JP2010158223A - Method for producing caffeic acid phenethyl ester - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、クロロゲン酸エステラーゼを特定量使用することにより、効率的な反応を行うことができるカフェ酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ）の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing caffeic acid phenethyl ester (CAPE) capable of performing an efficient reaction by using a specific amount of chlorogenic acid esterase.
一般に、プロポリスに含有される微量成分としてカフェ酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ）が知られている。カフェ酸フェネチルエステルは、抗酸化作用、抗炎症作用及び抗癌作用の他、抗ウイルス作用等を有していることが知られている（特許文献１参照）。 In general, caffeic acid phenethyl ester (CAPE) is known as a trace component contained in propolis. Caffeic acid phenethyl ester is known to have an antiviral effect and the like in addition to an antioxidant effect, an anti-inflammatory effect, and an anticancer effect (see Patent Document 1).
従来より、カフェ酸フェネチルエステルの製造方法としては、天然物中から抽出する方法、及び化学的・酵素的に合成する方法が知られている。化学的に合成する方法としては、カフェ酸とフェネチルアルコールを酸触媒下で高温で反応させる方法が知られている（特許文献２参照）。また、カフェ酸を塩化チオニルを用いて塩素化した後、フェネチルアルコールと反応させて合成する方法が知られている（特許文献３参照）。また、酵素を用いた合成方法としては、カフェ酸とフェネチルアルコールの存在下でクロロゲン酸エステラーゼ（約０．０１６５Ｕ／ｍＬ）を作用させて合成する方法が知られている（非特許文献１）。 Conventionally, as a method for producing caffeic acid phenethyl ester, a method of extracting from a natural product and a method of chemically and enzymatically synthesizing are known. As a method of chemically synthesizing, a method of reacting caffeic acid and phenethyl alcohol at a high temperature under an acid catalyst is known (see Patent Document 2). Further, a method is known in which caffeic acid is chlorinated with thionyl chloride and then reacted with phenethyl alcohol for synthesis (see Patent Document 3). Moreover, as a synthesis method using an enzyme, a method is known in which chlorogenic acid esterase (about 0.0165 U / mL) is allowed to act in the presence of caffeic acid and phenethyl alcohol (Non-patent Document 1).
ところが、天然物から抽出する方法は、天然物中の存在量が微量であるためカフェ酸フェネチルエステルの入手効率が非常に悪いという問題があった。また、特許文献２，３に開示される化学的に合成する方法は、合成反応後に酸触媒又は塩素化剤を除去する必要があり、カフェ酸フェネチルエステルを効率的に得ることができないという問題があった。また、非特許文献１に開示されるカフェ酸フェネチルエステルの合成方法は、反応率及び収率が非常に悪く、効率的にカフェ酸フェネチルエステルを得ることができないという問題があった。 However, the method of extracting from a natural product has a problem that the availability of caffeic acid phenethyl ester is very poor because the abundance in the natural product is very small. In addition, the methods of chemically synthesizing disclosed in Patent Documents 2 and 3 have a problem that it is necessary to remove an acid catalyst or a chlorinating agent after the synthesis reaction, and caffeic acid phenethyl ester cannot be efficiently obtained. there were. Further, the method for synthesizing caffeic acid phenethyl ester disclosed in Non-Patent Document 1 has a problem that the reaction rate and yield are very poor and caffeic acid phenethyl ester cannot be efficiently obtained.
本発明者らは、カフェ酸フェネチルエステルの製造方法を新たに模索した。その結果、原料としてカフェ酸とフェネチルアルコールの存在下で特定量のクロロゲン酸エステラーゼを作用させることにより効率的に製造されることを発見するに至った。 The present inventors have sought a new method for producing caffeic acid phenethyl ester. As a result, the inventors have found that it can be efficiently produced by the action of a specific amount of chlorogenic acid esterase in the presence of caffeic acid and phenethyl alcohol as raw materials.
本発明の目的とするところは、効率的に製造することができる新規なカフェ酸フェネチルエステルの製造方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a novel method for producing caffeic acid phenethyl ester which can be efficiently produced.
上記目的を達成するために、請求項１に記載の発明のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、水、カフェ酸、及びフェネチルアルコールの存在下でクロロゲン酸エステラーゼを０．０５〜１０Ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素量で反応させることを特徴とする。 In order to achieve the above object, the method for producing caffeic acid phenethyl ester according to claim 1, wherein 0.05 to 10 Unit / mL enzyme of chlorogenic acid esterase is present in the presence of water, caffeic acid, and phenethyl alcohol. It is characterized by reacting in an amount.
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、前記クロロゲン酸エステラーゼは、０．２〜８Ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素量で反応させることを特徴とする。 The invention according to claim 2 is characterized in that, in the method for producing caffeic acid phenethyl ester according to claim 1, the chlorogenic acid esterase is reacted in an enzyme amount of 0.2 to 8 Unit / mL.
請求項３に記載の発明は、請求項１又は請求項２に記載のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、さらに、前記クロロゲン酸エステラーゼによる反応後に、シリカ系樹脂、芳香族系合成吸着剤、及び脂肪族エステル系合成吸着剤から選ばれる少なくとも一種に接触させることにより、カフェ酸フェネチルエステルを吸着させる処理、次に溶出用溶媒を用いてカフェ酸フェネチルエステルを溶出させる処理を、１又は２回以上繰り返す工程を備えることを特徴とする。 Invention of Claim 3 is a manufacturing method of the caffeic acid phenethyl ester of Claim 1 or Claim 2, Furthermore, after reaction by the said chlorogenic acid esterase, a silica-type resin, an aromatic synthetic adsorption agent, and One or more treatments of adsorbing caffeic acid phenethyl ester by contacting with at least one selected from aliphatic ester-based synthetic adsorbents, and then eluting caffeic acid phenethyl ester using an elution solvent It is characterized by comprising a repeating step.
請求項４に記載の発明は、請求項１又は請求項２に記載のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、さらに、前記クロロゲン酸エステラーゼによる反応後に反応液を遠心分離又は静置することにより水層とフェネチルアルコール層とに分離する処理、次に得られた前記水層にカフェ酸及びフェネチルアルコールを配合することにより再度酵素反応させる処理を、１又は２回以上繰り返す工程を備えることを特徴とする。 The invention according to claim 4 is the method for producing caffeic acid phenethyl ester according to claim 1 or 2, further comprising centrifuging or standing the reaction solution after the reaction with the chlorogenic acid esterase. And the process of separating the phenethyl alcohol layer, and then the step of repeating the enzyme reaction again by blending caffeic acid and phenethyl alcohol into the obtained aqueous layer one or more times. .
本発明によれば、カフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、効率的に製造することができる。 According to the present invention, it can be efficiently produced in the method for producing caffeic acid phenethyl ester.
以下、本発明のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法を具体化した実施形態を説明する。
本発明のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法は、原料としてカフェ酸とフェネチルアルコール、酵素として所定量のクロロゲン酸エステラーゼ、及び溶媒として水を用い、それらの存在下で酵素反応させる工程からなる。カフェ酸フェネチルエステルは、カフェ酸とフェネチルアルコールとがクロロゲン酸エステラーゼによってエステル化させることにより合成される。
Hereinafter, the embodiment which actualized the manufacturing method of the caffeic acid phenethyl ester of this invention is described.
The method for producing caffeic acid phenethyl ester of the present invention comprises a step of performing an enzymatic reaction in the presence of caffeic acid and phenethyl alcohol as raw materials, a predetermined amount of chlorogenic acid esterase as an enzyme, and water as a solvent. Caffeic acid phenethyl ester is synthesized by esterifying caffeic acid and phenethyl alcohol with chlorogenic acid esterase.
