JP2010130918A - 微生物検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明によれば、捕集した微生物を直接検出するので、試薬で殺菌または溶菌された微生物を迅速に検出できる。
【解決手段】本発明の実施形態の微生物検出方法は、以下のステップを含む。
(ｉ)少なくとも一種の微生物を含む試料に、いずれかの微生物を殺菌または溶菌する第一の試薬を添加する第一のステップ。(ｉｉ)該微生物を捕集する第二のステップ。(ｉｉｉ)捕集した該微生物に、殺菌または溶菌した微生物と殺菌または溶菌していない微生物とを判別するための第二の試薬を添加する第三のステップ。
【選択図】図１

Description

本発明は、微生物検出方法に関する。

微生物を検出する方法として、一般的に培養方法が用いられる。この培養方法では、微生物が増殖するまでに時間がかかることが知られている。また、増殖した微生物が、例えば大腸菌であるかどうかの判定法が煩雑であるため、判定までに時間がかかるという問題がある。

特許文献１には、蛍光物質を用いて微生物を検出する方法が記載されている。微生物を検出するには、発光した微生物の色彩を測定する色彩計測手段が用いられている。この色彩計測手段は、光学的輝度のダイナミックレンジの大きいＣＣＤもしくはＣＭＯＳからなる受像素子を用いたことを特徴としている。これにより、発光手段の感度によらず色彩により細胞や微生物と反応した発光と、細胞や微生物以外の検体に含まれる不純物との違いを区別できると記載されている。
上述のような蛍光物質を用いて微生物を検出する方法として各種の提案がある（例えば、特許文献２、非特許文献１参照）。
特開２００７−６７０９号公報 特開２０００−２７０８９２号公報 "bioplorer"、Panasonic社、［２００８年１０月２２日検索］インターネット<ＵＲＬ：http://panasonic.biz/kankyo/bioplorer/pdf/syouhin/setsumei1.pdf>

細菌の薬剤感受性を検出する方法において、一般的な培養方法では、細菌を培養する必要があり、そのため、検出するまでに時間がかかっていた。
また、細菌の菌種を特定する方法において、従来の特許文献１に記載の方法では、細菌の菌種を特定することができなかった。

本発明により、少なくとも一種の微生物を含む試料に、いずれかの微生物を殺菌または溶菌する第一の試薬を添加する第一のステップと、
前記微生物を捕集する第二のステップと、
捕集した前記微生物に、殺菌または溶菌した微生物と殺菌または溶菌していない微生物とを判別するための第二の試薬を添加する第三のステップと、を含むことを特徴とする微生物検出方法が提供される。ただし、このステップは状況により順番が変更される場合もある。

本発明によれば、捕集した微生物を直接検出するので、試薬で殺菌または溶菌された微生物を迅速に検出できる。

本発明の実施の一形態を図面を参照して以下に説明する。ただし、本実施の形態に関して前述した一従来例と同一の部分は、同一の名称を使用して詳細な説明は省略する。

(第一の実施形態)
図１は、本発明の実施形態の微生物を検出する方法を示すフローチャートである。
本発明の実施形態の微生物を検出する方法は、以下のステップを含む。
(ｉ)少なくとも一種の微生物を含む試料に、いずれかの微生物を殺菌または溶菌する第一の試薬を添加する第一のステップ。
(ｉｉ)該微生物を捕集する第二のステップ。
(ｉｉｉ)捕集した該微生物に、殺菌または溶菌した微生物と殺菌または溶菌していない微生物とを判別するための第二の試薬を添加する第三のステップ。

本実施形態の微生物を検出する方法の概要について説明する。
まず、微生物を含む試料を準備し（Ｓ１００）、この試料に微生物を殺菌または溶菌する第一の試薬を添加する(Ｓ１０２)。続いて、試料中の微生物を捕集し（Ｓ１０４）、この捕集した微生物の第一の試薬の作用による生死を第二の試薬を用いて（Ｓ１０６）判別する（Ｓ１０８）。

本実施形態の微生物を検出する方法は、例えば第一の試薬として抗生物質またはファージを用いることができる。また、生死の判別には、例えば市販の蛍光染色試薬を用いることができる。抗生物質を用いた場合には、検出対象菌の薬剤感受性を調べることができる。また、ファージを用いた場合には、特定菌の検出することができる。ここで、本実施形態において、微生物を殺菌または溶菌する観点から、微生物とは細菌や菌類等である。
以下、各ステップの概要について説明する。

[(ｉ)第一のステップ]
第一のステップは、少なくとも一種の微生物を含む試料を準備し（Ｓ１００）、この試料にいずれかの微生物を殺菌または溶菌する第一の試薬を添加する(Ｓ１０２)ものである。本ステップでは、図２、図３に示しているセンサーチップ１００を用いることができる。

本ステップにおいて、微生物を含む試料を準備する（Ｓ１００）とは、微生物を含有するか含有する可能性のある液体試料を準備することである。例えば、この液体試料として飲み物などを準備する。また、食べ物などの固体の場合は、これをホモジナイズする方法により、液体試料を準備する。さらに、ベットや人体などの場合、その表面から綿棒などを用いて微生物を採取し、これを生理食塩水やリン酸緩衝液などに遊離させる方法により、液体試料を準備する。

