JP2010065167A - Method for preparing plasmalogen-type phospholipid and sphingolipid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、動物組織から、プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids from animal tissues.
脂質は、分子中に長鎖脂肪酸又は類似の炭化水素鎖をもち、生体内に存在するか、生物に由来する物質である。脂質は大まかに単純脂質・複合脂質・誘導脂質の3種類に分けられる。単純脂質とはアルコールと脂肪酸のエステルである。複合脂質は分子中にリン酸や糖を含む脂質で、一般にスフィンゴシンまたはグリセリンが骨格となる。誘導脂質は、単純脂質や複合脂質から、加水分解によって誘導される化合物である。 A lipid is a substance having a long-chain fatty acid or a similar hydrocarbon chain in a molecule and existing in a living body or derived from an organism. Lipids are roughly divided into three types: simple lipids, complex lipids, and derived lipids. Simple lipids are esters of alcohol and fatty acids. Complex lipids are lipids containing phosphoric acid or sugar in the molecule, and generally have sphingosine or glycerin as the backbone. The derived lipid is a compound derived from a simple lipid or complex lipid by hydrolysis.
複合脂質には、両親媒性を持つものが多く、細胞膜の脂質二重層の主要な構成要素であるほか、体内での情報伝達などに関わる。前述のように、複合脂質の骨格となる分子は一般的にグリセリンあるいはスフィンゴシンであるため、これらを基準としてグリセロ脂質とスフィンゴ脂質に分類される。 Many complex lipids have amphipathic properties and are not only the main component of the lipid bilayer of the cell membrane, but also related to information transmission in the body. As described above, since the molecule serving as the skeleton of the complex lipid is generally glycerin or sphingosine, it is classified into glycerolipid and sphingolipid based on these.
グリセロリン脂質は、生体膜の構成成分として重要であるが、なかでもプラズマローゲン型リン脂質は、脳神経細胞や心筋に特徴的に多く含まれるリン脂質であり、コレステロールを含むリン脂質の酸化安定性に寄与しているとの報告、細胞の情報伝達システムに重要な役割を果たすとの報告の他、アルツハイマー病疾患の脳は健常者の脳に比べてプラズマローゲン型リン脂質量が30%近くも減量していることから(非特許文献1)、プラズマローゲン型リン脂質を飲食品や医薬品に含有させることにより、アルツハイマー病等の疾患を改善・予防することも提案されている(特許文献1、2)。
Glycerophospholipid is an important component of biological membranes, but plasmalogen-type phospholipids are phospholipids that are characteristically contained in cerebral nerve cells and myocardium, and contribute to the oxidative stability of phospholipids including cholesterol. In addition to reports that it contributes and reports that it plays an important role in the cell communication system, Alzheimer's disease brain is reduced by about 30% in plasmalogen phospholipids compared to healthy individuals Therefore, it has also been proposed to improve / prevent diseases such as Alzheimer's disease by including plasmalogen-type phospholipids in foods and drinks and pharmaceuticals (
しかしながら、プラズマローゲン型リン脂質含有脂質の抽出には、クロロホルムやメタノール等の溶媒を用いるため(引用文献1、2)抽出されたプラズマローゲン型リン脂質含有脂質を飲食品に含有させて摂取するには安全性に問題があった。
However, in order to extract plasmalogen-type phospholipid-containing lipids, a solvent such as chloroform or methanol is used (
また、凍結乾燥したホヤ、ヒトデなどの水産動物を粉砕し、アセトンやn−ヘキサン/エタノール/水を用いてプラズマローゲン型リン脂質を抽出する方法も報告されている(特許文献3)。しかし、原料となるホヤやヒトデを大量入手することは困難であり、安定供給するには問題があった。 In addition, a method for pulverizing aquatic animals such as freeze-dried sea squirts and starfish and extracting plasmalogen-type phospholipids using acetone or n-hexane / ethanol / water has been reported (Patent Document 3). However, it is difficult to obtain a large amount of sea squirts and starfish as raw materials, and there is a problem in stably supplying them.
さらに、鶏表皮を処理し、プラズマローゲン型リン脂質やスフィンゴミエリン(代表的なスフィンゴ脂質)を回収する方法も報告されている(特許文献4)。しかし、その精製度合いは低いものであった。 Furthermore, a method for treating chicken epidermis and recovering plasmalogen-type phospholipid and sphingomyelin (representative sphingolipid) has also been reported (Patent Document 4). However, the degree of purification was low.
一方、スフィンゴ脂質は、細胞の分化や増殖、あるいは接着を調製・制御し、また、アトピー性皮膚炎を緩和し得、美肌効果を有する等といわれており、食品や化粧品、医薬品等に「セラミド」等と称されて含有されることもある。 On the other hand, sphingolipids are said to have the ability to prepare and control cell differentiation, proliferation, or adhesion, and to relieve atopic dermatitis and have a skin-beautifying effect. And so on.
しかし、最大の供給源が牛脳であったことから、BSE問題の発生後は供給源を穀類や酵母に頼っているのが現状であり、これらから抽出されるスフィンゴ脂質は構成スフィンゴイド塩基の違いによりヒト体内での利用性が低いとされている。 However, since the largest source was bovine brain, after the occurrence of the BSE problem, the source of supply is now dependent on cereals and yeast, and the sphingolipids extracted from these sources depend on the constituent sphingoid bases. Due to the difference, it is said that the utilization in the human body is low.
また、動物性製品由来の脂肪濃縮物からスフィンゴミエリンを抽出する方法が報告されている(特許文献5)。しかし当該方法は脂肪濃縮物を原料とするものであり、原料調達に手間及びコストがかかるものであった。 In addition, a method for extracting sphingomyelin from a fat concentrate derived from animal products has been reported (Patent Document 5). However, this method uses a fat concentrate as a raw material, and it takes time and cost to procure the raw material.
このような状況下、安全な動物組織からプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を高純度で精製する技術の開発が待ち望まれていた。
本発明は、安価に大量入手可能で、かつ安全な材料から、高純度のプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を製造する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing high-purity plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids from a material that is inexpensively available in large quantities and is safe.
本発明者らは、驚くべき事に、
動物組織からプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を製造する方法であって、
(A)プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を含有する動物組織に対して、エタノール抽出処理を行い、エタノール抽出物を得る工程、
(B)前記(A)工程で得たエタノール抽出物に含まれるジアシル型グリセロリン脂質を加水分解する工程、
(C)前記(B)工程で得た処理物を、水溶性ケトン系溶剤で処理し、不溶部を回収する工程、
(D)前記(C)工程で得た不溶部を、 脂肪族炭化水素溶剤と水溶性ケトン溶剤との混合有機溶剤、及び水、で溶媒分配し、混合有機溶剤部を回収する工程
を含む方法であれば、高純度のプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を製造できることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
The inventors surprisingly
A method for producing plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids from animal tissues,
(A) A step of performing an ethanol extraction treatment on an animal tissue containing plasmalogen-type phospholipid and sphingolipid to obtain an ethanol extract,
(B) a step of hydrolyzing the diacyl glycerophospholipid contained in the ethanol extract obtained in the step (A),
(C) The process obtained by the said (B) process is processed with a water-soluble ketone solvent, The process of collect | recovering insoluble parts,
(D) A method comprising a step of recovering the mixed organic solvent part by solvent-distributing the insoluble part obtained in the step (C) with a mixed organic solvent of an aliphatic hydrocarbon solvent and a water-soluble ketone solvent and water. Then, it has been found that high-purity plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids can be produced, and further improvements have been made to complete the present invention.
すなわち、本発明は以下の項1〜5の動物組織からプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を製造する方法に係るものである。
項1.
動物組織からプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を製造する方法であって、
(A)プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を含有する動物組織に対して、エタノール抽出処理を行い、エタノール抽出物を得る工程、
(B)前記(A)工程で得たエタノール抽出物に含まれるジアシル型グリセロリン脂質を加水分解する工程、
(C)前記(B)工程で得た処理物を、水溶性ケトン系溶剤で処理し、不溶部を回収する工程、
(D)前記(C)工程で得た不溶部を、 脂肪族炭化水素溶剤と水溶性ケトン溶剤との混合有機溶剤、及び水、で溶媒分配し、混合有機溶剤部を回収する工程
を含む、方法。
項2.
前記(B)工程が、
前記(A)工程で得られたエタノール抽出物をホスホリパーゼA1(PLA1)で処理し、ジアシル型グリセロリン脂質を加水分解する工程である、
項1に記載の方法。
項3.
前記(C)工程において、
水溶性ケトン系溶剤が、
アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、エチルプロピルケトン、及びジプロピルケトンからなる群より選ばれる少なくとも1種の水溶性ケトン溶剤であるか、
又は当該水溶性ケトン溶剤と水との混合溶剤である、
項1又は2に記載の方法。
項4.
前記(D)工程において、
脂肪族炭化水素溶媒が炭素数4〜10のアルカンの少なくとも1種であり、
水溶性ケトン溶剤が、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、エチルプロピルケトン、及びジプロピルケトンからなる群より選ばれる少なくとも1種であり、
混合有機溶媒における(脂肪族炭化水素溶媒:水溶性ケトン溶剤)の混合体積比が3:7〜7:3である、
項1〜3のいずれかに記載の方法。
項5.
