JP2010207095A - Method for developing lateral root of rice plant - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、低窒素条件下で培養することにより、野生型のイネと比して、側根が発達したイネを製造する方法及びイネの側根を発達させる方法に関する。 The present invention relates to a method for producing rice with a developed side root and a method for developing a side root of rice by culturing under low nitrogen conditions as compared to wild-type rice.
窒素は植物の生長を支える重要な栄養素の一つである。窒素には植物の発育を促進する働きがある。例えば、過去40年間で世界の作物生産量を2倍にするため、それまでの7倍の窒素肥料が使用された。しかし、植物の生長を促すために窒素を大量に消費することには、種々の問題がある。 Nitrogen is one of the important nutrients that support plant growth. Nitrogen works to promote plant growth. For example, seven times as much nitrogen fertilizer has been used to double global crop production over the past 40 years. However, there are various problems in consuming a large amount of nitrogen to promote plant growth.
大量に土壌に投入された窒素は、地下水などを経由して湖沼や海洋に流れ、プランクトンの異常発生などの環境汚染を引き起こす。さらに大量の窒素の土壌への投入は、家畜障害をもたらし得る。例えば、大量に窒素を吸収した土壌で育てた草を摂取した牛などの家畜は、胃の中でN−ニトロソ化合物を生成し、癌を発症する可能性が高くなる他、乳中の硝酸態窒素量が増加するため、高窒素下で生育した乳牛の乳を飲んだ乳幼児はヘモグロビン血症を引き起こす可能性が高くなる。さらに、近年では、原料となる化石燃料の値上り等から窒素肥料が高騰し、大量の窒素肥料の使用を必要とする農法は農家の収益を低下させる。 A large amount of nitrogen introduced into the soil flows into lakes and oceans via groundwater and causes environmental pollution such as the occurrence of plankton abnormalities. In addition, large amounts of nitrogen input to the soil can cause livestock damage. For example, livestock such as cows that have ingested grass grown on soil that has absorbed a large amount of nitrogen produces N-nitroso compounds in the stomach, increasing the possibility of developing cancer, and the nitrate state in milk. As the amount of nitrogen increases, infants drinking milk from dairy cows grown under high nitrogen are more likely to cause hemoglobinemia. Furthermore, in recent years, nitrogen fertilizers have soared due to rising prices of fossil fuels as raw materials, and farming methods that require the use of large amounts of nitrogen fertilizers reduce the profits of farmers.
上記窒素の大量消費に関する問題を解決する試みとして、現在は、窒素利用効率を高めることにより、低窒素条件下で、バイオマスを含む植物の収量を向上させることが研究されている。植物の窒素利用効率を高めるためには、植物の窒素の吸収能及び同化能の向上が求められる。このうち、窒素の吸収能を高めるためのアプローチとして、窒素吸収の場である根の形(root architecture)を改良する試みがある。 As an attempt to solve the above-mentioned problems related to mass consumption of nitrogen, research is currently being conducted to improve the yield of plants including biomass under low nitrogen conditions by increasing the nitrogen utilization efficiency. In order to increase the nitrogen utilization efficiency of plants, it is required to improve the nitrogen absorption ability and assimilation ability of plants. Among them, as an approach for increasing the nitrogen absorption capacity, there is an attempt to improve the root architecture, which is a field of nitrogen absorption.
植物の根は大きく主根と側根に分けられる。一般に、イネを含む植物では、窒素源が少なすぎると側根が形成されず、主根のみが伸長するが、窒素があると、窒素を効率よく吸収するために主根から側根が分化し伸長する。これまでに本発明者らは、細胞膜局在性のRING−H2型ユビキチンリガーゼであるEL5のアミノ酸配列の一部に変異を入れた変異EL5を発現するイネを、20.6mMの硫酸アンモニウム、18.8mMの硝酸カリウム及び3.0mMの塩化カルシウムを含むMS培地で培養すると根が褐変化して伸びないが(非特許文献1)、次いで水道水か純水で4日間栽培することにより主根を発根させる方法を報告した(非特許文献2)。さらに、シロイヌナズナをオーキシンの存在下で培養することにより、シロイヌナズナの側根を伸長させ得るとの報告がある(非特許文献3)。 Plant roots are broadly divided into main and side roots. In general, in plants containing rice, when there are too few nitrogen sources, the side roots are not formed and only the main roots are elongated, but when nitrogen is present, the side roots differentiate and extend from the main roots in order to absorb nitrogen efficiently. So far, the present inventors have used 20.6 mM ammonium sulfate, and rice that expresses mutant EL5 in which a part of the amino acid sequence of EL5, which is a RING-H2 type ubiquitin ligase localized in cell membrane, is mutated. When cultured in MS medium containing 8 mM potassium nitrate and 3.0 mM calcium chloride, the roots turn brown and do not grow (Non-Patent Document 1), but then root the roots by cultivating them in tap water or pure water for 4 days. The method was reported (nonpatent literature 2). Furthermore, it has been reported that the side roots of Arabidopsis thaliana can be elongated by culturing Arabidopsis thaliana in the presence of auxin (Non-patent Document 3).
側根が長く伸びた植物は、根全体の表面積が大きく、窒素の吸収能が高いことが予想され、低窒素条件下でも生育が阻害されないことが期待される。また、植物に与える窒素肥料の使用量を低減することにより、環境や家畜に対して負荷が少なく、かつ低コストである農業が可能となる。そこで、低窒素条件下で栽培し得る、側根数が多く、長い植物を製造する方法が求められている。 A plant with long side roots is expected to have a large surface area of the whole root and a high nitrogen-absorbing capacity, and growth is not inhibited even under low nitrogen conditions. In addition, by reducing the amount of nitrogen fertilizer used for plants, it is possible to carry out agriculture with less burden on the environment and livestock and at a lower cost. Therefore, there is a demand for a method for producing a long plant having a large number of side roots that can be cultivated under low nitrogen conditions.
しかし、従来知られている技術のうち非特許文献2に記載の方法は、イネの主根を形成させる方法であり、イネの側根を形成させる方法ではない。また、非特許文献3に記載されているように、シロイヌナズナの側根はオーキシンによって伸長し得る。しかし、イネの側根がオーキシンによって伸長することについてはこれまでに知られておらず、例えイネの側根がオーキシンによって伸長するとしても、オーキシンは主根の伸長を抑制することから、オーキシンによってイネの根全体の表面積を増加させることができないと予測される。 However, among the conventionally known techniques, the method described in Non-Patent Document 2 is a method of forming a main root of rice, and is not a method of forming a side root of rice. Moreover, as described in Non-Patent Document 3, the side roots of Arabidopsis thaliana can be extended by auxin. However, it has not been known so far that the lateral root of rice is elongated by auxin, and even if the lateral root of rice is elongated by auxin, auxin suppresses the elongation of the main root. It is predicted that the overall surface area cannot be increased.
したがって、土壌中の窒素を効率よく吸収させるために、主根の伸長を抑制することなく、野生型のイネと比べて、側根が長い又は側根の数が多いイネ、すなわち側根が発達したイネを製造する方法はこれまでに知られていない。 Therefore, in order to efficiently absorb nitrogen in the soil, it is possible to produce rice with a longer side root or a larger number of side roots compared to wild-type rice, that is, rice with developed side roots, without suppressing the elongation of the main root. How to do is not known so far.
そこで、本発明の目的は、主根の伸長をほとんど抑制することなく、野生型のイネと比べて、側根が発達したイネを製造する方法及びイネの側根を発達させる方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing rice having a developed side root and a method for developing a side root of rice, compared with wild-type rice, with little suppression of elongation of the main root.
本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、EL5のドメインIVのアミノ酸配列における、第162位のバリンがアラニンへ置換されたV162A変異EL5を発現する形質転換イネを、窒素源として1mM未満の硝酸カリウム又は10mM未満の硫酸アンモニウムを含む培地を用いて培養することにより、野生型のイネより側根の数が多いイネを得ることに成功した。この低窒素条件下で培養することにより側根が発達したイネが得られるとの現象は、土壌中の窒素源が少ないと、側根の伸長がはじまる部分である側根原基の分化及び伸長がほとんど起こらないが、窒素源が増えると側根形成が促進されるというこれまでの知見に相反する現象であり、本発明者らにとっては驚くべき現象であった。また、主根の伸長と側根の発達は別機構で制御されていることが知られている。非特許文献3に記載されている通り、オーキシン処理により、側根は発達するが、主根の伸長は抑制される。また、窒素源が豊富な環境下でイネを栽培すると、上記の通り、側根は発達するが、主根の伸長は抑制される。しかし、上記現象は、主根の伸長機構に影響を与えることなく、側根の発達を促進するものであった。すなわち、上記現象は、主根の伸長を抑制せずに、側根の発達を促進することができる現象であった。 As a result of diligent research, the inventors of the present invention have used, as a nitrogen source, less than 1 mM of a transformed rice expressing a V162A mutant EL5 in which the valine at position 162 is substituted with alanine in the amino acid sequence of domain IV of EL5. By culturing using a medium containing potassium nitrate or ammonium sulfate of less than 10 mM, rice having a larger number of lateral roots than wild type rice was successfully obtained. The phenomenon that cultivated rice under this low nitrogen condition yields rice with developed lateral roots is that when there are few nitrogen sources in the soil, the lateral root primordium, which is the part where lateral roots begin to grow, is almost differentiated and elongated. Although it is not a phenomenon that contradicts the previous knowledge that lateral root formation is promoted when the nitrogen source is increased, it was a surprising phenomenon for the present inventors. It is also known that main root elongation and lateral root development are controlled by separate mechanisms. As described in Non-Patent Document 3, side roots are developed by auxin treatment, but elongation of main roots is suppressed. Moreover, when rice is cultivated in an environment rich in nitrogen source, as described above, lateral roots develop, but elongation of main roots is suppressed. However, the above phenomenon promoted the development of lateral roots without affecting the elongation mechanism of the main roots. That is, the above phenomenon is a phenomenon that can promote the development of the lateral root without suppressing the elongation of the main root.