このように、微生物を含む試料を準備(Ｓ１００)するには、あらゆる場所から採取してきた微生物を第一の試薬と反応できるように溶媒に溶かして、試料を調製する方法が用いられる。微生物はあらゆる環境に存在するため、採取場所としては特に限定されない。また、ステップ(Ｓ１００)において、試料を調製するために、あらかじめ培養しておいた微生物を用いてもよい。なお、このステップでは状況に応じて培養過程を入れる場合もある。その際、培養過程と同時に下記の第一の試薬を添加し、対象菌の殺菌または溶菌を同時に行う場合もある。

第一の試薬を添加する(Ｓ１０２)とは、上記の方法により準備した試料に、第一の試薬または第一の試薬を含む溶液を混ぜて、この第一の試薬と試料中の微生物とを接触させることである。
ここで、第一の試薬は、特に限定されず、いずれかの微生物を殺菌または溶菌するものであればよい。

いずれかの微生物を殺菌または溶菌する第一の試薬とは、自然界に存在する微生物のうち、すくなくとも１種微生物を殺菌または溶菌する性質を示す試薬のことである。本実施形態では、このような第一の試薬として、抗生物質または抗生物質を含む溶液、ファージ、ファージを含む溶液を用いることができる。

[(ｉｉ)第二のステップ]
第二のステップは、上記ステップで第一の試薬と接触した試料中の微生物を捕集するものである(Ｓ１０４)。本ステップにおいて、図５に示している吸引装置１３２を用いることができる。捕集するとは、液体試料のうち、この微生物とその他の試料溶液等とを分け、この微生物を有意に集めることをいう。
[(ｉｉｉ)第三のステップ]
第三のステップは、上記の捕集した微生物に、殺菌または溶菌した微生物と殺菌または溶菌していない微生物とを判別するための第二の試薬を添加するものである(Ｓ１０６)。その後この第一の試薬で殺菌または溶菌された微生物と、殺菌または溶菌されなかった微生物とを判別する（Ｓ１０８）。つまり、捕集した微生物の第一の試薬の作用による生死を第二の試薬を用いて判別する。
ここで、殺菌または溶菌した微生物と殺菌または溶菌していない微生物とを判別する方法として、第二の試薬として例えば、市販の蛍光染色試薬を用いて生死菌の判別をする方法を用いる。
この生死菌を判別する方法には、(ａ)複合蛍光染色法、または(ｂ)生菌染色法と全菌染色法との組み合わせた方法などがある。

(ａ)の場合、蛍光染色試薬として、生死菌で発光色の違う蛍光試薬が用いられる。具体的には、緑色蛍光のＳＹＴＯ９色素と赤色蛍光のよう化プロビジウム色素を含くむ複合蛍光染色試薬である。この他にも、死菌の標識として、ＹＯＹＯ-１、７ＡＤＤ、生菌の標識として、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ、ＬＤＳ７５１などの蛍光染色試薬を用いることができる。
(ｂ)の場合、ＤＡＰＩ染色法、ＥＢ染色法、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１染色法などの全菌染色法と、ＣＴＣ染色法、ＣＦＤＡ染色法などの生菌染色法とを組み合わせて用いることができる。例えば、ＤＡＰＩ染色法とＣＦＤＡ染色法との二重染色により、生死菌の判別をする。

このように、第二の試薬を添加して（Ｓ１０６）生死菌を判別することにより、殺菌または溶菌された微生物と殺菌または溶菌されなかった微生物とを判別することができる。この生死菌を判別する方法には、生死菌で異なる発光色を用いて判別する方法がある。この発光色を判別するには、蛍光顕微鏡を用いて目視観察または画像解析などをする。本ステップにおいて、例えは図４に示すように検出装置を用いることができる。

上記の各ステップにおいてセンサーチップ１００、吸引装置１３２、および検出装置が用いられる。これらの装置は微生物検出システムとして構成されている。このセンサーチップ１００を吸引装置１３２、検出装置と順番にセットして用いることで、各ステップに準じて微生物を検出することができる。
以下、この微生物検出システムを用いた本実施形態の微生物を検出する方法について説明する。

図２には、本発明の実施形態のセンサーチップ１００が示されている。図３には、図２のセンサーチップ１００のＡ−Ａの断面図が示されている。
図２、図３の示したセンサーチップ１００は、センサーチップ１００に形成された検出部１４０と、検出部１４０内に設けられたメンブレンフィルタ１３０とを備えるものである。また、図２においては、１つのセンサーチップ１００には、複数の検出部１４０がアレイ状に配置されている。これにより、上記ステップにおいて、一度の工程で複数の試料の微生物を検出することができる。このセンサーチップ１００は、液体試料中の検出対象成分の有無または量を検出するセンサーとして用いることができる。

