JP2010011847A - Method for producing royal jelly having hypotensive effect - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造方法、並びに、該方法によって得られるローヤルゼリーを含有するローヤルゼリー組成物および血圧降下剤に関する。 The present invention relates to a method for producing a royal jelly having a blood pressure lowering action, and a royal jelly composition and a blood pressure lowering agent containing the royal jelly obtained by the method.
ローヤルゼリーとは、若い働き蜂の咽頭腺により分泌される乳白色したペースト状物質であり、その成分は必須アミノ酸をはじめとするアミノ酸が豊富に含まれ良質なタンパク質などから構成されている。さらに、ビタミン類、ミネラル類、炭水化物などの微量成分を含んでいる。例えばビタミン類ではビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ナイアシン、成長促進や老化防止に効果のあるパントテン酸、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンEなどが挙げられる。ミネラル類ではカリウム、マグネシウム、カルシウム、銅、鉄、リンなどが挙げられる。炭水化物ではブドウ糖、果糖などが挙げられる。さらに、アセチルコリン様物質、有機酸（10−ヒドロキシデセン酸など）、脂肪、タンパク質性の抗菌物質であるロイアリシンなどが含まれている。 Royal jelly is a milky white paste-like substance secreted by the pharyngeal glands of young worker bees, and its components are abundant in amino acids including essential amino acids and are composed of high-quality proteins. In addition, it contains trace components such as vitamins, minerals and carbohydrates. Examples of vitamins include vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, niacin, pantothenic acid, vitamin A, vitamin C, and vitamin E, which are effective in promoting growth and preventing aging. Minerals include potassium, magnesium, calcium, copper, iron, phosphorus and the like. Examples of carbohydrates include glucose and fructose. Furthermore, acetylcholine-like substances, organic acids (such as 10-hydroxydecenoic acid), fats, and protein-like antibacterial substances such as leuricin are included.
このようにローヤルゼリーは様々な栄養成分を含んでおり、例えば、抗菌作用、免疫増強作用、抗炎症作用、老化防止作用、更年期障害の予防・治療作用、抗がん作用など数多くの効果が知られている。 As described above, royal jelly contains various nutritional components and has many known effects such as antibacterial action, immune enhancement action, anti-inflammatory action, anti-aging action, prevention / treatment action for menopause, and anticancer action. ing.
一方、生活習慣病の中でも高血圧患者数は我が国では30歳以上で2000万人と推定され、高血圧は現在の国民病ともいわれる側面をもっている。高血圧は各種慢性疾患に対するリスクファクターとなり、脳血管障害、心筋梗塞などの血管障害を誘発することが知られている。今後ますます高齢化が進むにつれ、高血圧症者も増大することが予想され、高血圧の改善あるいは発症の予防が課題となっている（非特許文献1）。 On the other hand, the number of patients with hypertension among lifestyle-related diseases is estimated to be 20 million in Japan over 30 years old, and high blood pressure has an aspect called current national disease. Hypertension is a risk factor for various chronic diseases, and is known to induce vascular disorders such as cerebrovascular disorders and myocardial infarction. As the population ages more and more in the future, the number of hypertensives is expected to increase, and improvement of hypertension or prevention of the onset is an issue (Non-patent Document 1).
アンジオテンシン変換酵素（以下ACEと略することがある）はアンジオテンシンIを血圧上昇物質であるアンジオテンシンIIに変換し、血圧降下作用をもつブラジキニンを分解するため血圧を上昇させる働きがある。したがってACEを阻害する物質（ACE阻害物質）があれば血圧を下げることができ、高血圧症予防又は治療に効果があることが期待される。
ACE活性を抑制させることにより血圧を降下させるACE阻害物質として、例えば、カプトプリルが開発され医薬品として利用されている。
Angiotensin converting enzyme (hereinafter sometimes abbreviated as ACE) converts angiotensin I into angiotensin II which is a blood pressure increasing substance and degrades bradykinin which has a blood pressure lowering action, thereby increasing blood pressure. Therefore, if there is a substance that inhibits ACE (ACE inhibitor), blood pressure can be lowered, and it is expected to be effective in preventing or treating hypertension.
As an ACE inhibitor that lowers blood pressure by suppressing ACE activity, for example, captopril has been developed and used as a pharmaceutical product.