さらに本発明者らは、変異EL5の発現を、野生型のEL5の発現を制御するEL5遺伝子プロモーターで制御することにより、上記と異なる態様の変異EL5(例えば、W165A変異EL5など)を発現する形質転換イネが、低窒素条件下で側根を発達させ得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。 Furthermore, the present inventors control the expression of mutant EL5 with an EL5 gene promoter that controls the expression of wild-type EL5, thereby expressing a mutant EL5 having a different aspect from the above (for example, W165A mutant EL5). It has been found that converted rice can develop lateral roots under low nitrogen conditions. The present invention has been completed based on these findings.
したがって、本発明によれば、変異があるEL5を発現する形質転換イネを、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて野生型のイネの生育に適した条件下で培養して、該条件下で培養した野生型のイネより側根が長い及び/又は側根の数が多いイネを得ることを含む、側根が発達したイネを製造する方法が提供される。 Therefore, according to the present invention, transformed rice expressing EL5 having a mutation is used under conditions suitable for growth of wild-type rice using a medium containing less than 1 mM nitrate or less than 10 mM ammonium salt as a nitrogen source. A rice having a longer side root and / or a larger number of side roots than wild-type rice cultivated under such conditions is provided.
本発明の別の側面によれば、変異があるEL5を発現する形質転換イネを、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて野生型のイネの生育に適した条件下で培養することを含む、イネの側根を発達させる方法が提供される。 According to another aspect of the present invention, transformed rice expressing EL5 with a mutation is suitable for growing wild-type rice using a medium containing less than 1 mM nitrate or less than 10 mM ammonium salt as a nitrogen source. A method is provided for developing rice lateral roots, comprising culturing under conditions.
好ましくは、前記変異があるEL5が、EL5のドメインIVに変異があるEL5である。 Preferably, the EL5 having the mutation is EL5 having a mutation in domain IV of EL5.
好ましくは、前記ドメインIVに変異があるEL5が、ドメインIVのアミノ酸配列において1から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも1種の変異があるEL5である。 Preferably, EL5 having a mutation in domain IV has at least one mutation selected from the group consisting of deletion, substitution, inversion, addition and insertion of one to a plurality of amino acids in the amino acid sequence of domain IV EL5.
好ましくは、前記ドメインIVに変異があるEL5が、EL5のアミノ酸配列における、第162位のバリン、第138位のロイシン、第165位のトリプトファン、及び第153位のシステインからなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸残基が野生型とは異なるアミノ酸残基へ置換されたEL5である。 Preferably, EL5 having a mutation in domain IV is at least selected from the group consisting of valine at position 162, leucine at position 138, tryptophan at position 165, and cysteine at position 153 in the amino acid sequence of EL5. EL5 in which one amino acid residue is substituted with an amino acid residue different from the wild type.
好ましくは、前記ドメインIVに変異があるEL5が、EL5のアミノ酸配列における第162位のバリンがアラニンへ置換されたEL5である。 Preferably, EL5 having a mutation in domain IV is EL5 in which the valine at position 162 in the amino acid sequence of EL5 is substituted with alanine.
好ましくは、前記形質転換イネが、変異があるEL5をコードする遺伝子をEL5遺伝子プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来35Sプロモーター、及びトウモロコシ由来ユビキチンプロモーターからなる群から選ばれる少なくとも1種のプロモーターの制御下に含む。 Preferably, the transformed rice contains a gene encoding EL5 having a mutation under the control of at least one promoter selected from the group consisting of an EL5 gene promoter, a cauliflower mosaic virus-derived 35S promoter, and a corn-derived ubiquitin promoter. .
好ましくは、前記硝酸塩が、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム及び亜硝酸ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも1種の硝酸塩である。 Preferably, the nitrate is at least one nitrate selected from the group consisting of potassium nitrate, sodium nitrate, potassium nitrite and sodium nitrite.
好ましくは、前記アンモニウム塩が、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムからなる群から選ばれる少なくとも1種のアンモニウム塩である。 Preferably, the ammonium salt is at least one ammonium salt selected from the group consisting of ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate and ammonium acetate.
好ましくは、前記培養が、5〜10日間実施される。 Preferably, the culture is performed for 5 to 10 days.
本発明によれば、低窒素条件下で、野生型のイネより側根が長い及び/又は側根の数が多いイネを得ることができる。通常、窒素濃度を上げれば、側根を発達させることができるが、主根の伸長は抑制される。しかし、本発明はこの逆の現象を利用するものであり、窒素濃度を下げることにより、主根の伸長をほとんど抑制することなく、側根を発達させることができる。このような低窒素条件下でのイネの栽培によって、野生型のイネの栽培と比べて、環境や家畜への影響を低減し、かつ経済性に有利な農業の実現が期待できる。 According to the present invention, rice having a longer side root and / or a larger number of side roots than wild-type rice can be obtained under low nitrogen conditions. Usually, if the nitrogen concentration is increased, lateral roots can be developed, but elongation of the main roots is suppressed. However, the present invention utilizes the reverse phenomenon, and by reducing the nitrogen concentration, the lateral root can be developed with almost no suppression of the main root elongation. By cultivating rice under such a low nitrogen condition, it is possible to reduce the impact on the environment and livestock compared to wild-type rice cultivation, and to realize agriculture that is economically advantageous.
以下に、本発明の詳細について説明する。
本発明は、側根が発達したイネを製造する方法及びイネの側根を発達させる方法に関する。本発明の側根が発達したイネを製造する方法は、変異があるEL5を発現する形質転換イネを、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて野生型のイネの生育に適した条件下で培養して、該条件下で培養した野生型のイネより側根が長い又は側根の数が多いイネを得ることを含む。以下に、本発明の側根が発達したイネを製造する方法について順を追って説明する。
Details of the present invention will be described below.
The present invention relates to a method for producing rice having developed lateral roots and a method for developing rice lateral roots. The method for producing a rice having developed lateral roots according to the present invention comprises transforming rice expressing EL5 having a mutation into a wild-type rice using a medium containing less than 1 mM nitrate or less than 10 mM ammonium salt as a nitrogen source. It includes culturing under conditions suitable for growth and obtaining rice having a longer side root or a larger number of side roots than wild-type rice cultivated under the condition. Hereinafter, a method for producing rice with developed side roots according to the present invention will be described step by step.
1.変異があるEL5を発現する形質転換イネ
EL5は、GenBankなどにおいてアクセッション番号:AB045120として登録されている、細胞膜局在性のユビキチンリガーゼ(以下、E3ともいう)の一種である。EL5をコードする遺伝子(以下、EL5遺伝子ともいう)は、イネの内在性の遺伝子であり、GenBankなどにおいて上記アクセッション番号として登録されている。
1. Transformed rice EL5 that expresses mutated EL5 is a kind of cell membrane-localized ubiquitin ligase (hereinafter also referred to as E3) registered under the accession number: AB045120 in GenBank and the like. A gene encoding EL5 (hereinafter also referred to as EL5 gene) is an endogenous gene of rice, and is registered as the accession number in GenBank and the like.
図1に示す通り、野生型のEL5は、5つのドメイン(I:第36位〜第64位:膜貫通領域、II:第65位〜第97位:塩基性アミノ酸領域、III:第98位〜第128位:保存領域、IV:第129位〜第181位:RING−H2ドメイン、V:第182位〜第325位:C末端領域)を有する。変異があるEL5(以下、変異EL5ともいう)は、上記ドメイン1〜5のいずれか1種又は2種以上のドメインにおける1個又は2個以上のアミノ酸残基に変異があるものを意味するが、変異の数や態様については、特に制限はない。 As shown in FIG. 1, wild-type EL5 has 5 domains (I: 36th to 64th: transmembrane region, II: 65th to 97th: basic amino acid region, III: 98th position) -128th: conserved region, IV: 129th-181st: RING-H2 domain, V: 182nd-325th: C-terminal region). The EL5 having a mutation (hereinafter also referred to as a mutant EL5) means one having one or two or more amino acid residues in any one or two or more of domains 1 to 5 having a mutation. There are no particular restrictions on the number and mode of mutations.
変異EL5の具体例として、図1に、ドメインIVに変異があるEL5の模式図を示す。図1において、EL5C153A、EL5V162A及びEL5W165Aは、ドメインIVに存在するEL5の第153位のシステイン、第162位のバリン及び第165位のトリプトファンがそれぞれアラニンへ置換された変異EL5である。 As a specific example of the mutation EL5, FIG. 1 shows a schematic diagram of EL5 having a mutation in domain IV. In FIG. 1, EL5C153A, EL5V162A, and EL5W165A are mutant EL5s in which cysteine at position 153, valine at position 162, and tryptophan at position 165 of EL5 in domain IV are respectively substituted with alanine.