第一のステップにおいて、検出部１４０に液体試料が注入され（Ｓ１００）、さらに第一の試薬が添加される（Ｓ１０２）。その後、吸引装置１３２の液体吸引機構により、検出部１４０は下側から吸引ろ過される。そして、検出部１４０のメンブレンフィルタ１３０の表面上に微生物が捕集されるＳ１０４）。検出部１４０内の捕集された微生物に第二の試薬が添加され（Ｓ１０６）、検出部１４０は吸引ろ過される。続いて、検出装置により検出部１４０内の微生物の生死が判別される（Ｓ１０８）。
また、メンブレンフィルタ１３０上の微生物を生理食塩水やリン酸緩衝液などで洗浄してもよい。

図３に示すように、検出部１４０は、テーパ状の下面開口部分にメンブレンフィルタ１３０を有している。このため、第二のステップにおいて、微生物は高密度に捕集される。これにより、第三のステップで生死菌の判別をするために、充分な微生物の濃度にすることができる。

このため、第一のステップに用いられる試料中の微生物の濃度は、非常に低濃度でよい。例えば、この微生物の濃度が１０個／ｍｌ以上程度、さらには１個／ｍｌ以上程度から、検出装置により、微生物を検出することが可能となる。
このように、実施形態のセンサーチップ１００を用いた場合、検出装置により高感度に微生物を検出することができる。

センサーチップ１００は例えば樹脂製である。メンブレンフィルタ１３０の孔径は、例えば０．１μｍ以上、１μｍ以下とする。また、メンブレンフィルタ１３０は、チタンなどの金属がコーティングされていてもよい。これにより、メンブレンフィルタ１３０の自己発光を抑えて、検知の際のノイズを低減させることができる。
また、上述のとおり同一のチップ中に複数の検出部１４０が形成されているため、複数の試料や試薬を同時に検査できる。さらに、検出部１４０上には、着脱自在の液溜めを設けてもよい。この液溜めから試料を検出部１４０に注入する機構を設けてもよい。検出部１４０にゴミなどを除去するフィルターをさらに設けてもよい。

続いて、本発明の実施形態の吸引装置１３２を用いた第二のステップについて説明する。図５に示すように、この吸引装置１３２は、ホルダー１０２、チューブ１２６、液溜１２０、送液ポンプ１２４、受け部１２８、チューブ１３４、廃液溜１１８、および吸引ポンプ１２２を備えるものである。ホルダー１０２はセンサーチップ１００を保持する。チューブ１２６はホルダー１０２に接続し、送液された液体が通る液体送液路である。液溜１２０は、送液ポンプ１２４を介してチューブ１２６に接続し、センサーチップ１００に送液される液体を溜める。送液ポンプ１２４は液溜１２０に接続し、液体を送液する。受け部１２８はホルダー１０２からセンサーチップ１００に送液された後、吸引された液体を受けるものである。チューブ１３４は受け部１２８に接続し、吸引された液体が通る液体吸引路である。廃液溜１１８は、吸引ポンプ１２２を介してチューブ１３４に接続し、センサーチップ１００から吸引された液体を溜める。吸引ポンプ１２２は廃液溜１１８に接続し、液体を吸引する。
この吸引装置１３２は、吸引する液体吸引機構を備えていればよく、さらに液体を送液する液体送液機構を備えてもよい。

この液体吸引機構において、吸引ポンプ１２２は、液溜１２０からセンサーチップ１００に送液された液体またはピペットなどを使ってセンサーチップ１００に供給された液体などを吸引する。これにより、ホルダー１０２にセットされたセンサーチップ１００の検出部１４０から液体試料が吸引される。そして、第一のステップおよび第三のステップにおいて、微生物以外の液体試料や添加された試薬などが吸引され、受け部１２８、チューブ１３４と経由して廃液溜１１３に排出される。その後、検出部１４０のメンブレンフィルタ１３０上に試薬と接触した微生物が残る。
液体送液機構において、送液する液体には、液体試料、試薬、センサーチップ１００の検出部１４０を洗浄する洗浄液などが挙げられる。液体の種類ごとに複数の液溜１２０を備えてもよい。

続いて、本発明の実施形態の検出装置を用いた第三のステップについて説明する。
本ステップにおいて、センサーチップ１００の検出部１４０に捕集された成分を検知する装置の構成に特に制限はなく、たとえば汎用の蛍光顕微鏡を用いることができる。
図４は、本発明の実施形態の検出装置を示している。
この検出装置は、ホルダー１０２、励起用光源１０４、ダイクロイックミラー１０８、対物レンズ１０６、光学フィルター１１０、結像レンズ１１２、及び検知機構１１４を備えるものである。ホルダー１０２はセンサーチップ１００を保持する。励起用光源１０４は励起光を照射する。ダイクロイックミラー１０８は励起用光源１０４から照射された励起光を分光させる。対物レンズ１０６はこの分光した励起光を集光させる。光学フィルター１１０は集光した励起光がセンサーチップ１００上の検出部１４０に照射したことにより、微生物などが発光した蛍光を上記対物レンズ１０６とダイクロイックミラー１０８とを経由して透過させる。結像レンズ１１２はこの透過した蛍光の光束を結像させる。検知機構１１４はこの結像を検知する。

