JP2010063761A - 白血球除去カラム - Google Patents

Abstract

【課題】炎症時の体液中に増加する顆粒球を効率的かつ選択的に除去することができ、炎症性疾患に対する優れた治療効果と生体適合性を併せ持つ白血球除去カラムを提供すること。
【解決手段】本発明は、体液から顆粒球を効率的に除去する白血球除去カラムであって、上記白血球除去カラムに充填する吸着担体は、平均直径が０．５〜３０μｍ以下の繊維であり、上記吸着担体の充填率は、９．８〜１９．５体積％であり、炎症時の体液からの顆粒球の除去率は、非炎症時の体液からの顆粒球の除去率と比較して１．２倍以上である、白血球除去カラムを提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、白血球除去カラムに関する。

潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性関節リウマチ、乾癬、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、成人スティル病及び急性肺損傷（ＡＲＤＳ／ＡＬＩ）に代表される炎症性疾患は、自己の免疫システムの機能不良や細菌又はウイルスによる感染がその原因の１つとして考えられている。

炎症性疾患では、炎症反応が繰り返し増強され、血液や炎症反応が認められる組織周囲の滲出液又は組織中に、過剰な顆粒球、単球、マクロファージ又は樹状細胞が誘導される。顆粒球は、外来の抗原又は自己抗原を認識すると、単球、マクロファージ、樹状細胞等と相互に活性化し合い、その結果、誘導されたインターロイキン−８等のケモカインの作用により、炎症組織中に誘導される。また、顆粒球は、炎症反応の進行により活性化されると、加速度的に組織障害を引き起こすことが知られている。

さらに、インターロイキン−１βやＴＮＦ−αは、顆粒球の中でも特に好中球を活性化し、活性化された好中球は、抗原を貪食するとともに脱顆粒を起こし、組織障害性を有するエラスターゼ、一酸化窒素、過酸化水素等を産生することによって、組織の炎症及び損傷を進行させることになる。したがって、効果的な炎症性疾患治療を行うためには、炎症反応が進行している時にこそ、過剰な顆粒球及び活性化した顆粒球を除去することが重要となる。

従来から、顆粒球を吸着除去ターゲットとした血液処理カラムが数多く開発されており（特許文献１〜３）、活性化した顆粒球を選択的に除去する吸着担体についても報告されている（特許文献４及び５）。

しかしながら、吸着担体の充填率並びに非炎症時及び炎症時の除去率比によって、炎症性疾患の治療効果又は生体適合性を検討した例はない。ここで、「生体適合性」とは、生体の免疫機能に障害を与えない性質のことをいうが、優れた生体適合性としては、例えば、非炎症時に感染防御に必要な顆粒球を不必要に多く除去しない特性、易感染性にならないように不必要に多くのリンパ球を除去しない特性等が挙げられる。

また、吸着担体の材料として酢酸セルロースビーズを用いた顆粒球ならびに単球を選択的に除去する吸着担体が開発されている。この吸着担体が顆粒球や単球を除去する機序はいまだ不明な点があるが、活性化された補体成分が顆粒球を活性化することが重要な役割を担っていると推察されている。（非特許文献１）。

しかしながら、上記吸着担体の顆粒球を吸着除去する性能は、補体の活性化の程度に影響を受けるものであり、非炎症時にも活性化顆粒球を作りだし、除去してしまうことから、炎症前後での除去率に差がなく、不必要に多くの顆粒球を除去することになる。このように、吸着担体の材料としての酢酸セルロースの利用は、生体適合性の面から懸念がある。

さらに、ポリエステル不織布を用いたフィルターを用いることにより、白血球の種類を問わず、白血球を除去する材料も開発されている。

しかしながら、上記のフィルターの非炎症時及び炎症時との白血球の除去性能は同等であり、非炎症時においても約９０％以上の白血球が除去されることとなる。このため、異物認識に必要な非炎症時の顆粒球又は免疫機構で重要な役割を担うリンパ球も除去されてしまうことから、やはり生体的適合性の面からの懸念がある（特許文献６）。
特開昭６０−１９３４６８号公報 特開平５−１６８７０６号公報 特開２００２−１７２１６３号公報 特開１９９９−２４４６９３号公報 特開２００２−５３９１７８号公報 特開平８−１０３４９３号公報 鈴木ら、日本アフェレーシス学会雑誌、２００１年、２０巻、１号、ｐ．１７−２６