EL5のインビトロ(in vitro)でのE3活性は、ドメインIVであるRING-H2ドメインとユビキチン結合酵素(E2)との相互作用の程度で決まり、Katohら(JBC, 280, 41015, 2005)によって報告されている。すなわち、図1に示す通り、EL5C153AとEL5W165AはE3活性が実質的に消失しており、EL5V162AはE3活性が野生型に対して低下している。EL5L138AのE3活性はEL5V162Aよりもさらに低下している。本発明の範囲に影響を及ぼさない程度の推測として、側根が発達したイネを得るためには、E3活性が実質的に消失している変異EL5を発現するイネを得るよりも、EL5V162AやEL5L 138Aなど、E3活性を低下させた変異EL5を発現するイネを得る方が好ましい場合もある。E3活性は、以下の方法で定性的に測定することができる。 The in vitro E3 activity of EL5 is determined by the degree of interaction between domain IV RING-H2 domain and ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and is reported by Katoh et al. (JBC, 280, 41015, 2005) Has been. That is, as shown in FIG. 1, EL5C153A and EL5W165A have substantially lost E3 activity, and EL5V162A has E3 activity reduced with respect to the wild type. The E3 activity of EL5L138A is further reduced than EL5V162A. As a speculation that does not affect the scope of the present invention, in order to obtain rice having developed lateral roots, EL5V162A and EL5L 138A are obtained rather than obtaining rice expressing mutant EL5 in which E3 activity is substantially lost. For example, it may be preferable to obtain rice that expresses mutant EL5 with reduced E3 activity. E3 activity can be qualitatively measured by the following method.
EL5のインビトロE3活性は、Matsudaらの方法(J. Cell Sci., 114, 1949, 2001)を基にした、Takaiら(Plant Journal 30, 447, 2002)の方法や、Katohら(JBC,280, 41015, 2005)の方法で測定することができる。すなわち、EL5の第96位のグリシンから第181位のバリンまでのRING-H2ドメインを含む領域をマルトース結合タンパク質(MBP)のC末端に融合させた組換えタンパク質(MBP-EL5)を大腸菌を使って調製する。このMBP-EL5にユビキチン、ユビキチン結合酵素、ユビキチン活性化酵素、ATPなどを混ぜ、30℃か35℃で1〜2時間インキュベートする。反応物を抗MBP抗体や抗ユビキチン抗体を用いて、通常のウェスタン分析を行うと、用いたEL5のRING-H2ドメインにユビキチン連結酵素活性(ユビキチンリガーゼ活性又はE3活性ともいう)に応じて、MBPのリジン残基にユビキチンが連結されたために分子量が増加したことによる、電気泳動で高分子側にシフトしたバンドが検出される。E3活性がなければ、バンドのシフトは認められず、E3活性が低下していれば、シフトしたバンドの濃さが元のMBP-EL5を反応させたときよりも薄くなる。 The in vitro E3 activity of EL5 is based on the method of Takai et al. (Plant Journal 30, 447, 2002) based on the method of Matsuda et al. (J. Cell Sci., 114, 1949, 2001), Katoh et al. (JBC, 280 , 41015, 2005). That is, a recombinant protein (MBP-EL5) in which the region containing the RING-H2 domain from glycine at position 96 to valine at position 181 of EL5 is fused to the C-terminus of maltose binding protein (MBP) is used in E. coli. Prepare. This MBP-EL5 is mixed with ubiquitin, ubiquitin-conjugating enzyme, ubiquitin-activating enzyme, ATP, etc., and incubated at 30 ° C. or 35 ° C. for 1-2 hours. When the reaction product was subjected to normal Western analysis using an anti-MBP antibody or anti-ubiquitin antibody, depending on the RING-H2 domain of EL5 used, ubiquitin-ligating enzyme activity (also called ubiquitin ligase activity or E3 activity), MBP A band shifted to the polymer side by electrophoresis due to the increase in molecular weight due to ubiquitin ligation to the lysine residue was detected. If there is no E3 activity, no band shift is observed, and if the E3 activity is reduced, the intensity of the shifted band becomes lighter than when the original MBP-EL5 was reacted.
変異EL5を発現する形質転換イネは特に制限されなく、変異EL5遺伝子を発現可能な状態で導入されたイネ、内在性のEL5遺伝子に変異が生じたイネ、又はこれらの両方の特徴を有するイネのいずれでもよい。なお、本明細書において、変異EL5を発現する形質転換イネに対して、変異EL5を発現しないイネを、野生型のイネという。 Transformed rice that expresses mutant EL5 is not particularly limited. Rice that has been introduced in a state in which the mutant EL5 gene can be expressed, rice that has undergone mutation in the endogenous EL5 gene, or rice that has both of these characteristics Either is acceptable. In this specification, rice that does not express mutant EL5 is referred to as wild-type rice compared to transformed rice that expresses mutant EL5.
イネに変異EL5遺伝子を発現可能な状態で導入する方法としては、これまでに知られているイネに外来遺伝子を発現可能な状態で導入する方法を限定せずに用いることができる。このような方法として、例えば、イネ内で機能するプロモーターとターミネーターとの間に変異EL5遺伝子を連結させたベクターを用意し、次いでこのベクターをイネに導入する方法を挙げることができる。なお、本明細書における分子生物学的な手法は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)などに記載されている方法に準じて行うことができる。 As a method for introducing a mutant EL5 gene into rice in a state where it can be expressed, any known method for introducing a foreign gene into rice can be used without limitation. Examples of such a method include a method in which a vector in which a mutant EL5 gene is linked between a promoter that functions in rice and a terminator is prepared, and then this vector is introduced into rice. The molecular biological technique in this specification is, for example, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 to 38, John Wiley & Sons (1987-1997).
上記方法において、プロモーターとしては、例えば、イネ内で機能するプロモーターであるEL5遺伝子プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来の35S(CaMV 35S)プロモーター、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターなどを用いることができる。ターミネーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターなどを挙げることができる。また、後述するように、プロモーターと変異EL5遺伝子との間にエンハンサーが含まれていてもよい。 In the above method, for example, an EL5 gene promoter that is a promoter that functions in rice, a cauliflower mosaic virus-derived 35S (CaMV 35S) promoter, a corn-derived ubiquitin promoter, and the like can be used. Examples of the terminator include a terminator derived from a cauliflower mosaic virus and a terminator derived from a nopaline synthase gene. Moreover, as will be described later, an enhancer may be included between the promoter and the mutant EL5 gene.
イネの内在性のEL5遺伝子に変異を導入する方法についても特に制限はなく、これまでに知られているイネ内の遺伝子に変異を導入する方法、例えば、イネ内の遺伝子の変異を誘発する薬剤を添加する方法やUVや放射能などを照射する方法などを限定せずに用いることができる。 There is no particular limitation on the method for introducing mutation into the endogenous EL5 gene of rice, and a known method for introducing mutation into a gene in rice, for example, a drug that induces mutation of a gene in rice There is no limitation on the method of adding or the method of irradiating UV or radioactivity.
2.変異があるEL5を発現する形質転換イネを製造する方法
変異EL5を発現する形質転換イネを製造する方法の具体例として、後述する実施例に記載の方法について説明する。
2. Method for Producing Transformed Rice Expressing EL5 with Mutation As a specific example of a method for producing transformed rice expressing mutated EL5, the method described in Examples described later will be described.
(1)変異EL5遺伝子を得る方法
まず、変異EL5遺伝子又は変異EL5を含むベクターを得る。アクセッション番号:AB045120に記載の塩基配列の情報を基づいて常法に従って作成したEL5遺伝子のcDNAを含むベクターを用意する。このベクターを鋳型として、所望の部位に変異を導入することができるプライマーセットと市販のキット(例えば、Quickchange site-directed mutagenesis kit、Stratagene社)を用いたPCRにより、部位特異的突然変異が生じたEL5遺伝子を含むベクターを得ることができる。変異EL5を含むベクターの具体例を図4に示す。得られたベクターについて、EL5遺伝子をシークエンシングし、所望の部位に変異が導入されていること、及びそれ以外の塩基配列には変異が入っていないことを確認することが望ましい。
(1) Method for obtaining mutant EL5 gene First, a mutant EL5 gene or a vector containing the mutant EL5 is obtained. A vector containing the EL5 gene cDNA prepared according to a conventional method based on the nucleotide sequence information described in Accession No. AB045120 is prepared. Using this vector as a template, PCR using a primer set that can introduce mutations at a desired site and a commercially available kit (eg, Quickchange site-directed mutagenesis kit, Stratagene) resulted in site-specific mutation. A vector containing the EL5 gene can be obtained. A specific example of the vector containing the mutation EL5 is shown in FIG. About the obtained vector, it is desirable to sequence the EL5 gene and confirm that the mutation has been introduced at the desired site and that the other nucleotide sequences have no mutation.
