collecting various samples from various parts of Japan, separating microorganisms that produce biosurfactants, and examining culture methods. It has been found and the present invention has been made.

従って、本発明は下記発明を提供する。
［１］．下記式（１）で表される糖脂質。

（式中、ＲＣＯは炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、ＲＣＯはマンノースとマンニトールとの構成要素のうち、マンノースの２位及び３位の水酸基とエステル結合をしており、ｎは２であり、マンノースの残りの水酸基にはアセチル基が結合していてもよい。）
［２］．ＲＣＯが炭素数６〜２０の直鎖飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする［１］記載の糖脂質。
［３］．ＲＣＯが炭素数６〜２０の直鎖不飽和脂肪族アシル基であることを特徴とする［１］記載の糖脂質。
［４］．ＲＣＯが炭素数６〜２０の飽和及び不飽和の直鎖脂肪族アシル基の混合物であることを特徴とする［１］記載の糖脂質。
［５］．ＲＣＯが、炭素数６〜１８の飽和脂肪族アシル基と炭素数８〜１２の不飽和脂肪族アシル基の混合物であることを特徴とする［１］記載の糖脂質。
［６］．シュードジーマ属に属する微生物を培養し、その培養物から得られたことをと特徴とする［１］〜［５］のいずれかに記載の糖脂質。
［７］．微生物がＴＭ−４５３であることを特徴とする［６］記載の糖脂質。
［８］．４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトール又は４モノ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトール。
［９］．シュードジーマ属に属する微生物を培養し、その培養物から糖脂質を回収することを特徴とする［１］記載の糖脂質の製造方法。
［１０］．微生物がＴＭ−４５３であることを特徴とする請求項［９］記載の糖脂質の製造方法。
［１１］．生産培地に炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素を加えることを特徴とする請求項［９］又は［１０］記載の糖脂質の製造方法。
［１２］．生産培地に炭素数６〜２４の脂肪酸を加えることを特徴とする［９］又は［１０］記載の糖脂質の製造方法。
［１３］．生産培地に炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドを加えることを特徴とする［９］又は［１０］記載の糖脂質の製造方法。
［１４］．生産培地に炭水化物を加えることを特徴とする［９］又は［１０］記載の糖脂質の製造方法。
Accordingly, the present invention provides the following inventions.
[1]. A glycolipid represented by the following formula (1).

(In the formula, RCO is an aliphatic acyl group having 6 to 20 carbon atoms, RCO is an ester bond with the hydroxyl groups at the 2nd and 3rd positions of mannose among the constituent elements of mannose and mannitol, n is 2 and an acetyl group may be bonded to the remaining hydroxyl group of mannose .)
[2]. The glycolipid according to [1], wherein RCO is a straight chain saturated aliphatic acyl group having 6 to 20 carbon atoms.
[3]. The glycolipid according to [1], wherein RCO is a linear unsaturated aliphatic acyl group having 6 to 20 carbon atoms.
[4]. The glycolipid according to [1], wherein RCO is a mixture of saturated and unsaturated linear aliphatic acyl groups having 6 to 20 carbon atoms.
[5]. The glycolipid according to [1], wherein RCO is a mixture of a saturated aliphatic acyl group having 6 to 18 carbon atoms and an unsaturated aliphatic acyl group having 8 to 12 carbon atoms.
[6]. The glycolipid according to any one of [1] to [5], wherein a microorganism belonging to the genus Pseudoma is cultured and obtained from the culture.
[7]. The glycolipid according to [6], wherein the microorganism is TM-453.
[8]. 4,6-di-O-acetyl-2,3-di-O-alkanoyl-β-D-mannopyranosyl 1-6-meso-mannitol or 4mono-O-acetyl-2,3-di-O-alkanoyl- β-D-mannopyranosyl 1-6-meso-mannitol.
[9]. The method for producing a glycolipid according to [1], wherein a microorganism belonging to the genus Pseudozima is cultured, and the glycolipid is recovered from the culture.
[10]. The method for producing a glycolipid according to claim [9], wherein the microorganism is TM-453.
[11]. The method for producing a glycolipid according to [9] or [10], wherein a linear aliphatic hydrocarbon having 6 to 24 carbon atoms is added to the production medium.
[12]. The method for producing a glycolipid according to [9] or [10], wherein a fatty acid having 6 to 24 carbon atoms is added to the production medium.
[13]. The method for producing a glycolipid according to [9] or [10], wherein a triglyceride containing a linear aliphatic hydrocarbon group having 6 to 24 carbon atoms is added to the production medium.
[14]. The method for producing a glycolipid according to [9] or [10], wherein a carbohydrate is added to the production medium.

本発明によれば、シュードジーマ（Ｐｓｅｕｄｚｙｍａ）ｓｐ．ＴＭ−４５３の培養物から、新規構造である糖脂質（マンノシルマンニトールリピッド）を得ることができ、この糖脂質はバイオサーファクタントとして有用である。 According to the present invention, Pseudzyma sp. A glycolipid (mannosylmannitol lipid) having a novel structure can be obtained from the culture of TM-453, and this glycolipid is useful as a biosurfactant.

以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
糖脂質
本発明の糖脂質は、下記式（１）で表される糖脂質である。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
Glycolipid The glycolipid of the present invention is a glycolipid represented by the following formula (1).

（式中、ＲＣＯは炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、マンノースとマンニトールとの構成要素のうちマンノースのいずれかの水酸基とエステル結合をしており、残りの水酸基にはアセチル基が結合していてもよい。ｎは１〜３を示す。）

(In the formula, RCO is an aliphatic acyl group having 6 to 20 carbon atoms, which has an ester bond with any hydroxyl group of mannose among the constituent elements of mannose and mannitol, and the remaining hydroxyl group has an acetyl group. (N may represent 1 to 3).

上記式中、ＲＣＯは炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、マンノースとマンニトールとの構成要素のうちマンノースのいずれかの水酸基とエステル結合をしており、下記式の構造となって結合する。

In the above formula, RCO is an aliphatic acyl group having 6 to 20 carbon atoms, and has an ester bond with one of the mannose hydroxyl groups among the constituent elements of mannose and mannitol, and has a structure of the following formula. To do.

ＲＣＯとしては、炭素数６〜２０の直鎖飽和脂肪族アシル基、炭素数６〜２０の直鎖不飽和脂肪族アシル基、炭素数６〜２０の飽和及び不飽和の直鎖脂肪族アシル基の混合物であることが好ましい。 As RCO, a C6-C20 linear saturated aliphatic acyl group, a C6-C20 linear unsaturated aliphatic acyl group, a C6-C20 saturated and unsaturated linear aliphatic acyl group It is preferable that it is a mixture.

本発明の糖脂質は、界面張力の低下能を有する新規構造のバイオサーファクタントであり、たとえば、シュードジーマ属の酵母、より好ましくはシュードジーマｓｐ．ＴＭ−４５３の培養によって得ることができる。前記シュードジーマｓｐ．ＴＭ−４５３は、本発明者らによって分離された新規酵母であり、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所の特許微生物寄託センター（ＮＩＢＨ）に平成１５年５月９日に寄託（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９３３９）されている。 The glycolipid of the present invention is a biosurfactant having a novel structure having the ability to reduce interfacial tension. For example, yeast of the genus Pseudosima, more preferably Pseudosima sp. It can be obtained by culturing TM-453. The pseudozima sp. TM-453 is a new yeast isolated by the present inventors and deposited on May 9, 2003 at the Patent Microbiology Depositary Center (NIBH) of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology of the Ministry of Economy, Trade and Industry. (Accession number FERM P-19339).

本発明の微生物は、本発明者が自然界に存在するものから、検索して新たに単離したものである。 The microorganism of the present invention has been newly isolated by searching for the present inventor from those existing in nature.

シュードジーマ属ｓｐ．ＴＭ−４５３（ＮＩＢＨ：受託番号ＦＥＲＭＰ−１９３３９）の菌学的性質は、次の通りである。なお、この菌は，１９９９年に、富山県の名称不明の樹木の葉より分離されたものである。 Pseudosima sp. The mycological properties of TM-453 (NIBH: accession number FERM P-19339) are as follows. This fungus was isolated from the leaves of an unknown tree in Toyama Prefecture in 1999.

