JP2010099090A - Target detection system having conformationally sensitive probe comprising nucleic acid based signal transducer - Google Patents
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Abstract
Description
本願出願は、本願出願と同じ発明の名称を有する、2002年10月11日にジョン・クンホとファン・ヒョンジンにより出願された米国仮出願番号60/417,864より優先権が主張されており、その内容を本明細書に組み込む。 This application claims priority from US Provisional Application No. 60 / 417,864, filed on October 11, 2002 by John Kungho and Hwang Hyunjin, who have the same invention title as the present application, The contents are incorporated herein.
本発明は、一般的に試料内で少なくとも一つの標的因子(target agent)を検出するためのシステムに関する。該システムは、標的因子の存在が、プローブの立体構造(probe conformation)の変化と関連づけられるように考案されたプローブを含む。典型的なプローブは、標的因子とプローブとの連合(association)を、あるハイブリダイゼーション状態(hybridization state)から他のハイブリダイゼーション状態へ検出可能な方式で変化させることによって報知する核酸ベースのシグナルトランスデューサー(nucleic acid based signal transducer)を含む。本発明は、生物学的、製薬的、産業的、または環境的試料において広範囲な種類の標的因子を検出するための用途を含む重要な用途を有する。 The present invention relates generally to a system for detecting at least one target agent in a sample. The system includes a probe designed to correlate the presence of a target agent with a change in probe conformation. A typical probe is a nucleic acid-based signal transducer that signals the association of a target agent with the probe by changing it in a detectable manner from one hybridization state to another. (nucleic acid based signal transducer). The present invention has important applications including applications for detecting a wide variety of target agents in biological, pharmaceutical, industrial or environmental samples.
“プローブ(probe)”という用語は、適合したシグナル発生システムと結合された標的認識要素(target recognition element)を含む構成物のことを言う。あるプローブは、認識要素(recognition element)と特異的に相互作用する生物学的または化学的標的因子を検出するために使用される。このようなプローブはしばしば実時間で標的因子を検査できるように、可逆的且つ連続的に作動するように考案される。
近来、化学、生物学、医学、製薬、産業及び環境監視、治安、及びその他の分野で使用するための多種多様なプローブを開発しようとする努力がなされてきている(Lakowicz,J.R.(1994);Leiner,M.J.P. and Hartmann,P.(1993);Aizawa,M.(1995)参照)。あるプローブでは、多種多様な生物学的且つ化学的物質が認識要素として使用される。例えば、抗原-抗体相互作用、酵素-基質相互作用、そして受容体-リガンド相互作用が全て提案されたことがある。合成または半合成相互作用もまた、認識要素を開発する基盤とされることが知られたことがある(例えば、クラウンエーテル(crown ether)及びカリックスアーレン(calixaren)と他の分子またはイオンとの会合。その例に、Shinbo,T.等による米国特許4,942,149及びLeiner,M.J.P.等による米国特許5,952,491を参照されたい。
既知の認識要素を、プローブベースの標的認識方式の開発のための基礎としようとする努力がなされてきた。このような方式に使用されるプローブは、ラベルされた(labeled)プローブとラベルされていない(unlabeled)プローブとに分けられる。
The term “probe” refers to a composition that includes a target recognition element coupled with a suitable signal generation system. Certain probes are used to detect biological or chemical target agents that interact specifically with recognition elements. Such probes are often devised to operate reversibly and continuously so that the target factor can be examined in real time.
Recently, efforts have been made to develop a wide variety of probes for use in chemical, biological, medical, pharmaceutical, industrial and environmental monitoring, security, and other fields (Lakowicz, JR (1994); Leiner, MJP and Hartmann, P. (1993); Aizawa, M. (1995)). In some probes, a wide variety of biological and chemical substances are used as recognition elements. For example, antigen-antibody interactions, enzyme-substrate interactions, and receptor-ligand interactions have all been proposed. Synthetic or semi-synthetic interactions have also been known to be the basis for developing recognition elements (e.g., association of crown ethers and calixaren with other molecules or ions). See, for example, U.S. Pat. No. 4,942,149 by Shinbo, T. et al., And U.S. Patent 5,952,491 by Leiner, MJP et al.
Efforts have been made to make known recognition elements the basis for the development of probe-based target recognition schemes. Probes used in such a system are divided into labeled probes and unlabeled probes.
ラベルされていないプローブは、複雑な検出方式が必要な上に、時には煩わしいプローブ固定化を必要とするものと知られている。例えば、表面プラズモン共鳴技術(surface plasmon resonance、SPR)(Liedberg,B.et al.(1995);Taremi,S.S. and Prosise,W.W. U.S.Pat.No.5,981,167)、エバネッセント-フィールド技術(evanescent-field technique)(Sutherland,R.M.et al.(1984);Hirschfeld,T.E. U.S.Pat.No.4,447,546)、水晶発振子マイクロバランス技術(quartz crystal microbalance technique)(Carter,R.M.et al.(1995);Ebersole,R.C.et al. U.S.Pat.No.5,658,732.)、そして飛行時間型質量分析技術(TOF mass spectrometry)(Griffin,T.J.et al.(1999))が報告されたことがある。これらの例では、複雑な機器装置が、標的因子とラベルされていないプローブとの結合を検出するシグナルトランスデューサー(signal transducer)の役割をする。 An unlabeled probe is known to require a complex detection scheme and sometimes requires troublesome probe immobilization. For example, surface plasmon resonance (SPR) (Liedberg, B. et al. (1995); Taremi, SS and Prosise, WWUSPat. No. 5, 981,167), evanescent-field technique ( Sutherland, RMet al. (1984); Hirschfeld, TEUSPat. No. 4,447,546), quartz crystal microbalance technique (Carter, RMet al. (1995); Ebersole, RCet al. US Pat. No. 5,658,732.) And time-of-flight mass spectrometry (TOF mass spectrometry) (Griffin, TJ et al. (1999)) have been reported. In these examples, a complex instrument serves as a signal transducer that detects binding of a target agent to an unlabeled probe.
他の類型のプローブでは、検出可能なラベルがプローブの構成成分として含まれている。例えば、このような類型のプローブは、標的因子とプローブ内部に在る認識要素との相互作用を表示するように考案されることができる。広く知られたシグナル発生技術であるELISA技術(Van Vunakis H.(1980);Hampar,B.et al. U.S.Pat.No.4,764,459)では、標的抗原(または、抗体)と固定化したプローブ抗体(または、抗原)との結合に反応して増幅されたシグナルを生成すべく、酵素でラベルされた抗体を利用する。核酸ハイブリダイゼーションプローブ(Caskey,C.T. and Gibbs,R.A.L. U.S.Pat.No.5,578,458;Chehab,F.F. U.S.Pat.No.5,489,507;Lucas,J.N.et al. U.S.Pat.No.5,616,465)では、標的核酸配列を検出すべく、蛍光ラベルされたオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)を利用する。 In other types of probes, a detectable label is included as a component of the probe. For example, such a type of probe can be devised to display the interaction between the target factor and the recognition element inside the probe. In ELISA technology (Van Vunakis H. (1980); Hampar, B. et al. USPat. No. 4,764, 459), which is a well-known signal generation technology, a target antigen (or antibody) and an immobilized probe antibody ( Alternatively, an enzyme-labeled antibody is used to generate an amplified signal in response to binding to the antigen. Nucleic acid hybridization probes (Caskey, CT and Gibbs, RALUSPat. No. 5,578,458; Chehab, FFUSPat. No. 5,489,507; Lucas, JNet al. USPat. No. 5,616,465) Fluorescently labeled oligonucleotides are used.
また、望む標的因子とプローブの認識要素との相互作用を、検出可能な立体構造的変化(detectable conformation change)によりシグナル化するプローブを開発するための努力がなされてきた。例えば、米国特許第5,925,517号は、標的核酸配列の検出のために光を生成する相互作用性ラベル対を有する二元性立体構造核酸ハイブリダイゼーションプローブ(dual conformation nucleic acid hybridization probe)について開示している。開示された如く、標的核酸配列が存在しないときには、ラベル対が相互に近接している位置(“オフ(off)”状態))にあり、一方、プローブが標的核酸配列と結合すると、プローブは、ラベル対が相互に離れている状態(“オン(on)”状態))となるように立体構造(conformation)を変化させる。 Efforts have also been made to develop probes that signal the interaction between the desired target factor and the recognition element of the probe by a detectable conformation change. For example, US Pat. No. 5,925,517 describes a dual conformation nucleic acid hybridization probe having an interactive label pair that generates light for detection of a target nucleic acid sequence. Disclosure. As disclosed, when the target nucleic acid sequence is not present, the label pairs are in close proximity to each other (the “off” state), while when the probe binds to the target nucleic acid sequence, the probe is The conformation is changed so that the label pairs are separated from each other ("on" state).
標的受容体を検出するために、リガンドが接合された消光体と蛍光性高分子の複合体を利用したシステムを含む他のプローブシステムも報告されたことがある(参照:Chen,L.et al.(1999);Whitten,D.G.et al.PCT Pub.No.WO 01/85997 A1)。
それ以外の種類のプローブも報告されたことがある(参照:Comoglio,S. and Celada,F.(1976);Gonnelli,M.et al.(1981);Henderson,D.R. U.S Pat.No.4,708,929)。
Other probe systems have also been reported, including systems that utilize a complex of a ligand-conjugated quencher and a fluorescent polymer to detect the target receptor (see Chen, L. et al (1999); Whitten, DGet al. PCT Pub. No. WO 01/85997 A1).
Other types of probes have also been reported (see: Comoglio, S. and Celada, F. (1976); Gonnelli, M. et al. (1981); Henderson, DRUS Pat. No. 4,708,929).
しかしながら、先行開発されたプローブとプローブベースの検出方式は、多くの欠点を抱えていた。例えば、大部分のプローブは、核酸またはこれと関連する標的を検出するように特異的に構成されている。アミノ酸配列(例えば、ポリペプチド、リガンド受容体、抗体及び酵素)及び合成分子(例えば、クラウンエーテル(crown ether)、ダイオキシン(dioxin)等)のような他の主要標的は、このような方式では検出しにくい。また、大部分の二元性立体構造プローブ(dual conformation probe)は、相互作用性ラベル対、すなわち、検出可能なシグナルを生成するために相互に可逆的連合が必要なラベルを使用するように限定されている。しかしながら、このようなプローブは、不幸なことにも他の種類のラベルと共に容易に使用できず、プローブの設計と検出方式の選択において制限がある。しかも、報告された多くの二元性立体構造プローブは、その単一形態的な特性によって、検出方式が、分子内立体構造的変化を利用する方式に局限される。すなわち、このようなプローブは、二つまたはそれ以上の独立したプローブ間の分子間立体構造的変化を表示するように考案されたものでない。これら欠点を含めた諸欠点は、多種の標的因子を再現可能・敏感・低コストの方法で検出することを不可能にする。 However, the previously developed probes and probe-based detection schemes have many drawbacks. For example, most probes are specifically configured to detect nucleic acids or targets associated therewith. Other major targets such as amino acid sequences (e.g. polypeptides, ligand receptors, antibodies and enzymes) and synthetic molecules (e.g. crown ether, dioxin etc.) are detected in this manner. Hard to do. Also, most dual conformation probes are limited to using interactive label pairs, that is, labels that require reversible association with each other to produce a detectable signal. Has been. Unfortunately, such probes are unfortunately not readily usable with other types of labels, and there are limitations in probe design and detection scheme selection. Moreover, many of the reported binary three-dimensional probes are limited to detection methods utilizing intramolecular three-dimensional structural changes due to their single morphological characteristics. That is, such probes are not devised to display intermolecular conformational changes between two or more independent probes. These drawbacks, including these, make it impossible to detect a wide variety of target factors in a reproducible, sensitive and low-cost manner.
本発明は、一般的に試料内で少なくとも一つの標的因子を検出するためのシステムに関する。一側面において、本発明のシステムは、試料内の標的因子の存在が、プローブ(probe)の立体構造(conformation)の検出可能な変化と関連づけられるように考案された少なくとも一つのプローブを含む。本発明のプローブは、標的因子とプローブとの連合(association)を、あるハイブリダイゼーション状態(hybridization state)から他のハイブリダイゼーション状態に検出可能に変化することによって報知する核酸ベースのシグナルトランスデューサー(nucleic acid based signal transducer)を含む。 The present invention relates generally to a system for detecting at least one target agent in a sample. In one aspect, the system of the present invention includes at least one probe designed to correlate the presence of a target agent in a sample with a detectable change in probe conformation. The probe of the present invention is a nucleic acid-based signal transducer (nucleic acid-based signal transducer) that reports the association between a target agent and a probe by detectably changing from one hybridization state to another. acid based signal transducer).
本発明は、生物学的、産業的、または環境的に関心の対象となる様々な試料において標的因子を検出することを含む、極めて広い範囲にわたる重要な用途を有する。 The present invention has important applications over a very wide range, including detecting target agents in various samples of biological, industrial or environmental interest.
本発明に係る典型的なプローブは、作動可能に連結された構成成分として:(1)絶対的ではないが典型的に、1または2対の相補的な核酸配列、及び(2)少なくとも一つの検出可能なラベルを含む、立体構造的に敏感な核酸ベースのシグナルトランスデューサーを含む。一実施の形態において、該シグナルトランスデューサーは、望む標的因子が存在していないアッセイ条件下において“オフ”ハイブリダイゼーション状態にあるが、試料内に標的因子が存在すると、“オン”ハイブリダイゼーション状態へ立体構造的に変化するようになる。後述するが、本発明の核酸ベースのシグナルトランスデューサーは、多様な範囲の検出方式と共に使用されることができ、先行開発されたいずれのラベル法にも限定されない。 Exemplary probes according to the present invention are as operably linked components: (1) typically, but not absolutely, one or two pairs of complementary nucleic acid sequences, and (2) at least one of Includes a conformationally sensitive nucleic acid based signal transducer containing a detectable label. In one embodiment, the signal transducer is in an “off” hybridization state under assay conditions in which the desired target agent is not present, but when the target agent is present in the sample, it enters an “on” hybridization state. It will change in three-dimensional structure. As will be described later, the nucleic acid-based signal transducer of the present invention can be used with a wide range of detection methods and is not limited to any of the previously developed label methods.
本発明のより特定のプローブは、作動可能に連結された構成成分としてさらに:(3)上記の相補的核酸配列のうち少なくとも一つ(例えば、1対または2対、好ましくは1対の相補的核酸配列)と好ましくは連合している少なくとも一つの標的因子認識要素を含む。
該認識要素は、1または2対の前記核酸配列と直接または間接的に好適に連結されている。特定プローブ認識要素は、望む標的因子のうち少なくとも一つに対して、一つまたはそれ以上の相互作用部位を提供するように好適に構成されている。このような認識要素は、プローブ、特に核酸ベースのシグナルトランスデューサーの内部または近傍に位置することによって、標的因子が認識要素と連合して存在するときに、このシグナルトランスデューサーがその立体構造を変えるようにするか、または変えるように促す。
More specific probes of the present invention may further comprise as operably linked components: (3) at least one of the above complementary nucleic acid sequences (eg, one or two pairs, preferably one pair of complementary) At least one target factor recognition element preferably associated with the nucleic acid sequence.
The recognition element is preferably linked directly or indirectly to one or two pairs of the nucleic acid sequences. The specific probe recognition element is suitably configured to provide one or more interaction sites for at least one of the desired target factors. Such a recognition element is located within or near a probe, particularly a nucleic acid based signal transducer, so that the signal transducer changes its conformation when the target agent is present in association with the recognition element. Or encourage them to change.
典型的に、標的因子と認識要素との相互作用は、核酸ベースのシグナルトランスデューサーに伝えられる不安定化力(destabilizing force)を促進させ、結果として、シグナルトランスデューサーが“オフ”ハイブリダイゼーション状態(標的因子が存在しない状態)から“オン”ハイブリダイゼーション状態(標的因子が存在する状態)へその立体構造を変えるようにする。シグナルトランスデューサーが全体的にまたは部分的に核酸配列を含んでいる実施形態において、不安定化力は、より具体的に“核酸ハイブリダイゼーション不安定化力(nucleic acid hybridization destabilizing force)”を意味する。しかしながら、一部の実施形態では、標的因子と認識要素との相互作用により、核酸ベースのシグナルトランスデューサーが既に特徴として持っていた核酸ハイブリダイゼーション不安定化力が減少または除去されることもある。この場合には、不安定化力の減少や除去により、シグナルトランスデューサーが“オフ”ハイブリダイゼーション状態から“オン”ハイブリダイゼーション状態へ立体構造を変化する。本発明によるプローブは、多種多様なの標的因子との相互作用、例えば、標的因子とプローブとの連合により直接的にまたは間接的に発生する立体障害(steric hindrance)、疏水性(hydrophobic)、親水性(hydrophilic)、または電荷-電荷間(charge-charge)斥力(repulsion)に起因する相互作用を、容易に検出可能なシグナルトランスデューサーシグナルに転換するのに特に極めて適している。標的因子、プローブ、またはこれら両者と連合する2次的な分子により全的にまたは部分的に生成される相互作用力もまた、本発明の標的因子検出システムにより考案されて検出されることができる。受容体-リガンド(receptor-ligand)、抗体-抗原(antibody-antigen)、酵素-基質(enzyme-substrate)対のように特異的に相互作用する対を形成する標的因子が例として含まれるが、これに限定されない。 Typically, the interaction between the target agent and the recognition element promotes a destabilizing force that is transmitted to the nucleic acid-based signal transducer, resulting in the signal transducer being in an “off” hybridization state ( The steric structure is changed from a state in which no target factor is present to an “on” hybridization state (in which the target factor is present). In embodiments in which the signal transducer includes the nucleic acid sequence in whole or in part, destabilizing force more specifically means “nucleic acid hybridization destabilizing force”. . However, in some embodiments, the interaction between the target agent and the recognition element may reduce or eliminate the nucleic acid hybridization destabilizing power already characterized by the nucleic acid based signal transducer. In this case, the signal transducer changes its three-dimensional structure from the “off” hybridization state to the “on” hybridization state by reducing or eliminating the destabilizing force. Probes according to the present invention can interact with a wide variety of target factors, e.g., steric hindrance, hydrophobic, hydrophilicity, generated directly or indirectly by the association of the target factor with the probe. It is particularly well suited for converting interactions due to (hydrophilic) or charge-charge repulsion into easily detectable signal transducer signals. Interaction forces generated in whole or in part by secondary molecules associated with the target factor, probe, or both can also be devised and detected by the target factor detection system of the present invention. Examples include target factors that form specifically interacting pairs such as receptor-ligands, antibody-antigens, enzyme-substrate pairs, It is not limited to this.
本発明によるより具体的な認識要素は、プローブ、特に核酸ベースのシグナルトランスデューサーから必要に応じて分離されていても良い。一実施の形態において、このようなシグナルトランスデューサーは少なくとも1個、好ましくは5個以下、そして典型的には1個または2個の連結子(adaptor)を含むが、この連結子は、標的因子との相互作用により認識要素の実質的な全体または少なくとも一部分がプローブから放出されるようにする目的のために含まれている。この目的の代わりに、またはこの目的に加えて、連結子は、プローブを他のプローブ、または他のプローブ構成成分に連結させる目的のために使用されることがあるが、ここで、他のプローブ構成成分は、少なくとも一つの標的因子に必要に応じて結合されている他の認識要素の少なくとも一部を含む。このように認識要素を必要に応じて分離しうる特徴は、種々の長所を提供するだけでなく、本発明の検出システムの有用性を相当広げる。 More specific recognition elements according to the invention may optionally be separated from probes, in particular nucleic acid based signal transducers. In one embodiment, such a signal transducer comprises at least one, preferably no more than five, and typically one or two adapters, which connect the target factor Is included for the purpose of allowing substantially all or at least a portion of the recognition element to be released from the probe upon interaction with the. Instead of or in addition to this purpose, the connector may be used for the purpose of linking the probe to other probes, or other probe components, where other probes The component includes at least a portion of other recognition elements that are optionally bound to at least one target agent. Such a feature that allows the recognition elements to be separated as needed not only provides various advantages, but also significantly broadens the usefulness of the detection system of the present invention.
例えば、認識要素がプローブから分離されない実施形態において、標的因子の認識要素に対する相互作用は、一般的にプローブ、特に核酸ベースのシグナルトランスデューサーに伝えられる相互作用力(すなわち、核酸ハイブリダイゼーション不安定化力)を発生させる。このような実施形態において、標的因子との相互作用により、シグナルトランスデューサーは立体構造を“オフ”ハイブリダイゼーション状態から“オン”ハイブリダイゼーション状態へ変化させるようになる。このようなプローブを、本明細書では“親和性(affinity)”プローブと言う。 For example, in embodiments where the recognition element is not separated from the probe, the interaction of the target agent with the recognition element is generally an interaction force (ie, nucleic acid hybridization destabilization) transmitted to the probe, particularly a nucleic acid-based signal transducer. Force). In such an embodiment, interaction with the target agent causes the signal transducer to change the conformation from an “off” hybridization state to an “on” hybridization state. Such probes are referred to herein as “affinity” probes.
しかしながら、プローブが少なくとも一つの連結子を含む認識要素を有する実施形態では、認識要素が標的因子との相互作用により非可逆的にまたは可逆的に、そして連合した標的因子と共にまたは単独で、プローブから切断(分離)されることができる。プローブが、このような切断可能な連結子(cleavable adaptor)と、この連結子に連合する少なくとも一つの標的因子とを含む実施形態では、プローブからの認識要素の分離が、核酸ベースのシグナルトランスデューサーの立体構造を“オフ”ハイブリダイゼーション状態から“オン”ハイブリダイゼーション状態へ検出可能に変化させる。このようなプローブを、本明細書では“切断性(cleavage)”反応プローブと言う。この実施形態において、標的因子は、“反応誘発因子(reaction inducing agent)”またはこれに類似する言葉で表現される。 However, in embodiments where the probe has a recognition element comprising at least one connector, the recognition element is irreversibly or reversibly by interaction with the target factor, and with the associated target factor or alone from the probe. Can be cut (separated). In embodiments where the probe comprises such a cleavable adaptor and at least one target agent associated with the ligator, separation of the recognition element from the probe may comprise a nucleic acid based signal transducer. The three-dimensional structure of is detected from an “off” hybridization state to an “on” hybridization state. Such probes are referred to herein as “cleavage” reaction probes. In this embodiment, the target factor is expressed in terms of “reaction inducing agent” or similar terms.
さらに他の実施形態において、プローブ連結子(probe adaptor)は、本明細書で不安定化因子と呼ばれるものと好ましくは連合している他の分子(以下、“反応基(reaction group)”とも言う。)と特異的に結合するように構成されている。例えば、仮に、ある特定の連結子が、標的因子(以下、“反応誘発因子”とも言う。)との相互作用により可逆的にまたは非可逆的に反応基をシグナルトランスデューサーと連結させるために使用される場合、このようなプローブは、“第I型”または“第II型”連結性プローブ(Type I or Type II coupling probe)と呼ばれる。このようなプローブに対する不安定化因子の連合(association)は、シグナルトランスデューサーに検出可能な立体構造的変化を誘発させる。しかしながら、他の実施形態では、反応誘発因子の存在によりプローブ連結子の少なくとも一部分が、低反応的または無反応的となり、結果として反応基との連結を減少させたり遮断させるように構成されている。この類型のプローブは、本明細書中で“第II(−)型”連結性プローブ(Type II(−) coupling probe)と呼ばれる。このようなプローブ類型を分類する基準についての詳細は後述される。 In yet other embodiments, the probe adaptor is also referred to as another molecule (hereinafter “reaction group”), preferably associated with what is referred to herein as a destabilizing factor. )) Specifically. For example, if a specific connector is used to reversibly or irreversibly link a reactive group to a signal transducer by interacting with a target factor (hereinafter also referred to as “reaction inducer”). If so, such probes are referred to as "Type I" or "Type II" connectivity probes. Such destabilizing factor association to the probe induces a detectable conformational change in the signal transducer. However, in other embodiments, the presence of a reaction inducer causes at least a portion of the probe connector to become less reactive or non-reactive, resulting in reduced or blocked linkage with reactive groups. . This type of probe is referred to herein as a “Type II (−)” coupling probe. Details of the criteria for classifying such probe types will be described later.
本発明は、望む連結反応を好ましくは誘発したり触媒する“反応誘発因子”と言われるものを利用する場合を含めて多様な連結方式と完全に互換可能である。ある特定の反応誘発因子は、一般的に関心の対象となる標的因子である。大部分の場合において、標的因子は反応基を持っておらず、一般的にプローブに直接連結される。しかしながら、自体的に反応基を含むか、反応基を含むように作製可能な標的因子を使用する場合も、本発明の標的検出システムの適用範囲に含まれる。より一般的に、このような実施形態における望む標的因子と反応基との相互作用は、反応基をもっている標的因子にのみ限定されるわけではない。すなわち、必要に応じて標的因子は反応基を介してプローブに直接または間接的に連結されても良い。 The present invention is fully compatible with a variety of linking schemes, including the use of so-called “reaction inducers” that preferably induce or catalyze the desired ligation reaction. Certain response inducers are generally target factors of interest. In most cases, the target agent has no reactive group and is generally directly linked to the probe. However, the target detection system of the present invention also includes a target agent that itself contains a reactive group or that can be prepared so as to include a reactive group. More generally, the interaction between a desired target factor and a reactive group in such an embodiment is not limited to only a target factor having a reactive group. That is, the target factor may be directly or indirectly linked to the probe via a reactive group as necessary.
本発明は、多種多様な検出方式において使用されることができ、容易に変形可能なプローブを提供することを目的とする。したがって、本発明の核酸ベースのシグナルトランスデューサーの“オフ”と“オン”ハイブリダイゼーション状態が、ある特定のプローブの構造や立体構造と関連づけられるように意図したものでないと強調することは重要である。より具体的に、核酸ベースのシグナルトランスデューサーが、標的因子が存在しないことを表す“オフ”状態である場合、シグナルトランスデューサーは、相異なる(一般的に、2種類の)立体構造のうち、好ましくは実質的に一つの立体構造を好む確率分布を有することになる。核酸ベースのシグナルトランスデューサーが、標的因子が存在することを表す“オン”状態である場合、シグナルトランスデューサーは、他の確率分布に、好ましくは実質的に他の立体構造を好む方向に、検出可能に立体構造的に変化する。特定検出方式の選択は、本発明の使用者らが理解できる様々な変数によって決定されるが、この変数は、検出する標的因子、ラベル方式、選択された特定認識要素、採用されたアッセイ条件、及びこれと関連する考慮点を含む。 It is an object of the present invention to provide a probe that can be used in a wide variety of detection schemes and can be easily deformed. It is therefore important to emphasize that the “off” and “on” hybridization states of the nucleic acid based signal transducers of the present invention are not intended to be related to the structure or conformation of a particular probe. . More specifically, when a nucleic acid-based signal transducer is in an “off” state that indicates the absence of a target agent, the signal transducer is of different (generally two types) conformations, Preferably, it has a probability distribution that favors substantially one steric structure. When the nucleic acid-based signal transducer is in the “on” state, which indicates the presence of the target agent, the signal transducer detects in another probability distribution, preferably in a direction that prefers substantially another conformation. Possible to change in three-dimensional structure. The selection of a specific detection method is determined by various variables that can be understood by the users of the present invention, including the target factor to be detected, the label method, the specific recognition element selected, the assay conditions employed, And related considerations.
標的因子の存在有無によって実質的に二本鎖の構造(二重体)または一本鎖の構造となるシグナルトランスデューサーを使用する実施形態において、後述する非競合的方式のシグナルトランスデューサーが典型的に使用される。さらに、“オフ”ハイブリダイゼーション状態で“実質的に”一つの立体構造を好み、“オン”ハイブリダイゼーション状態で“実質的に”もう一つの立体構造を好むプローブが、多くの場合において一般的に好ましい。
本発明の検出システムを使用した標的因子の検出は、望む標的因子の存在有無を、検出可能な立体構造的変化により表示し、使用者に報知する核酸ベースのシグナルトランスデューサーの能力と密接に関連している。しかし、このような標的因子の検出は、標的因子が存在するか存在しない状態におけるある特定のハイブリダイゼーション構造と関連しているのではない。本発明の検出システムの重要な特徴は、望む標的因子が存在しないときにはプローブの立体構造が検出可能に変化しないということである。
前述した親和性及び反応性プローブを含む本発明によるプローブは、後述のように非競合的方式と競合的検出方式とにさらに区分される。
In an embodiment using a signal transducer that has a substantially double-stranded structure (duplex) or a single-stranded structure depending on the presence or absence of the target factor, a non-competitive signal transducer described below is typically used. used. Furthermore, probes that prefer “substantially” one-dimensional structure in an “off” hybridization state and “substantially” another conformation in an “on” hybridization state are generally common in many cases. preferable.
Detection of a target factor using the detection system of the present invention is closely related to the ability of a nucleic acid based signal transducer to display the presence or absence of a desired target factor by a detectable conformational change and inform the user. is doing. However, detection of such a target factor is not associated with a particular hybridization structure in the presence or absence of the target factor. An important feature of the detection system of the present invention is that the three-dimensional structure of the probe does not change detectably when the desired target agent is not present.
Probes according to the present invention, including the affinity and reactive probes described above, are further divided into a non-competitive method and a competitive detection method, as described below.
本発明の非競合的プローブ検出方式を利用する実施形態において、核酸ベースのシグナルトランスデューサーは、(1)1対の相補的核酸配列、及び絶対的ではないが典型的に(2)少なくとも一つの検出可能なラベルを含む。標的因子の存在をシグナル化するシグナルトランスデューサーの立体構造的変化は、前記相補的核酸配列対間の分子間ハイブリダイゼーションの変化、すなわち、実質的に一本鎖(または、二本鎖)の立体構造から、さらなる二本鎖(または、一本鎖)の立体構造への変化にてプローブシグナルトランスデューサーにより表示される。 In embodiments utilizing the non-competitive probe detection scheme of the present invention, the nucleic acid based signal transducer comprises (1) a pair of complementary nucleic acid sequences, and typically but not necessarily (2) at least one Contains a detectable label. The conformational change of the signal transducer that signals the presence of the target factor is a change in intermolecular hybridization between the pair of complementary nucleic acid sequences, i.e. a substantially single-stranded (or double-stranded) conformation. The change from structure to further double-stranded (or single-stranded) conformation is displayed by the probe signal transducer.
本発明の非競合的プローブ検出方式の他の例では、核酸ベースのシグナルトランスデューサーが好ましくは、少なくとも部分的には自己相補的(self-complimentary)な一本鎖からなることを特徴とする。この種のプローブは、本明細書中で“単分子(unimolecular)”プローブとも呼ばれる。この例において、シグナルトランスデューサーは、標的因子が存在しないときに“オフ”状態にあるようになるが、この状態は、プローブの自己相補的な部分間に実質的な分子内ハイブリダイゼーション(または、切断性プローブまたは第II型(−)切断性プローブの場合には脱ハイブリダイゼーション)が起こることを表す。しかしながら、標的因子と単分子プローブの認識要素との相互作用は、分子内立体構造的変化を引き起こし、シグナルトランスデューサーを“オン”ハイブリダイゼーション状態とするが、この状態は、標的因子の存在を表す指標となり、より具体的に、実質的に一本鎖状態(または、切断性プローブまたは第II(−)型連結性プローブの場合には実質的に二本鎖状態)のプローブが形成されることを表す指標となる。例えば、このような単分子プローブは、相互作用性ラベル、すなわちラベル対でラベルされ、このラベル対は相互に組み合わせられており、少なくとも一つのラベル群が他のラベル群の少なくとも一つの測定可能な特徴を変化させるように構成されるが、単分子プローブのある立体構造においてお互い比較的非常に近接して位置している時にはこのような変化を起こすが、他の立体構造では十分に離れているため、このような変化を起こすことがない。適切に相互作用的なラベルの例は後述する。 In another example of the non-competitive probe detection scheme of the present invention, the nucleic acid based signal transducer is preferably characterized in that it is at least partially composed of self-complimentary single strands. This type of probe is also referred to herein as a “unimolecular” probe. In this example, the signal transducer becomes “off” when no target agent is present, which is a substantial intramolecular hybridization between the self-complementary portions of the probe (or In the case of a cleavable probe or a type II (−) cleavable probe, this indicates that dehybridization occurs. However, the interaction of the target factor with the recognition element of the unimolecular probe causes an intramolecular conformational change that puts the signal transducer in an “on” hybridization state, which indicates the presence of the target factor. As an index, more specifically, a probe in a substantially single-stranded state (or a double-stranded state in the case of a cleavable probe or a type II (-) linking probe) is formed. It becomes an index showing. For example, such a unimolecular probe is labeled with an interactive label, i.e. a label pair, the label pair being combined with each other, at least one label group being at least one measurable of the other label group. Configured to change characteristics, but causes such changes when they are located relatively close together in one conformation of a unimolecular probe, but well separated in other conformations Therefore, such a change will not occur. Examples of appropriately interactive labels are described below.
上述したように、競合的検出方式に使用するための立体構造的に敏感なプローブもまた考案された。
例えば、一実施の形態において、核酸ベースのシグナルトランスデューサーは、本明細書中で“対象(object)”配列と呼ばれるものと、少なくとも二つの相補的配列(“第1”及び“第2”相補配列(complement sequence)とも言う。)とを含むように考案されている。第1及び第2相補配列は、典型的に対象配列(object sequence)の相互に異なるが部分的に重複する部分に、分子間または分子内ハイブリダイゼーションをするように考案されている。対象配列に対して相補的特性を有するこのような重複領域は、第1相補配列及び第2相補配列が対象配列にハイブリダイズするにおいて、特にその重複する配列(overlapping sequence)にハイブリダイズするにおいて、熱力学的競合のための基盤を提供する。
好ましく、少なくとも一つの認識要素が核酸ベースのシグナルトランスデューサーに連合しており、認識要素に対する標的因子の相互作用により相補配列のうち一つ、すなわち第1及び第2相補配列のうち一つが、対象配列にハイブリダイズするのを優先的に遮断(または、促進)するようになり、残り一つの相補配列が対象配列にハイブリダイズするのは、優先的に遮断(または、促進)しなくなる。したがって、本発明の一例において、核酸ベースのシグナルトランスデューサーは、第1(または第2)相補配列が対象配列にハイブリダイズするのを好み、第2(または第1)相補配列が対象配列にハイブリダイズするのを好まない立体構造へ変化することによって、認識要素に連合している標的因子の存在を知らせるようになる。上述の如く、ハイブリダイゼーションは、対象配列上の重複要素(overlapping element)を含むことが好ましい。したがって、本発明の大部分の実施形態において、認識要素は重複領域と近く連合していてはいけなく、そうでないと、本発明のシグナルトランスデューサーの目的とする機能を妨げることになる。
As noted above, conformation sensitive probes have also been devised for use in competitive detection schemes.
For example, in one embodiment, a nucleic acid-based signal transducer has at least two complementary sequences (“first” and “second” complements) and what is referred to herein as an “object” sequence. (Also called a complement sequence). The first and second complementary sequences are typically devised to perform intermolecular or intramolecular hybridization on different but partially overlapping portions of the object sequence. Such overlapping regions having complementary properties to the subject sequence are such that in the first complementary sequence and the second complementary sequence hybridize to the subject sequence, in particular to the overlapping sequence. Provides a basis for thermodynamic competition.
Preferably, at least one recognition element is associated with the nucleic acid-based signal transducer, and one of the complementary sequences, ie one of the first and second complementary sequences, is targeted by the interaction of the target factor with the recognition element Hybridization to the sequence is preferentially blocked (or promoted), and the remaining one complementary sequence is not preferentially blocked (or promoted) to hybridize to the target sequence. Thus, in one example of the invention, the nucleic acid based signal transducer prefers that the first (or second) complementary sequence hybridize to the subject sequence, and the second (or first) complementary sequence hybridizes to the subject sequence. By changing to a three-dimensional structure that does not like soy, the presence of a target factor associated with the recognition element is announced. As described above, the hybridization preferably includes overlapping elements on the subject sequence. Thus, in most embodiments of the present invention, the recognition element must not be closely associated with the overlap region, otherwise it will interfere with the intended function of the signal transducer of the present invention.
したがって、一側面において、本発明は、本明細書に開示するような少なくとも一つのプローブを含む標的検出システムを提供する。一実施の形態において、プローブは、試料内で少なくとも一つの標的因子、好ましくは5個未満、典型的には1個または2個の標的因子を検出するために、検出温度(または、温度範囲)を含む最適化したた条件下で行われるアッセイに特に有用である。特定プローブは、下記の構成成分のうち少なくとも一つ、好ましくは全部を、作動可能に連結された状態に含む:
a)第1対象配列及び第1相補配列を含む核酸配列対を含む少なくとも一つの核酸ベースのシグナルトランスデューサーであって、前記第1対象配列と前記第1相補配列は、それぞれ独立してその長さが約3個ないし約150個のヌクレオチドからなり、相互に実質的に相補的であることから、標的因子が存在しないときには“オフ”ハイブリダイゼーション状態を形成し、標的因子が存在するときには“オン”ハイブリダイゼーション状態を形成する少なくとも一つの核酸ベースのシグナルトランスデューサー;
b)前記核酸ベースのシグナルトランスデューサーに作動可能に連結されており、分析する試料内の少なくとも一つの標的因子と特異的に相互作用する少なくとも一つの認識要素;及び
c)必要に応じて、前記プローブに、特に前記核酸ベースのシグナルトランスデューサーに作動可能に連結されている少なくとも一つの検出可能なラベルであって、前記標的因子の前記プローブに対する、特に前記認識因子に対する相互作用により、前記“オフ”ハイブリダイゼーション状態から前記“オン”ハイブリダイゼーション状態へ立体構造的な変化が起こり、その大きさが前記プローブのシグナルトランスデューサーにより提供される前記“オン”ハイブリダイゼーション状態の量の指標となる特徴的シグナルを発生する前記少なくとも一つの検出可能なラベル。
Accordingly, in one aspect, the present invention provides a target detection system that includes at least one probe as disclosed herein. In one embodiment, the probe detects a detection temperature (or temperature range) in order to detect at least one target agent in the sample, preferably less than 5, typically 1 or 2 target agents. Are particularly useful in assays performed under optimized conditions, including A specific probe comprises at least one, preferably all, of the following components in an operatively linked state:
a) at least one nucleic acid-based signal transducer comprising a nucleic acid sequence pair comprising a first target sequence and a first complementary sequence, wherein the first target sequence and the first complementary sequence are each independently of their length Consists of about 3 to about 150 nucleotides and is substantially complementary to each other, thus forming an “off” hybridization state in the absence of the target factor and “on” in the presence of the target factor. "At least one nucleic acid based signal transducer forming a hybridization state;
b) at least one recognition element operably linked to the nucleic acid-based signal transducer and specifically interacting with at least one target agent in the sample to be analyzed; and c) optionally, At least one detectable label operably linked to a probe, in particular to said nucleic acid based signal transducer, said interaction of said target factor to said probe, in particular to said recognition factor, said "off" A conformational change occurs from the “hybridization state” to the “on” hybridization state, the magnitude of which is indicative of the amount of the “on” hybridization state provided by the probe signal transducer Said at least one detection generating a signal Noh label.
上述したように、本発明の検出システムは、非競合的または競合的検出方式で使用可能なプローブをすべて含む。競合的検出方式が要求される実施形態において、プローブは、少なくとも1対の作動可能に連結された下記の構成成分をさらに含む:
d)前記第1核酸配列対の一部として組み込まれる第2対象配列であって、約3個ないし150個のヌクレオチドを含み、好ましくは前記第1対象配列と連合していることから、約40個未満のヌクレオチドを含み、前記第1及び第2対象配列により定義される重複領域を形成する前記第2対象配列;
e)約3個ないし約150個のヌクレオチドを含む長さの第2相補配列であって、前記第1及び第2相補配列は、前記第1及び第2対象配列間に存在する前記重複領域に対して本質的に完壁に相補的であり、前記第2対象配列と前記第2相補配列は、少なくとも前記重複領域に該当する長さ以上に対して相互に実質的に相補的であるので、前記標的因子が存在しないときには“オフ”ハイブリダイゼーション状態を形成し、前記標的因子が存在するときには“オン”ハイブリダイゼーション状態を形成するのに充分である前記第2相補配列。
As mentioned above, the detection system of the present invention includes all probes that can be used in a non-competitive or competitive detection scheme. In embodiments where a competitive detection scheme is required, the probe further comprises at least one pair of the following operably linked components:
d) a second subject sequence incorporated as part of the first nucleic acid sequence pair, comprising about 3 to 150 nucleotides, preferably associated with the first subject sequence; The second subject sequence comprising less than nucleotides and forming an overlapping region defined by the first and second subject sequences;
e) a second complementary sequence of about 3 to about 150 nucleotides in length, wherein the first and second complementary sequences are located in the overlapping region present between the first and second target sequences. Because the second target sequence and the second complementary sequence are substantially complementary to each other for at least the length corresponding to the overlapping region, The second complementary sequence that is sufficient to form an “off” hybridization state when the target agent is not present and to form an “on” hybridization state when the target agent is present.
第2対象配列及び第2相補配列は、“オフ”状態から“オン”状態への立体構造的変化を容易にするためのものである。標的因子がプローブの核酸ベースのシグナルトランスデューサーと相互作用をする時、プローブ構成方式によって重複領域と第2または第1相補配列との競合的結合が起こるように構成されることから、シグナルトランスデューサーは“オフ”ハイブリダイゼーション状態から立体構造的変化が起こるようになる。標的因子との相互作用により起こる立体構造的変化は、第1相補配列(または、第2相補配列)が第1対象配列(または、第2対象配列)から、特に重複領域から分離されることを熱力学的に十分に好む方向に起こるようになる。したがって、この実施形態において、“オン”ハイブリダイゼーション状態は、第2相補配列(または、第1相補配列)は競合的に結合された状態となり、第1相補配列(または、第2相補配列)は実質的に分離された状態となるものとして表される。 The second target sequence and the second complementary sequence are for facilitating a three-dimensional structural change from the “off” state to the “on” state. The signal transducer is configured such that when the target factor interacts with the nucleic acid-based signal transducer of the probe, the probe construction scheme causes competitive binding between the overlapping region and the second or first complementary sequence. Causes a conformational change to occur from the “off” hybridization state. The conformational change caused by the interaction with the target factor is that the first complementary sequence (or the second complementary sequence) is separated from the first target sequence (or the second target sequence), particularly from the overlapping region. It happens in the direction that you like enough thermodynamically. Therefore, in this embodiment, the “on” hybridization state is such that the second complementary sequence (or first complementary sequence) is competitively bound and the first complementary sequence (or second complementary sequence) is It is expressed as being in a substantially separated state.
本発明の検出システムに対する大部分の実施形態において、核酸ベースのシグナルトランスデューサーの“オン”ハイブリダイゼーション状態は、試験した試料内に標的因子が存在するということを表す指標とされる。認識要素と標的因子との相互作用は、核酸ベースのシグナルトランスデューサーの“オフ”ハイブリダイゼーション状態を“オン”ハイブリダイゼーション状態を好む方向へ検出可能な程度に変化(一般的に、減少)させる。このような立体構造的変化は、検出可能なラベル(存在する場合のみ)により生成された特徴的シグナルの変化(一般的に、増加)に符合する。本発明の親和性プローブと反応性プローブを利用する標的検出システムを使用する一部の実施形態において、核酸ベースのシグナルトランスデューサーにより具現される立体構造的変化は、熱力学的に可逆的である。すなわち、シグナルトランスデューサーの立体構造が試料内に在る標的因子の量によって、与えられた時間の間“オフ”または“オン”ハイブリダイゼーション状態へ相互移動するようになる。 In most embodiments for the detection system of the present invention, the “on” hybridization status of the nucleic acid based signal transducer is an indication that the target agent is present in the sample being tested. The interaction between the recognition element and the target agent changes (generally decreases) the “off” hybridization state of the nucleic acid-based signal transducer to a detectable degree in a direction that favors the “on” hybridization state. Such conformational changes correspond to the characteristic signal changes (generally increased) produced by the detectable label (if present) only. In some embodiments using a target detection system that utilizes an affinity probe and a reactive probe of the present invention, the conformational change embodied by the nucleic acid based signal transducer is thermodynamically reversible. . That is, the three-dimensional structure of the signal transducer moves to the “off” or “on” hybridization state for a given time, depending on the amount of target factor present in the sample.
他の側面において、本発明は、本明細書に開示するように、少なくとも一つの単分子プローブを含む検出システムを提供する。一実施の形態において、当該プローブは、下記の構成成分のうち少なくとも一つ、好ましくは全部を、作動可能に連結した状態に含む:
a)第1対象配列及び第1相補配列を含む一本鎖の核酸配列を含む少なくとも一つの核酸ベースのシグナルトランスデューサーであって、前記第1対象配列及び前記第1相補配列はそれぞれ独立してその長さが約3個ないし約150個のヌクレオチドからなり、相互に実質的に相補的であることから、標的因子が存在しないときには“オフ”ハイブリダイゼーション状態を形成し、標的因子が存在するときには“オン”ハイブリダイゼーション状態を形成する前記少なくとも一つの核酸ベースのシグナルトランスデューサー;
b)前記核酸ベースのシグナルトランスデューサーに作動可能に連結されており、試料内の少なくとも一つの標的因子と特異的に相互作用する少なくとも一つの認識要素;及び c)必要に応じて、前記プローブに、特に前記核酸ベースのシグナルトランスデューサーに作動可能に連結されている少なくとも一つの検出可能なラベルであって、前記標的因子の前記プローブに対する、特に前記認識因子に対する相互作用により、前記“オフ”ハイブリダイゼーション状態から前記“オン”ハイブリダイゼーション状態へ立体構造的変化が起こり、その大きさが前記シグナルトランスデューサーの前記“オン”ハイブリダイゼーション状態の量を表す指標となる特徴的シグナルを発生する前記少なくとも一つの検出可能なラベル。
In another aspect, the present invention provides a detection system comprising at least one unimolecular probe, as disclosed herein. In one embodiment, the probe comprises at least one, preferably all, of the following components in an operatively linked state:
a) at least one nucleic acid-based signal transducer comprising a single-stranded nucleic acid sequence comprising a first subject sequence and a first complementary sequence, wherein the first subject sequence and the first complementary sequence are each independently Its length consists of about 3 to about 150 nucleotides and is substantially complementary to each other, thus forming an “off” hybridization state in the absence of the target factor and in the presence of the target factor. Said at least one nucleic acid based signal transducer forming an "on" hybridization state;
b) at least one recognition element operably linked to the nucleic acid-based signal transducer and specifically interacting with at least one target agent in the sample; and c) optionally, to the probe At least one detectable label operably linked to the nucleic acid based signal transducer, in particular, due to the interaction of the target factor with the probe, in particular with the recognition factor. A conformational change from a hybridization state to the “on” hybridization state occurs, the magnitude of the at least one generating a characteristic signal indicative of the amount of the “on” hybridization state of the signal transducer. Two detectable labels.
競合的検出方式が要求される実施形態では、プローブは、第2対象配列及び第2相補配列からなる少なくとも1対の相補的な核酸配列をさらに含む。
また、本発明は、本明細書に開示される一つ以上のプローブが、少なくとも一つ、好ましくは一つ、二つ、または三つの固体支持体に作動可能に連結された形態の特定形態の標的検出システムを提供する。一実施の形態において、当該プローブは、直接的にまたは一つ以上のリンカー(linker)により、好ましくは固体支持体と固定化したプローブとの間に空間を置き、与えられた固体支持体に共有結合で連結される。好ましい固体支持体の種類は、本発明の属する分野に周知されており、クロマトグラフィー(chromatography)、パンニング(panning)、バイオチップ(biochip)、及び関連の応用分野で使用されるものを含む。
In embodiments where a competitive detection scheme is required, the probe further comprises at least one pair of complementary nucleic acid sequences consisting of a second subject sequence and a second complementary sequence.
The present invention also relates to a specific form of one or more probes disclosed herein operatively linked to at least one, preferably one, two, or three solid supports. A target detection system is provided. In one embodiment, the probe is shared by a given solid support, either directly or by one or more linkers, preferably placing a space between the solid support and the immobilized probe. Connected with a bond. Preferred solid support types are well known in the field of the present invention and include those used in chromatography, panning, biochip, and related applications.
なお、本発明は、プリプローブ(pre-probe)と、これらプリプローブを含むキットを提供する。一実施の形態において、プリプローブは、次の構成成分を、作動可能に連結された(または、作動可能に連結され得る)状態に含む:a)少なくとも一つの前述した核酸ベースのシグナルトランスデューサー、及びb)必要に応じて、少なくとも一つの連結子。
“プリプローブ(pre-probe)”は、本発明による作動可能な親和性プローブまたは反応性プローブに容易に変換されるが、例えば、一つ以上の望む認識要素を、連結子を使用するか使用することなく核酸ベースのシグナルトランスデューサーに共有結合で連結することによって容易に変換される。好ましい本発明のキットは、あらかじめ決定された標的因子特異性を有する望む親和性または反応性プローブへプリプローブを変換させるための手段を含む。
The present invention provides a pre-probe and a kit including these pre-probes. In one embodiment, the pre-probe comprises the following components in an operatively linked (or operatively linked) state: a) at least one of the aforementioned nucleic acid based signal transducers, And b) optionally at least one connector.
A “pre-probe” is easily converted into an operable affinity probe or reactive probe according to the present invention, eg, using one or more desired recognition elements using a ligator or using Easily converted by covalent linkage to a nucleic acid based signal transducer. A preferred kit of the invention comprises a means for converting the preprobe to a desired affinity or reactive probe having a predetermined target factor specificity.
さらに、本発明は、本明細書に開示される標的検出システムを用いたアッセイを提供する。好ましいアッセイは、次に述べるものを含めて非常に多様な標的因子を検出できるように構成される。その例には、薬物(調合薬)等のような化学物質をはじめとして、抗体、受容体、酵素、サイトカイン(cytokine)、毒素(toxin)、ペプチドホルモン(peptide hormone)、成長因子(growth factor)、血液因子(blood factor)、及びこれらの結合性(または、機能性)断片を含んだ類似体のようなアミノ酸配列を検出するためのアッセイが含まれるが、これに限定されない。リン脂質(phospholipid)を含んだ脂質(lipid)、及び生物学的に重要なブドウ糖のような糖類を含んだ炭水化物(carbohydrate)を検出するためのアッセイも含まれる。核酸ベースのシグナルトランスデューサーからラベルされた部分を分離する段階または段階を含まない実施形態では、本明細書に記述される単分子プローブのいずれかを使用することが好ましい。これら方法は、必要に応じて生体外(in vitro)、インサイチュ(in situ)、または生体内(in vivo)で行われることができる。より好ましいアッセイは、一般的に標的因子と連合していないプローブ(または、その構成要素)を除去するための過度な洗浄段階や分離段階を必要としないが、この洗浄または分離段階を行うことによって一部の実施形態では検出システムの性能を改善することもある。 Further, the present invention provides an assay using the target detection system disclosed herein. Preferred assays are configured to detect a wide variety of target factors, including those described below. Examples include chemicals such as drugs (prepared drugs), antibodies, receptors, enzymes, cytokines (cytokine), toxins (toxin), peptide hormones (peptide hormones), growth factors (growth factor) Assays for detecting amino acid sequences such as, but not limited to, blood factors, and analogs containing binding (or functional) fragments thereof. Also included are assays for detecting lipids containing phospholipids and carbohydrates containing biologically important sugars such as glucose. In embodiments that do or do not include a step of separating the labeled portion from the nucleic acid based signal transducer, it is preferred to use any of the single molecule probes described herein. These methods can be performed in vitro, in situ, or in vivo as required. More preferred assays generally do not require undue washing or separation steps to remove probes (or their components) that are not associated with the target agent, but by performing this washing or separation step Some embodiments may improve the performance of the detection system.
本発明の検出システムを使用するのに適しているアッセイは、少なくとも一つの本明細書に開示されるプローブを使用する。一実施の形態において、このような方法は、プローブを分析しようとする試料と接触することを含むが、当該試料は、敏感で信頼性ある検出が必要な少なくとも一つの標的因子を有するか、有していると疑われるか、あるいは、有するようにした試料である。ここで、接触は、標的因子が存在しない時の核酸ベースのシグナルトランスデューサーの測定可能な特徴のような適切な対照群と比較し、プローブに含まれている核酸ベースのシグナルトランスデューサーのハイブリダイゼーション状態に、検出可能な変化があるか確認するための検出方式(例えば、使用されるプローブの種類と検出される標的因子の種類)に見合う環境下で行われる。一部の実施形態において、標的因子を含まない(または、検出不可能な程度の微量を含む)対照群試料を共に実験し、実験しようとする試料の反応結果を対照群試料の反応結果と比較することが有用であることは明らかである。核酸ベースのシグナルトランスデューサーにより生成されるシグナルの大きさは、必要に応じて定量的に、半定量的に、または定性的に測定されることができる。例えば、シグナルトランスデューサーにより表示されるいずれの大きさの検出可能な変化でも、標的因子が試料内に存在することを知らせる指標で定性的に評価されることができる。自動または半自動の試料分析をする製薬的、臨床的または診断的装置において本発明の検出システムが利用される実施形態では、必ずしも対照群試料を共に実験する必要はないということがもう一つの長所である。この例では、標的因子の特定量の存在を出力シグナル(典型的に、シグナルの大きさ)に関連づける標準曲線を作成するための予備実験をするだけでも充分である。 An assay suitable for using the detection system of the present invention uses at least one probe disclosed herein. In one embodiment, such a method includes contacting the probe with a sample to be analyzed, wherein the sample has or has at least one target agent that requires sensitive and reliable detection. It is a sample that is suspected to be or has been included. Here, the contact refers to hybridization of the nucleic acid based signal transducer contained in the probe as compared to an appropriate control group, such as a measurable characteristic of the nucleic acid based signal transducer in the absence of the target agent. It is performed in an environment commensurate with a detection method (for example, the type of probe used and the type of target factor to be detected) for confirming whether there is a detectable change in the state. In some embodiments, control samples that do not contain the target agent (or contain undetectable trace amounts) are tested together and the reaction results of the sample to be tested are compared to the reaction results of the control sample Obviously it is useful to do. The magnitude of the signal generated by the nucleic acid based signal transducer can be measured quantitatively, semi-quantitatively or qualitatively as needed. For example, a detectable change of any magnitude displayed by the signal transducer can be qualitatively evaluated with an indicator that informs that the target agent is present in the sample. In an embodiment where the detection system of the present invention is utilized in a pharmaceutical, clinical or diagnostic device that performs automated or semi-automated sample analysis, it is another advantage that the control sample need not necessarily be run together. is there. In this example, it is sufficient to do a preliminary experiment to create a standard curve that relates the presence of a specific amount of the target agent to the output signal (typically the magnitude of the signal).
したがって、本発明は、試験する試料内に存在するか、存在すると疑われるか、あるいは、その試料に含まれるように作られた少なくとも一つの標的因子を検出するために本発明の検出システムを利用する方法も提供する。一実施の形態において、このような方法は、本明細書に開示される少なくとも一つのプローブを、少なくとも一つの標的因子と連合させるのに充分な条件下でプローブと接触させることを含む。この接触は、核酸ベースのシグナルトランスデューサーが“オフ”から“オン”ハイブリダイゼーション状態へ立体構造的に容易に変化するようにする。シグナルトランスデューサーの“オン”ハイブリダイゼーション状態の存在は、一つ以上の標的因子が存在するということを表す指標として使用されることができる。好ましくは、シグナルトランスデューサーは、“オン”ハイブリダイゼーション状態から発生したシグナルを一つまたはそれ以上の検出機器に出力するが、この検出機器は、好ましくは、未来に分析するためにシグナルを貯蔵するか、出力シグナルを使用者に実時間で報知するか、あるいは、これら両動作を全部遂行するように構成されたものである。
なお、本発明は、標的因子と認識要素の相互作用に強い影響を与える広い範囲の分子を検出できるアッセイを含む。これら分子は、前記相互作用を減少または除去するもの(“阻害剤(inhibitor)”)を含む。あるいは、標的因子と認識要素との相互作用を増強させる分子(“増強剤(enhancer)”)を、本発明の方法を用いて検出することも十分に可能である。
Thus, the present invention utilizes the detection system of the present invention to detect at least one target agent that is present, suspected of being present, or made to be included in the sample being tested. It also provides a way to do this. In one embodiment, such a method comprises contacting at least one probe disclosed herein with a probe under conditions sufficient to associate with at least one target agent. This contact allows the nucleic acid based signal transducer to easily change in conformation from an “off” to an “on” hybridization state. The presence of the “on” hybridization state of the signal transducer can be used as an indicator that one or more target factors are present. Preferably, the signal transducer outputs the signal generated from the “on” hybridization state to one or more detection devices, which preferably store the signals for future analysis. Alternatively, the output signal is notified to the user in real time, or both of these operations are performed.