また図４においては、励起用光源１０４からの出射光が、ダイクロイックミラー１０８、対物レンズ１０６を経由してセンサーチップ１００の検出部１４０に照射される。検出部１４０からの出射光は、対物レンズ１０６を経由してダイクロイックミラー１０８を通過し、光学フィルター１１０により不要な光を排除し、結像レンズ１１２により結像され、電荷結合素子（Charge Coupled Device：ＣＣＤ）により、この結像が電子データに変換される。

ホルダー１０２は、センサーチップ１００が平行に移動できるステージとなっている。これにより、集光した励起光が照射する位置にセンサーチップ１００上の各検出部１４０の位置を移動させることができる。対物レンズ１０６は、検出部１４０を拡大する。励起用光源１０４としては、ＬＥＤ等を用いることができる。また、検知機構１１４としては、接眼レンズまたはＣＣＤカメラを用いる。これにより、ステップＳ１０８において、目視による観察や、ＣＣＤカメラに接続したＰＣ１１６を用いた画像解析もするこができる。これにより、各検出部１４０の微生物の生菌と死菌とが異なる発光を示すデータを得ることができる。

本実施形態の効果を説明する。本実施形態においては、ファージに接触した微生物を捕集し、この捕集した微生物の溶菌による生死を直接検出することで、微生物の菌種を迅速に特定することができる。また、本実施形態においては、抗生物質に接触した微生物を捕集し、この捕集した微生物の殺菌作用による生死を直接検出することで、微生物の薬剤感受性を迅速に検査することができる。本実施形態においては、培養法、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：ＰＣＲ）法のような時間を要する工程が不要となるため、迅速に微生物の菌種を特定または微生物の薬剤感受性を検査することができる。

また、センサーチップ１００を用いた場合には、ファージまたは抗生物質に接触した微生物はメンブレンフィルタ１３０で捕集される。このため、このメンブレンフィルタ１３０上で捕集された微生物のファージまたは抗生物質の作用による生死を直接検出するので、迅速に微生物の菌種を特定しまたは微生物の薬剤感受性を検査することができる。さらに、検出部１４０のメンブレンフィルタ１３０上には、微生物は高密度に捕集されるため、第一のステップに用いられる試料中の微生物の濃度は、非常に低濃度でよい。そのため、検出装置により高感度に微生物を検出することができる。

このように微生物の第一の試薬による生死の判別が迅速に行うことが可能となる。検査結果の迅速性が求められる観点から、本実施形態のファージを用いた特定菌の検出方法は、食品衛生検査、環境衛生分析および感染症診断等に応用することできる。また、同様に本実施形態の抗生物質を用いた薬剤感受性試験は、院内感染原因菌の検出、感染症診断および抗菌剤の感受性試験等に応用することができる。

次に、本実施形態において、ファージを用いた場合の特定菌の検出方法について説明する。
図９、図１０に、本発明の実施形態の特定菌の検出方法の手順が示されている。
まず、上述のセンサーチップ１００の検出部１４０に参照試料と検査試料とを準備する（図９(ａ)、図１０(ａ)、Ｓ１００）。本実施形態では、参照試料と検査試料とは同じ液体の試料２００である。この試料２００には、後述のステップで添加するファージの対象菌２２０と非対象菌２３０が含まれているものとする。

続いて、検査試料の試料２００に、既知のファージ溶液１５０を添加する(図１０(ｂ)、Ｓ１０２)。このファージ溶液１５０の添加により、試料２００内の対象菌２２０と非対象菌２３０とにファージが接触する。そして、このファージはこれらのうち対象菌２２０にのみ特異的に感染する。感染サイクル後に、対象菌２２０は溶菌する。
この感染サイクルは一般的に１５分〜３時間程度であるため、試料２００中のファージにより溶菌した対象菌２２０の有無を迅速に検出することができる。

続いて、試料２００内の対象菌２２０と非対象菌２３０とを捕集する(図９(ｂ)、図１０(ｃ)、Ｓ１０４)。捕集するには、上述の吸引装置１３２を用いることができるが、この方法に限定されない。

さらに、検出部１４０に生菌と死菌で発色が異なる蛍光試薬１６０を添加して(図９(ｃ)、図１０(ｄ)、Ｓ１０６)、メンブレンフィルタ１３０上に捕集された対象菌２２０と非対象菌２３０を直接検出する(図９(ｄ)、図１０(ｅ)、Ｓ１０８)。

図９(ｃ)、図１０(ｄ)に示すように、対象菌２２０と非対象菌２３０とが蛍光試薬１６０に覆われればよいので、検出部１４０に添加する蛍光試薬１６０の量は非常に少なくすることができる。

また、図９(ｄ)、図１０(ｅ)に示すように、参照試料において対象菌２２０と非対象菌２３０と生菌２４０として染色され、他方検査試料において対象菌２２０は死菌２５０として非対象菌２３０は生菌２４０としてそれぞれ染色される。
これにより、試料２００中のファージにより溶菌した対象菌２２０の有無を迅速に検出することができる。既知のファージ溶液１５０用いることで、ファージとファージが特異的に感染する対象菌２２０との関係により、試料２００中の微生物の菌種を特定することができる。つまり、死菌２５０として染色された対象菌２２０の菌種を特定することができる。この関係には一般的に知られているものも、本実施形態で調べたものも含まれる。また上述の検出装置を用いて上記蛍光染色を観察することができるが、この方法に限定されない。