(A)工程後(B)工程前に
(A)工程で得られたエタノール抽出物を、水溶性ケトン系溶剤で処理し、不溶部を回収する工程((A2)工程)
を含み、
(B)工程において、(A2)工程で得られた不溶部をエタノール抽出物として用いる、
項1〜4のいずれかに記載の方法。
That is, the present invention relates to a method for producing plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids from animal tissues according to
A method for producing plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids from animal tissues,
(A) A step of performing an ethanol extraction treatment on an animal tissue containing plasmalogen-type phospholipid and sphingolipid to obtain an ethanol extract,
(B) a step of hydrolyzing the diacyl glycerophospholipid contained in the ethanol extract obtained in the step (A),
(C) The process obtained by the said (B) process is processed with a water-soluble ketone solvent, The process of collect | recovering insoluble parts,
(D) The step of recovering the mixed organic solvent part by solvent-distributing the insoluble part obtained in the step (C) with a mixed organic solvent of an aliphatic hydrocarbon solvent and a water-soluble ketone solvent, and water, Method.
The step (B)
The ethanol extract obtained in the step (A) is treated with phospholipase A1 (PLA1) to hydrolyze diacyl glycerophospholipid.
In the step (C),
Water-soluble ketone solvent
At least one water-soluble ketone solvent selected from the group consisting of acetone, methyl ethyl ketone, diethyl ketone, methyl propyl ketone, ethyl propyl ketone, and dipropyl ketone,
Or a mixed solvent of the water-soluble ketone solvent and water,
In the step (D),
The aliphatic hydrocarbon solvent is at least one of alkanes having 4 to 10 carbon atoms,
The water-soluble ketone solvent is at least one selected from the group consisting of acetone, methyl ethyl ketone, diethyl ketone, methyl propyl ketone, ethyl propyl ketone, and dipropyl ketone;
The mixing volume ratio of (aliphatic hydrocarbon solvent: water-soluble ketone solvent) in the mixed organic solvent is 3: 7 to 7: 3.
(A) After step (B) Before step (B) Process the ethanol extract obtained in step (A) with a water-soluble ketone solvent and recover the insoluble part (step (A2))
Including
In the step (B), the insoluble part obtained in the step (A2) is used as an ethanol extract.
本発明によれば、安価に大量入手が可能な動物組織を材料とし、高純度のプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質画分を製造することができる。 According to the present invention, high-purity plasmalogen-type phospholipids and sphingolipid fractions can be produced using animal tissues that can be obtained in large quantities at low cost.
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
なお、本発明の説明においては、次の略語を用いることがある。
PE: ホスファチジルエタノールアミン(ジアシル型グリセロリン脂質の一種)
PC: ホスファチジルコリン(ジアシル型グリセロリン脂質の一種)
EP: エタノールアミンプラズマローゲン
CP: コリンプラズマローゲン
SM: スフィンゴミエリン(スフィンゴリン脂質の一種)
LPE: リゾホスファチジルエタノールアミン(2-アシル型グリセロリン脂質の一種)
LPC: リゾホスファチジルコリン(2-アシル型グリセロリン脂質の一種)
Cer: 遊離セラミド(スフィンゴ脂質の一種)
PS: ホスファチジルセリン(ジアシル型グリセロリン脂質の一種)
PI: ホスファチジルイノシトール(ジアシル型グリセロリン脂質の一種)
PL: リン脂質
Pls: プラズマローゲン
PLA1: ホスホリパーゼA1
FFA:遊離脂肪酸(Free fatty acidを略してFFA)
In the description of the present invention, the following abbreviations may be used.
PE: Phosphatidylethanolamine (a type of diacyl glycerophospholipid)
PC: Phosphatidylcholine (a type of diacyl glycerophospholipid)
EP: Ethanolamine plasmalogen
CP: Choline Plasmalogen
SM: Sphingomyelin (a type of sphingophospholipid)
LPE: Lysophosphatidylethanolamine (a type of 2-acyl glycerophospholipid)
LPC: Lysophosphatidylcholine (a type of 2-acyl glycerophospholipid)
Cer: Free ceramide (a type of sphingolipid)
PS: Phosphatidylserine (a type of diacyl glycerophospholipid)
PI: Phosphatidylinositol (a type of diacyl glycerophospholipid)
PL: Phospholipid
Pls: Plasmalogen
PLA1: Phospholipase A1
FFA: Free fatty acid (FFA)
本発明は、上記の項1に記載の、動物組織からプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を製造する方法に係るものである。以下、各工程ごとに説明する。
The present invention relates to the method for producing plasmalogen-type phospholipid and sphingolipid from animal tissue as described in
<工程(A)>
本発明においては、プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を製造する原材料として動物組織を用いる。動物組織には、組織の違いによって含有量の差こそあれ、プラズマローゲン型リン脂質(例えばEP、CP)及びスフィンゴ脂質(例えばSM)が含まれており、これらを濃縮、回収するための原材料として適している。特に、安価に大量入手できるもの、安全なもの、比較的プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質が多く含まれるもの、が好ましい。例えば、食用として飼育される動物の組織であれば安価に大量入手が可能であり、安全であることから、好ましい。また、さらに好ましくは、食用とされる動物から食用部位が回収された後通常であれば廃棄されるような部分も利用できる。具体的には、牛、豚、鶏などの肉、皮、内臓、蹄(足)、等が挙げられる。
<Process (A)>
In the present invention, animal tissue is used as a raw material for producing plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids. Animal tissues contain plasmalogen-type phospholipids (eg, EP, CP) and sphingolipids (eg, SM), regardless of the content depending on the tissue, as raw materials for concentrating and recovering these. Is suitable. In particular, those that can be obtained in large quantities at low cost, those that are safe, and those that are relatively rich in plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids are preferable. For example, a tissue of an animal bred for food is preferable because it can be obtained in large quantities at low cost and is safe. More preferably, a portion that is normally discarded after the edible portion is collected from the edible animal can also be used. Specific examples include meat such as cows, pigs, and chickens, skin, internal organs, hoofs (legs), and the like.
特に、鶏は、永い食経験と、全人類一人に一羽とも言われる程多く飼育されており、好ましい。なかでも、従来採卵のために飼育されているレイヤーは、産卵期間が終了すると鶏肉として供給されているが、レイヤーの肉質は硬く締まっており、食品価値としては低い。しかし、レイヤーの肉は多くのプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を含有しており、特に本発明に用いる動物組織として好適である。 In particular, chickens are preferred because they have a long dietary experience and have been raised as many as one animal for all human beings. Among them, the layer conventionally raised for egg collection is supplied as chicken when the egg-laying period is finished, but the meat quality of the layer is tight and the food value is low. However, the meat of the layer contains many plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids, and is particularly suitable as an animal tissue used in the present invention.
なお、このような動物組織は、放置すると悪臭、伝染病等の原因ともなるため、特に食肉加工業界においてこれらの処理は重要な課題であり、これまでは手間と労力をかけ廃棄せざるを得なかったようなものをも有効利用できる点も、本発明の利点の1つである。 In addition, since such animal tissues can cause malodors and infectious diseases if left untreated, these treatments are an important issue particularly in the meat processing industry. Until now, it has been necessary to dispose of them with labor and effort. One of the advantages of the present invention is that it is possible to effectively use what has not been.
本発明では、まず、動物組織に含有される成分をエタノールにより抽出する。当該動物組織に対して行われるエタノール抽出処理は、エタノールを抽出溶媒として使用し、通常の抽出方法によって実施される。なお、抽出に使用するエタノールは含水エタノールであってもよい。 In the present invention, first, components contained in animal tissues are extracted with ethanol. The ethanol extraction treatment performed on the animal tissue is performed by a normal extraction method using ethanol as an extraction solvent. The ethanol used for extraction may be hydrous ethanol.
上記エタノール抽出処理における処理条件については、特に制限されないが、冷浸、温浸等の浸漬法、パーコレーション法等により行うことができる。好適な一例として、鶏ムネ肉にエタノールを加え、30℃で60分以上、好ましくは40℃で180分以上、静置又は撹拌を行う方法が例示される。 The treatment conditions in the ethanol extraction treatment are not particularly limited, but can be carried out by an immersion method such as cold immersion or digestion, a percolation method, or the like. A preferred example is a method in which ethanol is added to chicken breast meat and allowed to stand or stir at 30 ° C. for 60 minutes or longer, preferably at 40 ° C. for 180 minutes or longer.
なお、効率的な抽出を行うために、乾燥粉砕処理された動物組織を使用することが好ましい。また、用いるエタノール量は、プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質が抽出され得るものであれば特に制限されず、適宜設定することができる。
また、抽出効率を高めるために、動物組織は、裁断、細切、粉砕等の処理を行っておくこともできる。
In order to perform efficient extraction, it is preferable to use animal tissue that has been subjected to dry pulverization. The amount of ethanol used is not particularly limited as long as it can extract plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids, and can be appropriately set.
