JP2010139429A - Method for detecting kidney disease - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、腎疾患、特に間質性腎疾患の検出方法を適用することに関するものである。さらに具体的には、尿中の特定のタンパク質（アイソザイム）を検出することにより、腎疾患、特に間質性腎疾患の検出方法を適用することに関するものである。 The present invention relates to applying a method for detecting kidney disease, particularly interstitial kidney disease. More specifically, the present invention relates to applying a method for detecting renal diseases, particularly interstitial renal diseases, by detecting specific proteins (isozymes) in urine.
腎臓は、糸球体とそれに連なる尿細管からなるネフロンが、多数集合することにより構成されている。この構造的な特徴を利用して、腎臓ではまず、血液中の老廃物が糸球体で濾過され、老廃物を含む原尿はその後、尿細管を通過しながら尿細管再吸収と尿細管分泌を受ける。その後、集合管に集まり、腎盂を経由して、最終的に膀胱へと到達する。腎臓においては、体内の血液や体液の水分量や電解質の調節、血圧の調節、老廃物の除去の他にも、造血ホルモン（エリスロポエチン）や、活性型ビタミンDを合成・分泌する作用を有する。このように、腎臓は体内の恒常性を維持するために重要な役割を果たしているため、いったんその機能が低下すると、致死的な状況を招きかねない。 The kidney is composed of many nephrons composed of glomeruli and tubules connected to them. Using this structural feature, the waste in the blood is first filtered through the glomeruli in the kidney, and the raw urine containing the waste is then passed through the tubules for reabsorption and tubule secretion. receive. After that, it gathers in the collecting duct and finally reaches the bladder via the renal pelvis. In the kidney, in addition to regulating the amount of water and electrolytes in the body and fluids, regulating blood pressure, and removing waste products, it has the action of synthesizing and secreting hematopoietic hormone (erythropoietin) and active vitamin D. Thus, since the kidney plays an important role in maintaining homeostasis in the body, once its function is reduced, it can lead to a lethal situation.
腎臓の主要な機能は、血液を含む体液の量と質を一定に保つことである。腎臓がこのような機能を正常に果たしているか否かは、機能しているネフロンの割合を調べることによって明らかにすることができる。臨床検査の分野においては、糸球体から濾過されて尿中に排泄される老廃物の血中濃度、例えば、血中尿素窒素（BUN）濃度、血中クレアチニン（Cre）濃度を測定することや、尿中のタンパク質濃度を測定することが一般的に行われている。 The main function of the kidney is to keep the quantity and quality of body fluids, including blood, constant. Whether or not the kidney performs such a function normally can be determined by examining the proportion of nephrons that function. In the field of clinical testing, measuring the blood concentration of waste products filtered from the glomeruli and excreted in the urine, such as blood urea nitrogen (BUN) concentration, blood creatinine (Cre) concentration, It is a common practice to measure protein concentration in urine.
しかしながら、血中BUN濃度や血中Cre濃度の検査結果は、腎不全の診断マーカーとして用いられているものの、実際には単に糸球体での濾過障害マーカーと考えられており、腎臓疾患を検出するための一次的な検査手段としては、十分なものではない。すなわち、血中BUN濃度の測定値は、タンパク質の摂取量の相違や脱水状態（水分摂取量の変化、下痢など）によっても大きく変化しやすく、腎機能の状況を正確には反映しにくいという欠点を有する。また、血中Cre濃度は、尿細管でのクレアチニン再吸収もあまり受けないため比較的安定した数値を示すため、糸球体濾過値の指標として有用であるものの、血中クレアチニン濃度は、機能しているネフロンの数が1/2〜1/3にまで減少しないと異常値を示さないという欠点を有している。そのため、外見上は腎疾患の症状が実際に見られるにもかかわらず、血液検査では正常値を示す場合がある。このことはすなわち、血液検査によって血中クレアチニン濃度の上昇が見られ、腎臓の疾患が推定された時には、既に腎臓の障害が進行した状態である場合があることを意味している。さらに、クレアチニン濃度は腎疾患がなくても筋肉量の大小によって変化し、筋肉に傷害があると血液中や尿中で高値を示すという点も、腎疾患の判定を行う際には欠点となる。 However, although the test results of blood BUN concentration and blood Cre concentration are used as a diagnostic marker for renal failure, it is actually considered as a marker for glomerular filtration failure, and it detects kidney disease. As a primary inspection means for this, it is not sufficient. In other words, the measurement value of blood BUN concentration is likely to change greatly due to differences in protein intake and dehydration (changes in water intake, diarrhea, etc.), and it is difficult to accurately reflect the status of renal function. Have In addition, the blood Cre creatinine concentration is useful as an index of glomerular filtration value because it does not receive creatinine reabsorption in the tubule so much, and it is useful as an index of glomerular filtration value. If the number of nephrons is not reduced to 1/2 to 1/3, an abnormal value is not exhibited. Therefore, the blood test may show a normal value even though the symptoms of kidney disease are actually seen. This means that when a blood test shows an increase in blood creatinine concentration and a kidney disease is estimated, the kidney disorder may already have progressed. Furthermore, the creatinine concentration varies depending on the amount of muscle mass even without kidney disease, and the high value in blood and urine when the muscle is injured is also a drawback when determining kidney disease. .
また、腎臓機能の低下を伴う腎臓の疾患は、傷害される部位によって糸球体腎炎や間質性腎炎などに分類されており、血液検査の結果からは、糸球体腎炎しか検査の対象にならないという欠点も存在していた。そして、検尿により多量の尿タンパク質が検出された場合は、糸球体を濾過した血漿タンパク質が尿細管において再吸収されないからと理解されているが、濾過量が急増して再吸収が間に合わない場合もあり、濾過障害と再吸収障害との判別は不可能である。また、ブタなどは膀胱炎でも尿中のタンパク質は増加する。 In addition, kidney diseases with decreased kidney function are classified as glomerulonephritis or interstitial nephritis depending on the injured site, and only glomerulonephritis can be examined from the results of blood tests. There were also drawbacks. And if a large amount of urine protein is detected by urinalysis, it is understood that the plasma protein filtered through the glomeruli is not reabsorbed in the tubules. Yes, it is impossible to distinguish between filtration failure and reabsorption failure. In pigs and the like, urinary protein increases even in cystitis.
さらに、ネコやイヌでは、これらの検査方法では、腎臓疾患を診断することができない症例が多く見られることが、経験的に知られている。
このような血液検査や尿検査の欠点を補完する目的で、例えば、超音波検査等の画像診断や、腎生検などの組織学的検査が行われる。しかしながら、これらの疾患は、外見的な症状が出ていたり、血液検査や尿検査の結果腎臓の疾患が疑われる場合に行われる二次的な検査に過ぎず、上述した血液検査や尿検査などの一次的な検査の欠点を補うことはできない。
Furthermore, it is empirically known that in cats and dogs, there are many cases in which kidney diseases cannot be diagnosed by these test methods.
For the purpose of complementing the drawbacks of such blood tests and urinalysis, for example, image diagnosis such as ultrasonic examination and histological examination such as renal biopsy are performed. However, these diseases are only secondary tests performed when there are apparent symptoms or a kidney test is suspected as a result of blood tests or urinalysis. The shortcomings of primary inspection cannot be compensated.
炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase）-VI（CA-VI）アイソザイムは、唾液腺で合成され、唾液中に分泌される炭酸脱水酵素アイソザイムの一つであり、分子量380000の大型の分子である。このCA-VIアイソザイムは、唾液中の重炭酸塩濃度を維持し、そして上部消化管の酸性度を低下させて酸による損傷を防止する機能を有する。哺乳動物において、CA-VIアイソザイムの組織分布を調べたところ、唾液腺、唾液、肝臓、膵臓、乳腺、乳汁、胆嚢、胆汁、腎臓など、幅広い組織に局在し、体液中では唾液、乳汁、胆汁に存在していることが明らかになった（非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3）。CA-VIアイソザイムタンパク質は血漿タンパク質ではなく、高分子のタンパク質でもあるから、例え唾液腺が傷害を受けても腎臓の糸球体から濾過されて尿中に出ることは考えられない。
本発明は、初期の腎臓疾患を検出するとともに腎臓疾患の進行度を同定するための、哺乳動物の腎臓疾患の新規診断マーカーおよびそれを用いた方法、並びにそれを用いた検出キットを開発することを課題とする。本発明はさらに、哺乳動物の腎臓疾患に関して、腎臓疾患の類症鑑別を迅速かつ簡便に行うための、新規診断マーカーおよびそれを用いた方法、並びにそれを用いた検出キットを開発することを課題とする。 The present invention develops a novel diagnostic marker for mammalian kidney disease, a method using the same, and a detection kit using the same for detecting early kidney disease and identifying the degree of progression of kidney disease Is an issue. It is another object of the present invention to develop a novel diagnostic marker, a method using the same, and a detection kit using the same for rapidly and easily distinguishing between renal diseases related to kidney diseases in mammals. And
本発明者は、一態様において、尿中の炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase）-VI（CA-VI）アイソザイムタンパク質の存在を検出することを含む、間質性腎疾患の検出方法を開発することにより、上述した課題を解決することができることを明らかにした。 In one aspect, the present inventor developed a method for detecting interstitial kidney disease comprising detecting the presence of carbonic anhydrase-VI (CA-VI) isozyme protein in urine. It has been clarified that the above-mentioned problems can be solved.
本発明者は、別の態様において、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質の存在、並びに血液中のBUNおよび／またはCreの存在を検出することによる、間質性腎疾患の進行度の同定方法を開発することにより、上述した課題を解決することができることを明らかにした。 In another embodiment, the present inventor provides a method for identifying the degree of progression of interstitial kidney disease by detecting the presence of CA-VI isozyme protein in urine and the presence of BUN and / or Cre in blood. It has been clarified that development can solve the above-mentioned problems.
本発明者は、さらに別の態様において、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質の濃度、並びに血液中のBUN濃度および／またはCre濃度を比較することによる、間質性腎疾患と糸球体腎疾患の判別方法を開発することにより、上述した課題を解決することができることを明らかにした。 In yet another embodiment, the inventor further compared interstitial kidney disease and glomerular kidney disease by comparing the concentration of CA-VI isozyme protein in urine and the concentration of BUN and / or Cre in blood. It was clarified that the above-mentioned problem can be solved by developing a discrimination method.
本発明者は、さらに別の態様において、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質が陽性であり、血液中のBUNおよび／またはCreが陰性である場合に、間質性腎疾患であると判定する、請求項6に記載の判定方法を開発することにより、上述した課題を解決することができることを明らかにした。 In yet another embodiment, the inventor determines that the urinary CA-VI isozyme protein is positive, and BUN and / or Cre in the blood is negative, it is an interstitial kidney disease. It has been clarified that the problem described above can be solved by developing the determination method according to claim 6.
本発明者は、さらに別の態様において、抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体を含む、間質性腎疾患の検出キットを開発することにより、上述した課題を解決することができることを明らかにした。 In yet another embodiment, the present inventor has clarified that the above-described problem can be solved by developing a detection kit for interstitial kidney disease including an anti-CA-VI isozyme protein antibody.
本発明により、初期の腎臓疾患を検出するとともに腎臓疾患の進行度を同定するための、哺乳動物の腎臓疾患の新規診断マーカーおよびそれを用いた方法、並びにそれを用いた検出キットを開発することができるとともに、哺乳動物の腎臓疾患に関して、腎臓疾患の類症鑑別を迅速かつ簡便に行うための、新規診断マーカーおよびそれを用いた方法、並びにそれを用いた検出キットを開発することができた。 In accordance with the present invention, a novel diagnostic marker for mammalian kidney disease, a method using the same, and a detection kit using the same for detecting early kidney disease and identifying the degree of progression of kidney disease are disclosed. As a result, it was possible to develop a novel diagnostic marker and method using the same, and a detection kit using the same, in order to quickly and easily differentiate asthma from kidney diseases regarding mammalian kidney disease. .
本発明者は、鋭意検討を行った結果、尿中の炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase）-VI（CA-VI）アイソザイムタンパク質の存在を検出することにより、初期の間質性腎疾患を検出すること、そして間質性腎疾患の進行度を同定することができることを明らかにした。 As a result of intensive studies, the present inventor detects early interstitial renal disease by detecting the presence of carbonic anhydrase-VI (CA-VI) isozyme protein in urine. It was revealed that the degree of progression of interstitial kidney disease can be identified.
炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase）-VI（CA-VI）アイソザイムは、唾液腺で合成され、唾液中に分泌される炭酸脱水酵素アイソザイムの一つであり、分子量380000の大型の分子である。哺乳動物において、CA-VIアイソザイムは、唾液腺、唾液、肝臓、膵臓、乳腺、乳汁、胆嚢、胆汁、腎臓など、幅広い組織に局在し、体液中では唾液、乳汁、胆汁に存在していることが明らかになった。 Carbonic anhydrase-VI (CA-VI) isozyme is one of the carbonic anhydrase isozymes synthesized in the salivary glands and secreted into saliva, and is a large molecule with a molecular weight of 380,000. In mammals, CA-VI isozymes are localized in a wide range of tissues, including salivary glands, saliva, liver, pancreas, mammary gland, milk, gallbladder, bile, and kidney, and are present in saliva, milk, and bile in body fluids. Became clear.
この知見に基づいて、CA-VIアイソザイムタンパク質の腎臓における組織分布をさらに詳細に検討したところ、腎臓の尿細管の遠位尿細管と集合管に局在していることが明らかになった。そこで、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質を定量したところ、尿中においても、CA-VIアイソザイムタンパク質が存在することがわかった。そして、臨床的に腎疾患の症状が実際に見られる動物個体の尿中に、臨床的に腎疾患の症状が実際に見られない個体の尿中よりも有意に高いCA-VIアイソザイムタンパク質が存在していることが明らかになった。CA-VIアイソザイムタンパク質は血漿タンパク質ではないし、高分子のタンパク質でもあるから例え唾液腺が傷害を受けても腎臓の糸球体から濾過されて尿中に出ることは考えられない。 Based on this finding, the tissue distribution of the CA-VI isozyme protein in the kidney was examined in more detail and was found to be localized in the distal tubule and collecting duct of the renal tubule. Therefore, quantification of urinary CA-VI isozyme protein revealed that CA-VI isozyme protein was also present in urine. In addition, CA-VI isozyme protein is significantly higher in the urine of animals that actually have clinical symptoms of renal disease than in the urine of individuals that do not actually have clinical symptoms of renal disease. It became clear that Since CA-VI isozyme protein is not a plasma protein, it is also a high molecular weight protein, so even if the salivary gland is damaged, it is unlikely that it will be filtered out from the glomeruli of the kidney and released into the urine.
この結果に基づいて、本発明において、尿中の炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase）-VI（CA-VI）アイソザイムタンパク質の存在を検出し定量することを含む、間質性腎疾患の検出方法を提供する。ここで、間質性腎疾患という場合、ネフロンや血管の間を取り巻いて埋めている構造である間質に炎症を生じた状態のことをいい、例えば、間質性の腎炎、腎不全、Dent病などの尿細管病変を伴う疾患を例示することができる。 Based on this result, the present invention provides a method for detecting interstitial kidney disease, which comprises detecting and quantifying the presence of carbonic anhydrase-VI (CA-VI) isozyme protein in urine. To do. Here, interstitial kidney disease refers to a condition in which inflammation has occurred in the interstitium, which is a structure that surrounds and fills between nephrons and blood vessels, such as interstitial nephritis, renal failure, Dent A disease associated with a tubular lesion such as a disease can be exemplified.
尿サンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質の存在を検出するためには、抗原-抗体反応を使用して抗原の検出・定量を行うために使用される当該技術分野において既知の方法であればいずれの方法であっても使用することができ、例えばウェスタンブロット法、イムノクロマト法、競合的反応型ELISA法やサンドイッチ型ELISA法などのELISA法、プロテインチップ法、マンシーニー法などを使用することができる。 To detect the presence of CA-VI isozyme protein in a urine sample, any method known in the art used to detect and quantify antigens using antigen-antibody reactions can be used. For example, Western blot method, immunochromatography method, competitive reaction type ELISA method or sandwich type ELISA method, protein chip method, Mansini method, etc. can be used.