(2)変異EL5遺伝子が挿入されたバイナリーベクターの作製
変異EL5遺伝子が得られれば、これまでに知られている種々の方法、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法などを利用して、変異があるEL5遺伝子をイネ内に導入し、次いでイネ内でEL5を発現させることできる。例えば、変異があるEL5遺伝子をバイナリーベクター内のT−DNA領域に挿入し、次いでこのT−DNA領域をアグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌を介してイネ内に導入すれば、イネ内で変異EL5を発現させることができる。
(2) Preparation of binary vector into which mutant EL5 gene is inserted Once mutant EL5 gene is obtained, various methods known so far, such as Agrobacterium method, particle gun method, polyethylene glycol method, etc. are used. Thus, an EL5 gene having a mutation can be introduced into rice, and then EL5 can be expressed in rice. For example, if an EL5 gene having a mutation is inserted into a T-DNA region in a binary vector, and then this T-DNA region is introduced into rice via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium , the mutant EL5 is transformed into rice. Can be expressed.
具体的には、上記(1)で得られたベクターから切り出した変異があるEL5遺伝子を含む断片を、バイナリーベクターにおけるT−DNA領域内にある、イネ内で機能するプロモーターとターミネーターの間にある外来遺伝子導入部位に挿入する。バイナリーベクターは、上記構成をとるT−DNA領域があれば特に制限されないが、例えば、pB1121(Clontech社)などの市販のバイナリーベクター以外にも、市販品に種々の改変を施したバイナリーベクターを用いることができる。 Specifically, a fragment containing an EL5 gene having a mutation excised from the vector obtained in (1) above is located in a T-DNA region of a binary vector, between a promoter functioning in rice and a terminator. Insert into the foreign gene transfer site. The binary vector is not particularly limited as long as it has a T-DNA region having the above-described configuration. For example, in addition to a commercially available binary vector such as pB1121 (Clontech), a commercially available binary vector having various modifications is used. be able to.
T−DNA領域は、この領域が導入されたイネを効率的に選択するために、選択マーカーが発現可能な選択マーカー遺伝子カセットを含むことが好ましく、又は選択マーカー遺伝子カセットを含むDNAと共にイネ内に導入されることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質ハイグロマイシン耐性をもたらすハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシン耐性をもたらすネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。 The T-DNA region preferably contains a selectable marker gene cassette capable of expressing a selectable marker in order to efficiently select the rice into which this region has been introduced, or in the rice together with the DNA containing the selectable marker gene cassette. It is preferably introduced. Examples of the selectable marker gene include, but are not limited to, a hygromycin phosphotransferase gene that provides resistance to the antibiotic hygromycin, a neomycin phosphotransferase gene that provides resistance to kanamycin, and the like.
市販品を改変したバイナリーベクターとしては、例えば、市販のバイナリーベクターのT−DNA領域内に、上記の選択マーカー遺伝子カセットの他に、エンハンサーなどの変異EL5の発現を促進する領域を1個又は複数個を入れたものなどを使用することができる。 As a binary vector obtained by modifying a commercially available product, for example, in the T-DNA region of a commercially available binary vector, in addition to the above selectable marker gene cassette, one or more regions that promote the expression of mutant EL5 such as an enhancer You can use things that contain pieces.
例えば、図6に示すpBI333-EN4-RCG3は、市販のpB1121のT−DNA領域内に、選抜マーカーカセットとしてCaMV 35Sプロモーター::ハイグロマイシンリン酸転移酵素(HPT)::CaMVターミネーターを有し、さらに外来遺伝子発現領域にあるプロモーターを、CaMV 35Sプロモーターのエンハンサー領域を4反復させた人工プロモーターであるEN4へ変えたものである。pBI333-EN4-RCG3の詳細については、本発明者らの文献(Nishizawa et al., Theor. Appl. Genet., 99, 383-390, 1999)を参照できる。 For example, pBI333-EN4-RCG3 shown in FIG. 6 has a CaMV 35S promoter :: hygromycin phosphotransferase (HPT) :: CaMV terminator as a selectable marker cassette in the T-DNA region of commercially available pB1121. Furthermore, the promoter in the foreign gene expression region is changed to EN4 which is an artificial promoter obtained by repeating the enhancer region of the CaMV 35S promoter four times. The details of pBI333-EN4-RCG3 can be referred to the literature of the present inventors (Nishizawa et al., Theor. Appl. Genet., 99, 383-390, 1999).
(3)アグロバクテリウムへの遺伝子導入法
変異があるEL5遺伝子を挿入したT−DNA領域を含むバイナリーベクターをアグロバクテリウム属細菌へ導入する方法は、これまでに知られている細菌にベクターを導入して細菌を形質転換させる方法を制限なく用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオン法、トリペアレント法などを用いることができるが、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。具体的には、Nagelらの文献(Nagel et al., Microbiol. Lett., 67, 325, 1990)に記載の方法に従ったエレクトロポレーション法を用いれば、上記(2)で作製したバイナリーベクターをアグロバクテリウム属細菌へ導入することができる。バイナリーベクターをアグロバクテリウム属細菌へ導入した後は、バイナリーベクター内の選択マーカーを用いて、形質転換アグロバクテリウムを選択することができる。
(3) Gene introduction method into Agrobacterium A method for introducing a binary vector containing a T-DNA region into which a mutated EL5 gene has been inserted into an Agrobacterium genus, Any method for introducing and transforming bacteria can be used without limitation. For example, an electroporation method, a calcium ion method, a triple parent method, or the like can be used, but the electroporation method is preferably used. Specifically, when the electroporation method according to the method described in Nagel et al. (Nagel et al., Microbiol. Lett., 67, 325, 1990) is used, the binary vector prepared in (2) above is used. Can be introduced into Agrobacterium. After introducing the binary vector into the genus Agrobacterium, transformed Agrobacterium can be selected using the selection marker in the binary vector.
(4)イネへの遺伝子導入法
イネに、上記形質転換アグロバクテリウムを接触させることにより、変異EL5を発現し得る形質転換イネを得ることができる。イネとは、通常、イネ科イネ属の植物をいい、学名ではOryza sativaとよばれる。イネには数種類の根があり、例えば、種子根、冠根、側根、根毛などに分けられる。一般的には、種子根は、種子中の胚に既に形成されている幼根が発達したものをいい、植物によっては主根とも呼ばれ、イネには1本だけあるものとして知られており;冠根は、シュート基部から発生する根をいい、節根や不定根としても知られており;側根は、種子根や冠根の内鞘細胞層から発生する根をいい、支根とも呼ばれており;根毛は、種子根、冠根、側根から生える一つの細胞が細長く成長した毛状の根をいう。
(4) Gene transfer method to rice By bringing the above transformed Agrobacterium into contact with rice, transformed rice capable of expressing the mutant EL5 can be obtained. Rice usually refers to plants belonging to the genus Gramineae, and is called Oryza sativa in scientific name. Rice has several types of roots, for example, seed roots, crown roots, lateral roots, root hairs and the like. In general, seed root refers to the development of larvae already formed in embryos in seeds, which are also called main roots in some plants and are known to have only one in rice; Crown roots are roots that originate from the shoot base and are also known as node roots and adventitious roots; lateral roots are roots that originate from the inner sheath cell layer of seed roots and crown roots, also called branch roots Root; root hair refers to a hairy root in which a single cell growing from a seed root, a crown root, or a lateral root is elongated.
形質転換イネを得る方法は、通常知られているアグロバクテリウム属細菌を植物に接触させる方法を制限なく用いることができ、例えば、Toki S (Plant Mol. Biol. Rep. 1997)やToki S (Plant J. 2006)などの文献に記載の方法に従って実施することができるが、これらに限定されるものではない。形質転換アグロバクテリウムをイネに感染させる方法の具体例は、以下の通りであるが、これに限定されるものではない。 As a method for obtaining transformed rice, a generally known method of contacting a genus Agrobacterium with a plant can be used without limitation. For example, Toki S (Plant Mol. Biol. Rep. 1997) and Toki S ( Although it can implement according to the method as described in literature, such as Plant J. 2006), it is not limited to these. Specific examples of the method of infecting rice with transformed Agrobacterium are as follows, but are not limited thereto.
脱籾した完熟種子を所定濃度のエタノール、次亜塩素酸ナトリウム、滅菌水などで洗浄する。滅菌した種子をオーキシンを含む培地(例えば、N6D培地)に置き、種子の前培養を実施する。上記(3)で得た形質転換アグロバクテリウムを、感染に適した条件で、前培養後の種子に感染させる。感染後、メロペンなどの除菌剤用いて、種子からアグロバクテリウムを除菌し、次いで上記選択マーカーを利用して、形質転換細胞を選択する。 The ripened ripe seed is washed with a predetermined concentration of ethanol, sodium hypochlorite, sterilized water, and the like. The sterilized seed is placed in a medium containing auxin (for example, N6D medium), and seed preculture is performed. The transformed Agrobacterium obtained in (3) above is infected with seeds after pre-culture under conditions suitable for infection. After infection, Agrobacterium is sterilized from the seed using a sterilizing agent such as meropen, and then transformed cells are selected using the selection marker.