（ａ）各培地における生育状態
ｉ．ＹＭ液体培地
３０℃で５日間培養後の細胞は，卵円形あるいは円筒形で、その大きさは１〜５×２〜２０μｍで、単独、鎖状で存在している。菌糸の生成が認められる。皮膜及び沈殿物の生成が認められる。
ｉｉ．ＴＭ寒天培地
３０℃での培養では，２日後は白色であるが、１０日後には薄いピンク色となる。
ｉｉｉ．ＹＭ寒天培地によるガラススライド培養
仮性菌糸、真正菌糸の形成が認められる。細胞は，円筒形のものが多く認められ，鎖状で存在している。
（ｂ）生理的性質
ｉ．生育できる範囲
ｐＨ２〜７、温度１０〜３７℃
ｉｉ．窒素化合物の利用
硝酸塩及び硫酸アンモニウムを利用できる。亜硝酸塩の利用は弱い。
ｉｉｉ．ビタミンの要求性：なし
ｉｖ．油脂を分解する。
ｖ．尿素を分解する。
ｖｉ．ウレアーゼ活性あり。
ｖｉｉ．菌体外ＤＮａｓｅ活性あり。
ｖｉｉｉ．ｐ−ニトロフェニル−α、Ｄ−グルコシドを分解する。
ｉｘ．ｐ−ニトロフェニル−β、Ｄ−グルコシドを分解する。
ｘ．糖の発酵性
Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、ショ糖、麦芽糖、乳糖の全てを発酵しない。
（Ｃ）利用する糖
Ｄ−グルコース、ショ糖、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、乳糖、Ｌ−ラムノース、サリシン、メリビオース、ラフィノース、イノシトール
（Ｄ）ｒＤＮＡシーケンス
ｒＤＮＡのＩＴＳ領域（ＩＴＳ５及びＩＴＳ４プライマー使用）の塩基配列を解析し，日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベースとの比較により、シュードジーマ属と良く一致した。 (A) Growth state in each medium i. YM liquid medium Cells after culturing at 30 ° C. for 5 days are oval or cylindrical, and have a size of 1 to 5 × 2 to 20 μm, and exist alone in a chain form. Mycelium formation is observed. Formation of film and precipitate is observed.
ii. TM agar medium In culture at 30 ° C., it becomes white after 2 days, but becomes light pink after 10 days.
iii. Glass slide culture on YM agar medium Formation of pseudohyphae and authentic hyphae is observed. Many cylindrical cells are recognized and are present in chains.
(B) Physiological properties i. Growth range pH 2-7, temperature 10-37 ° C
ii. Use of nitrogen compounds Nitrate and ammonium sulfate can be used. Nitrite use is weak.
iii. Vitamin requirements: None iv. Decomposes oils and fats.
v. Decomposes urea.
vi. There is urease activity.
vii. Has extracellular DNase activity.
viii. Decomposes p-nitrophenyl-α, D-glucoside.
ix. Decomposes p-nitrophenyl-β, D-glucoside.
x. Fermentation of sugar D-glucose, D-galactose, sucrose, maltose, and lactose are not fermented.
(C) Sugar to be used D-glucose, sucrose, D-galactose, maltose, lactose, L-rhamnose, salicin, melibiose, raffinose, inositol (D) rDNA sequence Base of ITS region of rDNA (using ITS5 and ITS4 primers) The sequence was analyzed, and it was in good agreement with Pseudosima by comparison with the database of Japan DNA Data Bank (DDBJ).

微生物のスクリーニング方法
１）培養
多様な微生物の存在が予想される、例えば、植物の葉、花、果実、木の樹液、ため池の水、土壌等の試料を全国から採取する。収集した試料を糖脂質を生産する微生物が優先的に成育できる培地、例えば、大豆油等の植物油脂、オクタデカンのような炭化水素を炭素源とした液体培地に加えて培養する。炭素源以外の培地成分としては、たとえば、北本ら（北本大：油化学、４１，８３９頁、１９９２年）が使用した培地を改変して使用することができる。本スクリーニング法において好適に用いられる培地の組成を表１に示す。 Microbiological screening method 1) Cultivation Samples such as plant leaves, flowers, fruits, tree sap, pond water, soil, etc. are collected from all over the country where various microorganisms are expected to exist. The collected sample is added to a medium in which microorganisms producing glycolipids can preferentially grow, for example, a vegetable oil or fat such as soybean oil, or a liquid medium using a hydrocarbon such as octadecane as a carbon source and cultured. As a medium component other than the carbon source, for example, a medium used by Kitamoto et al. (U. Kitamoto: Yukagaku, 41, 839, 1992) can be modified and used. Table 1 shows the composition of the medium preferably used in this screening method.

表１に示す液体培地１及び２の培地に試料を加えて、２８〜３２℃で３〜７日間振とう培養する。培養液が白濁したものについて、表１に示す寒天平板上に画線して２８〜３２℃で培養する。培養液が白濁する原因は、大豆油が微生物が生産するリパーゼによって分解されて、脂肪酸が遊離してくる、あるいは炭素源を資化して菌体が増殖したことによるものであり、疎水性の炭素源を細胞内に取り込むためにバイオサーファクタントを生産している可能性が高いと考えられる。寒天平板上に生育したコロニーを釣菌し、再度寒天平板上に画線し、同条件で培養する。顕微鏡観察を行ってコンタミネーションが無くなるまで、この操作を繰り返して微生物を単離する。単離した微生物を再び、表１の液体培地１及び２の入った試験管に接種して、同条件で振とう培養する。 A sample is added to the culture media of liquid media 1 and 2 shown in Table 1, and cultured with shaking at 28 to 32 ° C. for 3 to 7 days. The culture solution becomes cloudy and is streaked on an agar plate shown in Table 1 and cultured at 28 to 32 ° C. The cause of the cloudiness of the culture solution is that soybean oil is decomposed by lipase produced by microorganisms and fatty acids are liberated, or cells are grown by assimilating carbon sources. It is likely that biosurfactants are being produced in order to incorporate the source into the cell. A colony grown on an agar plate is picked, streaked again on the agar plate, and cultured under the same conditions. This operation is repeated until the contamination is eliminated by microscopic observation, and the microorganism is isolated. The isolated microorganism is again inoculated into the test tube containing the liquid media 1 and 2 shown in Table 1, and cultured under shaking under the same conditions.

２）糖脂質成分の抽出
糖脂質の存在を確認するために、培養液が白濁したものについて酢酸エチルを加えて糖脂質等の脂質成分を抽出し、エバポレーターを用いて酢酸エチルを留去する。得られた脂質成分を２Ｎ（Ｎは（１０³ｍｏｌ／ｍ³）／ｚ：ｚはイオンの電荷数、以下同じ）のトリフルオロ酢酸を用いて加水分解して、単糖、脂肪酸等の単位成分に分解する。分解物について高速液体クロマトグラフィーを用いて糖の有無を調べる。糖の存在が認められた菌株について表２に示した液体培地４の入った５００ｍＬ容の坂口フラスコに接種して、２６〜３２℃で１週間振とう培養する。培養終了後、酢酸エチルを加えて脂質成分を抽出し、エバポレーターを用いて酢酸エチルを留去し、２Ｎのトリフルオロ酢酸で加水分解する。分解物についてガスクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析する。脂質成分をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）プレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開する。展開終了後、オルシノール硫酸試薬及びローダミン６Ｇ試薬で糖脂質の存在を確認する。さらに、保持時間（試料をチャージした位置からスポットの中心までの距離／試料をチャージした位置から展開溶液の最高到達点までの距離）を既存の糖脂質の一種であるマンノシルエリスリトールリピッド、ソホロリピッドと比較する。 2) Extraction of glycolipid component In order to confirm the presence of the glycolipid, ethyl acetate is added to the culture solution which has become cloudy to extract the lipid component such as glycolipid, and the ethyl acetate is distilled off using an evaporator. The obtained lipid component is hydrolyzed with trifluoroacetic acid of 2N (N is (10 ³ mol / m ³ ) / z: z is the number of charges of ions, the same shall apply hereinafter) to give units such as monosaccharides and fatty acids. Decomposes into components. The degradation product is examined for the presence of sugar using high performance liquid chromatography. The 500-mL Sakaguchi flask containing the liquid medium 4 shown in Table 2 is inoculated for the strain in which the presence of sugar is observed, and cultured with shaking at 26-32 ° C. for 1 week. After completion of the culture, ethyl acetate is added to extract the lipid component, and the ethyl acetate is distilled off using an evaporator, followed by hydrolysis with 2N trifluoroacetic acid. The decomposition product is analyzed for sugar composition using gas chromatography and liquid chromatography. The lipid component is charged on a TLC (thin layer chromatography) plate and developed with chloroform: methanol: water = 65: 15: 2 (volume ratio). After completion of the development, the presence of glycolipid is confirmed with an orcinol sulfate reagent and a rhodamine 6G reagent. Furthermore, the retention time (distance from the sample charged position to the center of the spot / distance from the sample charged position to the highest point of the developing solution) is compared with existing glycolipids, such as mannosyl erythritol lipid and sophoro lipid. To do.

糖組成の分析及び保持時間の比較の結果、新規の糖脂質の存在が予想される菌株について、例えば表２の組成の液体培地３が４〜６ｍＬ入った試験管に１白金耳接種し、２６〜３２℃で１〜３日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、２６〜３２℃で１〜３日間培養を行った。これを例えば表２の液体培地４が１．４Ｌ入った２．５Ｌ容のジャーファメンターに接種して、２６〜３２℃、通気量１〜２Ｌ／分、撹拌速度６００〜１０００ｒｐｍで１〜２週間培養する。 As a result of the analysis of the sugar composition and the comparison of the retention time, for a strain expected to have a new glycolipid, for example, 1 platinum ear is inoculated into a test tube containing 4 to 6 mL of the liquid medium 3 having the composition shown in Table 2. Shaking culture was performed at ˜32 ° C. for 1 to 3 days. This was inoculated into a Sakaguchi flask containing 100 mL of the medium having the same composition, and cultured at 26 to 32 ° C. for 1 to 3 days. For example, this is inoculated into a 2.5 L jar fermenter containing 1.4 L of the liquid medium 4 shown in Table 2, and is 1 to 2 at 26 to 32 ° C., an aeration rate of 1 to 2 L / min, and a stirring speed of 600 to 1000 rpm. Incubate for a week.