The present invention includes an assay that can detect a wide range of molecules that strongly influence the interaction between a target factor and a recognition element. These molecules include those that reduce or eliminate the interaction (“inhibitors”). Alternatively, a molecule that enhances the interaction between the target agent and the recognition element (“enhancer”) can be well detected using the methods of the present invention.
これら方法のうち一つは、阻害剤(または、増強剤)として知られているか疑われるか、あるいは、検出システムに添加される間または以降に阻害剤(または、増強剤)に変形しうる一つまたはそれ以上の候補化合物を、本発明の検出システムに添加する段階を含む方法である。この標的検出システムへの添加段階の好ましい方式は、望むプローブに含まれた認識要素と標的因子との相互作用を減少させたり増強させることを可能にする方式である。この方法は、選択されたプローブが、プローブの立体構造を他のハイブリダイゼーション状態へ変化させるか否かを検出する段階をさらに含む。全的ではないが一般的に、このような変化は、水、緩衝溶液、及びその類似体のような適切な対照群試料に対比して測定される。候補化合物の存在下におけるプローブの立体構造的変化の検出は、標的検出システムに阻害剤や増強剤が存在または非存在することを表す指標として使用されることができる。 One of these methods is one known or suspected as an inhibitor (or enhancer) or can be transformed into an inhibitor (or enhancer) during or after addition to the detection system. A method comprising the step of adding one or more candidate compounds to the detection system of the present invention. The preferred mode of this addition step to the target detection system is that which allows the interaction between the recognition element contained in the desired probe and the target factor to be reduced or enhanced. The method further comprises detecting whether the selected probe changes the probe conformation to another hybridization state. Generally, but not entirely, such changes are measured relative to appropriate control group samples such as water, buffer solutions, and analogs thereof. Detection of the conformational change of the probe in the presence of the candidate compound can be used as an indicator to indicate the presence or absence of an inhibitor or enhancer in the target detection system.
本明細書に開示される大部分のプローブにおける立体構造的変化の割合は、標準化した分析原理を適用することによって測定可能である。本発明は、核酸ベースのシグナルトランスデューサーにより報知される立体構造的変化の割合における増加または減少有無を検出することによって、望む標的因子の存在または非存在を検出する方法に関する実施形態を含むように構成された。
本発明による好ましいプローブは、本明細書で“二元性立体構造(dual conformation)”プローブとも言われるが、これは、核酸ベースのシグナルトランスデューサーが“オフ”と“オン”ハイブリダイゼーション状態へ相互に転換可能であることを意味する。当該のプローブは、本発明の属する技術分野で公知された他の種類のプローブに比べ、多くの側面で多様な長所を有する。
例えば、シグナルトランスデューサー部分がプローブに分子的物質として一体として構成されているので、シグナルを測定したり発生させる上で一般的な蛍光測定機(fluorometer)や発光測定機(luminometer)以外の大規模の機器や装置を必要としない。また、本発明の二元性立体構造プローブは、例えば、ELISAまたは固定化したプローブを使用する種類の方法と比較し、検出段階が非常に単純化する均一アッセイ(homogeneous assay)に使用可能となるように適宜構成されることができる。
The rate of conformational change in most probes disclosed herein can be measured by applying standardized analytical principles. The present invention includes an embodiment relating to a method for detecting the presence or absence of a desired target agent by detecting the presence or absence of an increase or decrease in the rate of conformational change signaled by a nucleic acid based signal transducer. Configured.
Preferred probes according to the present invention are also referred to herein as “dual conformation” probes, which allow nucleic acid-based signal transducers to interact between “off” and “on” hybridization states. It is possible to convert to The probe has various advantages in many aspects as compared with other types of probes known in the technical field to which the present invention belongs.
For example, since the signal transducer part is integrated with the probe as a molecular substance, a large scale other than a general fluorometer or luminometer is used to measure and generate signals. No equipment or equipment is required. In addition, the dual conformation probe of the present invention can be used in a homogeneous assay that greatly simplifies the detection step as compared with, for example, methods using ELISA or immobilized probes. It can be configured as appropriate.
本発明は、多種多様なの認識要素に接合された核酸のハイブリッド(nucleic acid hybrid)を利用する新規の二元性立体構造プローブを開示する。本発明によるプローブは、プローブに接合されている認識要素と標的因子との相互作用に敏感に反応してハイブリダイズした状態(hybridized state)から解離した状態(dissociated state)へ、またはその逆に前記核酸のハイブリッドが立体構造的変化を起こすように考案されている。本発明のプローブは、核酸のハイブリッドを一つのシグナルトランスデューサーの構成単位として使用するので、後述するように、多様な周知のラベル方法を本発明に適用することができる。 The present invention discloses novel dual conformation probes that utilize nucleic acid hybrids conjugated to a wide variety of recognition elements. The probe according to the present invention is sensitive to the interaction between a recognition element conjugated to the probe and a target factor, from a hybridized state to a dissociated state, or vice versa. Nucleic acid hybrids have been devised to cause conformational changes. Since the probe of the present invention uses a nucleic acid hybrid as a constituent unit of one signal transducer, various well-known labeling methods can be applied to the present invention as described later.
本発明による特定のプローブはその他の長所を提供する。例えば、本発明のプローブは、認識要素を変えることによって多様な化学的、生化学的、そして生物学的標的因子の検出に使用することができる。例えば、標的受容体因子(target receptor agent)または標的リガンド(target ligand)を検出するための親和性プローブを構成するために受容体因子に特異的に結合しうるリガンドを認識要素として使用することができ、本明細書では、このような認識要素をより具体的に“プローブリガンド(probe ligand)”と言う。切断反応(cleavage reaction)、連結反応(coupling reaction)、及び修飾反応(modification reaction)に触媒作用を及ぼす酵素のような反応誘発因子(reaction-inducing agent)を検出するために、基質(substrate)または反応部位(reaction site)を認識要素として使用することもできるので、本明細書では、このような認識要素をより具体的に“プローブ基質(probe substrate)”とも言う。したがって、“認識要素(recognition element)”が意味するところが、プローブの構成内容によって区分されるということは明らかである。後で詳しく説明されるが、本発明は、化学的且つ生化学的アッセイに必要な選択性と敏感性を有する、多様なラベルされた二元性立体構造プローブを提供する。 Certain probes according to the present invention provide other advantages. For example, the probes of the present invention can be used to detect a variety of chemical, biochemical and biological target agents by changing the recognition element. For example, using a ligand that can specifically bind to a receptor factor as a recognition element to construct an affinity probe to detect a target receptor agent or target ligand. In this specification, such a recognition element is more specifically referred to as a “probe ligand”. To detect reaction-inducing agents such as enzymes that catalyze cleavage, coupling, and modification reactions, a substrate or Since a reaction site can also be used as a recognition element, such a recognition element is also more specifically referred to herein as a “probe substrate”. Therefore, it is clear that what is meant by “recognition element” is classified according to the configuration of the probe. As will be described in detail later, the present invention provides a variety of labeled dual conformation probes that have the selectivity and sensitivity required for chemical and biochemical assays.
上にも述べたように、本発明の標的検出システムは、容易に変形されて用いられ、よって、一つまたはそれ以上の異なるラベル方式を組み合わせて用いられることができる。やはり上述のように、本発明による大部分のプローブは、“必要において(optionally)”ラベルされているが、これは、標的システムが本発明の検出可能にラベルされた状態のプローブと常に関連しているのではないということを意味する。
例えば、一実施の形態において、本明細書に記述された標的検出システムは、よく定型化されているβ−ガラクトシダーゼレポーターシステム(beta-galactosidase reporter system)のような周知のシグナル増幅技術と互換して使用可能である。当該システムの一つは、検出可能なシグナルを生成するために酵素供与体(enzyme donor)-酵素受納体(enzyme acceptor)対を使用する(例:Comoglio,S. and Celada,F.(1976);Gonnelli,M.et al.(1981);Henderson,D.R. U.S.Pat.No.4,708,929)。本発明の標的検出システムは、このような技術を使用できるように適切に変形される。これは、例えば、前記酵素供与体-受納体対を相互作用性ラベル対として含む本発明によるプローブを製作することによって可能になる。好ましい使用において、プローブに含まれた相互作用性ラベル対は、プローブ、より具体的には核酸ベースのシグナルトランスデューサーにより生成されたシグナルを好ましく増幅する。
As mentioned above, the target detection system of the present invention can be easily modified and thus used in combination with one or more different labeling schemes. As also noted above, most probes according to the present invention are labeled “optionally”, but this is always associated with the detectably labeled probe of the present invention. It means not.
For example, in one embodiment, the target detection system described herein is compatible with well-known signal amplification techniques such as the well-stabilized beta-galactosidase reporter system. It can be used. One such system uses an enzyme donor-enzyme acceptor pair to generate a detectable signal (eg, Comoglio, S. and Celada, F. (1976 Gonnelli, M. et al. (1981); Henderson, DRUSPat. No. 4, 708, 929). The target detection system of the present invention is suitably modified to allow such techniques to be used. This is made possible, for example, by making a probe according to the invention comprising the enzyme donor-acceptor pair as an interactive label pair. In preferred use, the interactive label pair contained in the probe preferably amplifies the signal generated by the probe, more specifically a nucleic acid based signal transducer.
その代わりに、あるいは、それに加えて、本発明の前記標的検出システムは、標準化した重合酵素連鎖反応(polymerase chain reaction、PCR)(または、重合酵素反応(polymerization reaction))増幅方式と互換して使用されることができる。一実施の形態において、本明細書に記述されたほとんど大部分の本発明によるプローブは、核酸複製鋳型(nucleic acid replication template)として使用可能な一つまたはそれ以上の配列を含むように構成されることができる。より具体的には、上に述べた対象配列及び相補配列(第1、第2、または両者)は、核酸複製の鋳型として使用可能な配列を含むように容易に変形される。本発明のプローブの、特に核酸ベースのシグナルトランスデューサーの立体構造的に敏感なハイブリダイゼーション状態に主として依存してPCR反応(または、重合酵素反応)が起こるようにし、また、増幅による産物が生成されるようにするために、重合酵素やこれに関連する酵素を使用することができる。これによる増幅産物の存在または重合反応反応物の量の減少、またはこの両者は、関心の対象となる試料内に標的因子が存在するか否かを表す指標となりうる。
本発明のその他の長所及び特徴は後述される。
Alternatively or in addition, the target detection system of the present invention is used interchangeably with a standardized polymerase chain reaction (PCR) (or polymerization reaction) amplification method. Can be done. In one embodiment, most of the probes according to the invention described herein are configured to contain one or more sequences that can be used as a nucleic acid replication template. be able to. More specifically, the subject sequence and complementary sequence (first, second, or both) described above are readily modified to include a sequence that can be used as a template for nucleic acid replication. The PCR reaction (or polymerization enzyme reaction) takes place mainly depending on the conformation sensitive hybridization state of the probe of the present invention, particularly of the nucleic acid based signal transducer, and the product by amplification is generated. In order to achieve this, a polymerization enzyme or an enzyme related thereto can be used. The presence of the amplification product and / or the decrease in the amount of the polymerization reaction reactant due to this can be an indicator of whether or not the target factor is present in the sample of interest.
Other advantages and features of the invention are described below.
上述の如く、本発明は、本明細書に開示されたような一つまたは一つ以上が組み合わせられた立体構造的に敏感なプローブを含む標的検出システムを提供する。本発明による好ましいプローブは、一つまたはそれ以上の標的因子の存在または非存在を報知しうる少なくとも一つの核酸ベースのシグナルトランスデューサーを含む。標的検出システムは、自然的に存在する標的因子をはじめとして、遺伝子組み換え物を含んだ合成された(synthetic)または半合成された(semi-synthetic)多くの標的因子を検出するのに非常に有用であるが、その例は、受容体因子(receptor agent)、リガンド(ligand)、環境毒素(environmental toxin)、薬物(drug)、及び反応誘発因子(例えば、酵素のような触媒構成物)を含むが、これに限定されない。また、本発明は、本発明による一つまたはそれ以上のプローブ(時には、プリプローブ)を使って標的因子を検出する多様なアッセイとキットを提供する。本発明の標的検出システムは、標的因子(または、その阻害剤及び増強剤)を検出したり、必要に応じて確認しうるように考案されたアッセイ、特にスクリーニングにおいて特に有用である。 As described above, the present invention provides a target detection system that includes one or more combined conformationally sensitive probes as disclosed herein. Preferred probes according to the present invention include at least one nucleic acid based signal transducer that can report the presence or absence of one or more target factors. The target detection system is very useful for detecting many synthetic or semi-synthetic target factors including genetically modified products, including naturally occurring target factors However, examples include receptor agents, ligands, environmental toxins, drugs, and reaction inducers (e.g., catalytic components such as enzymes). However, it is not limited to this. The present invention also provides a variety of assays and kits for detecting target agents using one or more probes (sometimes preprobes) according to the present invention. The target detection system of the present invention is particularly useful in assays, particularly screening, designed to detect a target factor (or an inhibitor and an enhancer thereof) and confirm it as necessary.
“標的検出システム(target detection system)”という用語は、少なくとも一つの、好ましくは5個未満の、そして典型的には1個、2個、または3個の本明細書に開示されるプローブが、一つまたはそれ以上の使用を助けるための他の構成要素と組み合わせられているのを意味する。追加の構成要素は、通常、プローブを使用するための塩水、緩衝溶液、水またはその類似体のような適切な水溶液培地を含む。また、本発明の一部の実施形態において、当該の構成要素は、一つまたはそれ以上のプローブと作動可能に連結された固体支持体を含むことができる。固体支持体の例には、クロマトグラフィー(chromatography)、パンニング(panning)、及び/またはバイオチップなどの多くの応用において適するものと知られた紙、樹脂(resin)、プラスチック、高分子、金属、金属酸化物、ガラス、シリコン、シリコン酸化物、ビーズ(bead)またはスフィアー(sphere)、ディップスティック(dipstick)、容器(well)、膜(membrane)などを含む。追加的に必要と予想される構成要素は、標的検出システムの使用を簡便にすることに役立つ安定化剤(stabilizer)、添加剤(additive)、防腐剤(preservative)及びこれらの類似体を含み、血清アルブミン(serum albumin)、アジ化ナトリウム(sodium azide)、グリコール(glycol)及びその類似体も含むが、これに限定されない。必要に応じて、標的検出システムは、標的検出システム、特に核酸ベースのシグナルトランスデューサーにより生成されるシグナルを、貯蔵された資料の形態にまたは実時間で収集し報知しうるコンピュータと連携した装置のような適切な検出器やこれに関連する機器と作動可能に連結または結合されていることができる。 The term “target detection system” refers to at least one, preferably less than 5, and typically 1, 2, or 3 probes disclosed herein, Means combined with other components to aid one or more uses. The additional components usually include a suitable aqueous medium such as saline, buffered solution, water or analogs for using the probe. Also, in some embodiments of the invention, the component can include a solid support that is operatively coupled to one or more probes. Examples of solid supports include papers, resins, plastics, polymers, metals known to be suitable in many applications such as chromatography, panning, and / or biochips, Including metal oxide, glass, silicon, silicon oxide, beads or spheres, dipsticks, wells, membranes and the like. Additional components that are expected to be needed include stabilizers, additives, preservatives, and analogs thereof that help simplify the use of the target detection system, Serum albumin, sodium azide, glycol and analogs thereof are also included, but are not limited thereto. Optionally, the target detection system is a device in conjunction with a computer that can collect and report the signal generated by the target detection system, particularly a nucleic acid based signal transducer, in the form of stored material or in real time. It can be operably linked or coupled to a suitable detector such as this and related equipment.
複数の形態を含む“核酸ベースのシグナルトランスデューサー(nucleic acid based signal transducer)”または“シグナルトランスデューサー(signal transducer)”という用語は、一つまたはそれ以上の標的因子の存在(または、非存在)に応じて好ましく反応する、立体構造的に敏感でかつ感応性を有する本明細書に記述されたプローブの一部を意味する。特定シグナルトランスデューサーは、一般的に核酸配列、例えば、DNA、RNA、またはこれらの組み合わせを含むが、非ヌクレオチド配列(non-nucleotide sequence)及び特にヌクレオチド類似体(nucleotide analogue)、例えば、アデノシン一リン酸(adenosine mono-phosphate)、チミジン一リン酸(thymidine mono-phosphate)、グアノシン一リン酸(guanosine mono-phosphate)、シチジン一リン酸(cytidine mono-phosphate)、及びウリジン一リン酸(uridine mono-phosphate)のチオ-(thio-)、アミノアルリ-(aminoally-)、及びメチル-(methyl-)誘導体;イノシン一リン酸(inosine mono-phosphate)、キュェオシン一リン酸(queuosine mono-phosphate)、ワイブトシン一リン酸(wybutosine mono-phosphate)、及びプソイドウリジン一リン酸(pseudouridine mono-phosphates);及び、これらの他の誘導体を含むことができる。一つまたはそれ以上の放射性同位元素ラベルヌクレオチド(radionucleotide)、例えば、3H、32P、33P、35S、または125Iでラベルされたヌクレオチドを含む核酸ベースのシグナルトランスデューサーも本発明に含まれる。本発明によるシグナルトランスデューサーは、一本鎖、二本鎖、またはこれらの組み合わせからなることができ、典型的に約250個未満の塩基対、好ましく約150個未満の塩基対、より好ましくは、約3個乃至約100個の塩基対を有する。 The term “nucleic acid based signal transducer” or “signal transducer”, including multiple forms, is the presence (or absence) of one or more target factors Means a portion of the probes described herein that are conformationally sensitive and sensitive, which react favorably depending on. Specific signal transducers generally comprise a nucleic acid sequence such as DNA, RNA, or combinations thereof, but non-nucleotide sequences and especially nucleotide analogues such as adenosine monophosphate. Acid (adenosine mono-phosphate), thymidine mono-phosphate, guanosine mono-phosphate, cytidine mono-phosphate, and uridine mono-phosphate thio-, aminoally-, and methyl- derivatives of phosphate; inosine mono-phosphate, queuosine mono-phosphate, wibutosin mono Phosphoric acid (wybutosine mono-phosphate) and pseudouridine monophosphate (pseudouridine mono-phosphates); and other derivatives thereof can be included. One or more radioisotopes label nucleotides (radionucleotide), for example, also included in the present invention 3 H, 32 P, 33 P , 35 S , or nucleic acid based signal transducer comprising a labeled nucleotide in 125 I, It is. A signal transducer according to the present invention can consist of single strands, double strands, or combinations thereof, typically less than about 250 base pairs, preferably less than about 150 base pairs, more preferably It has about 3 to about 100 base pairs.
本発明による大部分のプローブは、一般に、DNA(deoxyribonucleic acid)、RNA(ribonucleic acid)、またはDNAとRNAとの混合物からなる核酸配列を含む。この核酸は、本発明の目的のために塩基がない無塩基ヌクレオチド(abasic nucleotide)、及び追加の化学部分が連結されたヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチド間の連結は、PNA(peptide nucleic acid)に在るペプチド結合のようにホスホジエステル結合(phophodiester bond)でない結合もある。修飾されたヌクレオチド間連結は、本発明の属する分野でよく知られているが、メチルリン酸(methylphosphonates)、ポスチオリン酸(phosphorothioates)、ジメチルリン酸(phosphorodithionates)、ホスホロアミダイト(phosphoroamidites)、及びリン酸エステル(phosphate ester)連結を含む。リン酸基のない連結(dephospho-linkages)も知られているが、これは、シロキサン(siloxane)、カーボネート(carbonate)、カルボキシルメチルエステル(carboxylmethyl ester)、アセトアミデート(acetamidate)、カバーメート(carbamate)、及びチオエーテル(thioether)連結を含む。プラスチックDNA(plastic DNA)、例えば、N-ビニル(N-vinyl)、メタクリロキシエチル(methacryloxyethyl)、メタクリルアミド(methacrylamide)、またはエチレンイミン(ethyleneimine)ヌクレオチド間連結を有するDNAも使用することができる。これは、例えば、Uhlmann and Peyman(1990)を参照されたい。PNAは、ヌクレアーゼ(nuclease)による分解に抵抗性があり、自然の核酸よりも強いハイブリダイズした二重鎖(hybridized duplex)を形成するので、特に有用であり、例えば、Orum et al.(1993)及びEgholm,M.et al.(1993)を参照されたい。さらに、これと関連する公知は、米国特許第5,925,517号を参照されたい。 Most probes according to the present invention generally comprise a nucleic acid sequence consisting of DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), or a mixture of DNA and RNA. The nucleic acid can include abasic nucleotides without bases for the purposes of the present invention, and nucleotides linked to additional chemical moieties. Linkage between nucleotides may be a bond that is not a phosphodiester bond, such as a peptide bond in PNA (peptide nucleic acid). Modified internucleotide linkages are well known in the field of the present invention, but include methylphosphonates, phosphorothioates, phosphorodithionates, phosphoramidites, and phosphates. Includes phosphate ester linkages. Dephospho-linkages are also known, which are siloxanes, carbonates, carboxylmethyl esters, acetamidates, carbamates. ), And thioether linkages. Plastic DNA, such as N-vinyl, methacryloxyethyl, methacrylamide, or ethyleneimine internucleotide linkages can also be used. See, for example, Uhlmann and Peyman (1990). PNA is particularly useful because it is resistant to degradation by nucleases and forms a hybridized duplex that is stronger than natural nucleic acids, eg, Orum et al. (1993). And Egholm, M. et al. (1993). In addition, see US Pat. No. 5,925,517 for related information.
上述の如く、好ましい核酸ベースのシグナルトランスデューサーは、少なくとも一つの標的因子(例えば、1個、2個、または3個の標的因子)の存在、非存在、またはある実施形態ではその量の変化に対して立体構造的に敏感であり、感応性を示す。例えば、本明細書に開示されたシグナルトランスデューサーは“オフ”ハイブリダイゼーション状態から“オン”ハイブリダイゼーション状態へ検出可能に立体構造が変化するように考案されている。しかし、大部分の核酸ベースのシグナルトランスデューサーは、“可逆的”であるので、シグナルトランスデューサーがその立体構造を“オン”ハイブリダイゼーション状態から“オフ”ハイブリダイゼーション状態へ検出可能に変化させる必要がある検出方式にも使用可能である。 As noted above, preferred nucleic acid-based signal transducers are sensitive to the presence, absence, or in some embodiments, the amount of at least one target factor (eg, one, two, or three target factors). In contrast, it is three-dimensionally sensitive and sensitive. For example, the signal transducers disclosed herein are devised such that the conformation changes detectably from an “off” hybridization state to an “on” hybridization state. However, since most nucleic acid-based signal transducers are “reversible”, the signal transducer needs to detectably change its conformation from an “on” hybridization state to an “off” hybridization state. It can also be used for certain detection schemes.
図1乃至図22は、特定核酸ベースのシグナルトランスデューサーを含む様々な特定プローブを示す図である。本発明のシグナルトランスデューサーが、標的因子が存在するときに、“オフ”ハイブリダイゼーション状態から“オン”ハイブリダイゼーション状態へ検出可能に立体構造を変化することを示す。 FIGS. 1-22 show various specific probes including specific nucleic acid based signal transducers. The signal transducer of the present invention is shown to detectably change conformation from an “off” hybridization state to an “on” hybridization state when a target agent is present.
なお、上述の如く、本発明は、下記の構成成分のうち少なくとも一つ、好ましくは全部を作動可能に連結された状態に含む:
a)第1対象配列及び第1相補配列を含む核酸配列対からなる少なくとも一つ(好ましくは、5個未満、典型的には1個または2個)の核酸ベースのシグナルトランスデューサーであって、前記第1対象配列及び第1相補配列は、それぞれ独立してその長さが約3個乃至約150個、好ましくは、約4個乃至約100個、より好ましくは、約4個乃至50個のヌクレオチドからなり、相互に実質的に(好ましくは、少なくとも80%、90%、またはそれ以上の長さに対して)相補的なので、標的因子が存在しないときには“オフ”ハイブリダイゼーション状態を形成し、標的因子が存在するときには“オン”ハイブリダイゼーション状態を形成する前記少なくとも一つの核酸ベースのシグナルトランスデューサー;
b)前記核酸ベースのシグナルトランスデューサーに作動可能に連結された少なくとも一つの認識要素であって、分析する試料内の少なくとも一つの標的因子と特異的に相互作用する前記少なくとも一つの認識要素;及び
c)必要に応じて、前記プローブに、特に前記核酸ベースのシグナルトランスデューサーに作動可能に連結されている少なくとも一つの検出可能なラベルであって、前記標的因子の前記プローブ、特に前記認識因子に対する相互作用により、“オフ”ハイブリダイゼーション状態から“オン”ハイブリダイゼーション状態へ立体構造的変化が起こり、その大きさが前記プローブのシグナルトランスデューサーにより提供される“オン”ハイブリダイゼーション状態の量の指標となる特徴的シグナルを生成する前記少なくとも一つの検出可能なラベル。
As described above, the present invention includes at least one, preferably all of the following components in an operatively connected state:
a) at least one (preferably less than 5, typically 1 or 2) nucleic acid based signal transducer consisting of a nucleic acid sequence pair comprising a first subject sequence and a first complementary sequence comprising: Each of the first target sequence and the first complementary sequence independently has a length of about 3 to about 150, preferably about 4 to about 100, more preferably about 4 to 50. Consisting of nucleotides and being substantially complementary to each other (preferably for a length of at least 80%, 90%, or more), thus forming an “off” hybridization state in the absence of the target agent, Said at least one nucleic acid-based signal transducer that forms an "on" hybridization state when a target agent is present;
b) at least one recognition element operably linked to the nucleic acid based signal transducer, wherein the at least one recognition element specifically interacts with at least one target agent in the sample to be analyzed; c) optionally, at least one detectable label operably linked to said probe, in particular to said nucleic acid based signal transducer, said probe of said target factor, in particular to said recognition factor The interaction causes a conformational change from an “off” hybridization state to an “on” hybridization state, the magnitude of which is an indication of the amount of “on” hybridization state provided by the probe signal transducer. Said at least producing a characteristic signal One of the detectable label.
“作動可能に連結された(operably linked)”、“作動可能に連合した(operably associated)”という用語は、標的検出システムの一つまたはそれ以上の構成要素が作動できる状態に(すなわち、機能的に)一つまたはそれ以上の他の構成要素に連結されているということを意味する。より具体的には、標的検出システムの一つまたはそれ以上の構成要素が共有結合で連結されている実施形態において、連合(association)は、炭素-炭素結合(carbon-carbon bonding)、炭素-酸素結合(carbon-oxygen bonding)、ホスホジエステル結合(phosphodiester bonding)、ペプチド結合(peptide bonding)などを含む。しかし、他の実施形態では、一つまたはそれ以上の構成要素が水素結合(hydrogen bonding)、塩橋(salt bridge)、イオン性引力(ionic attraction)及びこれに類似するもの等により非共有結合的に連結されることができる。一部の構成要素が共有結合で連結され、残りは、非共有結合的に連結された標的検出システムも、本発明の範囲に含まれる。 The terms “operably linked” and “operably associated” are used to indicate that one or more components of a target detection system are operational (ie, functionally Means to be linked to one or more other components. More specifically, in embodiments in which one or more components of the target detection system are covalently linked, the association is carbon-carbon bonding, carbon-oxygen. Including carbon-oxygen bonding, phosphodiester bonding, peptide bonding, and the like. However, in other embodiments, one or more components may be non-covalent, such as by hydrogen bonding, salt bridge, ionic attraction, and the like. Can be linked to. Target detection systems in which some components are covalently linked and the rest are non-covalently linked are also within the scope of the present invention.
一つまたはそれ以上の標的検出システムの構成要素が作動可能に連結されている実施形態において、このような連結の特徴が、立体構造的状態及びプローブ方式のような因子に強く影響を受けるということは明らかである。例えば、1対の相補的な核酸配列が非共有結合的に連結されている場合、例えば、水素結合によりハイブリダイズし、ハイブリダイズした立体構造となる場合のような本発明の実施形態において、当該核酸配列は、お互い空間的に離れているか、または解離した立体構造において相互に分離されていることができる。一つまたはそれ以上のインターカレート染色剤(intercalating dye)を検出可能なラベルとして使用する本発明の他の例では、当該ラベルが、ハイブリダイズした立体構造(hybridized conformation)または二重体(duplex)には非共有結合的に連結(または連合)されるが、解離した立体構造には連結されなくなる。さらに他の実施形態では、不安定化因子が第I型、第II型、または第II(−)型“連結性(coupling)”プローブに、認識要素の一部分として連結されることができる。この例において、不安定化因子は最初にはプローブから分離されているが、望む連結反応が起こった後にはプローブに共有結合によりまたは非共有結合的に連結される。同様に、“切断性(cleavage)”プローブでは最初には連結された状態にあった不安定化因子が、標的反応誘発因子との相互作用によりプローブから分離される。 In embodiments in which one or more target detection system components are operably coupled, the characteristics of such coupling are strongly influenced by factors such as conformational state and probe type. Is clear. For example, in the embodiment of the present invention where a pair of complementary nucleic acid sequences are non-covalently linked, for example, when hybridized by hydrogen bonding to form a hybrid three-dimensional structure, Nucleic acid sequences can be spatially separated from one another or separated from one another in dissociated conformations. In other examples of the invention using one or more intercalating dyes as a detectable label, the label may be hybridized conformation or duplex. Are non-covalently linked (or associated) but are no longer linked to the dissociated conformation. In still other embodiments, the destabilizing factor can be coupled to a Type I, Type II, or Type II (−) “coupling” probe as part of a recognition element. In this example, the destabilizing factor is initially separated from the probe, but is covalently or non-covalently linked to the probe after the desired ligation reaction has occurred. Similarly, destabilizing factors that were initially linked in a “cleavage” probe are separated from the probe by interaction with the target reaction inducer.
本明細書に使用されるように、“相補的配列(complementary sequence)”という用語、または“相補的プローブ(complementary probe)”のようにこれと関連する用語は、ある核酸配列または部分配列(subsequence)に特異的相補性をもってハイブリダイズし、一般的にDNAまたはRNAからなる亜構成単位配列(subunit sequence)として定義される。
相補率(percent complementarity)は、一般化した実験過程により、または、好ましくはBLAST及びこれと関連しているプログラムのような適切なコンピュータソフトウェアプログラムを使用することによって容易に決定されることができる。BLASTプログラムの使用と関連した公知は、米国バイオテクノロジー情報センター(United States National Center for Biotechnology Information:NCBI)で見つけることができる。“実質的に相補的な(substantially complementary)”という用語は、少なくとも80%、好ましくは90%またはそれ以上に相補的であることを意味する。
As used herein, the term “complementary sequence” or related terms such as “complementary probe” refers to a nucleic acid sequence or subsequence. ) With specific complementarity and is generally defined as a subunit sequence consisting of DNA or RNA.
The percent complementarity can be readily determined by a generalized experimental process or preferably by using a suitable computer software program such as BLAST and related programs. Public knowledge relating to the use of the BLAST program can be found at the United States National Center for Biotechnology Information (NCBI). The term “substantially complementary” means complementary to at least 80%, preferably 90% or more.
上にも述べたように、本発明の好ましいプローブは、少なくとも一つの認識要素を含む。“認識要素(recognition element)”という用語は、一実施の形態において、少なくとも一つのプローブリガンド(probe ligand)またはプローブ基質(probe substrate)とこれに作動可能に連結された少なくとも一つの連結要素(coupling element)を含むプローブ構成要素を意味する。典型的に、連結要素は、使用用途によってその大きさと原子の数が変わりうる連結基(linking group)のことである。一般的に、シグナルトランスデューサーとプローブリガンドまたはプローブ基質との間にある程度の距離を置くために連結要素を含むことが好ましいが、一部用途では連結要素が不要なこともある。
より具体的に、本発明による“認識要素”は、親和性プローブが使用される実施形態ではプローブリガンドを含む。しかし、切断性プローブが使用される場合、認識要素は、好ましくはリンカーにより連結された切断部位と不安定化因子を含む。第I型、第II型、及び第II(−)型連結性プローブにおいて、認識要素は典型的に反応部位(reaction site)を含む。他の場合において、第I型、第II型、及び第II(−)型連結性プローブで使用される好ましい認識要素は、反応部位(reaction site)、不安定化因子(destabilizing agent)、及び反応基(reaction group)を含む。特定の認識要素の例は、図面にて提供される。リンカー(linker)のような特定連結要素(coupling element)に対する図解もまた本明細書に開示されている。
As also mentioned above, preferred probes of the present invention include at least one recognition element. The term “recognition element” refers, in one embodiment, to at least one probe ligand or probe substrate and at least one coupling element operably linked thereto. element). Typically, a linking element is a linking group whose size and number of atoms can vary depending on the intended use. In general, it is preferable to include a linking element to provide some distance between the signal transducer and the probe ligand or probe substrate, but in some applications the linking element may not be necessary.
More specifically, a “recognition element” according to the present invention comprises a probe ligand in embodiments where an affinity probe is used. However, when a cleavable probe is used, the recognition element preferably comprises a cleavage site and a destabilizing factor linked by a linker. In Type I, Type II, and Type II (−) connectivity probes, the recognition element typically includes a reaction site. In other cases, preferred recognition elements used in Type I, Type II, and Type II (-) connectivity probes include reaction sites, destabilizing agents, and reactions. Contains a reaction group. Examples of specific recognition elements are provided in the drawings. An illustration for a particular coupling element, such as a linker, is also disclosed herein.
本発明の特定のプローブは、いくつかの種類に分類されるが、例えば、受容体因子(receptor agent)またはリガンド(ligand)を検出するための親和性プローブ(affinity probe)と反応誘発因子(reaction-inducing agent)を検出するための反応性プローブ(reaction probe)とに分類される。反応性プローブは、反応誘発因子により誘発される反応の性質によって4つの類型にさらに分類される。その第一は、反応誘発因子の作用により一つの基質が少なくとも二つの断片に切断される切断反応を検出しうる切断性プローブ(cleavage probe)である。第二は、反応誘発因子の作用により少なくとも二つの基質が共有結合で連結される連結反応を検出する第I型連結性プローブ(Type I coupling probe)である。第三は、反応誘発因子の作用により基質に在る反応部位(reaction site)が接合部位(conjugation site)へ変換される修飾反応を検出する第II型連結性プローブ(Type II coupling probe)である。最後は、反応誘発因子の作用により既に接合部位(conjugation site)であった反応部位(reaction site)が、非接合性部位(non-conjugatable site)に変換される修飾反応を検出する第II(−)型連結性プローブ(Type II(-) coupling probe)である。第II型及び第II(-)型連結性プローブでは、第2の基質が自発的な結合(binding)を用いるか、自発的にまたは連結試薬(coupling reagent)の助けにて起こる連結反応を用いて接合部位に接合される。 Certain probes of the present invention are classified into several types, for example, affinity probes for detecting receptor agents or ligands and reaction inducers (reactions). -Inducing agent) is classified as a reaction probe. Reactive probes are further classified into four types according to the nature of the reaction elicited by the reaction inducer. The first is a cleavage probe that can detect a cleavage reaction in which one substrate is cleaved into at least two fragments by the action of a reaction inducer. The second is a type I coupling probe (Type I coupling probe) that detects a coupling reaction in which at least two substrates are covalently linked by the action of a reaction inducer. The third is a type II coupling probe (Type II coupling probe) that detects a modification reaction in which a reaction site in the substrate is converted into a conjugation site by the action of a reaction inducing factor. . Finally, the reaction site (reaction site), which was already a conjugation site by the action of a reaction inducing factor, detects a modification reaction in which the reaction is converted to a non-conjugatable site (- ) Type connectivity probe (Type II (-) coupling probe). In type II and type II (-) connectivity probes, the second substrate uses spontaneous binding or uses a ligation reaction that occurs spontaneously or with the aid of a coupling reagent. To be joined to the joining site.
本明細書に使用されるように、“プローブ(probe)”という用語は、本発明によるハイブリダイゼーションに適するヌクレオチドを含む二つ以上の亜構成単位(DNA、RNA、PNA)を含むオリゴマー(oligomer)として定義される。当該プローブは、検出可能な部分でラベルされても、ラベルされなくても良い。また、プローブは、溶液相にあってもよく、固体支持体や固体運搬体に固定化されていても良い。より特定なプローブの例は、DNA、RNA、及びDNA-RNAハイブリッド分子、及びペプチド核酸(peptide nucleic acids:PNA)を含む。 As used herein, the term “probe” refers to an oligomer comprising two or more subunits (DNA, RNA, PNA) comprising nucleotides suitable for hybridization according to the present invention. Is defined as The probe may or may not be labeled with a detectable moiety. Further, the probe may be in a solution phase, or may be immobilized on a solid support or a solid carrier. Examples of more specific probes include DNA, RNA, and DNA-RNA hybrid molecules, and peptide nucleic acids (PNA).
本発明の範囲に属するプローブは、さらに、Wengel,PCT WO 99/14226に開示されている少なくとも一つの2環または3環ヌクレオシド(bi-or tri-cyclic nucleoside)類似体を含む。好ましくは、このようなプローブは、少なくとも一つのLNA(locked nucleic acid)単量体に置換された部分を含んでいる。LNAとこれと関連する類似体の作製及び使用についての内容は、既に報告されたことがある(U.S Pat.No.6,268,490参照)。
LNAと一つまたはそれ以上のDNA、RNA、またはPNAとを含むプローブも、本発明の範囲に含まれる。
さらに他のプローブは、RNA及び/またはDNAの摸倣体からなる少なくとも一つの亜構成単位を含む。この例には、米国特許第6,077,709及びこれに公知された参考文献に記述されたように、オリゴヌクレオチドの骨格(backbone)を修飾したもの、糖基(sugar group)を修飾したもの、及び塩基(base)を修飾したものが含まれる。これらプローブの例は、チオリン酸骨格(phosphorothioate backbone)を有するもの、2'-メトキシリボース(2'-methoxyribose)のように置換された糖部分を有するオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)、そして5-メチルサイトシン(5-methylcytosine)のように修飾されたヌクレオベース(nucleobase)を有するものを含む。接合されたプローブ、すなわち活性度を増加させるために一つのプローブを他のプローブに、他のある部分を用いて化学的にクロスリンクさせたものも本発明に含まれる。
Probes within the scope of the present invention further include at least one bi- or tri-cyclic nucleoside analog disclosed in Wengel, PCT WO 99/14226. Preferably, such a probe includes a portion substituted with at least one LNA (locked nucleic acid) monomer. Content on the production and use of LNA and related analogs has already been reported (see US Pat. No. 6,268,490).
Probes comprising LNA and one or more DNA, RNA, or PNA are also within the scope of the present invention.
Still other probes comprise at least one subunit consisting of RNA and / or DNA mimics. Examples include modified oligonucleotide backbones and sugar groups as described in US Pat. No. 6,077,709 and references known thereto. And those with modified bases. Examples of these probes are those having a phosphorothioate backbone, oligonucleotides with sugar moieties substituted, such as 2'-methoxyribose, and 5-methylcytosine. Including those having a modified nucleobase such as (5-methylcytosine). Also included in the present invention are joined probes, i.e., one probe chemically cross-linked to another probe using some other moiety to increase activity.
大部分の本発明によるプローブは、立体構造的に敏感でかつ感応性を有する核酸ベースのシグナルトランスデューサーを含む。当該プローブは、標的因子の存在または非存在によって立体構造的変化を起こす“二元性立体構造(dual-conformation)”プローブに特徴付けられる。立体構造的変化の一形態は、プローブに含まれた少なくとも一つの認識要素と標的因子(等)との相互作用により誘発された一対または2対の実質的に相補的な核酸配列のハイブリダイゼーション及び解離を含む。1または2対の核酸配列を有している本発明のプローブは、ハイブリダイゼーション過程の非競合的または競合的性質に鑑みてそれぞれ、“非競合的(non-competitive)”または“競合的(competitive)”プローブと言う。 Most probes according to the invention comprise conformationally sensitive and sensitive nucleic acid based signal transducers. The probe is characterized as a “dual-conformation” probe that undergoes a conformational change in the presence or absence of the target agent. One form of conformational change is the hybridization of a pair or two pairs of substantially complementary nucleic acid sequences induced by the interaction of at least one recognition element contained in the probe with a target factor (etc.) and Includes dissociation. Probes of the invention having one or two pairs of nucleic acid sequences can be considered as “non-competitive” or “competitive”, respectively, in view of the non-competitive or competitive nature of the hybridization process. ) ”Probe.
競合的方式が好ましい実施形態において、上述の(a)乃至(c)の構成成分に加えて、プローブは少なくとも1対の下記の構成成分を作動可能に連結した状態にさらに含む:
d)前記第1核酸配列対の一部として付加される第2対象配列であって、その長さが約3個乃至150個、好ましくは約4個乃至100個、より好ましくは約4個乃至50個のヌクレオチドからなり、好ましくは、前記第1対象配列と連合しており、好ましくは約40個未満のヌクレオチドを含み、前記第1及び第2対象配列により定義される重複領域を形成する前記第2対象配列;及び
e)約3個乃至約150個、好ましく約4個乃至100個、より好ましく約4個乃至約50個のヌクレオチドを含む長さの第2相補配列であって、前記第1及び第2相補配列は、前記第1及び第2対象配列の間に存在する前記重複領域に対して本質的に完壁に相補的であり、前記第2対象配列及び前記第2相補配列は、少なくとも前記重複領域に該当する長さ以上に対して相互に実質的に相補的なので、前記標的因子が存在しないときには“オフ”ハイブリダイゼーション状態を形成し、前記標的因子が存在するときには“オン”ハイブリダイゼーション状態を形成するのに充分である前記第2相補配列。
上に述べたように、前記第2対象配列及び前記第2相補配列は、“オフ”から“オン”状態へ立体構造的変化が起こるのを容易にするために導入される。
In an embodiment in which a competitive scheme is preferred, in addition to the components (a) to (c) described above, the probe further comprises at least one pair of the following components operably linked:
d) a second target sequence added as part of the first nucleic acid sequence pair, the length of which is about 3 to 150, preferably about 4 to 100, more preferably about 4 to Said nucleotide comprising 50 nucleotides, preferably associated with said first subject sequence, preferably comprising less than about 40 nucleotides, forming an overlapping region defined by said first and second subject sequences A second target sequence; and e) a second complementary sequence of length comprising about 3 to about 150, preferably about 4 to 100, more preferably about 4 to about 50 nucleotides, The first and second complementary sequences are essentially completely complementary to the overlapping region present between the first and second target sequences, and the second target sequence and the second complementary sequence are , At least the length corresponding to the overlapping area Since they are substantially complementary to each other, they are sufficient to form an “off” hybridization state when the target factor is not present and to form an “on” hybridization state when the target factor is present. The second complementary sequence.
As noted above, the second subject sequence and the second complementary sequence are introduced to facilitate a conformational change from an “off” to an “on” state.
上述の如く、本発明のプローブは、三番目の作動可能に連結された構成要素として、好ましくは前記対象及び相補核酸配列のうち少なくとも一つと連合している少なくとも一つの標的因子認識要素を含む。プローブが競合的方式の実施形態において、プローブは2対の前記核酸配列を全て含む。好ましくは、前記認識要素は、前記核酸配列のうち、(前記第2核酸配列対には接合されず)前記第1核酸配列対に接合されるが、好ましくは、前記重複領域を除いた前記第1対象配列または前記第1相補配列に接合される。
特定の競合的プローブ方式に対する図解を、図2、図12、図13、図19及び図22(様々なラベル方法を示す親和性プローブ方式)、図4(切断性プローブ)、図8(第I型連結性プローブ)、図9(第II型連結性プローブ)、図14及び図15(固定化した親和性プローブ)に示す。
As described above, the probe of the present invention includes, as a third operably linked component, preferably at least one target factor recognition element associated with at least one of the subject and complementary nucleic acid sequences. In embodiments where the probe is competitive, the probe comprises all two pairs of the nucleic acid sequences. Preferably, the recognition element is joined to the first nucleic acid sequence pair (not joined to the second nucleic acid sequence pair) of the nucleic acid sequences, but preferably the first excluding the overlapping region. It is joined to one target sequence or the first complementary sequence.
Illustrations for specific competitive probe schemes are shown in FIGS. 2, 12, 13, 19 and 22 (affinity probe schemes showing various labeling methods), FIG. 4 (cleavable probes), and FIG. Type connectivity probe), FIG. 9 (type II connectivity probe), FIG. 14 and FIG. 15 (immobilized affinity probe).
他の側面において、本発明は、本明細書に開示されたように、少なくとも一つの単分子プローブを含む検出システムを提供する。一実施の形態において、当該プローブは、下記の構成成分のうち少なくとも一つ、好ましくは全部を作動可能に連結された状態に含む: a)第1対象配列及び第1相補配列を含む一本鎖の核酸配列を含む少なくとも一つの核酸ベースのシグナルトランスデューサーであって、前記第1対象配列と前記第1相補配列は、それぞれ独立してその長さが約3個乃至約150個、好ましく約4個乃至100個、より好ましく約4個乃至50個のヌクレオチドからなり、相互に実質的に(すなわち、少なくとも80%、90%、またはそれ以上の長さに対して)相補的なので、標的因子が存在しないときには“オフ”ハイブリダイゼーション状態を形成し、標的因子が存在するときには“オン”ハイブリダイゼーション状態を形成する前記少なくとも一つの核酸ベースのシグナルトランスデューサー;
b)前記核酸ベースのシグナルトランスデューサーに作動可能に連結されている少なくとも一つの認識要素であって、少なくとも一つの標的因子と特異的に相互作用する前記少なくとも一つの認識要素;及び
c)必要に応じて、前記プローブに、特に前記核酸ベースのシグナルトランスデューサーに作動可能に連結されている少なくとも一つの検出可能なラベルであって、前記標的因子の前記プローブに対する、特に前記認識因子に対する相互作用により、“オフ”ハイブリダイゼーション状態から“オン”ハイブリダイゼーション状態へ立体構造的な変化が起こり、その大きさが前記シグナルトランスデューサーの“オン”ハイブリダイゼーション状態の量を表す指標となる特徴的シグナルを発生する前記少なくとも一つの検出可能なラベル。
In another aspect, the present invention provides a detection system comprising at least one unimolecular probe, as disclosed herein. In one embodiment, the probe comprises at least one of the following components, preferably all in an operably linked state: a) a single strand comprising a first subject sequence and a first complementary sequence At least one nucleic acid-based signal transducer, wherein each of the first subject sequence and the first complementary sequence independently has a length of about 3 to about 150, preferably about 4 Consists of from 1 to 100, more preferably from about 4 to 50 nucleotides, and is substantially complementary to each other (ie, for a length of at least 80%, 90%, or more) so that the target factor is Said at least one of said "off" hybridization states when not present and "on" hybridization state when said target agent is present. A nucleic acid based signal transducer;
b) at least one recognition element operably linked to the nucleic acid based signal transducer, wherein the at least one recognition element interacts specifically with at least one target agent; and c) Accordingly, at least one detectable label operably linked to the probe, in particular to the nucleic acid based signal transducer, by interaction of the target factor with the probe, in particular with the recognition factor. , A conformational change from an “off” hybridization state to an “on” hybridization state, generating a characteristic signal whose magnitude is indicative of the amount of the signal transducer's “on” hybridization state Said at least one detectable label
競合的検出方式が要求される実施形態において、プローブは、第2対象配列と第2相補配列とからなる少なくとも1対の相補的な核酸配列をさらに含む。
適切な対照群と対比して前記標的検出システムにより出力されたシグナルが検出可能であれば、特徴的シグナルが本発明によって“変化”(増加または減少)したことを意味する。適切な対照群の例は、検出する標的因子の代りに同量の水、緩衝溶液、またはその類似体を前記システムに添加したものを含む。本発明の属する分野で通常の知識を有する者にとっては、一度特定の対照群(存在する場合に限る)と関連している出力シグナルを理解すると、本発明を使用する度に対照群実験を行わなくても良いということは自明である。このような本発明の特徴は、同一または類似の標的因子に対する多数の分析を必要とする応用の場合において重要とされる。
In embodiments where a competitive detection scheme is required, the probe further comprises at least one pair of complementary nucleic acid sequences consisting of a second subject sequence and a second complementary sequence.
If the signal output by the target detection system is detectable relative to an appropriate control group, it means that the characteristic signal has been “changed” (increased or decreased) by the present invention. Examples of suitable control groups include those in which the same amount of water, buffer solution, or analog thereof is added to the system in place of the target agent to be detected. For those of ordinary skill in the field to which the present invention pertains, once the output signal associated with a particular control group (if present) is understood, a control group experiment is performed each time the present invention is used. Obviously, it is not necessary. Such features of the present invention are important in applications that require multiple analyzes for the same or similar target factors.
本発明による非競合的プローブの一実施の形態は、作動可能に連結された構成要素として:1)第1対象配列及び第1相補配列からなる第1核酸配列対;2)前記第1対象配列及び前記第1相補配列のうち少なくとも一つに接合されている少なくとも一つの認識要素;及び、3)必要に応じて、少なくとも一つの検出可能なラベルを含む。この前記認識要素は、一つまたはそれ以上の標的因子と特異的に相互作用しうる要素である。認識要素の具体的な実体は標的因子の性質によって多様に変わるが、これは、各類型のプローブを説明するに当たって詳細に後述する。前記第1対象及び第1相補配列は、典型的に約3個乃至約150個、好ましくは約4個乃至約100個、より好ましくは約4個乃至約50個のヌクレオチドを有し、相互に実質的に相補的である。“実質的に相補的(substantially complementary)”という用語は、前記対象及び相補配列が前記プローブを使用する(検出温度を含む)アッセイ条件下で標的因子が存在または非存在するときに、ハイブリダイズした二重鎖(hybridized duplex)を形成することができるということを意味する。これに加えて、前記対象及び相補配列のうち少なくとも一つは、一つまたはそれ以上の検出目的の追加的な配列(例えば、先にも述べたPCRまたは重合酵素反応を用いたシグナル増幅方法において必要な配列)を有することができる。好適な条件下で、前記第1対象及び第1相補配列は約3個乃至約100個、好ましくは約4個乃至約70個、より好ましくは約4個乃至約50個の相補的塩基対を有する第1ハイブリダイズした二重鎖(first hybridized duplex)を形成する。 One embodiment of a non-competitive probe according to the present invention is as follows: 1) a first nucleic acid sequence pair consisting of a first target sequence and a first complementary sequence; 2) the first target sequence And at least one recognition element joined to at least one of said first complementary sequences; and 3) optionally, at least one detectable label. The recognition element is an element that can specifically interact with one or more target factors. The specific entity of the recognition element varies depending on the nature of the target factor, which will be described in detail later in describing each type of probe. The first object and the first complementary sequence typically have from about 3 to about 150, preferably from about 4 to about 100, more preferably from about 4 to about 50 nucleotides, Are substantially complementary. The term “substantially complementary” means that the subject and complementary sequence hybridized when the target agent was present or absent under assay conditions (including the detection temperature) using the probe. It means that a duplexed duplex can be formed. In addition, at least one of the target and the complementary sequence is one or more additional sequences for detection purposes (for example, in the signal amplification method using the PCR or the polymerase reaction described above). Required sequences). Under suitable conditions, the first subject and the first complementary sequence may comprise about 3 to about 100, preferably about 4 to about 70, more preferably about 4 to about 50 complementary base pairs. Forming a first hybridized duplex with the first hybridized duplex.
前記非競合的プローブは、標的因子の存在または非存在に応じて、第1ハイブリダイズした二重鎖が形成されるハイブリダイズした立体構造から第1ハイブリダイズした二重鎖が解離する解離した立体構造へ、または、その逆に立体構造的変化を起こすように考案されている。核酸ハイブリダイゼーションは、可逆的な熱力学的現象であるので、“立体構造的変化”という用語は、前記両立体構造間の確率分布における変化を意味する。
このような非競合的方式のプローブに対する例が、図1、図10、図16、図20、及び図21(様々なラベル方法を使用する親和性プローブ)、図3(切断性プローブ)、図5(第I型連結性プローブ)、図6(第II型連結性プローブ)、及び図11(固定化した親和性プローブ)に示されている。図17及び図18には、相互作用性ラベル対を使用する単分子方式の非競合的プローブの具体的な例を示す。
The non-competitive probe is a dissociated three-dimensional structure in which the first hybridized duplex is dissociated from the hybridized three-dimensional structure in which the first hybridized duplex is formed depending on the presence or absence of the target factor. It is devised to cause a conformational change to the structure and vice versa. Since nucleic acid hybridization is a reversible thermodynamic phenomenon, the term “conformational change” means a change in the probability distribution between the compatible structures.
Examples for such non-competitive probes are FIGS. 1, 10, 16, 20, and 21 (affinity probes using various labeling methods), FIG. 3 (cleavable probes), FIG. 5 (Type I connectivity probe), FIG. 6 (Type II connectivity probe), and FIG. 11 (Immobilized affinity probe). 17 and 18 show specific examples of unimolecular non-competitive probes that use interactive label pairs.
競合的方式で使用される追加的に適切なプローブは、第2対象配列と第2相補配列とからなる競合する核酸配列である第2核酸配列対をさらに含む。これら第2対象及び第2相補配列は、約3個乃至約150個、好ましくは約4個乃至約100個、より好ましくは約4個乃至約50個のヌクレオチドを有しており、相互に実質的に相補的なので、好適な条件下で約3個乃至約100個、好ましくは約4個乃至約70個、一般的に約4個乃至約50個の相補的塩基対を有する第2ハイブリダイズした二重鎖(second hybridized duplex)を形成することができる。前記第1及び第2対象配列は、一般的に同一の核酸配列、つまり、対象配列に含まれており、少なくとも一つの共通するヌクレオチドで構成された重複領域を共有している。好ましい実施形態において、当該重複領域は、前記第1対象配列に含まれたヌクレオチドのうち少なくとも約10%、好ましくは約20%、より好ましくは約30%のヌクレオチドを含む。したがって、前記第1及び第2相補配列は、前記対象配列に対して競合的にハイブリダイズするようになり、前記第1ハイブリダイズした二重鎖(first hybridized duplex)または前記第2ハイブリダイズした二重鎖(second hybridized duplex)を形成する。このようなハイブリダイゼーションの競合的性質から、あるハイブリダイズした二重鎖の形成は、他のハイブリダイズした二重鎖の形成を不可能にするか、または、十分に抑制させる。 Additional suitable probes for use in a competitive manner further include a second nucleic acid sequence pair that is a competing nucleic acid sequence consisting of a second subject sequence and a second complementary sequence. The second object and the second complementary sequence have about 3 to about 150, preferably about 4 to about 100, more preferably about 4 to about 50 nucleotides, which are substantially Second hybridize having from about 3 to about 100, preferably from about 4 to about 70, and generally from about 4 to about 50 complementary base pairs under suitable conditions. A second hybridized duplex can be formed. The first and second target sequences are generally contained in the same nucleic acid sequence, that is, the target sequence, and share an overlapping region composed of at least one common nucleotide. In a preferred embodiment, the overlapping region comprises at least about 10%, preferably about 20%, more preferably about 30% nucleotides among the nucleotides contained in the first subject sequence. Accordingly, the first and second complementary sequences come to hybridize competitively with the target sequence, and the first hybridized duplex or the second hybridized duplex. Forms a second hybridized duplex. Due to the competitive nature of such hybridization, the formation of one hybridized duplex makes the formation of other hybridized duplexes impossible or sufficiently suppressed.