一方、食品分野においては、乳カゼイン（非特許文献2）、わかめタンパク質（特許文献1、非特許文献3）、かつお節（非特許文献4、非特許文献5）、イワシ（非特許文献6）などの酵素分解物、発酵乳（非特許文献7）、ブナハリタケエキス（非特許文献8）などACE阻害物質を含む食品が数多く市販されている。 On the other hand, in the food field, milk casein (Non-patent document 2), wakame protein (patent document 1, non-patent document 3), bonito (non-patent document 4, non-patent document 5), sardine (non-patent document 6), etc. Numerous foods containing ACE inhibitors such as enzymatic degradation products, fermented milk (Non-patent Document 7), and Bunaharitake extract (Non-patent Document 8) are commercially available.
近年では動物の消化酵素であるトリプシンや枯草菌（Bacillus subtilis）などの微生物由来のタンパク質分解酵素を用いてローヤルゼリーを加水分解することによりACE阻害物質を得る試みがなされている（特許文献2、特許文献3、非特許文献9）。さらに、枯草菌由来のタンパク質分解酵素を用いてローヤルゼリーを加水分解した際の血圧降下の関与成分としてはイソロイシン−チロシン、バリン−チロシンおよびイソロイシン−バリン−チロシンなどのペプチドが知られている（非特許文献10）。しかし、ローヤルゼリーの消化に用いるトリプシンは動物由来の消化酵素であり、トリプシンで加水分解したローヤルゼリーは動物由来の感染性物質の混入を完全に否定することは困難であるという問題があり、より安全なローヤルゼリー由来のACE阻害物質が望まれている。また、タンパク質分解酵素により生産されるものはローヤルゼリーが加水分解されたペプチドであり、それ以外の有用産物の生産は見込めず、食品の高付加価値化は期待できない。 In recent years, attempts have been made to obtain ACE inhibitors by hydrolyzing royal jelly using a proteolytic enzyme derived from microorganisms such as trypsin and Bacillus subtilis, which are digestive enzymes of animals (Patent Document 2, Patent) Reference 3, Non-patent document 9). Furthermore, peptides such as isoleucine-tyrosine, valine-tyrosine, and isoleucine-valine-tyrosine are known as components involved in lowering blood pressure when royal jelly is hydrolyzed using a proteolytic enzyme derived from Bacillus subtilis (non-patented). Reference 10). However, trypsin used to digest royal jelly is an animal-derived digestive enzyme, and royal jelly hydrolyzed with trypsin has a problem that it is difficult to completely rule out contamination of animal-derived infectious substances, making it safer. An ACE inhibitor derived from royal jelly is desired. In addition, what is produced by proteolytic enzymes is a peptide in which royal jelly is hydrolyzed, and production of other useful products cannot be expected, and high value-added foods cannot be expected.
さらに、ローヤルゼリーに麹菌を添加して発酵させることにより、ACE阻害作用を有するローヤルゼリーを製造する方法が報告されている（特許文献4）。 Furthermore, a method for producing royal jelly having an ACE inhibitory action by adding koji mold to royal jelly and fermenting it has been reported (Patent Document 4).
本発明は、従来法で得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーより高い血圧降下作用を有し、さらに血圧降下作用以外の有用な特性を発揮するローヤルゼリーを得ることのできる技術を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a technique capable of obtaining a royal jelly having a higher blood pressure lowering effect than that of a royal jelly having a blood pressure lowering effect obtained by a conventional method and exhibiting useful properties other than the blood pressure lowering effect. To do.
本発明者らは鋭意検討を行った結果、ローヤルゼリーには抗菌物質である10−ヒドロキシデセン酸やロイアリシンが含まれているにもかかわらず、ローヤルゼリーをパエニバチルス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）で発酵することにより、前記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors fermented royal jelly with Paenibacillus polymyxa, even though royal jelly contains antibacterial substances 10-hydroxydecenoic acid and leuallysin. The present inventors have found that the above problems can be solved and have completed the present invention.
すなわち本発明は、
1.パエニバチルス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）を培養する工程および、前記培養する工程で得られたパエニバチルス ポリミキサでローヤルゼリーを発酵させる工程を含むことを特徴とする、血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造方法、
2.少なくともマンガン塩を含有させて、パエニバチルス ポリミキサを培養することを特徴とする前記ローヤルゼリーの製造方法、
3.発酵工程の後に、微生物を殺菌する工程を含むことを特徴とする、前記いずれかのローヤルゼリーの製造方法、
4.血圧降下作用を有するローヤルゼリーがアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを特徴とする、前記いずれかのローヤルゼリーの製造方法、
5.前記いずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーを含有することを特徴とする、ローヤルゼリー組成物、
6.前記いずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする、血圧降下剤、
からなる。
That is, the present invention
1. A method for producing a royal jelly having a blood pressure lowering action, comprising a step of culturing Paenibacillus polymyxa and a step of fermenting royal jelly with the Paenibacillus polymyxa obtained in the culturing step.