選択された形質転換細胞は、適切な植物調節物質を含む再分化培地(例えば、サイトカイニンを含むMS培地)に移され、適切な期間、保温され得る。イネを再生するためには、再分化した形質転換体を、発根培地(例えば、植物調節物質を含まないMS培地)に移す。形質転換体をイネへ再生させる方法としては、例えば、カルスからイネを再生させる方法(Toki, et al., Plant Journal, 47, 969-976, 2006)、エレクトロポレーション法を用いた場合は、プロトプラストからイネを再生させる方法(Toki, et al., Plant Physiol., 100, 1503-1507, 1992)などを用いることができる。ゲノム中に変異EL5遺伝子が導入された形質転換体が得られれば、これを基にして、イネ培養組織やイネのシュートなどを量産することも可能である。根の発育が確認された後、形質転換イネは、鉢上げされ得る。これらの方法については、特許第3141084号公報の段落0028〜0030を参照することができる。ただし、変異があるEL5を発現する形質転換イネはMS培地において根をほとんど形成しないため、鉢上げするためには水道水などで培養して発根させた後に鉢上げする。 The selected transformed cells can be transferred to a regeneration medium containing an appropriate plant regulator (eg, MS medium containing cytokinin) and incubated for an appropriate period of time. In order to regenerate rice, the redifferentiated transformant is transferred to a rooting medium (for example, MS medium not containing a plant regulator). As a method of regenerating a transformant into rice, for example, a method of regenerating rice from callus (Toki, et al., Plant Journal, 47, 969-976, 2006), or using an electroporation method, A method of regenerating rice from protoplasts (Toki, et al., Plant Physiol., 100, 1503-1507, 1992) can be used. If a transformant in which the mutant EL5 gene is introduced into the genome is obtained, it is possible to mass-produce rice cultured tissues, rice shoots, and the like. After root development is confirmed, the transformed rice can be potted. Regarding these methods, reference can be made to paragraphs 0028 to 0030 of Japanese Patent No. 3141084. However, since transformed rice expressing EL5 with mutations hardly forms roots in MS medium, in order to make a pot, it is cultivated in tap water or the like and rooted.
3.変異があるEL5を発現する形質転換イネの培養方法
側根が発達したイネを得ることを目的とした、変異があるEL5を発現する形質転換イネの培養方法は、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて、野生型のイネの生育に適した条件下で変異があるEL5を発現する形質転換イネを培養する限りにおいて特に制限はない。
3. Method for culturing transformed rice expressing EL5 with mutation The method for culturing transformed rice expressing EL5 with mutation for the purpose of obtaining rice with developed lateral roots is a nitrate source of less than 1 mM nitrate or 10 mM. There is no particular limitation as long as transformed rice expressing EL5 having a mutation is cultured under conditions suitable for growth of wild-type rice using a medium containing less ammonium salt.
培養に供する形質転換イネは、冠根が発達し得る程度の大きさを有するイネであればよく、例えば、2cm以上の苗条(シュート)が好ましく、3cm〜10cmのシュートがより好ましく、3cm〜5cmのシュートがさらに好ましい。 The transformed rice used for the culture may be rice having such a size that a crown root can develop. For example, shoots (shoots) of 2 cm or more are preferable, shoots of 3 cm to 10 cm are more preferable, and 3 cm to 5 cm. The shoot is more preferable.
形質転換イネの培養に供される培地は、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を含む。硝酸塩としては、1mM未満、好ましくは0.1mM以下、より好ましくは0.05mM以下、さらに好ましくは0.01mM以下の濃度で培地に含まれる限りにおいて特に制限はなく、例えば、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム及び亜硝酸ナトリウムなどを単独又は組み合わせて用いることができるが、好ましくは硝酸カリウムである。同様に、アンモニウム塩についても培地に含まれる濃度が10mM未満、好ましくは5mM以下、より好ましくは2mM以下、さらに好ましくは0.2mM以下であれば特に制限はなく、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムなどを単独又は組み合わせて用いることができるが、好ましくは硫酸アンモニウムである。培地に含まれる硝酸塩及びアンモニア塩の濃度範囲は、それぞれ1mM未満及び10mM未満であれば特に制限はなく、例えば、0mMの濃度、すなわち窒素源を含まない培地とすることもできる。 The medium used for culturing transformed rice contains less than 1 mM nitrate or less than 10 mM ammonium salt as a nitrogen source. The nitrate is not particularly limited as long as it is contained in the medium at a concentration of less than 1 mM, preferably 0.1 mM or less, more preferably 0.05 mM or less, and even more preferably 0.01 mM or less. For example, potassium nitrate, sodium nitrate, Although potassium nitrite and sodium nitrite can be used alone or in combination, potassium nitrate is preferred. Similarly, the ammonium salt is not particularly limited as long as the concentration in the medium is less than 10 mM, preferably 5 mM or less, more preferably 2 mM or less, and even more preferably 0.2 mM or less. For example, ammonium sulfate, ammonium chloride, phosphorus Ammonium acid and ammonium acetate can be used alone or in combination, but ammonium sulfate is preferred. The concentration ranges of nitrate and ammonia salt contained in the medium are not particularly limited as long as they are less than 1 mM and less than 10 mM, respectively. For example, a concentration of 0 mM, that is, a medium containing no nitrogen source may be used.
窒素源以外の培地の組成は、通常知られているイネに適した培地組成を含む培地を制限なく用いることができ、例えば、MS培地(Murashige−Skoog培地)やB5培地(O.L.Gamborg et al, (1968), Experimental Cell Research, 50, 151-158を参照)などの組成を改変して用いることができる。例えば、冠根の生育に増して側根を発達させるためには、カルシウム塩の量を減らすことが好ましく、培地中のカルシウム塩の濃度を100μM以下とすることがより好ましい。 As the composition of the medium other than the nitrogen source, a medium containing a known medium composition suitable for rice can be used without limitation. For example, MS medium (Murashige-Skoog medium) or B5 medium (OLGamborg et al, (1968), Experimental Cell Research, 50, 151-158). For example, in order to develop the lateral root in addition to the growth of the crown root, it is preferable to reduce the amount of calcium salt, and it is more preferable that the concentration of the calcium salt in the medium is 100 μM or less.
培地の形態は特に制限はなく、例えば、液体、半固体又は固体の培地とすることができる。より具体的には、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を土壌に加えたものを、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を含む培地として使用することができる。 The form of the medium is not particularly limited, and can be, for example, a liquid, semi-solid or solid medium. More specifically, a medium containing less than 1 mM nitrate or less than 10 mM ammonium salt as a nitrogen source can be used as a medium containing less than 1 mM nitrate or less than 10 mM ammonium salt as a nitrogen source.
形質転換イネを培養する際の温度、期間、照射量その他の条件は、EL5遺伝子に変異がない野生型のイネの生育に適した条件、例えば、5〜35℃、好ましくは25〜30℃;数日〜数十日間、好ましくは5〜10日間;無照射又は数キロルックス〜数十キロルックス、好ましくは2〜5キロルックスの白色光を照射して培養することができる。 The temperature, period, irradiation amount, and other conditions for cultivating the transformed rice are conditions suitable for growth of wild-type rice having no mutation in the EL5 gene, for example, 5-35 ° C., preferably 25-30 ° C .; It can be cultured for several days to several tens of days, preferably 5 to 10 days; irradiated with white light without irradiation or with several kilolux to several tens of kilolux, preferably 2 to 5 kilolux.
4.側根が発達したイネ
本発明の製造方法で得られる側根が発達したイネは、野生型のイネより、側根が長い及び/又は側根の数が多いイネである。比較の対象となる野生型のイネは、変異があるEL5を発現する形質転換イネの培養条件と同じ条件で培養したものである。変異があるEL5を発現する形質転換イネ及び野生型のイネの培養の時期は、同時でもいいし、それぞれ異なるタイミングでもよい。野生型のイネより側根が長い及び/又は側根の数が多いか否かは、目視又は顕微鏡やデジタルマイクロスコープなどの機器を用いて、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて、野生型のイネの生育に適した条件下で変異があるEL5を発現する形質転換イネを培養して得られたイネ(以下、本発明の方法によって得られたイネともいう)と、同条件下で培養した野生型のイネ(以下、対照イネともいう)の側根の長さ若しくは側根の数又はその両方を測定することにより確認することができる。
4). Rice with developed side roots Rice with developed side roots obtained by the production method of the present invention is rice with a longer side root and / or a larger number of side roots than wild-type rice. The wild-type rice to be compared is cultured under the same conditions as the culture conditions of the transformed rice expressing EL5 having a mutation. The timing of culturing transformed rice and wild-type rice that express EL5 with mutation may be the same or different. Whether the side roots are longer than the wild type rice and / or the number of side roots is greater than 1 mM nitrate or less than 10 mM ammonium as a nitrogen source by visual inspection or using an instrument such as a microscope or a digital microscope. Rice obtained by culturing transformed rice expressing EL5 having a mutation under conditions suitable for growth of wild-type rice using a medium (hereinafter also referred to as rice obtained by the method of the present invention) And by measuring the length of the side roots and / or the number of side roots of wild-type rice (hereinafter referred to as control rice) cultured under the same conditions.
例えば、対照イネと比較して、所定の長さ、例えば、冠根から出根し、1cmの冠根当たり0.5mm以上の長さの側根の数が多いことを確認することによって、側根が発達したイネであることが確認できる。本発明の方法によって得られる側根が発達したイネは、体長が10〜15cmである場合に、1cmの冠根当たり0.5mm以上の長さの側根の数が、通常、対照イネと比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、又は4倍以上である。 For example, by comparing the control rice with a predetermined length, for example, roots from a crown root, and confirming that the number of side roots with a length of 0.5 mm or more per 1 cm crown root is larger, It can be confirmed that it is a developed rice. In the rice having developed side roots obtained by the method of the present invention, when the body length is 10 to 15 cm, the number of side roots having a length of 0.5 mm or more per 1 cm crown root is usually compared with that of control rice. 1.2 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, or 4 times or more.
