JP2010035459A - 酵素遺伝子スクリーニング法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】スクリーニング標的となる酵素遺伝子を保持する細胞に、その酵素反応により生じる物質(生成物)によって発現が誘導される遺伝子ユニット(例えば転写制御因子やリボスイッチ)と該酵素遺伝子発現を検出するレポーター遺伝子とを含むセンシングベクターを導入するか、あるいは該ベクターを導入したセンシング細胞と上記標的酵素遺伝子保持細胞とを共培養し、レポーター遺伝子の発現の有無を指標にして、目的の酵素遺伝子を含有する細胞あるいは目的とする酵素遺伝子をスクリーニングする。
【選択図】なし
Description
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(2)探索対象細胞が複合生物群の細胞であることを特徴とする、上記(1)に記載の方法。
(3)探索対象細胞が、遺伝子ライブラリーを構成する各クローン化遺伝子を含む細胞であることを特徴とする上記(1)又は(2)に記載の方法。
(4)遺伝子ライブラリーが、単一生物の遺伝子から構成されるライブラリーである、上記(3)に記載の方法。
(5)遺伝子ライブラリーが、複合生物群の遺伝子から構成されるライブラリーであることを特徴とする、上記(3)に記載の方法。
(6)探索対象細胞と、上記センシングベクターを導入したセンシング細胞とがゲルマイクロドロップに封入されていることを特徴とする上記(1)〜(5)に記載の方法。
(7)ゲルマイクロドロップをフローソーティングによって選別することを特徴とする、上記(6)に記載の方法。
(8)センシング細胞が、細胞膜の物質透過性の促進処理剤により処理されたものであることを特徴とする、上記(1)〜(7)に記載の方法。
(9)レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする、上記(1)〜(8)に記載の方法。
(10)レポーター遺伝子が、蛍光物質生成酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、上記(1)〜(8)に記載の方法。
(11)レポーター遺伝子が、色素生成酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、上記(1)〜(8)に記載の方法。
(12)レポーター遺伝子が、薬剤耐性を付与する遺伝子であることを特徴とする、上記(1)〜(8)に記載に方法。
(13)標的酵素遺伝子の発現により活性化される遺伝子発現因子が、転写制御因子をコードする遺伝子であることを特徴とする上記(1)〜(12)に記載の方法。
(14)標的酵素遺伝子の発現により活性化される遺伝子発現因子が、RNAリボスイッチをコードする遺伝子であることを特徴とする、上記(1)〜(12)に記載の方法。
(15)細胞中の標的酵素遺伝子のスクリーニングに用いるセンシングベクターであって、標的酵素遺伝子の発現により活性化される遺伝子発現因子と該遺伝子発現因子の活性化により誘導発現されるレポーター遺伝子を含む上記センシングベクター。
(16)細胞中の標的酵素遺伝子のスクリーニングに用いるセンシング細胞であって、標的酵素遺伝子の発現により活性化される遺伝子発現因子と該遺伝子発現因子の活性化により誘導発現されるレポーター遺伝子とを含む上記センシングベクターが導入された、上記センシング細胞。
このような酵素遺伝子の検出手段のより具体的な例は、予め目的の酵素活性により生じる生成物によって活性化される遺伝子発現因子と該因子の活性化により発現が誘導されるレポーター遺伝子を組み込んだベクター及び該ベクターを保持した細胞である。本明細書においては、上記ベクターをセンシングベクターといい、上記細胞をセンシング細胞という。
探索対象細胞中に標的酵素遺伝子が存在し、該酵素遺伝子が発現すると、基質は酵素反応により変換され、生じた生成物は、センシングベクター上の遺伝子ユニットである遺伝子発現因子を活性化し、レポーター遺伝子の発現が起きる。レポーター遺伝子の発現した探索対象細胞は標的酵素遺伝子が存在する細胞である。これにより、標的酵素遺伝子を含有する細胞を選別でき、さらに、該細胞から標的酵素遺伝子を得ることができる。
さらに、本発明においては、特に遺伝子ライブラリーを構築せずに、個々に分離された細胞を標的酵素遺伝子の探索対象細胞としてもよく、例えば、環境サンプル等の複合生物群を構成する各細胞を分離し、これら細胞をそのまま標的酵素遺伝子の探索対象細胞として用いてもよい。また、細胞の種類も特に限定されず、微生物、動物あるいは植物等の各種の細胞を用いることができる。
本発明の方法によってスクリーニング可能な酵素遺伝子の一例は、特定の化合物の変換反応を触媒する酵素遺伝子である。例えば、ベンズアミドのアミド基に水分子由来のヒドロキシイオンを導入し安息香酸を生産する酵素「ベンズアミド アミドハイドロラーゼ (benzamide amidohydrolase EC 3.5.1.4) (Wu S, Fallon RD, Payne MS. Cloning and nucleotide sequence of amidase gene from Psudomonas putida. DNA Cell Biol. 1998 17:915-920.)などが該当する。さらに、エステラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、トランスアミナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、キチナーゼ、オキシゲナーゼ、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナーゼ、キシラナーゼ又はセルラーゼなども含まれるが、これらに限定されない。