2. A method for producing the royal jelly comprising culturing the Paenibacillus polymixer containing at least a manganese salt,
3. The method for producing any of the above-mentioned royal jelly, comprising a step of sterilizing microorganisms after the fermentation step,
4. The method for producing any of the above royal jelly, wherein the royal jelly having a blood pressure lowering action has an angiotensin converting enzyme inhibitory action,
5. A royal jelly composition having a blood pressure lowering action obtained by any of the above methods,
6. An antihypertensive agent comprising, as an active ingredient, royal jelly having an antihypertensive effect obtained by any of the above methods,
Consists of.
本発明によると従来法と比較してより安全で簡便な方法により高い血圧降下作用を有するローヤルゼリーを製造することができ、この血圧降下作用を有するローヤルゼリーを利用して、ローヤルゼリー組成物や血圧降下剤を提供することができる。 According to the present invention, a royal jelly having a high blood pressure lowering action can be produced by a safer and simpler method than the conventional method, and a royal jelly composition and a blood pressure lowering agent are obtained by using this royal jelly having a blood pressure lowering action. Can be provided.
本発明に係る血圧降下作用を有するローヤルゼリーは、パエニバチルス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）を培養する工程および前記培養する工程で得られたパエニバチルス ポリミキサでローヤルゼリーを発酵させる工程により製造される。パエニバチルス ポリミキサはタンパク質分解酵素を産生するため、パエニバチルス ポリミキサでローヤルゼリーを発酵させると、ローヤルゼリーが該タンパク質分解酵素により加水分解され、その結果、血圧降下の関与成分であるACE阻害物質が産生される。 The royal jelly having a blood pressure lowering action according to the present invention is produced by a step of culturing Paenibacillus polymyxa and a step of fermenting the royal jelly with the Paenibacillus polymyxa obtained in the culturing step. Since Paenibacillus polymixer produces a proteolytic enzyme, when royal jelly is fermented by Paenibacillus polymixer, the royal jelly is hydrolyzed by the proteolytic enzyme, and as a result, an ACE inhibitor that is a component involved in lowering blood pressure is produced.
パエニバチルス ポリミキサは、バチルス ポリミキサ（Bacillus polymyxa）とも呼ばれ、固体培地または液体培地で培養したものを用いることができるが、液体培地で培養したものが好ましい。液体培養したパエニバチルス ポリミキサをローヤルゼリーと混合する場合、滅菌水、滅菌した生理的食塩水または滅菌した緩衝液などで菌体を洗浄し培養液を除去してもよい。さらに、菌体を洗浄した場合、ガラスフィルター等で菌体より余分な水分を除去した後、ローヤルゼリーと混合してもよいし、洗浄した菌体を再度、滅菌水、滅菌した生理的食塩水または滅菌した緩衝液に懸濁してローヤルゼリーと混合してもよい。あるいは、液体培養終了後、上記のような洗浄を行わず、菌体と培養液の混合液をローヤルゼリーと混合してもよく、菌体と培養液の混合液をローヤルゼリーと混合し、発酵を行うのが好ましい。 The Paenibacillus polymixer is also called a Bacillus polymyxa, and one cultured in a solid medium or liquid medium can be used, but one cultured in a liquid medium is preferable. When the liquid-cultured Paenibacillus polymixer is mixed with royal jelly, the cells may be removed by washing the cells with sterilized water, sterilized physiological saline, or sterilized buffer. Furthermore, when the cells are washed, excess water is removed from the cells with a glass filter or the like, and then mixed with royal jelly, or the washed cells are again sterilized water, sterilized physiological saline or It may be suspended in a sterilized buffer and mixed with royal jelly. Or after completion | finish of liquid culture, you may mix the liquid mixture of a microbial cell and a culture solution with a royal jelly without performing the above washing | cleaning, and mix a liquid mixture of a microbial cell and a culture solution with a royal jelly, and perform fermentation. Is preferred.
パエニバチルス ポリミキサの培養の条件はパエニバチルス ポリミキサがタンパク質分解酵素を産生する条件であれば特に制限はなく、適宜条件を選択できる。
例えば、培地のpHはパエニバチルス ポリミキサがタンパク質分解酵素を産生するpHであれば特に限定されないが、pH6〜10、好ましくはpH7〜9、さらに好ましくはpH7〜8を挙げることができる。
また、培養温度はパエニバチルス ポリミキサがタンパク質分解酵素を産生する温度であれば特に限定されないが、5〜40℃、好ましくは20〜35℃の培養温度を挙げることができる。
The culture conditions of the Paenibacillus polymixer are not particularly limited as long as the Paenibacillus polymixer produces a proteolytic enzyme, and the conditions can be appropriately selected.