本発明による典型的な競合的プローブは、標的因子の存在または非存在によって前記第1ハイブリダイズした二重鎖が形成される第1ハイブリダイズした立体構造から前記第2ハイブリダイズした二重鎖が形成される第2ハイブリダイゼーション立体構造へ、または、その逆に立体構造的変化を起こすように考案されている。“立体構造的変化”という用語は、二つのハイブリダイズした立体構造間の確率分布に検出可能な変化があることを意味する。
本発明の特定実施形態では、少なくとも一つの検出可能なラベルがプローブに接合されており、標的因子の量または標的因子と認識要素間の相互作用の程度の指標となる特徴的シグナルを生成する。大部分の非競合的プローブにおいて、検出可能なラベルからの特徴的シグナルは、前記第1対象配列と前記第1相補配列とがハイブリダイズした程度の関数として示され、より具体的には、前記ハイブリダイズした立体構造または前記解離した立体構造の量に対する関数として示される。競合的プローブでは、検出可能なラベルからの特徴的シグナルが、前記第1または第2ハイブリダイズした立体構造の量の関数として示される。検出可能なラベルを導入するための様々な構成方法は後述される。
A typical competitive probe according to the present invention comprises a second hybridized duplex from a first hybridized conformation in which the first hybridized duplex is formed by the presence or absence of a target agent. It has been devised to cause a conformational change to the second hybridization conformation that is formed, or vice versa. The term “conformational change” means that there is a detectable change in the probability distribution between two hybridized conformations.
In certain embodiments of the invention, at least one detectable label is conjugated to the probe to produce a characteristic signal indicative of the amount of target factor or the degree of interaction between the target factor and the recognition element. In most non-competitive probes, the characteristic signal from the detectable label is shown as a function of the extent to which the first subject sequence and the first complementary sequence have hybridized, more specifically, It is shown as a function of the amount of hybridized or dissociated conformation. For competitive probes, the characteristic signal from the detectable label is shown as a function of the amount of the first or second hybridized conformation. Various construction methods for introducing a detectable label are described below.
先に言及したように、本発明の典型的なプローブは、プローブに作動可能に連結された状態の少なくとも一つ、好ましくは約5個未満、一般的に約1個または2個の認識要素を含む。大部分の実施形態において、少なくとも一つの認識要素のそれぞれは、前記第1対象及び第1相補配列のうち少なくとも一つに接合されている。“接合された(conjugated)”“接合(conjugation)”及びこれと類似する用語は、核酸ベースのシグナルトランスデューサーと認識要素との間に少なくとも一つの共有結合(例えば、炭素-炭素、炭素-酸素結合など)または非共有結合(例えば、水素結合、イオン結合、塩橋など)が形成されることを意味する。多くの実施形態において、共有結合性接合が一般的に好ましいと言えよう。特定の非共有性相互作用の例は、水素結合、イオン結合、そして親水性及び疏水性相互作用を含むが、これに限定されない。典型的に、それぞれの認識要素は、一つまたはそれ以上の連結要素(coupling element)によりシグナルトランスデューサーに接合されている。好適な連結要素の例は、化学結合(chemical bond)、二価原子(divalent atom)、二価の化学部分(divalent chemical moiety)、及び多価の化学部分(multivalent chemical moiety)を含む。 As previously mentioned, an exemplary probe of the present invention has at least one, preferably less than about 5, generally about 1 or 2 recognition elements operably coupled to the probe. Including. In most embodiments, each of the at least one recognition element is joined to at least one of the first object and the first complementary sequence. “Conjugated”, “conjugation” and similar terms refer to at least one covalent bond (eg, carbon-carbon, carbon-oxygen) between a nucleic acid-based signal transducer and a recognition element. Or non-covalent bonds (eg, hydrogen bonds, ionic bonds, salt bridges, etc.) are formed. In many embodiments, covalent bonding may be generally preferred. Examples of specific non-covalent interactions include, but are not limited to, hydrogen bonding, ionic bonding, and hydrophilic and hydrophobic interactions. Typically, each recognition element is joined to the signal transducer by one or more coupling elements. Examples of suitable linking elements include chemical bonds, divalent atoms, divalent chemical moieties, and multivalent chemical moieties.
本発明のプローブに関する一部の実施形態において、二つまたはそれ以上の認識要素が核酸ベースのシグナルトランスデューサーに、デンドリーマー(dendrimer)のような多価の連結要素(multivalent coupling element)により接合されていることができる。
他の実施形態において、本発明による認識要素は、一つ以上、例えば10個未満、好ましくは約1個乃至約5個、より好ましくは約2個の連結要素を用いて接合されることができる。認識要素は、プローブのほぼ全位置に接合可能であるが、例えば、シグナルトランスデューサーに望む立体構造的変化を引き起こせるような範囲内で、ほぼ全類型の連結要素を用いて第1対象配列または第1相補配列のいずれの位置にも接合可能である。上述の如く、核酸ベースのシグナルトランスデューサーは、標的因子と認識要素との相互作用に対して立体構造的に敏感でかつ感応性を有している。
In some embodiments relating to probes of the invention, two or more recognition elements are joined to a nucleic acid based signal transducer by a multivalent coupling element such as a dendrimer. Can be.
In other embodiments, recognition elements according to the present invention can be joined using one or more, for example, less than 10, preferably from about 1 to about 5, more preferably about 2 connecting elements. . The recognition element can be joined to almost all positions of the probe, but, for example, within a range that can cause the desired conformational change in the signal transducer, the first target sequence or It can be joined to any position of the first complementary sequence. As described above, nucleic acid-based signal transducers are three-dimensionally sensitive and sensitive to the interaction between target factors and recognition elements.
競合的プローブ方式の実施形態において、第1対象配列及び第1相補配列のうち少なくとも一つに、第1対象配列に含まれている重複領域を除いた位置に認識要素を接合することが好ましい。必要に応じて、一つのプローブに複数の相異なる認識要素を接合することによって、1個以上、好ましくは約3個未満の標的因子を検出できるようにプローブを容易に変形することができる。
上述の如く、認識要素と標的因子との相互作用の結果として典型的に誘発(または、除去)される“不安定化効果(destabilization effect)”に対して充分な感応性を有するプローブを提供することに本発明の一目的がある。このような相互作用は、生産的な場合、プローブ、特に核酸ベースのシグナルトランスデューサーに立体構造的変化を引き起こす。一実施の形態において、標的因子と認識要素との相互作用は、シグナルトランスデューサーの第1ハイブリダイズした二重鎖の熱力学的安全性を調節する(すなわち、増加または減少させる)。しかし、対象及び相補配列からなる2対の競合する核酸配列対を有している競合的方式のプローブでは、第1ハイブリダイズした二重鎖と比較して、第2ハイブリダイズした二重鎖は前記相互作用の影響を全く受けないか、または、より弱く受けることが好ましい。典型的に、第1対象配列に含まれている重複配列を除いた第1対象配列、または第1相補配列に認識要素を接合させることで、当該の目的を達成することができる。後述されるが、このような相互作用は、プローブの類型によって第1ハイブリダイズした二重鎖を不安定化させるか、第1ハイブリダイズした二重鎖を不安定な状態から解放させることができる。好ましく、標的因子との相互作用により第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が、少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃変化する。
In an embodiment of the competitive probe system, it is preferable that a recognition element is joined to at least one of the first target sequence and the first complementary sequence at a position excluding the overlapping region included in the first target sequence. If necessary, the probe can be easily modified to detect one or more, preferably less than about 3, target factors by joining a plurality of different recognition elements to a probe.
Provide a probe that is sufficiently sensitive to the “destabilization effect” that is typically induced (or eliminated) as a result of the interaction between the recognition element and the target factor, as described above. In particular, there is an object of the present invention. Such interactions, when productive, cause conformational changes in probes, particularly nucleic acid based signal transducers. In one embodiment, the interaction between the target agent and the recognition element modulates (ie, increases or decreases) the thermodynamic safety of the first hybridized duplex of the signal transducer. However, in a competitive probe having two pairs of competing nucleic acid sequences consisting of the subject and complementary sequences, the second hybridized duplex is compared to the first hybridized duplex. It is preferred that the interaction is not affected at all or is weaker. Typically, the object can be achieved by joining a recognition element to the first target sequence excluding the overlapping sequence contained in the first target sequence, or to the first complementary sequence. As will be described later, such an interaction can destabilize the first hybridized duplex depending on the type of the probe, or release the first hybridized duplex from an unstable state. . Preferably, the melting temperature of the first hybridized duplex upon interaction with the target agent varies by at least about 1 ° C, more preferably at least about 5 ° C.
本発明の特定のプローブは、認識要素が一つまたはそれ以上の標的因子と相互作用することと関連付けられているプローブ立体構造不安定化効果(または、場合によってはは安定化効果)により、一つまたはそれ以上の標的因子の存在を報知する。より具体的に、プローブ立体構造不安定化(または、安定化)効果は、核酸ベースのシグナルトランスデューサーの立体構造の変化により典型的に現れる。この効果は、シグナルトランスデューサーに直接的に、または一部実施形態では認識要素を介して間接的に伝えられることができる。例えば、一実施の形態において、プローブと標的因子との相互作用に伴う不安定化効果は、標的因子の作用により認識要素に付着されたり、または認識要素から分離される不安定化因子により生成される立体障害(steric hindrance)により引き起こされる。しかし、静電気的相互作用(electrostatic interaction)、双極子-双極子相互作用(dipole-dipole interaction)、ファンデルワールス力(van der Waals force)のような親水性及び疏水性相互作用(hydrophilic and hydrophobic interaction)、電子再配置(electron redistribution)などに起因する他の類型の障害(hindrance)もまた可能である。一部の実施形態において、このような立体障害(または、他の種類の障害)の存在は、第1ハイブリダイズした二重鎖の構造的歪みを誘発し、よって、検出温度を含むアッセイ条件下で第2ハイブリダイズした二重鎖に比べて、第1ハイブリダイズした二重鎖が熱力学的に不安定または低安定な状態となるようにする。 Certain probes of the present invention have a probe conformation destabilizing effect (or in some cases a stabilizing effect) associated with the recognition element interacting with one or more target factors. Announce the presence of one or more target factors. More specifically, probe conformational destabilization (or stabilization) effects are typically manifested by changes in the conformation of nucleic acid-based signal transducers. This effect can be communicated directly to the signal transducer or in some embodiments indirectly via a recognition element. For example, in one embodiment, the destabilizing effect associated with the interaction between the probe and the target factor is generated by a destabilizing factor that is attached to or separated from the recognition element by the action of the target factor. Caused by steric hindrance. However, hydrophilic and hydrophobic interactions such as electrostatic interaction, dipole-dipole interaction, van der Waals force ), Other types of hindrances due to electron redistribution etc. are also possible. In some embodiments, the presence of such steric hindrance (or other type of hindrance) induces structural distortion of the first hybridized duplex, and thus the assay conditions including the detection temperature. As compared with the second hybridized duplex, the first hybridized duplex is thermodynamically unstable or less stable.
したがって、“不安定化因子(destabilizing agent)”という用語は、核酸ベースのシグナルトランスデューサーの立体構造に検出可能な変化を誘発するか、あるいは、誘発するのを助けるほとんどあらゆる(自然的に存在する、合成された、または半合成された)分子を意味する。不安定化因子の大きさと特徴は、目的とする標的システムの用途に応じて様々に変わることができる。例えば、約1nm乃至約25nmの直径を有する、典型的には約5nm乃至約15nmの直径を有する特定タンパク質またはタンパク質複合体が用いられることができる。不安定化因子は、本明細書に記述される切断性及び連結性プローブと共に使用される際に特に有用である。これは、図3及び図5に例示する。 Thus, the term “destabilizing agent” induces, or assists in inducing, a detectable change in the conformation of a nucleic acid-based signal transducer. , Synthesized, or semi-synthesized). The size and characteristics of the destabilizing factor can vary depending on the intended use of the target system. For example, specific proteins or protein complexes having a diameter of about 1 nm to about 25 nm, typically having a diameter of about 5 nm to about 15 nm can be used. Destabilizing agents are particularly useful when used with the cleavable and linking probes described herein. This is illustrated in FIGS. 3 and 5.
次に、図面に基づき、各類型のプローブについて詳細に説明する。
図1は、検出可能なラベルを持たない上に、第1核酸配列対を含む非競合的方式の親和性プローブを概略的に示す図である。この親和性プローブにおいて、認識要素3は、受容体因子10に特異的に結合しうるプローブリガンド11である。本発明によれば、一つまたはそれ以上のプローブリガンドが、第1対象配列1aまたは第1相補配列2aのいずれの位置にも接合可能である。各プローブリガンドは、少なくとも一つの連結要素4により接合される。同図において、認識要素3は、“受容体”因子10に特異的に結合しうるプローブリガンド11である。この例において、連結子は、プローブリガンド(すなわち、認識要素)を核酸ベースのシグナルトランスデューサーに連結させる連結要素4に該当する。
“連結子(adaptor)”という用語は、特にプローブが親和性プローブの場合、連結要素(coupling element)を意味する。しかし、切断性プローブにおいて連結子は、連結要素、少なくとも一つの切断部位(cleavage site)、及びリンカー(linker)を含む。第I型、第II型、または第II(−)型連結性プローブが使用される他の実施形態において、好ましい連結子は、連結要素を含む。
Next, each type of probe will be described in detail with reference to the drawings.
FIG. 1 schematically illustrates a non-competitive affinity probe that has no detectable label and includes a first nucleic acid sequence pair. In this affinity probe, the
The term “adaptor” means a coupling element, particularly when the probe is an affinity probe. However, in a cleavable probe, the ligator comprises a linking element, at least one cleavage site, and a linker. In other embodiments in which type I, type II, or type II (−) connectivity probes are used, preferred connectors include linking elements.
非競合的方式の親和性プローブは、プローブリガンド11に受容体因子10が結合されることによってハイブリダイズした立体構造(図1A)から、解離した立体構造(図1B)へ立体構造的変化を起こすように考案されている。具体的に、受容体因子の結合により誘発された立体構造的変化は、前記ハイブリダイズした立体構造にある確率の減少と前記解離した立体構造にある確率の増加を招く。
望む立体構造的変化を誘発するためには、前記受容体因子の結合が、前記第1ハイブリダイズした二重鎖を十分に強く不安定化させなければならない。該第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が、前記受容体因子が結合することによって少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃減少すると良い。
The non-competitive affinity probe causes a conformational change from a hybridized three-dimensional structure (FIG. 1A) to a dissociated three-dimensional structure (FIG. 1B) by binding of the
In order to induce the desired conformational change, the binding of the receptor factor must destabilize the first hybridized duplex sufficiently strongly. The melting temperature of the first hybridized duplex may be reduced by at least about 1 ° C., more preferably at least about 5 ° C. upon binding of the receptor factor.
好ましい実施形態において、前記ハイブリダイズした立体構造は、検出温度を含むアッセイ条件下で、前記受容体因子が存在しないときには熱力学的に安定している。典型的に、このような方式の好ましい親和性プローブでは、前記受容体因子が存在しない時における前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が、検出温度に比べ、好ましくは少なくとも約5℃、より好ましくは少なくとも約10℃高い。
図2は、検出可能なラベルを持たない上に、競合する核酸配列である第2核酸配列対をさらに含む競合的方式の親和性プローブを示す図である。好ましい実施形態において、プローブリガンド11は、第1対象配列1aの重複領域1cを除いた部分または第1相補配列2aに接合される。上述の如く、第1及び第2対象配列1a,1bは、一つの対象配列に含まれている。このような方式のプローブは、受容体因子10の結合によって第1対象配列1a及び第1相補配列2a間に第1ハイブリダイズした二重鎖が形成される第1ハイブリダイズした立体構造(図2A)から、第2対象配列1b及び第2相補配列2b間に第2ハイブリダイズした二重鎖が形成される第2ハイブリダイズした立体構造(図2B)へ立体構造的変化を起こすように考案されている。具体的に、前記受容体因子の結合により誘発された立体構造的変化は、前記第1ハイブリダイズした立体構造にある確率の減少と前記第2ハイブリダイズした立体構造にある確率の増加を招く。
In a preferred embodiment, the hybridized conformation is thermodynamically stable in the absence of the receptor factor under assay conditions including a detection temperature. Typically, in preferred affinity probes of this manner, the melting temperature of the first hybridized duplex in the absence of the receptor factor is preferably at least about 5 ° C., compared to the detection temperature, More preferably, it is at least about 10 ° C higher.
FIG. 2 is a diagram showing a competitive-type affinity probe that does not have a detectable label and further includes a second nucleic acid sequence pair that is a competing nucleic acid sequence. In a preferred embodiment, the
望む立体構造的変化を誘発するためには、前記受容体因子の結合が、典型的に前記第1ハイブリダイズした二重鎖を十分に強く不安定化させ、また、前記第2ハイブリダイズした二重鎖を十分に弱く不安定化させるか、全く不安定化させてはいけない。前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が、前記受容体因子が結合することによって少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃減少すると良い。
好ましい実施形態において、前記受容体因子が存在しないときに、前記第1ハイブリダイズした二重鎖が、前記第2ハイブリダイズした二重鎖よりも優先的に形成される。好ましくは、前記受容体因子が存在しないときに、前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度は、前記第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度に比べて、少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃高い。前記受容体因子が結合することによってハイブリダイゼーションの選好度が、前記第2ハイブリダイズした二重鎖を好むように変わることがより好ましい。好ましくは、前記受容体因子が過量存在する時における前記第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度は、前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度よりも少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃高い。
In order to induce the desired conformational change, binding of the receptor factor typically destabilizes the first hybridized duplex sufficiently strongly and the second hybridized duplex. Do not destabilize the heavy chain sufficiently weakly or at all. The melting temperature of the first hybridized duplex may be reduced by at least about 1 ° C, more preferably at least about 5 ° C due to binding of the receptor factor.
In a preferred embodiment, when the receptor factor is not present, the first hybridized duplex is preferentially formed over the second hybridized duplex. Preferably, when the receptor factor is not present, the melting temperature of the first hybridized duplex is at least about 1 ° C., more preferably compared to the melting temperature of the second hybridized duplex. Is at least about 5 ° C higher. More preferably, the binding preference of the receptor factor changes to favor the second hybridized duplex. Preferably, the melting temperature of the second hybridized duplex when the receptor agent is present in excess is at least about 1 ° C., more preferably at least about the melting temperature of the first hybridized duplex. About 5 ° C higher.
好ましい実施形態において、前記受容体因子が存在しないときに、前記第1及び第2ハイブリダイズした二重鎖は両方とも、検出温度を含むアッセイ条件下で熱力学的に安定している。典型的に、好ましい親和性プローブでは、前記受容体因子が存在しない時における前記第1及び第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が、検出温度よりも高いが、好ましくは少なくとも約5℃、より好ましくは少なくとも約10℃高い。
上述の親和性プローブにおいて、前記受容体の結合によって生じる不安定化効果(destabilization effect)は、大部分の場合において前記受容体因子(または、前記受容体因子と前記プローブリガンドとの複合体)及び前記第1ハイブリダイズした二重鎖間の立体障害(steric hindrance)に起因するが、静電気的相互作用(electrostatic interaction)、双極子-双極子相互作用(dipole-dipole interaction)、ファンデルワールス力(van der Waals force)のような親水性及び疏水性相互作用(hydrophilic and hydrophobic interaction)、電子再配置(electron redistribution)などによる他の類型の障害(hindrance)に起因することもある。
In a preferred embodiment, in the absence of the receptor factor, both the first and second hybridized duplexes are thermodynamically stable under the assay conditions including the detection temperature. Typically, in preferred affinity probes, the melting temperature of the first and second hybridized duplexes in the absence of the receptor factor is higher than the detection temperature, but preferably at least about 5 ° C. More preferably, it is at least about 10 ° C higher.
In the affinity probe described above, the destabilization effect caused by the binding of the receptor is in most cases the receptor factor (or the complex of the receptor factor and the probe ligand) and Due to steric hindrance between the first hybridized duplexes, electrostatic interaction, dipole-dipole interaction, van der Waals force ( It may be due to other types of hindrance, such as hydrophilic and hydrophobic interactions, such as van der Waals force, electron redistribution.
より大きな立体障害を誘発するために、多くの場合、前記受容体因子がより大きく、且つ前記プローブリガンドの接合されている核酸配列により近づいていることが好ましい。
たいてい前記受容体因子そのものが、検出しようとする標的因子であるので、その概略的な大きさが分かり、したがって、この受容体因子が小さすぎて充分に強い立体障害を誘発できない場合、デンドリマー(dendrimer)のような多価の化学部分を連結要素として一つ以上のプローブリガンドを接合することもできる。好ましい実施形態において、前記連結要素の長さを変化させることによって、前記受容体因子(または、前記受容体因子と前記プローブリガンドとの複合体)と前記第1対象及び/または第1相補配列との間の距離を調節することが好ましい。立体障害(及び他の種類の障害)は、短い距離でより強くなるので、より短い長さの連結要素を使用することがより好ましいこともある。しかし、あまりにも短い長さの連結要素は、前記受容体因子が前記プローブリガンドに結合するのを不可能にしたり、阻害したりする。したがって、前記不安定化効果及び前記受容体因子の結合を最大化するためには、前記連結要素の長さ及び他の変数を適切に選択すべきである。
In order to induce greater steric hindrance, it is often preferred that the receptor factor is larger and closer to the nucleic acid sequence to which the probe ligand is conjugated.
Usually, the receptor factor itself is the target factor to be detected, so that its approximate size is known, so if this receptor factor is too small to induce sufficiently strong steric hindrance, dendrimer It is also possible to join one or more probe ligands using a multivalent chemical moiety such as In a preferred embodiment, the receptor factor (or the complex of the receptor factor and the probe ligand), the first object and / or the first complementary sequence are changed by changing the length of the linking element. It is preferable to adjust the distance between the two. Because steric hindrance (and other types of hindrance) becomes stronger at short distances, it may be more preferable to use shorter length connecting elements. However, too short a linking element makes the receptor factor impossible or inhibited from binding to the probe ligand. Therefore, in order to maximize the destabilizing effect and the binding of the receptor factor, the length of the linking element and other variables should be selected appropriately.
もう明らかなように、本発明は、非常に多様な標的受容体因子を検出し、さらには確認する用途に使用される。このような受容体因子の例には、直径約50nm未満、好ましくは直径約1nm乃至約25nm、より好ましくは約5nm乃至約15nmを典型的な有用な範囲とし、直径約10nmの大きさを有する受容体、抗体、そして酵素が含まれる。酵素の基質及び阻害剤、または炭水化物は、例えば長さや直径が数nmまたはそれ以下と多少小さいこともある。もし、受容体因子がその表面に受容体分子を有しているウイルスや微生物である場合、受容体因子の大きさは約100nmから数μm(または、約10μm)までの範囲にあっても良い。 As is apparent, the present invention is used for applications that detect and further confirm a wide variety of target receptor factors. Examples of such receptor factors have a useful range of less than about 50 nm in diameter, preferably from about 1 nm to about 25 nm, more preferably from about 5 nm to about 15 nm, and have a size of about 10 nm in diameter. Receptors, antibodies, and enzymes are included. Enzyme substrates and inhibitors, or carbohydrates, may be slightly smaller, for example, a few nanometers or less in length and diameter. If the receptor factor is a virus or microorganism having a receptor molecule on its surface, the size of the receptor factor may be in the range of about 100 nm to several μm (or about 10 μm). .
非常に多様な連結子、より具体的には連結要素が、本発明によって使用されることができる。一般的に、好ましい連結要素の長さ(すなわち、受容体因子または不安定化因子と核酸ベースのシグナルトランスデューサーとの間の距離)は、受容体因子の大きさ及び模様、または使用される不安定化因子に大きく依存する。しかし、大部分の場合、連結要素の長さは受容体因子(または、不安定化因子)の大きさと本質的に等しいか、やや短いもの、好ましくは、受容体因子(または、不安定化因子)の大きさの約1/2または1/4よりも短いものを使用することが、本発明に適している。あえて理論に合わせなくても、少なくとも受容体因子(または、不安定化因子)のある部分、特に不規則に突出した部分は、いくつかの場合において核酸ベースのシグナルトランスデューサーと接触すると考えられるが、例えば、受容体因子が回転運動をしたり、またはロッキング(rocking)運動(または、他の振動運動)をする中にこのような接触が起こることができる。いくつかの場合において、このような運動は、本発明の核酸ベースのシグナルトランスデューサーの立体構造的切替を招く不安定化力が造成されるようにする。 A great variety of connectors, more specifically connecting elements, can be used according to the invention. In general, the length of the preferred linking element (i.e., the distance between the receptor factor or destabilizing factor and the nucleic acid-based signal transducer) depends on the size and pattern of the receptor factor, or the amount used. Highly dependent on the stabilizing factor. However, in most cases, the length of the linking element is essentially equal to or slightly shorter than the size of the receptor factor (or destabilizing factor), preferably the receptor factor (or destabilizing factor) It is suitable for the present invention to use less than about 1/2 or 1/4 of the size of). Even if not dared to fit the theory, at least some of the receptor factors (or destabilizing factors), especially the irregularly protruding parts, are thought to contact nucleic acid-based signal transducers in some cases. For example, such contact can occur while the receptor factor is in a rotational motion or a rocking motion (or other vibrational motion). In some cases, such movement causes a destabilizing force to be created that results in a conformational switch of the nucleic acid-based signal transducer of the present invention.
本明細書に記述されたプローブと共に使用するのに適切なより具体的な連結要素は、柔軟性があり、自由に回転運動ができるリンカー(linker)及びこれと関連した構造体を含む。その例には、必要に応じて置換されたアルキル(alkyl)、アルキニル(alkenyl)、またはアルキニル(alkynyl)のような炭素鎖(好ましくは、直鎖)、ポリペプチド(または、ペプチド)鎖、ペプチド摸倣体(mimetic)または類似体、核酸鎖、合成高分子(polymer)または共重合体(co-polymer)鎖、そしてポリエチレングリコール鎖(polyethylene glycole chain)及びポリエステル鎖(polyester chain)のようなこれらの類似体を含む。この類型の連結要素は、受容体因子(または、不安定化因子)と核酸ベースのシグナルトランスデューサーとの間に充分な運動自由度が好ましい場合に好適である。 More specific linking elements suitable for use with the probes described herein include flexible and freely rotatable linkers and associated structures. Examples include carbon chains (preferably linear), polypeptide (or peptide) chains, peptides such as optionally substituted alkyl, alkenyl, or alkynyl. These such as mimetics or analogs, nucleic acid chains, polymer or co-polymer chains, and polyethylene glycole and polyester chains Including analogs of This type of linking element is suitable when a sufficient degree of freedom of movement is preferred between the receptor factor (or destabilizing factor) and the nucleic acid based signal transducer.
“必要に応じて置換された(optionally substituted)”という用語は、一つまたはそれ以上の可能な位置、典型的に1個乃至3個または4個の位置に一つまたはそれ以上の本明細書に開示されたような水素原子でない適切な基(group)が置換されたことを意味する。
“置換された”基(group)、部分(moiety)、または他の部位(site)に存在できる適切な基(group)は、本明細書に開示するように、次のものを含む:フルオロ(fluoro)、クロロ(chloro)、ブロモ(bromo)、そしてヨード(iodo)のようなハロゲン(halogen);シアノ(cyano);ヒドロキシル(hydroxyl);ニトロ(nitro);アジド(azido);アシル(acyl)及びその類似体のようなアルカノイル(alkanoyl)であって、例えば、C1-6アルカノイル(alkanoyl);カルボキシアミド(carboxamido);1個乃至約12個の炭素を有する、または1,2,3,4,5または6個の炭素を有するアルキル基(alkyl groups);一つまたはそれ以上の不飽和結合(unsaturated linkage)と2個乃至12個炭素、または2,3,4,5または6個の炭素を有するアルケニル(alkenyl)及びアルキニル(alkynyl)基;一つまたはそれ以上の酸素結合(oxygen linkages)と1個乃至12個の炭素、または1,2,3,4,5,または6個の炭素を有するアルコキシ(alkoxy)基;フェノキシ(phenoxy)のようなアリロキシ(aryloxy);一つまたはそれ以上のチオエーテル結合(thioether linkages)と1個乃至12個の炭素、または1,2,3,4,5または6個の炭素を有する部分を含むアルキルチオ(alkylthio)基;一つまたはそれ以上のスルフィニル結合(sulfinyl linkages)と1個乃至12個の炭素、または1,2,3,4,5または6個の炭素を有する部分を含むアルキルスルフィニル(alkyl sulfinyl)基;一つまたはそれ以上のスルホニル結合(sulfonyl linkages)と1個乃至12個の炭素、または1,2,3,4,5または6個の炭素を有する部分を含むアルキルスルホニル(alkylsulfonyl)基;一つまたはそれ以上の窒素原子と1個乃至12個の炭素、または1,2,3,4,5または6個の炭素を有する基のようなアミノアルキル(aminoalkyl)基;特にフェニル(phenyl)のような6個またはそれ以上の炭素を有するカルボサイクリックアリール(carbocyclic aryl)(例えば、置換または非置換されたビフェニル(biphenyl)部分をR基として持つもの);ベンジル(benzyl)を好ましい基とし、1個乃至3個の分離または融合された環構造と6個乃至18個の炭素を環原子として持つアラルキル(aralkyl);1個乃至3個の分離または融合された環構造とO-ベンジル(O-benzyl)のように6個乃至18個の炭素を環原子として持つアルアルコキシ(aralkoxy);または、一つ以上のN、O、またはS原子と各環当たり3個乃至約8個の構成原子を有する1個乃至3個の分離または融合された環構造を有するヘテロアロマチック(heteroaromatic)またはヘテロアリサイクリック(heteroalicyclic)基であって、例えば、クマリニル(coumarinyl)、キノリニル(quinolinyl)、ピリジル(pyridyl)、ピラジニル(pyrazinyl)、ピリミジル(pyrimidyl)、フリル(furyl)、ピロリル(pyrrolyl)、チエニル(thienyl)、チアゾリル(thiazolyl)、オキサゾリル(oxazolyl)、イミダゾリル(imidazolyl)、インドリル(indolyl)、ベンゾフラニル(benzofuranyl)、ベンゾチアゾリル(benzothiazolyl)、テトラヒドロフラニル(tetrahydrofuranyl)、ヒドロピラニル(tetrahydropyranyl)、ピペリジニル(piperidinyl)、モルホリノ(morpholino)及びピロリジニル(pyrrolidinyl)。
The term “optionally substituted” refers to one or more of the present specification in one or more possible positions, typically one to three or four positions. Means that a suitable group which is not a hydrogen atom as disclosed in.
Suitable groups that can be present in “substituted” groups, moieties, or other sites include the following: as disclosed herein: fluoro ( halogens such as fluoro, chloro, bromo, and iodo; cyano; hydroxyl; nitro; azido; acyl And alkanoyl such as C 1-6 alkanoyl; carboxamido; having 1 to about 12 carbons, or 1, 2, 3, Alkyl groups having 4, 5 or 6 carbons; one or more unsaturated linkages and 2 to 12 carbons, or 2, 3, 4, 5 or 6 carbons Alkenyl and alkynyl groups having carbon; one or more oxygen bonds n linkages) and an alkoxy group having 1 to 12 carbons, or 1, 2, 3, 4, 5, or 6 carbons; aryloxy such as phenoxy; one Or an alkylthio group containing a moiety having one or more thioether linkages and 1 to 12 carbons, or 1, 2, 3, 4, 5, or 6 carbons; An alkyl sulfinyl group comprising a sulfinyl linkages of 1 to 12 carbons, or a moiety having 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbons; Alkylsulfonyl groups containing sulfonyl linkages and moieties having 1 to 12 carbons, or 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbons; one or more nitrogen atoms 1 to 12 Or an aminoalkyl group such as a group having 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbons; in particular carbosai having 6 or more carbons such as phenyl Carbocyclic aryl (eg, having a substituted or unsubstituted biphenyl moiety as the R group); one to three separate or fused ring structures with benzyl as the preferred group And aralkyl having 6 to 18 carbons as ring atoms; 1 to 3 separated or fused ring structures and 6 to 18 carbons such as O-benzyl 1 to 3 separated or fused with one or more N, O, or S atoms and 3 to about 8 member atoms per ring Heteroaromatic with a ring structure (heteroaromatic) or heteroalicyclic groups, for example, coumarinyl, quinolinyl, pyridyl, pyrazinyl, pyrimidyl, furyl, pyrrolyl ( pyrrolyl), thienyl, thiazolyl, oxazolyl, imidazolyl, indolyl, benzofuranyl, benzothiazolyl, tetrahydrofuranyl, hydropyranyl, tetrahydropyranyl, tetrahydropyranyl (piperidinyl), morpholino and pyrrolidinyl.
本発明の特定実施形態において、必要に応じて置換されたアルケニル(alkenyl)またはアルキニル(alkynyl)鎖のようにより組織化した、つまり、低い運動自由度を持つ連結要素を使用するか、または、一つの認識要素に2個以上の連結要素を連結して自由な回転運動またはロッキング(rocking)運動(または、他の振動運動)をほとんど許さないように使用することがより好ましいこともある。追加的な連結要素は、デンドリマー(dendrimer)で構成されたものまたはこれを含むものを含む。もちろん、既に述べられた柔軟性があり、かつ、自由に回転できる連結要素に、フェニル(phenyl)、ベンジル(benzyl)などのような一つまたはそれ以上の必要に応じて置換された環構造システムを導入することによって、より低い柔軟性を持たせることができる。あえて理論に合わせなくても、一部の実施形態において、特定受容体因子(または、不安定化因子)は、低い運動自由度を持つ連結要素を使用することによって、前記核酸ベースのシグナルトランスデューサーに対して強く不安定化された立体構造として固着されることができる。本発明による好適な連結要素の鎖長(または、受容体因子(または、不安定化因子)と核酸ベースのシグナルトランスデューサーとの距離)は、受容体因子の大きさ(典型的に、約1nm乃至約10nm)にたびたび依存するが、一般的に約1nm乃至約100nm、最も典型的には約1nm乃至約10nmとなる。 In certain embodiments of the invention, a linking element is used that is more organized like an optionally substituted alkenyl or alkynyl chain, i.e., has a low degree of freedom of movement, or one It may be more preferable to use two or more connecting elements in one recognition element, so that little free rotational or rocking movement (or other vibration movement) is allowed. Additional connecting elements include those composed of or including dendrimers. Of course, a ring structure system with one or more optionally substituted linkages, such as phenyl, benzyl, etc., on the flexible and freely rotatable connecting elements already mentioned. By introducing, lower flexibility can be provided. Although not in theory, in some embodiments, specific receptor factors (or destabilizing factors) can be generated by using the nucleic acid-based signal transducer by using a linking element that has a low degree of freedom of movement. It can be fixed as a strongly destabilized three-dimensional structure. The chain length (or the distance between the receptor factor (or destabilizing factor) and the nucleic acid based signal transducer) of the preferred linking element according to the present invention is the size of the receptor factor (typically about 1 nm). From about 1 nm to about 10 nm), but generally from about 1 nm to about 100 nm, most typically from about 1 nm to about 10 nm.
他の考慮もまた、ある特定の発明の応用に適合するように好ましい連結要素の長さを決定するのに有用である。より具体的に、一部の実施形態において、前記連結要素の典型的に好ましい長さは、受容体因子(または、不安定化因子)の結合部位(binding site)の深さと略同じか、やや大きいものとなる。例えば、多くの実施形態において、抗体標的因子の結合部位は、約0.5nm乃至約3.5nmの深さを有し、受容体と酵素との結合部位は、典型的に約0.5nm乃至約5nmの深さを有するものと知られている。ファンデルワールス相互作用(van der Waals interaction)は、典型的に約0.3nm乃至0.5nm距離の範囲で生じ、電荷-電荷または静電気的斥力(charge-charge or electrostatic repulsion)は、より長い距離の範囲(数nmまたはより長い距離)で生じ、核電荷斥力(nuclear charge repulsion)は、より短い距離の範囲(約0.1nmまたはより短い距離)で生じるものと一般的に知られている。したがって、あえて理論に合せなくても、前記連結要素の好ましい長さは、約1nm(または、これよりも短い距離)乃至約10nm、または好ましくは約1nm乃至約5nmの範囲内にあることになる。 Other considerations are also useful in determining the preferred connecting element length to suit a particular invention application. More specifically, in some embodiments, the typically preferred length of the linking element is about the same as or somewhat the depth of the binding site of the receptor factor (or destabilizing factor). It will be big. For example, in many embodiments, the binding site of the antibody targeting agent has a depth of about 0.5 nm to about 3.5 nm, and the binding site of the receptor and the enzyme is typically about 0.5 nm to It is known to have a depth of about 5 nm. Van der Waals interaction typically occurs in the range of about 0.3 nm to 0.5 nm distance, with charge-charge or electrostatic repulsion being longer distances. It is generally known that nuclear charge repulsion occurs at shorter distance ranges (about 0.1 nm or shorter distances). Thus, even without being in theory, the preferred length of the linking element will be in the range of about 1 nm (or shorter distance) to about 10 nm, or preferably about 1 nm to about 5 nm. .
受容体因子とプローブリガンドとの複合体の構造が、本発明の属する技術分野に知られているか、コンピュータシミュレーションを用いて計算できる場合、前記連結要素の好ましい長さまたは構造を予測したり推定したりすることも可能である。しかし、複雑な検出溶液内でのプローブの行動を、確実性をもって予測することが常に可能なわけではないので、実験的検証により試験するのが、本発明によるプローブを最適化させることにおいて非常に有用である。
本発明による親和性プローブは、多様な受容体因子を検出するのに有用である。本発明において、“受容体(receptor)”及び“リガンド(ligand)”という用語は、一つの結合対(binding pair)の一部分を含む広い意味として使用された。本明細書に使用されるように、“受容体または受容体因子”という用語は、プローブリガンドのような“リガンド”と本明細書で言う相補的分子性物質(complementary molecular entity)に特異的に結合するほとんどあらゆる分子性物質を意味する。前記受容体因子の例は、タンパク質、糖タンパク質(glycoprotein)、ポリペプチド(polypeptide)、炭水化物(carbohydrate)、脂質(lipid)、リン脂質(phospholipid)、核酸、抗体、抗体断片、抗原、酵素、受容体、ホルモン(hormone)、サイトカイン(cytokine)、ウイルス(virus)、細菌(bacteria)、微生物(microorganism)、及びこれらの機能性断片を含んだ類似体を含むが、これに限定されず、さらに、超分子(例えば、クラウンエーテル(crown ether)やこれと類似する化合物)とナノ粒子のように生物学的根源でない受容体因子を含む。前記プローブリガンドの例は、化学的及び生化学的リガンド、抗原、抗体、抗体断片、酵素、酵素の基質または阻害剤、ホルモン、抗生剤(antibiotic)、麻薬(narcotic)、毒素(toxin)、ポリペプチド(polypeptide)、タンパク質、タンパク質断片、標的配列(targeting sequence)またはトランジットペプチド(transit peptide)、糖タンパク質(glycoprotein)、脂質(lipid)、リン脂質(phospholipid)、多糖(polysaccaharide)、炭水化物(carbohydrate)、核酸、ペプチド核酸(peptide nucleic acid)及びこれらの類似体を含む。プローブリガンドに受容体因子が特異的に結合し、このような結合が好ましい立体構造的変化をもたらす限り、ほとんどあらゆる種類のリガンドがプローブリガンドとして使用されることができる。プローブリガンドを接合させる上でさらに考慮すべき点は、プローブリガンドの接合が受容体因子の結合を不可能にしたり実質的に妨害してはならないということである。
If the structure of the complex of receptor factor and probe ligand is known in the technical field to which the present invention belongs or can be calculated using computer simulation, the preferred length or structure of the linking element is predicted or estimated. It is also possible to do. However, since it is not always possible to predict with certainty the behavior of a probe in a complex detection solution, testing with experimental verification is very important in optimizing the probe according to the invention. Useful.
The affinity probes according to the present invention are useful for detecting a variety of receptor factors. In the present invention, the terms “receptor” and “ligand” have been used in a broad sense to include a portion of one binding pair. As used herein, the term “receptor or receptor factor” refers specifically to a “complementary molecular entity” referred to herein as a “ligand” such as a probe ligand. It means almost any molecular substance that binds. Examples of the receptor factor include proteins, glycoproteins, polypeptides, carbohydrates, carbohydrates, lipids, phospholipids, nucleic acids, antibodies, antibody fragments, antigens, enzymes, receptors Including, but not limited to, the body, hormones, cytokines, viruses, bacteria, microorganisms, and analogs containing these functional fragments. Contains supramolecules (eg, crown ethers and similar compounds) and receptor factors that are not biological sources, such as nanoparticles. Examples of said probe ligands are chemical and biochemical ligands, antigens, antibodies, antibody fragments, enzymes, enzyme substrates or inhibitors, hormones, antibiotics, narcotics, toxins, polys. Peptide (polypeptide), protein, protein fragment, targeting sequence or transit peptide, glycoprotein, lipid, phospholipid, polysaccharide (polysaccaharide), carbohydrate , Nucleic acids, peptide nucleic acids and analogs thereof. Almost any type of ligand can be used as the probe ligand, as long as the receptor factor specifically binds to the probe ligand and such binding results in a favorable conformational change. An additional consideration in conjugating probe ligands is that probe ligand conjugation should not disable or substantially interfere with receptor factor binding.
図3は、検出可能なラベルを持たない非競合的方式の切断性プローブを示す図である。
切断性プローブにおいて、認識要素3は、反応誘発因子20に特異的な少なくとも一つの切断部位21と不安定化因子22を含むプローブ基質である。前記少なくとも一つの切断部位の一末端はリンカー23により、典型的に共有結合または非共有結合的に前記不安定化因子に接合されている。前記リンカーの例は、化学結合(chemical bond)、二価原子(divalent atom)、二価の化学部分(divalent chemical moiety)、及び多価の化学部分(multivalent chemical moiety)を含む。前記切断部位の他の末端は、第1対象配列1aまたは第1相補配列2aのいずれの位置にも連結要素4により接合されることができる。本発明によれば、一つ以上のプローブ基質(すなわち、認識要素)が接合されることができる。
“反応誘発因子(reaction-inducing agent)”という用語は、切断させる分子(cleaving molecule)を意味するが、一般に、少なくとも前記認識要素の一部分を加水分解(hydrolyze)しうる化学物質または酵素のようなタンパク質配列を意味する。このような加水分解は、可逆的にまたは非可逆的に前記切断部位、及び/または、例えば前記認識要素の他の部分を切断することができる。好ましい酵素の例は、本明細書に記述されるように、一般的にプロテアーゼ(protease)、エンドヌクレアーゼ(endonuclease)、リパーゼ(lipase)、グリコシダーゼ(glycosidase)及びこれらの類似体を含む。化学的反応誘発因子の例は後述される。
FIG. 3 shows a non-competitive cleaving probe with no detectable label.
In the cleaving probe, the
The term “reaction-inducing agent” means a cleaving molecule, but in general, such as a chemical or enzyme that can hydrolyze at least a portion of the recognition element. Refers to protein sequence. Such hydrolysis can reversibly or irreversibly cleave the cleavage site and / or other parts of the recognition element, for example. Examples of preferred enzymes generally include proteases, endonucleases, lipases, glycosidases and analogs thereof as described herein. Examples of chemical reaction inducing factors are described below.
本発明の本実施形態において、前記反応誘発因子は、前記切断部位を特異的に切断し、前記第1ハイブリダイズした二重鎖を不安定化させる前記不安定化因子を放出させる。したがって、前記非競合的切断性プローブは、前記反応誘発因子により前記切断部位が切断されることによって、解離した立体構造(図3A)からハイブリダイズした立体構造(図3B)へ立体構造的変化を起こすように考案されている。具体的に、前記切断による立体構造的変化は、前記ハイブリダイズした立体構造にある確率の増加と前記解離した立体構造にある確率の減少を招く。
望む立体構造的変化を誘発するためには、前記不安定化因子が前記第1ハイブリダイズした二重鎖を十分に強く不安定化させなければならない。十分に強い不安定化効果を発生させる限り、ほとんどあらゆる種類の不安定化因子が使用されることができる。大きな大きさを有するタンパク質やタンパク質複合体を不安定化因子として使用することが好ましいが、これは、大きな大きさによって立体障害(steric hindrance)が容易に発生するためである。好ましい実施形態において、前記切断部位の一末端に連結されているビオチン(biotin)に結合しているストレプトアビジン(streptavidin)またはその誘導体を不安定化因子として使用することができる。ビオチンを連結するための化学は、本発明の属する技術分野によく知られている。好ましい切断性プローブにおいて、前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度は、切断により少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃上昇する。
In this embodiment of the present invention, the reaction inducing factor specifically cleaves the cleavage site and releases the destabilizing factor that destabilizes the first hybridized duplex. Therefore, the non-competitive cleavage probe undergoes a conformational change from a dissociated conformation (FIG. 3A) to a hybridized conformation (FIG. 3B) by cleaving the cleavage site by the reaction inducer. Designed to wake up. Specifically, the conformational change due to the cleavage causes an increase in the probability of being in the hybridized conformation and a decrease in the probability of being in the dissociated conformation.
In order to induce the desired conformational change, the destabilizing factor must destabilize the first hybridized duplex sufficiently strongly. Almost any kind of destabilizing factor can be used as long as it produces a sufficiently strong destabilizing effect. It is preferable to use a protein or protein complex having a large size as a destabilizing factor, because steric hindrance easily occurs due to the large size. In a preferred embodiment, streptavidin or a derivative thereof bound to biotin linked to one end of the cleavage site can be used as a destabilizing factor. The chemistry for linking biotin is well known in the technical field to which the present invention belongs. In preferred cleavable probes, the melting temperature of the first hybridized duplex is increased by at least about 1 ° C, more preferably at least about 5 ° C upon cleavage.
好ましい実施形態において、前記反応誘発因子が存在しないときに、前記ハイブリダイズした立体構造は、検出温度を含むアッセイ条件下で熱力学的に不安定である。典型的に、この方式の好ましい切断反応性プローブでは、前記反応誘発因子が存在しない時における前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が検出温度よりも低いが、好ましくは少なくとも約5℃、より好ましくは少なくとも約10℃低い。
図4は、競合する核酸配列対である第2核酸配列対をさらに含む競合的方式の切断性プローブを示す。好ましい実施形態において、切断部位21は、重複領域1cを除いた第1対象配列1a、または第1相補配列2aに接合されている。この競合的切断性プローブは、切断部位が切断されることによって、第2ハイブリダイズした二重鎖が形成される第2ハイブリダイズした立体構造(図4A)から、第1ハイブリダイズした二重鎖が形成される第1ハイブリダイズした立体構造(図4B)へ立体構造的変化を起こすように考案されている。具体的に、この切断により誘発された立体構造的変化は、前記第1ハイブリダイズした立体構造にある確率の増加と前記第2ハイブリダイズした立体構造にある確率の減少を招く。
In a preferred embodiment, in the absence of the reaction inducer, the hybridized conformation is thermodynamically unstable under assay conditions including the detection temperature. Typically, preferred cleavage reactive probes of this format have a melting temperature of the first hybridized duplex in the absence of the reaction inducer below the detection temperature, preferably at least about 5 ° C, More preferably it is at least about 10 ° C lower.
FIG. 4 shows a competitive-type cleavable probe further comprising a second nucleic acid sequence pair that is a competing nucleic acid sequence pair. In a preferred embodiment, the
望む立体構造的変化を誘発するためには、前記不安定化因子が前記第1ハイブリダイズした二重鎖を十分に強く不安定化させ、かつ、前記第2ハイブリダイズした二重鎖を十分に弱く不安定化させるか、全く不安定化させてはならない。前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が、前記切断部位が切断されることによって少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃増加することが好ましい。
好ましい実施形態において、前記反応誘発因子が存在しないときに、前記第2ハイブリダイズした二重鎖が前記第1ハイブリダイズした二重鎖に比べて優先的に形成される。好ましくは、前記反応誘発因子が存在しないときに、前記第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度は、前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度と比較して少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃高い。切断が起こることによってハイブリダイゼーションの選好度が、前記第1ハイブリダイズした二重鎖を好むように変わることがより好ましい。好ましくは、前記反応誘発因子が過量存在するときに、前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度は、前記第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度よりも少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃高い。
In order to induce the desired conformational change, the destabilizing factor destabilizes the first hybridized duplex sufficiently strongly and the second hybridized duplex sufficiently Do not destabilize weakly or at all. Preferably, the melting temperature of the first hybridized duplex is increased by at least about 1 ° C., more preferably at least about 5 ° C. due to cleavage of the cleavage site.
In a preferred embodiment, when the reaction inducer is not present, the second hybridized duplex is preferentially formed as compared to the first hybridized duplex. Preferably, when the reaction inducer is not present, the melting temperature of the second hybridized duplex is at least about 1 ° C., more preferably compared to the melting temperature of the first hybridized duplex. Is at least about 5 ° C higher. It is more preferable that the preference of hybridization changes so as to prefer the first hybridized duplex when cleavage occurs. Preferably, when the reaction inducer is present in excess, the melting temperature of the first hybridized duplex is at least about 1 ° C., more preferably, than the melting temperature of the second hybridized duplex. At least about 5 ° C higher.
好ましい実施形態において、前記反応誘発因子が存在しないときに、検出温度を含むアッセイ条件下で前記第2ハイブリダイズした二重鎖は熱力学的に安定しているが、前記第1ハイブリダイズした二重鎖は不安定または低安定している。典型的に、本実施形態の好ましい切断性プローブでは、前記反応誘発因子が存在しない時における前記第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が検出温度よりも高いが、好ましくは少なくとも約5℃、より好ましくは少なくとも約10℃高い。
上述の切断性プローブにおいて、前記不安定化因子と前記プローブ基質の接合される核酸配列との距離は、充分に強い不安定化効果を誘発するために調節(最適化)されることができる。大部分の本発明の実施形態において、より短い距離がより強い不安定化を生じさせる。より大きい不安定化因子を使用することによって、より強い不安定化を誘発することも可能である。しかし、短すぎる距離または大きすぎる大きさは前記反応誘発因子の活性を遮断したり抑制したりすることがある。したがって、前記不安定化効果と前記反応誘発因子の活性を最大化するためには、このような変数を適切に選択すべきである。
In a preferred embodiment, the second hybridized duplex is thermodynamically stable under assay conditions including a detection temperature in the absence of the reaction inducer, but the first hybridized duplex. The heavy chain is unstable or less stable. Typically, in a preferred cleavable probe of this embodiment, the melting temperature of the second hybridized duplex in the absence of the reaction inducing agent is higher than the detection temperature, preferably at least about 5 ° C, More preferably, it is at least about 10 ° C higher.
In the above-described cleaving probe, the distance between the destabilizing factor and the nucleic acid sequence to which the probe substrate is conjugated can be adjusted (optimized) to induce a sufficiently strong destabilizing effect. In most embodiments of the present invention, shorter distances cause stronger destabilization. It is also possible to induce stronger destabilization by using larger destabilizing factors. However, distances that are too short or too large may block or inhibit the activity of the reaction-inducing factor. Therefore, such variables should be selected appropriately to maximize the destabilizing effect and the activity of the reaction-inducing factor.
本発明による特定切断性プローブは、前記切断部位を切断する特異的活性を有する反応誘発因子を検出するのに有用である。既に言及したように、本発明は、様々に変形可能であり、特定切断部位への使用に限定されるのではない。切断部位の例は、プロテアーゼ(protease)、エンドヌクレアーゼ(endonuclease)、リパーゼ(lipase)、及びグリコシダーゼ(glycosidase)のように細胞内で切断活性を有する多様な酵素に対して特異的なものを含むが、これに限定されない。特定ペプチド結合を特異的に切断するものと知られた臭化シアン(cyanogens bromide:CNBr)とヒドロキシルアミン(hydroxylamine:NH2-OH)のような化学的切断試薬も本発明に含まれる。前記反応誘発因子によって前記切断部位の実体は多様に変わることができる。例えば、前記切断部位は、プロテアーゼではアミノ酸配列となり、エンドヌクレアーゼでは二本鎖DNA配列となり、リパーゼでは脂質、そしてグリコシダーゼでは炭水化物となる。 The specific cleaving probe according to the present invention is useful for detecting a reaction inducer having a specific activity for cleaving the cleavage site. As already mentioned, the present invention can be modified in various ways and is not limited to use at specific cleavage sites. Examples of cleavage sites include those specific to a variety of enzymes that have cleavage activity in the cell, such as proteases, endonucleases, lipases, and glycosidases. However, the present invention is not limited to this. Chemical cleavage reagents such as cyanogens bromide (CNBr) and hydroxylamine (NH 2 —OH) known to specifically cleave specific peptide bonds are also included in the present invention. The entity of the cleavage site can be variously changed according to the reaction inducing factor. For example, the cleavage site is an amino acid sequence for proteases, a double-stranded DNA sequence for endonucleases, a lipid for lipases, and a carbohydrate for glycosidases.
次いで、本発明による多様な特異的切断部位について述べる。例えば、ヒトへパラナーゼ-1(human heparanase-1)に特異的な切断部位は重要な例である。へパラナーゼ-1は、腫瘍細胞の転移に関係すると見られるエンドグリコシダーゼ(endoglycosidase)である。
へパラナーゼ-1は、細胞外マトリックス(extracellular matrix)を分解することによって、腫瘍細胞が組織関門(tissue barrier)を通過して侵入することを媒介するものと知られている。ヒトヘパラナーゼ-1に特異的なオリゴ糖(oligosaccharide)切断部位の例(1)を、表1に示す。
Next, various specific cleavage sites according to the present invention will be described. For example, a cleavage site specific for human heparanase-1 is an important example. Heparanase-1 is an endoglycosidase that appears to be involved in tumor cell metastasis.
Heparanase-1 is known to mediate the entry of tumor cells through the tissue barrier by degrading the extracellular matrix. Table 1 shows an example (1) of an oligosaccharide cleavage site specific for human heparanase-1.
(2)ΔHexUA、GlcN、及びGlcUAはそれぞれ、不飽和ヘキスロン酸(unsaturated hexuronic acid)、グルコサミン(glucosamine)、及びグルクロン酸(glucuronic acid)を表す。2S、3S、6S、及びNSはそれぞれ、2-O、3-O、6-O、及び2-N-硫酸化(sulfation)を表す。切断の位置は“/”で表す。
(2) ΔHexUA, GlcN, and GlcUA represent unsaturated hexuronic acid, glucosamine, and glucuronic acid, respectively. 2S, 3S, 6S, and NS represent 2-O, 3-O, 6-O, and 2-N-sulfation, respectively. The cutting position is represented by “/”.
プロテアーゼ特異的切断部位は、多種の哺乳類またはウイルスのプロテアーゼがヒト疾病と関連していることから、やはり非常に重要である。
さらに好ましいプロテアーゼ切断部位は、例えば、酵母(yeast)、細菌(bacterium)、真菌類(fungus)、線虫(nematode)、ウイルス(virus)または原生動物(protozoan)のような、ヒト病原体と関連しているプロテアーゼにより特異的に加水分解されるものである。より具体的な例は、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus:CMV);単純ヘルペスウイルス(herpes simplex virus:HSV);肝炎ウイルス(hepatitis virus)、好ましくはA型またはC型;ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus: HIV)、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(Kaposi's sarcoma-associated herpes virus: KSHV)、黄熱ウイルス(yellow fever virus)、フラビウイルス(flavivirus)、ライノウイルス(rhinovirus)、またはP.ファルシパルム(P. falciparum)、P.ビバックス(P. vivax)、P.オバレ(P. ovale)、またはP.マラリエ(P. malariae)のようなマラリア原虫(plasmodium)を含む。典型的に、前記マラリア原虫は、マラリアやマラリアと関連した多様な合併症を誘発する。プラスメプシンI(plasmepsin I)とプラスメプシンII(plasmepsin II)プロテアーゼがこのような疾病と関連しているということが知られている。HSVを対象とする実施形態において、前記プロテアーゼは、HSVの成熟したプロテアーゼ(maturational protease)となる。
Protease-specific cleavage sites are also very important since various mammalian or viral proteases are associated with human diseases.