培養終了後、等容積量の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、酢酸エチルをエバポレーターを用いて留去し、脂質成分を回収する。この脂質成分を等量のクロロホルムに溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム、クロロホルム：酢酸エチル溶液（４：１）、アセトン、メタノールの順で溶出させる。各溶液をＴＬＣプレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：２（容積比）で展開する。展開終了後、オルシノール硫酸試薬及びローダミン６Ｇ試薬で糖脂質の存在を確認する。糖脂質の含まれる溶出液を集め、溶媒を留去して糖脂質成分を得た。得られた糖脂質成分を再度クロロホルム１ｍＬに溶解し、イアトロビーズカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：メタノール＝９５：５（容積比）で溶出させ、ＴＬＣで単一のバンドを示す糖脂質成分を単離する。 After completion of the culture, the lipid component is extracted with an equal volume of ethyl acetate, and the ethyl acetate is distilled off using an evaporator to recover the lipid component. This lipid component is dissolved in an equal amount of chloroform, and this is subjected to silica gel chromatography, and eluted with chloroform, chloroform: ethyl acetate solution (4: 1), acetone and methanol in this order. Each solution is charged on a TLC plate and developed with chloroform: methanol: water = 65: 15: 2 (volume ratio). After completion of the development, the presence of glycolipid is confirmed with an orcinol sulfate reagent and a rhodamine 6G reagent. The eluate containing the glycolipid was collected and the solvent was distilled off to obtain a glycolipid component. The obtained glycolipid component was dissolved again in 1 mL of chloroform, subjected to iatrobead column chromatography, eluted with chloroform: methanol = 95: 5 (volume ratio), and a glycolipid component showing a single band by TLC was simply separated. Release.

糖脂質の構造決定法
本発明の糖脂質は、以下のようにしてその構造を決定する（構造決定のための糖脂質は、シュードジーマｓｐ．ＴＭ−４５３株を用いて大豆油を炭素源として培養したものについて説明する）。単離した脂質成分は、ＴＬＣプレート上で、オルシノール硫酸試薬で赤紫色に呈色し、ローダミン６Ｇ試薬でも陽性を示したことから糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析において、擬似分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ｍ／ｚ７３１と７５７が検出された（図１−１）。 Method for Determining Structure of Glycolipid The structure of the glycolipid of the present invention is determined as follows (glycolipid for structure determination is determined using soybean oil sp. TM-453 as a carbon source) Explain what was cultured). The isolated lipid component was reddish purple with the orcinol sulfate reagent on the TLC plate and was positive with the rhodamine 6G reagent, so that it can be judged to be a glycolipid component. In this glycolipid, pseudomolecular ions [M + Na] ⁺ m / z 731 and 757 were detected in MALDI-TOF / MS analysis (FIG. 1-1).

１）糖組成の解析
糖脂質の糖組成をメチルグリコシド−ＴＭＳ誘導体化法を用いてガスクロマトグラフィーで解析したところ、マンノースとマンニトールが等モル量ずつ検出された（図２）。
ついで、アルカリ（ＫＯＨ）でケン化して得られた糖鎖を完全メチル化してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析を行ったところ、マンノシールマンニトールの完全メチル化物に相当する擬似分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ｍ／ｚ４９３が検出された（図１−３）。さらにこのメチル糖の加水分解物の解析では、等モルの非還元末端マンノースと６−モノ置換マンニトールが検出された（図３）。糖鎖の結合様式は、完全メチル化物の¹Ｈ−ＮＭＲ解析により、マンノースのアノメリックプロトン（Ｈ−１）の結合定数からβ−結合であることが確認できた（図４）。以上の結果から、この糖脂質の糖鎖部分の構造は、６−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシール−ｍｅｓｏ−マンニトールであると確認した。 1) Analysis of sugar composition When the sugar composition of glycolipid was analyzed by gas chromatography using the methylglycoside-TMS derivatization method, mannose and mannitol were detected in equimolar amounts (FIG. 2).
Subsequently, the sugar chain obtained by saponification with alkali (KOH) was completely methylated and subjected to MALDI-TOF / MS analysis. As a result, a pseudomolecular ion [M + Na] ⁺ m corresponding to the fully methylated product of mannosylmannitol was obtained. / Z493 was detected (FIGS. 1-3). Furthermore, in the analysis of this hydrolyzate of methyl sugar, equimolar non-reducing terminal mannose and 6-monosubstituted mannitol were detected (FIG. 3). The binding mode of the sugar chain was confirmed to be β-bond from the binding constant of the anomeric proton (H-1) of mannose by ¹ H-NMR analysis of the fully methylated product (FIG. 4). From the above results, it was confirmed that the structure of the sugar chain portion of this glycolipid was 6-O-β-D-mannopyranosyl-meso-mannitol.

２）脂質組成の解析
一方、脂質部分の組成は、糖脂質を塩酸メタノールでメタノリシスし、ヘキサンで抽出して得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析したところ、Ｃ８とＣ１０の直鎖飽和脂肪酸とＣ１０の不飽和脂肪酸が主成分として検出された。 2) Analysis of lipid composition On the other hand, the composition of the lipid part was obtained by analyzing the fatty acid methyl ester obtained by methanolysis of glycolipid with methanolic hydrochloric acid and extraction with hexane, and C8 and C10 linear saturation. Fatty acids and C10 unsaturated fatty acids were detected as the main components.

３）脂肪酸成分の結合部位の解析
この糖脂質を、過ヨウ素酸で処理し、酢酸酸性条件下で水素化シアノホウ素ナトリウムで還元して得られた過ヨウ素酸酸化糖脂質は、分子量で１２０の低下が認められた（図１−２）。生成物の組成分析において、糖成分としてマンノースのみが検出され、さらに上述のすべての脂肪酸成分の存在が確かめられた。従って、過ヨウ素酸酸化によりマンニトールが分解されたこと、糖脂質の脂肪酸成分は、すべてマンノースに結合していることが確認された。マンノース残基上の脂肪酸の結合位置の同定は、この過ヨウ素酸酸化糖脂質のＮＭＲによる解析で行った。¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは、一般に糖のＨ−２〜Ｈ−６のプロトンは３．５ｐｐｍ付近にまとまって検出されるが、水酸基の水素がアシル基とエステル結合すると、そのα−プロトンのシグナルは低磁場にシフトすることが知られている。本糖脂質においても脂肪酸の結合によると考えられる低磁場シフトした４つのプロトンシグナルが観測され、それぞれのシグナルは、マンノース残基の各プロトンＨ−２；５．５０３ｐｐｍ、Ｈ−３；５０５４、Ｈ−４；５．２２２、Ｈ−６；４．１９８ｐｐｍと同定できた（図５）。このことから、この糖脂質は、４分子のアシル基が結合していると同定できる。さらに、２．０８１ｐｐｍと２．０１５ｐｐｍに２分子のアセチル基（−ＣＯＣＨ₃）の存在を示すシグナルが、そして２．４２２ｐｐｍと２．２０１ｐｐｍに２分子の−ＣＯＣＨ₂−の存在を示すシグナルが観測されたことから、マンノースに結合している４分子のアシル基は、２分子が酢酸で、そして残りの２分子が脂肪酸であると同定できる。 3) Analysis of binding site of fatty acid component Periodate-oxidized glycolipid obtained by treating this glycolipid with periodic acid and reducing it with sodium cyanoborohydride under acetic acid acidic condition has a molecular weight of 120 A decrease was observed (FIGS. 1-2). In the composition analysis of the product, only mannose was detected as the sugar component, and the presence of all the fatty acid components described above was confirmed. Therefore, it was confirmed that mannitol was decomposed by periodate oxidation and that all fatty acid components of glycolipid were bound to mannose. Identification of the binding position of the fatty acid on the mannose residue was performed by NMR analysis of this periodate oxidized glycolipid. ^{In the 1} H-NMR spectrum, protons of sugars H-2 to H-6 are generally detected in the vicinity of 3.5 ppm. However, when the hydrogen of the hydroxyl group is ester-bonded to the acyl group, the signal of the α-proton is It is known to shift to a low magnetic field. Also in this glycolipid, four proton signals shifted by a low magnetic field, which are thought to be due to the binding of fatty acids, were observed, and each signal represents each proton H-2 of mannose residue; 5.503 ppm, H-3; 5054, H -4; 5.222, H-6; 4.198 ppm (FIG. 5). From this, this glycolipid can be identified as having 4 molecules of acyl groups bound thereto. Furthermore, signals indicating the presence of two molecules of acetyl group (—COCH ₃ ) are observed at 2.081 ppm and 2.015 ppm, and signals indicating the presence of two molecules of —COCH ₂ — are observed at 2.422 ppm and 2.201 ppm. From the above, it is possible to identify four molecules of acyl groups bonded to mannose as two molecules being acetic acid and the remaining two molecules being fatty acids.