本発明の方法によって得られた側根が発達したイネは、例えば、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を含む土壌を培地とした場合には、植え替えなどせずに、そのまま又は窒素源を加えて引き続き培養することができる。また、例えば、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を含むMS培地などを用いて培養した場合には、側根が発達したイネは、イネ栽培用土壌に植え替えることが好ましい。この場合は、側根が発達したイネは、野生型のイネの栽培条件と比べて、窒素源を低下させた条件下で栽培することが期待できる。 For example, in the case of using rice soil with less than 1 mM nitrate or less than 10 mM ammonium salt as a nitrogen source, the rice with developed side roots obtained by the method of the present invention can be used as is or without replanting. Nitrogen source can be added to continue the culture. In addition, for example, when cultured using an MS medium containing less than 1 mM nitrate or less than 10 mM ammonium salt as a nitrogen source, it is preferable to replant rice in which lateral roots have developed into rice cultivation soil. In this case, it can be expected that the rice having developed side roots is cultivated under a condition in which the nitrogen source is reduced as compared with the cultivation condition of wild-type rice.
5.イネの側根を発達させる方法
上記の通り、変異があるEL5を発現する形質転換イネを、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて、野生型のイネの生育に適した条件下で培養すれば、該形質転換イネの側根を野生型イネの側根よりも発達させることができる。本発明には、窒素源として1mM未満の硝酸塩又は10mM未満のアンモニウム塩を含む培地を用いて野生型のイネの生育に適した条件下で培養することを含む、イネの側根を発達させる方法も含まれる。
5. Method for Developing Side Roots of Rice As described above, transformed rice expressing EL5 having a mutation is used to grow wild-type rice using a medium containing less than 1 mM nitrate or less than 10 mM ammonium salt as a nitrogen source. When cultured under suitable conditions, the side roots of the transformed rice can be developed more than the side roots of wild-type rice. The present invention also includes a method of developing a lateral root of rice, comprising culturing under a condition suitable for growth of wild-type rice using a medium containing less than 1 mM nitrate or less than 10 mM ammonium salt as a nitrogen source. included.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
1.改変EL5遺伝子の作製
EL5タンパク質の162番目のバリン残基をアラニンに置換したEL5V162Aをコードする変異EL5遺伝子クローンを得るために、EL5遺伝子のcDNA(アクセッション番号:AB045120のうち、アミノ酸コード領域のcDNA)がクローン化されているpENTRベクター(Invitrogen社)を鋳型とし、Quickchange site-directed mutagenesis kit (Stratagene)を用いて、kitに付属のプロトコールに従ってPCRを行った。オリゴDNAプライマーとして、EL5V162A作製用には、5'-CCACGCCGAGTGCGCGGACATGTGGCTCG-3'(配列表の配列番号1)と5'-CGAGCCACATGTCCGCGCACTCGGCGTGG-3'(配列表の配列番号2)を用い、さらにEL5W165A作製用には、5'- CGTCGACATGGCGCTCGGCTCCCACTCC-3'(配列表の配列番号3)と5'- GGAGTGGGAGCCGAGCGCCATGTCGACG-3'(配列表の配列番号4)を用いた。各プライマーの下線部は、変異を導入した塩基を示す。得られたプラスミドのEL5遺伝子の部分をシークエンシングし、目的の部位に変異が導入されていること、および、それ以外の塩基配列には変異が入っていないことを確認し、pENTR-EL5V162AおよびpENTR-EL5W165A(図4を参照)を得た。
1. Production of modified EL5 gene
In order to obtain a mutant EL5 gene clone encoding EL5V162A in which the 162nd valine residue of EL5 protein was replaced with alanine, the cDNA of the EL5 gene (accession number: cDNA of the amino acid coding region of AB045120) was cloned. The pENTR vector (Invitrogen) was used as a template, and PCR was performed using Quickchange site-directed mutagenesis kit (Stratagene) according to the protocol attached to the kit. As an oligo DNA primer, 5′-CCACGCCGAGTGC GCG GACATGTGGCTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) and 5′-CGAGCCACATGTC CGC GCACTCGGCGTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) are used for the preparation of EL5V162A. For the preparation of EL5W165A, 5′-CGTCGACATG GCG CTCGGCTCCCACTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) and 5′-GGAGTGGGAGCCGAG CGC CATGTCGACG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) were used. The underlined portion of each primer indicates the base into which the mutation has been introduced. Sequencing the EL5 gene part of the resulting plasmid, confirming that the mutation has been introduced at the target site and that there are no mutations in other nucleotide sequences, pENTR-EL5V162A and pENTR -EL5W165A (see FIG. 4) was obtained.
2.植物導入用ベクターの構築
上記の通りに得られた変異EL5遺伝子をイネで発現させるために、カリフラワーモザイクウィルス(CaMV)の35Sプロモーターのエンハンサー領域を4反復させた人工プロモーターEN4(独立行政法人農業生物資源研究所 廣近洋彦博士より譲渡)の下流に連結させたバイナリーベクターpBI333-EN4-EL5V162AおよびpBI333-EN4-EL5W165A(図5を参照)を構築した。具体的には以下のように実施した。
2. Construction of vector for plant introduction In order to express the mutant EL5 gene obtained as described above in rice, artificial promoter EN4 (independent administrative agency agricultural organism) in which the 35S promoter enhancer region of cauliflower mosaic virus (CaMV) is repeated four times. Binary vectors pBI333-EN4-EL5V162A and pBI333-EN4-EL5W165A (see Fig. 5) linked downstream of the Resource Research Institute (assigned from Dr. Hirohiko Tsuji) were constructed. Specifically, it was carried out as follows.
pBI333−EN4−RCG3(Nishizawa et al., Theor. Appl. Genet., 99, 383-390, 1999に記載の方法に従って調製したもの、図6を参照)は、バイナリーベクターpBI121(Clontech社、アクセッション番号:AF485783)のT−DNA領域内に、選抜マーカーカセットとして、CaMV 35Sプロモーター::ハイグロマイシンリン酸転移酵素(HPT)::CaMVターミネーターを持つ他に、上記EN4と、その下流に、RCG3(イネキチナーゼ遺伝子Cht−3;アクセッション番号:D16223)とノパリン合成酵素のターミネーター(NOS3’)を持つ。このpBI333−EN4−RCG3をSacIで開環後、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、続いてXbaIで切断することによってRCG3を除き、そこに先にクローン化したpENTR-EL5V162AまたはpENTR-EL5W165A由来のXbaI-EcoRV断片を連結し、pBI333-EN4-EL5V162AおよびpBI333-EN4-EL5W165Aを完成させた。 pBI333-EN4-RCG3 (prepared according to the method described in Nishizawa et al., Theor. Appl. Genet., 99, 383-390, 1999, see FIG. 6) is a binary vector pBI121 (Clontech, Accession). In addition to the CaMV 35S promoter :: hygromycin phosphotransferase (HPT) :: CaMV terminator as a selection marker cassette in the T-DNA region of the number: AF485783), the above-mentioned EN4 and RCG3 ( Rice chitinase gene Cht-3; accession number: D16223) and nopaline synthase terminator (NOS3 ′). This pBI333-EN4-RCG3 was opened with SacI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then cleaved with XbaI to remove RCG3, from which XbaI derived from pENTR-EL5V162A or pENTR-EL5W165A previously cloned was removed. -EcoRV fragments were ligated to complete pBI333-EN4-EL5V162A and pBI333-EN4-EL5W165A.
EL5自身のプロモーターを使ってEL5W165Aを発現させるために、次の方法でEL5プロモーター(PEL5)をクローン化した。すなわち、イネ(品種:日本晴)のDNAを鋳型にして、5'-GCGGGCCCGCAAATAGGGTCTCTCGTTAGC-3'(配列表の配列番号5)と5'-CCTCTAGATGCATATGTGACCGCGCGCACT-3'(配列表の配列番号6)を用いてPCRし、続いてApaIとXbaIで切断後、pBlueScript SK(Stratagene社)のApaIとXbaI間に連結し、SK-PEL5を得た(図7を参照)。次に、SK-PEL5のPEL5を含むApaIからXbaIまでの断片を、先に作製したpBI333-EN4-EL5W165AをApaIとXbaIで切断して、EN4プロモーターを除いた断片と連結し、pBI333-PEL5-EL5W165Aを完成させた(図8を参照)。 In order to express EL5W165A using EL5's own promoter, the EL5 promoter (PEL5) was cloned by the following method. That is, PCR using rice (variety: Nipponbare) DNA as a template and 5′-GCGGGCCCGCAAATAGGGTCTCTCGTTAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) and 5′-CCTCTAGATGCATATGTGACCGCGCGCACT-3 ′ (SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) Then, after cutting with ApaI and XbaI, ligation was performed between ApaI and XbaI of pBlueScript SK (Stratagene) to obtain SK-PEL5 (see FIG. 7). Next, the fragment from ApaI to XbaI containing PEL5 of SK-PEL5 was cleaved with pBI333-EN4-EL5W165A prepared earlier with ApaI and XbaI, and ligated with the fragment excluding the EN4 promoter, pBI333-PEL5- EL5W165A was completed (see FIG. 8).