For example, the pH of the medium is not particularly limited as long as the Paenibacillus polymixer produces a proteolytic enzyme, and examples thereof include pH 6 to 10, preferably pH 7 to 9, and more preferably pH 7 to 8.
The culture temperature is not particularly limited as long as the Paenibacillus polymixer produces a proteolytic enzyme, and examples thereof include a culture temperature of 5 to 40 ° C, preferably 20 to 35 ° C.
さらに、パエニバチルス ポリミキサの培養方法は静置培養、振とう培養、攪拌培養、通気攪拌培養などの培養方法で培養することができ、好ましくは攪拌培養または通気攪拌培養のように好気的な条件で培養するのが好ましい。
培地成分として例えば、炭素源としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、スクロース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、エチレングリコール、澱粉、糖蜜、コーン・ステープ・リカー、麦芽エキス、澱粉水解物などを単独または二種以上混合したものを例示できる。窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機性窒素源や、ペプトン、大豆粉、大豆ペプトン、肉エキス、カゼイン、カザミノ酸、尿素などの有機性窒素源を単独または二種以上混合したものを例示できる。また、培地には必要に応じて、アミノ酸、各種ビタミン、酵母エキス、粉末酵母、脂肪酸などの有機微量栄養素を含有させてもよい。
Furthermore, the culture method of the Paenibacillus polymixer can be cultured by a culture method such as stationary culture, shaking culture, agitation culture, aeration and agitation culture, preferably under aerobic conditions such as agitation culture or aeration and agitation culture. It is preferable to culture.
Examples of medium components include carbon sources such as glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose, sucrose, fructose, mannitol, sorbitol, glycerin, ethylene glycol, starch, molasses, corn steep liquor, malt extract, starch hydrolyzate These may be used alone or in combination of two or more. Nitrogen sources include inorganic nitrogen sources such as ammonium salts and nitrates, and organic nitrogen sources such as peptone, soy flour, soy peptone, meat extract, casein, casamino acid, urea, etc., alone or in combination. It can be illustrated. The medium may contain organic micronutrients such as amino acids, various vitamins, yeast extract, powdered yeast, and fatty acids as necessary.
パエニバチルス ポリミキサの培養にはカルシウム塩、リン酸塩、カリウム塩、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩、その他の金属塩などの無機塩類を単独または二種以上併用して用いることができる。マンガン塩を含有させて培養することにより培養工程でタンパク質分解酵素が効率よく産生される。したがって、パエニバチルス ポリミキサはマンガン塩を含有させて培養することが好ましい。マンガン塩としては、パエニバチルス ポリミキサのタンパク質分解酵素を効率よく産生させ得るものであればよく、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン、硝酸マンガン、リン酸マンガン、蓚酸マンガン等の水溶性の無機マンガン塩やマンガンを含有する酵母エキス、粉末酵母、ビール酵母、マンガン酵母などが例示され、中でも硫酸マンガン、酵母エキス、粉末酵母、ビール酵母、マンガン酵母が好ましい。マンガン塩の濃度は、パエニバチルス ポリミキサのタンパク質分解酵素を効率よく産生させ得る濃度であればよく、例えば無機マンガン塩であれば、0.001〜0.5W/V％程度であることが好ましい。また、無機塩の代わりに金属塩を含有する酵母粉末などを用いてもよい。 For cultivation of Paenibacillus polymixer, inorganic salts such as calcium salt, phosphate salt, potassium salt, iron salt, manganese salt, magnesium salt and other metal salts can be used alone or in combination of two or more. Proteolytic enzyme is efficiently produced in the culturing process by culturing with manganese salt. Therefore, it is preferable to culture the Paenibacillus polymixer containing a manganese salt. The manganese salt is not particularly limited as long as it can efficiently produce Paenibacillus polymixer proteolytic enzyme, such as manganese sulfate, manganese chloride, manganese acetate, manganese nitrate, manganese phosphate, manganese oxalate, and other water-soluble inorganic manganese salts. Examples include manganese-containing yeast extract, powdered yeast, brewer's yeast, manganese yeast and the like, among which manganese sulfate, yeast extract, powdered yeast, brewer's yeast and manganese yeast are preferred. The concentration of the manganese salt may be any concentration that can efficiently produce the proteolytic enzyme of the Paenibacillus polymixer. For example, in the case of an inorganic manganese salt, it is preferably about 0.001 to 0.5 W / V%. Moreover, you may use the yeast powder etc. which contain a metal salt instead of an inorganic salt.