本実施形態において、参照試料をネガティブコントロールとして用いることができる。また、試料として既知の対象菌２２０に、既知のファージ溶液１５０を添加することでポジティブコントロールを得ることもできる。

細菌とこれに特異的なファージの組合せは、大腸菌とＴ系ファージ，λファージ等、サルモネラとＰ系ファージ等、シュードモナスとＰ系ファージ等、緑膿菌と４２ファージ、黄色ブドウ球菌とφＭＲ１１ファージ、炭疽菌とγファージなどを例示的に挙げることができる。

本実施形態の特定菌の検出では、ファージに接触した微生物を捕集し、この捕集した微生物の溶菌による生死を直接検出することで、微生物の菌種を迅速に特定することができる。培養法やＰＣＲ法等と比べると検査に要する試料の処理工程が少ないため、非常に簡単である。さらに、培養法を除くほかの検査方法と比べると使用する試薬が少ないため、ランニングコストを低く抑えることも可能である。また、この特定菌の検出は、食品衛生検査、環境衛生分析および感染症診断等に応用することもできる。

ところで、上述した特許文献２の蛍光物質を用いて微生物を検出する方法の場合、蛍光物質で核酸を標識したファージが用いられている。その場合、細菌に特異的に感染したファージにより細菌を検出するものであるため、このファージによって全ての細菌が溶菌していないことが必要となる。
そのため、低濃度の細菌を用いた場合には、このファージが細菌を溶菌してしまい、細菌を検出できない可能性があった。また、上述の特許文献２の方法は、ファージのＤＮＡに蛍光標識を導入する必要がある。このため、非常に時間がかり、操作が煩雑であった。加えて、この蛍光標識に利用できる蛍光色素が非常に限られている上、それらの蛍光色素では生死菌の判別は不可能であると考えられる。

これに対して、本実施形態においては、ファージが特異的に感染した微生物を溶菌し、この溶菌した微生物を死菌として検出するものである。そのため、上述のとおり低濃度の微生物を試料として用いた場合にも、感度よく検出できる。
また、本実施形態のセンサーチップ１００を用いることで、この微生物の濃度が１０個／ｍｌ以上程度から、微生物を検出することが可能となる。

次に、本実施形態において、抗生物質を用いた場合の検出対象菌の薬剤感受性を調べる方法について説明する。
図１１、図１２に、本発明の実施形態の薬剤感受性の検出方法の手順が示されている。
まず、上述のセンサーチップ１００の検出部１４０に参照試料と検査試料とを準備する（図１１(ａ)、図１２(ａ)、Ｓ１００）。本実施形態では、参照試料と検査試料とは同じ液体の試料３００である。この試料３００には、後述のステップで添加する抗生物質３１０の薬剤耐性菌２８０と通常菌２７０が含まれているものとする。

続いて、検査試料の試料３００に、既知の抗生物質３１０を添加する(図１２(ｂ)、Ｓ１０２)。この抗生物質３１０の添加により、試料３００内の薬剤耐性菌２８０と通常菌２７０とに抗生物質３１０が接触し、薬剤耐性菌２８０以外の通常菌２７０を殺菌する。殺菌された通常菌２７０は死菌となる。
この殺菌にかかる時間としては一般的に１５分〜３時間程度であるため、抗生物質３１０によって殺菌されなかった薬剤耐性菌２８０の薬剤感受性を迅速に検出することができる。
薬剤耐性菌２８０が未知の場合には、準備した試料には薬剤耐性菌の有無の判別をすることができる。また、薬剤耐性菌２８０が既知の場合には、この薬剤耐性菌２８０の薬剤感受性を調べることができる。

続いて、試料３００内の薬剤耐性菌２８０と通常菌２７０とを捕集する(図１１(ｂ)、図１２(ｃ)、Ｓ１０４)。捕集するには、上述の吸引装置１３２を用いることができるが、この方法に限定されない。

さらに、検出部１４０に生菌と死菌で発色が異なる蛍光試薬１６０を添加して(図１１(ｃ)、図１２(ｄ)、Ｓ１０６)、メンブレンフィルタ１３０上に捕集された薬剤耐性菌２８０と通常菌２７０とを直接検出する(図１１(ｄ)、図１２(ｅ)、Ｓ１０８)。

図１１(ｃ)、図１２(ｄ)に示すように、薬剤耐性菌２８０と通常菌２７０とが蛍光試薬１６０に覆われればよいので、検出部１４０に添加する蛍光試薬１６０の量は非常に少なくすることができる。

また、図１１(ｄ)、図１２(ｅ)に示すように、参照試料において薬剤耐性菌２８０と通常菌２７０と生菌２４０として染色され、他方検査試料において通常菌２７０は死菌２５０として薬剤耐性菌２８０は生菌２４０としてそれぞれ染色される。
これにより、既知の抗生物質３１０で、生菌２４０として染色された薬剤耐性菌２８０の薬剤感受性を調べることができる。この蛍光染色は、上述の検出装置を用いて観察することができるが、この方法に限定されない。