Further preferred protease cleavage sites are associated with human pathogens, such as, for example, yeast, bacteria, fungus, nematode, virus or protozoan. It is specifically hydrolyzed by the protease. More specific examples are cytomegalovirus (CMV); herpes simplex virus (HSV); hepatitis virus, preferably type A or C; human immunodeficiency virus : HIV), Kaposi's sarcoma-associated herpes virus (KSHV), yellow fever virus, flavivirus, rhinovirus, or P. cerevisiae. P. falciparum, P. P. vivax, P.I. P. ovale or P. ovale Contains malaria plasmodium such as P. malariae. Typically, the malaria parasite induces various complications associated with malaria and malaria. It is known that plasmepsin I and plasmepsin II proteases are associated with such diseases. In an embodiment directed to HSV, the protease is a mature protease of HSV.
特定のHIV-1とHCVのプロテアーゼに特異的な多様な切断部位が公知されている。その例には、Gluzman,I.Y.et al.,J.Clin.Invest.,94:1602(1994);Grakoui,A.et al.,J.of Virol.,67:2832(1993);Kolykholov,AA.et al.,J.of Virol.,68:7525(1994);及びBarrie,K.A.et al.,Virology,219:407(1996)があり、これら参考文献に公知された内容は、本発明の参考資料として組み込まれる。
なお、病源体-特異的プロテアーゼ及び特異的切断部位が公知されたことがあり、これらは、本発明に合わせて使用されることができる。例えば、HSV-1の成熟したプロテアーゼとその切断部位が開示されている(Hall,M.R.T.及びW.Gibson,Virology,227:160(1997)参照)。また、プラスメプシンI及びII(plasmepsins I and II)は、P.ファルシパルム(P. falciparum)の消化液胞(digestive vacuole)から発見されたし、これに相応するプロテアーゼ切断部位もまた公知されている(Moon,R.P.,Eur.J.Biochem.,244:552(1997)参照)。
A variety of cleavage sites specific for specific HIV-1 and HCV proteases are known. Examples include Gluzman, IY et al., J. Clin. Invest., 94: 1602 (1994); Grakoui, A. et al., J. of Virol., 67: 2832 (1993); Kolykholov, AA. et al., J. of Virol., 68: 7525 (1994); and Barrie, KAet al., Virology, 219: 407 (1996), and the contents known in these references are the reference material of the present invention. Incorporated as.
In addition, the pathogen-specific protease and the specific cleavage site have been known, and these can be used in accordance with the present invention. For example, the mature protease of HSV-1 and its cleavage site have been disclosed (see Hall, MRT and W. Gibson, Virology, 227: 160 (1997)). In addition, plasmepsins I and II are described in P. A corresponding protease cleavage site was also known from the digestive vacuole of P. falciparum (Moon, RP, Eur. J. Biochem., 244: 552). 1997)).
本発明に使用するための追加的なプロテアーゼ特異的切断部位は、血液凝固(blood coagulation)、アポトーシス(apoptosis)、アルツハイマー病(Alzheimer's disease)、または細胞外マトリックス(extracellular matrix)と関連する哺乳類のプロテアーゼにより特異的に切断される。
プロテアーゼ特異的切断部位の例を、表2に示す。
(1)知られている場合、切断の位置は“/”で表す。
Additional protease-specific cleavage sites for use in the present invention include mammalian proteases associated with blood coagulation, apoptosis, Alzheimer's disease, or extracellular matrix. Cleaved specifically.
Examples of protease specific cleavage sites are shown in Table 2.
(1) When known, the cutting position is indicated by “/”.
次に、本発明による第I型、第II型、及び第II(−)型連結性プローブの特定の例について述べる。
図5及び図6は、検出可能なラベルを持たない非競合的方式の第I型及び第II型連結性プローブを示す。図5に示す第I型連結性プローブにおいて、認識要素3は、反応誘発因子の特異的作用により不安定化因子31が(典型的に共有結合にて)接合可能な反応部位31である。この不安定化因子は、前記反応誘発因子が存在するときに、前記反応部位と共有結合または非共有結合を形成しうる少なくとも一つの反応基33を有している。
図6に示す第II型連結性プローブにおいて、認識要素3は、反応誘発因子40の特異的作用により特異的に接合部位42へ変換しうる反応部位41である。この接合部位は、不安定化因子43が接合されうる部位である。この不安定化因子は、自発的にまたは連結因子(coupling agent)の存在下で前記接合部位に共有結合または非共有結合的に連結される少なくとも一つの反応基44を有する基質であるか、または、前記接合部位に特異的に結合しうる受容体因子でありうる。前記不安定化因子の連結(coupling)または結合(binding)は、前記接合部位に対して特異的でなければならない。
Next, specific examples of type I, type II, and type II (−) connectivity probes according to the present invention are described.
FIGS. 5 and 6 show non-competitive type I and type II connectivity probes without detectable labels. In the type I connectivity probe shown in FIG. 5, the
In the type II connectivity probe shown in FIG. 6, the
この代わりに、さらに第II型連結性プローブを、最初は不安定化因子が接合可能な一つの接合部位(conjugation site)として作用するが、反応誘発因子の作用により非接合性部位(non-conjugatable site)へ変換される反応部位を含むように変形して構成することができる。このようなプローブは、本明細書で“第II(−)型連結性プローブ”と呼ばれる。
図7に示す第II(−)型連結性プローブにおいて、不安定化因子53は、反応誘発因子が存在しないときにはプローブ、特に反応部位51(すなわち、認識部位3)に接合されることができるが、反応誘発因子50の作用により反応部位51が非接合性部位52へ変換されると、当該プローブに接合できなくなる。不安定化因子53は、反応部位51に共有結合または非共有結合的に連結されうる少なくとも一つの反応基54を有している基質でありうる。上記の第II型連結性プローブと共に使用される不安定化因子は、当該の第II(−)型結合性プローブとも共に使用されることができる。
上記の非競合的方式の第I型、第II型及び第II(−)型連結性プローブにおいて、一つまたはそれ以上の反応部位が、第1対象配列1aまたは第1相補配列2aのいずれの位置にも接合可能である。各反応部位は、連結要素4により、典型的に共有結合にて接合される。
Instead, type II connectivity probes initially act as a single conjugation site to which the destabilizing factor can be conjugated, but non-conjugatable by the action of the reaction-inducing factor. It can be modified to include a reaction site that is converted to (site). Such a probe is referred to herein as a “Type II (−) connectivity probe”.
In the type II (−) connectivity probe shown in FIG. 7, the
In the non-competitive type I, type II, and type II (−) connectivity probes, one or more reaction sites are either the
非競合的方式の前記第I型及び第II型連結性プローブは、前記反応誘発因子の作用により前記不安定化因子が前記反応部位に結合または接合されることによって、ハイブリダイズした立体構造(図5A及び6A)から、解離した立体構造(図5B及び6C)へ立体構造的変化を起こすように考案されている。具体的に、前記連結により誘発された立体構造的変化は、前記ハイブリダイズした立体構造にある確率の減少と前記解離した立体構造にある確率の減少を招く。
非競合的方式の前記第II(−)型連結性プローブは、前記反応誘発因子の作用により、解離した立体構造(図7C)からハイブリダイズした立体構造(図7B)へ立体構造的変化を起こすように考案されており、このような立体構造的変化によって、前記ハイブリダイズした立体構造にある確率の増加と前記解離した立体構造にある確率の減少が起こる。
The type I and type II connectivity probes in a non-competitive manner are hybridized three-dimensional structures by binding or joining the destabilizing factor to the reaction site by the action of the reaction inducing factor (FIG. It is devised to cause a conformational change from 5A and 6A) to a dissociated conformation (FIGS. 5B and 6C). Specifically, the conformational change induced by the ligation leads to a decrease in the probability of being in the hybridized conformation and a decrease in the probability of being in the dissociated conformation.
The non-competitive type II (−) type linking probe causes a conformational change from a dissociated conformation (FIG. 7C) to a hybrid conformation (FIG. 7B) by the action of the reaction inducer. Such a conformational change causes an increase in the probability of being in the hybridized conformation and a decrease in the probability of being in the dissociated conformation.
望む立体構造的変化を誘発するためには、前記不安定化因子が前記第1ハイブリダイズした二重鎖を十分に強く不安定化させなければならない。十分に強い不安定化効果を生じさせる限り、ほとんどあらゆる種類の不安定化因子が使用されることができる。大きい大きさを有するタンパク質やタンパク質複合体を不安定化因子として使用することが好ましいが、これは、大きな大きさによって立体障害(steric hindrance)が容易に発生できるためである。好ましい実施形態において、連結反応のための少なくとも一つの反応基を有する修飾されたビオチン(modified biotin)に結合しているストレプトアビジン(streptavidin)またはその誘導体を不安定化因子として使用することができる。ビオチンを修飾するための化学は、本発明の属する技術分野でよく知られている。前記第II型及び第II(−)型連結性プローブの他の好ましい実施形態において、前記接合部位(前記第II(−)型連結性プローブでは反応部位)に特異的に結合しうる抗体や受容体またはこれらの類似体を不安定化因子として使用することができる。好ましいプローブにおいて、前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度は、前記不安定化因子の連結または接合により少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃減少する。 In order to induce the desired conformational change, the destabilizing factor must destabilize the first hybridized duplex sufficiently strongly. Almost any type of destabilizing factor can be used as long as it produces a sufficiently strong destabilizing effect. It is preferable to use a protein or protein complex having a large size as a destabilizing factor, because steric hindrance can easily occur due to the large size. In a preferred embodiment, streptavidin or a derivative thereof bound to modified biotin having at least one reactive group for the ligation reaction can be used as a destabilizing factor. Chemistry for modifying biotin is well known in the art to which the present invention belongs. In another preferred embodiment of the type II and type II (−) connectivity probes, an antibody or a receptor capable of specifically binding to the junction site (the reaction site in the type II (−) connectivity probe). Bodies or their analogs can be used as destabilizing factors. In preferred probes, the melting temperature of the first hybridized duplex is reduced by at least about 1 ° C., more preferably at least about 5 ° C., due to ligation or conjugation of the destabilizing factor.
非競合的方式の前記第I型及び第II型連結性プローブの好ましい実施形態において、前記反応誘発因子が存在しないときに、前記ハイブリダイズした立体構造は、検出温度を含むアッセイ条件下で熱力学的に安定している。典型的に、この方式の好ましい第I型及び第II型連結性プローブでは、前記反応誘発因子が存在しない時における前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が検出温度よりも高いが、好ましくは少なくとも約5℃、より好ましくは少なくとも約10℃高い。
非競合的方式の前記第II(−)型連結性プローブの好ましい実施形態において、前記不安定化因子が前記プローブに結合しており、前記反応誘発因子が存在しないときに、前記解離した立体構造は、検出温度を含むアッセイ条件下で熱力学的に安定している。典型的に、この方式の好ましい第II(−)型連結性プローブでは、前記反応誘発因子が存在しない時(前記不安定化因子が結合されている状態)における前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が検出温度よりも低いが、好ましくは少なくとも約5℃、より好ましくは少なくとも約10℃低い。
In a preferred embodiment of the type I and type II connectivity probes in a non-competitive manner, when the reaction inducer is not present, the hybridized conformation is thermodynamic under assay conditions including the detection temperature. Stable. Typically, in preferred Type I and Type II connectivity probes of this format, the melting temperature of the first hybridized duplex in the absence of the reaction inducer is higher than the detection temperature, but preferably Is at least about 5 ° C, more preferably at least about 10 ° C higher.
In a preferred embodiment of the type II (-) connectivity probe in a non-competitive manner, the dissociated conformation when the destabilizing factor is bound to the probe and the reaction inducing agent is not present Is thermodynamically stable under assay conditions including the detection temperature. Typically, in this type of preferred type II (-) linking probe, the first hybridized duplex in the absence of the reaction inducing factor (the destabilizing factor bound) The melting temperature of is lower than the detection temperature, but is preferably at least about 5 ° C, more preferably at least about 10 ° C lower.
図8及び図9は、競合する核酸配列対である第2核酸配列対をさらに含む競合的方式の第I型及び第II型連結性プローブを示す。好ましい実施形態において、反応部位(31または41)は、重複領域1cを除いた第1対象配列1a、または第1相補配列2aに接合されている。競合的方式の前記第I型及び第II型連結性プローブは、前記不安定化因子が結合されることによって、第1ハイブリダイズした二重鎖が形成される第1ハイブリダイズした立体構造(図8A及び図9A)から、第2ハイブリダイズした二重鎖が形成される第2ハイブリダイズした立体構造(図8B及び図9C)へ、立体構造的変化を起こすように考案されている。具体的に、前記不安定化因子(32または43)の結合により誘発された立体構造的変化は、前記第1ハイブリダイズした立体構造にある確率の減少と前記第2ハイブリダイズした立体構造にある確率の増加を招く。
FIGS. 8 and 9 show competitive type I and type II connectivity probes further comprising a second nucleic acid sequence pair that is a competing nucleic acid sequence pair. In a preferred embodiment, the reaction site (31 or 41) is joined to the
本発明によって、競合的方式の第II(−)型連結性プローブは、最初には接合部位(conjugation site)として作用するが、反応誘発因子の作用により非接合性部位(non-conjugatable site)へ変換する反応部位を含むことによって構成されることができる。競合的方式の第II(−)型連結性プローブは、前記反応誘発因子の作用によって、第2ハイブリダイズした立体構造から第1ハイブリダイズした立体構造へ立体構造的変化を起こすように考案されている。このような立体構造的変化は、前記第1ハイブリダイズした立体構造にある確率の増加と前記第2ハイブリダイズした立体構造にある確率の減少を招く。
望む立体構造的変化を誘発するためには、前記不安定化因子が、前記第1ハイブリダイズした二重鎖を十分に強く不安定化させ、かつ、前記第2ハイブリダイズした二重鎖を十分に弱く不安定化させるか、または、全く不安定させてはならない。前記第I型、第II型及び第II(−)型連結性プローブにおいて、前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が、前記不安定化因子が結合または接合されることによって少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃減少することが好ましい。
According to the present invention, competitive type II (−) connectivity probe initially acts as a conjugation site, but to the non-conjugatable site by the action of a reaction-inducing factor. It can be configured by including a reactive site to convert. The competitive type II (−) type linking probe is designed to cause a conformational change from the second hybridized three-dimensional structure to the first hybridized three-dimensional structure by the action of the reaction inducer. Yes. Such a three-dimensional structural change causes an increase in the probability of being in the first hybridized three-dimensional structure and a decrease in the probability of being in the second hybridized three-dimensional structure.
In order to induce the desired conformational change, the destabilizing factor destabilizes the first hybridized duplex sufficiently strongly and sufficient for the second hybridized duplex. Should not be destabilized weakly or at all. In the Type I, Type II, and Type II (-) connectivity probes, the melting temperature of the first hybridized duplex is at least about 1 due to binding or conjugation of the destabilizing factor. It is preferred that the temperature decrease by more than about 5 ° C, more preferably at least about 5 ° C.
前記第I型及び第II型連結性プローブの好ましい実施形態において、前記反応誘発因子が存在しないときに、前記第1ハイブリダイズした二重鎖が前記第2ハイブリダイズした二重鎖に比べて優先的に形成される。好ましくは、前記反応誘発因子が存在しないときに、前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度は、前記第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度と比較して少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃高い。連結が起こることによって、前記ハイブリダイゼーションの選好度が、前記第2ハイブリダイズした二重鎖を好むように変わることがより好ましい。好ましくは、前記反応誘発因子が過量存在する時における前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度は、前記第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度よりも少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃低い。 In a preferred embodiment of the type I and type II connectivity probes, the first hybridized duplex takes precedence over the second hybridized duplex when the reaction inducer is not present. Formed. Preferably, when the reaction inducer is not present, the melting temperature of the first hybridized duplex is at least about 1 ° C., more preferably compared to the melting temperature of the second hybridized duplex. Is at least about 5 ° C higher. More preferably, the occurrence of ligation changes the preference of the hybridization to favor the second hybridized duplex. Preferably, the melting temperature of the first hybridized duplex when the reaction inducer is present in excess is at least about 1 ° C., more preferably at least about the melting temperature of the second hybridized duplex. About 5 ° C lower.
前記第II(−)型連結性プローブの好ましい実施形態において、前記反応誘発因子が存在しないときに、前記プローブ(すなわち、前記反応部位)に前記不安定化因子が付着している状態で、前記第2ハイブリダイズした二重鎖は、前記第1ハイブリダイズした二重鎖に比べて優先的に形成される。好ましくは、前記プローブに前記不安定化因子が結合されており、前記反応誘発因子が存在しないときに、前記第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度は、前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度よりも少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃高い。前記反応誘発因子の作用によって、ハイブリダイゼーションの選好度が前記第1ハイブリダイズした二重鎖を好むように変わることがより好ましい。好ましくは、前記反応誘発因子が過量存在するときに、前記第1ハイブリダイズした二重鎖の融解温度は、前記第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度よりも少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約5℃高い。 In a preferred embodiment of the type II (-) connectivity probe, when the reaction inducer is not present, the destabilizing factor is attached to the probe (i.e., the reaction site). The second hybridized duplex is preferentially formed as compared to the first hybridized duplex. Preferably, when the destabilizing factor is bound to the probe and the reaction-inducing factor is not present, the melting temperature of the second hybridized duplex is the first hybridized duplex. At least about 1 ° C., more preferably at least about 5 ° C. above the melting temperature of More preferably, the preference of hybridization changes according to the action of the reaction-inducing factor so as to favor the first hybridized duplex. Preferably, when the reaction inducer is present in excess, the melting temperature of the first hybridized duplex is at least about 1 ° C., more preferably, than the melting temperature of the second hybridized duplex. At least about 5 ° C higher.
前記第I型及び第II型連結性プローブの好ましい実施形態において、前記反応誘発因子が存在しないときに、前記第1及び第2ハイブリダイズした二重鎖は両方とも検出温度を含むアッセイ条件下で熱力学的に安定している。典型的に、好ましい前記第I型及び第II型連結性プローブでは、前記反応誘発因子が存在しない時における前記第1及び第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が検出温度よりも高いが、好ましくは5℃、より好ましくは少なくとも10℃高い。
前記第II(−)型連結性プローブの好ましい実施形態において、前記反応誘発因子が存在しないときに、検出温度を含むアッセイ条件下で前記第2ハイブリダイズした二重鎖は熱力学的に安定しているが、前記不安定化因子が結合されている前記第1ハイブリダイズした二重鎖は熱力学的に不安定または低安定している。典型的に、好ましい第II(−)型連結性プローブでは、前記反応誘発因子が存在しない時における前記第2ハイブリダイズした二重鎖の融解温度が、前記検出温度よりも高いが、好ましくは少なくとも約5℃、より好ましくは少なくとも約10℃高い。
In a preferred embodiment of the type I and type II linking probes, both the first and second hybridized duplexes are under assay conditions including a detection temperature when the reaction inducer is not present. Thermodynamically stable. Typically, in the preferred type I and type II linking probes, the melting temperature of the first and second hybridized duplexes in the absence of the reaction inducer is higher than the detection temperature, Preferably it is 5 ° C, more preferably at least 10 ° C higher.
In a preferred embodiment of the type II (-) linking probe, the second hybridized duplex is thermodynamically stable under assay conditions including a detection temperature in the absence of the reaction inducer. However, the first hybridized duplex to which the destabilizing factor is bound is thermodynamically unstable or less stable. Typically, in preferred type II (-) linking probes, the melting temperature of the second hybridized duplex in the absence of the reaction inducer is higher than the detection temperature, but preferably at least About 5 ° C, more preferably at least about 10 ° C higher.
上述のあらゆる類型の連結性プローブにおいて、前記不安定化因子が連結されている前記核酸配列と前記不安定化因子との距離を、前記連結要素(coupling element)の長さを変化させることによって調節することが好ましい。立体障害(及び他の種類の障害)は、短い距離でより強くなるので、より短い長さの連結要素を使用することがより好ましいこともある。また、より大きい不安定化因子が使用されるようにすることによってより強い不安定化を誘発しても良い。しかし、短すぎる距離または大きすぎる大きさは、前記反応誘発因子の活性を遮断したり阻害したりもするので、前記不安定化効果及び前記反応誘発因子の活性を最大化するためには、このような変数を適切に選択すべきである。 In all types of connectivity probes described above, the distance between the nucleic acid sequence to which the destabilizing factor is linked and the destabilizing factor is adjusted by changing the length of the coupling element. It is preferable to do. Since steric hindrance (and other types of hindrance) becomes stronger at short distances, it may be more preferable to use shorter length connecting elements. Also, stronger destabilization may be induced by allowing larger destabilizing factors to be used. However, too short distances or too large sizes can also block or inhibit the activity of the reaction inducer, so to maximize the destabilizing effect and the activity of the reaction inducer Such variables should be selected appropriately.
第I型連結性プローブは、不安定化因子に、関心の対象となる反応部位を(典型的に共有結合により)接合しうる特異的活性を有する反応誘発因子を検出するのに有用である。無論、本発明は、様々に変形可能なもので、ある特定反応部位への使用に限定されない。前記反応部位の例は、ポリヌクレオチドリガーゼ(polynucleotide ligase)、アミノアシルtRNAリガーゼ(aminoacyl tRNA ligase)、ビオチンタンパク質リガーゼ(biotin protein ligase)等のような多様なリガーゼ(ligase)に対して特異的な反応部位を含む。前記反応誘発因子によって前記反応部位の実体は多様に変わることができる。例えば、ポリヌクレオチドリガーゼ(polynucleotide ligase)では核酸配列、アミノアシルtRNAリガーゼ(aminoacyl tRNA ligase)ではアミノ酸、ビオチンタンパク質リガーゼ(biotin protein ligase)ではビオチンが、前記反応部位となる。 Type I connectivity probes are useful for detecting reaction inducers with specific activity that can join the destabilizing factor to the reaction site of interest (typically by covalent bonds). Of course, the present invention can be modified in various ways and is not limited to use for a specific reaction site. Examples of the reaction site include reaction sites specific for various ligases such as polynucleotide ligase, aminoacyl tRNA ligase, biotin protein ligase and the like. including. The substance of the reaction site can be variously changed according to the reaction inducing factor. For example, the reaction site is a nucleic acid sequence in a polynucleotide ligase, an amino acid in an aminoacyl tRNA ligase, and biotin in a biotin protein ligase.
第II型連結性プローブは、反応部位を接合部位に変換する特異的活性を有する反応誘発因子を検出するのに有用である。勿論、本発明は、様々に変形可能なもので、ある特定反応部位への使用に限定されない。前記反応部位の例は、キナーゼ(kinase)、DNAポリメラーゼ(DNA polymerase)、アセチル-CoAトランスフェラーゼ(acetyl-CoA transferase)などのような多様なトランスフェラーゼ(transferase)に対して特異的な反応部位を含む。前記反応誘発因子によって、前記反応部位の実体は多様に変わることができる。例えば、プロテインキナーゼ(protein kinase)ではアミノ酸配列、DNAポリメラーゼ(DNA polymerase)では核酸配列、アセチル-CoAトランスフェラーゼ(acetyl-CoA transferase)では脂肪酸が、前記反応部位となる。 Type II connectivity probes are useful for detecting reaction inducers with specific activity that converts reaction sites to conjugation sites. Of course, the present invention can be variously modified and is not limited to use for a specific reaction site. Examples of the reaction site include reaction sites specific for various transferases such as kinase, DNA polymerase, acetyl-CoA transferase, and the like. Depending on the reaction inducing factor, the substance of the reaction site can be variously changed. For example, amino acid sequences are used as protein kinases, nucleic acid sequences are used as DNA polymerases, and fatty acids are used as reaction sites in acetyl-CoA transferase.
第II(−)型連結性プローブは、既に接合部位(conjugation site)だった反応部位を非接合性部位(non-conjugatable site)へ変換する特異的活性を有する反応誘発因子を検出するのに有用である。勿論、本発明は、様々に変形可能なもので、ある特定反応部位への使用に限定されない。前記第II(−)型連結性プローブの認識要素として使用可能な前記反応部位の重要な一例に、ホスファターゼ(phosphatase)特異的反応部位がある。ホスファターゼ特異的反応部位の例は、チロシンホスファターゼ(tyrosine phosphatase)、二重特異性ホスファターゼ(dual specificity phosphatase)及びプロテインSer/Thrホスファターゼ(protein Ser/Thr phosphatase)のようなリン酸化プロテインホスファターゼ(phosphoprotein phosphatase)に特異的なもの;ホスファチジルイノシトール-3,4-二リン酸4-ホスファターゼ(phosphatidylinositol-3,4-biphosphate 4-phosphatase)、ホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸3-ホスファターゼ(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate 3-phosphatase)、SH2ドメイン含有イノシトールホスファターゼ(SH2 domain-containing inositol phosphatase:SHIP)及び膜-会合リン脂質ホスファターゼ(membrane-associated phospholipid phosphatase)のようなリン脂質ホスファターゼ(phospholipids phosphatase)に特異的なもの;ポリヌクレオチド3'-ホスファターゼ(polynucleotide 3'-phosphatase)及びポリヌクレオチド5'-ホスファターゼ(polynucleotide 5'-phosphatase)のようなポリヌクレオチドホスファターゼ(polynucleotide phosphatase)に特異的なものを含む。 Type II (-) connectivity probes are useful for detecting reaction inducers with specific activity that convert reaction sites that were already conjugation sites into non-conjugatable sites. It is. Of course, the present invention can be variously modified and is not limited to use for a specific reaction site. An important example of the reaction site that can be used as a recognition element of the type II (−) connectivity probe is a phosphatase-specific reaction site. Examples of phosphatase specific reaction sites include phosphoprotein phosphatases such as tyrosine phosphatase, dual specificity phosphatase and protein Ser / Thr phosphatase. Specific for: phosphatidylinositol-3,4-biphosphate 4-phosphatase, phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate 3-phosphatase Phospholipids phosphatase such as 3,4,5-triphosphate 3-phosphatase, SH2 domain-containing inositol phosphatase (SHIP) and membrane-associated phospholipid phosphatase Specific to); Polynu These include those specific for polynucleotide phosphatase, such as polynucleotide 3'-phosphatase and polynucleotide 5'-phosphatase.
新薬開発と診断においてキナーゼの検出は非常に重要であり、したがって、本発明の第II型連結性プローブに適用しうるキナーゼに特異的な反応部位のより具体的な例を次に示す。
一般に、キナーゼは、水酸基(hydroxyl group)を典型的に有する反応部位を認識し、ATP存在下で前記反応部位を特異的にリン酸化する。例えば、プロテイン-キナーゼ(protein-kinase)は、特定アミノ酸配列または特定アミノ酸残基を認識し、リン酸基を特定アミノ酸に付着する。キナーゼの作用により、前記第II型連結性プローブの前記反応部位は、追加されたリン酸基を有する接合部位へ変換する。ホスファターゼ特異的第II(−)型連結性プローブに含まれた反応部位は、ホスファターゼの作用により脱リン酸化されるリン酸基を既に有している接合部位という事実に注目されたい。このようなホスファターゼにより誘発された反応は、上述のキナーゼにより誘発された反応の全く逆反応となる。したがって、前記キナーゼ特異的第II型連結性プローブに含まれた前記接合部位に、異なる種類の不安定化因子を接合するための下記の代表的な例は、前記第II(−)型連結性プローブの前記反応部位に不安定化因子を接合させるのに一般的に使用されることができる。
The detection of kinases is very important in the development and diagnosis of new drugs. Therefore, more specific examples of reaction sites specific to kinases that can be applied to the type II linking probe of the present invention are shown below.
In general, a kinase recognizes a reaction site typically having a hydroxyl group and specifically phosphorylates the reaction site in the presence of ATP. For example, protein-kinase recognizes a specific amino acid sequence or a specific amino acid residue and attaches a phosphate group to the specific amino acid. By the action of the kinase, the reaction site of the type II connectivity probe is converted into a junction site having an added phosphate group. Note the fact that the reaction site included in the phosphatase-specific type II (-) linking probe is a junction site that already has a phosphate group that is dephosphorylated by the action of phosphatase. The reaction induced by such a phosphatase is completely opposite to the reaction induced by the above-mentioned kinase. Therefore, the following representative examples for conjugating different types of destabilizing factors to the junction site included in the kinase-specific type II connectivity probe include the type II (−) connectivity. It can generally be used to conjugate a destabilizing factor to the reactive site of the probe.
第一に、もし、リン酸基を含む前記接合部位に特異的に結合する受容体因子が存在するなら、この受容体因子は、親和性プローブにおけると略同様の方法で不安定化因子として使用されることができる。例えば、抗ホスホチロシンペプチド抗体(anti-phosphotyrosine peptide antibody)は、チロシンキナーゼ(tyrosine kinase:TK)特異的反応部位を有する第II型連結性プローブまたはチロシンプロテインホスファターゼ(protein tyrosine phosphatase)特異的反応部位を有する第II(−)型連結性プローブに対する不安定化因子として使用されることができ、また、同様の方式で、抗ホスホセリンペプチド抗体(anti-phosphoserine peptide antibody)または抗ホスホスレオニンペプチド抗体(anti-phosphothreonine peptide antibody)は、セリン-スレオニンキナーゼ(serine-threonine kinase:STK)特異的第II型連結性プローブまたはプロテインSer/Thrホスファターゼ(protein Ser/Thr phosphatase)特異的第II(−)型連結性プローブに対する不安定化因子として使用されることができる。in vivoまたはin situアッセイでは、このような受容体因子、すなわち不安定化因子は、関心の対象となる細胞の内部または外部に自然的に存在する受容体分子であっても良く、細胞の内部で遺伝子組み換えにより発現されたものを含めて意図的に導入された受容体分子であっても良い。他の例では、次の実施形態が、不安定化因子をリン酸基を有する前記接合部位に共有結合で連結するのに非常に有用となる。 First, if there is a receptor factor that specifically binds to the junction site containing a phosphate group, this receptor factor can be used as a destabilizing factor in much the same way as in an affinity probe. Can be done. For example, an anti-phosphotyrosine peptide antibody has a type II ligation probe having a tyrosine kinase (TK) -specific reaction site or a protein tyrosine phosphatase-specific reaction site. It can be used as a destabilizing factor for type II (-) connectivity probes, and in a similar manner, anti-phosphoserine peptide antibody or anti-phosphothreonine peptide antibody (anti- The phosphothreonine peptide antibody) is a serine-threonine kinase (STK) -specific type II linking probe or a protein Ser / Thr phosphatase-specific type II (-) linking probe. Can be used as a destabilizing factor for. For in vivo or in situ assays, such receptor factors, ie destabilizing factors, may be receptor molecules that are naturally present inside or outside the cell of interest and are internal to the cell. It may be a receptor molecule intentionally introduced, including those expressed by genetic recombination. In another example, the following embodiment would be very useful for covalently linking a destabilizing factor to the junction site having a phosphate group.
リン酸基を含む前記接合部位に不安定化因子を連結させるためのさらに他の実施形態において、前記連結反応を誘発しうる反応基を有する修飾されたATPを、ATPの代用にすることができる。例えば、γ-リン酸基(γ-phosphate group)に酸素原子の代わりに硫黄原子を有するアデノシン5'-O-(3-チオ三リン酸)(adenosine 5'-O-(3-thiotriphosphate):ATPγS)を使用すると、前記反応部位にキナーゼ存在下でチオリン酸基(thiophosphate group)が付着される。このチオリン酸基は、ヨードアセチル基(iodoacetyl group)と自発的に反応して共有結合を形成するものと知られている(Jeong,S. and Nikiforov,T.T.(1999))。したがって、少なくとも一つのヨードアセチル基(iodoacetyl group)を有する不安定化因子を、本実施形態で使用することができる。他の方法として、少なくとも一つのチオル基(thiol group)を有する不安定化因子を使用することができる。BMB(1,4-bis-maleimidobutane)、BMH(bis-maleimidohexane)、及びHBVS(1,6-hexane-bis-vinylsulfone)のような連結試薬を使って不安定化因子に在るチオル基(thiol group)と
チオリン酸基(thiophosphate group)間にジスルフィド(disulfide)結合を形成することができる(Pierce 2001-2002 Catalog,pp.294-331参照)。好ましくは、少なくとも一つのヨードアセチル基(iodoacetyl group)やチオル基(thiol group)を有するタンパク質またはタンパク質複合体を、不安定化因子として使用することができる。少なくとも一つのヨードアセチル基(iodoacetyl group)やチオル基(thiol group)を、ストレプトアビジン(streptavidin)やその誘導体の結合を邪魔しない位置に持つビオチンに結合しているストレプトアビジンまたはその誘導体は、非常に有用な例である(Jeong,S. and Nikiforov,T.T.(1999))。ビオチンを修飾する化学は、本発明の属する技術分野でよく知られている。
In yet another embodiment for linking a destabilizing factor to the junction site containing a phosphate group, a modified ATP having a reactive group capable of inducing the ligation reaction can be substituted for ATP. . For example, adenosine 5'-O- (3-thiotriphosphate) having a sulfur atom instead of an oxygen atom in a γ-phosphate group: When ATPγS is used, a thiophosphate group is attached to the reaction site in the presence of a kinase. This thiophosphate group is known to spontaneously react with an iodoacetyl group to form a covalent bond (Jeong, S. and Nikiforov, TT (1999)). Therefore, destabilizing factors having at least one iodoacetyl group can be used in this embodiment. Alternatively, a destabilizing factor having at least one thiol group can be used. Thiol groups present in destabilizing factors using linking reagents such as BMB (1,4-bis-maleimidobutane), BMH (bis-maleimidohexane), and HBVS (1,6-hexane-bis-vinylsulfone) A disulfide bond can be formed between a group and a thiophosphate group (see Pierce 2001-2002 Catalog, pp.294-331). Preferably, a protein or protein complex having at least one iodoacetyl group or thiol group can be used as the destabilizing factor. Streptavidin or its derivatives bound to biotin with at least one iodoacetyl group or thiol group in a position that does not interfere with the binding of streptavidin and its derivatives This is a useful example (Jeong, S. and Nikiforov, TT (1999)). The chemistry for modifying biotin is well known in the art to which the present invention belongs.
さらに他の実施形態において、リン酸基を有している前記第II型または第II(−)型連結性プローブの接合部位(または、反応部位)に使用可能な不安定化因子は、二価陽イオン性(dicataionic)、三価陽イオン性(tricataionic)または多価陽イオン性(polycationic)の金属イオンを含んでいる重合体(synthetic polymer)またはその類似体からなるナノ粒子(nanoparticle)、ミクロ粒子(microparticle)、ビーズ(bead)または膜(membrane)でありうるが、例えば、Fe3+、Ga3+またはRu2+を含むポリスチレン(polystyrene)ビーズまたはナノ粒子のようなものでありうる。このような粒子または物質が、リン酸基を含む部分に結合するということが公知されているが、例えば、本発明の前記キナーゼ特異的第II型連結性プローブの接合部位や前記ホスファターゼ特異的第II(−)型連結性プローブの反応部位に結合する。これは、Sportsman,J.et al.PCT Pub.No.WO 00/75167 A2;Huang,W.et al.EP Pub.No.EP1156329 A2;及び、Nikiforov,T.T.U.S.Pat No.6,287,774 B1を参照されたい。 In still another embodiment, the destabilizing factor that can be used in the junction site (or reaction site) of the type II or type II (−) connectivity probe having a phosphate group is a divalent agent. Nanoparticles, microparticles of synthetic polymers or their analogs that contain cationic, dicataionic, tricataionic or polycationic metal ions It can be a microparticle, a bead or a membrane, but can be, for example, a polystyrene bead or nanoparticle containing Fe 3+ , Ga 3+ or Ru 2+ . It is known that such a particle or substance binds to a moiety containing a phosphate group. For example, the binding site of the kinase-specific type II linking probe of the present invention or the phosphatase-specific group can be used. It binds to the reaction site of type II (-) connectivity probe. See Sportsman, J. et al. PCT Pub. No. WO 00/75167 A2; Huang, W. et al. EP Pub. No. EP1156329 A2; and Nikiforov, TTU Pat No. 6,287,774 B1.
好ましいキナーゼ特異的反応部位は、ヒト疾病と係わるキナーゼにより特異的にリン酸化されるものである。例えば、ヒト疾病と係わる多様なプロテインキナーゼとこれらの認識部位が、本発明の属する技術分野で公知されており、例えば、Pearson R.B. and Kemp B.E.(1991),“Methods in Ezymology”,vol.200,pp.62-81;Bachem catalog(2002),pp.749-758;New England Biolabs catalog(2000),p.162;及び、ウェブページ、“The Protein Kinase Resources”at http://pkr.sdsc.edu/html/disease.shtmを参照されたい。前記第II型連結性プローブの反応部位として使用可能なキナーゼ特異的認識部位の重要例(1)を、表3に示す。 Preferred kinase-specific reaction sites are those that are specifically phosphorylated by kinases associated with human diseases. For example, various protein kinases related to human diseases and their recognition sites are known in the technical field to which the present invention belongs. For example, Pearson RB and Kemp BE (1991), “Methods in Ezymology”, vol. 200, pp.62-81; Bachem catalog (2002), pp.749-758; New England Biolabs catalog (2000), p.162; and the web page “The Protein Kinase Resources” at http: //pkr.sdsc. Please refer to edu / html / disease.shtm. Table 3 shows important examples (1) of kinase-specific recognition sites that can be used as reaction sites of the type II connectivity probe.
(1)参考文献:“Method in Ezymology”,vol.200,pp.62-81;Bachem catalog(2002),pp.749-758;及び、New England Biolabs catalog(2000),p.162.
(2)下線付きの文字は、リン酸化反応(phosphorylation)部位を、イタリック体文字は、既にリン酸化しているセリン(phosphorylated serine)を表す。括弧中の番号は、配列番号を表す。
(1) References: “Method in Ezymology”, vol. 200, pp. 62-81; Bachem catalog (2002), pp. 749-758; and New England Biolabs catalog (2000), p. 162.
(2) The underlined letter represents the phosphorylation site, and the italic letter represents the phosphorylated serine. The numbers in parentheses represent the sequence numbers.
上述の如く、前述の各類型のプローブは、一つまたはそれ以上の望む標的因子の存在、非存在、または減少された量により、一つの立体構造から他の立体構造へ容易に検出可能な立体構造的変化を起こすように考案されている。本発明のプローブの特性とされる前記立体構造的変化は、前記対象及び相補核酸配列のハイブリダイゼーションの変化により起こる。したがって、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ(Dattagupta,N. U.S.Pat.No4,968,602;Tyagi,S.et al. U.S.Pat.No.5,925,517;及び、Lucas,J.N.et al. U.S.Pat.No.6,027,879参照)の技術分野で知られているほとんどあらゆる検出可能なラベル及びこれらを使用する方法を、本発明のプローブに合わせて適用することができる。一般に、少なくとも一つの検出可能なラベルを本発明のプローブに接合することができる。ラベル部分の接合は、プローブのいずれの位置に接合されていてもアッセイ条件下で安定していなければならない。大部分の実施形態において共有結合による接合が好ましいものとされているが、一般的に、接合は共有結合または非共有結合によるものでありうる。非共有結合による接合の例は、イオン結合(ionic bond)、インターカレーション(intercalation)、そして親水性及び疏水性相互作用(hydrophilic and hydrophobic interaction)を含むが、これに限定されない。検出可能なラベルを含ませるための重要例を、次に示す。 As noted above, each type of probe described above is a three-dimensional structure that is readily detectable from one conformation to another, depending on the presence, absence, or reduced amount of one or more desired target agents. It is devised to cause structural changes. The conformational change, which is characteristic of the probe of the present invention, is caused by a change in hybridization of the target and complementary nucleic acid sequences. Thus, in the technical field of nucleic acid hybridization assays (see Dattagupta, NUS Pat. No. 4,968,602; Tyagi, S. et al. USPat. No. 5,925,517; and Lucas, JNet al. USPat. No. 6,027,879). Almost any known detectable label and methods using them can be applied to the probes of the present invention. Generally, at least one detectable label can be attached to the probe of the present invention. The label moiety bond must be stable under assay conditions, regardless of the position of the probe. Although covalent bonding is preferred in most embodiments, in general, the bonding can be covalent or non-covalent. Examples of non-covalent bonding include, but are not limited to, ionic bonds, intercalation, and hydrophilic and hydrophobic interactions. An important example for including a detectable label is as follows.
本発明によるプローブは、典型的に共有結合にて前記プローブに接合された、少なくとも一つの非相互作用性ラベル(non-interactive label)を有することができる。非相互作用性ラベルの例は、蛍光体(fluorescer);化学的発光体(chemiluminescer)、放射線発光体(radioluminescer)、生物学的発光体(bioluminescer)及び電気化学的発光体(electrochemiluminescer)のような発光体(luminescer);放射線同位元素(radioisotopes);アルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase)及び 西洋ワサビペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)のような酵素(enzyme);抗体(antibody);抗原(antigen);電気化学的ラベル(electrochemical label);及び、これらの組み合わせを含む。蛍光体と発光体のような光を生成するラベルが最も便利に使用される。シグナル増幅方法を含む酵素アッセイ(enzyme assay)とELISAで使用されるラベル、すなわち、本発明の属する技術分野で一般的に知られた酵素、抗体、抗原、及びこれらの組み合わせを含む生化学的ラベルは、少ない量の標的因子を検出する上で非常に有用である。 Probes according to the present invention can have at least one non-interactive label, typically covalently joined to the probe. Examples of non-interacting labels are fluorescers; chemiluminescers, radioluminescers, bioluminescers and electrochemiluminescers Luminescers; radioisotopes; enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase; antibodies; antigens; electrochemical labels ( electrochemical label); and combinations thereof. Labels that generate light, such as phosphors and phosphors, are most conveniently used. Labels used in enzyme assays and ELISAs including signal amplification methods, ie biochemical labels containing enzymes, antibodies, antigens, and combinations thereof commonly known in the art to which the invention belongs Is very useful in detecting small amounts of target factors.
本発明のプローブに好適な他のラベルも公知されている(Dattagupta,N. U.S.Pat.No.4,968,602;Tyagi S.et al. U.S.Pat.No.5,925,517;Lucas,J.N. et al. U.S.Pat.No.6,027,879参照)。望む用途に見合う多様な類型のプローブが考案されており、その例は、FRET(fluorescence resonance energy transfer)ラベル対及び酵素供与体-受納体対(enzyme donor-acceptor pair)のような相互作用性ラベルを有するプローブ、及び蛍光体、発光体、抗原、抗体、酵素、及び電気化学的ラベルのような非相互作用性ラベルを有するプローブを含む。本発明によるプローブは、必要なアッセイ条件に合うプローブの最適化を考慮して容易に考案されるが、これは、核酸のハイブリッドの性質を、周知の計算方法または実験的資料を根拠として容易に予測できるからである。 Other labels suitable for the probes of the present invention are also known (Dattagupta, NUS Pat. No. 4,968,602; Tyagi S. et al. USPat. No. 5,925,517; Lucas, JN et al. USPat. No. 6,027,879. reference). Various types of probes have been devised to suit the desired application, examples of which are interaction properties such as FRET (fluorescence resonance energy transfer) label pairs and enzyme donor-acceptor pairs. Probes with labels and probes with non-interactive labels such as fluorophores, illuminants, antigens, antibodies, enzymes, and electrochemical labels. Probes according to the present invention are easily devised in view of the optimization of the probe to meet the required assay conditions, which facilitates the nature of nucleic acid hybrids based on well-known computational methods or experimental data. This is because it can be predicted.
図10は、少なくとも一つの非相互作用性ラベル5を有する非競合的方式のプローブを示す。ここでは、親和性プローブを特定例とした。好ましくは、このプローブは、第1対象配列1aを含む第1分子と第1相補配列2aを含む第2分子とからなる二分子プローブ(bimolecular probe)である。少なくとも一つの非相互作用性ラベルが、前記第1及び第2分子のいずれの位置に接合されても良いが、認識要素3と標的因子(すなわち、プローブ方式によって受容体因子または反応誘発因子)との相互作用を邪魔する位置に接合されることはできない。
図11は、少なくとも一つの非相互作用性ラベル5を有する非競合的方式の固定化した二分子プローブを示す。ここでは、親和性プローブを特定例とした。第1及び第2分子のうち一つは、リンカー13を介して固体支持体12に固定化されることができる。典型的に、このリンカーは、前記プローブの作動を邪魔しないアルキル鎖(alkyl chain)または他の部分を有する分子である。図11に示すように、前記非相互作用性ラベルは、前記第1または第1分子のうち、固定化していない分子に接合されていることが好ましい。
本発明に使用するのに好適なより好ましいリンカーは、約5個乃至約100個の原子、より好ましくは約5個乃至約50個の原子の長さを有する。
FIG. 10 shows a non-competitive probe with at least one
FIG. 11 shows a non-competitive immobilized bimolecular probe with at least one
More preferred linkers suitable for use in the present invention have a length of from about 5 to about 100 atoms, more preferably from about 5 to about 50 atoms.
図12は、少なくとも一つの非相互作用性ラベル5a,5bを有する競合的方式のプローブを示す。ここでは、親和性プローブを特定例とした。好ましくは、図13に示すように、このプローブは、第1及び第2対象配列からなる対象配列1を含む第1分子、第1相補配列2aを含む第2分子、及び第2相補配列2bを含む第3分子からなる三分子プローブ(trimolecular probe)である。少なくとも一つの非相互作用性ラベルが、前記第1、第2、及び第3分子のうちいずれか一つの位置に接合されても良いが、認識要素3と標的因子との相互作用を邪魔する位置に接合されることはできない。好ましい実施形態において、少なくとも一つの非相互作用性ラベルが、前記第2及び第3分子のうち少なくとも一つに接合されているが、もし、両分子ともラベルされているなら、各分子は相異なるラベルを有する。前記第2及び第3分子に相異なるラベルを接合することによって、前記第1ハイブリダイズした二重鎖と前記第2ハイブリダイズした二重鎖の形成を区別することが可能になる。
FIG. 12 shows a competitive probe having at least one
図13は、実施例4で使用された非相互作用性ラベルを有する競合的方式の親和性プローブの例を示す。受容体因子であるストレプトアビジン(streptavidin)を検出するために、ビオチン(biotin)がプローブリガンドとして使用された。蛍光ラベルとしてフルオレセイン(fluorescein)が第2対象配列2bに接合された。好ましい実施形態により、重複領域に含まれない第1対象配列の領域に、プローブリガンドが接合された。また、第1相補配列は、第2相補配列に比べてより長いものが選択された。こうすると、前記受容体因子が存在しないときに、前記第1相補配列が前記第2相補配列に比べて優先的にハイブリダイズすることができる(図13A)。好ましい実施形態により、前記受容体因子が存在するときに、前記ハイブリダイゼーションの選好度が前記第2相補配列のハイブリダイゼーションを好む方向に変わるようになる(図13B)。
FIG. 13 shows an example of a competitive affinity probe with a non-interactive label used in Example 4. Biotin was used as a probe ligand to detect the receptor factor streptavidin. As a fluorescent label, fluorescein was conjugated to the
図14は、少なくとも一つの非相互作用性ラベルを有する競合的方式の固定化した三分子プローブを示す。ここでは、親和性プローブを特定例とした。図14に示すように、第1、第2、及び第3分子のうちいずれか一つが、リンカー13を介して固体支持体12に固定される。もし、対象配列1を含んでいる第1分子が固定化していると(図14A)、第1及び第2相補配列2a,2bをそれぞれ含んでいる第2及び第3分子のうち少なくとも一つに、少なくとも一つの非相互作用性ラベルを接合することが好ましい。この場合、もし、前記第2及び第3分子の両方ともラベルされていると、各分子は、相異なるラベルを有する。図14B及び図14Cに示すように、もし、前記第2または第3分子が固定化されていると、前記対象配列を含んでいる前記第1分子に少なくとも一つの非相互作用性ラベルが接合されることが好ましい。
FIG. 14 shows a competitive mode of immobilized trimolecular probe with at least one non-interactive label. Here, an affinity probe is taken as a specific example. As shown in FIG. 14, any one of the first, second, and third molecules is fixed to the
図15は、実施例9で使用された非相互作用性ラベルを有する固定化した競合的方式の親和性プローブの例を示す。ここでも同様に、ストレプトアビジンを検出するためのプローブリガンドとしてビオチンが使用されたが、ただし、このビオチンが第1相補配列2aに接合されている。第2相補配列2bに接合されている非相互作用性ラベルは、フルオレセイン(fluorescein)である。対象配列は、リンカー13を介して固体支持体12にその5'末端が固定化されている。好ましい実施形態により、前記受容体因子が存在しないときに、前記第1相補配列が前記第2相補配列に比べて優先的にハイブリダイズするように、前記第1相補配列は、前記第2相補配列に比べてより長いものとした(図15A)。好ましい実施形態により、前記受容体因子が存在するときに、前記ハイブリダイゼーションの選好度が、前記第2相補配列のハイブリダイゼーションを好む方向に変わるようになる(図15B)。
FIG. 15 shows an example of an immobilized competitive-type affinity probe with a non-interactive label used in Example 9. Here again, biotin was used as a probe ligand for detecting streptavidin, but this biotin was conjugated to the first
一部の実施形態において、少なくとも一つの非相互作用性ラベルを有する前記競合的方式のプローブは、前記対象配列と前記第1及び第2相補配列のうち一つとを含む第1分子と、残りの相補配列を含む第2分子とからなる二分子プローブでありうる。前記第1分子に含まれている二つの配列は、ループ部分(loop moiety)により共有結合で連結されている。好ましいループ部分は、前記第1分子に含まれた前記対象及び相補配列のハイブリダイゼーションを邪魔しないように、充分な長さと柔軟性を有する二価(divalent)または多価(multivalent)の化学部分でありうる。例えば、前記ループ部分は、アルキル鎖(alkyl chain)、ポリペプチド鎖(polypeptide chain)、核酸配列、またはポリエチレングリコール鎖(polyethylene glycole chain)及びポリエステル鎖(polyester chain)のような高分子鎖(polymer chain)でありうる。もし、前記ループ部分が核酸配列であれば、約4〜100個のヌクレオチド長が好ましい。このループ部分は、前記第1分子に含まれた二つの配列をいずれの位置でも連結することができる。好ましくは、前記ループ部分は、ある配列の5'または3'末端のいずれかを他の配列の5'または3'末端のいずれかに連結する。
より好ましくは、前記ループ部分は、前記二つの配列を、5’から3’方向または3'から5'方向へ連結する。上述の如く、このループ部分は、前記対象及び相補配列のハイブリダイゼーションを邪魔しない範囲内で、前記二つの配列をいずれの位置でも連結する、二価または多価の化学部分でありうる。前記二分子プローブにおいて、少なくとも一つの非相互作用性ラベルは、前記第1及び第2分子のうち少なくとも一つに接合されている。
もし、前記両分子ともラベルされているなら、各分子は、相異なるラベルを有する。一部の実施形態において、前記第1及び第2分子のうち一つは、固体支持体に固定されている。このような実施形態において、前記少なくとも一つの非相互作用性ラベルは、固定化していない分子に接合されることが好ましい。
In some embodiments, the competitive probe having at least one non-interactive label comprises a first molecule comprising the subject sequence and one of the first and second complementary sequences, and the remaining It can be a bimolecular probe consisting of a second molecule containing a complementary sequence. The two sequences contained in the first molecule are covalently linked by a loop moiety. A preferred loop moiety is a divalent or multivalent chemical moiety that has sufficient length and flexibility so as not to interfere with the hybridization of the subject and complementary sequences contained in the first molecule. It is possible. For example, the loop portion may be an alkyl chain, a polypeptide chain, a nucleic acid sequence, or a polymer chain such as a polyethylene glycol chain and a polyester chain. ). If the loop portion is a nucleic acid sequence, a length of about 4 to 100 nucleotides is preferred. This loop portion can link the two sequences contained in the first molecule at any position. Preferably, the loop portion links either the 5 ′ or 3 ′ end of one sequence to either the 5 ′ or 3 ′ end of another sequence.
More preferably, the loop portion connects the two sequences in the 5 ′ to 3 ′ direction or the 3 ′ to 5 ′ direction. As described above, the loop portion may be a divalent or polyvalent chemical moiety that links the two sequences at any position within a range that does not interfere with hybridization of the target and complementary sequences. In the bimolecular probe, at least one non-interactive label is joined to at least one of the first and second molecules.
If both molecules are labeled, each molecule has a different label. In some embodiments, one of the first and second molecules is immobilized on a solid support. In such an embodiment, the at least one non-interactive label is preferably conjugated to an unimmobilized molecule.
前述した少なくとも一つの非相互作用性ラベルを有するプローブにおいて、前記分子のうちいずれも固定化していないと、前記標的因子の存在は、分離過程の後にハイブリダイズしたまたはハイブリダイズしていない分子と連合している前記ラベルからの特徴的シグナルを検出することによって確認することができる。この分離過程は、本明細書に記載された一部の実験例におけるように非変性(non-denaturing)条件で電気泳動をすることによって行われる。異なる種を区別するために前記特徴的シグナルを大きさの関数として検出することが好ましい。前記固定化したプローブにおいて、前記標的因子の存在は、固定化したプローブに結合していない分子を洗浄し除去した後、前記ラベルからの特徴的シグナルを検出することによって確認することができる。 In the probe having at least one non-interactive label described above, if none of the molecules is immobilized, the presence of the target factor is associated with a hybridized or non-hybridized molecule after the separation process. This can be confirmed by detecting a characteristic signal from the label. This separation process is performed by electrophoresis under non-denaturing conditions as in some of the experimental examples described herein. Preferably, the characteristic signal is detected as a function of magnitude in order to distinguish different species. In the immobilized probe, the presence of the target factor can be confirmed by washing and removing molecules not bound to the immobilized probe and then detecting a characteristic signal from the label.
本発明のプローブに容易に適用可能な他の類型の検出可能なラベルは、一本鎖核酸に比べて二本鎖核酸に優先的に結合するエチジウムブロマイド(ethidium bromide)及びSYBR(登録商標) Green(Molecular Probes、OR、USA)のようなインターカレート染色剤(intercalating dye)である。インターカレート染色剤が前記検出可能なラベルとして使用される時、非競合的方式の本発明のプローブは、第1対象配列を含む第1分子と、第1相補配列を含む第2分子とを含むように構成されることができ、これら第1及び第2分子のうちいずれか一つが支持体に固定化される。インターカレート染色剤を使用する一部の実施形態において、非競合的方式のプローブは、前記第1対象及び第1相補配列をループ部分により連結された状態に含む一つの分子からなると良く、リンカーを介して支持体に固定化されていることもできる。もし、前記プローブが競合的方式のものなら、前記対象配列、前記第1相補配列、及び前記第2相補配列が異なる分子に含まれていることが好ましい。そうしないと、第1及び第2ハイブリダイズした二重鎖の形成を、インターカレート染色剤を使って区分できないこともある。もし、前記競合的方式のプローブを固定化したい場合には、前記第1及び第2相補配列のうちいずれか一つをリンカーを介して支持体に固定化することが好ましい。 Other types of detectable labels that are readily applicable to the probes of the present invention include ethidium bromide and SYBR® Green, which preferentially bind to double-stranded nucleic acids over single-stranded nucleic acids. Intercalating dyes such as (Molecular Probes, OR, USA). When an intercalating stain is used as the detectable label, the non-competitive probe of the invention comprises a first molecule comprising a first target sequence and a second molecule comprising a first complementary sequence. Any one of these first and second molecules can be immobilized on a support. In some embodiments using an intercalating stain, the non-competitive probe may comprise a single molecule comprising the first object and the first complementary sequence linked by a loop moiety, It can also be fixed to the support via the. If the probe is of a competitive type, it is preferable that the target sequence, the first complementary sequence, and the second complementary sequence are contained in different molecules. Otherwise, the formation of the first and second hybridized duplexes may not be distinguishable using an intercalating stain. If it is desired to immobilize the competitive probe, it is preferable to immobilize one of the first and second complementary sequences on a support via a linker.
検出可能なラベルとしてインターカレート染色剤(intercalating dye)を使用することが好ましい実施形態において前記プローブが固定化されていないと、前記標的因子の存在は、例えば、非変性(non-denaturing)条件下で電気泳動をするような分離過程を行った後、前記ハイブリダイズした二重鎖(等)に連合している前記ラベルからの特徴的シグナルを検出することによって確認することができる。少なくとも一つの非相互作用性ラベルを有するプローブにおけると同様に、前記特徴的シグナルを大きさの関数として検出することが、相異なる種を区別する上で好ましい。前記固定化したプローブにおいて前記標的因子の存在は、固定化したプローブに結合していない分子を洗浄し除去した後、前記ラベルからの特徴的シグナルを検出することによって確認することができる。 In an embodiment where it is preferred to use an intercalating dye as the detectable label, if the probe is not immobilized, the presence of the target factor may be, for example, non-denaturing conditions. After performing a separation process such as electrophoresis under, it can be confirmed by detecting a characteristic signal from the label associated with the hybridized duplex (etc.). As with probes having at least one non-interactive label, it is preferred to distinguish the different species by detecting the characteristic signal as a function of magnitude. The presence of the target factor in the immobilized probe can be confirmed by washing and removing molecules not bound to the immobilized probe, and then detecting a characteristic signal from the label.