ローヤルゼリーの原産国は例えば日本、中国、台湾、タイ、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメリカなどを挙げることができ、いずれの原産国のローヤルゼリーを用いてもよい。また、複数の原産国のローヤルゼリーを適宜混合して用いてもよい。ローヤルゼリーは液体であることが好ましく、凍結乾燥状態のローヤルゼリーを用いる場合は精製水、水道水または適当な緩衝液などで溶解して用いることができる。また、凍結状態のローヤルゼリーは融解して用いることができる。 Examples of the country of origin of royal jelly include Japan, China, Taiwan, Thailand, Brazil, European countries, Oceania countries, the United States, etc. Royal jelly of any country of origin may be used. Further, a plurality of royal jelly of the country of origin may be appropriately mixed and used. The royal jelly is preferably a liquid, and when lyophilized royal jelly is used, it can be used after being dissolved in purified water, tap water, or an appropriate buffer. The frozen royal jelly can be used after being thawed.
さらに、ローヤルゼリーは加熱、遠心分離、アルコール抽出、ろ過、フリーズドライまたは熱風乾燥などの加工並びに各種栄養素などが添加されたものであってもよい。 Further, the royal jelly may be one to which processing such as heating, centrifugation, alcohol extraction, filtration, freeze drying or hot air drying, and various nutrients are added.
パエニバチルス ポリミキサは単独で使用してもよく、パエニバチルス ポリミキサ以外の他の微生物を組み合わせてもよい。 The Paenibacillus polymixer may be used alone or in combination with other microorganisms other than the Paenibacillus polymixer.
パエニバチルス ポリミキサとローヤルゼリーを混合する場合、必要な菌体量を一度にローヤルゼリーと混合してもよいし、必要な菌体量を2回以上に分けて混合してもよい。また、パエニバチルス ポリミキサと他の微生物を使用する場合、ぞれぞれの微生物を同時にローヤルゼリーと混合してもよく、別々に分けてローヤルゼリーと混合してもよい。 When mixing Paenibacillus polymixer and royal jelly, the required amount of bacterial cells may be mixed with royal jelly at once, or the required amount of bacterial cells may be divided into two or more times. Further, when using Paenibacillus polymixer and other microorganisms, each microorganism may be mixed with royal jelly at the same time, or separately and mixed with royal jelly.
パエニバチルス ポリミキサと混合した後のローヤルゼリーの固形分濃度は、0.1〜30W/W％を挙げることができ、好ましくは5〜20W/W％を挙げることができる。ここで、例えば10W/W％は、100gのローヤルゼリー混合物を凍結乾燥などにより乾燥させたとき10gの乾燥品が得られることを意味している。 The solid content concentration of the royal jelly after mixing with the Paenibacillus polymixer can be 0.1 to 30 W / W%, preferably 5 to 20 W / W%. Here, for example, 10 W / W% means that 10 g of a dried product can be obtained when 100 g of a royal jelly mixture is dried by freeze drying or the like.
パエニバチルス ポリミキサとローヤルゼリーを混合し発酵する時間は目的とする血圧降下物質が産生する時間であれば特に限定されないが、半日〜10日間、好ましくは半日〜4日間が好ましい。 The time for mixing and fermenting Paenibacillus polymixer and royal jelly is not particularly limited as long as the target antihypertensive substance is produced, but is preferably from half a day to 10 days, preferably from a half day to 4 days.
また、微生物とローヤルゼリーを混合する際のローヤルゼリーのpHは目的とする血圧降下物質が産生するpHであれば特に限定されないが、pH3〜8、好ましくはpH4〜6が好ましい。 In addition, the pH of the royal jelly when mixing the microorganism and the royal jelly is not particularly limited as long as it is a pH produced by the target antihypertensive substance, but is preferably pH 3 to 8, preferably pH 4 to 6.
パエニバチルス ポリミキサとローヤルゼリーを混合し発酵させている間の温度は血圧降下物質が産生する温度であれば特に限定されないが、5〜50℃、好ましくは20〜45℃が好ましい。 Although the temperature during mixing and fermenting Paenibacillus polymixer and royal jelly is not particularly limited as long as it is a temperature at which a blood pressure lowering substance is produced, it is preferably 5 to 50 ° C, and preferably 20 to 45 ° C.