本発明において使用することができる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体はともに、生体組織（例えば唾液腺）からCA-VIアイソザイムタンパク質を精製し、この精製CA-VIアイソザイムタンパク質を免疫原として使用して、当該技術分野においてよく知られている方法に従って、免疫動物（たとえばポリクローナル抗体の場合にはヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラットなど、また、モノクローナル抗体の場合にはマウス、ラットなど）に投与し、体内において抗体を産生させる。ポリクローナル抗体の場合には、免疫動物の血清、または血清から精製した免疫グロブリンを使用できる。一方、モノクローナル抗体の場合には、CA-VIアイソザイムタンパク質で免疫したマウスやラットなどの脾臓由来のプラズマ細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を作製し、そのなかからCA-VIアイソザイムタンパク質と反応する抗体を生産するクローンを選択して得ることができる。通常は、このようにして調製したハイブリドーマをマウス腹腔に注射し、腹水中に蓄積されたモノクローナル抗体を精製することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。またハイブリドーマ細胞を無血清培地で培養し、その培養上清から精製することも可能である。またファージ等を利用して抗体を作製する方法も利用することができる。 The antibody that can be used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Both monoclonal and polyclonal antibodies purify CA-VI isozyme protein from biological tissue (eg, salivary glands) and use this purified CA-VI isozyme protein as an immunogen according to methods well known in the art. The antibody is administered to an immunized animal (eg, sheep, goat, rabbit, mouse, rat, etc. in the case of a polyclonal antibody, and mouse, rat, etc. in the case of a monoclonal antibody) to produce the antibody in the body. In the case of a polyclonal antibody, serum from an immunized animal or immunoglobulin purified from the serum can be used. On the other hand, in the case of a monoclonal antibody, hybridoma cells are prepared by fusing spleen-derived plasma cells such as mice and rats immunized with CA-VI isozyme protein with myeloma cells, and then reacting with CA-VI isozyme protein. A clone producing the antibody to be selected can be selected and obtained. Usually, a monoclonal antibody can be obtained by injecting the hybridoma prepared in this way into a mouse abdominal cavity and purifying the monoclonal antibody accumulated in the ascites. In addition, hybridoma cells can be cultured in a serum-free medium and purified from the culture supernatant. In addition, a method for producing an antibody using a phage or the like can also be used.
CA-VIアイソザイムタンパク質の種間のアミノ酸配列同一性が最低でも68％あることから、イヌ、ネコ、ブタ、ウシまたはヒト等の哺乳動物のいずれに由来するCA-VIアイソザイムタンパク質を使用して抗体を作製した場合であっても、それぞれの抗体がイヌ、ネコ、ブタ、ウシまたはヒト等の哺乳動物のいずれに由来するCA-VIアイソザイムタンパク質にも交差反応することができる。従って、上述した本発明の方法は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシまたはヒト等の哺乳動物のいずれに対しても適用することができる。 Since CA-VI isozyme protein has at least 68% amino acid sequence identity between species, antibodies using CA-VI isozyme protein derived from any mammal such as dog, cat, pig, cow or human Each antibody can also cross-react with CA-VI isozyme protein derived from any mammal such as dog, cat, pig, cow or human. Therefore, the above-described method of the present invention can be applied to any mammal such as dog, cat, pig, cow or human.
本発明で使用する抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体を検出する方法としては、当該技術分野において既知の抗体検出方法であればいずれの方法であっても使用することができる。例えば、抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体をペルオキシダーゼ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ；HRP）などの検出可能な分子で標識しておき発色基剤を発色させることにより検出する方法、抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体をビオチン標識しておき、ビオチンをアビジンを使用した検出系により検出する方法、あるいは抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体を認識する標識二次抗体（例えば抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体がマウス由来のIgG抗体であれば抗マウスIgG抗体）を使用し、この二次抗体を上述したHRP系またはビオチン-アビジン系等を用いて検出する方法、等のいずれの方法であっても、本発明において使用することができる。 As a method for detecting an anti-CA-VI isozyme protein antibody used in the present invention, any method can be used as long as it is an antibody detection method known in the art. For example, a method of detecting an anti-CA-VI isozyme protein antibody by labeling with a detectable molecule such as peroxidase (eg, horseradish peroxidase; HRP) and developing a chromogenic base, Either biotin-labeled and biotin detected by a detection system using avidin, or labeled secondary antibody that recognizes anti-CA-VI isozyme protein antibody (eg anti-CA-VI isozyme protein antibody is a mouse-derived IgG antibody) Any method such as an anti-mouse IgG antibody (if present) and a method for detecting this secondary antibody using the HRP system or the biotin-avidin system described above can be used in the present invention. it can.
定量を行う場合には、例えば競合的反応型ELISA法、ウェスタンブロット法を使用して行うことができる。競合的ELISA法により定量する場合、例えばCA-VIアイソザイムタンパク質を固定化した測定プレートに、調べたいサンプルと抗CA-VIアイソザイムタンパク質一次抗体を添加して、固相上に固定化されたCA-VIアイソザイムタンパク質とサンプル中に含まれるCA-VIアイソザイムタンパク質との間で、抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体に対して競合的に反応させることにより行う。測定プレートを洗浄したのちに、上述したいずれかの方法で標識した、抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体に対する二次抗体を反応させる。測定プレートを洗浄したのち、発色試薬を添加して、酵素反応によって発色した反応液の吸光度を測定し、サンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質を算出する。抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体は固定化されたCA-VIアイソザイムタンパク質またはサンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質と競合的に反応するので、サンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質が多いほど固定化されたCA-VIアイソザイムタンパク質と反応してプレート内に残る抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体の量は減少し、同時に標識した抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体に対する二次抗体も減少する。つまり、サンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質濃度が高いほど、発色が少ないことになる。 When quantification is performed, for example, competitive reaction type ELISA method or Western blot method can be used. When quantifying by competitive ELISA, for example, the sample to be examined and the primary antibody of the anti-CA-VI isozyme protein are added to a measurement plate on which the CA-VI isozyme protein is immobilized, and the CA- immobilized on the solid phase. It is carried out by reacting competitively with the anti-CA-VI isozyme protein antibody between the VI isozyme protein and the CA-VI isozyme protein contained in the sample. After washing the measurement plate, a secondary antibody against the anti-CA-VI isozyme protein antibody labeled by any of the methods described above is reacted. After washing the measurement plate, a coloring reagent is added, the absorbance of the reaction solution colored by the enzyme reaction is measured, and the CA-VI isozyme protein in the sample is calculated. Anti-CA-VI isozyme antibody reacts competitively with immobilized CA-VI isozyme protein or CA-VI isozyme protein in the sample, so the more CA-VI isozyme protein in the sample, the more immobilized CA The amount of anti-CA-VI isozyme protein antibody that reacts with the -VI isozyme protein and remains in the plate is reduced, while the secondary antibody to the labeled anti-CA-VI isozyme protein antibody is also reduced. In other words, the higher the CA-VI isozyme protein concentration in the sample, the less color development.
また、ウェスタンブロット法を用いて定量する場合、常法にしたがってウェスタンブロットを行ったメンブレンを、イメージアナライザーなどで解析することにより、定量することができる。イムノドット法も同様である。 Moreover, when quantifying using a Western blot method, it can quantify by analyzing the membrane which performed the Western blot according to the conventional method with an image analyzer. The same applies to the immunodot method.