核酸ハイブリダイゼーションアッセイに対する技術分野でよく知られた相互作用性ラベル対(interactive label pair)は、本発明によるプローブにおいて検出可能なラベルとして非常に有用である。本発明によるプローブに有用に使用可能な相互作用性ラベル対は、両ラベル部分間の距離に依存する特徴的シグナルを生成できる特性を有していなければならない。上述の如く、本発明によるプローブは、標的因子の存在または非存在によって立体構造的変化を起こす。本発明のプローブの特性とされる立体構造的変化は、対象配列と相補配列とのハイブリダイゼーション及び解離の結果である。したがって、距離依存的にシグナルを生成する特徴を有する大半の相互作用性ラベル対は、本発明によるプローブに両ラベル部分を適切に接合することによって使用されることができる。標的核酸配列の検出と関連して有用な相互作用性ラベル対の例が、米国特許第5,925,517に開示されている。本発明によるプローブに接合される最も好ましい相互作用性ラベル対は、作用方式が蛍光共鳴エネルギー転移(fluorescence resonance energy transfer:FRET)である蛍光体(flourescer)と消光体(quencher)の対または発光体(lumniescer)と消光体(quencher)の対であるか、直接的蛍光エネルギー転移(direct fluorescence energy transfer)を引き起こすこれらの類似体である。しかし、他の類型の相互作用性ラベル対、例えば酵素とその補助因子(cofactor)の対、またはよく知られている酵素相補方式アッセイ(enzyme complementation assay)で使用される酵素供与体(enzyme donor)と酵素受納体(enzyme acceptor)の対のような酵素の断片または亜構成単位対を使用することができる。前記酵素相補方式アッセイに係わる例は、Comoglio,S. and Celada,F.(1976);Gonnelli,M.et al.(1981);及び、Henderson,D.R. U.S Pat.No.4,708,929を参照されたい。非常に少ない量の標的因子を検出するために本発明のプローブのシグナルトランスデューサーのシグナルを増幅する必要がある場合に、前記酵素ラベル対は特に有用である。発光体の例は、化学的発光体(chemiluminescer)、放射線発光体(radioluminescer)、電気化学的発光体(electrochemiluminescer)、及び生物学的発光体(bioluminescer)を含む。蛍光体と消光体対または発光体と消光体対のようなFRETラベル対を、検出可能なラベルとして使用する場合、前記特徴的シグナルは、前記蛍光体または前記発光体から発生する光であるが、前記2ラベル部分の相互作用によって発生する光の強度(intensity)、寿命(lifetime)、または偏光(polarization)が変化するようになる。場合によって、前記プローブから発生する蛍光の波長(wavelength)が、前記両ラベル部分の相互作用によって変化することもある。これは、前記消光体部分もまた蛍光体であって、好ましくは、前記蛍光体部分よりも長い放出波長を有し、この蛍光体部分に対してエネルギー転移受納体(energy transfer acceptor)として作用できる蛍光体である特別な場合である。このような実施形態において、前記蛍光波長の変化は、前記蛍光の強度(intensity)、寿命(lifetime)、または偏光(polarization)の変化に加えて、あるいはその代わりに、前記プローブの立体構造的変化に起因する前記両ラベル部分間の相互作用の指標として使用されることができる。少なくとも一つの相互作用性ラベル対を有する大部分の実施形態において、二つの相互作用性ラベル部分は、前記ハイブリダイズした立体構造におけるように相互に近づいている状態では相互作用をし、前記解離した立体構造におけるように相互に遠ざかっている状態では相互作用をしなくなる。次に、少なくとも一つの相互作用性ラベル対を有する本発明によるプローブの好ましい実施形態の一部の代表的な例を示す。 The interactive label pairs well known in the art for nucleic acid hybridization assays are very useful as detectable labels in the probes according to the invention. An interactive label pair that can be usefully used in a probe according to the present invention must have the property of producing a characteristic signal that depends on the distance between both label portions. As described above, the probe according to the present invention undergoes a conformational change depending on the presence or absence of the target factor. The conformational change characteristic of the probe of the present invention is a result of hybridization and dissociation between the target sequence and the complementary sequence. Thus, most interactive label pairs with the characteristic of generating signals in a distance dependent manner can be used by appropriately joining both label portions to a probe according to the present invention. An example of an interactive label pair useful in connection with detection of a target nucleic acid sequence is disclosed in US Pat. No. 5,925,517. The most preferred interactive label pair to be conjugated to the probe according to the present invention is a phosphors and quencher pair or illuminant whose mode of action is fluorescence resonance energy transfer (FRET). (lumniescer) and quencher pairs or their analogs that cause direct fluorescence energy transfer. However, other types of interactive label pairs, such as an enzyme and its cofactor pair, or an enzyme donor used in the well-known enzyme complementation assay Enzyme fragments or subunit building pairs such as enzyme acceptor pairs can be used. See, for example, Comoglio, S. and Celada, F. (1976); Gonnelli, M. et al. (1981); and Henderson, DRUS Pat. No. 4,708,929 I want to be. The enzyme label pair is particularly useful when it is necessary to amplify the signal transducer signal of the probe of the present invention in order to detect very small amounts of target agent. Examples of illuminants include chemiluminescers, radioluminescers, electrochemiluminescers, and bioluminescers. When a FRET label pair such as a phosphor and quencher pair or a phosphor and quencher pair is used as a detectable label, the characteristic signal is light generated from the phosphor or the phosphor. The intensity, lifetime, or polarization of light generated by the interaction of the two label portions changes. In some cases, the wavelength of the fluorescence generated from the probe may change due to the interaction between the two label portions. This is because the quencher part is also a phosphor, preferably having a longer emission wavelength than the phosphor part and acting as an energy transfer acceptor for this phosphor part. It is a special case that is a phosphor that can. In such an embodiment, the change in the fluorescence wavelength may be in addition to or instead of a change in the intensity, lifetime, or polarization of the fluorescence. It can be used as an indicator of the interaction between the two label parts due to. In most embodiments having at least one interactive label pair, the two interactive label moieties interact and dissociate when in close proximity as in the hybridized conformation. In the state where they are far away from each other as in the three-dimensional structure, they no longer interact. The following are representative examples of some of the preferred embodiments of probes according to the invention having at least one interactive label pair.
図16は、競合的方式の1対の相互作用性ラベルを有する二分子プローブを示す概略図である。ここでは、親和性プローブを特定例とした。この特定実施形態において、前記プローブは、第1対象配列1aに接合された第1ラベル部分6aと、第1相補配列2aに接合された第2ラベル部分6bとからなる1対の相互作用性ラベル対を含む。受容体因子10が存在しないときに、このプローブは、ハイブリダイズした立体構造(図16A)におり、前記二つの相互作用性ラベル部分は、相互に近づいて位置することによって両ラベル部分間に効果的な相互作用が起こるようになる。前記受容体因子が存在するときに、このプローブは、解離した立体構造(図16B)へ変化し、前記二つの相互作用性ラベル部分は相互に遠ざかることによって、両ラベル部分間の相互作用が遮断されたり抑制されたりする。一部の実施形態では、前記第1または第2分子のいずれかを、リンカーを介して支持体に固定化することが有用である。
FIG. 16 is a schematic diagram showing a bimolecular probe having a pair of interactive labels in a competitive manner. Here, an affinity probe is taken as a specific example. In this particular embodiment, the probe comprises a pair of interactive labels comprising a
図17は、1対の相互作用性ラベルを有する非競合的方式の単分子プローブを示す概略図である。ここでは、親和性プローブを特定例とした。この単分子プローブにおいて、第1対象配列1aと第1相補配列2aは、ループ部分により共有結合で連結されている。前記相互作用性ラベル対は、前記第1対象配列1aに接合された第1ラベル部分6aと、前記第1相補配列2aに接合された第2ラベル部分6bとからなっている。受容体因子10が存在しないときに、このプローブは、ハイブリダイズした立体構造(図17A)におり、前記二つの相互作用性ラベル部分は相互に近づいて位置することによって両ラベル部分間に効果的な相互作用が起こるようになる。前記受容体因子が存在するときに、このプローブは、解離した立体構造(図17B)へ変化し、前記二つの相互作用性ラベルはお相互に遠ざかることによって、両ラベル部分間の相互作用が遮断されたり抑制されたりする。一部の実施形態において、前記相互作用性ラベル部分のうち少なくとも一つは、前記第1対象または第1相補配列以外の他の位置に接合されていることがあるが、例えば、前記ループ領域、好ましくは前記第1対象または第1相補配列に近い位置に接合されていることができる。勿論、本発明は、様々に変形可能なもので、前記相互作用性ラベルの特定接合位置にその使用が限定されるのではない。上述の距離依存的相互作用特性が得られる限り、前記二つの相互作用性ラベルは、前記プローブの相異なる二つのいずれの箇所にも位置することができる。一部の実施形態では、前記単分子プローブをリンカーを介して支持体に固定化させることが有用である。
FIG. 17 is a schematic showing a non-competitive single molecule probe with a pair of interactive labels. Here, an affinity probe is taken as a specific example. In this single molecule probe, the
図18は、実施例3で使用された一つの相互作用性ラベル対を有する親和性単分子プローブの例を示す。ここでも、受容体因子であるストレプトアビジン(streptavidin)を検出するために第1対象配列(または、第1相補配列)に接合されたビオチンをプローブリガンドとして使用している。使用された相互作用性ラベル対は、蛍光体のフルオレセイン(fluorescein)と消光体のDABCYL(4-(4'-dimethylaminophenylazo)benzoic acid)とから構成されているが、前記単分子プローブの5'末端と3'末端にそれぞれ共有結合で連結されている。本発明によれば、前記プローブは、前記受容体因子の結合によって、ハイブリダイズした立体構造(図18A)から解離した立体構造(図18B)へ立体構造的変化を起こすように考案されている。 FIG. 18 shows an example of an affinity unimolecular probe having one interactive label pair used in Example 3. Again, biotin conjugated to a first target sequence (or first complementary sequence) is used as a probe ligand to detect the receptor factor streptavidin. The interactive label pair used is composed of the fluorophore fluorescein and the quencher DABCYL (4- (4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid), but the 5 'end of the unimolecular probe. And 3 ′ ends are covalently linked to each other. According to the present invention, the probe is devised to undergo a conformational change from a hybridized conformation (FIG. 18A) to a dissociated conformation (FIG. 18B) upon binding of the receptor factor.
競合的方式のプローブも、少なくとも1対の相互作用性ラベル対を、前記対象及び相補配列のうち少なくとも1対に接合させることによって構成されることができる。図19は、2対の相異なる相互作用性ラベル対を有する競合的方式のプローブを示す概略図である。ここでは、親和性プローブを特定例とした。この特定実施形態において、第1相互作用性ラベル対は、第1対象配列1aに接合された第1ラベル部分6aと、第1相補配列2aに接合された第2ラベル部分6bとから構成されており、第2相互作用性ラベル対は、第2対象配列1bに接合された第3ラベル部分7aと、第2相補配列2bに接合された第4ラベル部分7bとから構成されている。受容体因子10が存在しないときに、このプローブは、第1ハイブリダイズした立体構造(図19A)におり、したがって、前記第2ラベル対は相互に遠ざかるが、前記第1ラベル対は相互に近づいて位置するようになる。これにより、前記第1ラベル対の間には効果的な相互作用が起こるが、前記第2ラベル対の間には相互作用が遮断または抑制されることになる。前記受容体因子が存在するときに、このプローブは、第2ハイブリダイズした立体構造(図19B)へ変化し、前記第1ラベル対は相互に遠ざかる一方、前記第2ラベル対は相互に近づくようになり、したがって、各ラベル対間の相互作用が変わるようになる。勿論、前記相互作用性ラベル対(等)は、前記対象及び相補配列のうち1対にのみ接合されていてもよく、2対の前記対象及び相補配列に接合されていても良い。もし、2対の前記対象及び相補配列ともラベルされていると、各対の前記対象及び相補配列は、異なる種類の相互作用性ラベル対を有することが好ましい。
特定例において、前記第1及び第3ラベル部分6a,7aは、好適な位置(例えば、前記対象配列の中央部分近傍)に接合された同一の部分であっても良いが、この同一のラベル部分が接合された位置は、好適な位置(例えば、前記対象配列に接合されている前記同一のラベル部分に近接しているある位置)に接合されている前記第2及び第4ラベル部分6a,7bと相互作用が可能な位置である。
A competitive probe can also be constructed by joining at least one pair of interactive labels to at least one of the subject and complementary sequences. FIG. 19 is a schematic diagram showing a competitive probe having two different pairs of interactive labels. Here, an affinity probe is taken as a specific example. In this particular embodiment, the first interactive label pair is composed of a
In a specific example, the first and
図19に示すように、少なくとも一つの相互作用性ラベル対を有する競合的方式のプローブは、対象配列を含む第1分子、第1相補配列を含む第2分子、及び第2相補配列を含む第3分子からなる三分子プローブでありうる。このような三分子プローブにおいて、前記第1、第2、及び第3分子のうち一つがリンカーを介して固体支持体に固定化されていることができる。他の実施形態では、前記競合的方式のプローブは対象配列、第1相補配列、及び第2相補配列のうち二つを含む第1分子と、残り一つの配列を含む第2分子とからなる二分子プローブであっても良い。前記第1分子に含まれている二つの配列は、ループ部分により共有結合で連結されている。このような二分子プローブでは、前記第1及び第2分子のうち一つがリンカーを介して支持体に固定化されていることができる。他の実施形態において、前記競合的方式のプローブは、対象配列、第1相補配列、及び第2相補配列が少なくとも一つのループ部分により共有結合で連結された単分子プローブであっても良い。また、このような単分子プローブは、リンカーを介して支持体に固定化されていることができる。上述した二分子プローブ及び単分子プローブにおいて、前記相互作用性ラベル部分のうち少なくとも一つが、前記対象配列、前記第1相補配列、または前記第2相補配列を除いたある位置、例えば、前記ループ部分に、好ましくは前記対象または相補配列に近接した位置に接合されることができる。上述の如く、前記ループ部分は両配列のある2位置を連結する二価(divalent)または多価(multivalent)の化学部分でありうるが、前記対象配列及び相補配列のハイブリダイゼーションを邪魔しないものでなければならない。 As shown in FIG. 19, a competitive probe having at least one interactive label pair includes a first molecule including a target sequence, a second molecule including a first complementary sequence, and a second molecule including a second complementary sequence. It can be a trimolecular probe consisting of three molecules. In such a trimolecular probe, one of the first, second, and third molecules may be immobilized on a solid support through a linker. In another embodiment, the competitive probe comprises a first molecule comprising two of the target sequence, the first complementary sequence and the second complementary sequence, and a second molecule comprising the remaining one sequence. It may be a molecular probe. The two sequences contained in the first molecule are covalently linked by a loop part. In such a bimolecular probe, one of the first and second molecules can be immobilized on a support via a linker. In another embodiment, the competitive probe may be a single molecule probe in which a target sequence, a first complementary sequence, and a second complementary sequence are covalently linked by at least one loop portion. In addition, such a unimolecular probe can be immobilized on a support via a linker. In the above-described bimolecular probe and unimolecular probe, at least one of the interactive label portions is a position excluding the target sequence, the first complementary sequence, or the second complementary sequence, for example, the loop portion. Furthermore, it can be preferably joined at a position close to the object or complementary sequence. As described above, the loop portion may be a divalent or multivalent chemical moiety that links two positions of both sequences, but does not interfere with the hybridization of the target sequence and the complementary sequence. There must be.
上述した相互作用性ラベル対を特徴的に有しているプローブの実施形態に加えて、本発明の範囲内で相互作用性ラベル対を有するプローブを構成しうる様々な他の方法がある。
その特定の追加的な一例を、次に述べる。
上述した実施形態では、相互作用性ラベルの各対は、1対の対象及び相補配列に接合されている。すなわち、各ラベル対のうちいずれかのラベル部分が前記第1または第2対象配列のうち一つに接合されると、残り一つのラベル部分はこの対象配列に対応する相補配列に接合されている。後述する実施形態では、相互作用性ラベル対の両ラベル部分とも、前記対象配列または相補配列のうち一つに追加的なアーム配列(arm sequence)を使用することによって接合される。
In addition to the probe embodiments characteristically having interactive label pairs described above, there are various other ways in which probes having interactive label pairs can be constructed within the scope of the present invention.
A specific additional example is given below.
In the embodiment described above, each pair of interactive labels is joined to a pair of objects and complementary sequences. That is, when one label part of each label pair is joined to one of the first or second target sequences, the remaining one label part is joined to a complementary sequence corresponding to the target sequence. . In the embodiments described below, both label portions of the interactive label pair are joined by using an additional arm sequence to one of the subject or complementary sequences.
図20は、本発明による非競合的方式のプローブの一例を示す。ここでは、2対の相互作用性ラベルを有する親和性プローブを特定例とした。この特定実施形態において、プローブは、第1及び第2アーム対(first and second arm pairs)からなる2対の核酸アーム配列(nucleic acid arm sequences)をさらに含む。前記第1アーム対は、第1対象配列1aの5'末端に共有結合で連結された第1の5’アーム配列8aと、第1対象配列1aの3'末端に共有結合で連結された第1の3’アーム配列8bとから構成されている。前記第2アーム対は、第1相補配列2aの5'末端に共有結合で連結された第2の5’アーム配列9aと、第1相補配列2aの3'末端に共有結合で連結された第2の3’アーム配列9bとから構成されている。各対のアーム配列は相互に相補的であり、これにより、前記プローブが解離した立体構造(図20B)にある時、前記第1及び第2アーム対は、約3〜35個の相補的塩基対を有する第1及び第2ステム二重鎖(stem duplex)をそれぞれ形成する。このプローブが、ハイブリダイズした立体構造(図20A)にある時、前記第1及び第2ステム二重鎖は解離する。前記プローブは、第1ラベル対と第2ラベル対とから構成された2対の相互作用性ラベルをさらに含むが、前記第1ラベル対は、前記第1の5’アーム配列に接合された第1ラベル部分6aと、前記第1の3’アーム配列に接合された第2ラベル部分6bとを含み、前記第2ラベル対は、前記第2の5’アーム配列に接合された第3ラベル部分7aと、前記第2の3’アーム配列に接合された第4ラベル部分7bとを含む。前記第1及び第2ラベル対はそれぞれ、前記第1及び第2ステム二重鎖が形成されるときに相互作用するようになる。
FIG. 20 shows an example of a non-competitive probe according to the present invention. Here, an affinity probe having two pairs of interactive labels was taken as a specific example. In this particular embodiment, the probe further comprises two pairs of nucleic acid arm sequences consisting of first and second arm pairs. The first arm pair includes a first 5 ′
受容体因子10が存在しないときに、前記プローブは、前記ハイブリダイズした立体構造(図20A)を好むようになり、前記2ステム二重鎖は解離する。したがって、各相互作用性ラベル対は相互に遠ざかり、よって、各ラベル対の両ラベル部分間の相互作用が遮断または抑制されることになる。前記受容体因子が存在するときに、前記プローブは、前記解離した立体構造(図20B)へ変化し、前記ステム二重鎖が形成されるようになる。したがって、各相互作用性ラベル対は相互に近づき、前記2ラベル部分間の相互作用が效果的に起こるようになる。勿論、前記相互作用性ラベル対(等)は、前記第1対象配列または前記第1相補配列のうち一つにのみ接合されても良く(図21参照)、または、前記第1対象及び第1相補配列の両方に接合されても良い(図21参照)。このプローブは、前記第1対象配列を含む第1分子と、前記第1相補配列を含む第2分子とからなる二分子プローブであっても良く、前記第1対象配列及び前記第1相補配列がループ部分により共有結合で連結された単分子プローブであっても良い。このプローブは、リンカーを介して支持体に連結された固定化したプローブであっても良い。もし、前記固定化したプローブが二分子プローブであれば、前記第1及び第2分子のうちいずれか一つが固定化される。場合によって、少なくとも一つの前記相互作用性ラベル部分が前記アーム配列でない他の位置に接合されていることもある。例えば、前記ループ領域または前記第1対象若しくは第1相補配列に、好ましくは前記アーム配列と近い位置に接合されている。
In the absence of
図22は、競合する2対の対象及び相補配列を含む競合的方式の本発明によるプローブの例を示す。ここでは、2対の相互作用性ラベルを有する親和性プローブを特定例とした。この特定の実施形態において、前記プローブは、第1及び第2アーム対(first and second arm pairs)からなる2対の核酸アーム配列(nucleic acid arm sequences)をさらに含む。前記第1アーム対は、第1相補配列2aの5’末端に共有結合で連結された第1の5’アーム配列8aと、第1相補配列2aの3’末端に共有結合で連結された第1の3’アーム配列8bとから構成されている。前記第2アーム対は、第2相補配列2bの5’末端に共有結合で連結された第2の5’アーム配列9aと第2相補配列2bの3’末端に共有結合で連結された第2の3’アーム配列9bとから構成されている。各対の5'及び3'アーム配列は、互いに相補的である。前記第1相補配列がハイブリダイズしていないときに、前記第1アーム対が、約3〜35個の相補的塩基対を有する第1ステム二重鎖(first stem duplex)を形成し、前記第2相補配列がハイブリダイズしていないときには、前記第2アーム対が、約3〜35個の相補的塩基対を有する第2ステム二重鎖(second stem duplex)を形成する。前記第1または第2相補配列が前記対象配列にハイブリダイズした時、それに相応するステム二重鎖は解離する。前記プローブは、第1ラベル対と第2ラベル対とからなる2対の相互作用性ラベルをさらに含むが、第1ラベル対は、第1の5’アーム配列8aに接合された第1ラベル部分6aと第1の3’アーム配列8bに接合された第2ラベル部分6bとを含み、第2ラベル対は、第2の5’アーム配列9aに接合された第3ラベル部分7aと第2の3’アーム配列9bに接合された第4ラベル部分7bとを含む。
これら第1及び第2ラベル対はそれぞれ、第1及び第2ステム二重鎖が形成されるときに相互作用するようになる。
FIG. 22 shows an example of a competitive probe according to the invention comprising two pairs of competing objects and complementary sequences. Here, an affinity probe having two pairs of interactive labels was taken as a specific example. In this particular embodiment, the probe further comprises two pairs of nucleic acid arm sequences consisting of first and second arm pairs. The first arm pair includes a first 5 '
These first and second label pairs will interact when the first and second stem duplexes are formed, respectively.
受容体因子10が存在しないときに、前記プローブは、第1ハイブリダイズした立体構造(図22A)におり、よって、第1ステム二重鎖は解離し、第2ステム二重鎖が形成される。これにより、前記第1相互作用性ラベル対は相互に遠ざかり、この第1ラベル対の両ラベル部分間の相互作用が遮断または抑制され、一方、前記第2相互作用性ラベル対は相互に近づき、この第2ラベル対の両ラベル部分間の相互作用が效果的に起こるようになる。前記受容体因子が存在するときに、このプローブは、第2ハイブリダイズした立体構造(図22B)へ変化し、これにより、第1ステム二重鎖が形成され、第2ステム二重鎖は解離する。この第2ハイブリダイズした立体構造において、第1ラベル対は效果的に相互作用するが、第2ラベル対は十分に弱く相互作用するか、相互作用しなくなる。もう明らかなように、前記相互作用性ラベル対(等)は、第1または第2相補配列のうち一つにのみ接合されても良く、第1及び第2相補配列の両方に接合されても良い。もし、二つの相補配列ともラベルされた場合には、各相補配列が異なる相互作用性ラベル対を持つことが好ましい。このプローブは、前記対象配列を含む第1分子、前記第1相補配列を含む第2分子、及び前記第2相補配列を含む第3分子からなる三分子プローブでありうる。この三分子プローブは、前記第1、第2、及び第3分子のうちいずれか一つがリンカーを介して支持体に固定化された固定化したプローブでありうる。該プローブは、前記第1対象配列、前記第1相補配列、及び前記第2相補配列のうち二つを含む第1分子と、残りの配列を含む第2分子とからなる二分子プローブであっても良い。前記第1分子の二つの配列は、ループ部分により共有結合で連結される。この二分子プローブは、前記第1及び第2分子のうちいずれか一つが、リンカーを介して支持体に固定化された固定化したプローブでありうる。このプローブは、少なくとも一つのループ部分により共有結合で連結された前記第1対象配列、前記第1相補配列、及び前記第2相補配列を有する単分子プローブであっても良い。この単分子プローブは、リンカーを介して支持体に連結された固定化したプローブでありうる。場合によって、少なくとも一つの前記相互作用性ラベル部分が前記アーム配列でない他の位置に接合されていることがある。例えば、前記ループ領域または前記第1対象または第1相補配列に、好ましくは前記アーム配列と近い位置に接合されていることがある。
In the absence of
上述した少なくとも一つの相互作用性ラベル対を持つ大部分の実施形態において、ラベル対の構成要素(member)間に1対1の分子対応関係が一般的に必ずしも必要とされるわけではない。一つの構成要素またはある構成要素の少なくとも一つの分子が、他の構成要素の少なくとも一つの分子に影響を与えたり受けて、いずれかの構成要素の少なくとも一つの測定可能な特徴が、残り一つの構成要素により距離依存的な方式で変化可能な限り、各構成要素(member)は、一つ以上の接合された分子から構成されることができる。相互作用性ラベル対の特徴的シグナルは、プローブの立体構造によって検出可能に変わり、例えば、非競合的方式ではハイブリダイズした立体構造か解離した立体構造かによって、競合的方式では第1ハイブリダイズした立体構造か第2ハイブリダイズした立体構造かによって変わる。一つ以上の接合された分子からなるラベル部分は、より大きい特徴的シグナルを発生しうるので、一部の実施形態では極めて有用となる。蛍光体と消光体対や発光体と消光体対のようなFRETラベル対を使用する場合、複数の消光体を、一つの光を生成するラベル部分と連係させて使用しても良い。この場合、消光体による、光を生成する部分に対する消光が極めて有効となり、背景シグナルが効率よく除去されるので、特に有用である。 In most embodiments having at least one interactive label pair as described above, a one-to-one molecular correspondence between the members of the label pair is generally not necessarily required. At least one molecule of one component or at least one molecule of one component affects or is affected by at least one molecule of another component, so that at least one measurable characteristic of any component is the remaining one Each member can be composed of one or more joined molecules, as long as it can vary in a distance dependent manner depending on the component. The characteristic signal of the interactive label pair changes detectably depending on the conformation of the probe, for example, the first hybrid in the competitive format depending on whether it is a hybridized or dissociated conformation in the noncompetitive format It depends on whether it is a three-dimensional structure or a second hybridized three-dimensional structure. Label portions made up of one or more conjugated molecules can be very useful in some embodiments because they can generate larger characteristic signals. When a FRET label pair such as a phosphor and quencher pair or a light emitter and quencher pair is used, a plurality of quenchers may be used in association with a label portion that generates one light. In this case, the quenching by the quencher for the part that generates light is extremely effective, and the background signal is efficiently removed, which is particularly useful.
上述の如く、最も好ましい相互作用性ラベル対は、蛍光体と消光体対または発光体と消光体対のようなFRETラベル対である。この場合、特徴的シグナルは、蛍光体部分または発光体部分により生成される特定波長の光の強度、寿命、または偏光でありうる。すなわち、両ラベル部分間の相互作用は、蛍光体または発光体により生成された光の強度の減少、寿命の減少、または偏光(または偏光の寿命)の変化を招くようになる。
上述の如く、酵素供与体(donor)と受納体(accetpor)対を含む酵素ラベル対もまた、例えば酵素反応を使用することによってプローブシグナルが増幅されるので、非常に少ない量の標的因子を検出する上で特に好ましい。
相互作用性ラベル対を有するプローブは、非相互作用性ラベル及びインターカレート染色剤のような他の検出可能なラベルを使用するプローブに比べて特に有用である。相互作用性ラベル対を固定化していないプローブと共に使用すると、他の種類のラベルを使用する場合に典型的に必要な分離過程を要求としない均一アッセイ(homogeneous assay)が可能になる。例えば、もし、蛍光体と消光体対または発光体と消光体対のようなFRETラベル対が使用されると、特別な分離過程無しで試料から放出される光の性質を単に検出するだけでも特徴的なシグナルを確認したり測定することが可能になる。したがって、相互作用性ラベル対を持つプローブは、in situまたはin vivoアッセイで使用可能である。少なくとも一つの相互作用性ラベル対を有する固定化したプローブもまた、他の種類のラベルを使用するときには典型的に必ず要求される洗浄過程を、必ずしも要求するのではないという利点がある。
As noted above, the most preferred interactive label pair is a FRET label pair such as a phosphor and quencher pair or a light emitter and quencher pair. In this case, the characteristic signal can be the intensity, lifetime, or polarization of light of a particular wavelength generated by the phosphor or phosphor moiety. That is, the interaction between both label portions results in a decrease in the intensity of light generated by the phosphor or illuminant, a decrease in lifetime, or a change in polarization (or lifetime of polarization).
As noted above, enzyme label pairs, including enzyme donor and acceptor pairs, also amplify the probe signal, for example by using an enzyme reaction, so that a very small amount of target factor is present. It is particularly preferable for detection.
Probes with interactive label pairs are particularly useful compared to probes that use non-interactive labels and other detectable labels such as intercalating stains. The use of interactive label pairs with non-immobilized probes allows for a homogeneous assay that does not require the separation process typically required when using other types of labels. For example, if a FRET label pair such as a phosphor and quencher pair or a light emitter and quencher pair is used, it can be characterized by simply detecting the nature of the light emitted from the sample without a special separation It is possible to confirm and measure a typical signal. Thus, probes with interactive label pairs can be used in in situ or in vivo assays. Immobilized probes having at least one interactive label pair also have the advantage that they do not necessarily require the washing process that is typically required when using other types of labels.
一部の実施形態において、本発明によるプローブは、特定の用途のために追加的な構成要素を含むように構成されても良い。
一実施の形態において、核、ミトコンドリア、ペルオキシソーム(peroxisome)、葉緑体(chloroplast)、液胞(vacuole)、ゴルジ体(Golgi apparatus)などの特定の細胞内小器官にプローブを位置移動させるために、一つまたはそれ以上のトランジットペプチド(transit peptide)または標的配列(targeting sequence)が本発明のプローブに接合されることができる。好ましくは、このようなトランジットペプチドや標的配列は、元来意図したプローブの検出機能を邪魔しない位置に接合(一般的に、共有結合にて接合)される。この類型のプローブを利用するアッセイは、細胞内小器官に在る標的因子を検出するためのin vivoまたはin situアッセイに使用されることができる。このような細胞内標的アッセイ(intracellular targeting assay)で相互作用性ラベル対を持つプローブが一般的に好ましいが、特に単分子プローブ方式が最も好ましい。
In some embodiments, a probe according to the present invention may be configured to include additional components for a particular application.
In one embodiment, to move a probe to a specific organelle such as the nucleus, mitochondria, peroxisome, chloroplast, vacuole, Golgi apparatus, etc. One or more transit peptides or targeting sequences can be conjugated to the probes of the present invention. Preferably, such a transit peptide or target sequence is joined (generally, covalently joined) at a position that does not interfere with the originally intended probe detection function. Assays utilizing this type of probe can be used in in vivo or in situ assays to detect target factors present in intracellular organelles. In such an intracellular targeting assay, a probe having an interactive label pair is generally preferred, but a single molecule probe method is most preferred.
他の実施形態において、一つまたはそれ以上の追加的な核酸配列が本発明のプローブ、特に核酸ベースのシグナルトランスデューサーに接合されることができる。より具体的に、この追加的な核酸配列は、前記対象及び/または相補配列に、好ましくは共有結合連結にて接合される。このようなプローブ、特に検出可能なラベルとして非相互作用性ラベルまたはインターカレート染色剤を有するプローブの特別な用途の一つは、ハイブリダイズしたまたはハイブリダイズしていない種に対する大きさ依存性確認を容易にするものである。例えば、三分子競合的プローブ方式において、第1または第2相補配列が、対象オリゴヌクレオチドの相応する部分(もし在れば)に十分に相補的でない追加的な核酸配列を含むように構成することができる。このような構成は、第1ハイブリダイズした二重鎖(または、第1相補配列)が、電気泳動分析において第2ハイブリダイズした二重鎖(または、第2相補配列)に比べてその大きさにおいて十分に異なってくるようにする。 In other embodiments, one or more additional nucleic acid sequences can be conjugated to a probe of the invention, particularly a nucleic acid based signal transducer. More specifically, this additional nucleic acid sequence is joined to said subject and / or complementary sequence, preferably by covalent linkage. One particular use of such probes, particularly probes with non-interactive labels or intercalating stains as detectable labels, is to determine size dependence on hybridized or non-hybridized species. To make it easier. For example, in a trimolecular competitive probe system, the first or second complementary sequence is configured to contain additional nucleic acid sequences that are not sufficiently complementary to the corresponding portion (if any) of the subject oligonucleotide. Can do. In such a configuration, the first hybridized duplex (or first complementary sequence) is larger in size than the second hybridized duplex (or second complementary sequence) in the electrophoresis analysis. To be sufficiently different.
さらに他の実施形態において、本明細書で記述されるほとんど大部分の本発明のプローブは、核酸複製鋳型(nucleic acid replication template)として使用される一つまたはそれ以上の追加的な核酸配列を、対象及び相補配列のうち少なくとも一つに接合される形で含むように構成されることができる。上述の如く、このようなプローブは、望むハイブリダイズした状態を検出するために、標準化したPCR(または、重合反応)増幅方式を使用できるようにする。より具体的に、前記プローブが非競合的方式であれば、第1対象配列または第1相補配列が核酸複製鋳型を含むように構成し、しかる後に、重合酵素(polymerase)または関連酵素を、PCRまたは重合反応を起こらせるのに使用することができるが、このPCRまたは重合反応は、ハイブリダイズした立体構造の量に敏感なものである。もし、前記プローブが競合的方式であれば、このプローブは、PCRまたは重合反応が第1または第2ハイブリダイズした立体構造のうち一つのみから起こるように構成されねばならなく、これは、様々な方法で可能である。例えば、もし、核酸複製鋳型を対象配列に含ませたい場合なら、第1及び第2相補配列のうちいずれか一つをホスファターゼ(phosphatase)で処理して5'末端のリン酸基が除去されるようにする。この処理は、5'末端にリン酸基がないように処理された相補配列に起因するPCRまたは重合反応が起きないようにする。他の方法として、核酸複製鋳型を第1及び第2相補配列のうち一つの5'末端にのみ含ませることによって、PCRまたは重合反応が、前記複製鋳型を有する相補配列が対象配列にハイブリダイズした時に限って起きるようにしても良い。上述の如く、このような増幅産物の存在または重合反応試薬の量の検出可能な減少(または、両方)を、試料内に標的因子が存在するのを表す指標として使用することができる。 In still other embodiments, most of the probes of the invention described herein contain one or more additional nucleic acid sequences that are used as nucleic acid replication templates. It may be configured to be included in a form joined to at least one of the target and the complementary sequence. As described above, such probes allow the use of a standardized PCR (or polymerization reaction) amplification scheme to detect the desired hybridized state. More specifically, if the probe is non-competitive, the first target sequence or the first complementary sequence is configured to include a nucleic acid replication template, and then the polymerase or related enzyme is added to the PCR. Alternatively, it can be used to cause a polymerization reaction, but this PCR or polymerization reaction is sensitive to the amount of hybridized conformation. If the probe is competitive, the probe must be configured so that the PCR or polymerization reaction occurs from only one of the first or second hybridized conformations, It is possible by a simple method. For example, if it is desired to include a nucleic acid replication template in the target sequence, one of the first and second complementary sequences is treated with phosphatase to remove the phosphate group at the 5 ′ end. Like that. This treatment prevents PCR or polymerization reactions due to complementary sequences that have been treated so that there is no phosphate group at the 5 'end. As another method, by including the nucleic acid replication template only at the 5 ′ end of one of the first and second complementary sequences, the PCR or polymerization reaction causes the complementary sequence having the replication template to hybridize to the target sequence. You may make it happen only occasionally. As noted above, the presence of such amplification products or a detectable decrease (or both) in the amount of polymerization reaction reagent can be used as an indicator of the presence of the target agent in the sample.
一般的に、本発明の標的検出システムと特に本明細書に開示するプローブは、本明細書に開示する手順と周知の実験技術を用いて用意することができる。例えば、本発明のプローブ、特に核酸ベースのシグナルトランスデューサーに含まれた核酸分子は、通常、固体相合成技術(Caruthers,M.H.(1985);Brown T. and Dorcas,J.S.(1995)参照)、合成された配列や制限酵素切片(restriction fragment)の結紮(ligation)、または、これら技術の組み合わせで用意することができる。典型的に、認識要素と検出可能なラベルとを含む他の構成要素は、このような構成要素(等)が接合された(無塩基ヌクレオチドと他のヌクレオチド類似体を含む)修飾されたヌクレオチドを核酸合成過程中に使用することによってプローブに導入させることができる。他の方法として、反応性ある反応基を連結子とする修飾ヌクレオチドを、核酸合成過程中に使用しても良い。しかる後に、認識要素、検出可能なラベル、ループ部分などの他の構成要素を周知の化学的または生化学的連結方法を用いて前記反応性ある反応基(等)に接合させることができる。このような化学的または生化学的連結反応には、ヒドロキシル(hydroxyl)、カルボキシル(carboxyl)、アミノ(amino)、スルフヒドリル(sulfhydryl)、アルデヒド(aldehyde)、リン酸(phosphate)、アルキルアミノ(alkylamino)、ヒドロキシアルキル(hydroxy alkyl)、アルキルリン酸(alkyl phosphate)、及びこれらに類似する反応基が関与できる。多様な反応基を有する修飾されたヌクレオチドを準備する技術は、本発明の属する技術分野によく知られている。典型的に、修飾されたヌクレオチドを有する核酸分子の合成には、よく知られた固体相合成技術(solid phase synthesis techniques)が使用される。認識要素、検出可能なラベル及び他の構成要素の準備及び/または接合は、一般的に知られた化学的、生化学的及び生物学的方法を用いて遂行されることができる。例えば、プロテアーゼ(protease)とプロテインキナーゼ(protein kinase)に特異的なアミノ酸配列は、周知の固体相合成技術または他の合成技術(Wunsch,E.(1971);Houghtem,R.A.(1985)参照)を用いて準備することができる。受容体、サイトカイン、タンパク質ホルモン、抗原、酵素及びこれらの類似体のようなタンパク質やポリペプチドは、組み換えDNAの準備、形質転換、細胞培養、及び発現されたタンパク質またはポリペプチドの分離及び精製を含む組み換えDNA技術で用意すると良い。炭水化物、脂質、リン脂質、及び他の化学的または生化学的物質は、知られた化学的、生化学的、そして生物学的技術を使用して用意することができる。さらに、化学的または生化学的物質をヌクレオチドまたは核酸分子に導入または接合させるための技術は、本発明の属する技術分野でよく知られている。本発明と共に使用可能な他の適切な実験過程が報告されており、それら方法に関する公知については、次の参考文献を参照されたい。Knorre, D.G. et al. in Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives, CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo (1994);Travers, A. and Buckle, M. in DNA-Protein Interactions: A Practical Approach, Oxford University Press (2000);Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989);Ausubel et al.in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York(1989);及びAusubel et al. in Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1999)。 In general, the target detection system of the present invention and in particular the probes disclosed herein can be prepared using the procedures disclosed herein and well-known experimental techniques. For example, nucleic acid molecules contained in probes of the invention, particularly nucleic acid-based signal transducers, are typically synthesized by solid-phase synthesis techniques (see Caruthers, MH (1985); Brown T. and Dorcas, JS (1995)), synthesis Can be prepared by ligation of restriction sequences or restriction fragment, or a combination of these techniques. Typically, other components, including recognition elements and detectable labels, are modified nucleotides (including abasic nucleotides and other nucleotide analogs) to which such components (etc.) are conjugated. It can be introduced into the probe by being used during the nucleic acid synthesis process. Alternatively, modified nucleotides with reactive reactive groups as ligators may be used during the nucleic acid synthesis process. Thereafter, other components such as recognition elements, detectable labels, loop portions, etc. can be conjugated to the reactive reactive group (etc.) using well-known chemical or biochemical linking methods. Such chemical or biochemical ligation reactions include hydroxyl, carboxyl, amino, sulfhydryl, aldehyde, phosphate, alkylamino. , Hydroxy alkyl, alkyl phosphate, and similar reactive groups can be involved. Techniques for preparing modified nucleotides having a variety of reactive groups are well known in the art to which the present invention belongs. Typically, well-known solid phase synthesis techniques are used to synthesize nucleic acid molecules having modified nucleotides. Preparation and / or conjugation of recognition elements, detectable labels and other components can be accomplished using commonly known chemical, biochemical and biological methods. For example, amino acid sequences specific for proteases and protein kinases can be obtained using well-known solid phase synthesis techniques or other synthesis techniques (see Wunsch, E. (1971); Houghtem, RA (1985)). Can be prepared using. Proteins and polypeptides such as receptors, cytokines, protein hormones, antigens, enzymes and analogs thereof include preparation of recombinant DNA, transformation, cell culture, and isolation and purification of expressed proteins or polypeptides Use recombinant DNA technology. Carbohydrates, lipids, phospholipids, and other chemical or biochemical substances can be prepared using known chemical, biochemical, and biological techniques. Furthermore, techniques for introducing or conjugating chemical or biochemical substances to nucleotide or nucleic acid molecules are well known in the art to which this invention belongs. Other suitable experimental procedures that can be used with the present invention have been reported and reference is made to the following references for public knowledge regarding these methods. Knorre, DG et al. In Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives, CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo (1994); Travers, A. and Buckle, M. in DNA-Protein Interactions: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); Sambrook et al. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Ausubel et al. In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989); and Ausubel et al. in Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1999).
また、本明細書に開示する実施例を、特定標的検出システムを作製し使用する方法と関連して参考されたい。
少なくとも一つの標的因子を検出するための本発明によるアッセイは、典型的に、a)標的因子を含むと疑われる試料と本発明によるプローブを接触させる段階;及び、b)検出温度を含むアッセイ条件下で、標的因子が存在しないときと比較して、前記特徴的シグナルの大きさが変化したか確認する段階を含む。本発明において、使用されたプローブに含まれたプローブリガンドに特異的に結合しうる受容体因子を検出するためのプローブは、親和性プローブであり、使用されたプローブに含まれた切断部位を特異的に切断しうる反応誘発因子を検出するためのプローブは、切断性プローブである。また、本発明において、使用されたプローブに含まれた反応部位を共有結合または非共有結合にて連結する反応を特異的に誘導しうる反応誘発因子を検出するためのプローブは、第I型連結性プローブであり、プローブに含まれた反応部位を接合部位へ特異的に変換させうる反応誘発因子を検出するためのプローブは、第II型連結性プローブである。本発明の他の例において、特定反応誘発因子を検出するために、第II(−)型連結性プローブも考案されている。典型的に、第II(−)型連結性プローブにおける反応誘発因子は、このプローブに含まれた反応部位(すなわち、接合部位)を非接合性部位へ特異的に変換させる。
Also, reference is made to the examples disclosed herein in connection with methods of making and using a specific target detection system.
An assay according to the invention for detecting at least one target agent typically comprises a) contacting a sample suspected of containing the target agent with a probe according to the invention; and b) an assay condition comprising a detection temperature. Below, the method includes the step of confirming whether the magnitude of the characteristic signal has changed as compared to when the target factor is not present. In the present invention, the probe for detecting a receptor factor that can specifically bind to the probe ligand contained in the used probe is an affinity probe, and the cleavage site contained in the used probe is specifically identified. A probe for detecting a reaction inducer that can be cleaved is a cleavable probe. Further, in the present invention, the probe for detecting a reaction inducing factor capable of specifically inducing a reaction for linking the reaction sites contained in the used probe with a covalent bond or a non-covalent bond is a type I linkage. A probe for detecting a reaction inducing factor that is a sex probe and can specifically convert a reaction site contained in the probe into a junction site is a type II connectivity probe. In another example of the present invention, a type II (−) connectivity probe is also devised to detect a specific reaction inducer. Typically, the reaction inducer in the type II (−) connectivity probe specifically converts the reaction site (ie, the junction site) contained in this probe into a non-zygous site.
本発明による前記親和性プローブ及び前記反応性プローブは、受容体因子及び反応誘発因子以外の標的因子を検出したり確認するためのアッセイにも使用可能である。そのいくつかの特定例を、次に述べる。
親和性プローブは、少なくとも一つの標的リガンド検出のためのアッセイにも使用されることができる。これらアッセイは、a)プローブリガンドと標的リガンドの両方に結合しうる受容体因子の存在下で、標的リガンドを含むと疑われる試料を本発明による親和性プローブと接触させる段階;及び、b)検出温度を含むアッセイ条件下で、標的因子が存在しないときと比較して、前記特徴的シグナルの大きさが変化するか確認する段階を含む。また、親和性プローブを使用するアッセイは、標的リガンドを確認するためのアッセイ、すなわち候補標的リガンドが関心の対象となる受容体因子と結合するか否かを決定するアッセイ、及び受容体因子とプローブリガンドの相互作用に影響を与える他の因子または物質を検出するためのアッセイを含む。このようなアッセイは、典型的に前記関心の対象となる受容体因子の存在下で行われる。
The affinity probe and the reactive probe according to the present invention can also be used in assays for detecting and confirming target factors other than receptor factors and reaction inducers. Some specific examples are described below.
Affinity probes can also be used in assays for detecting at least one target ligand. These assays include: a) contacting a sample suspected of containing a target ligand with an affinity probe according to the present invention in the presence of a receptor factor capable of binding to both the probe ligand and the target ligand; and b) detection. Confirming that the magnitude of the characteristic signal changes under assay conditions including temperature compared to when no target agent is present. Assays using affinity probes also include assays for identifying target ligands, ie, assays that determine whether a candidate target ligand binds to a receptor factor of interest, and receptor factors and probes Assays to detect other factors or substances that affect ligand interaction are included. Such assays are typically performed in the presence of the receptor factor of interest.
反応性プローブもまた、反応誘発因子でない標的因子を検出するためのアッセイで使用されることができる。これらアッセイは典型的に、a)反応性プローブと特異的に相互作用しうる反応誘発因子の存在下で、標的因子を含むと疑われる試料と本発明による反応性プローブを接触する段階;及び、b)検出温度を含むアッセイ条件下で、標的因子が存在しないときと比較して、前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階を含む。これらアッセイにおける前記標的因子は、前記反応誘発因子と前記反応性プローブとの意図的相互作用及び/または前記プローブの意図的機能のために必要な試料内の他の要素または物質でありうる。このような標的因子の例は、反応誘発因子の活性と密接に関連した補因子(cofactor)、補酵素(coenzyme)、金属イオン(metal ion)、二次基質(secondary substrate)及びこれらの類似体のような特定因子を含む。第I型、第II型、及び第II(−)型連結性プローブにおいて、このような標的因子は、前記プローブに連結または接合されて不安定化因子として作用しうるものを含む試料内の特定物質でありうる。また、反応性プローブを使用するこれらアッセイは、当該の因子及び物質を確認するためのアッセイ、すなわち候補因子または候補物質が前記反応誘発因子と前記プローブの相互作用に影響を与えるか否かを決定するためのアッセイを含む。このようなアッセイは典型的に反応誘発因子の存在下で行われる。 Reactive probes can also be used in assays to detect target factors that are not response inducers. These assays typically include: a) contacting a reactive probe according to the present invention with a sample suspected of containing a target agent in the presence of a reaction inducer capable of specifically interacting with the reactive probe; b) confirming whether there is a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when no target agent is present under the assay conditions including the detection temperature. The target factor in these assays may be other elements or substances in the sample that are necessary for the intentional interaction of the reaction-inducing factor and the reactive probe and / or the intended function of the probe. Examples of such target factors are cofactors, coenzymes, metal ions, secondary substrates and analogs thereof that are closely related to the activity of the reaction-inducing factor. Specific factors such as In type I, type II, and type II (-) connective probes, such target factors are identified in the sample, including those that can be linked or conjugated to the probe and act as destabilizing factors. It can be a substance. In addition, these assays using reactive probes determine the factors and substances of interest, i.e., determine whether a candidate factor or candidate substance affects the interaction of the reaction-inducing factor with the probe. Including assays for Such assays are typically performed in the presence of a reaction inducer.
なお、本発明は、標的因子と認識要素間の相互作用を阻害または増強させる阻害剤または増強剤を検出するためのアッセイを提供する。これらアッセイは典型的に、a)標的因子の存在下に候補化合物を本発明によるプローブと接触させる段階;及び、b)検出温度を含むアッセイ条件下で、候補化合物が存在しないときと比較して前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階を含む。先に述べたように、前記標的因子が受容体因子の場合、前記プローブは親和性プローブであり、前記標的因子が切断反応活性を有する反応誘発因子であれば、前記プローブは本発明による切断性プローブである。前記標的因子が連結反応活性を有する反応誘発因子であれば、前記プローブは第I型連結性プローブであり、前記標的因子が修飾反応活性を有する反応誘発因子であれば、前記プローブは第II型または第II(−)型連結性プローブである。第I型、第II型または第II(−)型連結性プローブを使用するアッセイにおいて前記接触する段階は、不安定化因子を添加することを含む段階である。そして、前記第II型または第II(−)型連結性プローブを使用するアッセイにおいて前記接触する段階は、必要に応じて連結試薬(coupling reagent)を添加することを含む段階である。 The present invention also provides an assay for detecting an inhibitor or enhancer that inhibits or enhances the interaction between a target factor and a recognition element. These assays typically involve a) contacting a candidate compound with a probe according to the invention in the presence of a target agent; and b) under assay conditions that include a detection temperature as compared to when no candidate compound is present. Checking whether there is a change in the magnitude of the characteristic signal. As described above, when the target factor is a receptor factor, the probe is an affinity probe, and if the target factor is a reaction inducer having a cleavage reaction activity, the probe is cleaved according to the present invention. It is a probe. If the target factor is a reaction inducer having ligation activity, the probe is a type I connectivity probe, and if the target factor is a reaction inducer having modification activity, the probe is type II Or it is a type II (-) connectivity probe. Said contacting in an assay using a type I, type II or type II (-) linking probe is a step comprising adding a destabilizing factor. In the assay using the type II or type II (-) linking probe, the contacting step is a step including adding a coupling reagent as necessary.
本発明によって、前記標的因子と前記認識要素との相互作用を阻害したり増強させる阻害剤や増強剤を検出するために、ほとんど大部分の化合物または化合物群をスクリーニングすることができる。この例には、サイトカイン(cytokine)、腫瘍抑制子(tumor suppressor)、抗体(antibody)、受容体(receptor)、ミューテイン(mutein)、このようなタンパク質の断片または一部、及びアンチセンサー(antisensor)RNAまたはリボザイム(rybozyme)のような活性RNA分子が含まれるが、これに限定されない。スクリーニング目的のための好ましい化合物は、小分子(small molecule)とも呼ばれる合成または半合成薬物である。その例には、化学的化合物、ペプチド、化学的化合物とペプチドとの混合物、及び天然物抽出物を含む。試験可能な候補阻害剤または増強剤の濃度は典型的に約0.1μM乃至100μMであり、多くの場合においてそれ以下となる。典型的なスクリーニングでは、約1μM乃至約10μMの濃度が好ましい。多数の候補化合物をスクリーニングする必要がある時、約5個乃至30個の候補抑制剤の混合物をスクリーニングの第1段階で使用することができる。 According to the present invention, almost all compounds or groups of compounds can be screened to detect inhibitors and enhancers that inhibit or enhance the interaction between the target factor and the recognition element. Examples include cytokines, tumor suppressors, antibodies, receptors, muteins, fragments or parts of such proteins, and antisensors. Examples include, but are not limited to, active RNA molecules such as RNA or ribozyme. Preferred compounds for screening purposes are synthetic or semi-synthetic drugs, also called small molecules. Examples include chemical compounds, peptides, mixtures of chemical compounds and peptides, and natural product extracts. The concentration of the candidate inhibitor or enhancer that can be tested is typically about 0.1 μM to 100 μM, and in many cases will be lower. For typical screening, a concentration of about 1 μM to about 10 μM is preferred. When it is necessary to screen a large number of candidate compounds, a mixture of about 5 to 30 candidate inhibitors can be used in the first stage of the screening.
多様な候補化合物の集まりが知られており、これらは本発明による標的検出システムで使用可能である。
例えば、ヒトウイルス性病源体の知られた阻害剤の誘導体は、本発明の方法で容易に試験することができる。これは、試験可能な多様な分子とその誘導体が開示されている米国特許第6,420,438;6,329,525;6,287,840;6,147,188;及び、6,046,190を参照されたい。本発明は、追加の化合物をスクリーニングするために使用することができ、これは、多様な潜在的ウイルスプロテアーゼ抑制化合物が開示されているPillay et al.(1995) Rev.Med.Virol.;インジナビル(indinavir)とABT-538を開示しているWei et al.(1995) Nature、373:117;及び、抗ヘルパス因子(anti-herpes agent)を開示しているHo et al.(1992) Ann.Intern.Med.113:111を参照されたい。
また、本発明の技術分野に既に知られた特定の化合物の誘導体、例えば、これに限定されるのではないが、サキナビル(saquinavir)とその誘導体を含む誘導体も本発明によってスクリーニングできる。
A diverse collection of candidate compounds is known and can be used in the target detection system according to the present invention.
For example, derivatives of known inhibitors of human viral pathogens can be readily tested with the methods of the invention. US Pat. Nos. 6,420,438; 6,329,525; 6,287,840; 6,147,188; and 6,046, See 190. The present invention can be used to screen for additional compounds, which include Pilary et al. (1995) Rev. Med. Virol .; indinavir, where a variety of potential viral protease inhibitor compounds are disclosed. indinavir) and ABT-538 Wei et al. (1995) Nature, 373: 117; and Ho et al. (1992) Ann. Intern disclosing anti-herpes agents. See .Med.113: 111.
In addition, derivatives of certain compounds already known in the art of the present invention, such as but not limited to saquinavir and derivatives thereof, can be screened by the present invention.
本発明による標的検出システムは、一つまたはそれ以上のプロテインキナーゼ(protein kinase)の調節子(modulator)を含む他の化合物の集まりと共に使用されることができる。これら集まりには、ランダムペプチドライブラリー(random peptide libraries)とD-、L-、またはD-及びL-アミノ酸からなる組み合わせ化学(combinatorial chemistry)により合成された分子ライブラリーが含まれることができる(Lam et al.,Nature 354:82-84(1991);Houghten et al.,Nature 354:84-86(1991)参照)。また、ホスホペプチドライブラリー(例えば、random and partially degenerate、directed phosphopeptide libraries)の使用も可能である(Songyang et al.,Cell 72:767-778(1993)参照)。
本発明は、米国特許番号第6,462,060;6,420,382;6,462,036で公知されたような特別に用意されたキナーゼ調節子(kinase modulator)ライブラリーとの使用も可能である。
上述したこれらアッセイは、定性的なものでも、定量的なものでも良い。定量的なアッセイは、本発明の属する技術分野で知られたアッセイを使用することができる。例えば、試料の特徴的シグナルを、段階別に希薄された標準標的因子溶液のシグナルと比較すると良い。また、測定を、時間の関数としても良く、陰性対照群及び/または陽性対照群の測定値と比較して行っても良い。
The target detection system according to the present invention can be used with a collection of other compounds including one or more protein kinase modulators. These collections can include random peptide libraries and molecular libraries synthesized by combinatorial chemistry consisting of D-, L-, or D- and L-amino acids ( Lam et al., Nature 354: 82-84 (1991); Houghten et al., Nature 354: 84-86 (1991)). In addition, phosphopeptide libraries (for example, random and partially degenerate, directed phosphopeptide libraries) can be used (see Songyang et al., Cell 72: 767-778 (1993)).