パエニバチルス ポリミキサとローヤルゼリーを混合し発酵させている間は、静置、振とう、攪拌、通気攪拌などを行ってもよい。 While the Paenibacillus polymixer and royal jelly are mixed and fermented, standing, shaking, stirring, aeration stirring, and the like may be performed.
ローヤルゼリーに炭素源、窒素源、有機微量栄養素、無機塩類、脂質類などを単独または二種以上を添加してもよい。例えば炭素源としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、スクロース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、エチレングリコール、澱粉、糖蜜、コーン・ステープ・リカー、麦芽エキス、澱粉水解物などを単独または二種以上混合したものを例示できる。窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機性窒素源や、ペプトン、大豆粉、大豆ペプトン、肉エキス、カゼイン、カザミノ酸、尿素などの有機性窒素源を単独または二種以上混合したものを例示できる。また、培地には必要に応じて、アミノ酸、各種ビタミン、酵母エキス、粉末酵母、脂肪酸などの有機微量栄養素を含有させてもよい。 You may add a carbon source, a nitrogen source, an organic micronutrient, an inorganic salt, lipids, etc. to royal jelly individually or in mixture of 2 or more types. For example, as a carbon source, glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose, sucrose, fructose, mannitol, sorbitol, glycerin, ethylene glycol, starch, molasses, corn steep liquor, malt extract, starch hydrolyzate, etc. alone or What mixed 2 or more types can be illustrated. Nitrogen sources include inorganic nitrogen sources such as ammonium salts and nitrates, and organic nitrogen sources such as peptone, soy flour, soy peptone, meat extract, casein, casamino acid, urea, or a mixture of two or more. It can be illustrated. The medium may contain organic micronutrients such as amino acids, various vitamins, yeast extract, powdered yeast, and fatty acids as necessary.
また、ローヤルゼリーにカルシウム塩、リン酸塩、カリウム塩、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩、その他の金属塩などの無機塩類をそれぞれ単独または二種以上併用して添加することができる。また、金属塩を含有する酵母粉末などを用いてもよい。 In addition, inorganic salts such as calcium salt, phosphate salt, potassium salt, iron salt, manganese salt, magnesium salt, and other metal salts can be added to royal jelly alone or in combination of two or more. Moreover, you may use the yeast powder containing a metal salt.
本明細書で用いる発酵の意味は、微生物とローヤルゼリーとを混合することにより血圧降下作用を有するローヤルゼリーが産生されればよく、微生物とローヤルゼリーの混合物中で該微生物が増殖してもしなくてもよい。本発明によって得られる血圧降下性ローヤルゼリーは、重要な特徴の一つとしてACE阻害作用を発揮する。血圧降下性ローヤルゼリーとは、血圧降下作用を有するローヤルゼリーのことをいう。 The meaning of fermentation used in the present specification is that a royal jelly having a blood pressure lowering action may be produced by mixing a microorganism and royal jelly, and the microorganism may or may not grow in the mixture of the microorganism and royal jelly. . The blood pressure-lowering royal jelly obtained by the present invention exhibits an ACE inhibitory action as one of important features. The blood pressure lowering royal jelly refers to a royal jelly having a blood pressure lowering action.
ローヤルゼリーを発酵させることにより、ACE阻害作用の他に種々の有用性の向上が期待される。上記のようにACE阻害物質の生産の他に、抗酸化物質、モナコリンK、γ−アミノ酪酸（GABA）、コリン（アセチルコリンの前駆体）などの生産や免疫賦活化が見込まれる。これらの効果としては、抗酸化物質は血流改善、モナコリンKは血中コレステロールの低下、GABAは血圧降下、コリンは血圧降下および動脈硬化予防などが期待される。 In addition to the ACE inhibitory action, various useful improvements are expected by fermenting royal jelly. In addition to the production of ACE inhibitors as described above, the production and immunostimulation of antioxidant substances, monacolin K, γ-aminobutyric acid (GABA), choline (a precursor of acetylcholine) and the like are expected. Antioxidants are expected to improve blood flow, monacolin K lowers blood cholesterol, GABA lowers blood pressure, choline lowers blood pressure and atherosclerosis.
ローヤルゼリーをパエニバチルス ポリミキサで発酵させることにより、ローヤルゼリーを麹菌、例えばアスペルギルス属、モナスカス属またはリゾプス属の麹菌で発酵させたときと比較して高いACE阻害活性を有するローヤルゼリーが産生される。 By fermenting royal jelly with Paenibacillus polymixer, royal jelly having higher ACE inhibitory activity is produced compared to when fermenting royal jelly with Aspergillus, such as Aspergillus, Monascus or Rhizopus.