本実施形態においてカフェ酸は、クロロゲン酸エステラーゼの基質として使用される。カフェ酸の配合形態としては、生合成品、化学合成品、天然素材からの精製品を適用することができる。精製方法としては、公知のクロマトグラフィーを用いて実施することができる。また、カフェ酸を含有する天然素材又はその抽出物（エキス）を原料として使用してもよい。カフェ酸を含有する天然素材としては、例えばコーヒー豆が挙げられる。コーヒー豆の種類としては、特に限定されないが、例えば、アラビカ種、カネフォーラ種ロブスタ、コニロン又はリベリカ種、及びそれらの雑種が挙げられる。コーヒー豆は、生豆の状態でもカフェ酸が含まれるが、コーヒー豆中に含有されるクロロゲン酸を熱によりカフェ酸へ分解させるために焙煎又は熱処理するのが好ましい。更に、焙煎又は熱処理したコーヒー豆を公知の方法に従って抽出後、アルカリ処理によって、クロロゲン酸を完全にカフェ酸へ分解させることがより好ましい。カフェ酸を含有する天然素材のエキスは、蒸気抽出や水（熱水）抽出、アルコール抽出、及び含水アルコール抽出等の公知の方法に従って抽出されることにより得られる。 In this embodiment, caffeic acid is used as a substrate for chlorogenic acid esterase. As a blending form of caffeic acid, biosynthetic products, chemically synthesized products, and purified products from natural materials can be applied. As a purification method, it can carry out using a well-known chromatography. Moreover, you may use the natural raw material containing caffeic acid, or its extract (extract) as a raw material. Examples of natural materials containing caffeic acid include coffee beans. Although it does not specifically limit as a kind of coffee bean, For example, Arabica seed | species, Canephora seed | species Robusta, Conilon or Revelica kind, and those hybrids are mentioned. The coffee beans contain caffeic acid even in the state of green beans, but are preferably roasted or heat-treated to decompose chlorogenic acid contained in the coffee beans into caffeic acid by heat. Furthermore, it is more preferable that after roasted or heat-treated coffee beans are extracted according to a known method, chlorogenic acid is completely decomposed into caffeic acid by alkali treatment. An extract of a natural material containing caffeic acid is obtained by extraction according to known methods such as steam extraction, water (hot water) extraction, alcohol extraction, and hydrous alcohol extraction.
フェネチルアルコールは、酵素によるエステル化反応の基質として利用される。フェネチルアルコールの配合形態としては、生合成品、化学合成品、天然素材から抽出された粗抽出品又は精製品を使用してもよく、フェネチルアルコールを含有する天然素材を原料として適用してもよい。フェネチルアルコールの水溶性を高めるために、水溶性の高いアルコールや有機溶媒、乳化剤等を酵素の変性が起こらない程度に加えてもよい。 Phenethyl alcohol is used as a substrate for an esterification reaction by an enzyme. As a blending form of phenethyl alcohol, a biosynthetic product, a chemically synthesized product, a crude extract or a refined product extracted from a natural material may be used, or a natural material containing phenethyl alcohol may be applied as a raw material. . In order to increase the water solubility of phenethyl alcohol, a highly water-soluble alcohol, organic solvent, emulsifier, or the like may be added to such an extent that enzyme denaturation does not occur.
クロロゲン酸エステラーゼは、基質としてのカフェ酸及びフェネチルアルコールを用いてエステル化反応を行うために配合される。クロロゲン酸エステラーゼは、麹菌等の糸状菌、酵母、細菌等の微生物が生産するものが一般的に用いられるが、酵素処理の効率が特に高いために、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、ボトリティス（Botrytis）属が生産するクロロゲン酸エステラーゼが好ましい。クロロゲン酸エステラーゼは、市販品を使用することができ、市販品としては例えばキッコーマン社製（Aspergillus japonicus由来）を挙げることができる。クロロゲン酸エステラーゼは、主としてクロロゲン酸をカフェ酸とキナ酸（キニン酸）に加水分解する反応を触媒する酵素であるが、クロロゲン酸エステラーゼの酵素量を調節することにより、またフェネチルアルコール等の基質の配合により、逆反応としてエステル化反応を進行させることができる。クロロゲン酸エステラーゼは、反応溶液中において０．０５Ｕｎｉｔ／ｍＬ（０．８３３ｎｋａｔ／ｍＬ）以上、好ましくは０．２Ｕｎｉｔ／ｍＬ（３．３３ｎｋａｔ／ｍＬ）以上、より好ましくは１Ｕｎｉｔ／ｍＬ（１６．７ｎｋａｔ／ｍＬ）以上の酵素量で反応させる。酵素量が０．０５Ｕｎｉｔ／ｍＬ未満であると反応効率が低下し、カフェ酸フェネチルエステルの収率が低下する。クロロゲン酸エステラーゼの配合量の上限は、反応溶液中において１０Ｕｎｉｔ／ｍＬ（１６７ｎｋａｔ／ｍＬ）以下、好ましくは８Ｕｎｉｔ／ｍＬ（１３３ｎｋａｔ／ｍＬ）以下、より好ましくは７．２Ｕｎｉｔ／ｍＬ（１２０ｎｋａｔ／ｍＬ）以下の酵素量で反応させる。酵素量が１０Ｕｎｉｔ／ｍＬを超えるとそれ以上の反応促進又は収率の増加効果は得られず、製造コストの上昇を招くおそれがある。尚、クロロゲン酸エステラーゼの酵素量１Ｕｎｉｔとは、３０℃で最も化学反応が進む酸性度（ｐＨ６．５）で毎分１μｍｏｌのクロロゲン酸を加水分解することができる酵素量を示す。 Chlorogenic acid esterase is blended to perform an esterification reaction using caffeic acid and phenethyl alcohol as substrates. As chlorogenic acid esterase, those produced by microorganisms such as filamentous fungi such as Aspergillus or yeast, bacteria are generally used, but due to the particularly high efficiency of enzyme treatment, Aspergillus genus and Penicillium genus Chlorogenic acid esterase produced by the genus Botrytis is preferred. As the chlorogenic acid esterase, a commercially available product can be used, and examples of the commercially available product include Kikkoman's product (derived from Aspergillus japonicus). Chlorogenic acid esterase is an enzyme that mainly catalyzes the reaction of hydrolyzing chlorogenic acid into caffeic acid and quinic acid (quinic acid). By adjusting the amount of chlorogenic acid esterase, it is also possible to remove phenethyl alcohol and other substrates. By blending, the esterification reaction can proceed as a reverse reaction. Chlorogenic acid esterase is 0.05 Unit / mL (0.833 nkat / mL) or more in the reaction solution, preferably 0.2 Unit / mL (3.33 nkat / mL) or more, more preferably 1 Unit / mL (16.7 nkat / mL). The reaction is performed with an enzyme amount of mL) or more. When the amount of the enzyme is less than 0.05 Unit / mL, the reaction efficiency decreases, and the yield of caffeic acid phenethyl ester decreases. The upper limit of the amount of chlorogenic acid esterase in the reaction solution is 10 Unit / mL (167 nkat / mL) or less, preferably 8 Unit / mL (133 nkat / mL) or less, more preferably 7.2 Unit / mL (120 nkat / mL) or less. React with the amount of enzyme. If the amount of the enzyme exceeds 10 Unit / mL, no further reaction acceleration or yield increase effect can be obtained, and the production cost may increase. The enzyme amount 1 unit of chlorogenic acid esterase indicates the amount of enzyme capable of hydrolyzing 1 μmol of chlorogenic acid per minute with the acidity (pH 6.5) at which the chemical reaction proceeds most at 30 ° C.
酵素処理は、カフェ酸及びフェネチルアルコールを溶媒である水に混合して反応溶液を調製した後、該反応溶液に酵素を作用させる処理である。尚、カフェ酸、フェネチルアルコール及び水とを混合して反応溶液を調製してもよいし、フェネチルアルコールに水を加えてフェネチルアルコール・水混合液を調製した後、該フェネチルアルコール・水混合液にカフェ酸を添加して反応溶液を調製してもよい。また、カフェ酸が含有される天然素材のエキスにフェネチルアルコールを配合して反応溶液を調製してもよい。この酵素処理では、所定条件下において酵素によりカフェ酸とフェネチルアルコールとのエステル化反応が行われ、カフェ酸フェネチルエステルが生成される。反応溶液中におけるカフェ酸の濃度は、好ましくは０．０２〜１Ｍ、より好ましくは０．１〜０．５Ｍ、さらに好ましくは０．２〜０．３Ｍである。カフェ酸の濃度が０．０２Ｍ未満の場合は、反応率は良いが、ＣＡＰＥの収量が少なく効率が悪い。また、カフェ酸の濃度が１Ｍを超える場合は、反応液への分散性が悪いため、反応率が低下するおそれがあり反応の効率が悪い。反応溶液中におけるカフェ酸及びフェネチルアルコールの配合比は、特に限定されず、カフェ酸の配合量に対し、フェネチルアルコールを過剰量配合すればよい。例えば、カフェ酸１モルに対し、好ましくは１〜２００モル、より好ましくは５〜５０モル、さらに好ましくは８〜１５モルである。 In the enzyme treatment, caffeic acid and phenethyl alcohol are mixed with water as a solvent to prepare a reaction solution, and then the enzyme is allowed to act on the reaction solution. The reaction solution may be prepared by mixing caffeic acid, phenethyl alcohol and water, or after adding water to phenethyl alcohol to prepare a phenethyl alcohol / water mixture, the phenethyl alcohol / water mixture is added to the mixture. A reaction solution may be prepared by adding caffeic acid. Alternatively, a reaction solution may be prepared by blending phenethyl alcohol with a natural material extract containing caffeic acid. In this enzyme treatment, an esterification reaction between caffeic acid and phenethyl alcohol is performed by an enzyme under predetermined conditions to produce caffeic acid phenethyl ester. The concentration of caffeic acid in the reaction solution is preferably 0.02 to 1M, more preferably 0.1 to 0.5M, and still more preferably 0.2 to 0.3M. When the concentration of caffeic acid is less than 0.02M, the reaction rate is good, but the yield of CAPE is small and the efficiency is poor. On the other hand, when the concentration of caffeic acid exceeds 1M, the dispersibility in the reaction solution is poor, so that the reaction rate may decrease and the reaction efficiency is poor. The blending ratio of caffeic acid and phenethyl alcohol in the reaction solution is not particularly limited, and an excess amount of phenethyl alcohol may be blended with respect to the blending amount of caffeic acid. For example, with respect to 1 mol of caffeic acid, it is preferably 1 to 200 mol, more preferably 5 to 50 mol, and still more preferably 8 to 15 mol.