In order to increase the extraction efficiency, the animal tissue can be subjected to treatments such as cutting, shredding, and pulverization.
例えば、乾燥処理された動物組織を1kgに対して、エタノールを例えば1〜10L、好ましくは1〜6L、さらに好ましくは2〜4L用いて行うことができる。 For example, it can be performed using 1 to 10 L, preferably 1 to 6 L, more preferably 2 to 4 L of ethanol per 1 kg of the dried animal tissue.
得られたエタノール抽出液が、不溶物(固形分)を含む場合には、これを除去することが好ましい。除去は、通常の方法によって行えばよく、例えば遠心分離、ペーパーフィルターでの濾過、等の手法が挙げられる。なお、ペーパーフィルターは通常エタノール抽出物を濾過する際に用いるものを使用することができ、例えばADVANTEC(東洋濾紙会社)が挙げられる。 When the obtained ethanol extract contains an insoluble matter (solid content), it is preferable to remove it. The removal may be performed by an ordinary method, and examples thereof include centrifugation, filtration with a paper filter, and the like. In addition, what is normally used when filtering an ethanol extract can be used for a paper filter, for example, ADVANTEC (Toyo filter paper company) is mentioned.
得られたエタノール抽出液は、濃縮乾固した後、次の処理工程((B)工程)に供されることが好ましい。濃縮乾固は公知の方法に従って行うことができ、例えばエバポレーターを用いて行い得る。このようにしてエタノール抽出物(乾固物)が得られ、当該乾固物を(B)工程に供する。このようにして得られる乾固物を、以下(A)乾固物と称することがある。 The obtained ethanol extract is preferably subjected to the next treatment step (step (B)) after being concentrated to dryness. Concentration to dryness can be performed according to a known method, for example, using an evaporator. In this way, an ethanol extract (dried product) is obtained, and the dried product is subjected to step (B). The dried product thus obtained may be hereinafter referred to as (A) dried product.
なお、(B)工程前に、当該(A)乾固物を水溶性ケトン系溶剤で処理し、中性脂質を除去してもよい(当該工程を(A2)工程とする)。このような処理としては、例えば、水溶性ケトン溶剤(その構造中にケトン基を有する水溶性の溶剤)と水との混合溶剤をエタノール抽出乾固物に添加し、撹拌した後遠心してもよいし、単一水溶性ケトン溶剤を添加し、撹拌した後遠心してもよい(すなわち、本発明で「水溶性ケトン系溶剤」とは、水溶性ケトン溶剤と水との混合溶剤、又は単一の水溶性ケトン溶剤、のいずれかを指す)。また、このようにして得られた沈殿に再度処理を行ってもよく、これらの処理は組み合わせて行う(例えば最初に水溶性ケトン溶剤と水との混合溶媒でエタノール抽出物を処理し、次に単一水溶性ケトン溶剤で処理する)こともできる。また、それぞれの処理を単独又は組み合わせて複数回行ってもよく、好ましくは1〜3回の処理を行う。 Before the step (B), the dried product (A) may be treated with a water-soluble ketone solvent to remove neutral lipids (this step is referred to as step (A2)). As such treatment, for example, a mixed solvent of a water-soluble ketone solvent (water-soluble solvent having a ketone group in its structure) and water may be added to the ethanol-extracted dried product, followed by stirring and centrifugation. Then, a single water-soluble ketone solvent may be added, stirred, and then centrifuged (that is, in the present invention, the “water-soluble ketone solvent” means a mixed solvent of a water-soluble ketone solvent and water, or a single solvent. One of water-soluble ketone solvents). The precipitate thus obtained may be treated again, and these treatments are carried out in combination (for example, the ethanol extract is first treated with a mixed solvent of a water-soluble ketone solvent and water, then Treatment with a single water-soluble ketone solvent). Moreover, each process may be performed several times combining single or a combination, and preferably 1 to 3 processes are performed.
使用する水溶性ケトン溶剤としては、プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を濃縮できるものであれば特に制限されないが、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、エチルプロピルケトン、及びジプロピルケトンからなる群より選ばれる少なくとも1種であることが好ましく、なかでもアセトンが好ましい。なお、これらは、1種又は2種以上を組み合わせて用いることもできる。 The water-soluble ketone solvent to be used is not particularly limited as long as it can concentrate plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids, but consists of acetone, methyl ethyl ketone, diethyl ketone, methyl propyl ketone, ethyl propyl ketone, and dipropyl ketone. At least one selected from the group is preferable, and acetone is particularly preferable. In addition, these can also be used 1 type or in combination of 2 or more types.
水溶性ケトン系溶剤として、水溶性ケトン溶剤と水との混合溶媒を用いる場合は、その混合割合は、特に制限されないが、(水溶性ケトン溶剤:水)の混合体積比が1:1〜1:0.1であることが好ましく、1:1〜1:0.5であることがより好ましい。 When a mixed solvent of a water-soluble ketone solvent and water is used as the water-soluble ketone solvent, the mixing ratio is not particularly limited, but the mixing volume ratio of (water-soluble ketone solvent: water) is 1: 1 to 1. : 0.1 is preferable, and 1: 1 to 1: 0.5 is more preferable.
処理に用いる水溶性ケトン系溶剤の量としては、(A)乾固物の量に応じて適宜設定することができる。例えば(A)乾固物100gに対し、50〜200mL、好ましくは50〜100mLである。 The amount of the water-soluble ketone solvent used for the treatment can be appropriately set according to the amount of (A) the dried product. For example, it is 50 to 200 mL, preferably 50 to 100 mL, with respect to 100 g of (A) dried product.
このように水溶性ケトン系溶剤で処理した場合、当該処理後得られる不溶部(沈殿)を乾固し得られるものを(A2)乾固物とする。(A2)工程を行った場合は、この(A2)乾固物を次の工程(B)において(A)乾固物として用いる。 Thus, when it processes with a water-soluble ketone solvent, what can be obtained by drying the insoluble part (precipitation) obtained after the said process is made into (A2) dried solid substance. When the step (A2) is performed, the (A2) dried product is used as the (A) dried product in the next step (B).
<工程(B)>
次に、(A)乾固物は、当該乾固物中に含まれるジアシル型グリセロリン脂質を分解するための処理を行う工程に供される。当該分解は、加水分解であることが好ましい。加水分解されることで、分解物は疎水性が弱まり、脂質成分であるプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を分離濃縮することが容易になる。
<Process (B)>
Next, (A) the dried product is subjected to a step of performing a treatment for decomposing the diacyl glycerophospholipid contained in the dried product. The decomposition is preferably hydrolysis. By being hydrolyzed, the hydrolyzate becomes less hydrophobic, and it becomes easy to separate and concentrate plasmalogen-type phospholipid and sphingolipid, which are lipid components.
このような加水分解処理としては、例えばホスホリパーゼA1(PLA1)による処理が挙げられる。図1に示すように、PLA1はジアシル型リン脂質において、sn-1脂肪酸とグリセリン骨格との結合部を特異的に加水分解する。一方、図2に示すように、プラズマローゲン型リン脂質はsn1がエーテル結合であるため、PLA1の作用を受けない。よって、PLA1で処理することにより、ジアシル型グリセロリン脂質は分解されるが、プラズマローゲン型リン脂質は分解されない。また、スフィンゴ脂質であるスフィンゴミエリンもPLA1の作用を受けない。 Examples of such hydrolysis treatment include treatment with phospholipase A1 (PLA1). As shown in FIG. 1, PLA1 specifically hydrolyzes the binding part of sn-1 fatty acid and glycerol skeleton in diacyl phospholipid. On the other hand, as shown in FIG. 2, plasmalogen-type phospholipids are not affected by PLA1 because sn1 is an ether bond. Therefore, by treating with PLA1, diacyl glycerophospholipid is degraded, but plasmalogen phospholipid is not degraded. Sphingomyelin, a sphingolipid, is also not affected by PLA1.
なお、PLA1により処理すれば、ジアシル型グリセロリン脂質は遊離脂肪酸及びリゾリン脂質へと分解される。プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴミエリンと共存しているPEやPCなどのジアシル型グリセロリン脂質をPLA1でリゾ体へと変換し、遊離脂肪酸及びリゾリン脂質を除去することで、プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴミエリン精製物を得ることができる(図3)。 When treated with PLA1, diacyl glycerophospholipid is decomposed into free fatty acid and lysophospholipid. By converting diacyl glycerophospholipids such as PE and PC coexisting with plasmalogen-type phospholipids and sphingomyelin into lyso form with PLA1, and removing free fatty acids and lysophospholipids, plasmalogen-type phospholipids and sphingos A purified myelin product can be obtained (FIG. 3).
PLA1は、上述の効果が得られるものであれば、その由来等は特に制限されない。例えば、三菱化学フーズ株式会社等から購入可能である。 The origin of PLA1 is not particularly limited as long as the above-described effects can be obtained. For example, it can be purchased from Mitsubishi Chemical Foods Corporation.