そこで本発明の目的は、非炎症時の体液中に存在する感染防御に必要な顆粒球や単球を不必要に多く除去することなく、炎症時の体液中に増加する組織傷害に関連する顆粒球や単球を効率的かつ選択的に除去することができ、炎症性疾患に対する優れた治療効果と生体適合性を併せ持つ白血球除去カラムを提供することにある。

上記の課題を達成するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、炎症時の体液中に増加する顆粒球を効率的に除去でき、非炎症時の体液に存在する顆粒球と比較して炎症時の体液に存在する顆粒球を選択的に除去できる白血球除去カラムを見出した。

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）に記載した白血球除去カラムを提供する。
（１）体液から顆粒球を効率的に除去する白血球除去カラムであって、上記白血球除去カラムに充填する吸着担体は、平均直径が０．５〜３０μｍ以下の繊維であり、上記吸着担体の充填率は、９．８〜１９．５体積％であり、炎症時の体液からの顆粒球の除去率は、非炎症時の体液からの顆粒球の除去率と比較して１．２倍以上である、白血球除去カラム。
（２）上記繊維は、表面にアミノ基を有する官能基を有する、（１）に記載の白血球除去カラム。
（３）上記繊維から構成される吸着担体は、シート構造を有する、（１）又は（２）に記載の白血球除去カラム。
（４）インターロイキン−１β、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、ＴＮＦ−αからなる群からなるサイトカインの少なくとも１種類以上のサイトカインを除去する、（１）〜（３）のいずれかに記載の白血球除去カラム。
（５）炎症性疾患の治療に使用する、（１）〜（４）のいずれかに記載の白血球除去カラム。
（６）上記炎症性疾患は、慢性関節リウマチである、（５）に記載の白血球除去カラム。

本発明の白血球除去カラムによれば、炎症時の体液中に増加する顆粒球を効率的かつ選択的に除去することができ、炎症性疾患に対し効果的でかつ生体適合性に優れた治療を実現できる。

以下、本発明を実施するための好ましい実施形態について説明する。

本発明の白血球除去カラムは、体液から顆粒球を効率的に除去する白血球除去カラムであって、上記白血球除去カラムに充填する吸着担体は、平均直径が０．５〜３０μｍ以下の繊維であり、上記吸着担体の充填率は、９．８〜１９．５体積％であり、炎症時の体液からの顆粒球の除去率は、非炎症時の体液からの顆粒球の除去率と比較して１．２倍以上であることを特徴としている。

「体液」とは、ヒト及び動物の体内に存在する液体のことであり、具体的には、組織間や体腔内、あるいは全身に広がった管や循環系の中を満たしている液体又は生体組織若しくは細胞から滲出する液体のことをいう。例えば、血液、リンパ液、組織液、腹水、胸水、羊水又は関節液を挙げることができる。

「顆粒球」とは、白血球の６０％以上を占め、細胞質中に顆粒を有することを特徴とする血球細胞のことであり、好中球、好酸球及び好塩基球に分類される。

「炎症時」とは、ヒト及び動物の体の組織が炎症反応を起こしている状態をいい、「非炎症時」とは、炎症時以外の状態をいう。臨床所見においては、疼痛等の知覚障害や運動障害も炎症時に包含される。

ここで「炎症反応」とは、生体が何らかの有害な刺激を受けた時に起こる防御反応のことをいい、有害な刺激としては、細菌やウイルス等の病原体や自己抗原、熱や放射線等の物理的刺激、酸やアルカリ・薬物等の化学的刺激、その他アレルギー反応等を例示できる。また、炎症反応によって起こる症状として、局所の発赤、発熱、腫脹、出血、潰瘍、痛みが挙げられ、生体内においては、有害な刺激を受けた生体組織、該生体組織若しくは細胞からの滲出液又は血液の中で、顆粒球の増加や活性化が起こることが特徴となる。