酵素処理は、前記反応溶液に酵素を直接添加して静置又は撹拌することにより行う。酵素と基質が接触しやすい点で、撹拌した方が好ましい。また、酵素処理の効率が高く、反応溶液と酵素との分離が容易な方法として、担体に固定化された酵素と反応溶液とを接触させることにより行ってもよい。担体に固定化された酵素と反応溶液との接触は、反応溶液中に前記担体を分散させる等により行われる。また、酵素反応を後述するクロマトグラフィー担体の存在下で行ってもよい。その場合、生成したカフェ酸フェネチルエステルがクロマトグラフィー担体に吸着されるため、化学平衡によりクロマトグラフィー担体に吸着していない酵素及び未反応基質より新たなカフェ酸フェネチルエステルが連続的に合成される。かかる連続的な合成により、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率がより一層向上する。 The enzyme treatment is performed by directly adding the enzyme to the reaction solution and allowing it to stand or stir. Stirring is preferred because the enzyme and the substrate can easily come into contact with each other. Further, as a method in which the efficiency of the enzyme treatment is high and the reaction solution and the enzyme can be easily separated, the enzyme immobilized on the carrier and the reaction solution may be brought into contact with each other. Contact between the enzyme immobilized on the carrier and the reaction solution is performed by dispersing the carrier in the reaction solution or the like. Moreover, you may perform an enzyme reaction in presence of the chromatographic support mentioned later. In that case, since the produced caffeic acid phenethyl ester is adsorbed on the chromatography carrier, new caffeic acid phenethyl ester is continuously synthesized from the enzyme and the unreacted substrate which are not adsorbed on the chromatography carrier due to chemical equilibrium. By such continuous synthesis, the production efficiency of caffeic acid phenethyl ester is further improved.
酵素処理の条件は、目的とする収率等に応じ、適宜設定することができる。反応ｐＨは、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ４〜５である。ｐＨ変化を少なくするために、緩衝液、例えばクエン酸緩衝液等を用いても良い。反応温度は、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは３５〜４５℃である。反応温度が３０℃未満の場合、酵素活性が低く反応が遅くなり、逆に６０℃を超える場合、酵素が失活するおそれがある。反応時間は、上記反応ｐＨ及び反応温度により適宜設定され得るが、好ましくは１２〜１２０時間、より好ましく２４〜９６時間である。反応時間が１２時間未満の場合、十分な量の反応生成物が得られない場合がある。逆に反応時間が１２０時間を超える場合、それ以上の反応生成物が得られず、効率が悪い。 The conditions for the enzyme treatment can be appropriately set according to the target yield and the like. The reaction pH is preferably pH 4-8, more preferably pH 4-5. In order to reduce the pH change, a buffer solution such as a citrate buffer solution may be used. The reaction temperature is preferably 30 to 60 ° C, more preferably 35 to 45 ° C. When the reaction temperature is less than 30 ° C, the enzyme activity is low and the reaction is slowed. Conversely, when the reaction temperature exceeds 60 ° C, the enzyme may be deactivated. The reaction time can be appropriately set depending on the reaction pH and reaction temperature, but is preferably 12 to 120 hours, more preferably 24 to 96 hours. When the reaction time is less than 12 hours, a sufficient amount of reaction product may not be obtained. On the other hand, when the reaction time exceeds 120 hours, no further reaction product is obtained and the efficiency is poor.
クロロゲン酸エステラーゼによる反応後は、反応後の溶液をそのままカフェ酸フェネチルエステル含有組成物として各種用途に適用してもよいが、未反応の基質等の不純物を除くために、分離・精製処理することが好ましい。分離・精製処理としては、公知のクロマトグラフィーを用いて、生成したカフェ酸フェネチルエステルを分離・精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えばカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び薄層クロマトグラフィーが挙げられる。クロマトグラフィーに用いられる担体としては、例えばシリカ系樹脂、及び合成吸着剤が挙げられる。シリカ系樹脂としては、例えばオクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）、フェニルシリル化シリカゲル、及びオクチルシリル化シリカゲル等が挙げられる。これらの中で、カフェ酸フェネチルエステルを効率よく分離することができるＯＤＳが好ましく適用される。合成吸着剤としては、例えば芳香族系合成吸着剤及び脂肪族エステル系合成吸着剤が挙げられる。合成吸着剤の中でも、カフェ酸フェネチルエステルを効率よく分離することができる芳香族系合成吸着剤のスチレン系合成吸着剤が好ましく適用される。スチレン系合成吸着剤の市販品としては、例えばデュオライトＳシリーズ、アンバーライトＸＡＤシリーズ（いずれもローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ２０、セパビーズＳＰ２０７、セパビーズＳＰ７００、セパビーズＳＰ８２５（いずれも三菱化学社製）等が挙げられる。これらの担体は１種類のみ適用してもよく、又は２種以上を組み合わせて適用してもよい。これらの中でもカフェ酸フェネチルエステルの分離効率がより高いスチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着剤であるダイヤイオンＨＰ２０が好ましく適用される。 After the reaction with chlorogenic acid esterase, the solution after the reaction may be applied as it is for various uses as a caffeic acid phenethyl ester-containing composition, but it must be separated and purified to remove impurities such as unreacted substrates. Is preferred. As the separation / purification treatment, the produced caffeic acid phenethyl ester can be separated / purified using known chromatography. Examples of the chromatography include column chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), and thin layer chromatography. Examples of the carrier used for chromatography include a silica-based resin and a synthetic adsorbent. Examples of the silica-based resin include octadecyl silylated silica gel (ODS), phenyl silylated silica gel, and octyl silylated silica gel. Among these, ODS that can efficiently separate caffeic acid phenethyl ester is preferably applied. Examples of the synthetic adsorbent include aromatic synthetic adsorbents and aliphatic ester synthetic adsorbents. Among the synthetic adsorbents, an aromatic synthetic adsorbent that can efficiently separate caffeic acid phenethyl ester is preferably applied. Commercially available styrene synthetic adsorbents include, for example, Duolite S series, Amberlite XAD series (both manufactured by Rohm and Haas), Diaion HP20, Sepabead SP207, Sepabead SP700, Sepabead SP825 (all Mitsubishi Chemical) Etc.). These carriers may be applied alone or in combination of two or more. Among these, Diaion HP20 which is a styrene-divinylbenzene synthetic adsorbent having higher separation efficiency of caffeic acid phenethyl ester is preferably applied.
上記各種クロマトグラフィーの使用方法としては、公知の方法を適宜採用することができる。例えば、酵素反応後の溶液を各種クロマトグラフィーの担体に接触させることによりカフェ酸フェネチルエステルを吸着させる吸着工程、次に洗浄用溶媒を用いて担体を洗浄する工程、次に溶出用溶媒を用いて担体からカフェ酸フェネチルエステルを溶出させる溶出工程からなる。クロマトグラフィーを用いた分離・精製処理は１回のみならず２回以上繰り返すことによりカフェ酸フェネチルエステルの純度を高めてもよい。洗浄用溶媒及び溶出用溶媒としては、水及び有機溶媒、例えばアルコール（エタノール、メタノール等）、アセトン、ヘキサン、クロロホルム、グリセリン、氷酢酸が挙げられる。溶媒はこれらの中から担体の種類、分離条件等に応じて適宜一種又は二種以上組み合わせて適用される。 As a method of using the above various chromatographies, known methods can be appropriately employed. For example, an adsorption step of adsorbing caffeic acid phenethyl ester by bringing the solution after the enzyme reaction into contact with various chromatographic carriers, then a step of washing the carrier with a washing solvent, and then using an elution solvent It comprises an elution step of eluting caffeic acid phenethyl ester from the carrier. The purity of caffeic acid phenethyl ester may be increased by repeating the separation / purification treatment using chromatography not only once but also twice or more. Examples of the washing solvent and elution solvent include water and organic solvents such as alcohol (ethanol, methanol, etc.), acetone, hexane, chloroform, glycerin, and glacial acetic acid. Among these solvents, one kind or a combination of two or more kinds is appropriately applied depending on the kind of carrier, separation conditions and the like.