また、その使用量も、用いるエタノール抽出物量((A)乾固物量)に応じて適宜設定することができる。好ましくは、0.2〜200unit/((A)乾固物1mg)を使用でき、さらに好ましくは 2〜200unit/((A)乾固物1mg)を使用できる。上述したように、(A2)工程を行った場合は、ここでの(A)乾固物は(A2)乾固物でもよい。(A2)乾固物を用いる場合は、酵素使用量を(A)乾固物を用いる場合の1/10にしてもよい。
Moreover, the amount of use can also be suitably set according to the amount of ethanol extract to be used ((A) amount of dry matter). Preferably, 0.2 to 200 units / ((A) dried
なお、1unitは、1分間当り1μmolの基質(ジアシル型グリセロリン脂質)を変化させる量(1μmol/min)を意味する。 1 unit means an amount (1 μmol / min) that changes 1 μmol of substrate (diacyl glycerophospholipid) per minute.
また、使用バッファーも使用するPLA1に応じて適宜選択できる。例えば0.1M クエン酸-HClバッファー(pH4.5)を用いることができる。この場合、(A)乾固物に当該バッファーを加えて溶解させてから、これにPLA1を加えればよい。また、使用バッファー量としては、酵素反応が進行し得るものであれば特に制限されないが、好ましくは(A)乾固物1gあたり1〜30mL、さらに好ましくは5〜15mL程度である。 In addition, the buffer used can be appropriately selected according to the PLA1 used. For example, 0.1 M citrate-HCl buffer (pH 4.5) can be used. In this case, (A) the buffer is added to the dried product and dissolved, and then PLA1 is added thereto. The amount of buffer used is not particularly limited as long as the enzyme reaction can proceed, but is preferably 1 to 30 mL, more preferably about 5 to 15 mL per 1 g of (A) dried solid.
反応条件も適宜設定できるが、好ましくは50℃で撹拌しながら1〜2時間反応させる。 Although reaction conditions can also be set suitably, Preferably it is made to react for 1 to 2 hours, stirring at 50 degreeC.
なお、次工程に供する前に、酵素の失活処理を行っても良い。好ましくは、温度を70℃程度まで上昇させることで当該処理を行う。 In addition, you may perform the deactivation process of an enzyme before using for the following process. Preferably, the treatment is performed by raising the temperature to about 70 ° C.
このようにして、ジアシル型グリセロリン脂質が分解された処理液を得ることができる。 In this way, a treatment liquid in which the diacyl glycerophospholipid is decomposed can be obtained.
<工程(C)>
ジアシル型グリセロリン脂質が分解された処理液(以下「(B)処理液」と称することがある)は、水溶性ケトン系溶剤で処理し、酵素バッファー及び酵素タンパク質を除去する。
<Process (C)>
The treatment liquid in which the diacyl glycerophospholipid is decomposed (hereinafter sometimes referred to as “(B) treatment liquid”) is treated with a water-soluble ketone solvent to remove the enzyme buffer and the enzyme protein.
水溶性ケトン系溶媒による処理方法としては、中性脂質が除去されるのであれば、特に制限はされず、水溶性ケトン溶剤と水との混合溶媒を(B)処理液に添加し、撹拌した後遠心してもよいし、単一水溶性ケトン溶剤を添加し、撹拌した後遠心してもよい。また、このようにして得られた沈殿に再度処理を行ってもよく、これらの処理は組み合わせて行う(例えば最初に水溶性ケトン溶剤と水との混合溶媒をエタノール抽出物で処理し、次に単一水溶性ケトン溶剤で処理する)こともできる。また、それぞれの処理を単独又は組み合わせて複数回(例えば1〜5回)行ってもよい。 The treatment method using a water-soluble ketone solvent is not particularly limited as long as neutral lipids are removed. A mixed solvent of a water-soluble ketone solvent and water is added to the treatment liquid (B) and stirred. After-centrifugation may be performed, or a single water-soluble ketone solvent may be added, stirred, and then centrifuged. Further, the precipitate thus obtained may be treated again, and these treatments are carried out in combination (for example, first, a mixed solvent of a water-soluble ketone solvent and water is treated with an ethanol extract, then Treatment with a single water-soluble ketone solvent). Moreover, you may perform each process several times (for example, 1 to 5 times) individually or in combination.
好ましくは、水溶性ケトン溶剤と水との混合溶媒で複数回(例えば2〜4回)(B)処理液を処理した後、単一水溶性ケトン溶剤で1又は2回処理する。例えば、水溶性ケトン溶剤と水との混合溶媒を(B)処理液に添加し、撹拌した後遠心する操作を2又は3回繰り返し、さらに単一水溶性ケトン溶剤を添加し、撹拌した後遠心するのが好ましい。 Preferably, the treatment liquid is treated multiple times (for example, 2 to 4 times) with a mixed solvent of a water-soluble ketone solvent and water, and then treated once or twice with a single water-soluble ketone solvent. For example, the operation of adding a mixed solvent of water-soluble ketone solvent and water to (B) treatment liquid, stirring and then centrifuging is repeated 2 or 3 times, adding a single water-soluble ketone solvent, stirring and then centrifuging. It is preferable to do this.
使用する水溶性ケトン溶剤としては、プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を濃縮できるものであれば特に制限されないが、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、エチルプロピルケトン、及びジプロピルケトンからなる群より選ばれる少なくとも1種であることが好ましく、なかでもアセトンが好ましい。なお、これらは、1種又は2種以上を組み合わせて用いることもできる。 The water-soluble ketone solvent to be used is not particularly limited as long as it can concentrate plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids, but consists of acetone, methyl ethyl ketone, diethyl ketone, methyl propyl ketone, ethyl propyl ketone, and dipropyl ketone. At least one selected from the group is preferable, and acetone is particularly preferable. In addition, these can also be used 1 type or in combination of 2 or more types.
水溶性ケトン溶剤と水との混合溶媒を用いる場合は、その混合割合は特に制限されるものではないが、(水溶性ケトン溶剤:水)の混合体積比が1:1〜1:0.1であることが好ましく、1:1〜1:0.5であることがより好ましい。 When a mixed solvent of a water-soluble ketone solvent and water is used, the mixing ratio is not particularly limited, but the mixing volume ratio of (water-soluble ketone solvent: water) is 1: 1 to 1: 0.1. Is preferable, and 1: 1 to 1: 0.5 is more preferable.
使用する水溶性ケトン系溶剤の量としては、例えば(A)乾固物100gに換算して、50〜200mL、好ましくは50〜100mLである。 The amount of the water-soluble ketone solvent to be used is, for example, 50 to 200 mL, preferably 50 to 100 mL in terms of (A) 100 g of dried product.
このようにして得られる沈殿(不溶部)を次の工程に供する。なお、当該沈殿を以下(C)沈殿と称することがある。 The precipitate (insoluble part) thus obtained is subjected to the next step. In addition, the said precipitation may be called below (C) precipitation.
<工程(D)>
こうして得られた不溶部((C)沈殿)には、疎水性物質としてプラズマローゲン型リン脂質とスフィンゴ脂質が高濃度で含まれている。これを、脂肪族炭化水素溶剤と水溶性ケトン溶剤との混合有機溶剤及び水で溶媒分配し、混合溶媒層(上層)を回収することで、高純度のプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を得ることができる。
<Process (D)>
The insoluble part ((C) precipitate) thus obtained contains plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids at high concentrations as hydrophobic substances. This is solvent-distributed with a mixed organic solvent and water of an aliphatic hydrocarbon solvent and a water-soluble ketone solvent, and the mixed solvent layer (upper layer) is recovered to obtain high-purity plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids. be able to.
なお、(B)工程においてPLA1を用いてジアシル型グリセロリン脂質を加水分解した場合は、(C)沈殿には、リゾリン脂質も濃縮されており、水層(下層)を回収することで、高純度のリゾリン脂質を得ることもできる。 In addition, when diacyl glycerophospholipid is hydrolyzed using PLA1 in step (B), lysophospholipid is also concentrated in (C) precipitate, and high purity is obtained by collecting the aqueous layer (lower layer). The lysophospholipid can also be obtained.
用いる脂肪族炭化水素溶剤は、特に制限されないが、特に炭素数4〜10のアルカンの少なくとも1種が好ましく、炭素数5〜8のアルカンの少なくとも1種がより好ましい。なお、これらは1種又は2種以上を組み合わせて用いることもできる。 Although the aliphatic hydrocarbon solvent to be used is not particularly limited, at least one kind of alkane having 4 to 10 carbon atoms is particularly preferred, and at least one kind of alkane having 5 to 8 carbon atoms is more preferred. In addition, these can also be used 1 type or in combination of 2 or more types.
水溶性ケトン溶剤も、特に制限されないが、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、エチルプロピルケトン、及びジプロピルケトンからなる群より選ばれる少なくとも1種が好ましく、アセトンが特に好ましい。なお、これらは1種又は2種以上を組み合わせて用いることもできる。 The water-soluble ketone solvent is not particularly limited, but is preferably at least one selected from the group consisting of acetone, methyl ethyl ketone, diethyl ketone, methyl propyl ketone, ethyl propyl ketone, and dipropyl ketone, and acetone is particularly preferable. In addition, these can also be used 1 type or in combination of 2 or more types.