顆粒球の活性化とは、顆粒球にサイトカインやケモカイン等の遺伝子の発現が誘導され、これらの翻訳産物であるタンパク質が高発現していることにより判定され、例えば、好中球、好酸球又は塩基球が以下の状態となっている状態を例示できる。
１）好中球は、有害な刺激となる異物を認識すると、異物を細胞内に取り込み、細胞内小胞に存在する酵素（ミエロペルオキシダーゼ、エラスターゼ及びムラミターゼ等）によって異物を消化、殺菌又は分解するが、これらの酵素は細胞外にも放出され、血管透過性を亢進し、異物を認識した組織に好中球の動員を導き、炎症反応を起こすこととなる。その結果、炎症反応を起こしている組織では、好中球は、単球、マクロファージ及び樹状細胞等と相互反応して活性化し、サイトカイン、ケモカイン、活性酸素等を放出することで組織傷害性を示すこととなる。このように、好中球が炎症組織に浸潤し、組織障害性を示している状態は、上記の顆粒球の活性化に該当し、炎症時に包含される。
２）好酸球は、有害な刺激となる異物を認識すると、好中球と同様に、運動能、走化能及び貪食能を示して細胞数が増加し、細胞内に存在するmajor basic protein、eosinophil cationic protein、eosinophil derived neurotoxin及びeosinophil peroxidaseと呼ばれるタンパク質を放出し、組織傷害性を示すこととなる。このように、好酸球が増加し、組織障害性を示している状態は、上記の顆粒球の活性化に該当し、炎症時に包含される。
３）好塩基球は、アレルギー性の炎症反応の進行に重要な働きを示すことが知られており、有害な刺激となる異物を認識すると、脱顆粒して、ヒスタミン、血小板活性化因子、セロトニン及びヘパリンを放出し、血管の透過性を亢進させて、くしゃみ、鼻炎、さらには喘息等でみられる気道収縮を引き起こすこととなる。このように、好塩基球が脱顆粒している状態は、上記の顆粒球の活性化に該当し、炎症時に包含される。

上記の吸着担体は、繊維であり、繊維の材料としては、例えば、有機高分子化合物、無機高分子化合物、金属等を挙げられるが、有機高分子化合物がより好ましい。有機高分子化合物としては、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ナイロン（登録商標）６、ナイロン（登録商標）６６等のポリアミドや、ポリオレフィン、ポリエステル等を例示できる。

ポリオレフィンとは、アルケン若しくはアルキンを単独重合又は共重合させて得られたポリマーをいい、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン等の単独重合により得られたポリオレフィン又はポリプロピレン−ポリエチレン共重合体、ポリブチレン−ポリプロピレン共重合体等の共重合により得られたポリオレフィンが挙げられる。

ポリエステルとしては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート及びポリオキシエチレンテレフタレートが挙げられる。吸着担体にサイトカインに対する吸着能を有する官能基を導入するには、特に、芳香環を有するポリスチレン又はポリスルホンがより好ましい。

上記の吸着担体となる繊維は、顆粒球の貪食作用を利用して顆粒球を除去するために、その平均直径が０．５〜３０μｍ以下であることが好ましく、４〜１０μｍであることがより好ましく、５〜１０μｍであることがさらに好ましい。また、繊維の断面形状は円形断面であることが好ましいが、それ以外の異形断面であっても適用できる。

吸着担体の平均直径とは、吸着担体を無作為に１０サンプル採取し、走査型電子顕微鏡で１０００〜３０００倍の写真を撮影し、１サンプルあたり１０箇所（合計１００箇所）の直径を測定した値の平均値のことをいう。なお、吸着担体のサンプルの測定断面が楕円、矩形又は多角形状である場合には、最外層を結んでできた図形の面積に相当する円の直径を、突起部分が存在する凸凹の形状の場合は、全ての突起部分の頂点を結んでできた図形の面積に相当する円の直径を、平均直径を算出するためのデータとして採用すればよい。

上記繊維は、表面にアミノ基を有する官能基を有することが好ましく、アミノ基によりサイトカインの吸着能をより高めることができる。

上記のアミノ基を有する官能基としては、例えば、アミノ基を有する環状ペプチド残基、ポリアルキレンイミン残基、ベンジルアミノ基又は１〜３級のアルキルアミノ基が挙げられ、１〜３級のアルキルアミノ基又はポリアルキレンイミン残基が好ましく、１〜３級のアルキルアミノ基がより好ましい。

アミノ基を有する環状ペプチドとしては、側鎖に１個以上のアミノ基を有するものであればよいが、２〜５０個以下のアミノ酸からなる環状ペプチドが好ましく、４〜１６個以下のアミノ酸からなる環状ペプチドがより好ましい。例えば、好適な具体例として、ポリミキシンＢ、ポリミキシンＥ、コリスチン、グラミシジンＳ並びにこれらのアルキル誘導体及びアシル誘導体が挙げられる。

ポリアルキレンイミン残基としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリヘキサメチレンイミン、ポリ（エチレンイミン・デカメチレンイミン）共重合体に代表されるポリアルキレンイミン、該ポリアルキレンイミンの窒素原子の一部をハロゲン化炭化水素（例えば、ｎ−ヘキシルブロマイド、ｎ−デカニルブロマイド、ｎ−ステアリルブロマイド等）若しくはそれらの混合物でアルキル化したもの又は該ポリアルキレンイミンの窒素原子の一部を酪酸、バレイン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、レノレイン酸、ステアリル酸等の脂肪酸でアシル化したものが挙げられる。