本発明に従う血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造においては、一般に、如上の発酵工程の後に微生物を殺菌する工程を含む。微生物とローヤルゼリーの発酵液の殺菌方法は、微生物が食品として問題がない程度に殺菌されればよい。殺菌方法としては、加熱により殺菌する方法、薬剤を用いて殺菌する方法、ろ過により微生物を除菌する方法、遠心分離を用いて微生物を除菌する方法が例示でき、これら方法を単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせてもよい。好ましくは、加熱により微生物を殺菌する。加熱温度は60℃以上、好ましくは80℃以上、より好ましくは90℃以上で加熱することが好ましい。 The production of a royal jelly having a blood pressure lowering effect according to the present invention generally includes a step of sterilizing microorganisms after the above fermentation step. The method for sterilizing the fermentation liquid of microorganisms and royal jelly may be as long as the microorganisms are sterilized as a food product. Examples of the sterilization method include a method of sterilization by heating, a method of sterilization using a drug, a method of sterilizing microorganisms by filtration, and a method of sterilizing microorganisms using centrifugation, and these methods can be used alone. Or two or more types may be combined. Preferably, the microorganism is sterilized by heating. It is preferable to heat at a heating temperature of 60 ° C. or higher, preferably 80 ° C. or higher, more preferably 90 ° C. or higher.
本発明に係るローヤルゼリーを各種クロマトグラフィーを用いて処理することにより、ACE阻害物質を精製してもよい。精製方法としてはゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動などを挙げることができる。これらは単独で若しくは組み合わせて精製に使用できる。 The ACE inhibitor may be purified by treating the royal jelly according to the present invention with various chromatographies. Examples of the purification method include gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, normal phase chromatography, ultrafiltration, electrophoresis and the like. These can be used for purification alone or in combination.
ゲルろ過クロマトグラフィーは、種々な分子量のタンパク質を分離できるゲルろ過クロマトグラフィー用の担体があり、分子量が約1万以下のタンパク質を分離できるゲルろ過クロマトグラフィー用の担体が好ましい。イオン交換クロマトグラフィーに用いられているイオン交換基としては、陰イオン交換体、陽イオン交換体などがあり、陰イオン交換体としては、ジエチルアミノエチル基（DEAE基）、四級アミノエチル基（QAE）などを例示することができる。また、陽イオン交換体としては、カルボキシメチル（CM）基、スルホプロピル（SP）基を例示することができる。疎水クロマトグラフィーに用いられる担体としてはブチル基（Butyl基）、エチル基（Ethyl基）、フェニル基（Phenyl基）が結合した担体を例示することができる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としてはオクタデシル基（C18）、オクタデシル基とはアルキル基の長さが異なるC30、C8、C4などが結合した担体が例示される。順相クロマトグラフィーに用いられる担体としてはシリカゲルのほか、シアノプロピル基、ジオール構造を有する官能基、アミノプロピル基、ポリアミンなどが結合した担体が例示される。 Gel filtration chromatography includes a carrier for gel filtration chromatography that can separate proteins having various molecular weights, and a carrier for gel filtration chromatography that can separate proteins having a molecular weight of about 10,000 or less is preferable. Examples of ion exchange groups used in ion exchange chromatography include anion exchangers and cation exchangers. Examples of anion exchangers include diethylaminoethyl groups (DEAE groups) and quaternary aminoethyl groups (QAEs). ) And the like. Examples of the cation exchanger include a carboxymethyl (CM) group and a sulfopropyl (SP) group. Examples of the carrier used in the hydrophobic chromatography include a carrier having a butyl group (Butyl group), an ethyl group (Ethyl group), and a phenyl group (Phenyl group) bound thereto. Examples of the carrier used for the reverse phase chromatography include octadecyl group (C18), and a carrier to which C30, C8, C4, etc. having different alkyl group length from octadecyl group are bonded. Examples of the carrier used for normal phase chromatography include silica gel, as well as a carrier bonded with a cyanopropyl group, a functional group having a diol structure, an aminopropyl group, a polyamine, and the like.