脂肪族炭化水素溶剤と水溶性ケトン溶剤との混合割合は、プラズマローゲン型リン脂質とスフィンゴ脂質を溶解し得るものであれば特に制限されないが、(脂肪族炭化水素系溶媒:水溶性ケトン溶剤)の混合体積比が3:7〜7:3であることが好ましく、4:6〜6:4であることがより好ましく、5:5であることがさらに好ましい。 The mixing ratio of the aliphatic hydrocarbon solvent and the water-soluble ketone solvent is not particularly limited as long as it can dissolve the plasmalogen-type phospholipid and sphingolipid, but (aliphatic hydrocarbon solvent: water-soluble ketone solvent) Is preferably 3: 7 to 7: 3, more preferably 4: 6 to 6: 4, and even more preferably 5: 5.
混合有機溶剤と水との混合割合は、特に制限されるものではないが、(混合溶剤:水)の混合体積比が20:2〜20:20であることが好ましく、20:2〜20:10であることがより好ましい。 The mixing ratio of the mixed organic solvent and water is not particularly limited, but the mixing volume ratio of (mixed solvent: water) is preferably 20: 2 to 20:20, and 20: 2 to 20: 10 is more preferable.
溶媒分配は公知の方法に従って行えばよく、例えば分液漏斗を用いるのが好適である。 Solvent distribution may be performed according to a known method. For example, a separatory funnel is preferably used.
プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質は、混合溶媒層(上層)に含まれる。これを公知の方法に従って濾過、濃縮乾固すれば、高濃度のプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を得ることができる。このようにして得られたプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質は、抽出に毒性の極めて低い溶媒あるいは水しか用いていないため、食品や化粧品、医薬に利用するのに好適である。 Plasmalogen-type phospholipid and sphingolipid are contained in the mixed solvent layer (upper layer). If this is filtered and concentrated to dryness according to a known method, high-concentration plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids can be obtained. The plasmalogen-type phospholipid and sphingolipid thus obtained are suitable for use in foods, cosmetics, and medicines because they use only a solvent or water with extremely low toxicity for extraction.
なお、ヘキサン/水で比率を1:2〜4:1程度にして分離する方法、あるいはクロロホルム/メタノール/水(8:4:3)や、ヘキサン/2-プロパノール(3:2)に0.7容の水を加える方法なども用いることができる。 Separation with hexane / water at a ratio of about 1: 2 to 4: 1, or 0.7 volume in chloroform / methanol / water (8: 4: 3) or hexane / 2-propanol (3: 2). A method of adding water can also be used.
本発明により得られるプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を含有する食品、化粧品、医薬を摂取することで、様々な生理活性や薬理活性を発現することができる。具体的には、例えば、アトピー性皮膚炎の改善、認知症の予防又は改善、高血糖化の抑制、火傷皮膚の修復、血中コレステロールの低下、脂質の代謝促進等の機能が発揮される。 Various physiological and pharmacological activities can be expressed by ingesting foods, cosmetics, and medicines containing plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids obtained by the present invention. Specifically, for example, functions such as improvement of atopic dermatitis, prevention or improvement of dementia, suppression of hyperglycemia, repair of burned skin, reduction of blood cholesterol, and promotion of lipid metabolism are exhibited.
またさらに、これまで得ることのできなかった程の高純度のプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を大量に提供することを可能とし、これらの物質の未知の機能解明に大きく寄与すると考えられる。 Furthermore, it is possible to provide a large amount of plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids that have not been obtained so far, and are considered to contribute greatly to elucidation of the unknown functions of these substances.
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described, but the present invention is not limited to the following examples.
実施例1.動物組織試料(鶏皮)からのリン脂質画分分離
乾燥鶏皮1kgにエタノール2Lを加えて12時間、40℃で静置して抽出する工程を2回行い、得られた抽出液を濾紙で濾過後、濃縮乾固した。
Example 1. Separation of phospholipid fraction from animal tissue sample (chicken skin) 2 kg of ethanol was added to 1 kg of dried chicken skin and allowed to stand at 40 ° C. for 12 hours for extraction. The resulting extract was filtered with filter paper. After filtration, it was concentrated to dryness.
これに水30mLとアセトン60mL(すなわち67%アセトン)を加えて撹拌、遠心し、沈殿を回収した。この沈殿に水45mLとアセトン45mL(すなわち50%アセトン)を加えて撹拌、遠心し、沈殿を回収した。さらにこの沈殿にアセトン90mLを加えて撹拌、遠心し、沈殿を得、再度アセトン90mLを加えて撹拌、遠心し、沈殿を回収した。最終的に得られた沈殿は10gであり、当該沈殿を鶏皮リン脂質画分とした。なお、遠心は3000rpm×10minで行い、アセトン単一を用いたものは4℃、他は15℃で行なった。 To this, 30 mL of water and 60 mL of acetone (that is, 67% acetone) were added, stirred and centrifuged, and the precipitate was recovered. To this precipitate, 45 mL of water and 45 mL of acetone (that is, 50% acetone) were added, stirred and centrifuged, and the precipitate was collected. Further, 90 mL of acetone was added to the precipitate and stirred and centrifuged to obtain a precipitate, and 90 mL of acetone was added again and stirred and centrifuged to collect the precipitate. The finally obtained precipitate was 10 g, and this precipitate was used as a chicken skin phospholipid fraction. Centrifugation was performed at 3000 rpm × 10 min. Acetone alone was used at 4 ° C., and others at 15 ° C.
当該工程のフローチャートを図4に示す。また、エタノール抽出画分、67%アセトン可溶部、50%アセトン可溶部、アセトン可溶部、アセトン沈殿部(鶏皮リン脂質画分)、それぞれをTLC(薄層クロマトグラフィー)により解析した結果を図5に示す。TLCは次の条件で行った。なお、以下の例におけるTLCもこの条件で行った。 A flowchart of this process is shown in FIG. In addition, the ethanol extraction fraction, 67% acetone soluble part, 50% acetone soluble part, acetone soluble part, acetone precipitation part (chicken phospholipid fraction) were analyzed by TLC (thin layer chromatography). The results are shown in FIG. TLC was performed under the following conditions. The TLC in the following examples was also performed under this condition.
プレート; シリカゲル60(25プレート、Merck社)
展開溶媒; クロロホルム/メタノール/水=65/25/4(体積比)
展開試料の使用量;エタノール抽出画分に換算して等体積となるようにした。(具体的には、抽出溶媒から等体積を分取して、窒素乾固してからエタノールに溶かして元の2μl相当量をスポットした)
Plate; silica gel 60 (25 plates, Merck)
Developing solvent: chloroform / methanol / water = 65/25/4 (volume ratio)
Amount of development sample used: Equal volume in terms of ethanol extraction fraction. (Specifically, an equal volume was taken from the extraction solvent, dried to nitrogen, dissolved in ethanol, and spotted in an amount equivalent to the original 2 μl)
図5に示されるように、エタノール抽出画分はニンヒドリン試薬噴霧及び硫酸噴霧どちらにおいてもスポットが検出され、タンパク質及び脂質が多く含まれていることがわかった。また、このエタノール抽出画分が、67%アセトン、50%アセトン及びアセトンで処理されてタンパク質と中性脂質が除去され、アセトン沈殿部にはPE、PC、SMが濃縮されることがわかった。 As shown in FIG. 5, spots were detected in both the ninhydrin reagent spray and the sulfuric acid spray in the ethanol-extracted fraction, and it was found that a lot of proteins and lipids were contained. In addition, it was found that this ethanol-extracted fraction was treated with 67% acetone, 50% acetone and acetone to remove proteins and neutral lipids, and PE, PC and SM were concentrated in the acetone precipitation part.
なお、ニンヒドリン試薬噴霧によるスポット検出は、0.25%ニンヒドリン試薬(Wako)を、噴霧器を用いてTLCプレート全体に噴霧し、120℃で30秒加熱することで行った。また、硫酸噴霧によるスポット検出は、50%硫酸も同様に噴霧し、150℃で15分加熱することで行った。 The spot detection by ninhydrin reagent spraying was performed by spraying 0.25% ninhydrin reagent (Wako) over the entire TLC plate using a sprayer and heating at 120 ° C. for 30 seconds. Spot detection by spraying with sulfuric acid was performed by spraying 50% sulfuric acid in the same manner and heating at 150 ° C. for 15 minutes.
実施例2.PLA1処理及び中性脂質の除去
実施例1で得た鶏皮リン脂質画分10gを、200mLのPLA1(ホスホリパーゼA1)酵素液(PLA1 10mg/mL[2unit/リン脂質画分mg]となるよう0.1Mクエン酸-HCl buffer (pH4.5)に溶解したもの;以下の例でも同様)に溶解し、50℃で撹拌しながら2時間反応させ、酵素反応液とした。なお、反応終了は、内部温度を70℃まで上昇させて酵素を失活させることで行った。その後、速やかに冷却した。また、操作は全て窒素ガスを封入して行なった。
Example 2 PLA1 treatment and
当該工程のフローチャートを図6に示す。 A flowchart of this process is shown in FIG.