さらに、ＨＭＢＣ（¹Ｈ−ｄｅｔｅｃｔｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｂｏｎｄｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒｍｕｌｔｉｐｌｅｑｕａｎｔｕｍｃｏｈｅｒｒｅｎｃｅｓｐｅｃｔｒｕｍ）解析において、Ｈ−４とＨ−６のプロトンシグナルが、アセチル基由来のカルボニル基のシグナル（１７０．４ｐｐｍと１７１．６ｐｐｍ）とそれぞれカップリングしていることが認められたことから、マンノースの４位と６位には酢酸がエステル結合していることが証明された（図６）。以上のことから、本糖脂質の構造は、４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトール（マンノシールマンニトールリピッド、以下ＭＭＬ）と同定できた。このＭＭＬのマススペクトルで検出された分子イオンのピークから脂肪酸の組成を考えると、７３１のピークはＣ８：０とＣ１０：０の脂肪酸が、そして７５７のピークはＣ１０：１とＣ１０：０の脂肪酸が各１分子ずつ、マンノースの２位と３位にエステル結合していると同定できる。さらに、これらの菌体が生産するＭＭＬには、アセチル基の数とその結合位置の異なる成分も存在していることを認められた。 Further, in ^{HMBC (1 H-detected multiple-} bond heteronuclear multiple quantum coherrence spectrum) analysis, proton signals of H-4 and H-6 are, the signal of the carbonyl group derived from the acetyl group (170.4Ppm and 171.6Ppm) It was proved that each was coupled, so that it was proved that acetic acid had an ester bond at positions 4 and 6 of mannose (FIG. 6). From the above, the structure of the present glycolipid is 4,6-di-O-acetyl-2,3-di-O-alkanoyl-β-D-mannopyranosyl 1-6-meso-mannitol (mannosylmannitol lipid , Hereinafter referred to as MML). Considering the composition of fatty acids from the molecular ion peaks detected in the mass spectrum of MML, the 731 peaks are C8: 0 and C10: 0 fatty acids, and the 757 peaks are C10: 1 and C10: 0 fatty acids. Can be identified as having an ester bond at the 2nd and 3rd positions of mannose. Furthermore, it was confirmed that the MML produced by these cells also contains components having different numbers of acetyl groups and their binding positions.

マンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）の製造方法
マンノシルマンニトールリピッドを生産する能力を有する微生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。現時点では、シュードジーマ（Ｐｓｕｄｏｚｙｍａ）ＴＭ−４５３株本菌株は、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所の特許微生物寄託センター（ＮＩＢＨ）に２００３年５月９日に寄託（ＦＥＲＭＰ−１９３３９））のみがマンノシルマンニトールリピッド生産菌と確認されているが、本発明者らはこの菌株以外にも多数のマンノシルマンニトールリピッド生産菌を保有しており、今後、生産菌の種類は増加するものと考えられる。 Production Method of Mannosyl Mannitol Lipid (MML) The microorganism having the ability to produce mannosyl mannitol lipid is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. At present, Psudozyma TM-453 strain is deposited on May 9, 2003 at the Patent Microbiology Depositary Center (NIBH) of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology of the Ministry of Economy, Trade and Industry. -19339)) only has been confirmed to be a mannosyl mannitol lipid-producing bacterium, but the present inventors possess a number of mannosyl mannitol lipid-producing bacteria in addition to this strain, and the types of producing bacteria will increase in the future. It is considered a thing.

前記シュードジーマｓｐ．ＴＭ−４５３株の培養に用いる培地には特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができ、酵母に対して一般に用いられる培地、たとえば、ＹＰＤ培地（イーストエキストラクト１０ｇ、ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース２０ｇ）を使用することができるが、炭素源を培地に入れることが好ましい。生育可能なｐＨ範囲は２．０〜７．０、好ましくは４．５〜６．０であり、生育可能な温度は１０〜３７℃、好ましくは２６〜３２℃である。良好な生育及びマンノシルマンニトールリピッドの生産のためには、培養液に酸素を供給する必要がある。このためには、ジャーファメンターを用いる場合では、空気を通気しながら撹拌するあるいは振とう培養を行う必要がある。 The pseudozima sp. The medium used for culturing the TM-453 strain is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, a medium generally used for yeast, for example, YPD medium (10 g yeast extract, 20 g polypeptone, and Glucose 20 g) can be used, but it is preferable to put the carbon source in the medium. The pH range in which growth is possible is 2.0 to 7.0, preferably 4.5 to 6.0, and the temperature at which growth is possible is 10 to 37 ° C, preferably 26 to 32 ° C. For good growth and production of mannosyl mannitol lipids, it is necessary to supply oxygen to the culture. For this purpose, in the case of using a jar fermenter, it is necessary to carry out stirring or shaking culture while aerating air.

炭素源としては、トリグリセリド、脂肪族炭化水素、脂肪酸、炭水化物等が挙げられる。
トリグリセリドとしては、特に制限がなく植物油脂又は動物油脂等が挙げられ、目的に応じて適宜選定することができる。植物油脂としては、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、バーム油等が挙げられ、これらの中でも、大豆油が好ましい。動物油脂としては、牛脂、豚脂、魚脂等が挙げられる。これらは、１種を単独で又は２種以上を適宜混合して用いてもよい。トリグリセリドとしては、炭素数６〜２４の直鎖脂肪族炭化水素基を含むトリグリセリドが好ましい。
なお、植物油脂又は動物油脂等としては、てんぷらを製造した後の食品廃油等も利用可能である。 Examples of the carbon source include triglycerides, aliphatic hydrocarbons, fatty acids, carbohydrates and the like.
The triglyceride is not particularly limited and includes vegetable oils and animal fats and the like, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples of vegetable oils include soybean oil, rapeseed oil, corn oil, peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, and balm oil. Among these, soybean oil is preferable. Examples of animal fats include beef tallow, pork tallow and fish tallow. You may use these individually by 1 type or in mixture of 2 or more types as appropriate. As a triglyceride, the triglyceride containing a C6-C24 linear aliphatic hydrocarbon group is preferable.
In addition, as vegetable oils or animal oils, food waste oils after producing tempura can be used.

脂肪族炭化水素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。炭化水素の炭素数は６〜２４の範囲であり、さらにそれぞれの分子内に１〜３箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ドデカン、ヘキサデカン、オクタデカンといった飽和炭化水素あるいは１−ペンタデセン（Ｃ₁₅Ｈ₃₀）、１−ヘプタデセン（Ｃ₁₇Ｈ₃₄）等の不飽和炭化水素及びその混合物であって、好ましくは炭素数１４〜２０の飽和あるいは不飽和炭化水素及びその混合物、さらに好ましくはオクタデカンを主成分とする混合物を用いることができる。 There is no restriction | limiting in particular as an aliphatic hydrocarbon, According to the objective, it can select suitably. The carbon number of the hydrocarbon is in the range of 6 to 24, and may further contain 1 to 3 unsaturated bonds in each molecule. For example, saturated hydrocarbons such as dodecane, hexadecane, and octadecane, unsaturated hydrocarbons such as 1-pentadecene (C ₁₅ H ₃₀ ), 1-heptadecene (C ₁₇ H ₃₄ ), and mixtures thereof, preferably 14 to It is possible to use 20 saturated or unsaturated hydrocarbons and mixtures thereof, more preferably a mixture mainly composed of octadecane.

脂肪酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。脂肪酸の炭素数は６〜２４の範囲であり、さらにそれぞれの分子内に１〜３箇所の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸といった飽和脂肪酸あるいはミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等の不飽和脂肪酸及びその混合物であって、好ましくは炭素数１４〜２０の飽和あるいは不飽和脂肪酸及びその混合物、さらに好ましくはリノール酸及びリノール酸を主成分とする混合物を用いる。 There is no restriction | limiting in particular as a fatty acid, According to the objective, it can select suitably. The number of carbon atoms of the fatty acid is in the range of 6 to 24, and 1 to 3 unsaturated bonds may be included in each molecule. For example, saturated fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid or unsaturated fatty acids such as myristoleic acid, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, and mixtures thereof, preferably having 14 to 14 carbon atoms Twenty saturated or unsaturated fatty acids and mixtures thereof, more preferably a mixture based on linoleic acid and linoleic acid are used.

炭水化物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。例えば、グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖とその誘導体、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖及びその混合物であって、好ましくは単糖、さらに好ましくはグルコースである。 There is no restriction | limiting in particular as a carbohydrate, According to the objective, it can select suitably. For example, monosaccharides such as glucose, mannose, glycerol, mannitol and derivatives thereof, oligosaccharides such as sucrose, maltose, lactose, and mixtures thereof, preferably monosaccharides, more preferably glucose.

炭素源としては特に植物油脂が好ましく、特に大豆油が好ましい。炭素源の含有量は、培地中２〜２４質量％が好ましく、特に４〜１８質量％が好ましい。 As the carbon source, vegetable oils and fats are particularly preferable, and soybean oil is particularly preferable. The content of the carbon source is preferably 2 to 24% by mass in the medium, and particularly preferably 4 to 18% by mass.