3.形質転換イネの作製
(1)アグロバクテリウムへの遺伝子導入法
Nagelらの方法(Microbiol. Lett., 67, 325, 1990を参照)にしたがってpBI333-EN4-EL5V162Aあるいは、pBI333-PEL5-EL5W165Aを、エレクトロポーレーション法によりAgrobacterium tumefacience(EHA105株)に導入した。その後、50μg/mLのカナマイシン及び50μg/mLのハイグロマイシンを含むLB培地上で28℃で2日間培養することによって形質転換アグロバクテリウムを得た。
3. Production of transgenic rice (1) Gene transfer to Agrobacterium
The method of Nagel et al. (Microbiol. Lett., 67, 325, 1990.) according pBI333-EN4-EL5V162A or the pBI333-PEL5-EL5W165A, was introduced into Agrobacterium tumefacience (EHA105 strain) by electroporation method. Then, transformed Agrobacterium was obtained by culturing at 28 ° C. for 2 days on LB medium containing 50 μg / mL kanamycin and 50 μg / mL hygromycin.
(2)イネへの遺伝子導入
イネの形質転換は、超迅速形質転換法(特許第3141084号公報、又は、Toki et al., Plant Journal, 47, 969-976, 2006を参照)に従って実施した。ただし、アグロバクテリウムの除菌にはメロペン(大日本住友製薬)を用いた。具体的には以下のようにして実施した。
(2) Gene introduction into rice Transformation of rice was carried out according to an ultra-rapid transformation method (see Japanese Patent No. 3141084 or Toki et al., Plant Journal, 47, 969-976, 2006). However, meropen (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) was used to disinfect Agrobacterium. Specifically, it was carried out as follows.
上記(1)で調製した形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液と、超迅速形質転換法にしたがって前培養したイネ(Oryza sativa 品種:日本晴)の種子を、2N6−AS培地(30g/L スクロース、10g/L グルコース、0.3g/L カザミノ酸、2mg/L 2,4−D、10mg/L アセトシリンゴン、4g/L ゲルライト、pH5.2)上で、暗黒下で3日間、28℃で共存培養した。その後、25mg/Lのメロペンを含有する滅菌水を用いて種子からアグロバクテリウムを洗浄後、種子を12.5mg/Lのメロペン及び選抜マーカーとして50mg/Lのハイグロマイシン、さらに4g/L ゲルライトを加えたN6培地(選抜培地)に置床して、28℃、暗所で約10日間培養し、ハイグロマイシン耐性細胞を増殖し、カルスを得た。 The transformed Agrobacterium suspension prepared in (1) above and rice ( Oryza sativa variety: Nipponbare) pre-cultured according to the ultra-rapid transformation method were added to 2N6-AS medium (30 g / L). Sucrose, 10 g / L glucose, 0.3 g / L casamino acid, 2 mg / L 2,4-D, 10 mg / L acetosyringone, 4 g / L gellite, pH 5.2) in the dark for 3 days, 28 Co-cultured at 0 ° C. After washing Agrobacterium from the seeds using sterilized water containing 25 mg / L meropen, the seeds were 12.5 mg / L meropen, 50 mg / L hygromycin as a selection marker, and 4 g / L gellite. It was placed on the added N6 medium (selection medium) and cultured in the dark at 28 ° C. for about 10 days to proliferate hygromycin-resistant cells to obtain callus.
選抜されたハイグロマイシン耐性カルスを再分化培地(6.25mg/L メロぺン及び50mg/L ハイグロマイシンを補充したMS培地:30g/L スクロース、30g/L ソルビトール、2g/L カザミノ酸、2mg/L カイネチン、0.002mg/L NAA、4g/L ゲルライト、pH5.8)に移植して、再分化するまで、28℃、明所で培養を続けた。 Selected hygromycin-resistant calli were redifferentiated (MS medium supplemented with 6.25 mg / L meropene and 50 mg / L hygromycin: 30 g / L sucrose, 30 g / L sorbitol, 2 g / L casamino acid, 2 mg / The cells were transplanted to L kinetin, 0.002 mg / L NAA, 4 g / L gellite, pH 5.8) and continued to be cultured at 28 ° C. in the light until redifferentiation.
再分化個体を、ホルモンフリー培地(6.25mg/L メロぺン及び25mg/L ハイグロマイシンを補充した、ホルモンを含まないMS培地)に置床した。約10日後、新しいホルモンフリー培地に1シュート毎に移植し、さらに約1週間後、形質転換植物が大きくなったところで無菌培養を終え、pBI333-PEL5-EL5W165A導入イネは3日間の馴化処理後、また、pBI333-EN4-EL5V162A導入イネは10日間の水道水での発根処理を経て、「呉羽粒状培土−D」(商品名;呉羽化学)を詰めたポットに移植し、温室内で生育させ、次世代の自殖種子(R1世代)を得た。 Redifferentiated individuals were placed on hormone-free medium (hormone-free MS medium supplemented with 6.25 mg / L meropene and 25 mg / L hygromycin). About 10 days later, transplanted to a new hormone-free medium every shoot, and after about one week, when the transformed plant became large, the sterile culture was finished. The rice introduced with pBI333-PEL5-EL5W165A was conditioned for 3 days, In addition, pBI333-EN4-EL5V162A-introduced rice is rooted in tap water for 10 days, transplanted to a pot filled with “Kureha granular soil-D” (trade name; Kureha Chemical), and grown in a greenhouse. Next-generation self-propagating seeds (R1 generation) were obtained.
4.無窒素条件下での発根テスト(結果は図2を参照)
EL5V162A遺伝子を発現するイネは、上記のホルモンフリー培地では発根が著しく阻害されるが、ホルモンフリー培地で培養を続けることによって、シュートを分げつさせ、増やすことが可能である。
4). Rooting test under nitrogen-free conditions (see Fig. 2 for results)
Rice that expresses the EL5V162A gene is markedly inhibited from rooting in the above-mentioned hormone-free medium. However, by continuing cultivation in the hormone-free medium, it is possible to distribute and increase the shoot.
ホルモンフリー培地上で継代し、継代後3〜4週の3〜5cm長になったEL5V162A遺伝子導入イネ(EL5V162Aイネ)のシュートを用いた。対照として、非形質転換イネ(品種:日本晴)の籾を取り除き、50%次亜塩素酸で30分滅菌後、滅菌水で3〜5回洗浄した後、4倍希釈のMS寒天培地で7日間発芽させ、胚乳及び根を切除したイネを用いた。それぞれをマヨネーズ瓶に入れた100mlの水耕液(70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 3% Sucrose)に、プラスチック製の筏を使って1瓶あたり12シュートずつ植え、約3キロルックスの白色光照射下で無菌的に10日間培養した後(28℃)、発根した冠根の長さ、及び冠根の単位長さあたりの側根数を測定した。 The shoots of EL5V162A gene-introduced rice (EL5V162A rice) that were subcultured on a hormone-free medium and became 3-5 cm long 3-4 weeks after the subculture were used. As a control, non-transformed rice (variety: Nipponbare) was removed, sterilized with 50% hypochlorous acid for 30 minutes, washed 3-5 times with sterile water, and then diluted with 4-fold MS agar for 7 days. Rice that had germinated and resected endosperm and roots was used. Hydroponic solution 100ml were placed respectively in mayonnaise bottle (70μM CaCl 2, 36μM FeSO 4 , 9μM MnSO 4, 3μM ZnSO 4, 0.2μM CuSO 4, 4.5μM H 3 BO 4, 0.05μM Na 2 MoO 4, 7μM Na 2 HPO 4 , 16 μM KCl, 150 μM MgCl 2 , 3% Sucrose) planted with 12 shoots per bottle using a plastic cage and cultured aseptically for 10 days under white light irradiation of about 3 kilolux (28 ° C.), the length of the rooted root, and the number of side roots per unit length of the crown root were measured.
その結果、冠根表面から出根した全ての側根数は、対照イネでは3.95±0.33本/cmであったのに対して、EL5V162Aイネでは16.35±1.11本/cmと約4倍の側根数の増加が見られた。冠根長は対照イネで1.94±0.73cm、EL5V162Aイネで2.23±1.11cmと有意差はなかった。 As a result, the number of all lateral roots rooted from the crown root surface was 3.95 ± 0.33 / cm in the control rice, whereas it was 16.35 ± 1.11 / cm in EL5V162A rice, which was about 4 times the number of lateral roots. An increase was seen. The crown root length was 1.94 ± 0.73 cm for control rice and 2.23 ± 1.11 cm for EL5V162A rice.