本実施形態において、参照試料をネガティブコントロールとして用いることができる。また、試料として既知の薬剤耐性菌２８０に、既知の抗生物質３１０を添加することでポジティブコントロールを得ることもできる。
本実施形態の薬剤感受性の検出方法では、抗生物質に接触した微生物を捕集し、この捕集した微生物の殺菌作用による生死を直接検出することで、微生物の薬剤感受性を迅速に検査することができる。培養法やＰＣＲ法等と比べると検査に要する試料の処理工程が少ないため、非常に簡単である。さらに、培養法を除くほかの検査方法と比べると使用する試薬が少ないため、ランニングコストを低く抑えることも可能である。また、この薬剤感受性の検出方法は、院内感染原因菌の検出、感染症診断および抗菌剤の感受性試験等に応用することもできる。
(第二の実施形態)
次に、本発明の第二の実施形態について説明する。第二の実施形態においては、１つの試料に対して複数の第一の試薬を添加する以外は第一の実施形態と同様に行うものである。

この実施形態の微生物を検出する方法は、第一のステップにおいて、互いに同一の複数の試料に、互いに異なる第一の試薬を添加するものである。
具体的には、複数の検出部Ｐ^１,・・・,Ｐ^Ｎ（Ｎは２以上）を備えるセンサーチップ１００を用いる。これにより、複数の検出部１４０に同一の試料Ｓ^１が配置される。この複数の検出部１４０にそれぞれ異なる第一の試薬Ｒ^１,・・・,Ｒ^Ｍ（Ｍは２以上）を添加することにより、これらの検出部１４０の検出結果を同時に得ることができる。
さらに、同一の試料Ｓ^２に対して、・・・、同一の試料Ｓ^Ｎに対してもこの検出結果を同時に得ることもできる。
これにより、多量かつ迅速に微生物を検出することができる。さらに、試料と第一の試薬との複数の組み合わせを同時に検査できるので、バリエーションに富んだ微生物の検出結果を迅速に得ることができる。

ここで、第一の試薬Ｒ^１,・・・,Ｒ^Ｍは抗生物質またはファージとすることができる。
互いに異なる種類のファージ溶液１５０を用いる場合、未知の微生物を含む試料において、未知の微生物の菌種を特定することもできる。

互いに異なる種類の抗生物質３１０を用いる場合、未知の微生物を含む試料において準備した試料において、薬剤耐性菌の有無の判別をすることができる。

一般的に感染症を治療する際、抗生物質が用いられる。このとき新たに耐性菌が発生しないように抗生物質が選択される。この選択において、この実施形態の検出方法を用いることで、感染症を引き起こしている細菌に作用する抗生物質を迅速に選択できる。つまり、この細菌の抗生物質に対する耐性の有無を調べることで、耐性の無い抗生物質を選択することができる。またこれ以外の細菌に関しても、これらの抗生物質に対する耐性の有無を調べることができる。

さらに、未知の微生物を含む試料において、ファージ溶液１５０で未知の微生物の菌種を特定した後、この特定菌について薬剤感受性を調べることもできる。

また、第一の試薬Ｒ^１,・・・,Ｒ^Ｍは抗生物質およびファージとすることができる。
これにより、未知の微生物を含む試料において、ファージ溶液１５０による未知の微生物の菌種の特定と、この特定菌の薬剤感受性とを同時に検出することもできる。

(第三の実施形態)
第三の実施形態では、第一の実施形態の微生物を検出する方法を用いた微生物の感受性を調べる方法について説明する。
本実施形態の微生物の感受性を調べる方法は、以下のステップを含む。
少なくとも一種の既知の微生物を含む複数の試料に、微生物を殺菌する第一の試薬を、濃度をふって添加する第一のステップ。
該微生物を捕集する第二のステップ。
捕集した該微生物に、殺菌した微生物と殺菌していない微生物とを判別するための第二の試薬を添加する第三のステップ。
第一の試薬の濃度と、捕集した該微生物の生菌数との関係から、第一の試薬に対する微生物の感受性を示すデータを生成する第四のステップ。

本実施形態において、複数の検出部Ｐ^１,・・・,Ｐ^Ｎ（Ｎは２以上）を備えるセンサーチップ１００を用いる。これにより、複数の検出部１４０に同一の既知微生物の試料Ｓが配置される。この複数の検出部１４０にそれぞれ異なる濃度Ｌ^１,・・・, Ｌ^Ｍ（Ｍは２以上）になるように抗生物質を添加することにより、これらの検出部１４０の検出結果を同時に得ることができる。