本発明のマンノシルマンニトールリピッドの製造方法は、目的に応じて適宜選定することができる。例えば、グルコース５〜２０ｇ／Ｌ，酵母エキス０．１〜２ｇ／Ｌ，硝酸アンモニウム０．１〜２ｇ／Ｌ，リン酸２水素カリウム０．１〜２ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に、１白金耳接種し、２６〜３２℃で１〜３日振とう培養を行う。これを同じ組成の培地５０〜１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、２６〜３２℃で１〜３日間振とう培養を行う。さらに、これを液体培地中２〜２４質量％、好ましくは４〜１８質量％の炭素源と酵母エキス０．１〜２ｇ／Ｌ，硝酸アンモニウム０．１〜２ｇ／Ｌ，リン酸２水素カリウム０．１〜２ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌの組成の液体培地１〜２Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、２６〜３２℃で１〜２Ｌ／分の通気速度と６００〜１０００ｒｐｍの撹拌速度本培養を開始する。このときの培養温度は２６〜３２℃、培養時間は、３〜２０日間である。 The manufacturing method of the mannosyl mannitol lipid of this invention can be suitably selected according to the objective. For example, glucose 5-20 g / L, yeast extract 0.1-2 g / L, ammonium nitrate 0.1-2 g / L, potassium dihydrogen phosphate 0.1-2 g / L, and magnesium sulfate 0.1-1 g / L One platinum loop is inoculated into a test tube containing 4 mL of a liquid medium having a composition of L, and cultured with shaking at 26 to 32 ° C. for 1 to 3 days. This is inoculated into a Sakaguchi flask containing 50 to 100 mL of the medium having the same composition, and cultured with shaking at 26 to 32 ° C. for 1 to 3 days. Further, this is obtained by adding 2 to 24% by mass, preferably 4 to 18% by mass of a carbon source and yeast extract 0.1 to 2 g / L, ammonium nitrate 0.1 to 2 g / L, potassium dihydrogen phosphate in a liquid medium. Inoculate a jar fermenter containing 1 to 2 g of liquid culture medium having a composition of 1 to 2 g / L and magnesium sulfate 0.1 to 1 g / L, aeration rate of 1 to 2 L / min at 26 to 32 ° C. and 600 Start a main culture with a stirring speed of ~ 1000 rpm. The culture temperature at this time is 26 to 32 ° C., and the culture time is 3 to 20 days.

なお、ｐＨは、ｐＨメーターで、溶存酸素濃度は、溶存酸素濃度メーターで測定できる。 The pH can be measured with a pH meter, and the dissolved oxygen concentration can be measured with a dissolved oxygen concentration meter.

前記回分培養では、１日に１乃至２回培養液を無菌的に採取して、培養液中の各成分を経時的に測定する。糖脂質、トリグリセリド、ジグリセリド及び脂肪酸は、採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収する。この酢酸エチル溶液をイアトロスキャン（ヤトロン社製）のロッドにチャージして所定の方法により各成分を定量分析する。 In the batch culture, a culture solution is aseptically collected once or twice a day, and each component in the culture solution is measured over time. Glycolipids, triglycerides, diglycerides and fatty acids are added to the collected culture and shaken vigorously and allowed to stand, and the supernatant ethyl acetate layer is recovered. This ethyl acetate solution is charged to a rod of Iatroscan (manufactured by Yatron), and each component is quantitatively analyzed by a predetermined method.

培養終了後、等〜４容積倍の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、酢酸エチルを、エバポレーターを用いて留去して脂質成分を回収する。 After completion of the culture, the lipid component is extracted with equal to 4 times volume of ethyl acetate, and the ethyl acetate is distilled off using an evaporator to recover the lipid component.

本発明の糖脂質は、優れた界面活性能を有するため、バイオサーファクタントとして用いることができる。界面活性能については、下記の方法で測定することができる。 Since the glycolipid of the present invention has excellent surface activity, it can be used as a biosurfactant. The surface active ability can be measured by the following method.

界面活性能の測定
糖脂質の界面活性能は水の表面張力低下能として測定する。糖脂質に蒸留水を加え超音波処理し、所定濃度の懸濁溶液を作製する。この懸濁溶液母液から順に希釈溶液を調製し、デュヌイの表面張力計を用いて、２５℃で各々の濃度の糖脂質溶液の表面張力を測定する。 Measurement of surface activity The surface activity of glycolipids is measured as the ability to reduce the surface tension of water. Distilled water is added to the glycolipid and sonicated to prepare a suspension solution having a predetermined concentration. Diluted solutions are prepared in order from this suspension solution mother liquor, and the surface tension of each glycolipid solution at 25 ° C. is measured using a Dunui surface tension meter.

以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a comparative example are shown and this invention is demonstrated concretely, this invention is not restrict | limited to the following Example.

［実施例１］
<微生物のスクリーニング>
１）培養、抽出、分画
日本各地から植物の葉、果実、木の樹液、ため池等の水、土壌等の試料を採取した。試料を表１に示した培地の入った試験管（１８^φ×１８０ｍｍ）に移し、２８℃で１週間振とう培養した。培養液が白濁したものについて、表１に示した寒天平板上に画線して２８℃で４日間培養した。この操作を繰り返して、微生物を単離した。単離した微生物を再び、表１の組成の液体培地１及び２の入った試験管に接種して、２８℃で１週間振とう培養した。培養液が白濁したものについて、酢酸エチルを加えて糖脂質等の脂質成分を抽出した。得られた脂質成分を２Ｎのトリフルオロ酢酸を用いて加水分解し、高速液体クロマトグラフィーを用いて糖の有無を調べた。さらに、表２の液体培地３が４ｍＬ入った試験管に糖の存在が認められた微生物菌株を１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを表２の液体培地４の入った５００ｍＬ容の坂口フラスコに接種して、３０℃で１週間振とう培養した。培養終了後、酢酸エチルを加えて脂質成分を抽出した。エバポレーターを用いて酢酸エチルを留去し、２Ｎのトリフルオロ酢酸で加水分解した後に、ガスクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析した。その結果、マンノース、エリスリトール、マンニトールが検出された。 [Example 1]
<Microbe screening>
1) Culture, extraction, fractionation Samples of plant leaves, fruits, tree sap, water from ponds, soil, etc. were collected from various parts of Japan. The sample was transferred to a test tube (18 ^φ × 180 mm) containing the medium shown in Table 1, and cultured with shaking at 28 ° C. for 1 week. The culture solution turned cloudy was streaked on the agar plate shown in Table 1 and cultured at 28 ° C. for 4 days. This operation was repeated to isolate microorganisms. The isolated microorganism was again inoculated into a test tube containing liquid media 1 and 2 having the composition shown in Table 1, and cultured with shaking at 28 ° C. for 1 week. About the thing in which the culture solution became cloudy, ethyl acetate was added and lipid components, such as glycolipid, were extracted. The obtained lipid component was hydrolyzed using 2N trifluoroacetic acid, and the presence or absence of sugar was examined using high performance liquid chromatography. Furthermore, 1 platinum loop of a microorganism strain in which the presence of sugar was observed was inoculated into a test tube containing 4 mL of the liquid medium 3 in Table 2, and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day. This was inoculated into a 500 mL Sakaguchi flask containing the liquid medium 4 shown in Table 2 and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 week. After completion of the culture, ethyl acetate was added to extract the lipid component. Ethyl acetate was distilled off using an evaporator and hydrolyzed with 2N trifluoroacetic acid, and then the sugar composition was analyzed using gas chromatography and liquid chromatography. As a result, mannose, erythritol and mannitol were detected.

マンノース、エリスリトール、マンニトールが検出された菌株について、表２の組成の液体培地３が４ｍＬ入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間培養を行った。これを表２の液体培地４が１．４Ｌ入った２．５Ｌ容のジャーファメンターに接種して、３０℃、通気量１．５Ｌ／分、撹拌速度８００ｒｐｍで１週間培養した。培養終了後、培養液に酢酸エチルを加えて脂質成分を抽出した。 For the strains in which mannose, erythritol and mannitol were detected, 1 platinum loop was inoculated into a test tube containing 4 mL of the liquid medium 3 having the composition shown in Table 2, and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day. This was inoculated into a Sakaguchi flask containing 100 mL of the medium having the same composition and cultured at 30 ° C. for 2 days. This was inoculated into a 2.5 L jar fermenter containing 1.4 L of the liquid medium 4 shown in Table 2, and cultured at 30 ° C., an aeration rate of 1.5 L / min, and a stirring speed of 800 rpm for one week. After completion of the culture, ethyl acetate was added to the culture solution to extract a lipid component.

２）糖脂質の分離
遠心分離して菌体を除いた培養液から等量の酢酸エチルで脂質成分を抽出した。得られた有機相の溶媒を留去し、残渣をメタノール５００ｍＬに溶解した後、倍量のヘキサンで油脂成分の抽出除去を数回繰り返した。メタノール相の溶媒を留去し、少量のクロロホルムに溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム、アセトン：メタノール溶液＝９：１（容積比）、メタノールの順で溶出させた。糖脂質の含まれるアセトン：メタノール溶出画分を集め、溶媒を留去して糖脂質成分を得た。得られた糖脂質成分を再度クロロホルム１ｍＬに溶解し、イアトロビーズカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：メタノール＝９５：５（容積比）で溶出させ、ＴＬＣで単一のバンドを示す糖脂質５成分を単離した。 2) Separation of glycolipid The lipid component was extracted with an equal amount of ethyl acetate from the culture solution after centrifugation to remove the cells. After the solvent of the obtained organic phase was distilled off and the residue was dissolved in 500 mL of methanol, extraction and removal of the fat and oil component was repeated several times with a double amount of hexane. The solvent of the methanol phase was distilled off, and the residue was dissolved in a small amount of chloroform, which was subjected to silica gel chromatography, and eluted with chloroform, acetone: methanol solution = 9: 1 (volume ratio), and methanol in this order. The fraction eluted with acetone: methanol containing glycolipid was collected, and the solvent was distilled off to obtain a glycolipid component. The obtained glycolipid component was again dissolved in 1 mL of chloroform, subjected to Iatrobead column chromatography, eluted with chloroform: methanol = 95: 5 (volume ratio), and 5 components of glycolipid showing a single band by TLC were obtained. Isolated.