このようにして得た酵素反応液から、バッファー及び酵素タンパク質を除去し、さらに中性脂質を除去するため、次の操作を行った。 The buffer and enzyme protein were removed from the enzyme reaction solution thus obtained, and the following operation was performed to further remove neutral lipids.
すなわち、上記のようにして得た酵素反応液を、遠心チューブに移し、アセトン120mL(酵素反応液の3/5体積)を加えて撹拌、遠心し(4℃、3000rpm×10分;本実施例において以下同様)、沈殿を回収した。この沈殿に水40mLとアセトン80mL(すなわち67%アセトン)を加えて撹拌、遠心して沈殿を回収した。(この操作により、バッファー及び酵素タンパク質を除去できる)。さらにこの沈殿にアセトン40mLを加えて撹拌、遠心するという操作を2回繰り返し、沈殿を回収した(この操作により、中性脂質を除去できる)。 That is, the enzyme reaction solution obtained as described above is transferred to a centrifuge tube, 120 mL of acetone (3/5 volume of the enzyme reaction solution) is added, and the mixture is stirred and centrifuged (4 ° C., 3000 rpm × 10 minutes; this example) In the same manner, the precipitate was recovered. To this precipitate, 40 mL of water and 80 mL of acetone (that is, 67% acetone) were added, stirred, and centrifuged to collect the precipitate. (This operation can remove the buffer and enzyme protein). Furthermore, the operation of adding 40 mL of acetone to the precipitate, stirring and centrifuging was repeated twice, and the precipitate was recovered (neutral lipids can be removed by this operation).
“PLA1処理及び中性脂質の除去”操作を行う前後の試料(すなわち、実施例1で得た鶏皮リン脂質画分、並びに、これをPLA1処理及び中性脂質の除去を行った沈殿)1mgをクロロホルム/メタノール(2:1, v/v)1mlに溶解してHPLC(10μl注入)で解析した結果を図7に示す。HPLCは次の条件で行った。なお、以下の例におけるHPLCもこの条件で行った。 Sample before and after performing “PLA1 treatment and neutral lipid removal” operation (ie, chicken skin phospholipid fraction obtained in Example 1, and precipitate from which PLA1 treatment and neutral lipid were removed) 1 mg 7 was dissolved in 1 ml of chloroform / methanol (2: 1, v / v) and analyzed by HPLC (10 μl injection). HPLC was performed under the following conditions. The HPLC in the following examples was also performed under these conditions.
機器;Shimadzu LC-10AD
カラム;LiChrospher Diol 100(250-4, Merck社)(プレカラム無し)
溶媒;A液:ヘキサン/2-プロパノール/酢酸(82:17:1. v/v)+0.08%トリエチルアミン,B液:2-プロパノール/水/酢酸(85:14:1, v/v)+0.08%トリエチルアミン
流速;1.0ml/min
検出;ELSD蒸発光散乱検出器 (島津製作所,京都,日本)
Equipment: Shimadzu LC-10AD
Column: LiChrospher Diol 100 (250-4, Merck) (no precolumn)
Solvent; A solution: hexane / 2-propanol / acetic acid (82: 17: 1. V / v) + 0.08% triethylamine, B solution: 2-propanol / water / acetic acid (85: 14: 1, v / v) + 0.08% triethylamine flow rate; 1.0ml / min
Detection; ELSD evaporative light scattering detector (Shimadzu, Kyoto, Japan)
図7に示されるように、PLA1処理前に存在したPE、PC、PS、PIはPLA1処理により分解されていることがわかった。また、PLA1処理前には検出されなかったLPE、LPCが、PLA1処理後には検出されており、PLA1処理により、PE、PCがリゾリン脂質へと変換されたことがわかった。ジアシル型リン脂質におけるPLA1の分解位置は図1に示す。なお、図1には、PLA2(ホスホリパーゼA2)、PLC(ホスホリパーゼC)、PLD(ホスホリパーゼD)の分解位置も併せて示す。 As shown in FIG. 7, it was found that PE, PC, PS, and PI existing before the PLA1 treatment were decomposed by the PLA1 treatment. In addition, LPE and LPC that were not detected before PLA1 treatment were detected after PLA1 treatment, and it was found that PE and PC were converted to lysophospholipids by PLA1 treatment. The position of PLA1 degradation in diacyl phospholipid is shown in FIG. FIG. 1 also shows the degradation positions of PLA2 (phospholipase A2), PLC (phospholipase C), and PLD (phospholipase D).
また、図2に示すように、プラズマローゲン型リン脂質はsn1がエーテル結合であるため、PLA1の作用を受けない。よって、PLA1で処理することにより、ジアシル型リン脂質は分解されるが、プラズマローゲン型リン脂質は分解されない。 In addition, as shown in FIG. 2, plasmalogen-type phospholipids are not affected by PLA1 because sn1 is an ether bond. Thus, treatment with PLA1 degrades diacyl phospholipids but not plasmalogen phospholipids.
なお、PLA1処理及び中性脂質の除去を行った沈殿をヘキサン/アセトン溶液を加えて遠心し、沈殿を回収することにより、SMが濃縮した試料を得ることもできる。(上清にはプラズマローゲン型リン脂質が含まれる) Note that a sample enriched with SM can also be obtained by adding a hexane / acetone solution and centrifuging the precipitate from which the PLA1 treatment and neutral lipid have been removed, and collecting the precipitate. (Supernatant contains plasmalogen-type phospholipids)
実施例3.好適分離溶媒混合比率の検討
実施例2で最終的に得た沈殿から、さらにリゾリン脂質及び酵素タンパク質を除去し、高純度プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴミエリンを回収するため、最適な分離溶媒を検討した。
Example 3 Examination of suitable separation solvent mixing ratio In order to further remove lysophospholipid and enzyme protein from the precipitate finally obtained in Example 2 and recover high-purity plasmalogen-type phospholipid and sphingomyelin, examination of the optimum separation solvent did.
当該除去は、次の手順で行う。すなわち、まず、実施例2で最終的に得た沈殿を濃縮乾固したものにヘキサン/アセトン(H/A)を加えて溶解して、分液漏斗へ移し、さらに水(W)を加える(すなわち分液漏斗中の溶液はH/A/Wとなる)。これをよく撹拌して静置し、下層を除去する。これにさらに、除去した下層に含まれたアセトン/水(H/W)を等量添加し、よく撹拌して静置し、下層を除去する。そして、上層をペーパーフィルターで濾過し、濃縮乾固して高純度プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴミエリン含有試料を得る。 The removal is performed by the following procedure. That is, first, hexane / acetone (H / A) was added to a precipitate obtained by concentrating to dryness in Example 2 and dissolved, transferred to a separatory funnel, and water (W) was further added ( That is, the solution in the separatory funnel becomes H / A / W). This is stirred well and allowed to stand, and the lower layer is removed. Further, an equal amount of acetone / water (H / W) contained in the removed lower layer is added, and the mixture is stirred well and allowed to stand to remove the lower layer. Then, the upper layer is filtered with a paper filter and concentrated to dryness to obtain a sample containing high-purity plasmalogen phospholipid and sphingomyelin.
なお、実施例2でSM濃縮試料を得た場合も、遠心後の上清にプラズマローゲン型リン脂質がふくまれることから、当該上清を濃縮乾固し、当該工程に供することも可能である。 Even when the SM-concentrated sample is obtained in Example 2, since the plasmalogen-type phospholipid is contained in the supernatant after centrifugation, the supernatant can be concentrated to dryness and subjected to the step. .
具体的には、次のようにして行った。実施例2で最終的に得た沈殿を濃縮乾固したもの1gに80mLの割合でヘキサン/アセトン(H/A)(1:1)を加えて溶解し、分液漏斗へ移した。これに(ヘキサン/アセトン/水 (H/A/W)が1:1:0.3となるように)さらに水12mLを加え、よく撹拌して静置したところ、上層H/A(10:5)、下層A/W(5:3)に分離した。なお、上層中、下層中の溶媒比率は、ヘキサンは上層、水は下層、アセトンは上下両層に分配されることから、上層と下層の液量を測定し、比率を算出して求めた。以下も同様である。 Specifically, it was performed as follows. The precipitate finally obtained in Example 2 was concentrated to dryness and dissolved in 1 g of hexane / acetone (H / A) (1: 1) at a ratio of 80 mL and transferred to a separatory funnel. To this was further added 12 mL of water (so that hexane / acetone / water (H / A / W) was 1: 1: 0.3), and after stirring well, the upper layer H / A (10: 5) Separated into lower layer A / W (5: 3). The solvent ratio in the upper layer and the lower layer was determined by measuring the amount of liquid in the upper layer and the lower layer and calculating the ratio because hexane is distributed in the upper layer, water is distributed in the lower layer, and acetone is divided into the upper and lower layers. The same applies to the following.