イヌおよびネコにおいて、外見上腎疾患を有さない正常な個体の尿中に含まれるCA-VIアイソザイムタンパク質を測定したところ、イヌの場合には100 ng/ml以下のCA-VIアイソザイムタンパク質が尿中に含まれる場合を正常の範囲であると考えることができることが推定された。従って、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質を測定した場合、100 ng/ml以下のCA-VIアイソザイムタンパク質、好ましくは80 ng/ml以下のCA-VIアイソザイムタンパク質、さらに好ましくは70 ng/ml以下のCA-VIアイソザイムタンパク質、さらに好ましくは60 ng/ml以下のCA-VIアイソザイムタンパク質、最も好ましくは50 ng/ml以下のCA-VIアイソザイムタンパク質、が尿中に含まれる場合に、正常であると判断される。一方、ネコの場合には、70 ng/ml以下のCA-VIアイソザイムタンパク質が尿中に含まれる場合を正常の範囲であると考えることができることが推定された。従って、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質を測定した場合、70 ng/ml以下のCA-VIアイソザイムタンパク質、好ましくは60 ng/ml以下のCA-VIアイソザイムタンパク質、最も好ましくは50 ng/ml以下のCA-VIアイソザイムタンパク質、が尿中に含まれる場合に、正常であると判断される。 In dogs and cats, CA-VI isozyme protein contained in the urine of normal individuals who apparently do not have renal disease was measured. In dogs, CA-VI isozyme protein of 100 ng / ml or less was detected in urine. It was estimated that the case included in the range can be considered as a normal range. Therefore, when urinary CA-VI isozyme protein is measured, it is 100 ng / ml or less CA-VI isozyme protein, preferably 80 ng / ml or less CA-VI isozyme protein, more preferably 70 ng / ml or less. CA-VI isozyme protein, more preferably 60 ng / ml or less CA-VI isozyme protein, most preferably 50 ng / ml or less CA-VI isozyme protein, determined to be normal when contained in urine Is done. On the other hand, in the case of cats, it was estimated that the normal range can be considered when 70-ng / ml or less CA-VI isozyme protein is contained in urine. Therefore, when measuring urinary CA-VI isozyme protein, it is less than 70 ng / ml CA-VI isozyme protein, preferably less than 60 ng / ml CA-VI isozyme protein, most preferably less than 50 ng / ml. When CA-VI isozyme protein is contained in urine, it is determined to be normal.
また、イヌおよびネコにおいて、外見上腎疾患を有さない正常な個体の尿中に含まれるCA-IIIアイソザイムタンパク質を測定したところ、CA-VIアイソザイムタンパク質の場合と同様に、100 ng/ml以下のCA-IIIアイソザイムタンパク質が尿中に含まれる場合を正常の範囲であると考えることができることが推定された。従って、尿中のCA-IIIアイソザイムタンパク質を測定した場合、100 ng/ml以下のCA-IIIアイソザイムタンパク質、好ましくは80 ng/ml以下のCA-IIIアイソザイムタンパク質、さらに好ましくは70 ng/ml以下のCA-IIIアイソザイムタンパク質、さらに好ましくは60 ng/ml以下のCA-IIIアイソザイムタンパク質、最も好ましくは50 ng/ml以下のCA-VIアイソザイムタンパク質、が尿中に含まれる場合に、正常であると判断される。 In dogs and cats, the CA-III isozyme protein contained in the urine of normal individuals who apparently do not have renal disease was measured to be 100 ng / ml or less, as in the case of CA-VI isozyme protein. It was estimated that the normal range can be considered when the CA-III isozyme protein is contained in urine. Therefore, when CA-III isozyme protein in urine is measured, CA-III isozyme protein of 100 ng / ml or less, preferably 80 ng / ml or less of CA-III isozyme protein, more preferably 70 ng / ml or less. CA-III isozyme protein, more preferably 60 ng / ml or less CA-III isozyme protein, most preferably 50 ng / ml or less CA-VI isozyme protein, determined to be normal when contained in urine Is done.
さらに、尿中に含まれるCA-VIアイソザイムタンパク質濃度が高い場合に、尿中のCA-IIIアイソザイムタンパク質濃度も比較的高い濃度で存在する、という正の相関性もまた示された。 Furthermore, a positive correlation was also shown that when the concentration of CA-VI isozyme protein contained in urine was high, the concentration of CA-III isozyme protein in urine was also present at a relatively high concentration.
本発明は別の態様において、上述した尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質の存在についての特徴を調べるとともに、血液中のBUNおよび／またはCreの存在を検出することにより、間質性腎疾患の進行度を同定する方法も提供する。前述したとおり、血液中のBUNおよび／またはCreの存在は、腎臓中の機能しているネフロンの数が1/2〜1/3にまで減少しないと異常値を示さないという特徴を有するため、腎疾患の中期〜後期の指標となる腎疾患マーカーである。一方、本発明のCA-VIアイソザイムタンパク質は、腎疾患の比較的初期に尿中に出現することを特徴としている。従って、尿サンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質は検出されるが血液中のBUNおよび／またはCreは検出されない場合を初期〜中期の腎疾患と同定することができ、そして尿サンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質も血液中のBUNおよび／またはCreも検出される場合を中期〜後期の腎疾患と同定することができる。 In another embodiment, the present invention examines the characteristics of the presence of the CA-VI isozyme protein in urine as described above, and detects the presence of BUN and / or Cre in the blood, thereby promoting the progression of interstitial renal disease. A method for identifying degrees is also provided. As mentioned above, the presence of BUN and / or Cre in the blood is characterized by the fact that the number of functioning nephrons in the kidney does not show abnormal values unless it is reduced to 1/2 to 1/3. It is a renal disease marker that serves as an indicator of the middle to late stages of renal disease. On the other hand, the CA-VI isozyme protein of the present invention is characterized by appearing in urine relatively early in renal diseases. Therefore, it is possible to identify an early to intermediate renal disease when CA-VI isozyme protein in a urine sample is detected but BUN and / or Cre in the blood is not detected, and CA-VI in the urine sample The case where both isozyme protein and BUN and / or Cre in the blood are detected can be identified as intermediate to late renal disease.
血液中のBUNおよび／またはCreの検出、定量については、既に臨床検査の分野において確立されている方法を使用することができる。
本発明はさらに別の態様において、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質の濃度、並びに血液中のBUN濃度および／またはCre濃度を比較することによる、間質性腎疾患と糸球体腎疾患とを判別する方法も提供する。血液中のBUNおよび／またはCreは、糸球体腎炎の場合に濃度が上昇する傾向があることが知られている。それに対して、本発明により、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質は、間質性腎炎の場合に濃度が上昇する傾向があることがわかった。これらの結果に基づいて、尿サンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質濃度の上昇が検出されるが血液中のBUN濃度および／またはCre濃度は上昇しない場合を間質性腎疾患と同定することができ、そして尿サンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質濃度の上昇は検出されないが血液中のBUN濃度および／またはCre濃度の上昇が検出される場合を糸球体腎疾患と同定することができる。
For the detection and quantification of BUN and / or Cre in blood, a method already established in the field of clinical examination can be used.
In yet another embodiment, the present invention discriminates interstitial kidney disease from glomerular kidney disease by comparing the concentration of CA-VI isozyme protein in urine and the concentration of BUN and / or Cre in blood. It also provides a way to do this. It is known that BUN and / or Cre in blood tend to increase in the case of glomerulonephritis. In contrast, according to the present invention, it was found that the concentration of CA-VI isozyme protein in urine tends to increase in the case of interstitial nephritis. Based on these results, it is possible to identify interstitial kidney disease when an increase in CA-VI isozyme protein concentration in urine samples is detected but BUN and / or Cre concentrations in blood are not increased. In addition, when an increase in the CA-VI isozyme protein concentration in the urine sample is not detected, but an increase in the BUN concentration and / or Cre concentration in the blood is detected, it can be identified as glomerular kidney disease.
血液中のBUNおよび／またはCreの検出、定量については、既に臨床検査の分野において確立されている方法を使用することができる。
本発明はさらに別の態様において、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質の濃度ならびに血液中のBUN濃度および／またはCre濃度を比較することによる、間質性腎疾患と糸球体腎疾患とを判別する方法もまた提供する。血液中のBUNおよび／またはCreは、糸球体腎炎の場合に濃度が上昇する傾向があることが知られている。それに対して、本発明により、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質は、間質性腎炎の場合に濃度が上昇する傾向があることがわかった。これらの結果に基づいて、尿サンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質は検出されるが、血液中のBUNおよび／またはCreは検出されない場合を、間質性腎疾患と同定することができ、そして尿サンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質は検出されないが血液中のBUNおよび／またはCreは検出される場合を、糸球体腎疾患と同定することができる。
For the detection and quantification of BUN and / or Cre in blood, a method already established in the field of clinical examination can be used.