アミノ基としては、１〜３級アミノ基が好ましく、サイトカインに対する吸着性の観点からは、窒素原子１個当たり炭素原子数３〜１８以下である１〜３級アミノ基がより好ましく、窒素原子１個当たり炭素数４〜１８以下である１〜３級アミノ基がさらに好ましい。

その具体例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルラウリルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ−エチル−ヘキシルアミン、テトラエチレンペンタミン等が挙げられるが、以下で説明するサイトカインに対する吸着能を高めるためには、テトラエチレンペンタミンであることが特に好ましい。なお、上記のアミノ基を有する官能基中に複数のアミノ基が存在する場合には、テトラエチレンペンタミン由来の官能基のように、それぞれのアミノ基が官能基の同一鎖上に存在することが好ましい。

また、アミノ基の結合の密度は、吸着担体の繰り返し単位あたり０．０１〜２．０モル以下が好ましく、０．１〜１．０モル以下がより好ましい。なお、アミノ基の結合の密度は、吸着担体の化学構造及び用途により異なるが、少なすぎるとその機能が発現しない傾向にあり、一方、多すぎると、固定化後の吸着担体の物理的強度が悪くなり、吸着担体としての機能も下がる傾向にある。

上記の繊維から構成される吸着担体は、シート状であることが好ましく、シート状の繊維としては、フェルト、編地、織物、ネット等を例示できる。シート状の繊維の製造は、当業者が利用可能な公知技術を使えば製造でき、例えば、カーディング法、エアレイ法、スパンボンド法、メルトブロー法といった公知の不織布の製造方法を用いることができる。

シート状の吸着担体は、特に不織布とした場合において、その形態保持性の向上のために、ネットとの２層以上の構造とすることが好ましい。かかる２層以上の構造とは、主に積層構造を指す。積層構造は、不織布とネットの２層構造でもよいが、不織布の間にネットを挟み込んだ形状、すなわち不織布−ネット−不織布のサンドイッチ構造をとることがより好ましい。

上記の白血球除去カラムは、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性関節リウマチ及び急性肺損傷等への関与が指摘されるサイトカインを１種類以上除去できることが好ましく、このようなサイトカインとしては、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、ＴＮＦ−αを例示できる。

また、上記の白血球除去カラムは、当業者が通常行っている手法によって、上記の吸着担体を無菌的にカラムに充填すれば作製できるが、その充填率は、９．８〜１９．５体積％であることが好ましく、１２．７〜１８．５体積％であることがより好ましい。

吸着担体の充填率は、７．８体積％以下の場合、炎症時の顆粒球の除去率が３５％以下となり、炎症性疾患を治療するには十分な効果が得られないことが予測される。一方、充填率が２１．５体積％以上の場合は、炎症性疾患の治療において除去することが好ましくないリンパ球の除去率を顕著に高めてしまい、炎症性疾患患者の免疫機能を低下させ、さらには、治療効果を低下させる可能性がある。

ここで、充填率とは、吸着担体の体積を吸着担体充填部の体積で除し、１００を乗じた値である。

以下に、吸着担体の体積及び吸着担体充填部の体積の測定方法を規定する。
（吸着担体の体積の測定方法）
超純水の比重は１として体積換算する。

まず、吸着担体が入るメスシリンダーを準備し、その中にカラムから取り出した吸着担体を入れ、超純水を吸着担体が十分沈むまで隙間なく充填し、充填した超純水の容積をメスシリンダーで測定し、得られた値（ｍＬ）を容積Ａとする。その際、気泡が残存しないように注意する。

その後、メスシリンダーから吸着担体を取り出し、水を含んだままの吸着担体の湿質量を電子天秤で測定し、得られた値（ｇ）を湿質量Ｂとする。その際、吸着担体に含まれている水はこぼさないように注意する。３０℃に設定した真空乾燥機で吸着担体を乾燥させ、吸着担体の乾燥質量を電子天秤で測定し、得られた値（ｇ）を乾燥質量Ｃとする。乾燥したことを判断するには、乾燥質量を２回測定した時の質量差が１％以下であることを指標にできる。なお、乾燥質量を２回測定する間隔は１時間とする。