<糖脂質の構造決定>
（１）上記精製した糖脂質５成分を塩酸メタノールで加水分解し、得られた水溶性成分をトリメチルシリル誘導体化し、カラムにＤＢ−５（０．２５ｍｍ×３０ｍ）を用いたガスクロマトグラフィーで解析した。ＴＬＣ上で保持時間の長い精製糖脂質３成分は、マンノースとエリスリトールと考えられるピークがほぼ１：１の比率で検出された。これらのピークの溶出時間は、標準サンプルとして用いたＤ−マンノースとＤ−エリスリトールの溶出時間と完全に一致した。ＴＬＣでの保持時間と併せて、これらの精製糖脂質は、既知のマンノシルエリスリトールリピッドと考えられる。
（２）ＴＬＣ上で保持時間の短い精製糖脂質２成分は、何れもマンノースを示す２本のピークとマンニトールと考えられる１本のピークがほぼ１：１の比率で検出された（図２）。これらのピークの溶出時間は、標準サンプルとして用いたＤ−マンノースとＤ−マンニトールの溶出時間と完全に一致した。
（３）以下、マンノースとマンニトールが検出された精製糖脂質２成分の内、より保持時間の長い糖脂質１成分について説明する。精製糖脂質を２Ｎの塩酸で加水分解して得られた糖混合物を水素化ホウ素ナトリウムで還元した後、アセチル化して得られたアルジトールアセテート誘導体化物を、同じカラムを用いたガスクロ分析した結果では、マンニトールの完全アセチル化物の溶出時間と同じ位置に単一のピークが検出された。
次いで、精製糖脂質を、水酸化カリウムを用いてケン化し、得られたオリゴ糖成分をアルカリ条件下でヨウ化メチルと反応させ、完全メチルエーテル化オリゴ糖を得た。この完全メチル化オリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析では、擬似分子イオンピーク［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ｍ／ｚ４９３が検出された（図１−３）。この分子イオンピークは、完全メチル化されたヘキソシール−ヘキシトールのナトリウムの付加した分子イオンに一致することから、この糖脂質がＤ−マンノースとＤ−マンニトールからなる二糖であることが確認された。 <Determining the structure of glycolipid>
(1) Hydrolysis of the 5 components of the purified glycolipid with methanolic hydrochloric acid, the resulting water-soluble component was converted into a trimethylsilyl derivative, and analyzed by gas chromatography using DB-5 (0.25 mm × 30 m) as a column. . For the three components of purified glycolipid having a long retention time on TLC, peaks considered to be mannose and erythritol were detected at a ratio of approximately 1: 1. The elution times of these peaks completely coincided with the elution times of D-mannose and D-erythritol used as standard samples. Together with the retention time in TLC, these purified glycolipids are considered known mannosyl erythritol lipids.
(2) As for two purified glycolipid components having a short retention time on TLC, two peaks indicating mannose and one peak considered to be mannitol were detected at a ratio of approximately 1: 1 (FIG. 2). . The elution times of these peaks completely coincided with the elution times of D-mannose and D-mannitol used as standard samples.
(3) Among the two purified glycolipid components in which mannose and mannitol were detected, one glycolipid component having a longer retention time will be described below. The result of gas chromatographic analysis using the same column for the alditol acetate derivatized product obtained by reducing the sugar mixture obtained by hydrolyzing the purified glycolipid with 2N hydrochloric acid with sodium borohydride and then acetylating. A single peak was detected at the same position as the elution time of the fully acetylated mannitol.
Subsequently, the purified glycolipid was saponified using potassium hydroxide, and the resulting oligosaccharide component was reacted with methyl iodide under alkaline conditions to obtain a completely methyl etherified oligosaccharide. In MALDI-TOF / MS analysis of this fully methylated oligosaccharide, a pseudo-molecular ion peak [M + Na] ⁺ m / z 493 was detected (FIGS. 1-3). Since this molecular ion peak coincides with the molecular ion of sodium of hexosyl-hexitol that has been completely methylated, it was confirmed that this glycolipid is a disaccharide composed of D-mannose and D-mannitol.

（４）上記（３）で得られた完全メチル化オリゴ糖を酸加水分解した後、重水素化ホウ素ナトリウムで還元し、アセチル化した。得られた部分メチル化アルジトールアセテート混合物を、ＤＢ−５カラムを用いるＧＣ−ＭＳで分析した結果、その溶出位置とマススペクトルから１，５−ジアセチル−２，３，４，６−テトラメチルマンニトールと６−モノアセチル−１，２，３，４，５−ペンタメチルマンニトールと同定できる化合物がモル比１：１の比率で検出された（図３−１）。このうち、１，５−ジアセチル−２，３，４，６−テトラメチルマンニトールのマススペクトルは、１位の水素が重水素に置換されていることを示すフラグメントイオンｍ／ｚ１０２、１１８そして１６２のシグナルが検出されたのに対し（図３−３）、６−モノアセチル−１，２，３，４，５−ペンタメチルマンニトールのマススペクトルは重水素置換を示すシグナルは検出されなかった（図３−２）。このことは、６−モノアセチル−１，２，３，４，５−ペンタメチルマンニトールで表された糖成分はもともと糖アルコールの状態で存在していることを意味しており、この糖脂質の糖鎖配列はＤ−マンノシール１−６−ｍｅｓｏ−マンニトールであると決定できた。
（５）オリゴ糖の結合様式は、¹Ｈ−ＮＭＲにより解析し、マンノースのアノメリックプロトンシグナル４．６５ｐｐｍの結合定数が１．５Ｈｚ以下であったことから、β−結合であると決定できた（図４）。 (4) The fully methylated oligosaccharide obtained in the above (3) was acid-hydrolyzed, then reduced with sodium deuteride and acetylated. The obtained partially methylated alditol acetate mixture was analyzed by GC-MS using a DB-5 column. As a result, 1,5-diacetyl-2,3,4,6-tetramethylmannitol was obtained from the elution position and mass spectrum. And 6-monoacetyl-1,2,3,4,5-pentamethylmannitol were detected at a molar ratio of 1: 1 (FIG. 3-1). Of these, the mass spectrum of 1,5-diacetyl-2,3,4,6-tetramethylmannitol shows that fragment ions m / z 102, 118 and 162 indicate that the hydrogen at the 1-position is replaced with deuterium. While a signal was detected (FIG. 3-3), no signal indicating deuterium substitution was detected in the mass spectrum of 6-monoacetyl-1,2,3,4,5-pentamethylmannitol (FIG. 3-3). 3-2). This means that the sugar component represented by 6-monoacetyl-1,2,3,4,5-pentamethylmannitol is originally present in the form of a sugar alcohol. The sugar chain sequence could be determined to be D-mannosyl 1-6-meso-mannitol.
(5) The binding mode of the oligosaccharide was analyzed by ¹ H-NMR, and the binding constant of mannose anomeric proton signal 4.65 ppm was 1.5 Hz or less, so that it could be determined to be β-bonding. (FIG. 4).

（６）精製糖脂質の脂肪酸は、塩酸メタノールの加水分解物からヘキサンを用いて脂肪酸メチルエステルとして回収した。得られた脂肪酸メチルエステルの混合物をガスクロマトグラフィーにて解析した結果、ｎ−オクタン酸（Ｃ８）約１５質量％、ｎ−デカン酸（Ｃ１０）約６０質量％を主成分とする炭素数６〜１８の飽和脂肪酸と炭素数８〜１２の不飽和脂肪酸（二重結合１個）約２５質量％が検出された。 (6) The fatty acid of the purified glycolipid was recovered as a fatty acid methyl ester from a hydrolyzate of methanolic hydrochloric acid using hexane. As a result of analyzing the obtained mixture of fatty acid methyl esters by gas chromatography, it was found that the main component was about 15% by mass of n-octanoic acid (C8) and about 60% by mass of n-decanoic acid (C10). About 18% of saturated fatty acid and unsaturated fatty acid having 8 to 12 carbon atoms (one double bond) were detected.

（７）精製糖脂質１ｍｇに２０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム／９０％メタノール溶液を１ｍＬ加え、３７℃で反応させた。６時間後、０．０２ｍＬの酢酸と５ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを加えて２時間室温で生じたアルデヒドを還元した。クロロホルム２ｍＬと蒸留水０．７５ｍＬを加えて、２層に分離させた後、過ヨウ素酸酸化された糖脂質成分をクロロホルム層に回収した。得られた糖脂質成分の分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで測定したところ、元の糖脂質より分子量１２０少ない擬似分子イオンピーク［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ｍ／ｚ６１１と６３７が検出された（図１−２）。さらに、この酸化反応物の組成をガスクロマトグラフィーで調べたところ、マンニトールは全く検出されず、マンノースだけが検出された。さらに、上記（５）で示した種類の脂肪酸が同じ割合で検出された。これらの結果は、糖脂質は、過ヨウ素酸処理によりマンニトール残基のＣ４とＣ５の間で切断され、しかもアシル基は、すべてマンノースに置換していることを示唆するものであった。 (7) 1 mL of 20 mM sodium metaperiodate / 90% methanol solution was added to 1 mg of purified glycolipid, and reacted at 37 ° C. After 6 hours, 0.02 mL acetic acid and 5 mg sodium cyanoborohydride were added to reduce the resulting aldehyde for 2 hours at room temperature. After adding 2 mL of chloroform and 0.75 mL of distilled water to separate into two layers, the periodate-oxidized glycolipid component was recovered in the chloroform layer. When the molecular weight of the obtained glycolipid component was measured by MALDI-TOF / MS, pseudo-molecular ion peaks [M + Na] ⁺ m / z 611 and 637 having a molecular weight of 120 less than the original glycolipid were detected (FIG. 1-2). . Further, when the composition of the oxidation reaction product was examined by gas chromatography, mannitol was not detected at all and only mannose was detected. Furthermore, the same type of fatty acid as shown in (5) above was detected. These results suggested that the glycolipid was cleaved between mannitol residues C4 and C5 by periodate treatment, and that all acyl groups were substituted with mannose.