In yet another embodiment, the present invention discriminates interstitial kidney disease from glomerular kidney disease by comparing the concentration of CA-VI isozyme protein in urine and the concentration of BUN and / or Cre in blood. A method is also provided. It is known that BUN and / or Cre in blood tend to increase in the case of glomerulonephritis. In contrast, according to the present invention, it was found that the concentration of CA-VI isozyme protein in urine tends to increase in the case of interstitial nephritis. Based on these results, a case in which CA-VI isozyme protein in a urine sample is detected but BUN and / or Cre in the blood is not detected can be identified as interstitial kidney disease, and urine When no CA-VI isozyme protein in the sample is detected but BUN and / or Cre in the blood is detected, it can be identified as glomerular kidney disease.
本発明においては、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質の濃度、並びに血液中のBUN濃度および／またはCre濃度を比較する際に、尿中の炭酸脱水酵素-III（CA-III）アイソザイムタンパク質の存在を同時に検出することをさらに含むことができる。CA-IIIアイソザイムタンパク質は筋肉から精製され、免疫組織化学的研究で腎臓の近位尿細管と遠位尿細管に局在することが明らかとなっているアイソザイムタンパク質である。2008年、Dent病（特発性尿細管性蛋白尿症）の際に尿中に排出されることが明らかにったアイソザイムでもある（非特許文献4）。従って、CA-VIアイソザイムタンパク質と共にCA-IIIアイソザイムタンパク質が尿中に存在している場合には、CA-VIアイソザイムタンパク質のみを検出する場合よりもより高精度に間質性腎疾患の判別を行うことができる。 In the present invention, the presence of urinary carbonic anhydrase-III (CA-III) isozyme protein when comparing the concentration of CA-VI isozyme protein in urine and the concentration of BUN and / or Cre in blood Can be further included. CA-III isozyme protein is an isozyme protein that has been purified from muscle and has been shown to be localized in the proximal and distal tubules of the kidney by immunohistochemical studies. It is also an isozyme that was found to be excreted in the urine during Dent's disease (idiopathic tubular proteinuria) in 2008 (Non-patent Document 4). Therefore, when CA-III isozyme protein is present in the urine together with CA-VI isozyme protein, interstitial renal disease is discriminated with higher accuracy than when only CA-VI isozyme protein is detected. be able to.
CA-IIIアイソザイムタンパク質の検出、定量は、本発明者の文献（非特許文献5）に記載される様にして行うことができる。具体的には、抗-CA-IIIアイソザイムタンパク質抗体（非特許文献5）を使用して、当該技術分野において既知のタンパク質検出・定量手段を用いて測定することができる。 The detection and quantification of CA-III isozyme protein can be performed as described in the literature of the present inventor (Non-patent Document 5). Specifically, it can be measured using an anti-CA-III isozyme protein antibody (Non-patent Document 5) using a protein detection / quantification means known in the art.
本発明はさらに、尿サンプル中のCA-VIアイソザイムタンパク質を検出・定量するための、抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体を含むキットにも関する。例えば、抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体を結合させたイムノクロマト用フィルターを含むキット、抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体を含むサンドイッチ型ELISAキット、抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体を含む競合的反応型ELISAキット等を提供することができる。 The present invention further relates to a kit containing an anti-CA-VI isozyme protein antibody for detecting and quantifying CA-VI isozyme protein in a urine sample. For example, a kit containing an immunochromatographic filter to which an anti-CA-VI isozyme protein antibody is bound, a sandwich ELISA kit containing an anti-CA-VI isozyme protein antibody, a competitive reaction ELISA kit containing an anti-CA-VI isozyme protein antibody, etc. Can be provided.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例により限定されるものではない。
実施例1：抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体の作製
本実施例においては、まず、CA-VIアイソザイムタンパク質に結合するポリクローナル抗体を作製した。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
Example 1 Production of Anti-CA-VI Isozyme Protein Antibody In this example, first, a polyclonal antibody that binds to the CA-VI isozyme protein was produced.
抗体を作製するための免疫原として、本発明者らの文献（非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3）に記載される方法にしたがって、CA-VIアイソザイムタンパク質を、ウシ、イヌ、ブタの唾液から、阻害剤-親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによって精製することにより調製した。 As an immunogen for producing an antibody, CA-VI isozyme protein is used in cattle and dogs according to the method described in our literature (Non-patent Document 1, Non-patent Document 2, Non-patent Document 3). Prepared from porcine saliva by purification by inhibitor-affinity chromatography and ion exchange chromatography.
具体的には、ピロカルピン溶液（1.5 mg/kg）をホルスタインウシ（メス）、梅山豚（メイシャントン）交配ブタ（オス）、およびイヌの筋肉内に注射して、ウシ、ブタおよびイヌの唾液分泌を誘導した。開口器を使用して口から唾液を滴下させるか（ウシおよびブタの場合）、または脱脂綿を使用して唾液を回収した（イヌの場合）。分泌された唾液をビーカーに回収し、それに0.2 Mのベンズアミジンを含有するおよそ1 L（ウシおよびブタの場合）または50 ml（イヌの場合）の0.1 M Tris-SO4バッファー（0.1 M Tris-SO4と0.2 M Na2SO4、pH 8.7）を添加した。60分間の回収の後、ウシおよびブタからはおよそ1 Lの唾液を、そしてイヌからは50 mlの唾液を、それぞれ回収した。 Specifically, pilocarpine solution (1.5 mg / kg) is injected intramuscularly in Holstein cattle (female), Umeyama pig (Meishanton) mating pigs (male), and dogs to produce saliva secretion in cattle, pigs and dogs. Induced. Saliva was dripped from the mouth using an opener (for cattle and pigs) or saliva was collected using cotton wool (for dogs). The secreted saliva is collected in a beaker and contains approximately 1 L (for cattle and pigs) or 50 ml (for dogs) of 0.1 M Tris-SO 4 buffer (0.1 M Tris-SO) containing 0.2 M benzamidine. 4 and 0.2 M Na 2 SO 4 , pH 8.7) were added. After 60 minutes collection, approximately 1 L saliva was collected from cattle and pigs and 50 ml saliva from dogs.
次いで、唾液-バッファー混合液を4℃にて遠心分離し（27000×g）、30分間）、すべての異物を取り除いた。上清を、アフィニティークロマトグラフィーを使用したCA-VIアイソザイムタンパク質の精製のためにすぐに使用した。次いで、300 mlのアフィニティークロマトグラフィーマトリクス（p-（アミノメチル）ベンゼンスルホンアミドに結合させたCM Sephadex、Pharmacia, Uppsala, Sweden）を唾液-バッファー混合液に対して添加し、ロータリーシェーカーで4℃にて一晩、穏やかに混合した。 The saliva-buffer mixture was then centrifuged at 4 ° C. (27000 × g, 30 minutes) to remove all foreign matter. The supernatant was used immediately for purification of CA-VI isozyme protein using affinity chromatography. Then 300 ml of affinity chromatography matrix (CM Sephadex conjugated to p- (aminomethyl) benzenesulfonamide, Pharmacia, Uppsala, Sweden) was added to the saliva-buffer mixture and brought to 4 ° C. on a rotary shaker. Gently mixed overnight.