最後に、吸着担体を取り出した後に残余した超純水の容積をメスシリンダーで測定、得られた値を（ｍＬ）を容積Ｄとする。

その結果、吸着担体の体積は、以下の式１で算出する。

吸着担体の体積＝容積Ａ−（（湿質量Ｂ−乾燥質量Ｃ）＋容積Ｄ）・・・・・・式１
（吸着担体充填部の体積の測定方法）
吸着担体充填部の体積とは吸着担体が充填された部分の体積を言い、その他血液流路を規定させるための部材や、流路そのものの空間などは含まない。例えば、吸着担体と、円筒状の筒の間に血液流路のための空隙があれば、除いて計算する。吸着担体の最外層は、細かな凹凸が認められる場合が多いが、面として考える。ノギス等を用い、計測し、計算によって容易に求めることが出来る。形状が複雑で計測が不能な場合も、それぞれの部材を実測することによって容易に求めることができる。

上記の白血球除去カラムは、炎症時の体液からの顆粒球の除去率が、非炎症時の体液からの顆粒球の除去率と比較して１．２倍以上であることが好ましく、１．５倍以上であることがより好ましく、１．７倍以上であることがさらに好ましい。この場合、上記の白血球除去カラムは、免疫機能を維持する観点から、リンパ球の除去率が５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがより好ましい。

既に説明した通り、炎症時の顆粒球は活性化しており、活性化した顆粒球は炎症性疾患の原因となり得る一方で、活性化していない顆粒球は、健常な人の免疫機能の維持に重要な役割を担っているため、炎症時の顆粒球を１．２倍以上選択的に除去できることは、炎症性疾患患者の免疫機能を低下させることなく、治療効果を発揮する上で非常に有用である。なお、顆粒球の除去率は、以下の式２により算出される。

顆粒球の除去率（％）＝｛（カラム入口の顆粒球数−カラム出口の顆粒球数）／カラム入口の顆粒球数}×１００・・・・・・式２
式中の「カラム入口の顆粒球数」及び「カラム出口の顆粒球数」は、例えば、自動血球計測装置を使用すれば容易に測定できる。自動血球計測装置としては、例えば、ＸＴ−１８００ｉ（シスメックス株式会社）が挙げられる。

また、炎症時の体液からの顆粒球の除去率と非炎症時の体液からの顆粒球の除去率とを比較した値は、除去率比として、以下の式３により算出される。

除去率比＝炎症時の体液からの顆粒球の除去率／非炎症時の体液からの顆粒球の除去率・・・・・・式３
除去率比は、高い値を示す程好ましく、白血球除去カラムの技術分野で、従来から使用されている白血球除去カラムでは、炎症時に非炎症時に比べ高率に白血球を除去する機能を備えているものは知られていない。除去率比が１．２以上となることで、非炎症時に存在する感染防御に必要な白血球の除去を抑え、炎症性疾患患者に対して、より治療効果が期待できる白血球を選択的に除去することが出来、治療効果を示すことが予測される。

顆粒球の除去率比の評価法としては、以下の方法を用いた。
（顆粒球の除去率比の評価法）
１）ウサギ関節炎モデルの作製
卵白アルブミン（シグマ社）とフロイント完全アジュバント（Freund’s complete adjuvant）を１：１の質量比（各４ｍｇ）で混合した混合溶液を、ウサギ（日本白色種、雄、体重約３ｋｇ）の皮内に投与し、投与から１４日後に、再度、上記と同じ組成の卵白アルブミンとフロイント完全アジュバント（Freund’s complete adjuvant）の混合溶液を調製して２回目の投与を行う。２回目の投与から５日後に、同一のウサギの右膝関節に卵白アルブミンを投与し、関節炎を惹起させ、ウサギ関節炎モデルを作製する。なお、左膝関節には、コントロールとして卵白アルブミンの代わりに生理食塩液を投与する。この評価ではウサギは３羽以上を用いて実施する。
２）ウサギ関節炎モデルにおける顆粒球の除去率の評価
上記の方法により作製したウサギ関節炎モデルに対し、吸着担体を充填したカラムを用いて血液の体外循環を実施して、白血球の除去性能を評価する。体外循環のヘパリンの使用量は、３０ＩＵ／ｋｇ／ｈｒ（ヘパリン加生理食塩液濃度：２０ＩＵ／ｍＬ）とする。血液の体外循環は、惹起後１０分（非炎症時）及び２４時間（炎症時）のそれぞれの時点において、ウサギの耳動静脈を使って実施する。血流速は２ｍＬ/分の流量で各々３０分間実施し、体外循環の終了後３０分が経過した時点で、カラムの入口手前と出口から出た血液を採取し、顆粒球の数（必要時には、顆粒球に加えてリンパ球の数）を自動血球計測装置により測定する。非炎症時及び炎症時の各時点において、カラムの入口から採取した血液中の顆粒球の数（カラム入口の顆粒球数）と出口から採取した血液中の顆粒球の数（カラム出口の顆粒球数）を、上記の式２に当てはめることにより顆粒球の除去率を算出する。除去率は３羽以上で実施された値の平均値を用いて評価する。
３）除去率比
式３に従い３羽以上で実施された値の平均値を用い除去率比を求める。