The present invention can also be used with specially prepared kinase modulator libraries such as those known in US Pat. Nos. 6,462,060; 6,420,382; 6,462,036. It is.
These assays described above may be qualitative or quantitative. As the quantitative assay, an assay known in the technical field to which the present invention belongs can be used. For example, the characteristic signal of the sample may be compared with the signal of a standard target factor solution diluted in stages. Further, the measurement may be a function of time, and may be performed by comparing with the measured value of the negative control group and / or the positive control group.
詳細に述べたように、本発明によるプローブは、非相互作用性ラベル、インターカレート染色剤、または相互作用性ラベル対からなる群より選らばたれ少なくとも一つの検出可能なラベルを有することができる。また、本発明によるプローブは、三分子、二分子、または単分子プローブでありうる。さらに、本発明によるプローブは、非競合的または競合的方式のものでありうる。このようなプローブはいずれも上述したアッセイで使用することができる。具体的に、もし、前記プローブが、検出可能なラベルとして非相互作用性ラベルまたはインターカレート染色剤を有しており、かつ、固定化していないと、前記確認する段階は、ハイブリダイズした種とハイブリダイズしていない種を大きさの関数として分離する段階を含む。もし、非相互作用性ラベルまたはインターカレート染色剤を有する前記プローブが固定化したプローブであれば、前記確認する段階は、プローブまたはその構成要素が固定化している支持体から、結合していない種を除去するための洗浄段階を含む。もし、前記プローブが、検出可能なラベルとして相互作用性ラベル対を有していると、前記アッセイは、均一アッセイ(homogeneous assay)であっても、不均一アッセイ(heterogeneous assay)であっても良いが、均一アッセイがより好ましい。非常に小さい量の標的因子を検出するためにシグナル増幅方法が必要とされる時には、前述した酵素ラベルが好ましいが、一般的に最も好ましい相互作用性ラベル対は、蛍光体と消光体対または発光体と消光体対のようなFRET対またはこれに類似するものである。 As described in detail, a probe according to the present invention can have at least one detectable label selected from the group consisting of non-interactive labels, intercalating stains, or interactive label pairs. . Also, the probe according to the present invention may be a trimolecular, bimolecular or unimolecular probe. Furthermore, the probes according to the invention can be of non-competitive or competitive type. Any such probe can be used in the assays described above. Specifically, if the probe has a non-interactive label or an intercalating stain as a detectable label and is not immobilized, the step of confirming is a hybridized species. Separating a species that is not hybridized with as a function of size. If the probe with a non-interactive label or intercalating stain is an immobilized probe, the step of confirming is not bound from the support on which the probe or its components are immobilized Including a washing step to remove the seeds. If the probe has an interactive label pair as a detectable label, the assay may be a homogeneous assay or a heterogeneous assay. However, a homogeneous assay is more preferred. The enzyme label described above is preferred when signal amplification methods are required to detect very small amounts of target agent, but in general the most preferred interactive label pair is a fluorophore and quencher pair or a luminescent pair. FRET pairs such as body and quencher pairs or similar.
相互作用性ラベル対を有するプローブは、組織または細胞の破壊無しで組織または細胞の内部または外部で標的因子を検出したり、阻害剤または増強剤をスクリーニングするためのin situまたはin vivoアッセイで特に有用である。過量のプローブを洗浄または分離過程無しで使用することが可能であり、一部の実施形態では大きい背景シグナルの発生無しで使用することが可能なので、本発明によるin situまたはin vivoアッセイは特に有用である。in situまたはin vivoアッセイのためには、相互作用性ラベル対を有する、好ましくは蛍光体と消光体対または発光体と消光体対を相互作用性ラベル対として有する単分子プローブが最も好ましいプローブである。in situまたはin vivoアッセイとスクリーニングにおいて、前記接触する段階は、使用されるプローブ(等)と必要な場合に他の因子を、試験しようとする組織または細胞を含む試料に添加したり、または細胞に導入することを含む。前記他の因子の例には、候補化合物、受容体因子、反応誘発因子、不安定化因子、受容体因子をコードしているベクトル、反応誘発因子として作用する酵素をコードするベクトルなどがある。本発明によるin situまたはin vivoアッセイにおいて、前記プローブと前記他の因子は、細胞内部に知られた方法を用いて導入されることができる。この導入する方法の例は、リポソーム(liposome)でプローブと他の因子をカプセル化して包むか、または細胞膜を、前記プローブと前記他の因子に対して透過性を持つようにしたり多孔性化して導入する方法がある。マイクロインジェクション(microinjection)方法は特に単一細胞を研究するのに有用であるが、特に、細胞の成長段階または多様なストレスや誘導シグナルに対する感応に従う時間の関数として研究するのに有用である。 Probes with interactive label pairs are particularly useful in in situ or in vivo assays to detect target agents inside or outside tissues or cells without screening the tissue or cells, or to screen for inhibitors or enhancers. Useful. The in situ or in vivo assay according to the present invention is particularly useful because an excess amount of probe can be used without a wash or separation process, and in some embodiments can be used without the generation of a large background signal. It is. For in situ or in vivo assays, unimolecular probes with interacting label pairs, preferably fluorophore and quencher pairs or phosphor and quencher pairs as interacting label pairs are the most preferred probes. is there. In in situ or in vivo assays and screening, the contacting step involves adding the probe (etc.) used and other factors as necessary to the sample containing the tissue or cell to be tested, or the cell Including the introduction. Examples of the other factors include a candidate compound, a receptor factor, a reaction inducing factor, a destabilizing factor, a vector encoding a receptor factor, and a vector encoding an enzyme that acts as a reaction inducing factor. In an in situ or in vivo assay according to the present invention, the probe and the other factor can be introduced into the cell using known methods. Examples of this introduction method include encapsulating a probe and other factors by encapsulating them with liposomes, or making the cell membrane permeable to the probe and other factors or making it porous. There is a way to introduce. The microinjection method is particularly useful for studying single cells, but is particularly useful for studying as a function of time according to cell growth stage or sensitivity to various stresses and inductive signals.
本発明による前記in situまたはin vivoアッセイは、“生体染色(vital staining)”、すなわち、生きた細胞または組織の特定構成成分を、細胞を殺さずに染色することを含む。このようなアッセイは、特定組織または生きた個体内で、または細胞の集団または混合物内で細胞の類型を確認するか、時には計数するのに使用されることができる。本発明によるin vivoアッセイは、多様な生きた細胞の内部または外部に存在するか、生きた細胞内部の細胞内小器官に存在する特定標的因子の位置を決定するのに特に有用である。本発明によるプローブは、前記標的因子の細胞間または細胞内位置だけでなく、前記標的因子と前記認識要素間の相互作用活性を同時に相互連関した方式で報知することができる。このような特徴は、ラベルされた受容体またはリガンド分子を使用する通常の染色法に比べて特に有利な長所を提供するが、その理由は、誤判定をほとんど生じさせなく、かつ、関心の対象となる前記標的因子についてのより詳細な情報が得られるようにするためである。特に、興味深いin vivoアッセイは、認識要素として標的配列(targeting sequence)を有するプローブを使用するアッセイである(トランジットペプチド(transit peptide)も前記標的配列の例に含まれる。)。標的配列は、様々な細胞類型への細胞間位置移動または多様な細胞内小器官への細胞内位置移動が起こるようにするものとして知られている。このような位置移動(translocation)過程には、特定分子的物質が標的配列に結合したり、時には標的配列の切断のような処理過程が起こるとされている。本発明によるプローブを使用することによって、前記位置移動過程中の標的配列の相互作用だけでなく、細胞の内部または外部での前記プローブと前記標的因子の位置を表示し報知することが可能である。例えば、本発明によって、2対の相異なるFRETラベル対を有する競合的方式の特定プローブを、プローブの立体構造が第1または第2ハイブリダイズした立体構造のいずれかにあるかによって、相異なる検出可能なシグナル(例えば、相異なる波長の蛍光シグナル)を生成しうるように製造することができる。同じ目的のために、他の例において、波長可変型FRETラベル対を持つ非競合的方式の特定プローブが製造されることができる。上述したように、消光体部分が他の蛍光体であれば、好ましくは蛍光体部分よりも長い蛍光波長を有する他の蛍光体であれば、前記プローブから発生する蛍光の波長が前記プローブの立体構造によって変わることができる。このような波長可変型プローブの使用は、細胞内における前記プローブの位置と標的因子とプローブ認識要素との相互作用を独立してモニタすることを可能にする。 Said in situ or in vivo assay according to the present invention comprises "vital staining", i.e. staining certain components of living cells or tissues without killing the cells. Such assays can be used to confirm or sometimes count cell types within a particular tissue or living individual, or within a population or mixture of cells. In vivo assays according to the present invention are particularly useful for determining the location of specific target factors that are present inside or outside a variety of living cells, or are present in intracellular organelles inside living cells. The probe according to the present invention can report not only the intercellular or intracellular position of the target factor, but also the interaction activity between the target factor and the recognition element in a simultaneously interrelated manner. Such a feature offers particularly advantageous advantages over conventional staining methods using labeled receptor or ligand molecules, because it causes little misjudgment and is of interest. This is because more detailed information about the target factor can be obtained. In particular, an in vivo assay of interest is an assay that uses a probe with a targeting sequence as a recognition element (transit peptides are also included in the examples of target sequences). Target sequences are known to allow intercellular relocation to various cell types or intracellular relocation to various intracellular organelles. In such a translocation process, it is said that a specific molecular substance binds to the target sequence, and sometimes a process such as cleavage of the target sequence occurs. By using the probe according to the present invention, it is possible to display and notify not only the interaction of the target sequence during the position transfer process but also the position of the probe and the target factor inside or outside the cell. . For example, according to the present invention, competitive specific probes having two different pairs of FRET labels can be detected differently depending on whether the probe conformation is in the first or second hybridized conformation. It can be manufactured so as to be able to generate possible signals (eg, fluorescence signals of different wavelengths). For the same purpose, in another example, a non-competitive specific probe with a tunable FRET label pair can be manufactured. As described above, if the quencher portion is another phosphor, preferably the other fluorescent material having a longer fluorescence wavelength than the phosphor portion, the wavelength of the fluorescence generated from the probe is three-dimensional. It can vary depending on the structure. Use of such a tunable probe makes it possible to independently monitor the position of the probe in the cell and the interaction between the target factor and the probe recognition element.
本発明によるプローブは、多様な高速アッセイ及び高速スクリーニングで使用するのに非常に適している。例えば、本発明のプローブは、Caliper Technologies Corp.とAgilent Technologies Inc.で作製するものを含むマイクロフルイディクスラブオンチップ(microfluidic Lab-on-a-chips)に使用するのに適している。このようなラブオンチップ装置は、典型的に電気泳動的分離と光学的(吸収または放射)検出可能に製作されている。これは、Kennedy,C.B. U.S.Pat No.5,885,470;Parce,J.W.et al. U.S.Pat.No.5,885,470;及び、Parce,J.W.et al. U.S.Pat.No.5,942,443を参照されたい。したがって、非相互作用性または相互作用性のラベルとして光を発生したり吸収するラベルを有する本発明のプローブは、標的因子の存在または非存在を報知したり表示する当該の装置と共に最も好ましく使用されることができる。本発明のプローブに具現されている標的因子とプローブとの相互作用による立体構造的変化は、通常、電気泳動的性質の変化につながるが、これは、光を発生したり吸収するラベルを検出手段としてラブオンチップで容易に検出可能である。 The probes according to the invention are very suitable for use in a variety of fast assays and fast screens. For example, the probes of the present invention are suitable for use in microfluidic Lab-on-a-chips, including those made by Caliper Technologies Corp. and Agilent Technologies Inc. Such lab-on-chip devices are typically fabricated for electrophoretic separation and optical (absorption or emission) detection. This is Kennedy, CBUSPat No. 5,885,470; Parce, JWet al. USPat. No. 5,885,470; and Parce, JWet al. USPat. No. 5,942,443. Please refer to. Therefore, the probe of the present invention having a label that generates or absorbs light as a non-interacting or interacting label is most preferably used in conjunction with such a device that reports or displays the presence or absence of a target factor. Can. The three-dimensional structural change due to the interaction between the target factor embodied in the probe of the present invention and the probe usually leads to a change in electrophoretic property, which is a means for detecting a label that generates or absorbs light. Can be easily detected with a lab-on-chip.
高速アッセイと高速スクリーニングにおいて本発明のプローブを用いる他の例には、バイオチップがあるが、これに限定されない。このバイオチップは典型的に固定化したプローブ分子を使用するが、その例には、免疫-検出マイクロチップ(Cohen,C.et al.(1999);Sato,K.et al.(2000)参照)のようなタンパク質チップがある。本発明によるほとんど大部分の類型の固定化したプローブが、このような高速バイオチップ装置とアッセイに使用するのに適している。本発明のプローブは、固定化及び非固定化方式のものともELISA方法を含んだマイクロタイターウェル(microtiter well)基盤のアッセイと高速装置に使用するのに非常に適している。これは、Bosworth,N. and Towers,P.(1989);Pope,A.J.et al.(1999)を参照されたい。 Other examples of using the probes of the invention in fast assays and fast screening include, but are not limited to, biochips. This biochip typically uses immobilized probe molecules, examples of which include immuno-detection microchips (see Cohen, C. et al. (1999); Sato, K. et al. (2000)). There is a protein chip like). Most types of immobilized probes according to the present invention are suitable for use in such high speed biochip devices and assays. The probes of the present invention, both immobilized and non-immobilized, are very suitable for use in microtiter well based assays and high speed devices including ELISA methods. See Bosworth, N. and Towers, P. (1989); Pope, A.J. et al. (1999).
なお、本発明は、上述したアッセイを行うために使用されるキットを提供する。本発明によるキットは、典型的に、本発明による少なくとも一つのプローブと、アッセイを行う上で必要な説明書とを含む。これらアッセイは、少なくとも一つの標的因子または標的リガンドを検出するか、あるいは、少なくとも一つの標的因子と認識要素との相互作用を阻害したり増強する阻害剤または増強剤を検出することでありうる。当該キットは、塩、緩衝溶液、ヌクレアーゼ(nuclease)阻害剤、酵素の基質または酵素が連結されたラベル(enzyme-coupled label)、受容体因子、反応誘発因子、受容体因子をコードするベクトル、反応誘発因子として作用する酵素をコードするベクトル、及び連結試薬からなる群より選ばれる一つまたはそれ以上の試薬を含むことができる。本発明によるin situまたはin vivoアッセイとスクリーニングにおいて、当該キットは、プローブと他の因子を細胞内に導入するのに必要な構成成分を含むことができるが、この細胞内に導入するのに必要な構成成分は透過誘導因子(permeabilizing agent)またはリポソーム前駆体(liposome precursor)から選ばれる。 In addition, this invention provides the kit used in order to perform the assay mentioned above. A kit according to the present invention typically comprises at least one probe according to the present invention and instructions necessary to perform the assay. These assays can be to detect at least one target factor or target ligand, or to detect an inhibitor or enhancer that inhibits or enhances the interaction of at least one target factor with a recognition element. The kit includes salts, buffer solutions, nuclease inhibitors, enzyme substrates or enzyme-coupled labels, receptor factors, inducers, vectors encoding receptor factors, reactions One or more reagents selected from the group consisting of a vector encoding an enzyme that acts as an inducer and a linking reagent may be included. In the in situ or in vivo assay and screening according to the present invention, the kit may contain the components necessary to introduce the probe and other factors into the cell, but is necessary for introduction into the cell. Such components are selected from permeabilizing agents or liposome precursors.
本発明による検出キットは、一般に、少なくとも一つの本発明の標的検出システムを含むが、この標的検出システムは、少なくとも一つの本発明によるプローブと一つまたはそれ以上のアッセイを行う上で必要な説明書とを含む。また、キットは、塩、緩衝溶液、ヌクレアーゼ阻害剤、制限酵素(restrictioen ezyme)、及び変性剤(denaturant)のような検出試薬を含むことができる。キットは、陽性対照群試験のための標的物またはモデル標的物と、陰性対照群試験のための標的物がない試料とを含むことができる。
産業廃棄物処分場のような現場で使用するのに適するキットもまた、本発明によって提供される。本発明のこのような例において、当該キットは、多くの場合において、ビーズ(bead)、ウェル(well)、またはディップスティック(dipstick)などの固体支持体に作動可能に連結されたプローブを使用するように作られた標的物検出システムを好ましく含む。
試料内に存在する知られた標的物にハイブリダイズする陽性対照群プローブを含めて複数のプローブが当該キットに含まれても良い。
The detection kit according to the invention generally comprises at least one target detection system according to the invention, which target detection system is necessary for performing one or more assays with at least one probe according to the invention. And the book. The kit can also include detection reagents such as salts, buffer solutions, nuclease inhibitors, restrictioenzymes, and denaturants. The kit can include a target or model target for a positive control group test and a sample without a target for a negative control group test.
Kits suitable for use on site such as an industrial waste disposal site are also provided by the present invention. In such examples of the present invention, the kit often uses a probe operably linked to a solid support such as a bead, well, or dipstick. Preferably including a target detection system made in such a manner.
A plurality of probes may be included in the kit, including a positive control group probe that hybridizes to a known target present in the sample.
本発明による“プリプローブ(pre-probe)”と、これらプリプローブを含むキットは、通常の合成技術を用いて本明細書に記述するほとんど大部分のプローブを作製するのに使用されることができる。典型的に、当該プリプローブは作動可能に連結された時、前述した非競合的または競合的方式の核酸ベースのシグナルトランスデューサーとして作動しうる1または2対の実質的に相補的な核酸配列を含む。大部分の実施形態において、この核酸配列は、適宜の位置に連結された一つまたはそれ以上の連結子として作用する反応基を有するが、この反応基は、認識要素を連結したり、時には検出可能なラベルまたは他の構成成分を連結するのに使用される。一部の実施形態において、当該プリプローブは、少なくとも一つの連結子をさらに含んでも良いが、この連結子の例は、特に切断性プローブ方式で必要な一つまたはそれ以上の切断部位を有する連結子を含む。典型的に、前記連結子は、通常の化学的または生化学的連結方法を用いて共有結合または非共有結合にて、核酸配列に含まれた反応基に連結されうる少なくとも一つの反応基を有する。上述の如く、この反応基の例は、ヒドロキシル(hydroxyl)、カルボキシル(carboxyl)、アミノ(amino)、スルフヒドリル(sulfhydryl)、アルデヒド(aldehyde)、リン酸(phosphate)、アルキルアミノ(alkyl amino)、ヒドロキシルアルキル(hydroxy alkyl)、アルキルリン酸(alkyl phosphate)、及びこれらの類似体を含む。追加的にそして必要に応じて、当該プリプローブは、異なる長さまたは異なる個数の相補的塩基対を有する一連の対象配列または相補配列からなる追加的な核酸配列をさらに含むことができる。この追加的な核酸配列は、認識因子と望む標的因子とが相互作用するのに適する条件に合せるために、プローブの作動条件、特に検出温度を最適化する必要がある場合に特に有用である。前記プリプローブを含む好ましいキットは、このプリプローブを望む親和性または反応性プローブへ変換させるための手段及び説明書を含む。 “Pre-probes” according to the present invention and kits containing these preprobes can be used to make most of the probes described herein using conventional synthetic techniques. it can. Typically, when the preprobe is operably linked, it contains one or two pairs of substantially complementary nucleic acid sequences that can act as a nucleic acid-based signal transducer in the non-competitive or competitive manner described above. Including. In most embodiments, the nucleic acid sequence has a reactive group that acts as one or more linkers linked at the appropriate position, but this reactive group can link a recognition element or sometimes detect it. Used to link possible labels or other components. In some embodiments, the pre-probe may further comprise at least one connector, an example of this connector is one that has one or more cleavage sites, particularly as required for a cleavable probe format. Includes children. Typically, the ligator has at least one reactive group that can be linked to a reactive group contained in the nucleic acid sequence, covalently or non-covalently, using conventional chemical or biochemical linking methods. . As mentioned above, examples of this reactive group are hydroxyl, carboxyl, amino, sulfhydryl, aldehyde, phosphate, alkylamino, hydroxyl. Including alkyl, hydroxy phosphate, and analogs thereof. Additionally and optionally, the preprobe can further comprise an additional nucleic acid sequence consisting of a series of subject or complementary sequences having different lengths or different numbers of complementary base pairs. This additional nucleic acid sequence is particularly useful when it is necessary to optimize the operating conditions of the probe, in particular the detection temperature, in order to match the conditions suitable for the interaction of the recognition factor with the desired target factor. A preferred kit comprising the preprobe comprises means and instructions for converting the preprobe to the desired affinity or reactive probe.
このキットに含まれるプローブは、本発明によって支持体に連結された固定化したプローブであっても良い。好ましい実施形態において、前記キットは、異なる標的因子を有し、同一の支持体のあらかじめ定められた位置に固定化された少なくとも一つの追加的な本発明によるプローブをさらに含むことができる。異なる標的因子を有する複数の固定化したプローブを持つこのような類型のキットは、複数の標的因子に対する高速検出または複数の標的因子に対する阻害剤または増強剤の高速スクリーニングにおいて非常に有用である。さらに他の好ましい実施形態において、固定化したプローブを含む前記キットは、同じ標的因子を有し、同一の支持体のあらかじめ定められた異なる位置に固定化された少なくとも一つの追加的な本発明による固定化したプローブをさらに含むことができる。同一の標的因子を有する複数の固定化したプローブを持つこの類型のキットは、特定標的因子に対する阻害剤または増強剤の高速スクリーニングに非常に有用である。
なお、本願明細書で言及されたあらゆる文献は、参考として本願明細書に組み込まれる。
The probe included in this kit may be an immobilized probe linked to a support according to the present invention. In a preferred embodiment, the kit can further comprise at least one additional probe according to the invention having different target factors and immobilized in a predetermined position on the same support. Such type of kit with multiple immobilized probes with different target factors is very useful in fast detection for multiple target factors or fast screening of inhibitors or enhancers for multiple target factors. In yet another preferred embodiment, said kit comprising immobilized probes is according to at least one additional invention having the same target agent and immobilized at different predetermined locations on the same support. An immobilized probe can be further included. This type of kit with multiple immobilized probes with the same target factor is very useful for rapid screening of inhibitors or enhancers against specific target factors.
It should be noted that all documents mentioned in this specification are incorporated herein by reference.
以下、下記の実施例に挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明の理解を助けるためのもので、本発明の範囲を制限するためのものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to help understanding of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.
実施例:実験材料
実施例1〜10に使用されたオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)は、QIAGEN Operon(CA、USA)とBioneer(大田、韓国)で購入したし、実施例11〜21に使用されたものは、Expedite 8909 DNA合成器(Perceptive Biosystems、MA、USA)を使って合成した。オリゴヌクレオチドの核酸配列は配列リストに示されており、核酸配列に含まれている修飾ヌクレオチドの構造は、図23及び図24に示す。
実施例1〜9において、各オリゴヌクレオチドストック溶液(stock solution)は、TE緩衝溶液(100mM NaCl、10mM Tris、1mM EDTA、pH7.5)に100μM濃度で用意した。検出の結果は、非変性条件(non-denaturing condition)でBio-Rad(CA、USA)で購入した“15% acrylamide TBE Read-gel”を使用して0.5xTBE(45mM Tris-borate、1mM EDTA)緩衝溶液内で電気泳動にて確認した。ストレプトアビジン(streptavidine、SA)とヤギの抗ビオチン抗体(goat anti-biotin antibody、AB)はPierce(IL、USA)で、抗ジゴキシン抗体(anti-digoxin antibody、AD)はSigma-Aldrich(MO、USA)でそれぞれ購入した。ストレプトアビジンとこれら抗体は、STE緩衝溶液または脱イオン水にそれぞれ2.5と2.0mg/mlの濃度で溶解した。
実施例9及び10の固定化したプローブを用意するのに使用されたストレプトアビジンでコーティングされたマイクロウェルプレート(microwell plate)は、Pierceで購入した。実施例10に使用された塩基性ホスファターゼが連結された抗フルオレセイン検出キット(alkaline phosphatase-linked anti-fluorescein detection kit)は、Amersham Biosciences(NJ、USA)で購入した。
Example: Experimental Materials The oligonucleotides used in Examples 1-10 were purchased from QIAGEN Operon (CA, USA) and Bioneer (Ota, Korea) and used in Examples 11-21. Was synthesized using an Expedite 8909 DNA synthesizer (Perceptive Biosystems, MA, USA). The nucleic acid sequence of the oligonucleotide is shown in the sequence list, and the structure of the modified nucleotide contained in the nucleic acid sequence is shown in FIG. 23 and FIG.
In Examples 1 to 9, each oligonucleotide stock solution was prepared in a TE buffer solution (100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) at a concentration of 100 μM. The result of detection was 0.5 x TBE (45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA) using “15% acrylamide TBE Read-gel” purchased from Bio-Rad (CA, USA) under non-denaturing conditions. ) Confirmed by electrophoresis in buffer solution. Streptavidin (SA) and goat anti-biotin antibody (AB) are Pierce (IL, USA), and anti-digoxin antibody (AD) is Sigma-Aldrich (MO, USA). ) Purchased each. Streptavidin and these antibodies were dissolved in STE buffer or deionized water at concentrations of 2.5 and 2.0 mg / ml, respectively.
The microwell plate coated with streptavidin used to prepare the immobilized probes of Examples 9 and 10 was purchased from Pierce. The basic phosphatase-linked anti-fluorescein detection kit used in Example 10 was purchased from Amersham Biosciences (NJ, USA).
実施例11〜21で使用されたオリゴヌクレオチド及びプローブを合成するために使用された修飾ヌクレオチド及びCPG支持物を含むホスホラミダイト単量体(phosphoramidite monomer)は、Glen Research(VA、USA)で購入した。実施例21で使用された試薬と材料は、次のように購入した。MBS(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)はPierce(IL、USA)で、ペプチドはPeptron Co.(大田、韓国)で購入した。セファデックスG-25(Sephadex G-25)はAmersham Bioscience(Uppsala、Sweden)で、PKC(プロテインキナーゼ C、protein kinase C)はCalbiochem(CA、USA)で、抗ホスホスレオニン単一クローン抗体(anti-phosphothreonine monoclonal antibody)とスタウロスポリン(staurosporin)はSigma-Aldrich(MO、USA)で購入した。 The phosphoramidite monomer containing the modified nucleotides used to synthesize the oligonucleotides and probes used in Examples 11-21 and the CPG support was purchased from Glen Research (VA, USA). The reagents and materials used in Example 21 were purchased as follows. MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) was purchased from Pierce (IL, USA) and the peptide was purchased from Peptron Co. (Ota, Korea). Sephadex G-25 is Amersham Bioscience (Uppsala, Sweden), PKC (protein kinase C) is Calbiochem (CA, USA), anti-phosphothreonine monoclonal antibody (anti- Phosphothreonine monoclonal antibody) and staurosporin were purchased from Sigma-Aldrich (MO, USA).
実施例1.ビオチンが連結された二分子プローブを用いたストレプトアビジンの検出のためのアッセイ
受容体因子であるストレプトアビジン(SA)を検出するために、プローブリガンドとしてビオチンを有する二分子親和性プローブが使用された。本実施例に使用された二分子プローブは、第1対象配列とプローブリガンドであるビオチンとを含む対象オリゴヌクレオチドOB1-39B(配列番号:123)と、第1相補配列と蛍光ラベルであるフルオレセイン(fluorescein)とを含む第1相補オリゴヌクレオチドCM1*(配列番号:124)とから構成されている。プローブリガンドは、対象オリゴヌクレオチドの39番目ヌクレオチド(チミジン、thymidine)と共有結合で連結されている(ビオチンが連結されたチミジンの構造は図23Aを参照されたい)。フルオレセインは、第1相補オリゴヌクレオチドの1番目ヌクレオチド(グアノシン、guanosine)にリンカーを介して連結されている(リンカーを有するフルオレセインの構造は図23Bを参照されたい)。
4種類の検出溶液は、表4にまとめた組成に従って用意したし、ストレプトアビジンがプローブリガンドに結合できるように、常温で1時間培養した。その結果を、非変性条件(non-denaturing conditions)で電気泳動にて検出した。図25に示すように、ストレプトアビジンが存在しないときには第1対象オリゴヌクレオチドと第1相補オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズすることで、第1ハイブリダイズした二重鎖が形成される(レーン2のバンドM)。ハイブリダイズしていない第1相補オリゴヌクレオチドに対する極めて弱いバンドが観察されたが(レーン2のバンドL)、これは、ストレプトアビジンが存在しないときに、検出温度を含むアッセイ条件で第1ハイブリダイズした二重鎖が熱力学的に安定しているということを表す。ストレプトアビジンの存在下で、ストレプトアビジンのプローブリガンドへの結合は、第1ハイブリダイズした二重鎖を不安定化させ、第1ハイブリダイズした二重鎖が解離する結果を招く。これは、解離した第1相補オリゴヌクレオチドCM1*に該当する低質量バンドの強度が増加されること(レーン3及び4のバンドL)と、ストレプトアビジンと複合体を形成した第1ハイブリダイズした二重鎖に該当する高質量バンドが現れること(レーン3及び4のバンドH)で証明される。レーン3及び4の高質量領域で観察される多数のバンドは、ストレプトアビジンが4個のビオチン結合部位を有しているためである。
このような類型の二分子プローブにおいて、標的因子の存在は、解離した第1相補配列または第1ハイブリダイズした二重鎖と連合しているラベルの特徴的シグナルを測定することによって検出される。第1ハイブリダイズした二重鎖からのシグナル検出は、実施例9におけるように対象オリゴヌクレオチドが支持体に固定化されている時に特に有用である。実施例1に使用される検出溶液の組成(単位:μl)を表4に示す。
Example 1. Assay for detection of streptavidin using biotin-linked bimolecular probe A bimolecular probe with biotin as the probe ligand was used to detect the receptor factor streptavidin (SA) . The bimolecular probe used in this example includes a target oligonucleotide OB1-39B (SEQ ID NO: 123) containing a first target sequence and biotin which is a probe ligand, a first complementary sequence and a fluorescent label fluorescein ( fluorescein) and a first complementary oligonucleotide CM1 * (SEQ ID NO: 124). The probe ligand is covalently linked to the 39th nucleotide (thymidine) of the target oligonucleotide (see FIG. 23A for the structure of thymidine linked to biotin). Fluorescein is linked to the first nucleotide (guanosine) of the first complementary oligonucleotide via a linker (see FIG. 23B for the structure of fluorescein with a linker).
Four types of detection solutions were prepared according to the compositions summarized in Table 4, and cultured at room temperature for 1 hour so that streptavidin could bind to the probe ligand. The results were detected by electrophoresis under non-denaturing conditions. As shown in FIG. 25, when streptavidin is not present, the first target oligonucleotide and the first complementary oligonucleotide are hybridized to form a first hybridized duplex (band M in lane 2). ). A very weak band for the unhybridized first complementary oligonucleotide was observed (band L in lane 2), which was first hybridized at assay conditions including the detection temperature in the absence of streptavidin. Indicates that the duplex is thermodynamically stable. In the presence of streptavidin, the binding of streptavidin to the probe ligand destabilizes the first hybridized duplex and results in dissociation of the first hybridized duplex. This is because the intensity of the low-mass band corresponding to the dissociated first complementary oligonucleotide CM1 * is increased (band L in
In this type of bimolecular probe, the presence of the target factor is detected by measuring the characteristic signal of the label associated with the dissociated first complementary sequence or first hybridized duplex. Signal detection from the first hybridized duplex is particularly useful when the target oligonucleotide is immobilized on a support as in Example 9. Table 4 shows the composition (unit: μl) of the detection solution used in Example 1.
実施例2.無塩基ヌクレオチド(abasic nucleotide)を有するビオチンが連結された二分子プローブを用いたストレプトアビジンの検出のためのアッセイ
受容体因子であるストレプトアビジン(SA)を検出するために、実施例1で使用されたものと類似な二分子親和性プローブが使用された。本実施例に使用された二分子プローブは、第1対象配列及びプローブリガンドであるビオチンを含む対象オリゴヌクレオチドOB2-39B(配列番号:125)と、第1相補配列及び蛍光ラベルであるフルオレセインを含む第1相補オリゴヌクレオチドCM2*(配列番号:126)とから構成されている。プローブリガンドは、対象オリゴヌクレオチドの39番目無塩基ヌクレオチド(abasic nucleotide)に共有結合で連結されている(ビオチンが連結された無塩基ヌクレオチドの構造は図23Cを参照されたい)。無塩基ヌクレオチドの存在によって、実施例1で使用されたプローブとは違い、第1対象配列と第1相補配列とのハイブリダイゼーションにおいて一つの誤った一致(または、不一致)が存在する。フルオレセインは、第1相補オリゴヌクレオチドの1番目ヌクレオチド(グアノシン、guanosine)に連結されている(リンカーを有するフルオレセインの構造は図23Bを参照されたい)。
Example 2 Assay for detection of streptavidin using a bimolecular probe ligated with biotin having abasic nucleotides. Used in Example 1 to detect the receptor factor streptavidin (SA). Bimolecular affinity probes similar to those used were used. The bimolecular probe used in this example includes a first target sequence and a target oligonucleotide OB2-39B (SEQ ID NO: 125) containing biotin as a probe ligand, a first complementary sequence and a fluorescent label fluorescein. It consists of a first complementary oligonucleotide CM2 * (SEQ ID NO: 126). The probe ligand is covalently linked to the 39th abasic nucleotide of the target oligonucleotide (see FIG. 23C for the structure of the abasic nucleotide linked to biotin). Due to the presence of abasic nucleotides, unlike the probe used in Example 1, there is one false match (or mismatch) in the hybridization of the first target sequence and the first complementary sequence. Fluorescein is linked to the first nucleotide (guanosine) of the first complementary oligonucleotide (see FIG. 23B for the structure of fluorescein with a linker).
実施例1におけると同様に、4種類の検出溶液は表5にまとめた組成に従って用意したし、ストレプトアビジンがプローブリガンドに結合しうるように常温で1時間培養した。
その結果は、電気泳動にて分析した。図26に示すように、ストレプトアビジンが存在しないときには、第1対象オリゴヌクレオチドと第1相補オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズすることで、第1ハイブリダイズした二重鎖が形成される(レーン2のバンドM)。
また、ハイブリダイズしていない第1相補オリゴヌクレオチドが実施例1に比べて高い強度で観測される(レーン2のバンドL)。これは、第1対象配列と第1相補配列間のハイブリダイゼーションに存在する不一致に起因する。ストレプトアビジンの存在下で、ストレプトアビジンのプローブリガンドへの結合は第1ハイブリダイズした二重鎖を不安定化させ、第1ハイブリダイズした二重鎖が解離する結果を招く。これは、解離した第1相補オリゴヌクレオチドCM2*に該当する低質量バンドの強度が増加されること(レーン3及び4のバンドL)と、ストレプトアビジンと複合体を形成した第1ハイブリダイズした二重鎖に該当する高質量バンドが現れること(レーン3及び4のバンドH)で証明される。受容体因子の結合に伴う、解離した第1相補オリゴヌクレオチドの量の変化は、実施例1で使用されたプローブにおいて観察されたものに比べて少なかった。これは、本実施例におけるようにプローブリガンドが無塩基ヌクレオチドに連結された時には、不安定化効果が相対的に弱くなるということを示す。実施例2に使用される検出溶液の組成(単位:μl)を表5に示す。
As in Example 1, four types of detection solutions were prepared according to the composition summarized in Table 5, and incubated at room temperature for 1 hour so that streptavidin could bind to the probe ligand.
The results were analyzed by electrophoresis. As shown in FIG. 26, when streptavidin does not exist, the first target oligonucleotide and the first complementary oligonucleotide hybridize to form a first hybridized duplex (the band in lane 2). M).
In addition, a non-hybridized first complementary oligonucleotide is observed with higher intensity than in Example 1 (Band L in Lane 2). This is due to the mismatch present in the hybridization between the first subject sequence and the first complementary sequence. In the presence of streptavidin, the binding of streptavidin to the probe ligand destabilizes the first hybridized duplex and results in dissociation of the first hybridized duplex. This is because the intensity of the low-mass band corresponding to the dissociated first complementary oligonucleotide CM2 * is increased (band L in
実施例3.蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を有する単分子プローブを用いたストレプトアビジンの検出のためのアッセイ
受容体因子であるストレプトアビジン(SA)を検出するために、ビオチンをプローブリガンドとする2種類の単分子親和性プローブUP1-34B(配列番号:127)とUP2-6B/36B(配列番号:128)が使用された。前記単分子親和性プローブUP1の概略は、図18に示す。UP1は、ビオチンが連結されたチミジン(thymidine)を34番位置に有しており、UP2はビオチンが連結されたチミジン二つを6番と36番の位置に有している(ビオチンが連結されたチミジンの構造は図23Aを参照されたい)。各単分子プローブは、蛍光体のフルオレセインと消光体のDABCYL(4-(4'-dimethylaminophenylazo)benzoic acid)とから構成された相互作用性ラベル対を有しているが、これらはそれぞれ、5'及び3'末端にリンカーを介して共有結合で連結されている。リンカーを有するフルオレセイン及びDABCYLの構造は、それぞれ図23B及び図23Dに示す。UP1とUP2は、受容体因子が存在しないときに、5'と3'末端領域の間でそれぞれ6個及び7個のハイブリダイズした塩基対を有するステム二重鎖(stem duplex)を形成し、ステム-ループ(stem-loop)構造を有するハイブリダイズした立体構造となるように考案された。5'と3'末端領域が、第1対象配列及び第1相補配列として作用する。ステム-ループ構造が形成されると、蛍光体部分が消光体部分と近接して位置するようになり、両ラベル部分間に効果的な相互作用が起こる。したがって、ステム二重鎖が解離し、蛍光体部分が消光体部分から遠くに位置するようになる解離した立体構造に比べて、プローブから生成される蛍光の強度が減少する。ループ領域に相補的なことからループ領域へのハイブリダイゼーションがステム二重鎖を解離させるループ結合オリゴヌクレオチドLB1(配列番号129)を対照群として使用した。
Example 3 FIG. Assay for detection of streptavidin using a unimolecular probe with an interactive label pair consisting of a fluorophore and a quencher To detect streptavidin (SA), a receptor factor, biotin is used as a probe ligand. Two single molecule affinity probes UP1-34B (SEQ ID NO: 127) and UP2-6B / 36B (SEQ ID NO: 128) were used. An outline of the single-molecule affinity probe UP1 is shown in FIG. UP1 has thymidine linked to biotin at position 34, and UP2 has two thymidine linked to biotin at
検出溶液は、表6にまとめた組成に従って用意したし、氷で1時間培養した後、電気泳動にて分析した。図27に示すように、ストレプトアビジンが存在しないときには単分子プローブの大きさに該当する位置で弱い蛍光が観察された(UP1はレーン1のバンドL、UP2はレーン5のバンドL)。これは、両プローブともステム-ループ構造を形成し、消光体が近づいて蛍光体を效果的に消光させたことを示す。ストレプトアビジンの存在下において高質量領域で強い蛍光が検出されたが(UP1はレーン2及び3のバンドH、UP2はレーン6及び7のバンドH)、これは、ストレプトアビジンがプローブリガンドに結合してステム二重鎖の解離を招くということを示す。上記の実施例におけるように、高質量領域で見出される複数のバンドは、ストレプトアビジンに多数の結合部位が存在するためである。受容体因子の結合に伴う不安定化効果によるステム二重鎖の解離は、増加された蛍光により証明される。受容体因子の結合によってステム二重鎖が解離し、前記単分子プローブが、蛍光体が消光体から遠く離れて位置する解離した立体構造を有するようになり、これにより、増加された蛍光が放出される。レーン4及び8は、ループ結合オリゴヌクレオチドLB1を単分子プローブと混合した時に得られた結果である。LB1が前記単分子プローブのループ領域と結合することで、解離した立体構造を有する単分子プローブが形成される。ストレプトアビジンの存在下で観察された蛍光強度の増加が、ループ結合オリゴヌクレオチドの存在下で得られた結果と似ているという事実は、ストレプトアビジンが前記単分子プローブのステム二重鎖を強く不安定化させたということを意味する。
本実施例で得られた結果は、蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を使用する時、電気泳動分離過程無しで単に蛍光の強度を測定するだけで受容体因子の存在を検出できるということを示唆する。したがって、本実施例は、本発明による少なくとも一つの相互作用性ラベル対を有するプローブが、標的因子を検出するための均一及び不均一アッセイに使用されることができるということを例証する。実施例3に使用される検出溶液の組成(単位:μl)を表6に示す。
The detection solution was prepared according to the composition summarized in Table 6, incubated for 1 hour on ice, and then analyzed by electrophoresis. As shown in FIG. 27, when streptavidin was not present, weak fluorescence was observed at a position corresponding to the size of the single-molecule probe (UP1 was band L in
The results obtained in this example show that when an interactive label pair consisting of a phosphor and a quencher is used, the presence of a receptor factor can be detected by simply measuring the intensity of the fluorescence without the electrophoretic separation process. Suggest that you can. Thus, this example illustrates that a probe having at least one interactive label pair according to the present invention can be used in homogeneous and heterogeneous assays for detecting a target agent. Table 6 shows the composition (unit: μl) of the detection solution used in Example 3.
実施例4.第1対象配列に接合されたプローブリガンドを有する三分子プローブを使用したストレプトアビジンの検出のためのアッセイ
第1対象配列に接合されたプローブリガンド(ビオチン)を有する三分子親和性プローブが、受容体因子であるストレプトアビジンを検出するために使用された。本実施例に使用された三分子プローブの概略は、図13に示す。この三分子プローブは第1及び第2対象配列と第1対象配列に接合されたプローブリガンドとを含む第1対象オリゴヌクレオチドOB1-39B(配列番号:123)、第1対象配列に相補的な第1相補オリゴヌクレオチドCM1(配列番号:130)、及び第2対象配列に相補的な第2相補オリゴヌクレオチドCM3*(配列番号:131)から構成されている。プローブリガンドは、第1対象オリゴヌクレオチドの39番目ヌクレオチドであるチミジン(thymidine)に共有結合で連結されている(ビオチンが連結されたチミジンの構造は図23Aを参照されたい)。第2相補オリゴヌクレオチドCM3*は、1番目ヌクレオチドであるシチジン(cytidine)にリンカーを介して共有結合で結合された蛍光ラベル、つまりフルオレセインを有している(リンカーを有するフルオレセインの構造は図23Bを参照されたい)。
Example 4 Assay for detection of streptavidin using a trimolecular probe having a probe ligand conjugated to a first target sequence A trimolecular affinity probe having a probe ligand (biotin) conjugated to a first target sequence is a receptor Used to detect the factor streptavidin. An outline of the trimolecular probe used in this example is shown in FIG. The trimolecular probe includes a first target oligonucleotide OB1-39B (SEQ ID NO: 123) including a first and second target sequence and a probe ligand conjugated to the first target sequence, and a first complementary sequence to the first target sequence. It consists of 1 complementary oligonucleotide CM1 (SEQ ID NO: 130) and a second complementary oligonucleotide CM3 * (SEQ ID NO: 131) complementary to the second target sequence. The probe ligand is covalently linked to thymidine, the 39th nucleotide of the first target oligonucleotide (see FIG. 23A for the structure of thymidine linked to biotin). The second complementary oligonucleotide CM3 * has a fluorescent label, ie, fluorescein, covalently attached to the first nucleotide cytidine via a linker (the structure of fluorescein having a linker is shown in FIG. 23B). (See)
第1及び第2対象配列が重複領域を共有しているので、このプローブでは二つの相補オリゴヌクレオチドCM1とCM3*が競合的に対象オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。第1対象配列と第1相補配列間の第1ハイブリダイズした二重鎖は、第2対象配列と第2相補配列間の第2ハイブリダイズした二重鎖よりも二つ多い相補的塩基対を有しているので、受容体因子が存在しないときに、第1ハイブリダイズした二重鎖が優先的に形成される。本発明の好ましい実施形態によって第2対象配列でなく第1対象配列にプローブリガンドが連結されたことに注目すべきである。これが、差等不安定化(differential destabilization)を招く。すなわち、受容体因子のプローブリガンドへの結合が、第1ハイブリダイズした二重鎖には強い不安定化を招き、第2ハイブリダイズした二重鎖には弱い不安定化を招いたり不安定化を招かないようにする。 Since the first and second target sequences share an overlapping region, in this probe, two complementary oligonucleotides CM1 and CM3 * hybridize with the target oligonucleotide competitively. The first hybridized duplex between the first target sequence and the first complementary sequence has two more complementary base pairs than the second hybridized duplex between the second target sequence and the second complementary sequence. So that when the receptor factor is not present, the first hybridized duplex is preferentially formed. It should be noted that the probe ligand is linked to the first target sequence rather than the second target sequence according to a preferred embodiment of the present invention. This leads to differential destabilization. That is, the binding of the receptor factor to the probe ligand causes strong destabilization in the first hybridized duplex and weak destabilization or destabilization in the second hybridized duplex. Do not invite.
検出溶液は、表7の組成に従って用意し、常温で1時間培養した後、電気泳動にて分析した。図28に示すように、ストレプトアビジンが存在しないときには、第1相補オリゴヌクレオチドCM1が優先的に対象オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするので、大部分の第2相補オリゴヌクレオチドCM3*がハイブリダイズしていないままで残るようになる(例えば、レーン3及び4のバンドLとレーン1のバンドLを比較すること)。レーン2に示す対照群実験は、バンドMが現れ、レーン3及び4に比べてレーン2のバンドLの強度が減少することから証明される如く、第1相補オリゴヌクレオチドが存在しないときに、第2相補オリゴヌクレオチドが対象オリゴヌクレオチドと效果的にハイブリダイズするということを証明する。図28のレーン5及び6に示すように、ストレプトアビジンの存在下でストレプトアビジンと複合化された第2ハイブリダイズした二重鎖に該当する高質量バンド(バンドH)が現れ、ハイブリダイズしていない第2相補オリゴヌクレオチド(バンドL)の強度は、ストレプトアビジンが存在しないときに比べて格段に減少する。この観察結果は、ストレプトアビジンの結合が、第2ハイブリダイズした二重鎖よりも第1ハイブリダイズした二重鎖をより強く不安定化させるということを意味する。したがって、受容体因子の存在下では、第1相補オリゴヌクレオチドに比べて第2相補オリゴヌクレオチドが対象オリゴヌクレオチドに優先的に結合し、これにより、ストレプトアビジンと複合化された第2ハイブリダイズした二重鎖を多量に形成する結果を招くようになる(レーン5及び6のバンドH)。ハイブリダイズしていない第2相補オリゴヌクレオチド(レーン5及び6のバンドL)に対して観察された大きな量的減少もまた、このような説明と一致する。レーン5及び6のバンドLの強度がレーン2に比べて相対的に高いという事実は、ストレプトアビジンのプローブリガンドへの結合が、第1ハイブリダイズした二重鎖を不安定化させることに比べては弱いが、第2ハイブリダイズした二重鎖を不安定化させるということを示す。
The detection solution was prepared according to the composition shown in Table 7, incubated at room temperature for 1 hour, and then analyzed by electrophoresis. As shown in FIG. 28, in the absence of streptavidin, the first complementary oligonucleotide CM1 preferentially hybridizes with the target oligonucleotide, so that most of the second complementary oligonucleotide CM3 * remains unhybridized . (For example, compare band L in
第1及び第2相補配列のうち少なくとも一つに接合された少なくとも一つの非相互作用性ラベルを有するこのような類型の三分子プローブを用いると、ハイブリダイズした二重鎖またはハイブリダイズしていない配列と連合しているラベルから発生する特徴的シグナルを測定することによって、標的因子の存在を検出することができる。ハイブリダイズした二重鎖から出力されるシグナルを検出することが、実施例9におけるように対象オリゴヌクレオチドが支持体に固定化されている時には特に有用である。
この類型の三分子プローブは、実施例1及び2の二分子プローブに比べて有利な長所を有する。この類型の三分子プローブに内在する差等不安定化効果から、受容体因子の存在または非存在によって第1及び第2相補配列がハイブリダイゼーション過程において差等的に競合するようになる。例えば、本実施例で使用されたプローブでは、受容体因子が存在しないときには第1ハイブリダイズした二重鎖が優先的に形成され、受容体因子が存在するときには第2ハイブリダイズした二重鎖が優先的に形成される。受容体因子が存在するとき、受容体の結合による第1ハイブリダイズした二重鎖の解離は、第2相補配列の優先的ハイブリダイゼーションの助けを受けることができるので、差等不安定化によるこのような差等競合は、実施例1及び2で使用した二分子プローブに比べて増加されたシグナルが現れるようにする。実施例4に使用される検出溶液の組成(単位:μl)を表7に示す。
Using this type of trimolecular probe having at least one non-interactive label joined to at least one of the first and second complementary sequences, hybridized duplex or non-hybridized The presence of the target agent can be detected by measuring the characteristic signal generated from the label associated with the sequence. Detection of a signal output from the hybridized duplex is particularly useful when the target oligonucleotide is immobilized on a support as in Example 9.
This type of trimolecular probe has advantages over the bimolecular probes of Examples 1 and 2. Due to the differential destabilizing effect inherent in this type of trimolecular probe, the first and second complementary sequences compete differently in the hybridization process depending on the presence or absence of the receptor factor. For example, in the probe used in this example, when the receptor factor is not present, the first hybridized duplex is preferentially formed, and when the receptor factor is present, the second hybridized duplex is Preferentially formed. In the presence of receptor factor, the dissociation of the first hybridized duplex by receptor binding can be assisted by preferential hybridization of the second complementary sequence, so this is due to differential destabilization. Such differential competition causes an increased signal to appear as compared to the bimolecular probe used in Examples 1 and 2. Table 7 shows the composition (unit: μl) of the detection solution used in Example 4.
実施例5.第1相補配列に接合されたプローブリガンドを有する三分子プローブを使用したストレプトアビジンの検出のためのアッセイ
受容体因子であるストレプトアビジンを検出するために、第1相補配列に接合されたプローブリガンド(ビオチン)を有する三分子親和性プローブを使用した。この三分子プローブは、第1及び第2対象配列を含む第1対象オリゴヌクレオチドOB1(配列番号:132)、第1対象配列に相補的であり、プローブリガンドを有する第1相補オリゴヌクレオチドCM1-4B(配列番号:133)、及び第2対象配列に相補的な第2相補オリゴヌクレオチドCM3*(配列番号:131)から構成されている。プローブリガンドは、第1相補オリゴヌクレオチドの4番目ヌクレオチドに共有結合で連結されている(ビオチンが連結されたチミジンの構造は図23Aを参照されたい)。第2相補オリゴヌクレオチドは、1番目ヌクレオチドであるシチジン(cytidine)にリンカーを介して共有結合で結合された蛍光ラベルを有している(リンカーを有するフルオレセインの構造は図23Bを参照されたい)。
実施例4で使用されたプローブにおけると同様に、二つの相補オリゴヌクレオチドCM1-4BとCM3*が、対象オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするために競合する。しかし、プローブリガンドが第1相補配列に連結されているので、単に第1ハイブリダイズした二重鎖のみが不安定化効果の影響下にあることになる。受容体の結合による第1ハイブリダイズした二重鎖の不安定化は、第2ハイブリダイズした二重鎖が優先的に形成される結果を招く。
上記の実施例におけると同様に、検出溶液は表8の組成に従って用意し、常温で1時間培養した後、電気泳動にて分析した。図29Aに示すように、ストレプトアビジンが存在しないときには、第1ハイブリダイズした二重鎖が優先的に形成され、大部分の第2相補オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしていないままで残るようになる(レーン3のバンドL参照)。レーン2に示すように、第1相補オリゴヌクレオチドが存在しないときには、第2相補オリゴヌクレオチドが対象オリゴヌクレオチドと效果的にハイブリダイズする(レーン2のバンドM)。ストレプトアビジンの存在下で、第2ハイブリダイズした二重鎖が優先的に形成され(レーン4及び5のバンドM)、ハイブリダイズしていない第2相補配列の強度は減少した。これは、受容体の結合による第1ハイブリダイズした二重鎖の不安定化に起因する。
As in the probe used in Example 4, the two complementary oligonucleotides CM1-4B and CM3 * compete to hybridize with the subject oligonucleotide. However, since the probe ligand is linked to the first complementary sequence, only the first hybridized duplex is under the influence of the destabilizing effect. Destabilization of the first hybridized duplex due to receptor binding results in the preferential formation of the second hybridized duplex.
As in the above examples, detection solutions were prepared according to the composition in Table 8, incubated at room temperature for 1 hour, and then analyzed by electrophoresis. As shown in FIG. 29A, in the absence of streptavidin, the first hybridized duplex is preferentially formed, and the majority of the second complementary oligonucleotides remain unhybridized ( (See band L in lane 3). As shown in
図29Bは、エチジウムブロマイド(ethidium bromide)染色から得られた結果である。
検出可能なラベルが連合していないので、図29Aでは目視できなかった、ストレプトアビジンが存在しない時の第1ハイブリダイズした二重鎖の優先的形成が観察された(レーン3のバンドM)。レーン4及び5のバンドHは、ストレプトアビジンと複合化された第1ハイブリダイズした二重鎖に該当し、これは、図29Aでは目視できなかった。レーン4及び5のバンドMは、第2ハイブリダイズした二重鎖に該当し、これは図29Aでも目視できた。実施例5で使用される検出溶液の組成(単位:μl)を表8に示す。
FIG. 29B shows the results obtained from ethidium bromide staining.
Since no detectable labels were associated, preferential formation of the first hybridized duplex in the absence of streptavidin was observed (band M in lane 3), which was not visible in FIG. 29A. Bands H in
実施例6.第1対象配列及び第1相補配列の両方に接合されたプローブリガンドを有する三分子プローブを使用したストレプトアビジン検出のためのアッセイ
第1対象及び第1相補配列に接合された二つのプローブリガンド(ビオチン)を有する三分子親和性プローブが、受容体因子であるストレプトアビジンを検出するために使用された。この三分子プローブは、第1及び第2対象配列とプローブリガンドを含む第1対象オリゴヌクレオチドOB1-39B(配列番号:123)、第1対象配列に相補的な第1相補オリゴヌクレオチドCM1-4B(配列番号:133)、及び第2対象配列に相補的な第2相補オリゴヌクレオチドCM3*(配列番号:131)から構成されている。プローブリガンドのうち一つは、第1対象オリゴヌクレオチドの39番目ヌクレオチドであるチミジン(thymidine)に、残り一つは第1相補オリゴヌクレオチドの4番目ヌクレオチドであるチミジンに共有結合でそれぞれ連結されている(ビオチンが連結されたチミジンの構造は図23Aを参照されたい)。第2相補オリゴヌクレオチドは、1番目ヌクレオチドであるシチジン(cytidine)にリンカーを介して共有結合で結合された蛍光ラベル、つまりフルオレセインを有している(リンカーを有するフルオレセインの構造は図23Bを参照されたい)。
Example 6 Assay for streptavidin detection using a trimolecular probe having a probe ligand conjugated to both a first subject sequence and a first complementary sequence. Two probe ligands (biotin conjugated to a first subject and a first complementary sequence). ) Was used to detect the receptor factor streptavidin. The trimolecular probe includes a first target oligonucleotide OB1-39B (SEQ ID NO: 123) including a first and second target sequence and a probe ligand, and a first complementary oligonucleotide CM1-4B (complementary to the first target sequence). SEQ ID NO: 133) and a second complementary oligonucleotide CM3 * (SEQ ID NO: 131) complementary to the second target sequence. One of the probe ligands is covalently linked to thymidine, the 39th nucleotide of the first target oligonucleotide, and the other is covalently linked to thymidine, the fourth nucleotide of the first complementary oligonucleotide. (See FIG. 23A for the structure of thymidine linked to biotin). The second complementary oligonucleotide has a fluorescent label, ie, fluorescein, covalently attached to the first nucleotide, cytidine via a linker (see FIG. 23B for the structure of fluorescein with a linker). Wanna).