アフィニティーゲルは、焼結ガラスフィルターを使用して減圧回収し、そして1 mMのベンズアミジンと20％（v/v）のグリセロールとを含有する0.1 M Tris-SO4バッファー（pH 8.7）を用いて洗浄した。ゲルをガラスカラム（3.3×30 cm）に充填し、そして未吸着のすべての成分が洗浄バッファーで洗い流されるまで1 mMのベンズアミジンと20％（v/v）のグリセロールとを含有する0.1 M Tris-SO4バッファー（pH 7.0）を用いて完全に洗浄した。次に、0.6 MのNaN3、1 mMのベンズアミジン、および20％（v/v）のグリセロールを含有する0.1 M Tris-SO4バッファー（pH 7.0）を使用して、CA-VIアイソザイムタンパク質を溶出した。このタンパク質を含有する画分を回収し、0.2 MのNaClを含有する0.05 Mリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.5）に対して透析し、次いで同バッファーを使用して平衡化した小麦胚芽レクチン-セファロース（Pharmacia, Uppsala, Sweden）カラム上に（ウシおよびイヌの場合）、または同バッファーを使用して平衡化したDEAEセファロース（1×15 cm、Pharmacia, Uppsala, Sweden）カラム上に（ブタの場合）、それぞれ適用した。非結合タンパク質を担体カラムから洗浄除去した後、0.2 MのNaClを含有する50 mMのリン酸ナトリウムバッファー中100 mg/mlのN-アセチル-D-グルコサミン溶液により、CA-VIアイソザイムタンパク質を溶出した。溶出ピークを回収し、そして使用時まで-80℃にて保存した。 Affinity gels are collected under reduced pressure using a sintered glass filter and washed with 0.1 M Tris-SO 4 buffer (pH 8.7) containing 1 mM benzamidine and 20% (v / v) glycerol. did. The gel is packed in a glass column (3.3 x 30 cm) and 0.1 M Tris- containing 1 mM benzamidine and 20% (v / v) glycerol until all unadsorbed components are washed away with wash buffer. washed thoroughly with sO 4 buffer (pH 7.0). The CA-VI isozyme protein is then eluted using 0.1 M Tris-SO 4 buffer (pH 7.0) containing 0.6 M NaN 3 , 1 mM benzamidine, and 20% (v / v) glycerol. did. Fractions containing this protein were collected, dialyzed against 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.2 M NaCl, and then equilibrated with wheat germ lectin-sepharose using the same buffer. On Pharmacia, Uppsala, Sweden) column (for cattle and dogs) or on DEAE Sepharose (1 × 15 cm, Pharmacia, Uppsala, Sweden) column equilibrated using the same buffer (for pigs), Each was applied. After washing away unbound protein from the support column, the CA-VI isozyme protein was eluted with 100 mg / ml N-acetyl-D-glucosamine solution in 50 mM sodium phosphate buffer containing 0.2 M NaCl. . The elution peak was collected and stored at −80 ° C. until use.
このようにして精製したCA-VIアイソザイムタンパク質を免疫原として使用した。精製したCA-VIアイソザイムタンパク質に対する抗体は、ウサギ体内で作製した。ウサギに、Freundの完全アジュバントを用いて乳化させた1 mgの精製CA-VIアイソザイムタンパク質をまず注射した。次に、同量のこのタンパク質を、5週間にわたって毎週一度のブースター注射を行った。ウサギからは、最終注射から10日後に、耳介静脈を介して採決した。抗血清の特異性を、二重免疫拡散法もしくはウェスタンブロッティング法を使用して調べた。 The purified CA-VI isozyme protein was used as an immunogen. Antibodies against the purified CA-VI isozyme protein were produced in rabbits. Rabbits were first injected with 1 mg of purified CA-VI isozyme protein emulsified with Freund's complete adjuvant. The same amount of this protein was then given a booster injection once a week for 5 weeks. Rabbits were voted through the auricular vein 10 days after the final injection. The specificity of the antiserum was examined using double immunodiffusion or Western blotting.
これまでに作製された抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体はすべて、二重免疫拡散法もしくはウェスタンブロッティング法の両方において、CA-VIアイソザイムタンパク質に対して結合することが明らかになった。また、これらの抗体はいずれも、ウシCA-VIアイソザイムタンパク質、ブタCA-VIアイソザイムタンパク質、イヌCA-VIアイソザイムタンパク質のいずれに対しても結合することが確認された。 All anti-CA-VI isozyme protein antibodies produced so far have been shown to bind to CA-VI isozyme protein in both double immunodiffusion or Western blotting methods. Further, it was confirmed that these antibodies bind to any of bovine CA-VI isozyme protein, porcine CA-VI isozyme protein, and canine CA-VI isozyme protein.
実施例2：正常動物の尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質の検出
本実施例においては、実施例1において作製された抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体を用いて、外見上腎疾患を有さない正常な動物の尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質を検出・定量できるかどうかを調べることを目的として行った。
Example 2: Detection of CA-VI isozyme protein in urine of normal animals In this example, the anti-CA-VI isozyme protein antibody prepared in Example 1 was used to make normal appearance without renal disease. The purpose of this study was to investigate whether CA-VI isozyme protein can be detected and quantified in the urine of various animals.
（1）ブタ
200頭の外見上正常なブタからそれぞれ尿サンプルを採取し、尿中に含まれるCA-VIアイソザイムタンパク質の濃度を測定した。この際、あわせて尿中に含まれるCA-IIIアイソザイムタンパク質の濃度も測定した。
(1) Pig
Urine samples were collected from 200 apparently normal pigs, and the concentration of CA-VI isozyme protein contained in the urine was measured. At this time, the concentration of CA-III isozyme protein contained in urine was also measured.
アイソザイムタンパク質濃度の測定は、競合法ELISAを使用して行った。すなわち、実施例1において得られたCA-VIアイソザイムタンパク質に対するポリクローナル抗体からIgGを精製して、これを固相（例えば、マイクロタイターウェル）に結合させ一次抗体とした。固相化した一次抗体に対して、精製したCA-VIアイソザイムタンパク質（5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、80 ng/ml、160 ng/ml、320 ng/mlおよび640 ng/mlを各0.1ml）をスタンダードとして使用し、ビオチン標識したCA-VIアイソザイムタンパク質とスタンダードあるいは尿サンプルを混合し、抗原-抗体複合体を形成させた。一次抗体に結合しなかったビオチン化CA-VIアイソザイムタンパク質や未反応成分を洗い流した後に、ABC複合体（アビジンとビオチンとペルオキシダーゼの複合体(ABC溶液；和光純薬)を加えて反応させた。未反応のABC複合体を洗浄して除去した後、ペルオキシダーゼの発色液を加えて発色し、イムノリーダー分光光度計を用いて吸光度を測定した。各種濃度のスタンダード（5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、80 ng/ml、160 ng/ml、320 ng/mlおよび640 ng/ml）の吸光度から検量線を作成して尿サンプル中の濃度を算出した。 Measurement of isozyme protein concentration was performed using a competitive ELISA. That is, IgG was purified from the polyclonal antibody against the CA-VI isozyme protein obtained in Example 1, and this was bound to a solid phase (for example, microtiter well) to obtain a primary antibody. Purified CA-VI isozyme protein (5 ng / ml, 10 ng / ml, 20 ng / ml, 40 ng / ml, 80 ng / ml, 160 ng / ml, 320 ng) against the immobilized primary antibody / ml and 0.1 ml each of 640 ng / ml) were used as standards, and biotin-labeled CA-VI isozyme protein was mixed with the standard or urine sample to form an antigen-antibody complex. After washing away biotinylated CA-VI isozyme protein and unreacted components that did not bind to the primary antibody, ABC complex (complex of avidin, biotin, and peroxidase (ABC solution; Wako Pure Chemical Industries) was added to cause reaction. Unreacted ABC complex was removed by washing, color was developed by adding a peroxidase coloring solution, and absorbance was measured using an immunoreader spectrophotometer.Standards of various concentrations (5 ng / ml, 10 ng / Concentrations in urine samples were calculated by preparing calibration curves from the absorbances of ml, 20 ng / ml, 40 ng / ml, 80 ng / ml, 160 ng / ml, 320 ng / ml and 640 ng / ml).