上記の白血球除去カラムは、炎症性疾患の治療に使用するものであることが好ましい。炎症性疾患としては、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性関節リウマチ、乾癬、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、成人スティル病、血球貪食症候群、多発性硬化症、急性肺損傷（ＡＲＤＳ／ＡＬＩ）、特発性肺線維症、間質肺炎等を挙げられ、上記の白血球除去カラムが治療効果を発揮する炎症性疾患としては、慢性関節リウマチがより適している。

以下の実施例において本発明をさらに具体的に説明するが、発明の内容がこれらに限定されるものではない。

慢性関節リウマチモデルとしてウサギ関節炎モデルを作製し、白血球除去カラムによる顆粒球及びリンパ球の除去作用について試験した。ウサギ関節炎モデルの作製ならびに顆粒球の除去率比、リンパ球数の測定は上記の方法を用いた。なお、採取した顆粒球ならびにリンパ球は自動血球計測装置（ＸＴ−１８００ｉ；シスメックス株式会社）を用いて測定した。
（ウサギ関節炎モデルにおけるリンパ球の除去率の評価法）
ウサギ関節炎モデルにおけるリンパ球の除去率の評価法を算出する式を以下に示す。

リンパ球の除去率（％）＝｛（カラム入口のリンパ球数−カラム出口のリンパ球数）／カラム入口のリンパ球数}×１００
（ウサギ関節炎モデルの関節炎の評価）
また、ウサギ関節炎モデルの関節炎の症状については、関節炎によって生じる膝関節部の腫脹を指標として、関節腫脹径を測定することによって評価した。

具体的には、惹起前と惹起後４８時間経過時点で、ウサギ関節炎モデルの膝関節部分を添木で直角に曲げ、膝関節部分の横幅をデジタルノギス（Ｄｉｇｉｍａｔｉｃ Ｃａｌｉｐｅｒ、ＣＤ−１５ＣＸ；ミツトヨ社）で３回測定し、以下の式より関節腫脹径を算出しその平均値を用いた。

関節腫脹径（ｍｍ）＝関節径Ａ−関節径Ｂ
関節径Ａ（ｍｍ）＝惹起後４８時間経過時点の右膝関節径−惹起後４８時間経過時点の左膝関節径
関節径Ｂ（ｍｍ）＝惹起前の右膝関節径−惹起前の左膝関節径
さらに、炎症反応の有無を確認すべく、それぞれの体外循環を実施する前に血清中のＣＲＰ濃度を測定した。

上記ＣＲＰ濃度は、具体的には、採取した血清を、ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ(レビス ＣＲＰ−ウサギ；シバヤギ社)を用いて、当該キットに示された方法に従って測定した。
（材料Ａの作製）
３６島の海島複合繊維であって、島がさらに芯鞘複合によりなるものを次の成分を用いて、紡糸速度８００ｍ／分、延伸倍率３倍の製糸条件で得た。

島の芯成分： ポリプロピレン
島の鞘成分： ポリスチレン９５質量％、ポリプロピレン５質量％
海成分： エチレンテレフタレート単位を主たる繰り返し単位とし、共重合成分として５−ナトリウムスルホイソフタル酸３質量％含む共重合ポリエステル
複合比率（質量比率）： 芯：鞘：海＝４５：４０：１５
この繊維８５質量％と直径２０μｍのポリプロピレン繊維１５質量％からなる不織布を作製した後、この不織布２枚の間にシート状のポリプロピレン製ネット（厚さ：０．５ｍｍ、単糸径：０．３ｍｍ、開口部：２ｍｍ角）を挟み、ニードルパンチすることによって３層構造の担体を得た。