上記の実施例と同様に、検出溶液は表9の組成に従って用意し、常温で1時間培養した後、電気泳動にて分析した。図30に示すように、ストレプトアビジンが存在しないときには、第1ハイブリダイズした二重鎖が優先的に形成され、大部分の第2相補オリゴヌクレオチドはハイブリダイズしていないままで残るようになる(レーン2及び3のバンドL参照)。レーン1のバンドMに示すように、第1相補オリゴヌクレオチドが存在しないときには第2相補オリゴヌクレオチドが效果的にハイブリダイズする。ストレプトアビジン存在下では、第2ハイブリダイズした二重鎖が優先的に形成され(レーン4〜6のバンドH)、ハイブリダイズしていない第2相補オリゴヌクレオチドの強度は減少する(レーン4〜6のバンドL)。これは、受容体の結合によって第1ハイブリダイズした二重鎖が不安定化するためである。実施例5とは違い、ストレプトアビジンが対象配列に結合されていることから、ストレプトアビジンが存在するときに、第2ハイブリダイズした二重鎖が高質量領域で見出されたことに注目すべきである。実施例6で使用される検出溶液の組成(単位:μl)を表9に示す。
As in the above examples, detection solutions were prepared according to the composition shown in Table 9, incubated at room temperature for 1 hour, and then analyzed by electrophoresis. As shown in FIG. 30, in the absence of streptavidin, the first hybridized duplex is preferentially formed and the majority of the second complementary oligonucleotides remain unhybridized ( (See band L in
実施例7.第1対象配列の無塩基ヌクレオチド(abasic nucleotide)に連結されたプローブリガンドを有する三分子プローブを使用したストレプトアビジンの検出のためのアッセイ
プローブリガンドが無塩基ヌクレオチドに共有結合で連結された以外は、本実施例に使用されたプローブは、実施例4に使用されたプローブと同様である。本実施例に使用されたプローブは、第1及び第2対象配列と第1対象配列に接合されたプローブリガンドとを含む対象オリゴヌクレオチドOB2-39B(配列番号:125)、第1対象配列に相補的な第1相補オリゴヌクレオチドCM1(配列番号:130)、及び第2対象配列に相補的な第2相補オリゴヌクレオチドCM3*(配列番号:131)から構成されている。プローブリガンドは、対象オリゴヌクレオチドの39番目無塩基ヌクレオチドに共有結合で連結されている(ビオチンが連結された無塩基ヌクレオチドの構造は図23Cを参照されたい)。第2相補オリゴヌクレオチドは、1番目ヌクレオチドであるシチジン(cytidine)にリンカーを介して共有結合で連結された蛍光ラベル、つまりフルオレセインを有している(リンカーを有するフルオレセインの構造は図23Bを参照されたい)。
Example 7 Assay for detection of streptavidin using a trimolecular probe having a probe ligand linked to an abasic nucleotide of the first target sequence, except that the probe ligand is covalently linked to an abasic nucleotide, The probe used in this example is the same as the probe used in Example 4. The probe used in this example is a target oligonucleotide OB2-39B (SEQ ID NO: 125) containing a first and second target sequence and a probe ligand joined to the first target sequence, complementary to the first target sequence. First complementary oligonucleotide CM1 (SEQ ID NO: 130) and a second complementary oligonucleotide CM3 * (SEQ ID NO: 131) complementary to the second target sequence. The probe ligand is covalently linked to the 39th abasic nucleotide of the target oligonucleotide (see FIG. 23C for the structure of the abasic nucleotide to which biotin is linked). The second complementary oligonucleotide has a fluorescent label, ie, fluorescein, covalently linked via a linker to the first nucleotide, cytidine (see FIG. 23B for the structure of fluorescein with a linker). Wanna).
検出溶液は、表10の組成に従って用意し、常温で1時間培養した後、電気泳動にて分析した。図31に示すように、その結果は、実施例4と略同一である。レーン3及び4に示すように、ストレプトアビジンが存在しないときには、第1相補オリゴヌクレオチドCM2が優先的にハイブリダイズし、大部分の第2相補オリゴヌクレオチドCM3*はハイブリダイズしていないままで残るようになる。第1相補オリゴヌクレオチドが存在しないときに、レーン2のバンドMで観察されたように、第2相補オリゴヌクレオチドが效果的にハイブリダイズする。ストレプトアビジンの存在下で、ストレプトアビジンと複合化された第2ハイブリダイズした二重鎖に該当する高質量バンド(バンドH)が現れ、ハイブリダイズしていない第2相補オリゴヌクレオチドの強度(バンドL)は減少した。したがって、第2ハイブリダイズした二重鎖またはハイブリダイズしていない第2相補オリゴヌクレオチドと連合している特徴的シグナルを測定することによって、受容体因子の存在を検出することができる。実施例7に使用される検出溶液の組成(単位:μl)を表10に示す。
The detection solution was prepared according to the composition shown in Table 10, cultured at room temperature for 1 hour, and then analyzed by electrophoresis. As shown in FIG. 31, the result is substantially the same as that of Example 4. As shown in
実施例8.三分子プローブを用いた抗体の検出のためのアッセイ
本実施例で使用された2種類の三分子プローブは、実施例4及び7で使用されたプローブを使用したが、受容体因子は、ヤギの抗ビオチン抗体(goat anti-biotin antibody、AB)が選択された。実施例4に使用された1番目のプローブは対象オリゴヌクレオチドOB1-39B(配列番号:123)、第1相補配列CM1(配列番号:130)、及び第2相補配列CM3*(配列番号:131)から構成されている。実施例7に使用された2番目のプローブは、対象オリゴヌクレオチドOB2-39B(配列番号:125)、第1相補配列CM2(配列番号:134)及び第2相補配列CM3*(配列番号:131)から構成されている。
Example 8 FIG. Assay for detection of antibodies using a trimolecular probe The two trimolecular probes used in this example used the probes used in Examples 4 and 7, but the receptor factor was goat An anti-biotin antibody (AB) was selected. The first probe used in Example 4 is the target oligonucleotide OB1-39B (SEQ ID NO: 123), the first complementary sequence CM1 (SEQ ID NO: 130), and the second complementary sequence CM3 * (SEQ ID NO: 131). It is composed of The second probe used in Example 7 is the target oligonucleotide OB2-39B (SEQ ID NO: 125), the first complementary sequence CM2 (SEQ ID NO: 134) and the second complementary sequence CM3 * (SEQ ID NO: 131). It is composed of
上記の実施例と同様に、検出溶液は、表11の組成に従って用意し、常温で1時間培養した後、電気泳動にて分析した。図32に示すように、前記2種類のプローブのいずれにも受容体因子が存在しないときに、第1相補オリゴヌクレオチドが対象オリゴヌクレオチドと優先的にハイブリダイズする。したがって、レーン1及び4に現れたように、大部分の第2相補オリゴヌクレオチドはハイブリダイズしていないままで残るようになり(バンドL)、極少量の第2ハイブリダイズした二重鎖(バンドM)が形成される。受容体因子の存在下において受容体因子の結合が、第1ハイブリダイズした二重鎖を不安定化させ、これにより、第2ハイブリダイズした二重鎖が優先的に形成される。この現象が、1番目のプローブではレーン2及び3で、2番目のプローブではレーン6及び7で観察される。高質量バンド(バンドH)は、抗ビオチン抗体と複合化された第2ハイブリダイズした二重鎖に該当する。ハイブリダイズしていない第2相補オリゴヌクレオチドの量的減少(バンドL)が、上記の実施例に比べて明確でないが、これは、抗ビオチン抗体の不安定化効果がストレプトアビジンに比べて弱いということを示す。レーン5は、蛍光ラベルを有する第1相補オリゴヌクレオチドCM2*(配列番号:126)を有する二分子プローブを使用した対照群実験結果である。この二分子プローブを使用した対照群実験において高質量バンド(バンドH)は、抗ビオチン抗体と複合化された第1ハイブリダイズした二重鎖に該当する。バンドM及びLは、第1ハイブリダイズした二重鎖とハイブリダイズしていない第1相補オリゴヌクレオチドにそれぞれ該当する。実施例8に使用される検出溶液の組成(単位:μl)を表11に示す。
Similar to the above examples, detection solutions were prepared according to the composition shown in Table 11, incubated at room temperature for 1 hour, and then analyzed by electrophoresis. As shown in FIG. 32, when no receptor factor is present in any of the two types of probes, the first complementary oligonucleotide preferentially hybridizes with the target oligonucleotide. Thus, as appears in
実施例9.第1相補配列に接合されたプローブリガンドを有する固定化した三分子プローブを使用したストレプトアビジンの検出のためのアッセイ
第1相補配列に連結されたプローブリガンド(ビオチン)を有する2種類の固定化した三分子親和性プローブが、ストレプトアビジンを検出するために使用された。使用された三分子プローブのうち一つの概略を、図15に示す。1番目のプローブは、第1及び第2対象配列を含む対象オリゴヌクレオチドOB1-1B(配列番号:135)、プローブリガンドを有する第1相補配列CM2-4B(配列番号:136)、及び第2相補配列CM3*(配列番号:131)から構成されている。2番目のプローブは、対象オリゴヌクレオチドOB1-1B(配列番号:135)、プローブリガンドを有する第1相補配列CM1-4B(配列番号:133)、及び第2相補配列CM3*(配列番号:131)から構成されている。対象オリゴヌクレオチドOB1-1Bには、対象配列を固定化させるために、1番目ヌクレオチドであるアデノシン(adenosine)の5'末端にビオチンが共有結合で連結されている(ビオチンが連結された無塩基ヌクレオチドの構造は図23Eを参照されたい)。第2相補オリゴヌクレオチドCM3*は、5'末端に蛍光ラベルとしてフルオレセインを持つ。
Example 9 Assay for detection of streptavidin using an immobilized trimolecular probe having a probe ligand conjugated to a first complementary sequence. Two types of immobilized having a probe ligand (biotin) linked to the first complementary sequence. A trimolecular affinity probe was used to detect streptavidin. An outline of one of the trimolecular probes used is shown in FIG. The first probe consists of a target oligonucleotide OB1-1B (SEQ ID NO: 135) containing first and second target sequences, a first complementary sequence CM2-4B (SEQ ID NO: 136) with a probe ligand, and a second complement It is composed of the array CM3 * (SEQ ID NO: 131). The second probe consists of the target oligonucleotide OB1-1B (SEQ ID NO: 135), the first complementary sequence CM1-4B (SEQ ID NO: 133) having a probe ligand, and the second complementary sequence CM3 * (SEQ ID NO: 131). It is composed of In the target oligonucleotide OB1-1B, biotin is covalently linked to the 5 ′ end of the first nucleotide, adenosine, in order to immobilize the target sequence (abasic nucleotide to which biotin is linked). (See FIG. 23E for the structure). The second complementary oligonucleotide CM3 * has fluorescein as a fluorescent label at the 5 ′ end.
5'末端にビオチン残基を有する対象オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロウェルプレート(microwell plate)に固定化された。固定化のために90μlのSTE緩衝溶液と10μlの対象オリゴヌクレオチド溶液(1μM)を各ウェルに入れて常温で30分間振ってから150μlのSTE緩衝溶液で2回洗浄した。しかる後に、他の試薬は、表12に示す組成に従って各ウェルに添加された。常温で30分間培養した後、結合していない種を除去するために各ウェルを150μlのSTE緩衝溶液で2回洗浄し、その後、ハイブリダイズした第2相補オリゴヌクレオチドCM3*を溶液相に流離させるために、0.2N NaOH溶液100μlを添加した。その後、マイクロウェルプレートリーダ(GENios、TECAN、USA)を使って各ウェルの第2相補オリゴヌクレオチドCM3*から放出される蛍光を測定した。 The target oligonucleotide having a biotin residue at the 5 ′ end was immobilized on a microwell plate coated with streptavidin. For immobilization, 90 μl of STE buffer solution and 10 μl of the target oligonucleotide solution (1 μM) were placed in each well, shaken at room temperature for 30 minutes, and then washed twice with 150 μl of STE buffer solution. Thereafter, other reagents were added to each well according to the composition shown in Table 12. After incubation at room temperature for 30 minutes, each well is washed twice with 150 μl STE buffer to remove unbound species, and then the hybridized second complementary oligonucleotide CM3 * is allowed to flow away into the solution phase. For this purpose, 100 μl of 0.2N NaOH solution was added. Thereafter, the fluorescence emitted from the second complementary oligonucleotide CM3 * in each well was measured using a microwell plate reader (GENios, TECAN, USA).
この結果を、図33に示す。図33に示す蛍光の強度は、各プローブごとに受容体因子の非存在時に観察される強度を基準として標準化した。図33に示すように、ストレプトアビジンを添加することによって蛍光の強度が増加した。例えば、1番目のプローブ(アッセイ番号1〜4)では、ストレプトアビジンの添加量によって1.5倍乃至1.9倍程度に蛍光の強度が増加した。2番目のプローブ(アッセイ番号5〜8)では、ストレプトアビジン添加によって蛍光の強度が2倍乃至3.5倍に増加した。観察された蛍光の増加は、受容体因子のプローブリガンドへの結合が第1ハイブリダイズした二重鎖を不安定化させ、結果として蛍光ラベルを有する第2相補オリゴヌクレオチドが固定化された対象オリゴヌクレオチドと優先的にハイブリダイズしたということを示す。実施例9に使用される検出溶液の組成(単位:μl)を表12に示す。
The result is shown in FIG. The fluorescence intensity shown in FIG. 33 was standardized based on the intensity observed in the absence of the receptor factor for each probe. As shown in FIG. 33, the intensity of fluorescence increased by adding streptavidin. For example, in the first probe (
実施例10.ELISA用ラベルを有する固定化した三分子プローブを使用した抗体の検出のためのアッセイ
ジゴキシゲニン(digoxigenin)をプローブリガンドとする固定化した三分子プローブが、抗ジゴキシン抗体(anti-digoxin antibody、AD)検出のために使用された。このプローブは、第1及び第2対象配列とプローブリガンドであるジゴキシゲニンとを含む対象オリゴヌクレオチドOB1-1B/39D(配列番号:137)、第1相補配列CM2(配列番号:134)、及び第2相補配列CM3*(配列番号:131)から構成されている。対象オリゴヌクレオチドOB1-1B/39Dは、39番目無塩基ヌクレオチドに共有結合で連結されたジゴキシゲニン(ジゴキシゲニンに連結された無塩基ヌクレオチドの構造は図23Fを参照されたい)と、5'末端に共有結合で連結されたビオチンとを有している。第2相補オリゴヌクレオチドCM3*は、5'末端に蛍光ラベルとしてフルオレセインを有している。
Example 10 Assay for detection of antibody using immobilized trimolecular probe with ELISA label Immobilized trimolecular probe with digoxigenin as probe ligand detects anti-digoxin antibody (AD) Used for. This probe is composed of a target oligonucleotide OB1-1B / 39D (SEQ ID NO: 137), a first complementary sequence CM2 (SEQ ID NO: 134), a second target sequence and a probe ligand digoxigenin. It is composed of the complementary sequence CM3 * (SEQ ID NO: 131). The target oligonucleotide OB1-1B / 39D is covalently linked to digoxigenin covalently linked to the 39th abasic nucleotide (see FIG. 23F for the structure of the abasic nucleotide linked to digoxigenin) and the 5 ′ end. And biotin linked by The second complementary oligonucleotide CM3 * has fluorescein as a fluorescent label at the 5 ′ end.
対象オリゴヌクレオチドは、5'末端のビオチン残基を用いて、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロウェルプレートに固定化された。固定化過程は実施例9におけると同様である。その後、他の試薬が、表13に示す組成に従って添加された。常温で1時間培養した後、非結合の種を除去するために各ウェルを150μlのSTE緩衝溶液で2回洗浄し、固定化した対象オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第2相補オリゴヌクレオチドCM3*の量を測定するためにELISAアッセイを行った。Amersham Biosciencesで購入した塩基性ホスファターゼ連結抗フルオレセイン検出キット(alkaline phosphatase-linked anti-fluorescein detection kit)を使って、第2相補オリゴヌクレオチドに結合されたフルオレセインを検出した。 The oligonucleotide of interest was immobilized on a microwell plate coated with streptavidin using a biotin residue at the 5 ′ end. The immobilization process is the same as in Example 9. Thereafter, other reagents were added according to the composition shown in Table 13. After incubation for 1 hour at room temperature, each well was washed twice with 150 μl of STE buffer solution to remove unbound species, and the amount of the second complementary oligonucleotide CM3 * hybridized to the immobilized target oligonucleotide An ELISA assay was performed to measure Fluorescein bound to the second complementary oligonucleotide was detected using a basic phosphatase-linked anti-fluorescein detection kit purchased from Amersham Biosciences.
図34Aは、ELISA増幅後に撮ったマイクロウェルプレートの写真である。マイクロウェル周辺部で観察される黄色の出現は、固定化した対象オリゴヌクレオチドに結合されたフルオレセインの存在を表す。各ウェルの黄色の強度は写真映像から計算されたし、その結果を、図34Bに示す。対象オリゴヌクレオチドが固定化していない時(アッセイ番号1)、ELISAシグナルがゼロに留まった。ラベルされた第2相補オリゴヌクレオチドのみを、固定化した対象オリゴヌクレオチドに添加した時(アッセイ番号2)、ELISAシグナルは格段に増加し、可能な最高シグナルを示した。アッセイ番号3は、受容体因子(ジゴキシゲニン)が存在しない時の前記三分子プローブにおいて観察されたELISAシグナルが、アッセイ番号2で観察されたものに比べて30%程度になるということを示す。このような観察結果は、受容体因子が存在しないときに、第1相補オリゴヌクレオチドが優先的にハイブリダイズし、検出可能なラベルを有する第2相補オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが低い水準に落ちる結果を招くということを示す。受容体因子を添加することによって、アッセイ番号4及び5のようにELISAシグナルが2倍以上増加したが、これは、受容体因子のプローブリガンドへの結合により、第1ハイブリダイズした二重鎖が第2ハイブリダイズした二重鎖に比べてより不安定化することを意味する。実施例10に使用される検出溶液の組成(単位:μl)を表13に示す。 FIG. 34A is a photograph of a microwell plate taken after ELISA amplification. The yellow appearance observed around the microwell represents the presence of fluorescein bound to the immobilized target oligonucleotide. The yellow intensity of each well was calculated from the photographic image and the results are shown in FIG. 34B. When the target oligonucleotide was not immobilized (assay number 1), the ELISA signal remained zero. When only the labeled second complementary oligonucleotide was added to the immobilized target oligonucleotide (assay number 2), the ELISA signal increased dramatically, indicating the highest possible signal. Assay No. 3 shows that the ELISA signal observed in the trimolecular probe in the absence of receptor factor (digoxigenin) is about 30% compared to that observed in Assay No. 2. Such observations indicate that in the absence of the receptor factor, the first complementary oligonucleotide preferentially hybridizes, and the second complementary oligonucleotide having a detectable label falls to a low level. Invite to be invited. The addition of the receptor factor increased the ELISA signal more than 2-fold as in Assay Nos. 4 and 5, because the binding of the receptor factor to the probe ligand caused the first hybridized duplex to It means destabilization compared to the second hybridized duplex. Table 13 shows the composition (unit: μl) of the detection solution used in Example 10.
実施例11.蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を有する非競合的単分子プローブの蛍光特性のループ長依存性
図17に示すものと類似する構造を有する6種類の非競合的単分子親和性プローブを合成し、これを、非競合的単分子プローブの蛍光特性のループ長依存性を試験するために使用した。6種の単分子プローブ、つまり、UP3-12B(配列番号:138)、UP4-14B(配列番号:139)、UP5-16B(配列番号:140)、UP6-23B(配列番号:141)、UP7-33B(配列番号:142)、及びUP8-43B(配列番号:143)は、ループ領域に相異なる個数のヌクレオチド、すなわち、それぞれ4,6,8,15,25及び35個のヌクレオチドを有するが、同じ5bpのステム二重鎖配列を有する(すなわち、5'-フルオレセイン-GCAGG-ループ-CCTGC-DABCYL-3'の配列)。全ての前記単分子プローブは、3'末端ステム領域内の同一の位置(すなわち、3'末端から3番目のヌクレオチドであるチミジン)に連結された、標的受容体因子であるストレプトアビジンを検出するためのビオチンをプローブリガンドとして持つ(ビオチンが連結されたチミジンの構造は図23Aを参照されたい)。各単分子プローブは、それぞれ5'と3'末端に共有結合で連結された蛍光体のフルオレセインと消光体のDABCYL(4-(4'-dimethylaminophenylazo)benzoic acid)とから構成された相互作用性ラベル対を有している。
リンカーを有するフルオレセインとDABCYLの構造はそれぞれ、図23B及び23Dに示す。
Example 11 Loop length dependence of fluorescence characteristics of non-competitive unimolecular probes having an interactive label pair consisting of a fluorophore and a quencher Six types of non-competitive unimolecular affinity having structures similar to those shown in FIG. Probes were synthesized and used to test the loop length dependence of the fluorescence properties of non-competitive single molecule probes. Six single-molecule probes, namely UP3-12B (SEQ ID NO: 138), UP4-14B (SEQ ID NO: 139), UP5-16B (SEQ ID NO: 140), UP6-23B (SEQ ID NO: 141), UP7 -33B (SEQ ID NO: 142) and UP8-43B (SEQ ID NO: 143) have different numbers of nucleotides in the loop region,
The structures of fluorescein and DABCYL with a linker are shown in FIGS. 23B and 23D, respectively.
上述した全ての単分子プローブは、受容体因子が存在しないときに、5'と3'末端領域の間に5個のハイブリダイズした塩基対を有するステム二重鎖を形成することによって(ステム二重鎖の融解温度よりも低い温度領域で)、ステム-ループ構造を有するハイブリダイズした立体構造を形成するように考案された。本発明により、前記5'及び3'末端領域が第1対象配列及び第1相補配列として作用する。ステム-ループ構造が形成されると、蛍光体部分が消光体部分に近接して位置するようになり、蛍光体と消光体間に効果的な相互作用が起こる。これにより、ステム二重鎖が解離することで蛍光体部分が消光体部分から遠くに位置するようになる解離した立体構造に比べて、プローブの蛍光の強度が減少する。このような立体構造的変化の概略は、図17に示す。
受容体結合のアッセイを行うために、約50pmolの各単分子プローブを、50mM KCl、2.5mM MgCl2を含むpH8.5の10mM Tris溶液50μlにおいて0、1/8、及び1/4モル当量(mole equivalent)のストレプトアビジン(それぞれ0、6.25、及び12.5pmol)と混合し、96ウェルPCRプレート(Bio-Rad、CA、USA)の各ウェルに入れた。
ストレプトアゾジンは4個のビオチン結合部位を有しているので、ストレプトアビジン1/4モル当量は、使用された単分子プローブ量と対応して1モル当量のストレプトアビジン内にあるビオチン結合部位に該当するということに注目すべきである。その後、検出溶液を60℃で約30分間培養した。各ウェルからの蛍光シグナルの温度依存性は、Bio-Rad(CA、USA)で購入したiCycler iQ実時間PCR装置で溶融温度プロファイルプロトコルを用いて測定した。
All the unimolecular probes described above form stem duplexes with 5 hybridized base pairs between the 5 ′ and 3 ′ end regions in the absence of receptor factor (
To perform the receptor binding assay, about 50 pmol of each unimolecular probe was converted to 0, 1/8, and 1/4 molar equivalents in 50 μl of a 10 mM Tris solution at pH 8.5 containing 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2. (mole equivalent) of streptavidin (0, 6.25, and 12.5 pmol, respectively) and placed in each well of a 96-well PCR plate (Bio-Rad, CA, USA).
Since streptazodin has four biotin binding sites, 1/4 mole equivalent of streptavidin is linked to the biotin binding site in 1 mole equivalent of streptavidin corresponding to the amount of unimolecular probe used. It should be noted that this is true. Thereafter, the detection solution was incubated at 60 ° C. for about 30 minutes. The temperature dependence of the fluorescence signal from each well was measured with an iCycler iQ real-time PCR instrument purchased from Bio-Rad (CA, USA) using a melting temperature profile protocol.
図35A〜35Fはそれぞれ、前記6種類の単分子プローブ、つまり、UP3-12B(配列番号:138)、UP4-14B(配列番号:139)、UP5-16B(配列番号:140)、UP6-23B(配列番号:141)、UP7-33B(配列番号:142)、及びUP8-43B(配列番号:143)の蛍光シグナルの温度依存性を、受容体因子ストレプトアビジンのそれぞれ異なる濃度で示すものである。受容体因子が存在しないとき(図35A〜図35Fにおいて円)、低い温度領域での蛍光シグナルは、背景水準の低い状態に留まるが、これは、前記単分子プローブがステム-ループ立体構造(“ハイブリダイズした立体構造”)に存在するということを示す。しかし、温度の増加によってS字状(sigmoid)の増加を見せるが、これは、高い温度領域で前記単分子プローブが“解離した立体構造”へ立体構造を変化したということを示す。これは、ステム-ループ構造の融解プロファイルの典型的な様子である。 FIGS. 35A to 35F respectively show the six types of single-molecule probes, that is, UP3-12B (SEQ ID NO: 138), UP4-14B (SEQ ID NO: 139), UP5-16B (SEQ ID NO: 140), UP6-23B. (SEQ ID NO: 141), UP7-33B (SEQ ID NO: 142), and UP8-43B (SEQ ID NO: 143) show temperature dependence of fluorescent signals at different concentrations of the receptor factor streptavidin. . When no receptor factor is present (circles in FIGS. 35A-35F), the fluorescence signal in the low temperature region remains at a low background level, indicating that the unimolecular probe has a stem-loop conformation (“ It indicates that it exists in a hybridized three-dimensional structure "). However, an increase in temperature shows a sigmoid increase, which indicates that the single-molecule probe has changed to a “dissociated three-dimensional structure” at a high temperature range. This is typical of the melting profile of the stem-loop structure.
受容体因子を添加することによって、ストレプトアビジン濃度の関数として蛍光シグナルが増加するが、これは、受容体因子(ストレプトアビジン)のプローブリガンド(ビオチン)への結合が、本発明による“核酸ハイブリダイゼーション不安定化力(nucleic acid hybridization destabilization force)”に起因する、ハイブリダイズした立体構造から解離した立体構造への立体構造的転換を誘発するということを示す。これにより、受容体因子が存在するときに蛍光の強度が増加するようになる。ステム二重鎖の融解温度以上の高い温度領域では、受容体因子の濃度に関わらず、類似な蛍光強度が得られるということは注目すべき事実である。これは、高温領域では、熱的溶融により受容体因子の濃度に関わらずに前記単分子プローブが解離した立体構造を有するということを示す。しかし、低温領域では、特にステム二重鎖の融解温度近傍または以下では、蛍光の強度が、受容体因子の濃度が高い時に相当高くなるが、これは、受容体因子のプローブリガンドへの結合による不安定化効果に起因する。 The addition of the receptor factor increases the fluorescence signal as a function of the streptavidin concentration, which indicates that the binding of the receptor factor (streptavidin) to the probe ligand (biotin) is “nucleic acid hybridization according to the present invention. It indicates that a three-dimensional structural change from a hybridized three-dimensional structure to a dissociated three-dimensional structure due to “nucleic acid hybridization destabilization force” is induced. This increases the intensity of fluorescence when the receptor factor is present. It is a remarkable fact that similar fluorescence intensities can be obtained in the high temperature range above the melting temperature of the stem duplex regardless of the concentration of the receptor factor. This indicates that in the high temperature region, the single molecular probe has a dissociated three-dimensional structure due to thermal melting regardless of the receptor factor concentration. However, in the low temperature region, particularly near or below the melting temperature of the stem duplex, the intensity of fluorescence increases considerably when the concentration of the receptor factor is high, which is due to binding of the receptor factor to the probe ligand. Due to the destabilizing effect.
図36は、25℃で測定された蛍光の強度が、1/4モル当量のストレプトアビジンを添加することによって、ストレプトアビジンを添加しない時に比べて相対的に増加することを示している。図36に示す蛍光の強度は、1/4モル当量のストレプトアビジンが存在する時の蛍光の強度を、ストレプトアビジンが存在しない時の蛍光の強度で分けた値である。この値は、このプローブの性能を判断する指標として使用することができる。図36に示すように、試験した全プローブが、受容体因子の添加によって約2倍から5倍に至る大きい蛍光強度の増加を見せた。蛍光強度の相対的増加は、ループ長に依存的なものとして観察されたが、ループ領域のヌクレオチド数が15個である時、つまり、UP6-23B(配列番号:141)の場合に最も大きい値が得られた。この結果は、ループ領域の長さを調節することによって、プローブの性能を最適化できるということを示唆する。
図37は、図35A〜図35Fに示す温度依存曲線の1次微分値から決定された単分子プローブの融解温度を示す。白円は、ストレプトアビジンが存在しない時のプローブの融解温度を示し、黒円は、ストレプトアビジンが1/4当量で存在する時の融解温度を示す。予想の通り、本発明により、受容体因子が添加されることによってプローブの融解温度が約5℃〜20℃低くなる。受容体因子が存在するときに、融解温度が低くなるという観察結果は、受容体因子の結合による核酸ハイブリダイゼーション不安定化効果がプローブの立体構造的転換を誘導するのに充分であるということを立証する。
FIG. 36 shows that the fluorescence intensity measured at 25 ° C. increases relatively with the addition of ¼ molar equivalent of streptavidin compared to when no streptavidin is added. The fluorescence intensity shown in FIG. 36 is a value obtained by dividing the fluorescence intensity when ¼ molar equivalent of streptavidin is present by the fluorescence intensity when streptavidin is not present. This value can be used as an index for judging the performance of this probe. As shown in FIG. 36, all the probes tested showed a large increase in fluorescence intensity ranging from about 2- to 5-fold with the addition of receptor factor. The relative increase in fluorescence intensity was observed as being dependent on the loop length, but the largest value was obtained when the number of nucleotides in the loop region was 15, that is, in the case of UP6-23B (SEQ ID NO: 141). was gotten. This result suggests that the performance of the probe can be optimized by adjusting the length of the loop region.
FIG. 37 shows the melting temperature of the unimolecular probe determined from the first derivative of the temperature dependence curves shown in FIGS. 35A to 35F. White circles indicate the melting temperature of the probe when no streptavidin is present, and black circles indicate the melting temperature when 1/4 equivalent of streptavidin is present. As expected, the present invention lowers the melting temperature of the probe by about 5 ° C. to 20 ° C. by adding the receptor factor. The observation that the melting temperature is lower in the presence of the receptor factor indicates that the nucleic acid hybridization destabilizing effect due to the binding of the receptor factor is sufficient to induce conformational change of the probe. Prove it.
実施例12.蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を有する非競合的単分子プローブの蛍光特性のステム配列依存性
図17に示すものと類似な構造を有する6種類の非競合的単分子親和性プローブを合成し、これを、非競合的単分子プローブの蛍光特性のステム配列依存性を試験するために使用した。6種類の単分子プローブ、つまり、UP6-23B(配列番号:141)、UP9-23B(配列番号:144)、UP10-23B(配列番号:145)、UP11-23B(配列番号:146)、UP12-23B(配列番号:147)、及びUP13-23B(配列番号:148)は、同じループ長(15個のヌクレオチド)と同じステムハイブリダイゼーション長(5bpステム二重鎖)を有するが、それぞれ異なるステム配列を有する。全ての前記単分子プローブは、3'末端ステム領域内の同一の位置(すなわち、3'末端から3番目のヌクレオチドであるチミジン)に連結されたビオチンを、標的受容体因子であるストレプトアビジンを検出するためのプローブリガンドとして有する(ビオチンが連結されたチミジンの構造は図23Aを参照されたい)。各単分子プローブは、それぞれ5'と3'末端にリンカーを介して共有結合で連結された蛍光体のフルオレセインと消光体のDABCYL(4-(4'-dimethylaminophenylazo)benzoic acid)とからなる相互作用性ラベル対を有している。リンカーを有するフルオレセインとDABCYLの構造はそれぞれ、図23B及び図23Dに示す。本実施例で使用された単分子プローブは、実施例3及び11で使用されたものと類似な性質を有するように考案された。
単分子プローブの検出溶液は、50pmolの各単分子プローブと0、1/8、及び1/4モル当量のストレプトアビジンを含むが、実施例11におけると同一の手順によって96ウェルPCRプレートに用意された。実施例11におけると同様に、iCycler iQ実時間PCR装置を使って蛍光シグナルの温度依存性を測定した。
Example 12 FIG. Stem sequence dependence of fluorescence characteristics of non-competitive unimolecular probes having an interactive label pair consisting of a fluorophore and a quencher Six types of non-competitive unimolecular affinities having structures similar to those shown in FIG. Probes were synthesized and used to test the stem sequence dependence of the fluorescence properties of non-competitive single molecule probes. Six types of single-molecule probes, namely UP6-23B (SEQ ID NO: 141), UP9-23B (SEQ ID NO: 144), UP10-23B (SEQ ID NO: 145), UP11-23B (SEQ ID NO: 146), UP12 -23B (SEQ ID NO: 147) and UP13-23B (SEQ ID NO: 148) have the same loop length (15 nucleotides) and the same stem hybridization length (5 bp stem duplex), but different stems Has an array. All the unimolecular probes detect biotin linked to the same position in the 3 ′ terminal stem region (ie, thymidine, the third nucleotide from the 3 ′ terminal), and the target receptor factor, streptavidin. (See FIG. 23A for the structure of thymidine linked to biotin). Each unimolecular probe is composed of a fluorescent fluorescein and a quencher DABCYL (4- (4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid), which are covalently linked to the 5 'and 3' ends via a linker. Has a sex label pair. The structures of fluorescein and DABCYL with a linker are shown in FIGS. 23B and 23D, respectively. The unimolecular probe used in this example was devised to have properties similar to those used in Examples 3 and 11.
The detection solution for the unimolecular probe contains 50 pmol of each unimolecular probe and 0, 1/8, and 1/4 molar equivalent of streptavidin, but was prepared in a 96-well PCR plate by the same procedure as in Example 11. It was. As in Example 11, the temperature dependence of the fluorescence signal was measured using an iCycler iQ real-time PCR instrument.
図38A〜図38Fはそれぞれ、6種類の各単分子プローブ、つまり、UP6-23B(配列番号:141)、UP9-23B(配列番号:144)、UP10-23B(配列番号:145)、UP11-23B(配列番号:146)、UP12-23B(配列番号:147)、及びUP13-23B(配列番号:148)の蛍光シグナルの温度依存性を受容体因子ストレプトアビジンのそれぞれ異なる濃度で示すものである。実施例11で使用された単分子プローブから得られた結果(図35A〜図35F)と同様に、受容体因子が存在しないときに、低い温度領域でのハイブリダイズした立体構造(すなわち、ステム-ループ構造)から高い温度領域での解離した立体構造への溶融転移(melting transition)が、全プローブにおいて観察されたし、受容体因子の添加によって蛍光の強度が受容体因子濃度の関数として相当増加することが観察された。
ストレプトアビジンを添加しなかった時と比べて、1/4モル当量のストレプトアビジンを添加した時の蛍光強度の相対的な増加が25℃で測定されたし、図39に、その結果を示す。図39において、蛍光強度の相対的増加値がステム配列、すなわち第1対象配列及び第1相補配列に強く(約4〜12)依存するということが観察できるが、この結果は、前記プローブのステム配列を調節することによってプローブの性能を最適化できるということを示唆する。
38A to 38F respectively show six types of single-molecule probes, namely, UP6-23B (SEQ ID NO: 141), UP9-23B (SEQ ID NO: 144), UP10-23B (SEQ ID NO: 145), UP11- The temperature dependence of the fluorescence signal of 23B (SEQ ID NO: 146), UP12-23B (SEQ ID NO: 147), and UP13-23B (SEQ ID NO: 148) is shown at different concentrations of the receptor factor streptavidin. . Similar to the results obtained from the unimolecular probe used in Example 11 (FIGS. 35A-35F), in the absence of receptor factor, the hybrid conformation (ie, stem- A melting transition from a (loop structure) to a dissociated conformation in the high temperature region was observed in all probes, and the addition of receptor factor significantly increased fluorescence intensity as a function of receptor factor concentration. To be observed.
The relative increase in fluorescence intensity was measured at 25 ° C. when 1/4 molar equivalent of streptavidin was added compared to when no streptavidin was added, and the results are shown in FIG. In FIG. 39, it can be observed that the relative increase in fluorescence intensity is strongly (approximately 4-12) dependent on the stem sequence, ie, the first subject sequence and the first complementary sequence. It suggests that the performance of the probe can be optimized by adjusting the sequence.
図40は、各ウェルに次のように組成を含むマイクロウェルプレートの蛍光映像の例である:A、B、及びC行に50pmolのUP6-23B(配列番号:141);D、E、及びF行に50pmolのUP10-23B(配列番号:145);1、2、及び3列にそれぞれ0、6.25、及び12.5pmolのストレプトアビジン。上述したように、各組成別に3個ずつ試験された。図40に示すように、受容体因子の量の関数として蛍光の強度が組織的に増加し、この結果は再現可能であることが観察された。
FIG. 40 is an example of a fluorescence image of a microwell plate containing the composition in each well as follows: A, B, and C rows with 50 pmol of UP6-23B (SEQ ID NO: 141); D, E, and 50 pmol UP10-23B (SEQ ID NO: 145) in row F; 0, 6.25, and 12.5 pmol streptavidin in
実施例13.蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を有する非競合的単分子プローブの蛍光特性のステム長依存性
それぞれ4bp及び6bpのステム二重鎖を有する2種類の非競合的単分子プローブUP14-21B(配列番号:149)とUP1-34B(配列番号:127)とを合成し、これを、非競合的単分子プローブの蛍光特性のステム長依存性を試験するために使用した。実施例11及び12に使用された単分子プローブと同様に、UP14-21B(配列番号:149)とUP1-34B(配列番号:127)は、3'末端から3番目のヌクレオチドであるチミジンに連結されたビオチンを有する(ビオチンが連結されたチミジンの構造は図23Aを参照されたい)。各単分子プローブは、それぞれ5'と3'末端に共有結合で連結された蛍光体のフルオレセインと消光体のDABCYL(4-(4'-dimethylaminophenylazo)benzoic acid))とから構成された相互作用性ラベル対を持つ。リンカーを有するフルオレセインとDABCYLの構造はそれぞれ、図23B及び図23Dに示す。
Example 13 Stem length dependence of fluorescence characteristics of a non-competitive single molecule probe having an interactive label pair consisting of a fluorophore and a quencher Two types of non-competitive single molecule probes UP14 each having 4 bp and 6 bp stem duplexes -21B (SEQ ID NO: 149) and UP1-34B (SEQ ID NO: 127) were synthesized and used to test the stem length dependence of the fluorescence properties of non-competitive single molecule probes. Similar to the unimolecular probes used in Examples 11 and 12, UP14-21B (SEQ ID NO: 149) and UP1-34B (SEQ ID NO: 127) were linked to thymidine, the third nucleotide from the 3 ′ end. (See FIG. 23A for the structure of thymidine linked to biotin). Each unimolecular probe is composed of a fluorescent fluorescein covalently linked to the 5 'and 3' ends and a quencher DABCYL (4- (4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid)). Have a label pair. The structures of fluorescein and DABCYL with a linker are shown in FIGS. 23B and 23D, respectively.
同様に、単分子プローブの検出溶液は、50pmolの各単分子プローブと0、1/8、及び1/4モル当量のストレプトアビジンを含むが、実施例11におけると同一の手順によって96ウェルPCRプレートに用意されたし、iCycler iQ実時間PCR装置を使って蛍光シグナルの温度依存性を測定した。
図41A及び図41Bは、前記2種類の単分子プローブそれぞれの蛍光シグナルの温度依存性を、それぞれ異なるストレプトアビジン濃度で示すものである。融解プロファイルと受容体因子であるストレプトアビジンの添加に対する感応特性は、5bpステム二重鎖を有する単分子プローブと一般的に類似するが、ステム長によって(また、ステム配列とループ長によって)融解温度が変化することが観察された(比較のために図38A〜38F参照)。6bpステム二重鎖を有するUP1-34Bプローブが、4bpステム二重鎖を有するUP14-21Bプローブに比べて約20℃高い融解温度を示すことが観察された。4bpのステム二重鎖を有する後者のプローブにおいて蛍光シグナルの相対的増加がより大きく観察された。この結果は、実施例11及び12で試験されたループ長及びステム配列の他に、ステム長(すなわち、第1対象配列及び第1相補配列のハイブリダイゼーション長)も本発明のプローブの性能と作動温度を最適化するのに重要な変数であるということを表す。
Similarly, a single molecule probe detection solution contains 50 pmol of each single molecule probe and 0, 1/8, and 1/4 molar equivalents of streptavidin, but with the same procedure as in Example 11, a 96 well PCR plate. The temperature dependence of the fluorescence signal was measured using an iCycler iQ real-time PCR apparatus.
41A and 41B show the temperature dependence of the fluorescence signals of the two types of single-molecule probes at different streptavidin concentrations. The melting profile and sensitivity characteristics to the addition of the receptor factor streptavidin are generally similar to unimolecular probes with 5 bp stem duplexes, but by stem length (and also by stem sequence and loop length) Was observed (see FIGS. 38A-38F for comparison). It was observed that the UP1-34B probe with a 6 bp stem duplex exhibits a melting temperature about 20 ° C. higher than the UP14-21B probe with a 4 bp stem duplex. A greater increase in the fluorescence signal was observed in the latter probe with a 4 bp stem duplex. As a result, in addition to the loop length and the stem sequence tested in Examples 11 and 12, the stem length (ie, the hybridization length of the first target sequence and the first complementary sequence) also shows the performance and operation of the probe of the present invention. It is an important variable for optimizing temperature.
実施例14.蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を有する非競合的単分子プローブの蛍光特性のループ配列依存性
UP6-23B(配列番号:141)と同じステム配列とループ長を有するが、異なるループ配列を有する非競合的単分子親和性プローブであるUP15-23B(配列番号:150)とUP16-23B(配列番号:151)とを合成し、非競合的単分子プローブの蛍光特性のループ配列依存性を検査するために使用した。実施例11及び12に使用された単分子プローブUP6-23B(配列番号:141)と同様に、これら2つのプローブもまた、同一の位置、つまり3'末端から3番目のヌクレオチドであるチミジンに連結されビオチンを有し、5'と3'末端にそれぞれ共有結合で連結されたフルオレセインとDABCYLとからなる相互作用性ラベル対を持つ。これら2つのプローブのループ配列は、各プローブが5'末端領域とループ領域との間に、2番目に安定した4bpステム二重鎖立体構造を有するように選択された。5'と3'末端領域の間で形成される5bpステム二重鎖立体構造が最も安定した立体構造である。これに対し、実施例11及び12で試験されたそれぞれの単分子プローブ(本実施例の2つのプローブと同じ5bpのステム二重鎖配列と同じループ長を有するUP6-23B(配列番号:141)包含)は、ループ配列を適切に選択することによって、唯一つのステム二重鎖立体構造を有するように考案された。
Example 14 Loop sequence dependence of fluorescence characteristics of a non-competitive single molecule probe having an interactive label pair consisting of a fluorophore and a quencher The stem sequence and loop length are the same as UP6-23B (SEQ ID NO: 141), but different UP15-23B (SEQ ID NO: 150) and UP16-23B (SEQ ID NO: 151), which are non-competitive single molecule affinity probes having a loop sequence, are synthesized, and the loop sequence of the fluorescence characteristics of the non-competitive single molecule probe Used to check for dependencies. Similar to the unimolecular probe UP6-23B (SEQ ID NO: 141) used in Examples 11 and 12, these two probes were also linked to thymidine, the third nucleotide from the 3 'end, ie the 3' end. And has an interactive label pair consisting of fluorescein and DABCYL covalently linked to the 5 'and 3' ends, respectively. The loop sequences of these two probes were selected such that each probe had a second stable 4 bp stem duplex conformation between the 5 ′ end region and the loop region. The 5 bp stem duplex structure formed between the 5 ′ and 3 ′ end regions is the most stable structure. In contrast, each single molecule probe tested in Examples 11 and 12 (UP6-23B (SEQ ID NO: 141) having the same 5 bp stem duplex sequence and the same loop length as the two probes of this example) Inclusion) was devised to have only one stem duplex conformation by appropriate selection of the loop sequence.
同様に、前記単分子プローブの検出溶液は、50pmolの各単分子プローブと0、1/8、及び1/4モル当量のストレプトアビジンを含むが、実施例11におけると同一の手順によって96ウェルPCRプレートに用意されたし、iCycler iQ実時間PCR装置を使って蛍光シグナルの温度依存性を測定した。
図42A及び図42Bは、0(円)と1/4(四角形)モル当量のストレプトアビジンが存在する時の前記2つの単分子プローブの蛍光シグナルの温度依存性をそれぞれ示している。融解プロファイルと受容体因子(ストレプトアビジン)の添加に対する感応特性は、唯一つのステム二重鎖立体構造を有するUP6-23B(配列番号:141)におけると一般的に類似することが観察された(比較のために図35D参照)。しかし、受容体因子(ストレプトアビジン)の添加による蛍光シグナルの相対的増加は、二次的なステム二重鎖立体構造(secondary stem duplex conformer)を有しないUP6-23Bの値と比較した時、より小さいことが観察された。例えば、1/4当量のストレプトアビジンを添加することによって(25℃で)UP15-23BとUP16-23Bの蛍光シグナルは約3倍及び1.5倍にそれぞれ増加する一方、UP6-23Bにおいては約5倍増加する(図37参照)。この結果は、UP15-23BとUP16-23Bが二次的なステム二重鎖構造(secondary stem duplex structure)を形成するという観点から容易に理解することができる。受容体因子がプローブに結合すると、これにより発生する核酸ハイブリダイゼーション不安定化効果によって一次的なステム二重鎖構造(primary stem duplex structure)が不安定になる。
この力によりUP15-23BとUP16-23Bは、前記2番目に安定している4bpステム二重鎖構造に立体構造的変化を起こす一方、UP6-23Bは、解離した立体構造へ変化する。したがって、受容体因子が結合した後、二次的なステム二重鎖構造を持たないUP6-23Bと比較して、UP15-23BとUP16-23Bは、二次的なステム二重鎖形成によって二つの相互作用性ラベル部分が相対的にお互いより近接して位置するようになる。受容体因子の添加によってUP15-23BがUP16-23Bに比べて大きい増加を見せるという事実も、前記メカニズムを通じて容易に理解することができる。UP15-23Bの二次的な4bpステム二重鎖はループ領域に4個のヌクレオチドを有するのに対し、UP16-23Bはループ領域に13個のヌクレオチドを有する。したがって、UP16-23Bの場合に比べて、UP15-23Bの二次的なステム二重鎖構造において二つの相互作用性ラベル部分がお互いより遠く離れて位置するようになり、その結果、UP16-23Bでは受容体因子の添加によってより大きい蛍光シグナルの増加が起こる。
本実施例から得られた結果は、ステム二重鎖の配列を参照してループ配列を選択することが、本発明のプローブの性能を最適化する上で非常に重要であるということを示唆する。
二次的なステム二重鎖構造の形成を避けるようにループ配列を選択することが好ましい。
Similarly, the detection solution of the unimolecular probe contains 50 pmol of each unimolecular probe and 0, 1/8, and 1/4 molar equivalent of streptavidin, but the same procedure as in Example 11 is used for 96-well PCR. The temperature dependence of the fluorescence signal was measured using an iCycler iQ real-time PCR device prepared on a plate.
FIG. 42A and FIG. 42B show the temperature dependence of the fluorescence signals of the two single-molecule probes when 0 (circle) and 1/4 (square) molar equivalents of streptavidin are present, respectively. It was observed that the melting profile and the sensitivity characteristics to the addition of receptor factor (streptavidin) were generally similar to those in UP6-23B (SEQ ID NO: 141) with only one stem duplex conformation (comparison) For FIG. 35D). However, the relative increase in fluorescence signal with the addition of receptor factor (streptavidin) is greater when compared to the value of UP6-23B, which does not have a secondary stem duplex conformer. Small was observed. For example, by adding 1/4 equivalent of streptavidin (at 25 ° C.), the fluorescence signals of UP15-23B and UP16-23B are increased approximately 3-fold and 1.5-fold, respectively, whereas in UP6-23B, approximately It increases 5 times (see FIG. 37). This result can be easily understood from the viewpoint that UP15-23B and UP16-23B form a secondary stem duplex structure. When the receptor factor binds to the probe, the primary stem duplex structure becomes unstable due to the nucleic acid hybridization destabilizing effect generated thereby.
This force causes UP15-23B and UP16-23B to undergo a conformational change in the second stable 4 bp stem duplex structure, while UP6-23B changes to a dissociated conformation. Thus, UP15-23B and UP16-23B, after binding of the receptor factor, have a dual stem duplex formation due to secondary stem duplex formation compared to UP6-23B, which does not have a secondary stem duplex structure. Two interactive label portions are positioned relatively closer to each other. The fact that UP15-23B shows a large increase compared to UP16-23B by the addition of receptor factor can also be easily understood through the mechanism. The secondary 15 bp duplex of UP15-23B has 4 nucleotides in the loop region, whereas UP16-23B has 13 nucleotides in the loop region. Thus, compared to UP16-23B, in the secondary stem duplex structure of UP15-23B, the two interactive label portions are located farther away from each other, resulting in UP16-23B Then, the addition of the receptor factor causes a greater increase in the fluorescent signal.
The results obtained from this example suggest that selecting a loop sequence with reference to the sequence of the stem duplex is very important in optimizing the performance of the probe of the present invention. .
It is preferred to select the loop sequence so as to avoid the formation of secondary stem duplex structures.
実施例15.蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を有する非競合的単分子プローブの蛍光特性のプローブリガンド接合位置依存性
ループ領域に同じ配列を有し、ステム二重鎖に同数の塩基対(5bp)を有するが、それぞれ異なる位置にプローブリガンド(ビオチン)が接合されている6種類の非競合的単分子親和性プローブが、非競合的単分子プローブのプローブ接合位置依存性を試験するために合成された。なかでも3つのプローブ、つまり、UP10-25B(配列番号:152)、UP10-23B(配列番号:145)、及びUP10-21B(配列番号:153)はステム二重鎖領域に、すなわち3'末端から1番目、2番目及び5番目のヌクレオチドに接合されたビオチンをそれぞれ有している。残り3つのプローブ、つまり、UP10-19B(配列番号:154)、UP10-13B(配列番号:155)、及びUP10-10B(配列番号:156)はループ領域に、すなわちループ領域の3'末端から2番目のヌクレオチド、ループ領域の5'及び3'末端の両方から8番目のヌクレオチド、及びループ領域の5'末端から5番目のヌクレオチドに接合されたビオチンをそれぞれ有している。したがって、前者の3つのプローブは、第1対象または第1相補配列に接合されたプローブリガンドを有しており、後者の3つのプローブは、第1対象または第1相補配列の外側に接合されたプローブリガンドを有している。各単分子プローブも同様に、5'と3'末端にそれぞれ共有結合で連結されたフルオレセインとDABCYLとからなる相互作用性ラベル対を持つ。
Example 15. Dependence of fluorescence characteristics of non-competitive single-molecule probe having an interactive label pair consisting of a fluorophore and a quencher on the probe ligand junction position. 6 non-competitive single-molecule affinity probes having 5 bp), each of which has a probe ligand (biotin) conjugated at different positions, in order to test the probe-composition position dependence of non-competitive single-molecule probes Synthesized. Among them, three probes, namely UP10-25B (SEQ ID NO: 152), UP10-23B (SEQ ID NO: 145), and UP10-21B (SEQ ID NO: 153) are located in the stem duplex region, ie at the 3 ′ end. Has biotin conjugated to the first, second and fifth nucleotides respectively. The remaining three probes, UP10-19B (SEQ ID NO: 154), UP10-13B (SEQ ID NO: 155), and UP10-10B (SEQ ID NO: 156) enter the loop region, ie from the 3 ′ end of the loop region. It has a second nucleotide, biotin conjugated to the 8th nucleotide from both the 5 ′ and 3 ′ ends of the loop region, and the 5th nucleotide from the 5 ′ end of the loop region, respectively. Thus, the former three probes have a probe ligand conjugated to the first object or first complementary sequence, and the latter three probes are conjugated to the outside of the first object or first complementary sequence. Has a probe ligand. Each unimolecular probe similarly has an interactive label pair consisting of fluorescein and DABCYL covalently linked to the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively.
図43A〜図43Fは、上記6種類の単分子プローブにおいて、プローブ量に対して1/4モル当量のストレプトアビジンが添加された時に得られた結果を、ストレプトアビジンを添加しない時と比較してそれぞれ示すものである。ステム二重鎖領域(すなわち、第1対象または第1相補配列)に接合されたプローブリガンドを有する単分子プローブは、受容体因子(ストレプトアビジン)の添加によって一般的に蛍光シグナルの増加を見せ、プローブリガンドの接合位置によって異なる相対的増加を見せる(図43A〜図43C参照)。しかし、ステム二重鎖領域の外側(すなわち、ループ領域)にプローブリガンドが接合された残り3つのプローブは、受容体因子が添加されても有意性ある蛍光シグナルの増加を見せない(図43D〜図43F参照)。このような結果は、本発明によってプローブを考案するに当たってプローブリガンド(または、認識要素)の接合位置が適宜選択されなければならないということを示唆する。 43A to 43F show the results obtained when 1/4 molar equivalent of streptavidin is added to the probe amount in the above six types of single molecule probes, compared with the case where no streptavidin is added. Each is shown. A unimolecular probe having a probe ligand conjugated to the stem duplex region (ie, the first subject or the first complementary sequence) generally exhibits an increase in fluorescence signal upon addition of a receptor factor (streptavidin), The relative increase is different depending on the position of probe ligand conjugation (see FIGS. 43A to 43C). However, the remaining three probes with probe ligands conjugated outside the stem duplex region (ie, the loop region) do not show a significant increase in fluorescent signal when receptor factor is added (FIGS. 43D-43). (See FIG. 43F). Such a result suggests that, in designing a probe according to the present invention, the bonding position of the probe ligand (or recognition element) must be appropriately selected.
実施例16.蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を有する非競合的単分子プローブの融解プロファイルにおけるMgCl2濃度の影響
3'末端から3番目のヌクレオチドであるチミジンに接合されたビオチンを有し、5'と3'末端にそれぞれ共有結合で連結されたフルオレセインとDABCYLとからなる相互作用性ラベル対を有する単分子プローブUP6-23B(配列番号:141)を用いて、融解プロファイルに及ぼすMgCl2濃度の影響を試験した。
前記単分子プローブの検出溶液は、50pmolの単分子プローブと0、1/8、及び1/4モル当量のストレプトアビジンを含んでいるが、実施例11におけると同一の手順従って96ウェルPCRプレートに用意されたし、iCycler iQ実時間PCR装置を使って蛍光シグナルの温度依存性を測定した。
図44A〜図44Dはそれぞれ、0、1、2.5、及び5mMのMgCl2濃度で得られた結果を示している。温度依存性プロファイルは、一般的に類似しているものと観察されたし、予想の通り、融解温度が、MgCl2濃度が増加されるにつれて増加する。受容体因子が存在しないとき(円)、融解温度が0Mm MgCl2、約38℃から5mM MgCl2、約58℃に増加する。受容体因子が存在するときに、融解温度が0Mm MgCl2、約33℃から5mM MgCl2、約45℃に増加する。この結果は、標的因子と認識要素の最適相互作用温度に合せてプローブの作動温度を調節する必要があるとき、MgCl2の濃度、または塩やインターカレート物質のようなその類似物の濃度を調節することが有用であることを示唆する。
Example 16 Effect of MgCl 2 concentration on the melting profile of non-competitive single molecule probes with interactive label pairs consisting of a fluorophore and a quencher with biotin conjugated to thymidine, the third nucleotide from the 3 'end, Using a single molecule probe UP6-23B (SEQ ID NO: 141) with an interactive label pair consisting of fluorescein and DABCYL covalently linked to the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively, the MgCl 2 concentration on the melting profile The effect of was tested.
The detection solution for the unimolecular probe contains 50 pmol of the unimolecular probe and 0, 1/8, and 1/4 molar equivalents of streptavidin, but according to the same procedure as in Example 11, a 96-well PCR plate was used. The temperature dependence of the fluorescence signal was measured using an iCycler iQ real-time PCR device.