尿中のCA-IIIアイソザイムタンパク質濃度は、非特許文献2に記載される方法に従って作製したCA-IIIアイソザイムタンパク質に対するポリクローナル抗体からIgGを精製し、これを固相（例えば、マイクロタイターウェル）に結合させ一次抗体とした。固相化した一次抗体に対して精製したCA-IIIアイソザイムタンパク質をスタンダードとして使用し、ビオチン標識したCA-IIIアイソザイムタンパク質とスタンダードとして精製したCA-IIIアイソザイムタンパク質（5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、80 ng/ml、160 ng/ml、320 ng/ml、および640 ng/ml）あるいは尿サンプルを混合し、抗原-抗体複合体を形成させた。一次抗体に結合しなかったビオチン化CA-VIアイソザイムタンパク質や未反応成分を洗い流した後に、ABC複合体（アビジンとビオチンとペルオキシダーゼの複合体（ABC溶液；和光純薬）を加えて反応させた。未反応のABC複合体を洗浄して除去した後、ペルオキシダーゼの発色液を加えて発色し、イムノリーダー分光光度計を用いて吸光度を測定した。各種濃度のスタンダード（5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、80 ng/ml、160 ng/ml、320 ng/mlおよび640 ng/ml）の吸光度から検量線を作成して尿サンプル中の濃度を算出した。 The concentration of CA-III isozyme protein in urine was purified from a polyclonal antibody against CA-III isozyme protein prepared according to the method described in Non-Patent Document 2 and bound to a solid phase (eg, microtiter well). Primary antibody. Using CA-III isozyme protein purified against the immobilized primary antibody as a standard, biotin-labeled CA-III isozyme protein and CA-III isozyme protein purified as standard (5 ng / ml, 10 ng / ml) 20 ng / ml, 40 ng / ml, 80 ng / ml, 160 ng / ml, 320 ng / ml, and 640 ng / ml) or urine samples were mixed to form antigen-antibody complexes. After washing away biotinylated CA-VI isozyme protein and unreacted components that did not bind to the primary antibody, an ABC complex (complex of avidin, biotin, and peroxidase (ABC solution; Wako Pure Chemical Industries) was added and reacted. Unreacted ABC complex was removed by washing, color was developed by adding a peroxidase coloring solution, and absorbance was measured using an immunoreader spectrophotometer.Standards of various concentrations (5 ng / ml, 10 ng / Concentrations in urine samples were calculated by preparing calibration curves from the absorbances of ml, 20 ng / ml, 40 ng / ml, 80 ng / ml, 160 ng / ml, 320 ng / ml and 640 ng / ml).
このようにして測定した結果、外見上正常なブタの尿中には、平均して56.7±43.3 ng/mlのCA-VIアイソザイムタンパク質が存在し、また平均して39.5±55.6 ng/mlのCA-IIIアイソザイムタンパク質が存在することが明らかになった。 As a result of the measurement, 56.7 ± 43.3 ng / ml of CA-VI isozyme protein was present on average in apparently normal pig urine, and 39.5 ± 55.6 ng / ml of CA was averaged. -III isozyme protein was found to exist.
（2）イヌ
11頭の外見上正常と判断されるイヌからそれぞれ尿サンプルを採取し、尿中に含まれるCA-VIアイソザイムタンパク質の濃度を測定した。この際、あわせて尿中に含まれるCA-IIIアイソザイムタンパク質の濃度も測定した。
(2) Dog
Urine samples were collected from 11 dogs judged to be normal in appearance, and the concentration of CA-VI isozyme protein contained in the urine was measured. At this time, the concentration of CA-III isozyme protein contained in urine was also measured.
タンパク質濃度測定は、ブタの場合（1）と同様に、競合法ELISAを使用して行った。このようにして測定した結果、外見上正常と判断されるイヌの尿中におけるCA-VIアイソザイムタンパク質濃度およびCA-IIIアイソザイムタンパク質濃度を、以下の表1にまとめる。表中、太字はCA-VIアイソザイムタンパク質濃度が異常値と判断された個体を示す。 The protein concentration measurement was performed using the competitive ELISA as in the case of pig (1). Table 1 below summarizes the CA-VI isozyme protein concentration and CA-III isozyme protein concentration in the urine of dogs that were determined to be normal as a result of the measurement. In the table, bold letters indicate individuals whose CA-VI isozyme protein concentration was determined to be an abnormal value.
この結果から、動物番号5、6および9の3頭の動物が、CA-VIアイソザイムタンパク質濃度について100 ng/ml以上の異常値を示すと判断された。なお、イヌの場合において、尿中に含まれるCA-VIアイソザイムタンパク質濃度が高い場合、尿中のCA-IIIアイソザイムタンパク質も比較的高い濃度で存在するという、相関性が示された。 From these results, it was determined that the three animals of animal numbers 5, 6, and 9 showed an abnormal value of 100 ng / ml or more for the CA-VI isozyme protein concentration. In the case of dogs, a correlation was shown that when the concentration of CA-VI isozyme protein contained in urine was high, CA-III isozyme protein in urine was also present at a relatively high concentration.
（3）ネコ
8頭の外見上正常と判断されるネコからそれぞれ尿サンプルを採取し、尿中に含まれるCA-VIアイソザイムタンパク質の濃度を測定した。この際、あわせて尿中に含まれるCA-IIIアイソザイムタンパク質の濃度も測定した。
(3) Cat
Urine samples were collected from eight cats judged to be normal in appearance, and the concentration of CA-VI isozyme protein contained in the urine was measured. At this time, the concentration of CA-III isozyme protein contained in urine was also measured.
タンパク質濃度測定は、ブタの場合（1）と同様に、競合法ELISAを使用して行った。このようにして測定した結果、外見上正常と判断されるネコの尿中におけるCA-VIアイソザイムタンパク質濃度およびCA-IIIアイソザイムタンパク質濃度を、以下の表2にまとめる。表中、太字はCA-VIアイソザイムタンパク質濃度が異常値と判断された個体を示す。 The protein concentration measurement was performed using the competitive ELISA as in the case of pig (1). The CA-VI isozyme protein concentration and the CA-III isozyme protein concentration in the urine of cats that are determined to be normal as a result of the measurement are summarized in Table 2 below. In the table, bold letters indicate individuals whose CA-VI isozyme protein concentration was determined to be an abnormal value.
この結果から、動物番号5の動物が、CA-VIアイソザイムタンパク質濃度について70 ng/ml以上の異常値を示すと判断された。なお、ネコの場合においても、尿中に含まれるCA-VIアイソザイムタンパク質濃度が高い場合、尿中のCA-IIIアイソザイムタンパク質も比較的高い濃度で存在するという、相関性が示された。 From this result, it was determined that the animal of animal number 5 showed an abnormal value of 70 ng / ml or more for the CA-VI isozyme protein concentration. In the case of cats as well, there was a correlation that when the concentration of CA-VI isozyme protein contained in urine was high, CA-III isozyme protein in urine was also present at a relatively high concentration.
実施例3：腎疾患を有する動物の尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質の検出
本実施例においては、実施例1において作製された抗CA-VIアイソザイムタンパク質抗体を用いて、外見上臨床的な腎疾患の症状を有する疾患動物の尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質を検出・定量できるかどうかを調べることを目的として行った。
Example 3: In the detection this example animal CA-VI isoenzyme protein in urine with renal disease using anti-CA-VI isoenzyme protein antibody produced in Example 1, apparently clinical renal The purpose of this study was to investigate whether CA-VI isozyme protein in urine of diseased animals with disease symptoms could be detected and quantified.
（1）イヌ
臨床所見として、食欲不振、多飲、多渇、多尿、体重減少、嘔吐などの観点での腎不全の症状を示すと判断された13頭のイヌから、それぞれ尿サンプルを採取し、尿中に含まれるCA-VIアイソザイムタンパク質の濃度を測定した。この際、あわせて尿中に含まれるCA-IIIアイソザイムタンパク質の濃度も測定すると共に、血液を採取して、血中BUN濃度およびCre濃度も測定した。
(1) Dogs Urine samples were collected from 13 dogs that were judged to show symptoms of renal failure in terms of anorexia, heavy drinking, thirst, polyuria, weight loss, and vomiting as clinical findings. The concentration of CA-VI isozyme protein contained in urine was measured. At this time, the concentration of CA-III isozyme protein contained in urine was also measured, and blood was collected to measure the BUN concentration and Cre concentration in blood.