本実施形態では、例えば濃度Ｌ^１,・・・, Ｌ^Ｍが所定の範囲にある同一の抗生物質を用いて、薬剤感受性を調べる。これにより、得られた生菌数の結果から、生菌がぎりぎり生存する濃度を示すデータが得られる。このデータから、殺菌が可能であったこの最低の濃度を、最小発育阻止濃度として、微生物に対する薬剤の効果の指標を得る。
また、異なる種類の抗生物質において、同時に検査することも可能である。
(第四の実施形態)
第四の実施形態では、第一の実施形態の微生物を検出する方法を用いた未知物質の殺菌性を調べる方法について説明する。
本実施形態の未知物質の殺菌性を調べる方法は、以下のステップを含む。
少なくとも一種の既知の微生物を含んでいて、互いに同一の複数の試料に、互いに異なる微生物を殺菌する既知の第一の試薬または少なくとも一種の未知物質を添加する第一のステップ。
該微生物を捕集する第二のステップ。
捕集した該微生物に、殺菌した微生物と殺菌していない微生物とを判別するための第二の試薬を添加する第三のステップ。
さらに、第一の試薬と未知物質との間で第三のステップで得られた判別結果を比較して、未知物質の殺菌性を示すデータを生成する第四のステップ。

本実施形態の複数の検出部Ｐ^１,・・・,Ｐ^Ｎ（Ｎは２以上）を備えるセンサーチップ１００を用いる。これにより、複数の検出部１４０に同一の既知微生物の試料Ｓが配置される。この複数の検出部１４０うち、一部に異なる既知抗生物質を添加し、その他に互いに異なる複数の未知物質を添加することにより、これらの検出部１４０の検出結果を同時に得ることができる。

続いて、既知抗生物質と未知物質との間で得られた上記検出結果を比較して、未知物質の殺菌性を示すデータを生成する。これにより、既知微生物Ｄ^１に対する既知抗生物質Ｒ^１の殺菌作用Ｙ^１と、同質の殺菌作用Ｙ^１を有すると考えられる未知物質をスクリーニングすることができる。
また、既知微生物Ｄ^２が異なれば、既知抗生物質Ｒ^１は殺菌作用Ｙ^２となる場合がある。このときには、未知物質は同質の殺菌作用Ｙ^２を有するものとしてスクリーニングされる。
つまり、本実施形態の未知物質の殺菌性を調べる方法では、第三のステップで得られた既知微生物に対する既知抗生物質の判別結果を、ポジティブコントロールとして用いて、殺菌性を示す未知物質をスクリーニングすることができる。

(実施例１)
本実施形態の生死菌の判別の具体例を示す。
本具体例では、図６に示すように、たとえば市販の蛍光染色試薬を用いて、生死菌の判別を行った。
検出対象成分：大腸菌
検出方法：蛍光顕微鏡観察
本実施例では、図２に示したチップを用いて、複合蛍光染色法と蛍光観察による大腸菌検出と生死判定を行った。

まず、センサーチップ１００の検出部１４０に大腸菌を採取した液体試料を準備した。続いて、吸引装置１３２を用いて試料内の大腸菌を捕集した。続いて、複合蛍光染色法を用いて、検出部１４０に生菌と死菌で発色が異なる複合蛍光染色試薬を添加して、その後、特異的に捕捉された大腸菌の生死と個体数を判別した。ここで、複合蛍光染色試薬として、LIVE/DEAD BacLight（商標） Bacterial Viability Kits（Invitrogen社製）を用いた。

続いて、複合蛍光染色試薬を含む緩衝溶液をチップの検出部１４０に導入した。複合蛍光染色試薬は、緑色蛍光のＳＹＴＯ９色素と赤色蛍光のよう化プロビジウム色素を含んでおり、これらは膜透過性に違いがある。ＳＹＴＯ９は生死菌両方の膜を透過し緑色に染色する。一方、よう化プロビジウムは死菌のダメージを受けた膜のみを透過し赤色に染色する。また、両方の色素がバクテリア中に存在すると、ＳＹＴＯ９の蛍光は減衰する。従って、細菌が生存していれば、複合蛍光試薬は緑色に蛍光し、細菌が死亡しているなら、複合蛍光試薬は、赤色に蛍光する。分子化学反応に、１０分要した後、蛍光顕微鏡観察を行った。

図６は、観察結果を示す図である。すべての菌の観察結果および画像解析により生菌および死菌を抽出した結果を示す。図６より、本実施形態においても、大腸菌を短時間で感度よく検出することができた。

(実施例２)
本実施例では、大腸菌の菌種の特定を行った。具体的には、実施例１で大腸菌を捕捉したチップの検出部１４０に、Ｔ^４ファージ溶液を投与し、検出部１４０に捕捉されている微生物（大腸菌）の生死の経過観察を行った。観察は実施例１に記載の方法に準じて行った。

図７は、参照試料と検査試料との観察結果を示す図である。図７の検査試料の結果より、赤色に発色した死菌が観察されたことから、Ｔ^４ファージの対象菌である大腸菌が検出できたことがわかった。

（実施例３）
本実施例では、大腸菌の薬剤感受性試験を行った。具体的には、実施例１で大腸菌を捕捉したチップの検出部１４０に、抗菌剤（セファム系抗生物質製剤「パンスポリン」武田薬品工業社製、濃度：１０ｇ／Ｌ）を投与し、検出部１４０に捕捉されている大腸菌の生死の経過観察を行った。観察は実施例１に記載の方法に準じて行った。