（８）アシル基の結合位置は、過ヨウ素酸酸化糖脂質のＮＭＲにより解析した。この糖脂質の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、既知のマンノシールエリスリトールリピッド（４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−４−ｍｅｓｏ−エリスリトール）のスペクトルと極めて類似していた。特に４．０ｐｐｍより低磁場側の５つのシグナルは、ほぼ一致していることから、それぞれのシグナルは、マンノース残基の各プロトンＨ−１；４．６８１ｐｐｍ、Ｈ−２；５．５０３ｐｐｍ、Ｈ−３；５．０５４、Ｈ−４；５．２２２、Ｈ−６；４．１９８ｐｐｍと同定でき、マンノースの２，３，４，６位には、それぞれアシル基が結合していることが確認された（図５）。これらのシグナルに加えて、高磁場の領域には、アシル基の特性を示すシグナルが観測されており、特に、２．０８１ｐｐｍと２．０１５ｐｐｍのシグナルは、それぞれアセチル基（−ＣＯＣＨ₃）のメチルプロトンの存在を示していることから、マンノースのヒドロキシル基に結合している４分子のアシル基の内２分子は、酢酸であることがわかった。さらにこれよりも少し低磁場のシグナル２．４２２ｐｐｍと２．２０１ｐｐｍは、それぞれ−ＣＯＣＨ₂−基の−ＣＨ₂−プロトンシグナルと同定できることから、これらは２分子の脂肪酸が存在していることを証明している。 (8) The binding position of the acyl group was analyzed by NMR of periodate oxidized glycolipid. The ¹ H-NMR spectrum of this glycolipid shows the known mannosyl erythritol lipid (4,6-di-O-acetyl-2,3-di-O-alkanoyl-β-D-mannopyranosyl 1-4-meso- It was very similar to the spectrum of erythritol. In particular, since the five signals on the lower magnetic field side than 4.0 ppm are almost the same, each signal represents each proton H-1 of the mannose residue; 4.681 ppm, H-2; 5.503 ppm, H -3; 5.054, H-4; 5.222, H-6; 4.198 ppm, and it was confirmed that acyl groups were bonded to positions 2, 3, 4, and 6 of mannose. (FIG. 5). In addition to these signals, signals indicating the properties of acyl groups are observed in the high magnetic field region. In particular, the signals of 2.081 ppm and 2.015 ppm are respectively methyl of the acetyl group (—COCH ₃ ). Since the presence of protons was shown, it was found that two of the four acyl groups bonded to the hydroxyl group of mannose were acetic acid. Furthermore, signals of 2.422 ppm and 2.201 ppm with a slightly lower magnetic field can be identified as -CH ₂ -proton signals of -COCH ₂ -groups, respectively, which proves that two molecules of fatty acids are present. is doing.

各アシル基の結合位置の解析は、ＨＭＢＣ法による２次元ＮＭＲで行った。まず、アセチルメチルプロトンと−ＣＯＣＨ₂−プロトンに隣接しているカルボニル基（−ＣＯ−）のカーボンのシグナルを求めたところ、それぞれのプロトン（２．０１５ｐｐｍ、２．０８１ｐｐｍ、２．２０１ｐｐｍ、２．４２２ｐｐｍ）とカップリングした４つのカーボンシグナル（１７０．４ｐｐｍ、１７１．６ｐｐｍ、１７３．６ｐｐｍ、１７４．１ｐｐｍ）が認められた（図６）。続いて、このカルボニル基のシグナルとカップリングするマンノースのプロトンを検索したところ、１７０．４ｐｐｍのシグナルとマンノースのＨ−４プロトン（５．２２２ｐｐｍ）が、１７１．６ｐｐｍのシグナルとマンノースのＨ−６プロトン（４．１９８ｐｐｍ）が、そして１７３．６ｐｐｍと１７４．１ｐｐｍのシグナルはマンノースのＨ−３とＨ−２プロトン（５．０５４ｐｐｍと５．５０３ｐｐｍ）とそれそれカップリングしていることが示された。これらのことはすなわち、４分子のアシル基のうち、アセチル基は、マンノースの４位と６位に、そして脂肪酸は、２位と３位にそれぞれエステル結合していることを示している。
以上のことから、本糖脂質の構造は、４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトールであると決定できた。 The analysis of the binding position of each acyl group was performed by two-dimensional NMR by the HMBC method. First, the carbon signals of the carbonyl group (—CO—) adjacent to the acetylmethyl proton and —COCH ₂ —proton were determined, and the respective protons (2.015 ppm, 2.081 ppm, 2.201 ppm, 2. 422 ppm) and four carbon signals (170.4 ppm, 171.6 ppm, 173.6 ppm, 174.1 ppm) were observed (FIG. 6). Subsequently, when the mannose proton coupled to the carbonyl group signal was searched, the 170.4 ppm signal and the mannose H-4 proton (5.222 ppm) were converted to the 171.6 ppm signal and the mannose H-6. The protons (4.198 ppm), and the 173.6 and 174.1 ppm signals are shown to be coupled to the mannose H-3 and H-2 protons (5.054 ppm and 5.503 ppm), respectively. It was. These facts indicate that, among the four acyl groups, the acetyl group is ester-bonded at the 4- and 6-positions of mannose, and the fatty acid is ester-bonded at the 2 and 3 positions, respectively.
From the above, the structure of this glycolipid was determined to be 4,6-di-O-acetyl-2,3-di-O-alkanoyl-β-D-mannopyranosyl 1-6-meso-mannitol. .

<糖脂質の物性>
得られた糖脂質は無色の油状物であった。
質量分析（ＭＳ）
擬似分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］⁺ ７３１，７５７（図１−１）
溶媒への溶解性
易溶性：アセトン、メタノール、エタノール
溶解性：クロロホルム
難容性：エーテル、水 <Physical properties of glycolipid>
The resulting glycolipid was a colorless oil.
Mass spectrometry (MS)
Pseudomolecular ion [M + Na] ⁺ 731,757 (FIG. 1-1)
Solubility in solvents Easy solubility: acetone, methanol, ethanol Solubility: chloroform Intolerance: ether, water

本菌体から得られる糖骨格がマンノシールマンニトールからなる糖脂質は、上記の成分以外に、分子量が４２少ない成分も存在しており、これらについても、同様の解析を行い、４モノ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル１−６−ｍｅｓｏ−マンニトールであることを確認した。 In addition to the above components, glycolipids having a sugar skeleton obtained from the present microbial skeleton consisting of mannosyl mannitol also have components having a molecular weight of 42. It was confirmed to be -acetyl-2,3-di-O-alkanoyl-β-D-mannopyranosyl 1-6-meso-mannitol.

以上のことより、シュードジーマ属ｓｐ．ＴＭ−４５３株は、既知のマンノシルエリスリトールリピッドとマンノシルマンニトールリピッドをその培養液中に生産する。 From the above, Pseudosima sp. The TM-453 strain produces known mannosyl erythritol lipids and mannosyl mannitol lipids in the culture medium.

＜発酵生産＞
ポテトデキストロース培地に保存しておいたシュードジーマｓｐ．ＴＭ−４５３株を表２の液体培地３が４ｍＬ入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行った。これを同じ組成の培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間培養を行った。さらに、これを表２の液体培地４が１．４Ｌ入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で１．５Ｌ／分の通気速度と８００ｒｐｍの撹拌速度で本培養を開始した。１日に１乃至２回培養液を無菌的に採取して、培養液中の各成分を経時的に測定した。ＭＥＬ、トリグリセリド、ジグリセリド、脂肪酸は、採取した培養液に酢酸エチルを加えて激しく振とうした後に静置し、上清の酢酸エチル層を回収した。脂質成分をＴＬＣプレートにチャージして展開する。展開終了後、オルシノール硫酸試薬で糖脂質を発色させた結果、ＭＭＬの位置にスポットを確認した。イアトロスキャンを用いて糖脂質を分析した結果、８．２ｇ／Ｌの糖脂質を生産していた。２Ｎのトリフルオロ酢酸で加水分解して、高速液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析した結果、エリスリトールとマンニトールの混合比（モル比）は、６２：３８であった。これは、マンノースに結合している脂肪酸の炭素数が異なるために正確な値ではないが、生産糖脂質の約３８モル％がＭＭＬであると見積もることができる。 <Fermentation production>
Pseudozyma sp. Stored in potato dextrose medium. One platinum loop of TM-453 strain was inoculated into a test tube containing 4 mL of the liquid medium 3 shown in Table 2, and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day. This was inoculated into a Sakaguchi flask containing 100 mL of the medium having the same composition and cultured at 30 ° C. for 2 days. Further, this was inoculated into a jar fermenter containing 1.4 L of the liquid medium 4 in Table 2, and main culture was started at 30 ° C. with an aeration rate of 1.5 L / min and an agitation rate of 800 rpm. The culture solution was aseptically collected once or twice a day, and each component in the culture solution was measured over time. MEL, triglyceride, diglyceride and fatty acid were allowed to stand after adding ethyl acetate to the collected culture and shaken vigorously, and the ethyl acetate layer of the supernatant was recovered. The lipid component is charged on the TLC plate and developed. After the development, as a result of coloring the glycolipid with orcinol sulfate reagent, a spot was confirmed at the position of MML. As a result of analyzing the glycolipid using Iatroscan, 8.2 g / L of glycolipid was produced. As a result of hydrolysis with 2N trifluoroacetic acid and analysis of the sugar composition using high performance liquid chromatography, the mixing ratio (molar ratio) of erythritol and mannitol was 62:38. This is not an accurate value because the number of carbon atoms of the fatty acid bonded to mannose is different, but it can be estimated that about 38 mol% of the produced glycolipid is MML.