5.各種窒素濃度下における発根テスト(結果は図3を参照)
ホルモンフリー培地上で継代し、継代後3〜4週の3〜5cm長になったEL5V162A遺伝子導入イネ(EL5V162Aイネ)のシュートを用いた。対照として、非形質転換イネ(品種:日本晴)の籾を取り除き、50%次亜塩素酸で30分滅菌後、滅菌水で3〜5回洗浄した後、4倍希釈のMS寒天培地で7日間発芽させ、胚乳及び根を切除したイネを用いた。それぞれをマヨネーズ瓶に入れた100mlの水耕液(70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 3% Sucrose, 10 mM MES (pH5.8)および各種濃度の窒素源を添加したもの)に、プラスチック製の筏を使って1瓶当たり12シュートずつ植え、約3キロルックスの白色光照射下で無菌的に10日間、28℃で培養し、根元1cmおよび根端1cmにおける約0.5mm以上の側根数を、対照イネと比較することにより側根形成度を記述した。各試験区の窒素源は以下の濃度で加えた。
硫酸アンモニウム(最終濃度;0.2mM、2mM、5mM、10mM)
硝酸カリウム(最終濃度;0.01mM、0.05mM、0.1mM、1mM、10mM)
5). Rooting test under various nitrogen concentrations (See Figure 3 for results)
The shoots of EL5V162A gene-introduced rice (EL5V162A rice) that were subcultured on a hormone-free medium and became 3-5 cm long 3-4 weeks after the subculture were used. As a control, non-transformed rice (variety: Nipponbare) was removed, sterilized with 50% hypochlorous acid for 30 minutes, washed 3-5 times with sterile water, and then diluted with 4-fold MS agar for 7 days. Rice that had germinated and resected endosperm and roots was used. Hydroponic solution 100ml were placed respectively in mayonnaise bottle (70μM CaCl 2, 36μM FeSO 4 , 9μM MnSO 4, 3μM ZnSO 4, 0.2μM CuSO 4, 4.5μM H 3 BO 4, 0.05μM Na 2 MoO 4, 7μM Na 2 HPO 4 , 16 μM KCl, 150 μM MgCl 2 , 3% Sucrose, 10 mM MES (pH 5.8) and various nitrogen sources), plant 12 shoots per bottle using a plastic basket Incubation at 28 ° C aseptically for 10 days under white light irradiation of about 3 kilolux, and the degree of lateral root formation by comparing the number of lateral roots of about 0.5 mm or more at the root 1 cm and root tip 1 cm with the control rice Was described. Nitrogen sources in each test section were added at the following concentrations.
Ammonium sulfate (final concentration: 0.2 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM)
Potassium nitrate (final concentration: 0.01 mM, 0.05 mM, 0.1 mM, 1 mM, 10 mM)
水耕液調製法は以下の通りである。終濃度70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 3% Sucroseになるように調製した溶液をオートクレーブ後、ファイルター滅菌した1M MES(pH5.8)を1/100容添加した。これを窒素無添加水耕液とし、さらに、オートクレーブした硫酸アンモニウムあるいは硝酸カリウム溶液を上記の終濃度になるように添加した。 The hydroponic liquid preparation method is as follows. Final concentration 70μM CaCl 2, 36μM FeSO 4, 9μM MnSO 4, 3μM ZnSO 4, 0.2μM CuSO 4, 4.5μM H 3 BO 4, 0.05μM Na 2 MoO 4, 7μM Na 2 HPO 4, 16μM KCl, 150μM MgCl 2, The solution prepared to 3% Sucrose was autoclaved, and 1/100 volume of 1M MES (pH 5.8) sterilized by filter was added. This was used as a nitrogen-free hydroponic solution, and an autoclaved ammonium sulfate or potassium nitrate solution was added to the above final concentration.
その結果、各窒素濃度試験区の対照イネに対して、EL5V162Aイネは、1mM以下の硝酸カリウム又は5mM以下の硫酸アンモニウムの存在下では、多くの側根を形成した。 As a result, EL5V162A rice formed many lateral roots in the presence of 1 mM or less of potassium nitrate or 5 mM or less of ammonium sulfate relative to the control rice in each nitrogen concentration test group.
6.EL5W165A導入イネの発根テスト(結果は図9を参照)
隔離温室で栽培したpBI333-PEL5-EL5W165Aで形質転換したイネの自殖次世代種子の玄米を50%次亜塩素酸で30分滅菌し、滅菌水で3〜5回洗浄した後、15mg/Lのハイグロマイシンを含む、終濃度70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 10 mM MES (pH5.8)、1.5%寒天培地に置床し、明下、28度で10日間培養した。対照として、非形質転換イネ(品種:日本晴)の玄米を、50%次亜塩素酸で30分滅菌し、滅菌水で3〜5回洗浄した後、終濃度70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 10 mM MES (pH5.8)、1.5%寒天培地に置床し、明下、28℃で10日間培養した。
6). EL5W165A introduction rice rooting test (See Fig. 9 for results)
Brown rice of self-propagating next-generation seeds of rice transformed with pBI333-PEL5-EL5W165A grown in an isolated greenhouse was sterilized with 50% hypochlorous acid for 30 minutes, washed with sterilized water 3-5 times, and then 15 mg / L containing hygromycin, final concentration 70μM CaCl 2, 36μM FeSO 4, 9μM MnSO 4, 3μM ZnSO 4, 0.2μM CuSO 4, 4.5μM H 3 BO 4, 0.05μM Na 2 MoO 4, 7μM Na 2 HPO 4, 16μM KCl, 150 μM MgCl 2 , 10 mM MES (pH 5.8), placed on 1.5% agar medium and cultured at 28 ° C. for 10 days. As a control, brown rice of non-transformed rice (variety: Nihonbare) was sterilized with 50% hypochlorous acid for 30 minutes, washed with sterilized water 3 to 5 times, and final concentrations of 70 μM CaCl 2 , 36 μM FeSO 4 , 9 μM MnSO 4, 3μM ZnSO 4, 0.2μM CuSO 4, 4.5μM H 3 BO 4, 0.05μM Na 2 MoO 4, 7μM Na 2 HPO 4, 16μM KCl, 150μM MgCl 2, 10 mM MES (pH5.8), 1. It was placed on a 5% agar medium and cultured for 10 days at 28 ° C. in the light.
ハイグロマイシン耐性のpBI333-PEL5-EL5W165A導入イネ、および対照イネの胚乳と根を切除後、それぞれをマヨネーズ瓶に入れた100mlの水耕液(70μM CaCl2, 36μM FeSO4, 9μM MnSO4, 3μM ZnSO4, 0.2μM CuSO4, 4.5μM H3BO4, 0.05μM Na2MoO4, 7μM Na2HPO4, 16μM KCl, 150μM MgCl2, 3% Sucrose, 10 mM MES (pH5.8))に、プラスチック製の筏を使って1瓶当たり12シュートずつ植え、約3キロルックスの白色光照射下で無菌的に10日間、28℃で培養し、側根形成を観察した。その結果、対照イネに対して、PEL5-EL5W165Aイネは、より多くの側根を形成した。 After removing endosperm and roots of hygromycin-resistant pBI333-PEL5-EL5W165A and control rice, 100 ml of hydroponic solution in each mayonnaise bottle (70 μM CaCl 2 , 36 μM FeSO 4 , 9 μM MnSO 4 , 3 μM ZnSO 4, 0.2μM CuSO 4, 4.5μM H 3 BO 4, 0.05μM Na 2 MoO 4, 7μM Na 2 HPO 4, 16μM KCl, to 150μM MgCl 2, 3% Sucrose, 10 mM MES (pH5.8)), plastic Twelve shoots were planted per bottle using a cocoon made of the product, and aseptically cultured under white light irradiation of about 3 kilolux for 10 days at 28 ° C., the lateral root formation was observed. As a result, PEL5-EL5W165A rice formed more lateral roots than control rice.
本発明の側根が発達したイネを製造する方法やイネの側根を発達させる方法は、例えば、農業及びイネの根を利用したバイオマス生産分野において利用できる。本発明によれば、土壌中の窒素量を減らして側根が発達したイネを製造し、かつこのイネを引き続き低窒素条件下で生育させることが期待されるために、窒素肥料の使用を抑えた低コスト・低環境負荷の農業が可能になると期待できる。また、従来技術と異なり、本発明により製造されたイネは、発根剤処理が不要なために、イネの根を培養して物質を生産させる際のコスト削減効果が見込める。 The method for producing rice having developed side roots and the method for developing rice side roots according to the present invention can be used, for example, in the field of agriculture and biomass production using rice roots. According to the present invention, the amount of nitrogen in the soil is reduced to produce rice with lateral roots developed, and the use of nitrogen fertilizer is suppressed because this rice is expected to continue to grow under low nitrogen conditions. It can be expected that agriculture with low cost and low environmental impact will be possible. In addition, unlike the prior art, the rice produced according to the present invention does not require a rooting agent treatment, so that it can be expected to reduce costs when cultivating rice roots to produce substances.
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Non-Patent Citations (6)
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JPN6014007949; The Journal of Biological Chemistry Vol. 280, 2005, p. 41015-41024 * |
JPN6014007953; The Plant Journal Vol. 51, 2007, p. 92-104 * |
JPN6014007956; 日本植物生理学会年会要旨集 , 2008, p. 172, 2aH02(280) * |
JPN6014007959; 日本植物生理学会年会要旨集 , 2009, p. 286, P135(688) * |
JPN6014007962; 日本植物病理学会報 Vol. 74(3), 200808, p. 203, (137) * |
JPN6014007964; 農林水産省農林水産技術会議事務局研究成果 , 2009, p. 85-87, (IP4003) * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011155929A (en) * | 2010-02-02 | 2011-08-18 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | Marigold transformation method |
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