反応溶液に酵素を作用させた後は、該酵素を失活又は反応溶液から取除いてもよいが、製造コストの低減のために以下の方法を用いてクロロゲン酸エステラーゼを再利用することが好ましい。まず、クロロゲン酸エステラーゼによる反応後に反応液を遠心分離又は静置することにより水層とフェネチルアルコール層とに分離する処理が行われる。遠心分離の条件は特に限定されないが、好ましくは１０００〜３０００ｒｐｍで５〜２０分の条件で行われる。また、静置の場合、静置の時間は一晩（約１２時間）以上が好ましい。分離後の水層には、クロロゲン酸エステラーゼが分配され、フェネチルアルコール層には、カフェ酸フェネチルエステル、並びに未反応のカフェ酸及びフェネチルアルコールが分配される。したがって、水層のみを取り出し、新規にカフェ酸及びフェネチルアルコールを配合することにより再度酵素反応させることができる。このクロロゲン酸エステラーゼが含有される水層の再利用は、２回以上繰り返してもよい。尚、分離後のフェネチルアルコール層は、既に溶媒としての水及び酵素が分離されているため、その後のクロマトグラフィーを用いたカフェ酸フェネチルエステルの分離・精製処理工程に好ましく適用することができる。また、担体に固定化された酵素を使用した場合は、公知の方法により担体を回収し、酵素を再利用できる。 After the enzyme is allowed to act on the reaction solution, the enzyme may be deactivated or removed from the reaction solution, but it is preferable to reuse the chlorogenic acid esterase using the following method in order to reduce the production cost. . First, after the reaction with chlorogenic acid esterase, the reaction solution is centrifuged or allowed to stand to separate into an aqueous layer and a phenethyl alcohol layer. Centrifugation conditions are not particularly limited, but are preferably performed at 1000 to 3000 rpm for 5 to 20 minutes. In the case of standing, the standing time is preferably overnight (about 12 hours) or longer. Chlorogenic acid esterase is distributed in the separated aqueous layer, and caffeic acid phenethyl ester, and unreacted caffeic acid and phenethyl alcohol are distributed in the phenethyl alcohol layer. Therefore, the enzyme reaction can be performed again by taking out only the aqueous layer and newly adding caffeic acid and phenethyl alcohol. The reuse of the aqueous layer containing the chlorogenic acid esterase may be repeated two or more times. In addition, since the water and enzyme as a solvent have already been isolate | separated, the phenethyl alcohol layer after isolation | separation can apply preferably to the isolation | separation and refinement | purification process process of caffeic acid phenethyl ester using subsequent chromatography. When an enzyme immobilized on a carrier is used, the carrier can be recovered by a known method and the enzyme can be reused.
カフェ酸フェネチルエステルの分離及び精製工程後の溶液は、そのままの状態でカフェ酸フェネチルエステルとして利用してもよく、真空乾燥及び凍結乾燥等の公知の乾燥処理を行うことにより、粉末化して使用してもよい。カフェ酸フェネチルエステルは、抗酸化作用、抗炎症作用、抗癌作用、及び抗ウイルス作用等を目的とした飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等の用途に利用することができる。 The solution after the separation and purification step of caffeic acid phenethyl ester may be used as it is as caffeic acid phenethyl ester, and may be used as a powder by performing a known drying process such as vacuum drying and freeze drying. May be. Caffeic acid phenethyl ester can be used for applications such as foods and drinks, pharmaceuticals, quasi-drugs, and cosmetics for anti-oxidant, anti-inflammatory, anti-cancer, and antiviral effects.
本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法は、原料としてカフェ酸とフェネチルアルコール、及び溶媒として水の存在下で酵素としてクロロゲン酸エステラーゼを０．０５〜１０Ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素量で反応させることを特徴とする。したがって、カフェ酸フェネチルエステルを効率的に製造することができる。また、化学合成に比べて複雑な製造工程を要することなく容易に製造することができる。
The effects exhibited by this embodiment will be described below.
(1) The production method of caffeic acid phenethyl ester of this embodiment is a reaction of caffeic acid and phenethyl alcohol as raw materials and chlorogenic acid esterase as an enzyme in the presence of water as a solvent at an enzyme amount of 0.05 to 10 Unit / mL. It is characterized by making it. Therefore, caffeic acid phenethyl ester can be produced efficiently. Moreover, it can manufacture easily, without requiring a complicated manufacturing process compared with chemical synthesis.
（２）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、好ましくはクロロゲン酸エステラーゼは０．２〜８Ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素量で反応させる。したがって、カフェ酸フェネチルエステルをより効率的に製造することができる。 (2) In the method for producing caffeic acid phenethyl ester of the present embodiment, preferably, chlorogenic acid esterase is reacted at an enzyme amount of 0.2 to 8 Unit / mL. Therefore, caffeic acid phenethyl ester can be produced more efficiently.
（３）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、好ましくは、さらに分離・精製処理される。分離・精製処理は、まず、酵素反応後にシリカ系樹脂、芳香族系合成吸着剤、及び脂肪族エステル系合成吸着剤から選ばれる少なくとも一種に接触させることにより、カフェ酸フェネチルエステルを吸着させる処理、次に溶出用溶媒を用いてカフェ酸フェネチルエステルを溶出させる処理を、１又は２回以上繰り返す工程を備える。したがって、カフェ酸フェネチルエステルを未反応原料から容易に分離・精製することができ、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率がより一層向上する。 (3) In the method for producing caffeic acid phenethyl ester of the present embodiment, preferably, separation and purification are further performed. Separation / purification treatment is a treatment to adsorb caffeic acid phenethyl ester by contacting with at least one selected from a silica-based resin, an aromatic synthetic adsorbent, and an aliphatic ester synthetic adsorbent after the enzyme reaction, Next, the process which elutes the caffeic acid phenethyl ester using the elution solvent is repeated one or more times. Therefore, caffeic acid phenethyl ester can be easily separated and purified from unreacted raw materials, and the production efficiency of caffeic acid phenethyl ester is further improved.
（４）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、好ましくは、さらに酵素反応後に反応液を遠心分離又は静置することにより水層とフェネチルアルコール層とに分離する処理、次に得られた前記水層にカフェ酸及びフェネチルアルコールを配合することにより再度酵素反応させる処理を、１又は２回以上繰り返す工程を備える。反応後にクロロゲン酸エステラーゼを含有する水層を再利用することでカフェ酸フェネチルエステルを連続的に合成することができ、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率がより一層向上する。また、クロロゲン酸エステラーゼを再利用するため、製造コストを抑制することができる。 (4) In the method for producing caffeic acid phenethyl ester of the present embodiment, preferably, after the enzyme reaction, the reaction solution is separated into an aqueous layer and a phenethyl alcohol layer by centrifugation or standing, and then obtained. The step of repeating the enzyme reaction again by adding caffeic acid and phenethyl alcohol to the aqueous layer is provided once or twice or more. Caffeic acid phenethyl ester can be synthesized continuously by reusing the aqueous layer containing chlorogenic acid esterase after the reaction, and the production efficiency of caffeic acid phenethyl ester is further improved. Moreover, since the chlorogenic acid esterase is reused, the production cost can be suppressed.
（５）本実施形態において、カフェ酸の原料として天然素材由来のエキスを使用することができる。したがって、カフェ酸フェネチルエステルを生体に適用する場合は、その安全性を高めることができる。また、生体に不要な成分を除去する必要がなく製造効率をより向上させることができる。 (5) In this embodiment, an extract derived from a natural material can be used as a raw material for caffeic acid. Therefore, when caffeic acid phenethyl ester is applied to a living body, its safety can be enhanced. Moreover, it is not necessary to remove components unnecessary for the living body, and the production efficiency can be further improved.