精製した糖脂質の界面活性能は水の表面張力低下能として測定した。糖脂質１０ｍｇに１００ｍＬの蒸留水を加え超音波処理し、０．１ｇ／Ｌ濃度の懸濁溶液を作製した。この母液から順に希釈溶液を調製し、デュヌイの表面張力計を用いて各々の濃度の糖脂質溶液の表面張力を測定した。測定温度は２５℃で行った。その結果、糖脂質溶液の表面張力は約３２ｄｙｎｅ／ｃｍにまで減少した（図７）。この値は、標準物質として用いたラウリル硫酸ナトリウム（２．３ｇ／Ｌ）の（３４ｄｙｎｅ／ｃｍ）とほぼ同程度の表面張力低下能であった。一方、この時の臨界ミセル濃度は、０．００９１ｇ／Ｌ（１．３×１０^-5Ｍ）で、ラウリル硫酸ナトリウムに比べて１００倍以上の薄い濃度であった。 The surface active ability of the purified glycolipid was measured as the ability to reduce the surface tension of water. 100 mL of distilled water was added to 10 mg of glycolipid and sonicated to prepare a suspension solution having a concentration of 0.1 g / L. Diluted solutions were prepared in order from this mother liquor, and the surface tension of each concentration of glycolipid solution was measured using a Dunui surface tension meter. The measurement temperature was 25 ° C. As a result, the surface tension of the glycolipid solution was reduced to about 32 dyne / cm (FIG. 7). This value was approximately the same surface tension reducing ability as that of (34 dyne / cm) of sodium lauryl sulfate (2.3 g / L) used as a standard substance. On the other hand, the critical micelle concentration at this time was 0.0091 g / L (1.3 × 10 ⁻⁵ M), which was 100 times thinner than sodium lauryl sulfate.

［実施例２］
本培養において、大豆油の代わりにリノール酸を用いる以外は実施例１と同様に培養を行った。実施例１と同様にＴＬＣプレート上でＭＭＬの位置にスポットを確認した。イアトロスキャンを用いて糖脂質を分析した結果、７．６ｇ／Ｌの糖脂質を生産していた。２Ｎのトリフルオロ酢酸で加水分解して、高速液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析した結果、エリスリトールとマンニトール（モル比）の混合比は、６０：４０であった。 [Example 2]
In the main culture, the culture was performed in the same manner as in Example 1 except that linoleic acid was used instead of soybean oil. As in Example 1, a spot was confirmed at the MML position on the TLC plate. As a result of analyzing glycolipids using Iatroscan, 7.6 g / L glycolipids were produced. As a result of hydrolysis with 2N trifluoroacetic acid and analysis of the sugar composition using high performance liquid chromatography, the mixing ratio of erythritol and mannitol (molar ratio) was 60:40.

［実施例３］
本培養において、大豆油の代わりにオクタデカンを用いる以外は実施例１と同様に培養を行った。実施例１と同様にＴＬＣプレート上でＭＭＬの位置にスポットを確認した。イアトロスキャンを用いて糖脂質を分析した結果、０．７ｇ／Ｌの糖脂質を生産していた。２ＮのＴＦＡで加水分解して、高速液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析した結果、エリスリトールとマンニトールの混合比は、６７：３３であった。 [Example 3]
In the main culture, the culture was performed in the same manner as in Example 1 except that octadecane was used instead of soybean oil. As in Example 1, a spot was confirmed at the MML position on the TLC plate. As a result of analyzing the glycolipid using Iatroscan, 0.7 g / L of glycolipid was produced. As a result of hydrolysis with 2N TFA and analysis of the sugar composition using high performance liquid chromatography, the mixing ratio of erythritol and mannitol was 67:33.

［実施例４］
本培養において、大豆油の代わりにグルコースを用いる以外は実施例１と同様に培養を行った。実施例１と同様にＴＬＣプレート上でＭＭＬの位置にスポットを確認した。イアトロスキャンを用いて糖脂質を分析した結果、１．２ｇ／Ｌの糖脂質を生産していた。２ＮのＴＦＡで加水分解して、高速液体クロマトグラフィーを用いて糖組成を分析した結果、エリスリトールとマンニトールの混合比（モル比）は、６５：３５であった。 [Example 4]
In the main culture, the culture was performed in the same manner as in Example 1 except that glucose was used instead of soybean oil. As in Example 1, a spot was confirmed at the MML position on the TLC plate. As a result of analyzing the glycolipid using Iatroscan, 1.2 g / L of glycolipid was produced. As a result of hydrolysis with 2N TFA and analysis of the sugar composition using high performance liquid chromatography, the mixing ratio (molar ratio) of erythritol and mannitol was 65:35.

実施例１に係る糖脂質の質量分析のチャートである。2 is a mass spectrometry chart of a glycolipid according to Example 1. 実施例１に係る糖脂質の過ヨウ素酸酸化物の質量分析のチャートである。1 is a mass spectrometry chart of periodate oxides of glycolipids according to Example 1. 実施例１に係る脱アシル化糖脂質の完全メチル化物の質量分析チャートである。2 is a mass spectrometry chart of a completely methylated product of a deacylated glycolipid according to Example 1. FIG. 実施例１に係る糖脂質の糖鎖の糖分析チャートである。1 is a sugar analysis chart of a sugar chain of a glycolipid according to Example 1. 実施例１に係る完全メチル化物の糖分析チャートである。1 is a sugar analysis chart of a fully methylated product according to Example 1. 図３−１のピーク１成分の質量分析チャートである。It is a mass spectrometry chart of the peak 1 component of Drawing 3-1. 図３−１のピーク２成分の質量分析チャートである。It is a mass spectrometry chart of the peak 2 component of Drawing 3-1. 実施例１に係る完全メチル化物の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。1 is a ¹ H-NMR spectrum of a completely methylated product according to Example 1. 実施例１に係る糖脂質の過ヨウ素酸酸化物の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。1 is a ¹ H-NMR spectrum of periodate oxide of a glycolipid according to Example 1. 実施例１に係る糖脂質の過ヨウ素酸酸化物のＨＭＢＣスペクトルである。2 is an HMBC spectrum of periodate oxide of a glycolipid according to Example 1. ＭＭＬ濃度に対する表面張力をプロットしたグラフである。It is the graph which plotted the surface tension with respect to MML density | concentration.

Claims

A glycolipid represented by the following formula (1).

(In the formula, RCO is an aliphatic acyl group having 6 to 20 carbon atoms, RCO is an ester bond with the hydroxyl groups at the 2nd and 3rd positions of mannose among the constituent elements of mannose and mannitol, n is 2 and an acetyl group may be bonded to the remaining hydroxyl group of mannose .)

The glycolipid according to claim 1, wherein RCO is a straight-chain saturated aliphatic acyl group having 6 to 20 carbon atoms.

The glycolipid according to claim 1, wherein RCO is a straight-chain unsaturated aliphatic acyl group having 6 to 20 carbon atoms.

2. The glycolipid according to claim 1, wherein RCO is a mixture of saturated and unsaturated linear aliphatic acyl groups having 6 to 20 carbon atoms.

The glycolipid according to claim 1, wherein RCO is a mixture of a saturated aliphatic acyl group having 6 to 18 carbon atoms and an unsaturated aliphatic acyl group having 8 to 12 carbon atoms.

The glycolipid according to any one of claims 1 to 5, wherein a microorganism belonging to the genus Pseudoma is cultured and obtained from the culture.

The glycolipid according to claim 6, wherein the microorganism is TM-453.

4,6-di-O-acetyl-2,3-di-O-alkanoyl-β-D-mannopyranosyl 1-6-meso-mannitol or 4mono-O-acetyl-2,3-di-O-alkanoyl- β-D-mannopyranosyl 1-6-meso-mannitol.

The method for producing a glycolipid according to claim 1, wherein a microorganism belonging to the genus Pseudozima is cultured, and the glycolipid is recovered from the culture.

The method for producing a glycolipid according to claim 9, wherein the microorganism is TM-453.

The method for producing a glycolipid according to claim 9 or 10, wherein a linear aliphatic hydrocarbon having 6 to 24 carbon atoms is added to the production medium.

The method for producing a glycolipid according to claim 9 or 10, wherein a fatty acid having 6 to 24 carbon atoms is added to the production medium.

The method for producing a glycolipid according to claim 9 or 10, wherein a triglyceride containing a linear aliphatic hydrocarbon group having 6 to 24 carbon atoms is added to the production medium.

The method for producing a glycolipid according to claim 9 or 10, wherein a carbohydrate is added to the production medium.