本発明においては、例えば、遺伝子ライブラリー中の酵素遺伝子をスクリーニングする場合、遺伝子ライブラリーを構築した細胞群をさらにセンシングベクターで形質転換させ、ライブラリーとセンシングベクターを同一細胞内に含む細胞群を作製する。あるいはセンシングベクターを用いて遺伝子ライブラリーを作製することも可能である。
一方、本発明においては、上記したように、遺伝子ライブラリーとセンシングベクターをそれぞれ別の細胞群として作製しても構わない。この場合スクリーニングを行う対象として遺伝子ライブラリーを構築せずに複合生物群の各細胞を用いることも可能である。
この場合、レポーター遺伝子にコードされた酵素が、蛍光などを発しない物質を、蛍光などを発する物質に変換することが望ましい。これにより、フローソーティングを用いて、発光細胞(レポーター遺伝子が発現した細胞)と非発光細胞(レポーター遺伝子が発現していない細胞)を高効率に選別できるようになる。
上記の酵素遺伝子クローニング法により選択されたクローン化ベクターにおける挿入配列を解読した後、そこから設計されたプローブやプライマーを用いたハイブリダイゼーションやPCRを行えば、周辺の遺伝子断片を獲得できる。このようにして、遺伝子の全体や近傍酵素遺伝子を獲得でき、また酵素遺伝子オペロンの全体構造を明らかにすることも可能になる。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例には限定されない。
始めに、センシングベクター p19GFPbenR(配列番号1)の構築を行った。p19GFPbenRは、ベクター pUC19 (TaKaRa)のlac プロモーターとは逆方向にbenR遺伝子とgfp遺伝子を挿入し、GFPの発現が安息香酸によって誘導されるように構築したものである(図3)。p19GFPbenRによって形質転換された大腸菌(Escherichia coli JM109)が、1 mM安息香酸の存在下でGFPの発現をフローサイトメーターFACSVantage SE (Becton Dickinson)により確認したところ、蛍光検出器において非常に強い蛍光を検出できた(図5)。一方でベクターpUC19によって形質転換された大腸菌や、安息香酸で誘導をかけない形質転換体および安息香酸アミドを培地中に加えた形質転換体は、全く蛍光を発しないことも確認した。これらの現象は位相差蛍光顕微鏡 (OLYMPUS) による観察(図6)や蛍光分光光度計(SpectraMAX Gemini XS; Molecular Devices)によっても確認された(図7)。
1.5倍濃度のPBS溶液1Lの組成; 12 g NaCl, 0.3 g KCl, 1.65 g Na2HPO4, 0.3 g KH2PO4を950 mlの蒸留水に溶かし、HClを用いてpH 7.4に調製した。1 Lに調製してオートクレーブを用いて滅菌処理したのち、0.22μmのポアサイズフィルターを用いて微粒子の除去をおこなった。
次に、センシングベクターとライブラリーが別々の細胞内に存在する場合のスクリーニング法によっても目的の酵素遺伝子が獲得できるか確認する為、メタゲノムライブラリーからベンズアミダーゼ活性を保持するクローンのスクリーニングを試みた。〔実施例1〕と同様にメタゲノムライブラリーはSuenagaらの作製した活性汚泥由来メタゲノムライブラリーを使用した。一方センシングベクターは新たに構築したpCmGFPbenR(配列番号2)を使用した。
Trace element solutionの組成;FeCl2・4H20 1.5 gを7.7 M HCl 20 mlに溶解させた。これを950 mlの蒸留水で希釈し、ZnCl2 0.07 g, MnCl・4H2O 0.1 g, H3BO3 0.006 g, CoCl・6H2O 0.19 g, CuCl2・2H2O 0.002 g, NiCl2・6H2O 0.024 g, Na2MoO4・2H2O 0.036 gをそれぞれ溶解させ、1 Lに調製したのち0.22μmのポアサイズフィルターを用いてろ過滅菌をおこなった。
ゲルマイクロドロップ法を用いてセンシングベクターとライブラリーが別々の細胞内に存在する場合のスクリーニング法によって目的の酵素遺伝子が獲得できるか確認する為、メタゲノムライブラリーから安息香酸アミダーゼ遺伝子のクローニングを試みた。メタゲノムライブラリーはSuenagaらの作製した活性汚泥由来メタゲノムライブラリーを使用し、センシング細胞としてpCmGFPbenRで形質転換された大腸菌を使用した。
次に予めLB液体培地中で対数増殖期まで培養したセンシング細胞を集菌し、1 x 10の9 乗cells/mlになるようにPBSで希釈し、前述のメタゲノムライブラリーと混合した。