（６）本実施形態において、カフェ酸の原料としてコーヒー豆エキスを使用することができる。したがって、カフェ酸フェネチルエステルを安価に製造することができる。
（７）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、酵素反応は好ましくは反応温度３０〜６０℃、反応時間１２〜１２０時間の条件下で作用させる。したがって、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率をより向上させることができる。
(6) In this embodiment, a coffee bean extract can be used as a raw material for caffeic acid. Therefore, caffeic acid phenethyl ester can be produced at low cost.
(7) In the method for producing caffeic acid phenethyl ester of the present embodiment, the enzyme reaction is preferably performed under conditions of a reaction temperature of 30 to 60 ° C. and a reaction time of 12 to 120 hours. Therefore, the production efficiency of caffeic acid phenethyl ester can be further improved.
（８）本実施形態のカフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、クロロゲン酸エステラーゼの酵素反応をクロマトグラフィー担体、例えばシリカ系樹脂、芳香族系合成吸着剤、及び脂肪族エステル系合成吸着剤の存在下で行ってもよい。生成したカフェ酸フェネチルエステルがクロマトグラフィー担体に吸着されるため、化学平衡によりクロマトグラフィー担体に吸着していない酵素及び未反応基質よって新たなカフェ酸フェネチルエステルが連続的に合成される。したがって、カフェ酸フェネチルエステルの反応液からの分離・精製が容易になるのみならず、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率がより一層向上する。 (8) In the method for producing caffeic acid phenethyl ester of this embodiment, the enzymatic reaction of chlorogenic acid esterase is performed in the presence of a chromatography carrier, for example, a silica-based resin, an aromatic synthetic adsorbent, and an aliphatic ester synthetic adsorbent. You may go on. Since the produced caffeic acid phenethyl ester is adsorbed on the chromatography carrier, new caffeic acid phenethyl ester is continuously synthesized by the enzyme and the unreacted substrate that are not adsorbed on the chromatography carrier due to chemical equilibrium. Therefore, not only the separation and purification of caffeic acid phenethyl ester from the reaction solution is facilitated, but also the production efficiency of caffeic acid phenethyl ester is further improved.
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・カフェ酸フェネチルエステルは、ヒトに適用される飲食品、医薬品、及び化粧品のみならず、家畜等の飼養動物に対する医薬品等に適用してもよい。
In addition, you may change the said embodiment as follows.
-Caffeic acid phenethyl ester may be applied not only to foods and drinks, pharmaceuticals, and cosmetics applied to humans, but also to pharmaceuticals for domestic animals such as livestock.
以下に試験例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜試験例１：酵素量と反応率との関係＞
基質としてカフェ酸及びフェネチルアルコール、酵素としてクロロゲン酸エステラーゼを用いた場合、酵素量と反応生成物であるカフェ酸フェネチルエステルの収率との関係について試験した。
Although the test example is given below and the embodiment is described more specifically, the present invention is not limited to these.
<Test Example 1: Relationship between enzyme amount and reaction rate>
When caffeic acid and phenethyl alcohol were used as substrates and chlorogenic acid esterase was used as an enzyme, the relationship between the amount of enzyme and the yield of caffeic acid phenethyl ester as a reaction product was tested.
蒸留水１０ｍＬにフェネチルアルコール（２−フェニルエタノール、ナカライテスク株式会社製）およびカフェ酸（カフェイン酸、３，４−ジヒドロキシケイ皮酸、東京化成工業株式会社製）を表１の各試料ごとに記した量を添加してよく混合した。この溶液に、キッコーマン株式会社製のクロロゲン酸エステラーゼ（製品コード６０７５６、２４．１Ｕｎｉｔ／ｇ、ブドウ糖９３％およびエステラーゼ７％を含む）を表１に記した量を添加し、最後に容量が２０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液の一部を下記測定条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。 Phenethyl alcohol (2-phenylethanol, manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.) and caffeic acid (caffeic acid, 3,4-dihydroxycinnamic acid, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) are added to 10 mL of distilled water for each sample in Table 1. Add the indicated amount and mix well. To this solution, the amount of chlorogenic acid esterase (product code 60756, 24.1 Unit / g, containing 93% glucose and 7% esterase) manufactured by Kikkoman Co., Ltd. was added, and finally the volume was adjusted to 20 mL. Distilled water was added to adjust. The reaction was allowed to proceed for 72 hours at 40 ° C. with gentle stirring. A part of the solution after the reaction was subjected to high performance liquid chromatography analysis under the following measurement conditions.
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＡＧ１２０（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、資生堂社製）
移動相：Ａ，水（０．１％トリフルオロ酢酸含有）、Ｂ，メタノール（０．１％トリフルオロ酢酸含有）
グラジエント：移動相Ａ４０％，移動相Ｂ６０％（０分）→移動相Ａ０％，移動相Ｂ１００％（１５分）→移動相Ａ０％，移動相Ｂ１００％（５分）
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：ＵＶ３２５ｎｍ（Ｗａｔｅｒｓ ９９６フォトダイオード）
カラム温度：４０℃
高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、カフェ酸及びＣＡＰＥの標準品（シグマ社製）とそれぞれ対比させることにより、カフェ酸及びＣＡＰＥのピークを同定し、それぞれのピーク面積を求めた。下記式１により、反応条件ごとの反応率を求めた。結果を表１，図１（カフェ酸０．２１Ｍ及びフェネチルアルコール２．５Ｍの場合）に示す。
<High-performance liquid chromatography analysis conditions>
Column: CAPCELL PAK C18 AG120 (inner diameter 4.6 mm × length 250 mm, manufactured by Shiseido Co., Ltd.)
Mobile phase: A, water (containing 0.1% trifluoroacetic acid), B, methanol (containing 0.1% trifluoroacetic acid)
Gradient: mobile phase A 40%, mobile phase B 60% (0 minutes) → mobile phase A 0%, mobile phase B 100% (15 minutes) → mobile phase A 0%, mobile phase B 100% (5 minutes)
Flow rate: 0.6 mL / min
Detection wavelength: UV325nm (Waters 996 photodiode)
Column temperature: 40 ° C
By comparing the retention time and ultraviolet absorption spectrum of each peak confirmed by high performance liquid chromatography with the standard product of caffeic acid and CAPE (manufactured by Sigma), respectively, the peaks of caffeic acid and CAPE are identified. The peak area was determined. The reaction rate for each reaction condition was determined by the following formula 1. The results are shown in Table 1 and FIG. 1 (in the case of 0.21 M caffeic acid and 2.5 M phenethyl alcohol).
式１：反応率（％）＝（ＣＡＰＥのピーク面積）／（カフェ酸のピーク面積＋ＣＡＰＥのピーク面積）×１００ Formula 1: Reaction rate (%) = (Cape peak area) / (Caffeic acid peak area + CAPE peak area) × 100
＜試験例２：ＣＡＰＥの分離・精製処理＞
（ＣＡＰＥの合成）
蒸留水１０ｍＬにフェネチルアルコール６．１ｇ（終濃度２．５Ｍ）及びカフェ酸０．７５ｇ（終濃度０．２１Ｍ）を添加してよく混合した。この溶液にクロロゲン酸エステラーゼ６ｇ（終濃度約７．２３Ｕ／ｍＬ）を添加し、最後に容量が２０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４５℃で２４時間反応させた。反応後の溶液に、酢酸エチルを２０ｍＬ添加し、５分間激しく撹拌後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その結果、上部の酢酸エチル層と、下部の水層に分かれた。酢酸エチル層と水層の一部について、それぞれ試験例１に示す条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。
<Test Example 2: CAPE separation / purification treatment>
(Synthesis of CAPE)
To 10 mL of distilled water, 6.1 g of phenethyl alcohol (final concentration 2.5 M) and 0.75 g of caffeic acid (final concentration 0.21 M) were added and mixed well. To this solution, 6 g of chlorogenic acid esterase (final concentration: about 7.23 U / mL) was added, and finally, distilled water was added to adjust the volume to 20 mL. The reaction was allowed to proceed for 24 hours at 45 ° C. with gentle stirring. 20 mL of ethyl acetate was added to the solution after the reaction, and the mixture was vigorously stirred for 5 minutes and then centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. As a result, it was separated into an upper ethyl acetate layer and a lower aqueous layer. A part of the ethyl acetate layer and the aqueous layer were subjected to high performance liquid chromatography analysis under the conditions shown in Test Example 1.