尿中タンパク質濃度の測定は、実施例2の（1）と同様に、競合法ELISAを使用して行った。また、血中BUN濃度およびCre濃度は、臨床検査の分野において周知であるように、ドライケム（動物用生化学自動分析装置、富士フイルム株式会社）を使用して測定した（イヌの場合正常値はBUN濃度が30 mg/dl以下、Cre濃度が2 mg/dl以下である）。このようにして測定した結果、外見上臨床的な腎不全の症状を有すると判断されるイヌの尿中におけるCA-VIアイソザイムタンパク質濃度およびCA-IIIアイソザイムタンパク質濃度、ならびに血液中のBUN濃度およびCre濃度を、以下の表3にまとめる。表中、太字はCA-VIアイソザイムタンパク質濃度が異常値と判断された個体を、そして下線を引いた数値は、BUN濃度およびCre濃度について正常値であることを示す。 The measurement of the urinary protein concentration was carried out using the competitive ELISA as in Example 1 (1). In addition, blood BUN concentration and Cre concentration were measured using dry chem (automatic biochemical analyzer for animals, Fuji Film Co., Ltd.) as is well known in the field of clinical tests (normal values for dogs are BUN concentration is 30 mg / dl or less, Cre concentration is 2 mg / dl or less). As a result of the measurement, CA-VI and CA-III isozyme protein concentrations in the urine of dogs that are apparently considered to have clinical symptoms of renal failure, and BUN concentration and Cre in the blood Concentrations are summarized in Table 3 below. In the table, bold letters indicate individuals whose CA-VI isozyme protein concentration was determined to be an abnormal value, and underlined numerical values indicate normal values for the BUN concentration and Cre concentration.
この結果から、動物番号1〜3、および8が、CA-VIアイソザイムタンパク質濃度について100 ng/ml以上の異常値を示すと判断された。その一方で、臨床的には腎不全の症状を示しているにもかかわらず、血中のBUN濃度およびCre濃度が共に正常範囲に収まっている動物が13頭中7頭（54％）も見られ（動物番号1〜7、および12）、それらの動物のうち3頭（動物番号1〜3）では、CA-VIアイソザイムタンパク質濃度が異常値を示していることが明らかになった。 From these results, it was determined that animal numbers 1 to 3 and 8 showed an abnormal value of 100 ng / ml or more for the CA-VI isozyme protein concentration. On the other hand, 7 out of 13 animals (54%) whose BUN concentration and Cre concentration in the blood are within the normal range despite clinical signs of renal failure. (Animal Nos. 1-7 and 12), and 3 of those animals (Animal Nos. 1-3) were found to have abnormal CA-VI isozyme protein concentrations.
このことから、臨床的に腎不全と診断された動物のうち、血液検査によるBUN濃度およびCre濃度の測定では検出できなかった腎疾患個体を、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質濃度を測定することにより検出できる場合が存在することが示された。 Based on this, it is necessary to measure the urinary CA-VI isozyme protein concentration in kidney disease individuals that could not be detected by blood test BUN concentration and Cre concentration among animals clinically diagnosed with renal failure. Showed that there were cases where it could be detected.
（2）ネコ
臨床所見として、食欲不振、多飲、多渇、体重減少などの観点などの臨床的な観点での腎不全の症状を示すと判断された31匹のネコから、それぞれ尿サンプルを採取し、尿中に含まれるCA-VIアイソザイムタンパク質の濃度を測定した。この際、あわせて尿中に含まれるCA-IIIアイソザイムタンパク質の濃度も測定すると共に、血液を採取して、血中BUN濃度およびCre濃度も測定した。
(2) Cats As clinical findings, urine samples were collected from 31 cats that were judged to exhibit symptoms of renal failure in clinical aspects such as anorexia, heavy drinking, thirst, and weight loss. It was collected and the concentration of CA-VI isozyme protein contained in urine was measured. At this time, the concentration of CA-III isozyme protein contained in urine was also measured, and blood was collected to measure the BUN concentration and Cre concentration in blood.
尿中タンパク質濃度の測定は、および血中BUN濃度およびCre濃度の測定は、実施例3の（1）と同様に行った。また、ドライケム（動物用生化学自動分析装置、富士フイルム株式会社）を使用して測定したネコにおけるBUN濃度およびCre濃度の正常値は、BUN濃度が30 mg/dl以下、Cre濃度が2 mg/dl以下である。このようにして測定した結果、外見上臨床的な腎不全の症状を有すると判断されるネコの尿中におけるCA-VIアイソザイムタンパク質濃度およびCA-IIIアイソザイムタンパク質濃度、ならびに血液中のBUN濃度およびCre濃度を、以下の表4にまとめる。表中、太字はCA-VIアイソザイムタンパク質濃度が異常値と判断された個体を、そして下線を引いた数値は、BUN濃度およびCre濃度について正常値であることを示す。 The measurement of urinary protein concentration and the measurement of blood BUN concentration and Cre concentration were performed in the same manner as in Example 3 (1). In addition, the normal values of BUN concentration and Cre concentration in cats measured using dry chemistry (animal biochemistry automatic analyzer, Fujifilm Corporation) are BUN concentration of 30 mg / dl or less, Cre concentration of 2 mg / dl or less. CA-VI and CA-III isozyme protein concentrations in cat urine, and BUN concentrations and Cre in the blood of cats that are apparently determined to have clinical symptoms of renal failure as a result of the measurement as described above. Concentrations are summarized in Table 4 below. In the table, bold letters indicate individuals whose CA-VI isozyme protein concentration was determined to be an abnormal value, and underlined numerical values indicate normal values for the BUN concentration and Cre concentration.
この結果から、動物番号6、15、19、20、27、30および31が、CA-VIアイソザイムタンパク質濃度について70 ng/ml以上の異常値を示すと判断された。その一方で、臨床的には腎不全の症状を示しているにもかかわらず、血中のBUN濃度およびCre濃度が共に正常範囲に収まっている動物が31頭中5頭（16％）も見られ（動物番号23〜25、27および28）、それらの動物のうち1頭（動物番号27）では、CA-VIアイソザイムタンパク質濃度が異常値を示していることが明らかになった。 From these results, it was determined that animal numbers 6, 15, 19, 20, 27, 30 and 31 showed abnormal values of 70 ng / ml or more for the CA-VI isozyme protein concentration. On the other hand, 5 out of 31 animals (16%) whose BUN and Cre concentrations in the blood are within the normal range despite clinical signs of renal failure. (Animal Nos. 23-25, 27 and 28), and one of those animals (Animal No. 27) was found to have an abnormal CA-VI isozyme protein concentration.
このことから、臨床的に腎不全と診断された動物のうち、血液検査によるBUN濃度およびCre濃度の測定では検出できなかった腎疾患個体を、尿中のCA-VIアイソザイムタンパク質濃度を測定することにより検出できる場合が存在することが示された。 Based on this, it is necessary to measure the urinary CA-VI isozyme protein concentration in kidney disease individuals that could not be detected by blood test BUN concentration and Cre concentration among animals clinically diagnosed with renal failure. Showed that there were cases where it could be detected.
本発明により、初期の腎臓疾患を検出するとともに、腎臓疾患の進行度を特定するための哺乳動物の腎臓疾患の新規診断マーカーおよびそれを用いた方法、ならびにそれを用いた検出キットを開発することができるとともに、哺乳動物の腎臓疾患に関して、腎臓疾患の類症鑑別を迅速かつ簡便に行うための、新規診断マーカーおよびそれを用いた方法、ならびにそれを用いた検出キットを開発することができた。 According to the present invention, a novel diagnostic marker for mammalian kidney disease, a method using the same, and a detection kit using the same for detecting early kidney disease and identifying the degree of progression of kidney disease are developed. As a result, we were able to develop a novel diagnostic marker, a method using the same, and a detection kit using the same in order to quickly and easily differentiate the renal diseases from mammals. .
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019196987A (en) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | 富士フイルム株式会社 | Animal urine examination device, animal urine examination system, and animal urine examination program |
| US11026625B2 (en) | 2017-08-08 | 2021-06-08 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Systems and methods for treating and estimating progression of chronic kidney disease |
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2008
- 2008-12-12 JP JP2008317179A patent/JP2010139429A/en not_active Withdrawn
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| JP2019196987A (en) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | 富士フイルム株式会社 | Animal urine examination device, animal urine examination system, and animal urine examination program |
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