このアガロース・微生物混合液を5倍量の1% (vol./vol.) Span 80 (Sigma-Aldrich)含有ミネラルオイル (Sigma-Aldrich)に加え、軽く攪拌した。この混合物をシリンジですべて吸い取り、そのシリンジにSPG膜乳化モジュール (SPGテクノ社)を取り付け、加圧してミネラルオイル中に均一なアガロース・微生物混合液含有ミセルを作成した。得られたミセルを5分間氷冷し、アガロースをゲル化させることによって、ゲルマイクロドロップを得た。
フローサイトメーターFACSVantage SE (Becton Dickinson)の設定;488 nmレーザーを出力0.5 Wに設定、シース圧は9 psiに設定した。ノズルは100μmを使用した。シース液には1.5倍濃度のPBS溶液を使用した。細胞分取の際は、ドロップドライブ頻度を16 kHz前後に設定、Counterモードを選択し、ドロップディレイを12から18の間に設定した。フローサイトメーターで得られる情報はCellQuest software (BD Biosciences)によって解析した。96ウェルプレート上へのゲルマイクロドロップの回収は、CloneCyt Plusを用いて行った。
Claims (16)
- (A)標的酵素遺伝子の探索対象細胞に、標的酵素遺伝子の発現により活性化される遺伝子発現因子と該遺伝子発現因子の活性化により誘導発現されるレポーター遺伝子とを含むセンシングベクターを導入し、得られる形質転換細胞を培養するか、あるいは(B)上記探索対象細胞と、上記センシングベクターを導入したセンシング細胞とを混合培養するとともに、培地に標的酵素遺伝子の基質化合物を含有せしめ、レポーター遺伝子の発現の有無を指標にして、標的酵素遺伝子を含有する細胞を検出することを特徴とする、標的酵素遺伝子を含有する細胞、あるいは標的酵素遺伝子をスクリーニングする方法。
- 探索対象細胞が複合生物群の細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 探索対象細胞が、遺伝子ライブラリーを構成する各クローン化遺伝子を含む細胞であることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 遺伝子ライブラリーが、単一生物の遺伝子から構成されるライブラリーである、請求項3に記載の方法。
- 遺伝子ライブラリーが、複合生物群の遺伝子から構成されるライブラリーであることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 探索対象細胞と、上記センシングベクターを導入したセンシング細胞とがゲルマイクロドロップに封入されていることを特徴とする請求項1〜5に記載の方法。
- ゲルマイクロドロップをフローソーティングによって選別することを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- センシング細胞が、細胞膜の物質透過性の促進処理剤により処理されたものであることを特徴とする、請求項1〜7に記載の方法。
- レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項1〜8に記載の方法。
- レポーター遺伝子が、蛍光物質生成酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項1〜8に記載の方法。
- レポーター遺伝子が、色素生成酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項1〜8に記載の方法。
- レポーター遺伝子が、薬剤耐性を付与する遺伝子であることを特徴とする、請求項1〜8に記載に方法。
- 標的酵素遺伝子の発現により活性化される遺伝子発現因子が、転写制御因子をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項1〜12に記載の方法。
- 標的酵素遺伝子の発現により活性化される遺伝子発現因子が、RNAリボスイッチをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項1〜12に記載の方法。
- 細胞中の標的酵素遺伝子のスクリーニングに用いるセンシングベクターであって、標的酵素遺伝子の発現により活性化される遺伝子発現因子と該遺伝子発現因子の活性化により誘導発現されるレポーター遺伝子を含む上記センシングベクター。
- 細胞中の標的酵素遺伝子のスクリーニングに用いるセンシング細胞であって、標的酵素遺伝子の発現により活性化される遺伝子発現因子と該遺伝子発現因子の活性化により誘導発現されるレポーター遺伝子とを含む上記センシングベクターが導入された、上記センシング細胞。
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JPN6013019495; 化学と生物 Vol.43, No.2, 2005, p.115-120 * |
JPN6013019496; Nature biotechnology Vol.23, No.1, 2005, p.88-93 * |
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