高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、クロロゲン酸エステラーゼ、カフェ酸、フェネチルアルコール、及びＣＡＰＥの標準品（シグマ社製）とそれぞれ対比させた。その結果、酢酸エチル層にはＣＡＰＥ、未反応のカフェ酸及びフェネチルアルコールが分配されたことが明らかになった。また、水層には、クロロゲン酸エステラーゼが分配されたことが明らかになった。以上の結果、酵素反応の結果、生成したＣＡＰＥは酢酸エチル層に分配されるが、未反応のカフェ酸及びフェネチルアルコールが混入するため、ＣＡＰＥのみを精製する場合、さらに処理工程が必要であることが明らかになった。次に、ＣＡＰＥの分離・精製処理工程においてＯＤＳカラム及びスチレン系合成吸着剤がそれぞれ適用可能か否かを以下の方法に従い検討した。 The retention time and ultraviolet absorption spectrum of each peak confirmed by high performance liquid chromatography were compared with chlorogenic acid esterase, caffeic acid, phenethyl alcohol, and CAPE standard products (manufactured by Sigma), respectively. As a result, it became clear that CAPE, unreacted caffeic acid and phenethyl alcohol were distributed in the ethyl acetate layer. It was also revealed that chlorogenic acid esterase was distributed in the aqueous layer. As a result of the above, the produced CAPE is distributed to the ethyl acetate layer as a result of the enzyme reaction. However, since unreacted caffeic acid and phenethyl alcohol are mixed, a further processing step is required when purifying only CAPE. Became clear. Next, whether or not the ODS column and the styrene-based synthetic adsorbent were applicable in the CAPE separation / purification treatment step was examined according to the following method.
（ＯＤＳカラムを用いた分離・精製処理）
蒸留水２０ｍＬにフェネチルアルコール１２．２ｇ（終濃度２．５Ｍ）及びカフェ酸１．５ｇ（終濃度０．２１Ｍ）を添加してよく混合した。この溶液に、クロロゲン酸エステラーゼ６ｇ（終濃度約３．６２Ｕ／ｍＬ）を添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液に、酢酸エチルを４０ｍＬ添加し、５分間激しく撹拌後、３０分間静置した。上部の酢酸エチル層を回収し、溶媒をできる限り減圧留去させた後に、あらかじめ４０％メタノールで平衡化したＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘＯＤＳ（富士シリシア化学株式会社製）カラム（内径５．６ｃｍ×長さ３０ｃｍ）にアプライした。カラムは、４Ｌの４０％メタノールで洗浄後、２Ｌの９９．８％メタノールで溶出させた。溶出液は、溶媒を減圧留去し、１．９３ｇの粉末を得た。粉末の一部をとり、５０％メタノールに溶解し、試験例１に示す条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、ＣＡＰＥの標準品と対比することにより、得られた粉末がＣＡＰＥであることを確認した。また、未反応のカフェ酸及びフェネチルアルコールのピークは、全く検出されなかった。酵素反応により得られたＣＡＰＥの粉末及びＣＡＰＥの標準品の高速液体クロマトグラムを図２及び図３にそれぞれ示す。また、酵素反応により得られたＣＡＰＥの粉末及びＣＡＰＥの標準品の紫外線吸収スペクトルを図４及び図５にそれぞれ示す。なお、下記式２により、ＣＡＰＥの収率を求めた。その結果、本実施例のＣＡＰＥの収率は、約７８％であった。以上により、ＣＡＰＥの分離・精製処理工程においてＯＤＳカラムの適用が有効であることが確認された。
(Separation / purification using ODS column)
To 20 mL of distilled water, 12.2 g (final concentration 2.5 M) of phenethyl alcohol and 1.5 g of caffeic acid (final concentration 0.21 M) were added and mixed well. To this solution, 6 g of chlorogenic acid esterase (final concentration of about 3.62 U / mL) was added, and finally distilled water was added to adjust the volume to 40 mL. The reaction was allowed to proceed for 72 hours at 40 ° C. with gentle stirring. 40 mL of ethyl acetate was added to the solution after the reaction, and the mixture was vigorously stirred for 5 minutes and then allowed to stand for 30 minutes. The upper ethyl acetate layer was recovered, the solvent was distilled off under reduced pressure as much as possible, and then applied to a Chromatorex ODS (manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd.) column (inner diameter 5.6 cm × length 30 cm) equilibrated with 40% methanol in advance. did. The column was washed with 4 L of 40% methanol and then eluted with 2 L of 99.8% methanol. In the eluate, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 1.93 g of powder. A part of the powder was taken, dissolved in 50% methanol, and subjected to high performance liquid chromatography analysis under the conditions shown in Test Example 1. The obtained powder was confirmed to be CAPE by comparing the retention time and the ultraviolet absorption spectrum with a standard CAPE product. In addition, unreacted caffeic acid and phenethyl alcohol peaks were not detected at all. The high performance liquid chromatograms of the CAPE powder and the CAPE standard product obtained by the enzyme reaction are shown in FIGS. 2 and 3, respectively. Moreover, the ultraviolet absorption spectrum of the powder of CAPE obtained by the enzyme reaction and the standard product of CAPE is shown in FIGS. 4 and 5, respectively. In addition, the yield of CAPE was calculated | required by the following formula 2. As a result, the yield of CAPE in this example was about 78%. As described above, it was confirmed that application of the ODS column is effective in the CAPE separation / purification process.
式２：収率（％）=（ＣＡＰＥのモル数）／（カフェ酸のモル数）×１００
（スチレン系合成吸着剤を用いた分離・精製処理）
蒸留水２０ｍＬにカフェ酸１．５ｇ（終濃度０．２１Ｍ）及びクロロゲン酸エステラーゼ６ｇ（終濃度約３．６２Ｕ／ｍＬ）を添加してよく混合した。この溶液に、フェネチルアルコール１２．２ｇ（終濃度２．５Ｍ）を添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液を一晩静置したところ、その溶液は、上部のフェネチルアルコール層と下部の水層に分かれた。フェネチルアルコール層と水層の一部について、それぞれ試験例１の測定条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、クロロゲン酸エステラーゼ、カフェ酸、フェネチルアルコール、及びＣＡＰＥの標準品とそれぞれ対比させた。その結果、フェネチルアルコール層には、フェネチルアルコール、ＣＡＰＥ、及び未反応のカフェ酸が分配されたことが明らかになった。また、水層にはクロロゲン酸エステラーゼが分配されたことが明らかになった。フェネチルアルコール層を回収し、溶媒をできる限り減圧留去させた後に、あらかじめ５０％エタノールで平衡化したスチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着剤としてのダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学株式会社製）カラム（内径３．４ｃｍ×長さ２６ｃｍ）にアプライした。０．５Ｌの５０％エタノール、０．５Ｌの６０％エタノール、及び０．５Ｌの７０％エタノールで段階的に溶出させ、それぞれ、画分１、画分２、画分３と名づけた。各画分の一部について、それぞれ試験例１の測定条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、カフェ酸、フェネチルアルコール、及びＣＡＰＥの標準品とそれぞれ対比させた。その結果、画分１には、カフェ酸及びフェネチルアルコールのピークが認められた。画分２には、フェネチルアルコールのピークのみ確認された。画分３には、ＣＡＰＥのピークのみ確認された（尚、データの添付はそれぞれ省略する）。以上の高速液体クロマトグラフィー分析結果に基づき、画分３について、溶媒を減圧留去し、１．８７ｇのＣＡＰＥ粉末を得た。なお、上記式２により、ＣＡＰＥの収率を求めた。その結果、本実施例のＣＡＰＥの収率は、約７５％であった。以上により、ＣＡＰＥの分離・精製処理工程においてスチレン系合成吸着剤の適用が有効であることが確認された。
Formula 2: Yield (%) = (number of moles of CAPE) / (number of moles of caffeic acid) × 100
(Separation and purification treatment using styrene synthetic adsorbent)
To 20 mL of distilled water, 1.5 g of caffeic acid (final concentration 0.21 M) and 6 g of chlorogenic acid esterase (final concentration of about 3.62 U / mL) were added and mixed well. To this solution, 12.2 g (final concentration 2.5 M) of phenethyl alcohol was added, and finally distilled water was added to adjust the volume to 40 mL. The reaction was allowed to proceed for 72 hours at 40 ° C. with gentle stirring. When the solution after the reaction was allowed to stand overnight, the solution was separated into an upper phenethyl alcohol layer and a lower aqueous layer. About a part of phenethyl alcohol layer and a water layer, the high performance liquid chromatography analysis was performed on the measurement conditions of Test Example 1, respectively. The retention time and ultraviolet absorption spectrum of each peak confirmed by high performance liquid chromatography were respectively compared with chlorogenic acid esterase, caffeic acid, phenethyl alcohol, and CAPE standard products. As a result, it was revealed that phenethyl alcohol, CAPE, and unreacted caffeic acid were distributed in the phenethyl alcohol layer. It was also revealed that chlorogenic acid esterase was distributed in the aqueous layer. After collecting the phenethyl alcohol layer and evaporating the solvent under reduced pressure as much as possible, Diaion HP20 (Mitsubishi Chemical Corporation) column (inner diameter 3) as a styrene-divinylbenzene synthetic adsorbent previously equilibrated with 50% ethanol. 4 cm × length 26 cm). Stepwise elution was performed with 0.5 L of 50% ethanol, 0.5 L of 60% ethanol, and 0.5 L of 70% ethanol, and named as fraction 1, fraction 2, and fraction 3, respectively. A part of each fraction was subjected to high performance liquid chromatography analysis under the measurement conditions of Test Example 1. The retention time and ultraviolet absorption spectrum of each peak confirmed by high performance liquid chromatography were respectively compared with the standard products of caffeic acid, phenethyl alcohol, and CAPE. As a result, in fraction 1, peaks of caffeic acid and phenethyl alcohol were observed. In fraction 2, only the peak of phenethyl alcohol was confirmed. In fraction 3, only the peak of CAPE was confirmed (note that data attachment is omitted). Based on the results of the above high performance liquid chromatography analysis, the solvent was distilled off under reduced pressure for fraction 3, to obtain 1.87 g of CAPE powder. In addition, the yield of CAPE was calculated | required by the said Formula 2. As a result, the yield of CAPE in this example was about 75%. From the above, it was confirmed that the application of the styrene-based synthetic adsorbent is effective in the CAPE separation / purification treatment step.