次に、この不織布を９５℃、３質量％の水酸化ナトリウム水溶液で処理し、海成分のエチレンテレフタレート単位を主たる繰り返し単位とし、共重合成分として５−ナトリウムスルホイソフタル酸３質量％含む共重合ポリエステルを溶解することによって、芯鞘繊維の直径が４．５μｍで、嵩密度が０．０２５ｇ／ｃｍ^３の不織布を作製した。

次に、ニトロベンゼン４６質量％、硫酸４６質量％、パラホルムアルデヒド０．８質量％、Ｎ−メチロール−α−クロルアセトアミド（以下、ＮＭＣＡ）７．２質量％を１０℃以下で混合、撹拌、溶解し、ＮＭＣＡ化反応液を調製した。このＮＭＣＡ化反応液を１５℃にし、不織布１ｇに対し、約４０ｍＬの固液比でＮＭＣＡ化反応液を加え、水浴中で反応液を１５〜２０℃に保ったまま２時間反応させた。

その後、反応液から不織布を取り出し、ＮＭＣＡ反応液と同量のニトロベンゼンに浸漬し洗浄した。引き続き、不織布を取り出し、メタノールに浸漬し洗浄を行い、α−クロルアセトアミドメチル化ポリスチレン不織布（中間体１）を得た。また、テトラエチレンペンタミン６．３ｇ、ｎ−ブチルアミン７．２ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５００ｍＬに溶解した液に１０ｇの中間体１を浸し、３０℃で３時間反応させ、ＤＭＦで洗浄した後に水洗し、真空乾燥することにより、中間体１から１３．９ｇのテトラエチレンペンタミン化繊維（以下、吸着担体Ａ）を得た。
（吸着担体Ａのカラムへの充填）
ミニカラム（直径１０ｍｍ×長さ２３．４９ｍｍ、吸着担体充填部体積：１．８４ｃｍ^３）１本当たり、直径１０ｍｍに打ち抜いた吸着担体Ａをカラムにそれぞれ充填（充填率：７．８〜２１．５体積％）した。その後、ミニカラム内を注射用水（大塚製薬）で満たした後、高圧蒸気滅菌を行った。充填枚数及び充填率は、表１の通りである。

なお、充填率の測定方法は上記の方法と同様であるが、ここではミニカラムを用いて充填率を算出している。ミニカラムの充填率の算出には、製品形態のカラムでみられるような吸着担体を充填していない空間体積も考慮に入れて、吸着担体充填部体積を算出し、充填率を求めた。充填率（体積％）の算出式を以下に示す。

充填率（体積％）＝吸着担体の体積／吸着担体充填部の体積×１００
吸着担体充填部の体積＝カラムの空間体積−吸着担体を充填していない空間体積（カラムを使用した時に体液のみが充填される部分の体積）
（酢酸セルロースビーズのカラムへの充填）
直径が約２ｍｍの酢酸セルロースビーズを作成し、１３．０６ｇを直径１５ｍｍのシリコンチューブに充填し、その上下に回路との接続のためのフィッティングを取り付けた（吸着担体体積：１０．０７ｃｍ^３）。その後、シリコンチューブ内を生理食塩液（大塚製薬）で満たし、内径１５ｍｍ×長さ１０５ｍｍのカラムを作製した（吸着担体充填部体積：１８．６ｃｍ^３）。作製したカラムは高圧蒸気滅菌を実施した。
（実施例１〜４）
上記の顆粒球の除去率比の評価法に従い、体外循環を実施し、吸着担体Ａを充填したカラムを評価した（１群：Ｎ＝３）。吸着担体Ａの充填率は９．８、１２．７、１８．５、１９．５体積％とした。その結果を表２及び図１に示す。
（比較例１）
上記の顆粒球の除去率比の評価法に従い、体外循環を実施し、吸着担体Ａを充填したカラムを評価した（１群：Ｎ＝３）。吸着担体Ａの充填率は２１．５体積％とした。その結果を表２及び図１に示す。

表２の結果より、吸着担体Ａの充填率が９．８〜１９．５体積％以下の範囲では非炎症時と炎症時の除去率比が１．２以上となり、非炎症時の顆粒球の除去率は抑えられる一方で炎症時の顆粒球は高率に除去された。さらにリンパ球の除去率は５０％以下を示し、リンパ球に対しても生体適合性が高いことが確認できた（実施例１〜４）。一方、充填率が７．８体積％では炎症時の顆粒球の除去率が低く、関節径の腫脹を指標とした治療効果は低かった。一方、充填率が２１．５体積％になると、免疫機能の担い手のリンパ球の除去率が高くなることや、非炎症時の顆粒球の除去率が高まることが示され生体適合性の低下が見られた（比較例１）。