図８は、参照試料と検査試料との観察結果を示す図である。図８の検査試料の結果より、緑色に発色した生菌が観察されたことから、抗菌剤に耐性を有する大腸菌が検出できたことがわかった。

なお、当然ながら、上述した実施の形態および複数の変形例は、その内容が相反しない範囲で組み合わせることができる。また、上述した実施の形態および変形例では、各部の構造などを具体的に説明したが、その構造などは本願発明を満足する範囲で各種に変更することができる。

本発明の実施形態の微生物を検出する方法を示す図である。 本発明の実施形態のセンサーチップを示す図である。 図２の本発明の実施形態のセンサーチップのＡ−Ａの断面図である。 本発明の実施形態の検出装置を示す図である。 本発明の実施形態の吸引装置を示す図である。 本発明の実施形態のチップの捕捉部の観察結果を示す図である。 本発明の実施形態のチップの捕捉部の観察結果を示す図である。 本発明の実施形態のチップの捕捉部の観察結果を示す図である。 本発明の実施形態の特定菌の検出方法を示す図である。 本発明の実施形態の特定菌の検出方法を示す図である。 本発明の実施形態の薬剤感受性の検出方法を示す図である。 本発明の実施形態の薬剤感受性の検出方法を示す図である。

符号の説明

１００ センサーチップ
１０２ ホルダー
１０４ 励起用光源
１０６ 対物レンズ
１０８ ダイクロイックミラー
１１０ 光学フィルター
１１２ 結像レンズ
１１３ 廃液溜
１１４ 検知機構
１１８ 廃液溜
１１６ ＰＣ
１２０ 液溜
１２２ 吸引ポンプ
１２４ 送液ポンプ
１２６ チューブ
１２８ 受け部
１３０ メンブレンフィルタ
１３２ 吸引装置
１３４ チューブ
１４０ 検出部
１５０ ファージ溶液
１６０ 蛍光試薬
２００ 試料
２２０ 対象菌
２３０ 非対象菌
２４０ 生菌
２５０ 死菌
２７０ 通常菌
２８０ 薬剤耐性菌
３００ 試料
３１０ 抗生物質

Claims (12)

1. 少なくとも一種の微生物を含む試料に、いずれかの微生物を殺菌または溶菌する第一の試薬を添加する第一のステップと、
   前記微生物を捕集する第二のステップと、
   捕集した前記微生物に、殺菌または溶菌した微生物と殺菌または溶菌していない微生物とを判別するための第二の試薬を添加する第三のステップと、を含むことを特徴とする微生物検出方法。
2. 前記第一の試薬は、抗生物質を含む請求項１に記載の微生物検出方法。
3. 前記第一の試薬は、ファージを含む請求項１または２に記載の微生物検出方法。
4. 前記第一のステップにおいて、互いに同一の複数の前記試料に、互いに異なる前記第一の試薬を添加することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の微生物検出方法。
5. 前記第一の試薬は、前記抗生物質と前記ファージとを含むことを特徴とする請求項４に記載の微生物検出方法。
6. 前記第一のステップに用いられる前記試料中の微生物の濃度が、１０個／ｍｌ以上である請求項１から５のいずれかに記載の微生物検出方法。
7. 前記第一のステップに用いられる前記試料中の微生物の濃度が、１個／ｍｌ以上である請求項１から６のいずれかに記載の微生物検出方法。
8. 前記微生物が、細菌または菌類を含む請求項１から７のいずれかに記載の微生物検出方法。
9. 前記第二の試薬が、蛍光染色試薬である請求項１から８のいずれかに記載の微生物検出方法。
10. 前記第二のステップにおいて、メンブレンフィルタを用いることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の微生物検出方法。
11. 前記微生物を検出する方法は、前記微生物の感受性を調べる方法であり、
    前記第一のステップにおいて、少なくとも一種の既知の微生物を含む複数の試料に、微生物を殺菌する前記第一の試薬を、濃度をふって添加し、
    前記第三のステップにおいて、捕集した前記微生物に、殺菌した微生物と殺菌していない微生物とを判別するための前記第二の試薬を添加し、
    その後さらに、前記第一の試薬の濃度と、捕集した前記微生物の生菌数との関係から、前記第一の試薬に対する前記微生物の感受性を示すデータを生成する第四のステップを有することを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。
12. 前記微生物を検出する方法は、未知物質の殺菌性を調べる方法であり、
    前記第一のステップにおいて、少なくとも一種の既知の微生物を含んでいて、互いに同一の複数の前記試料に、互いに異なる微生物を殺菌する既知の前記第一の試薬または少なくとも一種の未知物質を添加し、
    前記第三のステップにおいて、捕集した前記微生物に、殺菌した微生物と殺菌していない微生物とを判別するための前記第二の試薬を添加し、
    その後さらに、前記第一の試薬と前記未知物質との間で前記第三のステップで得られた判別結果を比較して、前記未知物質の殺菌性を示すデータを生成する第四のステップを有することを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。