＜試験例３：クロロゲン酸エステラーゼの再利用＞
クロロゲン酸エステラーゼを繰り返し酵素反応に使用することにより、より効率的なＣＡＰＥの合成が可能かを検討した。
<Test Example 3: Reuse of chlorogenic acid esterase>
It was examined whether or not CAPE could be synthesized more efficiently by repeatedly using chlorogenic acid esterase in the enzymatic reaction.
（１回目の酵素反応）
蒸留水２０ｍＬにカフェ酸１．５ｇ（終濃度０．２１Ｍ）及びクロロゲン酸エステラーゼ６ｇ（終濃度約３．６２Ｕ／ｍＬ）を添加してよく混合した。この溶液に、フェネチルアルコール１２．２ｇ（終濃度２．５Ｍ）を添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離したところ、その溶液は、上部のフェネチルアルコール層と下部の水層に分かれた。試験例１と同様に、上記測定条件での高速液体クロマトグラフィー分析の結果、フェネチルアルコール層には、フェネチルアルコール、ＣＡＰＥ及び未反応のカフェ酸が分配されたことが明らかになった。また、水層にはクロロゲン酸エステラーゼが分配されたことが明らかになった。フェネチルアルコール層を回収し、試験例２に記載される条件でダイヤイオンＨＰ２０カラムを用いた精製を行いＣＡＰＥ粉末１．８８ｇを得た（以上、１回目の酵素利用）。
(First enzyme reaction)
To 20 mL of distilled water, 1.5 g of caffeic acid (final concentration 0.21 M) and 6 g of chlorogenic acid esterase (final concentration of about 3.62 U / mL) were added and mixed well. To this solution, 12.2 g (final concentration 2.5 M) of phenethyl alcohol was added, and finally distilled water was added to adjust the volume to 40 mL. The reaction was allowed to proceed for 72 hours at 40 ° C. with gentle stirring. When the solution after the reaction was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, the solution was separated into an upper phenethyl alcohol layer and a lower aqueous layer. As in Test Example 1, as a result of high-performance liquid chromatography analysis under the above measurement conditions, it was revealed that phenethyl alcohol, CAPE, and unreacted caffeic acid were distributed in the phenethyl alcohol layer. It was also revealed that chlorogenic acid esterase was distributed in the aqueous layer. The phenethyl alcohol layer was recovered and purified using a Diaion HP20 column under the conditions described in Test Example 2 to obtain 1.88 g of CAPE powder (first use of enzyme).
（２回目の酵素反応）
次に、上記水層を回収し、新たにカフェ酸１．５ｇを添加してよく混合した。この溶液にフェネチルアルコール１２．２ｇを添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液を上記の条件で遠心分離し、上部のフェネチルアルコール層と下部の水層に分離させた。フェネチルアルコール層を回収し、試験例２に記載される条件でダイヤイオンＨＰ２０カラムを用いた精製を行いＣＡＰＥ粉末１．８３ｇを得た（以上、２回目の酵素利用）。
(Second enzyme reaction)
Next, the aqueous layer was recovered, and 1.5 g of caffeic acid was newly added and mixed well. To this solution, 12.2 g of phenethyl alcohol was added, and finally distilled water was added to adjust the volume to 40 mL. The reaction was allowed to proceed for 72 hours at 40 ° C. with gentle stirring. The solution after the reaction was centrifuged under the above conditions, and separated into an upper phenethyl alcohol layer and a lower aqueous layer. The phenethyl alcohol layer was recovered and purified using a Diaion HP20 column under the conditions described in Test Example 2 to obtain 1.83 g of CAPE powder (the second use of the enzyme).
（３回目の酵素反応）
次に、２回目の酵素反応で得られた水層を回収し、新たにカフェ酸１．５ｇを添加してよく混合した。この溶液に、フェネチルアルコール１２．２ｇを添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液を上記の条件で遠心分離し、上部のフェネチルアルコール層と下部の水層に分離させた。フェネチルアルコール層を回収し、試験例２に記載される条件でダイヤイオンＨＰ２０カラムを用いた精製を行いＣＡＰＥ粉末１．７６ｇを得た（以上、３回目の酵素利用）。
(Third enzyme reaction)
Next, the aqueous layer obtained by the second enzymatic reaction was recovered, and 1.5 g of caffeic acid was newly added and mixed well. To this solution, 12.2 g of phenethyl alcohol was added, and finally, distilled water was added to adjust the volume to 40 mL. The reaction was allowed to proceed for 72 hours at 40 ° C. with gentle stirring. The solution after the reaction was centrifuged under the above conditions, and separated into an upper phenethyl alcohol layer and a lower aqueous layer. The phenethyl alcohol layer was recovered and purified using a Diaion HP20 column under the conditions described in Test Example 2 to obtain 1.76 g of CAPE powder (the third use of the enzyme).
（４回目の酵素反応）
次に、３回目の酵素反応で得られた水層を回収し、新たにカフェ酸１．５ｇを添加してよく混合した。この溶液に、フェネチルアルコール１２．２ｇを添加し、最後に容量が４０ｍＬになるように蒸留水を添加して調整した。穏やかに撹拌しながら、４０℃で７２時間反応させた。反応後の溶液を上記の条件で遠心分離し、上部のフェネチルアルコール層と下部の水層に分離させた。フェネチルアルコール層を回収し、試験例２に記載される条件でダイヤイオンＨＰ２０カラムを用いた精製を行いＣＡＰＥ粉末１．７１ｇを得た（以上、４回目の酵素利用）。
(4th enzyme reaction)
Next, the aqueous layer obtained by the third enzyme reaction was recovered, and 1.5 g of caffeic acid was newly added and mixed well. To this solution, 12.2 g of phenethyl alcohol was added, and finally distilled water was added to adjust the volume to 40 mL. The reaction was allowed to proceed for 72 hours at 40 ° C. with gentle stirring. The solution after the reaction was centrifuged under the above conditions, and separated into an upper phenethyl alcohol layer and a lower aqueous layer. The phenethyl alcohol layer was recovered and purified using a Diaion HP20 column under the conditions described in Test Example 2 to obtain 1.71 g of CAPE powder (the fourth use of the enzyme).
以上、酵素を再利用したときの、ＣＡＰＥの収率を上記式２により求めた。結果を表２に示す。 As described above, the yield of CAPE when the enzyme is reused was determined by the above formula 2. The results are shown in Table 2.