次に、下層を除去し、A/W(5:3)を32mL(すなわち除去した下層の溶媒と等量)加えて撹拌して静置し、下層を除去した。この上層をペーパーフィルターで濾過し、濃縮乾固した。当該濃縮乾固された画分1mgををクロロホルム/メタノール(2:1, v/v)1mlに溶解してHPLCで解析した結果を図8に示す。また、当該工程のフローチャートを図9に示す。図8でピンクに塗られたピークが、プラズマローゲン型リン脂質、スフィンゴリン脂質及びセラミドであり、当該ピンクピーク面積の合計は、全ピーク面積の合計の94%を占めた。このことから、当該工程により、鶏皮から高純度のプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴリン脂質画分を回収できることがわかった。 Next, the lower layer was removed, 32 mL of A / W (5: 3) (that is, the same amount as the solvent of the removed lower layer) was added, stirred and left to stand, and the lower layer was removed. The upper layer was filtered through a paper filter and concentrated to dryness. FIG. 8 shows the results obtained by dissolving 1 mg of the concentrated and dried fraction in 1 ml of chloroform / methanol (2: 1, v / v) and analyzing by HPLC. A flowchart of the process is shown in FIG. The peaks painted pink in FIG. 8 are plasmalogen-type phospholipids, sphingophospholipids and ceramides, and the total of the pink peak areas accounted for 94% of the total peak area. From this, it was found that the high-purity plasmalogen-type phospholipid and sphingophospholipid fraction can be recovered from chicken skin by this step.
なお、SMは分子内の脂肪酸鎖長が多様であり、その違いにより極性が異なりピークが分かれ得る。具体的には、図8中、SM1は炭素数24の脂肪酸、SM3は炭素数16の脂肪酸、SM2はその間の炭素数の脂肪酸を有するSMである。また、遊離セラミド(Cer)は生体組織中でスフィンゴミエリンが分解されて生じる成分であり、動物の屠殺時期や飼育法の違い等によりその両成分の割合は変動するが、期待される生理機能は同等であると考えられており、今回は両成分の合計値を示した。 In addition, SM has various fatty acid chain lengths in the molecule, and depending on the difference, the polarity is different and the peak can be separated. Specifically, in FIG. 8, SM1 is a fatty acid having 24 carbon atoms, SM3 is a fatty acid having 16 carbon atoms, and SM2 is an SM having a fatty acid having a carbon number therebetween. Free ceramide (Cer) is a component produced by the decomposition of sphingomyelin in living tissues, and the proportion of both components varies depending on the timing of animal slaughter and the breeding method, but the expected physiological function is It is considered to be equivalent, and this time, the total value of both components is shown.
実施例4.動物組織試料(鶏ムネ肉)からの、高純度プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質含有画分分離
乾燥粉末鶏ムネ肉1kgにエタノール2Lを加えて40℃で静置12時間抽出を2回行い、得られた抽出液を濾紙で濾過後、濃縮乾固し、鶏ムネ肉リン脂質画分を調整した。
Example 4 From the animal tissue sample (chicken fillet), high-purity plasmalogen-type phospholipid and sphingolipid-containing fraction separated dry powdered chicken fillet 1kg ethanol 2L, left at 40 ℃ for 12 hours extraction, The obtained extract was filtered through a filter paper and concentrated to dryness to prepare a chicken fillet phospholipid fraction.
当該濃縮乾固サンプル(約60g)にPLA1酵素液240mLを加え、50℃で撹拌しながら1時間反応させた。当該反応液を遠心チューブに移し、アセトン150mL(反応液の3/5体積)を加え、撹拌して遠心分離(3000rpm×10min)した。 To the concentrated dry sample (about 60 g), 240 mL of PLA1 enzyme solution was added and reacted at 50 ° C. with stirring for 1 hour. The reaction solution was transferred to a centrifuge tube, 150 mL of acetone (3/5 volume of the reaction solution) was added, and the mixture was stirred and centrifuged (3000 rpm × 10 min).
当該遠心分離で得た沈殿に水50mLとアセトン100mL(すなわち67%アセトン)を加えて撹拌、遠心し、沈殿を回収した。この沈殿に水20mLとアセトン80mL(すなわち80%アセトン)を加えて撹拌、遠心し、沈殿を回収した。 To the precipitate obtained by the centrifugation, 50 mL of water and 100 mL of acetone (that is, 67% acetone) were added, stirred and centrifuged, and the precipitate was collected. To this precipitate, 20 mL of water and 80 mL of acetone (that is, 80% acetone) were added, stirred and centrifuged, and the precipitate was collected.
さらに当該沈殿にアセトン100mLを加えて撹拌、遠心し、沈殿を得、再度アセトン100mLを加えて撹拌、遠心し、沈殿を回収した。 Further, 100 mL of acetone was added to the precipitate and stirred and centrifuged to obtain a precipitate, and 100 mL of acetone was added again and stirred and centrifuged to collect the precipitate.
このようにして得られた沈殿を濃縮乾固し、実施例3に記載の手順と同様にして、高純度のプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴミエリン試料からリゾリン脂質を分離できる最適な分離溶媒を検討した。なお、以下、当該沈殿を濃縮乾固した試料を試料αと呼ぶことがある。 The precipitate thus obtained is concentrated and dried, and an optimal separation solvent capable of separating lysophospholipids from high-purity plasmalogen-type phospholipids and sphingomyelin samples is examined in the same manner as described in Example 3. did. Hereinafter, a sample obtained by concentrating and drying the precipitate may be referred to as a sample α.
すなわち、まず、沈殿を濃縮乾固したもの(試料α)にヘキサン/アセトン(H/A)を加えて溶解して、分液漏斗へ移し、さらに水(W)を加えた(すなわち分液漏斗中の溶液はH/A/Wとなる)。これをよく撹拌して静置し、下層を除去した。これにさらに、除去した下層に含まれたアセトン/水(H/W)を等量添加し、よく撹拌して静置し、下層を除去した。そして、上層をペーパーフィルターで濾過し、濃縮乾固して高純度プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴミエリン含有試料を得られるかを検討した。 That is, first, hexane / acetone (H / A) was added and dissolved in a concentrated and dried precipitate (sample α), transferred to a separatory funnel, and water (W) was further added (ie, separatory funnel). The solution inside becomes H / A / W). This was stirred well and allowed to stand, and the lower layer was removed. Further, an equal amount of acetone / water (H / W) contained in the removed lower layer was added, and the mixture was stirred well and allowed to stand to remove the lower layer. Then, the upper layer was filtered with a paper filter and concentrated to dryness to examine whether a sample containing high-purity plasmalogen phospholipid and sphingomyelin could be obtained.
具体的には、分液漏斗中の溶液H/A/Wの体積の比率が(14:6:5)、(14:6:3)、(10:10:5)、又は(10:10:3)の4通りについて検討した。なお、使用する試料αは一検討あたり1g、使用する溶媒量(H/A量)は、試料α1gあたりそれぞれ160mLとした(すなわち、分液漏斗中量(H/A/W量)は200mL、184mL、200mL、184mL)。 Specifically, the volume ratio of the solution H / A / W in the separatory funnel is (14: 6: 5), (14: 6: 3), (10: 10: 5), or (10:10 : We examined four ways of 3). Note that the sample α to be used was 1 g per study, and the amount of solvent used (H / A amount) was 160 mL per 1 αg of sample α (that is, the amount in the separatory funnel (H / A / W amount) was 200 mL, 184mL, 200mL, 184mL).
なお、(14:6:5)のとき、上層はH/A(14:1)、下層はA/W(5:5)であり、
(14:6:3)のとき、上層はH/A(14:2)、下層はA/W(4:3)であり、
(10:10:5)のとき、上層はH/A(10:3)、下層はA/W(7:5)であり、
(10:10:3)のとき、上層はH/A(10:5)、下層はA/W(5:3)であった。
When (14: 6: 5), the upper layer is H / A (14: 1), the lower layer is A / W (5: 5),
(14: 6: 3), the upper layer is H / A (14: 2), the lower layer is A / W (4: 3),
(10: 10: 5), the upper layer is H / A (10: 3), the lower layer is A / W (7: 5),
When (10: 10: 3), the upper layer was H / A (10: 5) and the lower layer was A / W (5: 3).
一度分液漏斗の下層を除去して、除去したH/Wを等量添加し、撹拌静置した後、再度除去した下層を回収し、この内容物の解析をTLCによって行った。また、同時に上層の内容物の解析も行った。なお、TLCに供するにあたり、上層と下層ともに窒素ガスで乾固し、それぞれ等容のクロロホルム/メタノール(2:1)溶媒に溶解して、1/2000容をプレートにスポットした。 Once the lower layer of the separatory funnel was removed, an equal amount of the removed H / W was added, and the mixture was allowed to stand with stirring. Then, the removed lower layer was collected again, and the contents were analyzed by TLC. At the same time, the contents of the upper layer were also analyzed. For use in TLC, both the upper layer and the lower layer were dried with nitrogen gas, dissolved in an equal volume of chloroform / methanol (2: 1) solvent, and 1/2000 volume was spotted on a plate.
結果を図10に示す。 The results are shown in FIG.