これらの結果より、吸着担体Ａを充填率９．８〜１９．５体積％以下の範囲で充填することによって、炎症時の顆粒球の除去率は非炎症時の除去率と比較して１．２倍以上と高率に除去する機能を有し、さらにリンパ球の除去率を５０％以下に抑えることにより生体適合性に優れた白血球除去カラムであることが示された。
（比較例２）
顆粒球の除去率比の評価法に従い、体外循環を実施し、酢酸セルロースビーズを充填したカラムを評価した（１群：Ｎ＝３）。その結果を表３に示す。

表３の結果より、酢酸セルロースビーズを充填したカラムでは炎症時の血液からの顆粒球の除去率が、非炎症時の血液からの顆粒球の除去率と比較して１未満であることが分かり、非炎症時の顆粒球の除去率は炎症時と比較するとやや高い傾向が示された。つまり、炎症時に増加する顆粒球を高率に除去する機能を有しておらず、非炎症時も炎症時も同様な顆粒球の除去率であった。
（実施例５〜８）
上記のウサギ関節炎モデルの関節炎の評価法に従い、体外循環を実施し、吸着担体Ａを充填したカラムを用いて、炎症時の顆粒球の除去率、顆粒球の除去率比及び関節腫脹径を評価した。吸着担体Ａの充填率は９．８、１２．７、１８．５、１９．５体積％とした。その結果を表４に示す。
（比較例３）
上記のウサギ関節炎モデルの関節炎の評価法に従い、体外循環を実施し、吸着担体Ａを充填したカラムを用いて、関節腫脹径を評価した。吸着担体Ａの充填率は７．８体積％とした。その結果を表４に示す。
（比較例４）
上記のウサギ関節炎モデルの関節炎の評価法に従い、体外循環を実施し、吸着体を充填していないＳｈａｍカラムを評価した（１群：Ｎ＝３）。Ｓｈａｍカラムは、直径７ｍｍのシリコンチューブを用意し、上下に回路との接続の為のフィッティングを取り付け、内径７ｍｍ×長さ１００ｍｍのカラムを作製した（プライミング容量：４．０８ｍＬ）。その後、ＥＯＧ滅菌を行った。その結果を表４に示す。

表４の結果より、吸着担体Ａを９．８〜１９．５体積％以下で充填したカラムは炎症時に高率に顆粒球を除去するほど、関節腫脹径の抑制効果が認められていることが示された（実施例５〜８）。一方、吸着担体Ａを７．８体積％で充填したカラムは顆粒球の除去率の比が１．２以上を示すものの、炎症時の顆粒球の除去率が低く、関節腫脹径の抑制効果も低いことが示された（比較例３）。また、Ｓｈａｍカラムでは、炎症時の顆粒球の除去率が極めて低く関節腫脹径の抑制効果が認められなかった（比較例４）。以上のことより、吸着担体Ａを９．８〜１９．５体積％以下で充填したカラムは炎症時に高率に顆粒球を除去することが示され、Ｓｈａｍカラムと比較しても、関節腫脹径の抑制が示され、炎症の治療効果が示された。

本発明の白血球除去カラムは、炎症時の体液中に増加する顆粒球を効果的に除去できるため、炎症性疾患の治療効果を高め、生体適合性に優れた炎症性疾患の治療用途に用いることができる。

吸着担体充填率（％）と顆粒球除去率比の関係を示したグラフである。

Claims (6)

1. 体液から顆粒球を効率的に除去する白血球除去カラムであって、
   前記白血球除去カラムに充填する吸着担体は、平均直径が０．５〜３０μｍ以下の繊維であり、
   前記吸着担体の充填率は、９．８〜１９．５体積％であり、
   炎症時の体液からの顆粒球の除去率は、非炎症時の体液からの顆粒球の除去率と比較して１．２倍以上である、白血球除去カラム。
2. 前記繊維は、表面にアミノ基を有する官能基を有する、請求項１記載の白血球除去カラム。
3. 前記繊維から構成される吸着担体は、シート構造を有する、請求項１又は２記載の白血球除去カラム。
4. インターロイキン−１β、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、ＴＮＦ−αからなる群からなるサイトカインの少なくとも１種類以上のサイトカインを除去する、請求項１〜３のいずれか一項記載の白血球除去カラム。
5. 炎症性疾患の治療に使用する、請求項１〜４のいずれか一項記載の白血球除去カラム。
6. 前記炎症性疾患は、慢性関節リウマチである、請求項５記載の白血球除去カラム。

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