Figure 44A~ Figure 44D respectively show the results obtained with MgCl 2 concentration of 0,1,2.5, and 5 mM. The temperature dependent profiles were generally observed to be similar, and as expected, the melting temperature increases as the MgCl 2 concentration is increased. When receptor agent is not present (circles), the
実施例17.蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を有する非競合的単分子プローブの蛍光特性のpH依存性
3'末端から3番目のヌクレオチドであるチミジンに接合されたビオチンを有し、5'と3'末端にそれぞれ共有結合で連結されたフルオレセインとDABCYLとからなる相互作用性ラベル対を有する単分子プローブUP6-23B(配列番号:141)を用いて、融解プロファイルに及ぼすpHの影響を試験した。
前記単分子プローブの検出溶液(50pmolの単分子プローブと0及び1/4モル当量のストレプトアビジンと緩衝溶液を含んだ総体積50μlの溶液)は、次の4つの緩衝溶液を使用して96ウェルPCRプレートに用意された:50mM KCl、2.5mM MgCl2を含むpH6.0、10mM MES;50mM KCl、2.5mM MgCl2を含むpH7.0、10mM Tris;50mM KCl、2.5mM MgCl2を含むpH8.0、10mM Tris;及び、50mM KCl、2.5mM MgCl2を含むpH9.0、10mM Tris。iCycler iQ実時間PCR装置を使って蛍光シグナルの温度依存性を測定した。
Example 17. PH dependence of fluorescence properties of non-competitive unimolecular probes having an interactive label pair consisting of a fluorophore and a quencher, having biotin conjugated to thymidine, the third nucleotide from the 3 ′ end, and 5 ′ The effect of pH on the melting profile using a unimolecular probe UP6-23B (SEQ ID NO: 141) having an interactive label pair consisting of fluorescein and DABCYL covalently linked to the 3 ′ end of each did.
The detection solution of the unimolecular probe (50 pmol of unimolecular probe, 0 and 1/4 molar equivalent of streptavidin and a buffer solution containing a total volume of 50 μl) was added to a 96-well solution using the following four buffer solutions. PCR plates were prepared: 50mM KCl, pH6.0,10mM MES containing 2.5mM MgCl 2; 50mM KCl, pH7.0,10mM Tris containing 2.5mM MgCl 2; 50mM KCl, the 2.5 mM MgCl 2 PH 8.0, 10 mM Tris containing; and pH 9.0, 10 mM Tris containing 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2 . The temperature dependence of the fluorescence signal was measured using an iCycler iQ real-time PCR instrument.
図45は、pH6.0(円)、7.0(三角形)、8.0(ダイアモンド)、及び9.0(四角形)で得られた結果を示している。白印と黒印はそれぞれ、ストレプトアビジンの非存在及び存在時に相当する。予想の通り、融解温度はpHと共に増加し、蛍光の強度は、pH依存的に格段な増加を示す。観察された蛍光強度の増加は、既知のフルオレセインのpH依存的蛍光特性に起因する。この結果は、プローブ作動温度を最適化するために、検出溶液のpH調節が(MgCl2濃度調節に加えて)非常に有用であるということを示す。蛍光強度のpH依存性もまた、本発明のプローブを使用するにおいて重要であるこがわかる。この結果によれば、本実施例で蛍光体として使用されたフルオレセインは、高いpHで強い蛍光を放出する。したがって、高いpHを使用するアッセイでは、フルオレセインを蛍光体部分に使用することが有利である。もし、本発明のプローブを使用するアッセイを低いpHで行う必要がある場合、低いpHで強い蛍光を放出する異なる蛍光体を使用することが好ましい。 FIG. 45 shows the results obtained at pH 6.0 (circle), 7.0 (triangle), 8.0 (diamond), and 9.0 (square). White and black marks correspond to the absence and presence of streptavidin, respectively. As expected, the melting temperature increases with pH, and the intensity of fluorescence shows a marked increase in a pH dependent manner. The observed increase in fluorescence intensity is due to the pH-dependent fluorescence properties of known fluoresceins. This result shows that pH adjustment of the detection solution is very useful (in addition to MgCl 2 concentration adjustment) to optimize probe operating temperature. It can be seen that the pH dependence of fluorescence intensity is also important in using the probes of the present invention. According to this result, the fluorescein used as a phosphor in this example emits strong fluorescence at a high pH. Therefore, in assays that use high pH, it is advantageous to use fluorescein in the fluorophore moiety. If it is necessary to perform an assay using the probe of the present invention at a low pH, it is preferable to use a different fluorophore that emits strong fluorescence at a low pH.
実施例18.蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を有する非競合的単分子プローブを用いた受容体因子の結合阻害試験
3'末端から3番目のヌクレオチドであるチミジンに接合されたビオチンを有し、5'と3'末端にそれぞれ共有結合で連結されたフルオレセインとDABCYLとからなる相互作用性ラベル対を有する単分子プローブUP6-23B(配列番号:141)を用いて、受容体因子のプローブリガンド結合に対する阻害を試験した。
阻害試験用検出溶液は、次のように用意した。12.5pmolのストレプトアビジンを含む10mM Tris溶液(pH8.5、50mM KCl、2.5mM MgCl2)とそれぞれ異なる量の阻害剤(ビオチン)を96ウェルPCRプレートの各ウェルに入れ、常温で30分間培養した。約50pmolのUP6-23B(配列番号:141)プローブを各ウェルに添加し、60℃で約30分間培養した後、蛍光を測定した。
図46は、各ウェルの蛍光強度(ストレプトアビジンと阻害剤を含まない検出溶液から、測定された蛍光強度を引いた値)を阻害剤濃度の関数として示している。阻害剤濃度の増加に伴う蛍光強度の増加は、受容体因子(ストレプトアビジン)のプローブリガンド(プローブに連結されたビオチン)への結合が阻害剤(ビオチン)によって阻害されるということを示す。この結果は、本発明のプローブが、標的因子と認識要素の相互作用を遮断したり抑制する特定阻害剤を探索するスクリーニングに使用可能であることを証明する。
Example 18 Binding inhibition test of receptor factor using a non-competitive single molecule probe having an interactive label pair consisting of a fluorophore and a quencher. It has biotin conjugated to thymidine, the third nucleotide from the 3 'end. Using a single molecule probe UP6-23B (SEQ ID NO: 141) having an interactive label pair consisting of fluorescein and DABCYL covalently linked to the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively, the probe ligand of the receptor factor Inhibition to binding was tested.
The detection solution for inhibition test was prepared as follows. A 10 mM Tris solution (pH 8.5, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2 ) containing 12.5 pmol of streptavidin and a different amount of an inhibitor (biotin) are placed in each well of a 96-well PCR plate for 30 minutes at room temperature. Cultured. About 50 pmol of UP6-23B (SEQ ID NO: 141) probe was added to each well and incubated at 60 ° C. for about 30 minutes, and then fluorescence was measured.
FIG. 46 shows the fluorescence intensity of each well (a value obtained by subtracting the measured fluorescence intensity from a detection solution containing no streptavidin and an inhibitor) as a function of the inhibitor concentration. An increase in fluorescence intensity with increasing inhibitor concentration indicates that the binding of the receptor factor (streptavidin) to the probe ligand (biotin linked to the probe) is inhibited by the inhibitor (biotin). This result proves that the probe of the present invention can be used for screening for specific inhibitors that block or suppress the interaction between the target factor and the recognition element.
実施例19.蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を有する非競合的二分子プローブを用いたストレプトアビジンの検出のためのアッセイ
図21に示す構造と類似する構造を有する2種類の二分子親和性プローブを作製し、標的受容体因子の濃度に対する感応を試験した。1番目の二分子プローブは、第1相補配列(または、第1対象配列)であるCM4*(配列番号:157)と第1対象配列(または第1相補配列)であるCM5-11B(配列番号:158)とから構成されている。2番目の二分子プローブは、第1相補配列(または、第1対象配列)であるCM4*(配列番号:157)と第1対象配列(または、第1相補配列)であるCM6-11B(配列番号:159)とから構成されている。CM4*(配列番号:157)は、5bpステム二重鎖構造を形成しうる5'及び3'アーム配列(5' and 3'arm sequence)と5'と3'末端にそれぞれ共有結合で連結されたフルオレセインとDABCYLとからなる相互作用性ラベル対を有している。CM5-11B(配列番号:158)とCM6-11B(配列番号:159)は、5'末端から11番目のヌクレオチドであるチミジンに接合されたビオチンをプローブリガンドとするそれぞれ15merと13merオリゴヌクレオチドである。このプローブ構成において、CM5-11B(配列番号:158)とCM6-11B(配列番号:159)は第1対象配列(または、第1相補配列)として作用し、CM4*(配列番号:157)のループ領域の全部または一部が、第1相補配列(または、第1対象配列)として作用する。
Example 19. Assay for detection of streptavidin using a non-competitive bimolecular probe with an interactive label pair consisting of a fluorophore and a quencher Two bimolecular affinities having a structure similar to that shown in FIG. Probes were made and tested for sensitivity to the concentration of the target receptor factor. The first bimolecular probe includes CM4 * (SEQ ID NO: 157) as the first complementary sequence (or first target sequence) and CM5-11B (SEQ ID NO: as the first target sequence (or first complementary sequence)). : 158). The second bimolecular probe includes CM4 * (SEQ ID NO: 157) which is the first complementary sequence (or first target sequence) and CM6-11B (sequence which is the first target sequence (or first complementary sequence)). Number: 159). CM4 * (SEQ ID NO: 157) is covalently linked to the 5 ′ and 3 ′ arm sequences and the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively, which can form a 5 bp stem duplex structure. And an interactive label pair consisting of fluorescein and DABCYL. CM5-11B (SEQ ID NO: 158) and CM6-11B (SEQ ID NO: 159) are 15-mer and 13-mer oligonucleotides, respectively, using biotin conjugated to thymidine as the 11th nucleotide from the 5 'end as a probe ligand. . In this probe configuration, CM5-11B (SEQ ID NO: 158) and CM6-11B (SEQ ID NO: 159) act as the first target sequence (or first complementary sequence), and CM4 * (SEQ ID NO: 157) All or part of the loop region acts as the first complementary sequence (or the first target sequence).
図21に概略的に示すように、標的受容体因子(ストレプトアビジン)が存在しないときには、前記二分子プローブが、図21Aのようにハイブリダイズした立体構造を好むように考案された。しかし、標的受容体因子の結合によって、図21Bに示すように、前記二分子プローブは解離した立体構造へ変化する。ハイブリダイズした立体構造では(すなわち、標的受容体因子が存在しないとき)、CM4*に在る二つの相互作用性ラベル部分がお互い遠く離れて位置するようになり、両ラベル部分間の相互作用が弱くなるか遮断され、結果として強い蛍光シグナルが放出される。解離した立体構造では(すなわち、標的受容体因子が存在するとき)、両分子が解離し、ステム二重鎖構造が形成されるので、CM4*に在る二つのラベル部分がお互い近接して位置するようになる。その結果、両ラベル部分間に強い相互作用が起こり、蛍光シグナルが消光されることになる。したがって、標的受容体因子(ストレプトアビジン)の濃度が増加するにつれて前記二分子プローブの蛍光シグナルは減少する。これが本実施例で試験された。 As schematically shown in FIG. 21, when the target receptor factor (streptavidin) is not present, the bimolecular probe was devised to prefer a hybridized three-dimensional structure as shown in FIG. 21A. However, due to the binding of the target receptor factor, the bimolecular probe changes to a dissociated three-dimensional structure, as shown in FIG. 21B. In the hybridized three-dimensional structure (ie, in the absence of the target receptor factor), the two interactive label portions in CM4 * are located far away from each other, and the interaction between both label portions is It is weakened or blocked, resulting in the emission of a strong fluorescent signal. In the dissociated conformation (ie, when the target receptor factor is present), both molecules dissociate and a stem duplex structure is formed, so that the two label moieties in CM4 * are located close to each other. To come. As a result, a strong interaction occurs between both label portions, and the fluorescence signal is quenched. Therefore, the fluorescence signal of the bimolecular probe decreases as the concentration of the target receptor factor (streptavidin) increases. This was tested in this example.
図47A及び図47Bは、前記2種類の二分子プローブ、CM4*+CM5-11BとCM4*+CM6-11Bに対して観察された蛍光シグナルを、ストレプトアビジン濃度及び温度の関数としてそれぞれ示している。96ウェルプレートの各ウェルにおいて、CM4*とCM5-11B(または、CM6-11B)各50pmolと、0、1/8、1/4、または1モル当量のストレプトアビジンを、50mM KCl、2.5mM MgCl2を含むpH8.5、10mM Tris溶液50μlに混合した。背景シグナルを観察するための対照群として、別途のウェルに、50μlのTris緩衝溶液に50pmolのCM4*のみを含有する検出溶液を準備した。図47A及び図47Bに示すように、標的受容体因子が存在しないときに、前記二分子プローブは強い蛍光シグナルを示すが(約20℃〜約40℃の温度範囲参照)、これは、第1対象配列と第1相補配列がハイブリダイズし、これにより、CM4*のステム二重鎖が解離し、二つのラベル部分がお互い遠く離れて位置するようになるということを示す。
標的受容体因子(ストレプトアビジン)の添加によって蛍光シグナルが減少するが、これは、第1対象配列と第1相補配列間のハイブリダイゼーションが不安定になり、お互い解離するようになるということを示す。このような解離によりCM4*のステム二重鎖構造が形成され、二つのラベル部分が效果的に相互作用するようになる。すなわち、観察されたように、蛍光が消光される現象が起こる。
47A and 47B show the fluorescence signals observed for the two bimolecular probes, CM4 * + CM5-11B and CM4 * + CM6-11B, as a function of streptavidin concentration and temperature, respectively. In each well of a 96-well plate, 50 pmol each of CM4 * and CM5-11B (or CM6-11B) and 0, 1/8, 1/4, or 1 molar equivalent of streptavidin, 50 mM KCl, 2.5 mM The mixture was mixed with 50 μl of a pH 8.5, 10 mM Tris solution containing MgCl 2 . As a control group for observing the background signal, a detection solution containing only 50 pmol CM4 * in 50 μl Tris buffer solution was prepared in a separate well. As shown in FIGS. 47A and 47B, when the target receptor factor is not present, the bimolecular probe shows a strong fluorescent signal (see temperature range of about 20 ° C. to about 40 ° C.), which The target sequence and the first complementary sequence hybridize, indicating that the stem duplex of CM4 * is dissociated and the two label portions are located far away from each other.
Addition of the target receptor factor (streptavidin) reduces the fluorescence signal, indicating that the hybridization between the first subject sequence and the first complementary sequence becomes unstable and dissociates from each other. . By such dissociation, a CM4 * stem duplex structure is formed, and the two label portions interact effectively. That is, as observed, a phenomenon occurs in which fluorescence is quenched.
実施例20.実施例19で試験されたものに類似する非競合的二分子プローブを用いたストレプトアビジンの検出のためのアッセイ
実施例19で試験されたものと類似する二分子親和性プローブを作製し、標的受容体因子の濃度に対する感応を試験した。この二分子プローブは、第1対象配列(または、第1相補配列)であるUP10-13B(配列番号:155)と第1相補配列(または、第1対象配列)であるCM5(配列番号:160)とから構成される。UP10-13B(配列番号:155)は、5'末端から13番目のヌクレオチドのループ領域に接合されたビオチンをプローブリガンドとして有し、5'と3'末端にそれぞれ共有結合で連結されたフルオレセインとDABCYLとからなる相互作用性ラベル対を有している。CM5は、UP10-13Bのループ領域に相補的な配列を有する15merオリゴヌクレオチドである。実施例19で試験された二分子プローブと同様に、CM5は、第1相補配列(または、第1対象配列)として作用し、UP10-13Bのループ領域は、第1対象配列(または、第1相補配列)として作用する。
Example 20. Assay for detection of streptavidin using a non-competitive bimolecular probe similar to that tested in Example 19 A bimolecular affinity probe similar to that tested in Example 19 was generated and targeted receptor Sensitivity to body factor concentrations was tested. This bimolecular probe includes UP10-13B (SEQ ID NO: 155) as a first target sequence (or first complementary sequence) and CM5 (SEQ ID NO: 160) as a first complementary sequence (or first target sequence). ). UP10-13B (SEQ ID NO: 155) has biotin conjugated to a loop region of the 13th nucleotide from the 5 ′ end as a probe ligand, and fluorescein covalently linked to the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively. It has an interactive label pair consisting of DABCYL. CM5 is a 15mer oligonucleotide having a sequence complementary to the loop region of UP10-13B. Similar to the bimolecular probe tested in Example 19, CM5 acts as the first complementary sequence (or first subject sequence) and the loop region of UP10-13B is the first subject sequence (or first subject sequence). Act as a complementary sequence).
本実施例で作製された二分子プローブは、実施例19で試験されたものと構造において似ているが、ただし、プローブリガンドであるビオチンが、本実施例では相互作用性ラベル対とステム-ループ構造を有するオリゴヌクレオチドに連結されているのに対し、実施例19では、ラベルを有しない線形オリゴヌクレオチドに連結されている点で異なっている。実施例19と同様にして(すなわち、UP10-13B及びCM5各50pmolと0、1/8、及び1/4モル当量のストレプトアビジン含有するようにして)検出溶液を用意し、蛍光シグナルを測定した。この結果は、図48に示す。予想の通り、標的受容体因子添加に対する二分子プローブの感応は、実施例19で観察した二分子プローブのそれに類似している。UP10-13Bは、実施例15で単分子プローブとして試験されたが、単分子プローブとして適切に作動しなかったということは注目すべき事実である。実施例15において、このような結果は、UP10-13Bがループ領域に(すなわち、第1対象あるいは第1相補配列以外の位置に)連結されたプローブリガンドを有したからと解析された。しかし、追加的なオリゴヌクレオチド構成成分を使用する二分子方式では、同じUP10-13Bを用いて標的濃度によって望む蛍光シグナルの変化が起こるようにすることが可能であった。 The bimolecular probe produced in this example is similar in structure to that tested in Example 19, except that the probe ligand, biotin, is an interactive label pair and stem-loop in this example. Example 19 is different in that it is linked to a linear oligonucleotide having no label, whereas it is linked to an oligonucleotide having a structure. A detection solution was prepared in the same manner as in Example 19 (ie, containing 50 pmol of UP10-13B and CM5 and 0, 1/8, and 1/4 molar equivalent of streptavidin), and the fluorescence signal was measured. . The result is shown in FIG. As expected, the sensitivity of the bimolecular probe to target receptor factor addition is similar to that of the bimolecular probe observed in Example 19. It is noteworthy that UP10-13B was tested as a unimolecular probe in Example 15, but did not work properly as a unimolecular probe. In Example 15, such results were analyzed because UP10-13B had a probe ligand linked to the loop region (ie, at a position other than the first target or first complementary sequence). However, in a bimolecular scheme using additional oligonucleotide components, it was possible to use the same UP10-13B to cause the desired fluorescent signal change with target concentration.
実施例21.蛍光体と消光体とからなる相互作用性ラベル対を有する非競合的単分子プローブを用いたキナーゼ活性とその阻害剤検出のためのアッセイ
キナーゼプローブの準備
クロスリンカー(cross-linker)を用いて、反応基を有するプリプローブとペプチドをクロスリングキングしてキナーゼプローブを準備した。共通する骨格構造を有する2種類のプリプローブを準備したが、5'と3'末端にそれぞれ接合された蛍光体と消光体を有しており、ステム-ループ構造を形成する25merオリゴヌクレオチドを骨格構造としている。
UP10-23C(配列番号:161)は、3'ステム配列の3'末端から3番目のヌクレオチドであるチミジンに共有結合で連結されたカルボキシル残基を有している。UP10-23A(配列番号:162)は、前記部位と同じステム部位に1級アミン残基を有している(カルボキシル基が連結されたチミジン及びアミン基が連結されたチミジンの構造は、図24A及び図24Bを参照されたい)。プリプローブの選択は、オリゴヌクレオチドとペプチドに含まれた反応基(等)に依存する。フルオレセインを蛍光体とする場合、1級アミン基を有するUP10-23Aが本実施例で使用されたように、より好まれる。使用されたクロスリンカーは、MBS(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)である。MBSは、NHS-エステル-マレイミド(NHS-ester-maleimide)異種二反応性クロスリンカー(heterobifunctional cross-linker)であるので、まず、一つの1級アミン基に連結させてから残りの分子のスルフヒドリル基(sulfhydryl group)に連結させる過程を通じて両分子をクロス-リングキングする時に使用される。本実施例で使用されたペプチド配列は、KRTLRRC(配列番号:163)である。ペプチドKRTLRR(配列番号:164)は、PKC(プロテインキナーゼC、protein kinase C)の認識配列である。PKCは、スレオニン(threonine)の側鎖であるヒドロキシル基(hydroxyl group)をリン酸化する。クロスリンカーのマレイミド環(maleimide ring)に接合するためのスルフヒドリル基(sulfhydryl group)を提供するために、システイン残基(cysteine residue)がC末端に導入されている。
Example 21. Assay for the detection of kinase activity and its inhibitors using a non-competitive unimolecular probe with an interactive label pair consisting of a fluorophore and a quencher
Preparation of Kinase Probe A kinase probe was prepared by cross-linking the pre-probe having a reactive group and a peptide using a cross-linker. Two types of preprobes with a common skeleton structure were prepared, but they have a phosphor and a quencher bonded to the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively, and a 25mer oligonucleotide forming a stem-loop structure is skeleton. It has a structure.
UP10-23C (SEQ ID NO: 161) has a carboxyl residue covalently linked to thymidine, the third nucleotide from the 3 ′ end of the 3 ′ stem sequence. UP10-23A (SEQ ID NO: 162) has a primary amine residue at the same stem site as the above site. And see FIG. 24B). The selection of the preprobe depends on the reactive group (etc.) contained in the oligonucleotide and peptide. When fluorescein is used as the phosphor, UP10-23A having a primary amine group is more preferred as used in this example. The crosslinker used is MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester). Since MBS is a NHS-ester-maleimide heterobifunctional cross-linker, it is first linked to one primary amine group and then the sulfhydryl group of the remaining molecule. Used when cross-ringking both molecules through the process of linking to (sulfhydryl group). The peptide sequence used in this example is KRTLRRC (SEQ ID NO: 163). The peptide KRTLRR (SEQ ID NO: 164) is a recognition sequence for PKC (protein kinase C). PKC phosphorylates the hydroxyl group which is the side chain of threonine. In order to provide a sulfhydryl group for conjugation to the maleimide ring of the crosslinker, a cysteine residue has been introduced at the C-terminus.
DMSOに溶解された約20倍モル過量のMBSを1mMのUP10-23Aプリプローブ溶液に迅速に混合しながら滴加し、常温で30分間培養した。反応混合物をセファデックスG-25(Sephadex G-25)カラムに通過させ、塩分が除去された状態のマレイミドに活性化したプリプローブを得た。その後、マレイミドに活性化したプリプローブに、配列KRTLRRCを有するペプチドを約40倍モル過量で添加し、常温で30分間反応させた。反応混合物を、セファデックスG-25に再び通過させた後、Supelco(PA、USA)の直径10mm×長さ250mm、C18 HPLCカラムとYoung Lin機器(安養、韓国)のAcme HPLCシステムを使ってペプチドが連結されたプローブを精製した。このようにして得られた産物が、PKCプローブのUP10-23PKC(配列番号:165)であるが、このプローブは、3'末端から3番目のヌクレオチドに接合されているPKC認識部位配列(配列番号:164)を有し、5'と3'末端にそれぞれ接合されたフルオレセインとDABCYLとからなる相互作用性ラベル対を持つ。PKC対照群プローブのUP10-23PKCp(配列番号:167)を作製するために、リン酸化したスレオニンRpを有するペプチドであるKRpTLRRC(配列番号:166)を同じUP10-23Aプリプローブに接合した(ペプチドが連結されたチミジンの構造は、図24C及び図24Dを参照されたい)。
About 20-fold molar excess of MBS dissolved in DMSO was added dropwise to 1 mM UP10-23A preprobe solution with rapid mixing, and incubated at room temperature for 30 minutes. The reaction mixture was passed through a Sephadex G-25 column to obtain a preprobe activated to maleimide in a state where salt was removed. Thereafter, a peptide having the sequence KRTLRRC was added to the preprobe activated to maleimide at a molar excess of about 40 times, and reacted at room temperature for 30 minutes. The reaction mixture was re-passed through Sephadex G-25, using a Supelco (PA, USA)
キナーゼアッセイ
PKC検出用緩衝溶液の組成は、10mM MgCl2、1mM ATPと1mM CaCl2を含むpH7.4、20mM HEPES緩衝溶液である。酵素活性を検出するために、50pmolのPKCプローブを50mUのPKCと共に50μlのHEPES緩衝溶液で30℃で1時間反応させた。(1unitのPKCは、0.6mg/mlのホスファチジルセリン(phosphatidylserine)と1.7mM CaCl2存在下でType III-S histone proteinを基質として30℃で1分当たり1nmolのリン酸基を伝達するのに必要な酵素の量として定義される。)EDTAを最終濃度10mMで添加することによって反応を終結した。約25pmoleの抗ホスホスレオニン抗体(anti-phosphothreonine antibody)を反応混合物に添加し、iCycler iQ実時間PCR装置を使って試料の蛍光シグナルを検出した。PKCプローブとPKC対照群プローブのそれぞれを、キナーゼ反応をせずに抗ホスホスレオニン抗体と混合して、陰性及び陽性対照群試料をそれぞれ準備した。阻害剤濃度とPKC活性間の関係を試験するために、強力なPKC阻害剤として知られたスタウロスポリン(staurosporin)を0〜90μM濃度でキナーゼ溶液に添加し、キナーゼ反応前に5分間培養した。
The buffer assay composition for kinase assay PKC detection is a pH 7.4, 20 mM HEPES buffer solution containing 10 mM MgCl 2 , 1 mM ATP and 1 mM CaCl 2 . To detect enzyme activity, 50 pmol PKC probe was reacted with 50 mU PKC in 50 μl HEPES buffer solution at 30 ° C. for 1 hour. (1 unit of PKC transmits 1 nmol phosphate group per minute at 30 ° C using Type III-S histone protein as a substrate in the presence of 0.6 mg / ml phosphatidylserine and 1.7 mM CaCl 2 . The reaction was terminated by adding EDTA at a final concentration of 10 mM. Approximately 25 pmole of anti-phosphothreonine antibody was added to the reaction mixture and the fluorescence signal of the sample was detected using an iCycler iQ real-time PCR instrument. Each of the PKC probe and the PKC control group probe was mixed with an anti-phosphothreonine antibody without performing a kinase reaction to prepare negative and positive control group samples, respectively. To test the relationship between inhibitor concentration and PKC activity, staurosporin, known as a potent PKC inhibitor, was added to the kinase solution at a concentration of 0-90 μM and incubated for 5 minutes before the kinase reaction. .
リン酸化したスレオニンを有するPKC対照群プローブUP10-23PKCpは、前記抗体を不安定化因子として添加した時に増加された蛍光を示した。図49に示すように、抗ホスホスレオニン抗体が存在するとき(25pmol)の前記PKC対照群プローブ(50pmol)から得られた蛍光の強度は、同量の抗ホスホスレオニン抗体が存在する時のリン酸化していないPKCプローブのUP10-23PKCと比較して、約10倍も大きく現れた。この結果は、前記抗体が、PKC対照群プローブに含まれたリン酸化したペプチド配列に結合しうる効果的な不安定化因子として作用し、これにより、前記ステム二重鎖立体構造が本発明によって十分に不安定化されるということを示す。図49Aは、PKC阻害剤のスタウロスポリンの存在または非存在下における前述のキナーゼ反応の結果を示している。同図において、阻害剤が存在しない時の蛍光シグナルは、反応しないPKCプローブにおいて測定されたものと比べて、相当増加することが観察された。この結果は、認識要素としてPKCプローブに含まれているPKC認識部位が、PKCの作用により效率的にリン酸化されたし、前記抗ホスホスレオニン抗体が本発明によって効率的な不安定化因子として作動したということを意味する。この阻害剤が存在するときに、阻害剤濃度の増加につれて蛍光シグナルが減少するが、これは、PKCのキナーゼ活性が前記阻害剤により濃度依存的に阻害されたということを意味する。本実施例の結果は、キナーゼプローブやプロテアーゼプローブのような本発明による反応性プローブを、多様な標的反応誘発因子の阻害剤をスクリーニングする上で效果的に使用することができるということを立証する。 The PKC control group probe UP10-23PKCp with phosphorylated threonine showed increased fluorescence when the antibody was added as a destabilizing factor. As shown in FIG. 49, the fluorescence intensity obtained from the PKC control group probe (50 pmol) in the presence of anti-phosphothreonine antibody (25 pmol) is the phosphorylation in the presence of the same amount of anti-phosphothreonine antibody. About 10 times larger than the PKC probe UP10-23PKC which was not used. This result shows that the antibody acts as an effective destabilizing factor that can bind to the phosphorylated peptide sequence contained in the PKC control group probe, so that the stem duplex conformation is in accordance with the present invention. Indicates that it is sufficiently destabilized. FIG. 49A shows the results of the aforementioned kinase reaction in the presence or absence of the PKC inhibitor staurosporine. In the figure, it was observed that the fluorescence signal in the absence of inhibitor was significantly increased compared to that measured with an unreacted PKC probe. As a result, the PKC recognition site contained in the PKC probe as a recognition element was efficiently phosphorylated by the action of PKC, and the anti-phosphothreonine antibody operates as an efficient destabilizing factor according to the present invention. It means that it was done. When this inhibitor is present, the fluorescence signal decreases with increasing inhibitor concentration, which means that the kinase activity of PKC was inhibited by the inhibitor in a concentration-dependent manner. The results of this example demonstrate that the reactive probes according to the present invention, such as kinase probes and protease probes, can be used effectively in screening for inhibitors of various target reaction inducers. .
実験材料及び実験方法
次に、本発明の標的検出システムを使用ために必要な場合に使用可能な材料及び実験方法を説明する。
1)ATPアッセイ
生物学的発光(bioluminescence)を用いてATPを測定するのは、よく確立された技術である。この方法では、極低い濃度のATPを測定するために、光を放出する反応であるルシフェラーゼ触媒によるルシフェリン酸化反応のATP依存性を利用する(De Luca,M. and McElroy,W.D.,(1978))。商業的なATP検出キットの検出範囲は、ATP 1nmol〜1fmol範囲(または、10-6〜10-11M範囲)である。Roche Molecular Biochemicalsの製品説明書ATP Bioluminescence Assay Kit CLSII(revised July,1999);及び、CalBiochemの製品説明書ATP Assay Kit Cat.No.119108(revised January 26,1999)を参照されたい。
Experimental Materials and Experimental Methods Next, materials and experimental methods that can be used when necessary to use the target detection system of the present invention will be described.
1) ATP assay Measuring ATP using bioluminescence is a well-established technique. This method utilizes the ATP dependence of luciferase-catalyzed luciferase oxidation, a light-emitting reaction, to measure very low concentrations of ATP (De Luca, M. and McElroy, WD, (1978)). . The detection range of commercial ATP detection kits is
2)ピロリン酸(pyrophosphate)アッセイ
ピロリン酸(PPi)は、無機ピロホスファターゼ(inorganic pyrophosphatase)の触媒反応により両分子の無機リン酸(Pi)に加水分解される。Pi存在下でマルトースホスホリラーゼ(maltose phosphorylase)は、マルトース(maltose)をグルコース1-リン酸(glucose1-phosphate)とグルコース(glucose)に変換させる。その後、グルコースオキシダーゼ(glucoseoxidase)がグルコースをグルコノラクトン(gluconolactone)とH2O2に変換させる。最後に、西洋ワサビ過酸化酵素(horseradish peroxidase、HRP)を触媒とし、H2O2がAmplex Red reagent(10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)と反応して吸光及び蛍光放出最高値がそれぞれ約563nmと約587nmであるレゾルフィン(resorufin)を生成する(Zhou,M.et al.,(1997);Hu,G.R.et al.,(1997))。この検出方法は、100μl反応で0.2μMまでのPPi(20pmol)を検出することができる。Molecular Probesの製品説明書PiPerTM Phosphate Assay Kit No.P-22061(revised on July 17、2002)を参照されたい。
さらに他の方法では、Pi存在下で基質である2-アミノ-6-メルカプト-7-メチルプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(2-amino-6-mercapto-7-methylpurine nucleoside phosphorylase、MESG)が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(purine nucleoside phosphorylase、PNP)によりリボース1-リン酸(ribose1-phosphate)と2-アミノ-6-メルカプト-7-メチルプリン(2-amino-6-mercapto-7-methylpurine)へ酵素的に変換される(Webb,M.R.,(1992))。MESGの酵素的変換により吸収最大波長が、基質の330nmから産物の360nmへ変化される。このアッセイは、1ml反応で1nmolのPPiまで検出可能である。Molecular Probesの製品説明書 EnzChek Pyrophosphate Assay Kit No.E-6646(revised on June 21,2002)を参照されたい。本願明細書に開示される全ての参考文献は、参考として本願明細書に組み込まれる。特に、次の参考文献が、参考として本願明細書に組み込まれる。
2) Pyrophosphate assay Pyrophosphate (PPi) is hydrolyzed into inorganic phosphate (Pi) of both molecules by the catalytic reaction of inorganic pyrophosphatase. In the presence of Pi, maltose phosphorylase converts maltose into glucose 1-phosphate and glucose. Thereafter, glucose oxidase converts glucose into gluconolactone and H 2 O 2 . Finally, horseradish peroxidase (HRP) is used as a catalyst, and H 2 O 2 reacts with Amplex Red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine) to give the highest absorbance and fluorescence emission values, respectively. Resorufin that is 563 nm and about 587 nm is produced (Zhou, M. et al., (1997); Hu, GR et al., (1997)). This detection method can detect PPi (20 pmol) up to 0.2 μM in a 100 μl reaction. See the Molecular Probes product manual, PiPer ™ Phosphate Assay Kit No. P-22061 (revised on July 17, 2002).
In still another method, 2-amino-6-mercapto-7-methylpurine nucleoside phosphorylase (MESG) is a purine nucleoside phosphorylase (MESG) in the presence of Pi. purine nucleoside phosphorylase (PNP) is enzymatically converted to ribose 1-phosphate and 2-amino-6-mercapto-7-methylpurine (Webb, MR, (1992)). Enzymatic conversion of MESG changes the absorption maximum wavelength from 330 nm of the substrate to 360 nm of the product. This assay can detect up to 1 nmol of PPi in a 1 ml reaction. See the Molecular Probes product manual EnzChek Pyrophosphate Assay Kit No. E-6646 (revised on June 21,2002). All references disclosed herein are hereby incorporated by reference. In particular, the following references are incorporated herein by reference:
Hirschfeld, T. E., Fluorescent immunoassay employing optical fiber in capillary tube. U.S. Pat. No. 4,447,546 (1984).
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以上では、具体的な例に挙げて本発明を説明してきたが、本発明は、これに限定されず、本発明の精神及び範囲内で様々な変形及び改良が可能であることは当業者にとって明らかである。 Although the present invention has been described above with specific examples, the present invention is not limited thereto, and various modifications and improvements can be made by those skilled in the art within the spirit and scope of the present invention. it is obvious.
Claims (228)
b)前記第1対象配列と前記第1相補配列のうち少なくとも一つに接合されており、少なくとも一つの標的因子と特異的に相互作用する少なくとも一つの認識要素;及び
c)必要に応じて、前記第1ハイブリダイズした二重鎖の量の関数としてその大きさが示される特徴的シグナルを発生する少なくとも一つの検出可能なラベル;からなる構成成分のうち少なくとも一つ、好ましくは全部を作動可能に連結された状態に含むプローブであって、
前記標的因子が存在するときに、前記標的因子と前記認識要素との前記相互作用により前記第1ハイブリダイズした二重鎖の量が、前記標的因子が存在しないときの量に比べて変化することによって前記特徴的シグナルが変化するプローブ。 a) a first subject sequence having about 3 to 150 nucleotides each independently and substantially complementary to each other to form a first hybridized duplex; and A first nucleic acid sequence pair consisting of one complementary sequence;
b) at least one recognition element joined to at least one of the first target sequence and the first complementary sequence and specifically interacting with at least one target factor; and c) optionally, At least one, preferably all, of the components comprising: at least one detectable label that generates a characteristic signal whose magnitude is indicated as a function of the amount of said first hybridized duplex A probe included in a state connected to
When the target factor is present, the amount of the first hybridized duplex due to the interaction between the target factor and the recognition element changes compared to the amount when the target factor is not present. A probe whose characteristic signal is changed by
前記第2対象配列と前記第2相補配列はそれぞれ独立して約3〜150個のヌクレオチドを有し、相互に実質的に相補的であることから第2ハイブリダイズした二重鎖(second hybridized duplex)を形成し;
前記第1対象配列と前記第2対象配列は、一つの対象配列内に含まれていながら、少なくとも一つのヌクレオチドからなる重複領域を有し、
前記標的因子が存在するときに、前記標的因子と前記認識要素との前記相互作用により、前記標的因子が存在しないときに比べて前記第1ハイブリダイズした二重鎖及び前記第2ハイブリダイズした二重鎖のいずれか一つの量は減少し、残り一つの量は増加することによって、前記特徴的シグナルが変化する請求項1に記載のプローブ。 The probe further comprises a second nucleic acid sequence pair that is a competing nucleic acid sequence consisting of a second target sequence and a second complementary sequence,
The second target sequence and the second complementary sequence each independently have about 3 to 150 nucleotides and are substantially complementary to each other, so that the second hybridized duplex (second hybridized duplex) );
The first target sequence and the second target sequence have an overlapping region consisting of at least one nucleotide while being included in one target sequence,
Due to the interaction between the target factor and the recognition element when the target factor is present, the first hybridized duplex and the second hybridized duplex are compared to when the target factor is absent. The probe according to claim 1, wherein the characteristic signal is changed by decreasing the amount of any one of the heavy chains and increasing the amount of the remaining one.
前記第1対象配列が前記第1相補配列にハイブリダイズしていないときに、前記アーム配列対は、約3〜35個の相補的な塩基対を有するステム二重鎖(stemd duplex)を形成し;
前記検出可能なラベルは、前記5'アーム配列に接合された第1ラベル部分と前記3'アーム配列に接合された第2ラベル部分とからなる相互作用性ラベル対を含み、前記ステム二重鎖が形成されるときに、前記第1及び第2ラベル部分が相互作用する請求項1に記載のプローブ。 The probe includes a 5 ′ arm sequence covalently linked to the 5 ′ end of the first target sequence, and a 3 ′ covalently linked to the 3 ′ end of the first target sequence. A probe further comprising a nucleic acid arm sequence pair consisting of an arm sequence (3'arm sequence),
When the first target sequence is not hybridized to the first complementary sequence, the arm sequence pair forms a stemd duplex having about 3 to 35 complementary base pairs. ;
The detectable label comprises an interactive label pair consisting of a first label portion joined to the 5 ′ arm sequence and a second label portion joined to the 3 ′ arm sequence, the stem duplex The probe of claim 1, wherein the first and second label portions interact when the is formed.
前記第1対象配列が前記第1相補配列にハイブリダイズしていないときに、前記アーム配列対は、約3〜35個の相補的な塩基対を有するステム二重鎖(stem duplex)を形成し;
前記検出可能なラベルは、前記5'アーム配列に接合された第1ラベル部分と、前記3'アーム配列に接合された第2ラベル部分とからなる相互作用性ラベル対を含み、前記ステム二重鎖が形成されるときに、前記第1及び第2ラベル部分が相互作用する請求項1に記載のプローブ。 The probe includes a 5 ′ arm sequence covalently linked to the 5 ′ end of the first complementary sequence and a 3 ′ covalently linked to the 3 ′ end of the first complementary sequence. A probe further comprising a nucleic acid arm sequence pair consisting of an arm sequence (3'arm sequence),
When the first target sequence is not hybridized to the first complementary sequence, the arm sequence pair forms a stem duplex having about 3 to 35 complementary base pairs. ;
The detectable label comprises an interactive label pair consisting of a first label portion joined to the 5 ′ arm sequence and a second label portion joined to the 3 ′ arm sequence, the stem duplex The probe of claim 1, wherein the first and second label portions interact when a chain is formed.
前記第1対象配列が前記第1相補配列にハイブリダイズしていないときに、前記第1アーム配列対は、約3〜35個の相補的な塩基対を有する第1ステム二重鎖(first stem duplex)を形成し、前記第2アーム配列対は、約3〜35個の相補的な塩基対を有する第2ステム二重鎖(second stemd duplex)を形成し;
前記検出可能なラベルは、前記第1の5’アーム配列に接合された第1ラベル部分と前記第1の3’アーム配列に接合された第2ラベル部分とからなる第1ラベル対と、前記第2の5’アーム配列に接合された第3ラベル部分と前記第2の3’アーム配列に接合された第4ラベル部分とからなる第2ラベル対と、からなる2対の相互作用性ラベル対を含み、前記第1ステム二重鎖が形成されるときに前記第1ラベル対が相互作用し、前記第2ステム二重鎖が形成されるときに前記第2ラベル対が相互作用する請求項1に記載のプローブ。 The probe is covalently linked to a first 5 'arm sequence that is covalently linked to the 5' end of the first target sequence and a 3 'end of the first target sequence. A first arm sequence pair consisting of a first 3 'arm sequence and a second 5' arm sequence (second) covalently linked to the 5 'end of the first complementary sequence. 5 'arm sequence) and a second arm sequence pair consisting of a second 3' arm sequence covalently linked to the 3 'end of the first complementary sequence A probe further comprising a nucleic acid arm sequence pair of
When the first sequence of interest is not hybridized to the first complementary sequence, the first arm sequence pair is a first stem duplex having about 3 to 35 complementary base pairs (first stem duplex). the second arm sequence pair forms a second stemd duplex having about 3 to 35 complementary base pairs;
The detectable label comprises a first label pair comprising a first label portion joined to the first 5 ′ arm array and a second label portion joined to the first 3 ′ arm array; Two pairs of interactive labels comprising a third label portion joined to a second 5 'arm arrangement and a second label pair comprising a fourth label portion joined to the second 3' arm arrangement A pair comprising: the first label pair interacts when the first stem duplex is formed and the second label pair interacts when the second stem duplex is formed Item 2. The probe according to Item 1.
前記第1相補配列が前記第1対象配列にハイブリダイズしていないときに、前記アーム配列対は約3〜35個の相補的な塩基対を有するステム二重鎖(stem duplex)を形成し; 前記検出可能なラベルは、前記5'アーム配列に接合された第1ラベル部分と、前記3'アーム配列に接合された第2ラベル部分とからなる相互作用性ラベル対を含み、前記ステム二重鎖が形成されるときに、前記第1及び第2ラベル部分が相互作用する請求項2に記載のプローブ。 The probe includes a 5 ′ arm sequence covalently linked to the 5 ′ end of the first complementary sequence and a 3 ′ covalently linked to the 3 ′ end of the first complementary sequence. A probe further comprising a nucleic acid arm sequence pair consisting of an arm sequence (3'arm sequence),
The arm sequence pair forms a stem duplex having about 3 to 35 complementary base pairs when the first complementary sequence is not hybridized to the first subject sequence; The detectable label comprises an interactive label pair consisting of a first label portion joined to the 5 ′ arm sequence and a second label portion joined to the 3 ′ arm sequence, the stem duplex The probe according to claim 2, wherein the first and second label portions interact when a chain is formed.
前記第2相補配列が前記第2対象配列にハイブリダイズしていないときに、前記アーム配列対は約3〜35個の相補的な塩基対を有するステム二重鎖(stem duplex)を形成し; 前記検出可能なラベルは、前記5'アーム配列に接合された第1ラベル部分と、前記3'アーム配列に接合された第2ラベル部分とからなる相互作用性ラベル対を含み、前記ステム二重鎖が形成されるときに、前記第1及び第2ラベル部分が相互作用する請求項2に記載のプローブ。 The probe includes a 5 ′ arm sequence covalently linked to the 5 ′ end of the second complementary sequence and a 3 ′ covalently linked to the 3 ′ end of the second complementary sequence. A probe further comprising a nucleic acid arm sequence pair consisting of an arm sequence (3'arm sequence),
The arm sequence pair forms a stem duplex having about 3 to 35 complementary base pairs when the second complementary sequence is not hybridized to the second subject sequence; The detectable label comprises an interactive label pair consisting of a first label portion joined to the 5 ′ arm sequence and a second label portion joined to the 3 ′ arm sequence, the stem duplex The probe according to claim 2, wherein the first and second label portions interact when a chain is formed.
前記第1相補配列が前記第1対象配列にハイブリダイズしていないときに、前記第1アーム配列対は、約3〜35個の相補的な塩基対を有する第1ステム二重鎖(first stem duplex)を形成し、前記第2相補配列が前記第2対象配列にハイブリダイズしていないときに、前記第2アーム配列対は、約3〜35個の相補的な塩基対を有する第2ステム二重鎖(second stem duplex)を形成し;
前記検出可能なラベルは、前記第1の5’アーム配列に接合された第1ラベル部分と前記第1の3’アーム配列に接合された第2ラベル部分とからなる第1ラベル対と、前記第2の5’アーム配列に接合された第3ラベル部分と前記第2の3’アーム配列に接合された第4ラベル部分とからなる第2ラベル対と、からなる2対の相互作用性ラベル対を含み、前記第1ステム二重鎖が形成されるときに前記第1ラベル対が相互作用し、前記第2ステム二重鎖が形成されるときに前記第2ラベル対が相互作用する請求項2に記載のプローブ。 The probe is covalently linked to the first 5 ′ arm sequence covalently linked to the 5 ′ end of the first complementary sequence and the 3 ′ end of the first complementary sequence. A first arm sequence pair consisting of a first 3 ′ arm sequence and a second 5 ′ arm sequence (second) covalently linked to the 5 ′ end of the second complementary sequence. 5'arm sequence) and a second arm sequence pair consisting of a second 3'arm sequence covalently linked to the 3 'end of the second complementary sequence A probe further comprising a nucleic acid arm sequence pair of
When the first complementary sequence is not hybridized to the first target sequence, the first arm sequence pair has a first stem duplex having about 3 to 35 complementary base pairs (first stem duplex). the second arm sequence pair has about 3 to 35 complementary base pairs when the second complementary sequence is not hybridized to the second target sequence. Forming a second stem duplex;
The detectable label comprises a first label pair comprising a first label portion joined to the first 5 ′ arm array and a second label portion joined to the first 3 ′ arm array; Two pairs of interactive labels comprising a third label portion joined to a second 5 'arm arrangement and a second label pair comprising a fourth label portion joined to the second 3' arm arrangement A pair comprising: the first label pair interacts when the first stem duplex is formed and the second label pair interacts when the second stem duplex is formed Item 3. The probe according to Item 2.
a)前記試料を、請求項5によるプローブと接触させる段階;及び
b)前記検出温度において前記標的受容体因子がない時と比べて特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target receptor factor in a sample that can optionally bind to a probe ligand under conditions including a detection temperature,
a) contacting the sample with a probe according to claim 5; and b) checking if there is a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when there is no target receptor factor at the detection temperature. Including assay.
a)前記試料を、前記プローブリガンド及び前記標的リガンドと結合しうる受容体因子の存在下で 請求項5によるプローブと接触させる段階;及び
b)前記検出温度において前記標的リガンドがない時と比べて特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target ligand in a sample under conditions including a detection temperature,
a) contacting the sample with the probe according to claim 5 in the presence of a receptor factor capable of binding the probe ligand and the target ligand; and b) as compared to when there is no target ligand at the detection temperature. Determining whether there is a change in the magnitude of the characteristic signal.
a)前記試料を、請求項10によるプローブと接触させる段階;及び
b)前記検出温度において前記標的反応誘発因子がない時と比べて特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target reaction inducer in a sample capable of specifically cleaving a cleavage site under conditions including a detection temperature,
a) contacting the sample with a probe according to claim 10; and b) checking if there is a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when there is no target reaction inducer at the detection temperature. Including assay.
a)前記試料を、請求項27によるプローブと接触させる段階;及び
b)前記検出温度において前記標的反応誘発因子がない時と比べて特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target reaction inducer in a sample capable of specifically inducing a covalent bond at a reaction site under conditions including a detection temperature,
a) contacting the sample with a probe according to claim 27; and b) checking whether there is a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when there is no target reaction inducer at the detection temperature. Including assay.
a)前記試料を、請求項34によるプローブと接触させる段階;及び
b)前記検出温度において前記標的反応誘発因子がない時と比べて特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target reaction inducer in a sample capable of specifically converting a reaction site to a junction site under conditions including a detection temperature,
a) contacting the sample with a probe according to claim 34; and b) checking if there is a change in characteristic signal magnitude compared to when there is no target reaction inducer at the detection temperature. Including assay.
b)前記検出温度において前記標的反応誘発因子がない時と比べて特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target reaction inducer in a sample capable of specifically converting a reactive site to a non-conjugated site under conditions including a detection temperature, a) Contacting with a probe according to Item 47; and b) checking if there is a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when there is no target reaction inducer at the detection temperature.
a)標的化合物を、前記受容体因子の存在下で請求項5によるプローブと接触させる段階;及び
b)前記検出温度において前記標的候補化合物がない時と比べて特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting an inhibitor or enhancer for binding of a receptor factor to a probe ligand under conditions including a detection temperature,
a) contacting the target compound with the probe according to claim 5 in the presence of the receptor factor; and b) a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when no target candidate compound is present at the detection temperature. An assay comprising the steps of:
a)標的化合物を、前記反応誘発因子の存在下で請求項10によるプローブと接触させる段階;及び
b)前記検出温度において前記標的化合物がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting an inhibitor or enhancer for a reaction inducer capable of specifically cleaving a cleavage site under conditions including a detection temperature,
a) contacting the target compound with the probe according to claim 10 in the presence of the reaction inducer; and b) a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when there is no target compound at the detection temperature. An assay comprising the steps of:
a)標的化合物を、前記反応誘発因子及び不安定化因子の存在下で請求項27によるプローブと接触させる段階;及び
b)前記検出温度において前記標的化合物がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting an inhibitor or enhancer against at least one reaction inducer capable of specifically inducing a reactive site covalent bond under conditions including a detection temperature,
a) contacting the target compound with the probe according to claim 27 in the presence of the reaction inducing factor and destabilizing factor; and b) the characteristic signal compared to when the target compound is absent at the detection temperature. An assay comprising: checking for a change in size.
a)標的化合物を、前記反応誘発因子及び不安定化因子の存在下で請求項34によるプローブと接触させる段階;及び
b)前記検出温度において前記標的化合物がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting an inhibitor or enhancer for at least one reaction inducer capable of specifically converting a reaction site to a junction site under conditions including a detection temperature,
a) contacting the target compound with a probe according to claim 34 in the presence of the reaction-inducing factor and destabilizing factor; and b) the characteristic signal compared to when the target compound is absent at the detection temperature. An assay comprising: checking for a change in size.
a)標的化合物を、前記反応誘発因子と不安定化因子の存在下で請求項47によるプローブと接触させる段階;及び
b)前記検出温度において前記標的化合物がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting an inhibitor or enhancer for at least one reaction inducer capable of specifically converting a reactive site to a non-conjugated site under conditions including a detection temperature,
a) contacting the target compound with the probe according to claim 47 in the presence of the reaction inducer and destabilizing factor; and b) the characteristic signal compared to when the target compound is absent at the detection temperature. An assay comprising: checking for a change in size.
c)前記試料を、請求項58によるプローブと接触させる段階;及び
d)前記検出温度において前記標的受容体因子がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target receptor factor in a sample that can optionally bind to a probe ligand under conditions including a detection temperature,
c) contacting the sample with a probe according to claim 58; and d) ascertaining whether there is a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when there is no target receptor factor at the detection temperature; An assay comprising:
c)前記試料を、前記プローブリガンド及び前記標的リガンドと結合しうる受容体因子の存在下で請求項58によるプローブと接触させる段階;及び
d)前記検出温度において前記標的リガンドがない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target ligand in a sample under conditions including a detection temperature,
c) contacting the sample with a probe according to claim 58 in the presence of a receptor agent capable of binding the probe ligand and the target ligand; and d) as compared to when there is no target ligand at the detection temperature. Confirming whether there is a change in the magnitude of the characteristic signal.
c)前記試料を、請求項62によるプローブと接触させる段階;及び
d)前記検出温度において前記標的反応誘発因子がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target reaction inducer in a sample capable of specifically cleaving a cleavage site under conditions including a detection temperature,
c) contacting the sample with a probe according to claim 62; and d) ascertaining whether there is a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when the target reaction inducer is absent at the detection temperature; An assay comprising:
c)前記試料を、請求項66によるプローブと接触させる段階;及び
d)前記検出温度において前記標的反応誘発因子がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target reaction inducer in a sample capable of specifically inducing a covalent bond at a reaction site under conditions including a detection temperature,
c) contacting the sample with a probe according to claim 66; and d) ascertaining whether there is a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when the target reaction inducer is absent at the detection temperature; An assay comprising:
c)前記試料を、請求項70によるプローブと接触させる段階;及び
d)前記検出温度において前記標的反応誘発因子がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target reaction inducer in a sample capable of specifically converting a reaction site to a junction site under conditions including a detection temperature,
c) contacting the sample with a probe according to claim 70; and d) ascertaining whether there is a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when the target reaction inducer is absent at the detection temperature; An assay comprising:
d)前記検出温度で前記標的反応誘発因子がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting the presence or absence of at least one target reaction inducer in a sample capable of specifically converting a reactive site to a non-conjugated site under conditions including a detection temperature, c) Contacting with the probe according to Item 73; and d) checking if there is a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when the target reaction inducer is absent at the detection temperature.
c)標的化合物を、前記受容体因子の存在下で請求項58によるプローブと接触させる段階;及び
d)前記検出温度において前記標的候補化合物がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting an inhibitor or enhancer for binding of a receptor factor to a probe ligand under conditions including a detection temperature,
c) contacting the target compound with a probe according to claim 58 in the presence of the receptor factor; and d) changing the magnitude of the characteristic signal compared to when there is no target candidate compound at the detection temperature. An assay comprising the steps of:
c)標的化合物を、前記反応誘発因子の存在下で請求項62によるプローブと接触させる段階;及び
d)前記検出温度において前記標的化合物がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting an inhibitor or enhancer for a reaction inducer capable of specifically cleaving a cleavage site under conditions including a detection temperature,
c) contacting the target compound with a probe according to claim 62 in the presence of the reaction inducer; and d) a change in the magnitude of the characteristic signal compared to when there is no target compound at the detection temperature. An assay comprising the steps of:
c)標的化合物を、前記反応誘発因子と不安定化因子の存在下で請求項66によるプローブと接触させる段階;及び
d)前記検出温度において前記標的化合物がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting an inhibitor or enhancer against at least one reaction inducer capable of specifically inducing a reactive site covalent bond under conditions including a detection temperature,
c) contacting the target compound with the probe according to claim 66 in the presence of the reaction inducer and destabilizing factor; and d) the characteristic signal compared to when the target compound is absent at the detection temperature. An assay comprising: checking for a change in size.
c)標的化合物を、前記反応誘発因子及び不安定化因子の存在下で請求項70によるプローブと接触させる段階;及び
d)前記検出温度において前記標的化合物がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting an inhibitor or enhancer for at least one reaction inducer capable of specifically converting a reaction site to a junction site under conditions including a detection temperature,
c) contacting the target compound with the probe according to claim 70 in the presence of the reaction-inducing factor and destabilizing factor; and d) the characteristic signal compared to when the target compound is absent at the detection temperature. An assay comprising: checking for a change in size.
c)標的化合物を、前記反応誘発因子及び不安定化因子の存在下で請求項73によるプローブと接触させる段階;及び
d)前記検出温度において前記標的化合物がない時と比べて前記特徴的シグナルの大きさに変化があるか確認する段階;を含むアッセイ。 In an assay for detecting an inhibitor or enhancer for at least one reaction inducer capable of specifically converting a reactive site to a non-conjugated site under conditions including a detection temperature,
c) contacting the target compound with a probe according to claim 73 in the presence of the reaction-inducing factor and destabilizing factor; and d) the characteristic signal compared to when the target compound is absent at the detection temperature. An assay comprising: checking for a change in size.
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