EP及びLPEはアミノ基を有するため、ニンヒドリン試薬噴霧により検出されるが、CP及びLPCは検出されない。また、これら4物質とも、炭素を有するため、50%硫酸噴霧により検出される。なお、LPEとCPは、TLCで分離した際、ほぼ同位置に検出されるため、50%硫酸噴霧の結果だけでは、検出されたスポットがLPEかCPか、あるいはこれらの混合物なのか分からない。ニンヒドリン試薬噴霧の結果と併せて検討し、ニンヒドリン試薬噴霧でスポットが検出できればLPEであり、スポットが検出できなければCPであることが確認できる。このように得られた結果を検討することで、H/A/W(10:10:3)の場合が、下層にロスするEPとCPが微量であり、かつLPEとLPCの除去効率が最大であることがわかった(図10)。 Since EP and LPE have an amino group, they are detected by ninhydrin reagent spraying, but CP and LPC are not detected. In addition, since these four substances have carbon, they are detected by spraying with 50% sulfuric acid. Since LPE and CP are detected at almost the same position when separated by TLC, it is not known from the result of spraying with 50% sulfuric acid only whether the detected spot is LPE, CP, or a mixture thereof. It is considered together with the result of ninhydrin reagent spraying, and if a spot can be detected by ninhydrin reagent spraying, it can be confirmed to be LPE, and if a spot cannot be detected, it can be confirmed to be CP. By examining the results obtained in this way, in the case of H / A / W (10: 10: 3), the amount of EP and CP lost to the lower layer is very small, and the removal efficiency of LPE and LPC is maximum. (Fig. 10).
またさらに、当該分液漏斗中溶液量比(H/A/W(10:10:3))において、さらに最適使用溶媒量を検討した。具体的には、当該分液漏斗中溶液量比において、使用溶媒量(H/A量)を試料α1gあたり160mL、80mL、32mLとして検討した(すなわち、分液漏斗中量(H/A/W量)は184mL、92mL、36.8mL)。 Furthermore, the optimal amount of solvent used was further examined in the solution amount ratio (H / A / W (10: 10: 3)) in the separatory funnel. Specifically, in the solution ratio in the separatory funnel, the amount of solvent used (H / A amount) was examined as 160 mL, 80 mL, and 32 mL per 1 αg of sample (that is, the amount in the separatory funnel (H / A / W Amount) is 184mL, 92mL, 36.8mL).
一度分液漏斗の下層を除去して、除去したH/Wと等量のH/Wを添加し、撹拌静置した後、再度下層を除去してこれを回収し、この内容物の解析をTLCによって行った。また、同時に上層の内容物の解析も行った。図11に、ニンヒドリン試薬噴霧結果(イメージA)及びジットマー試薬噴霧(イメージB)の結果を示す。ニンヒドリン試薬により、エタノールアミンとセリンなどを有するアミノ脂質のみが検出され、ジットマー試薬により、全リン脂質成分が検出される。 Remove the lower layer of the separatory funnel, add the same amount of H / W as the removed H / W, and stir to stand, then remove the lower layer again, collect this, and analyze the contents. By TLC. At the same time, the contents of the upper layer were also analyzed. FIG. 11 shows the results of ninhydrin reagent spraying results (image A) and Jittmer reagent spraying (image B). Only amino lipids having ethanolamine, serine and the like are detected by the ninhydrin reagent, and all phospholipid components are detected by the Jitmer reagent.
図11イメージA及びBに示されるように、いずれの溶媒量(H/A量)であっても、上層にはアミノ脂質であるプラズマローゲン型リン脂質(EP)が検出され、また、アミノ脂質ではないプラズマローゲン(CP)も検出された。また、下層では、PLA1処理により生成したLPE及びLPCが検出された。 As shown in FIG. 11 images A and B, plasmalogen-type phospholipid (EP), which is an amino lipid, is detected in the upper layer regardless of the amount of solvent (H / A amount). Not a plasmalogen (CP) was also detected. In the lower layer, LPE and LPC generated by PLA1 treatment were detected.
以上のことから、鶏ムネ肉から高純度のプラズマローゲン型リン脂質を回収できたことが確認できた。
また、鶏ムネ肉リン脂質画分、及び試料αを(H/A/W(10:10:3))の分離溶液で処理した画分をそれぞれ1gをクロロホルム/メタノール(2:1, v/v)1mlに溶解してHPLCで解析した結果を図12に示す。図12でピンクに塗られたピークが、プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴリン脂質であり、イメージBでは当該ピンクピーク面積の合計は、全ピーク面積の合計の96%を占めた。このことから、当該工程により、鶏ムネ肉から高純度のプラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴリン脂質画分を回収できることがわかった。
From the above, it was confirmed that high-purity plasmalogen-type phospholipids could be recovered from chicken fillet.
In addition, 1g each of the chicken breast phospholipid fraction and the fraction obtained by treating the sample α with the separation solution of (H / A / W (10: 10: 3)) was added to chloroform / methanol (2: 1, v / v) The results of dissolution in 1 ml and analysis by HPLC are shown in FIG. The peaks painted pink in FIG. 12 are plasmalogen-type phospholipids and sphingophospholipids. In image B, the total of the pink peak areas accounted for 96% of the total peak area. From this, it turned out that the high purity plasmalogen type phospholipid and sphingophospholipid fraction can be collect | recovered from a chicken breast meat by the said process.
Claims (5)
(A)プラズマローゲン型リン脂質及びスフィンゴ脂質を含有する動物組織に対して、エタノール抽出処理を行い、エタノール抽出物を得る工程、
(B)前記(A)工程で得たエタノール抽出物に含まれるジアシル型グリセロリン脂質を加水分解する工程、
(C)前記(B)工程で得た処理物を、水溶性ケトン系溶剤で処理し、不溶部を回収する工程、
(D)前記(C)工程で得た不溶部を、 脂肪族炭化水素溶剤と水溶性ケトン溶剤との混合有機溶剤、及び水、で溶媒分配し、混合有機溶剤部を回収する工程
を含む、方法。 A method for producing plasmalogen-type phospholipids and sphingolipids from animal tissues,
(A) A step of performing an ethanol extraction treatment on an animal tissue containing plasmalogen-type phospholipid and sphingolipid to obtain an ethanol extract,
(B) a step of hydrolyzing the diacyl glycerophospholipid contained in the ethanol extract obtained in the step (A),
(C) The process obtained by the said (B) process is processed with a water-soluble ketone solvent, The process of collect | recovering insoluble parts,
(D) The step of recovering the mixed organic solvent part by solvent-distributing the insoluble part obtained in the step (C) with a mixed organic solvent of an aliphatic hydrocarbon solvent and a water-soluble ketone solvent, and water, Method.
前記(A)工程で得られたエタノール抽出物をホスホリパーゼA1(PLA1)で処理し、ジアシル型グリセロリン脂質を加水分解する工程である、
請求項1に記載の方法。 The step (B)
The ethanol extract obtained in the step (A) is treated with phospholipase A1 (PLA1) to hydrolyze diacyl glycerophospholipid.
The method of claim 1.
水溶性ケトン系溶剤が、
アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、エチルプロピルケトン、及びジプロピルケトンからなる群より選ばれる少なくとも1種の水溶性ケトン溶剤であるか、
又は当該水溶性ケトン溶剤と水との混合溶剤である、
請求項1又は2に記載の方法。 In the step (C),
Water-soluble ketone solvent
At least one water-soluble ketone solvent selected from the group consisting of acetone, methyl ethyl ketone, diethyl ketone, methyl propyl ketone, ethyl propyl ketone, and dipropyl ketone,
Or a mixed solvent of the water-soluble ketone solvent and water,
The method according to claim 1 or 2.
脂肪族炭化水素溶媒が炭素数4〜10のアルカンの少なくとも1種であり、
水溶性ケトン溶剤が、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、エチルプロピルケトン、及びジプロピルケトンからなる群より選ばれる少なくとも1種であり、
混合有機溶媒における(脂肪族炭化水素溶媒:水溶性ケトン溶剤)の混合体積比が3:7〜7:3である、
請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 In the step (D),
The aliphatic hydrocarbon solvent is at least one of alkanes having 4 to 10 carbon atoms,
The water-soluble ketone solvent is at least one selected from the group consisting of acetone, methyl ethyl ketone, diethyl ketone, methyl propyl ketone, ethyl propyl ketone, and dipropyl ketone;
The mixing volume ratio of (aliphatic hydrocarbon solvent: water-soluble ketone solvent) in the mixed organic solvent is 3: 7 to 7: 3.
The method according to claim 1.
(A)工程で得られたエタノール抽出物を、水溶性ケトン系溶剤で処理し、不溶部を回収する工程((A2)工程)
を含み、
(B)工程において、(A2)工程で得られた不溶部をエタノール抽出物として用いる、
請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 (A) After step (B) Before step (B) Process the ethanol extract obtained in step (A) with a water-soluble ketone solvent and recover the insoluble part (step (A2))
Including
In the step (B), the insoluble part obtained in the step (A2) is used as an ethanol extract.
The method according to claim 1.
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