＜試験例４：原料としてコーヒー豆エキスを用いたＣＡＰＥの製造＞
（熱アルカリ処理法によるカフェ酸含有コーヒー豆エキスの調製）
焙煎後のアラビカ種コーヒー豆（銘柄：モカ）１０ｇを粉砕後、５０％エタノール１００ｍＬを加えて２時間撹拌して抽出した。抽出液をろ過後、溶媒を留去し、８０ｍＬの水を加えて撹拌した。水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１１．９に調製し、８０℃で３時間加熱した。アルカリ処理前後の溶液の一部について、それぞれ下記測定条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行った。
<Test Example 4: Production of CAPE using coffee bean extract as raw material>
(Preparation of coffee beans extract containing caffeic acid by hot alkali treatment method)
10 g of Arabica coffee beans (brand: mocha) after roasting were pulverized, 100 mL of 50% ethanol was added, and the mixture was extracted by stirring for 2 hours. After filtering the extract, the solvent was distilled off, and 80 mL of water was added and stirred. The pH was adjusted to 11.9 using sodium hydroxide and heated at 80 ° C. for 3 hours. A part of the solution before and after the alkali treatment was subjected to high performance liquid chromatography analysis under the following measurement conditions.
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＡＧ１２０（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、資生堂社製）
移動相：Ａ，水（０．１％トリフルオロ酢酸含有）、Ｂ，メタノール（０．１％トリフルオロ酢酸含有）
グラジエント：移動相Ａ９０％，移動相Ｂ１０％（０分）→移動相Ａ０％，移動相Ｂ１００％（２０分）→移動相Ａ０％，移動相Ｂ１００％（５分）
流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：ＵＶ３２５ｎｍ（Ｗａｔｅｒｓ ９９６フォトダイオード）
カラム温度：４０℃
高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、クロロゲン酸（東京化成工業社製）、各種カフェオイルキナ酸類（ＯＤＳカラム及びＡＣＲシリカゲルを用いて公知の方法により精製した精製品：例えば特開２００６−２１３６３６号公報等参照）、及びカフェ酸の標準品とそれぞれ対比させた。その結果、アルカリ処理前に認められたクロロゲン酸及び各種カフェオイルキナ酸類のピークが、アルカリ処理後には殆ど認められなかった。また、アルカリ処理によって、処理前には顕著でなかったカフェ酸のピークが増大した（図６，７）。
<High-performance liquid chromatography analysis conditions>
Column: CAPCELL PAK C18 AG120 (inner diameter 4.6 mm × length 250 mm, manufactured by Shiseido Co., Ltd.)
Mobile phase: A, water (containing 0.1% trifluoroacetic acid), B, methanol (containing 0.1% trifluoroacetic acid)
Gradient: mobile phase A 90%, mobile phase B 10% (0 minutes) → mobile phase A 0%, mobile phase B 100% (20 minutes) → mobile phase A 0%, mobile phase B 100% (5 minutes)
Flow rate: 0.7 mL / min
Detection wavelength: UV325nm (Waters 996 photodiode)
Column temperature: 40 ° C
The retention time and ultraviolet absorption spectrum of each peak confirmed by high-performance liquid chromatography were measured using chlorogenic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and various caffeoylquinic acids (ODS column and ACR silica gel purified by a known method). Product: for example, see JP-A-2006-213636) and a standard product of caffeic acid. As a result, the peaks of chlorogenic acid and various caffeoylquinic acids observed before the alkali treatment were hardly observed after the alkali treatment. In addition, the alkali treatment increased caffeic acid peaks that were not significant before the treatment (FIGS. 6 and 7).
（ＣＡＰＥの合成）
このアルカリ処理後のコーヒー豆エキスは、塩酸を加えてｐＨ５．７に調整した。このうち５ｍＬを測り取り、フェネチルアルコールを２．１ｇ及び試験例１に記載されるクロロゲン酸エステラーゼ１．１ｇ（終濃度約３Ｕ／ｍＬ）を添加し、穏やかに撹拌しながら、４０℃で１１６時間反応させた。反応液の一部を試験例１に示す条件で高速液体クロマトグラフィー分析を行い、ＣＡＰＥの生成を確認した。高速液体クロマトグラフィーで確認できた各ピークの保持時間及び紫外線吸収スペクトルを、カフェ酸及びＣＡＰＥの標準品（シグマ社製）とそれぞれ対比させることにより、カフェ酸及びＣＡＰＥのピークを同定し、それぞれのピーク面積を求めた。式１により、反応率は、７４．４％であった。アルカリ処理前のコーヒー豆エキス、アルカリ処理後のコーヒー豆エキス、及び酵素反応後のコーヒー豆エキスの高速液体クロマトグラムを図６、図７及び図８にそれぞれ示す。以上により、コーヒー豆エキスからアルカリ処理及び所定量のクロロゲン酸エステラーゼを用いた酵素反応を経て効率的にＣＡＰＥを製造することが可能であることが示された。
(Synthesis of CAPE)
The coffee bean extract after the alkali treatment was adjusted to pH 5.7 by adding hydrochloric acid. 5 mL of this was measured, 2.1 g of phenethyl alcohol and 1.1 g of chlorogenic acid esterase described in Test Example 1 (final concentration of about 3 U / mL) were added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 116 hours with gentle stirring. Reacted. A part of the reaction solution was subjected to high performance liquid chromatography analysis under the conditions shown in Test Example 1 to confirm the formation of CAPE. By comparing the retention time and ultraviolet absorption spectrum of each peak confirmed by high performance liquid chromatography with the standard product of caffeic acid and CAPE (manufactured by Sigma), respectively, the peaks of caffeic acid and CAPE are identified. The peak area was determined. According to Formula 1, the reaction rate was 74.4%. The high-speed liquid chromatograms of the coffee bean extract before the alkali treatment, the coffee bean extract after the alkali treatment, and the coffee bean extract after the enzyme reaction are shown in FIG. 6, FIG. 7, and FIG. From the above, it was shown that it is possible to efficiently produce CAPE from coffee bean extract through an alkali treatment and an enzymatic reaction using a predetermined amount of chlorogenic acid esterase.
次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、それらの効果とともに以下に追記する。
（ａ）前記カフェ酸は、原料として天然素材由来のエキスが用いられることを特徴とするカフェ酸フェネチルエステルの製造方法。したがって、カフェ酸フェネチルエステルを生体に適用する場合は、その安全性を高めることができる。また、生体に不要な成分を除去する必要がなく製造効率をより向上させることができる。
Next, technical ideas that can be grasped from the above-described embodiment and other examples will be described below together with their effects.
(A) The said caffeic acid uses the extract derived from a natural material as a raw material, The manufacturing method of the caffeic acid phenethyl ester characterized by the above-mentioned. Therefore, when caffeic acid phenethyl ester is applied to a living body, its safety can be enhanced. Moreover, it is not necessary to remove components unnecessary for the living body, and the production efficiency can be further improved.
（ｂ）アルカリ処理後のコーヒー豆エキスにフェネチルアルコール及びクロロゲン酸エステラーゼが配合されることにより得られたコーヒー豆エキス。したがって、安価にカフェ酸フェネチルエステルを製造することができる。 (B) A coffee bean extract obtained by blending phenethyl alcohol and chlorogenic acid esterase into a coffee bean extract after alkali treatment. Therefore, caffeic acid phenethyl ester can be produced at low cost.
（ｃ）前記カフェ酸フェネチルエステルの製造方法において、酵素反応時にシリカ系樹脂、芳香族系合成吸着剤、及び脂肪族エステル系合成吸着剤から選ばれる少なくとも一種のクロマトグラフィー担体に接触させることにより、生成したカフェ酸フェネチルエステルを吸着させると同時に、更に酵素反応を継続する工程、次に溶出用溶媒を用いてカフェ酸フェネチルエステルを溶出させる処理を行う工程を備えることを特徴とする。生成したカフェ酸フェネチルエステルがクロマトグラフィー担体に吸着されるため、化学平衡によりクロマトグラフィー担体に吸着していない酵素及び未反応基質より新たなカフェ酸フェネチルエステルが連続的に合成される。したがって、カフェ酸フェネチルエステルの反応液からの分離・精製が容易になるのみならず、カフェ酸フェネチルエステルの製造効率がより一層向上する。 (C) In the above method for producing caffeic acid phenethyl ester, by contacting with at least one chromatography carrier selected from a silica-based resin, an aromatic synthetic adsorbent, and an aliphatic ester synthetic adsorbent during an enzyme reaction, It comprises a step of adsorbing the produced caffeic acid phenethyl ester and at the same time further continuing the enzyme reaction, and a step of performing a treatment of eluting the caffeic acid phenethyl ester using an elution solvent. Since the produced caffeic acid phenethyl ester is adsorbed on the chromatography carrier, new caffeic acid phenethyl ester is continuously synthesized from the enzyme and the unreacted substrate which are not adsorbed on the chromatography carrier due to chemical equilibrium. Therefore, not only the separation and purification of caffeic acid phenethyl ester from the reaction solution is facilitated, but also the production efficiency of caffeic acid phenethyl ester is further improved.
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