本発明に係る血圧降下作用を有するローヤルゼリーは、上記のクロマトグラフィーなどを用いて精製を行なうことにより血圧降下剤として利用することができる。また、本発明に係る血圧降下性ローヤルゼリーまたはその精製品に各種成分を添加することによりローヤルゼリー組成物として供することができる。各種成分としては、例えば食品、糖、脂質、乳化剤、増粘剤、調味料、香料、酸味調整剤、保存料、果汁、香料、各種栄養成分などが挙げられ、本発明に係るローヤルゼリーの効果を損なわない範囲で使用することができる。また、各種成分は単独で用いてもよいし二種以上を混合して用いてもよい。例えば糖としては、蔗糖、異性化糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロースなどを例示することができる。乳化剤としては、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチンなどを例示することができる。増粘剤としてはカラギーナン、アラビアガム、キサンタンガム、グァーガム、ペクチン、ローカストビーンガム増粘剤澱粉、ジェランガムなどを例示することができる。酸味調整剤としては、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、フマル酸、グルコン酸、酒石酸などを例示することができる。保存料としては、安息香酸及びその塩、ソルビン酸及びその塩、パラベン、亜硫酸ナトリウム、ペクチン分解物、グリシンなどを例示することができる。果汁としては、トマト果汁、梅果汁、リンゴ果汁、レモン果汁、オレンジ果汁、ベリー系果汁などを例示することができる。香料としては、ハーブ、スパイスなどの香辛料、フルーツ系香料、バニラなどの香料などを例示することができる。この他、好ましい他の栄養成分として、ビタミンDなどのビタミン類やカルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛などのミネラル類などが挙げられる。 The royal jelly having a blood pressure lowering action according to the present invention can be used as a blood pressure lowering agent by performing purification using the above-described chromatography or the like. Moreover, it can provide as a royal jelly composition by adding various components to the blood pressure-lowering royal jelly which concerns on this invention, or its refined product. Examples of the various components include foods, sugars, lipids, emulsifiers, thickeners, seasonings, fragrances, sourness adjusters, preservatives, fruit juices, fragrances, various nutritional components, etc. It can be used as long as it is not damaged. Moreover, various components may be used independently and may be used in mixture of 2 or more types. Examples of sugars include sucrose, isomerized sugar, glucose, fructose, palatinose, trehalose, lactose, xylose and the like. Examples of emulsifiers include sucrose fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, and lecithin. Examples of the thickener include carrageenan, gum arabic, xanthan gum, guar gum, pectin, locust bean gum thickener starch, gellan gum and the like. Examples of the sourness adjuster include citric acid, lactic acid, malic acid, fumaric acid, gluconic acid, tartaric acid and the like. Examples of the preservative include benzoic acid and its salt, sorbic acid and its salt, paraben, sodium sulfite, pectin degradation product, glycine and the like. Examples of the fruit juice include tomato juice, plum juice, apple juice, lemon juice, orange juice, and berry juice. Examples of the fragrances include spices such as herbs and spices, fruit fragrances, and fragrances such as vanilla. In addition, other preferable nutrients include vitamins such as vitamin D and minerals such as calcium, magnesium, iron, manganese, and zinc.
本発明によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリー、ローヤルゼリー組成物または血圧降下剤はそれらを添加・配合して調製した食品として供することもできる。そのような食品の具体的形態としては、例えば、飲料類、菓子、キャンディ、ガム、パン、畜肉製品、乳製品、レトルト食品、即席食品、冷凍食品、ゼリー状食品、養蜂産品、漬物、調味料などを挙げることができる。これらの食品は、いわゆる健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、サプリメントなどとしても有用である。また、それらの食品としての形状としては、顆粒、粉末、タブレット、カプセル、チュアブル、ドリンク、ゼリー、ペースト、粒などを挙げることができる。 The royal jelly, royal jelly composition or antihypertensive agent having an antihypertensive effect obtained by the present invention can also be used as a food prepared by adding and blending them. Specific examples of such foods include, for example, beverages, confectionery, candy, gum, bread, livestock meat products, dairy products, retort foods, instant foods, frozen foods, jelly-like foods, beekeeping products, pickles, seasonings And so on. These foods are also useful as so-called health foods, functional foods, foods for specified health use, functional nutritional foods, dietary supplements, supplements and the like. Moreover, granule, powder, tablet, capsule, chewable, drink, jelly, paste, grain etc. can be mentioned as the shape as those foods.
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
パエニバチルス ポリミキサの培養を行い、培養液を得た。具体的には、栄研器材株式会社製パールコア（登録商標）標準寒天培地を使用方法に従い調製した平板培地に、パエニバチルス ポリミキサATCC842（以下ATCC842ということがある）を一白金耳植菌し、30℃で一晩培養を行い、平板培養したATCC842を得た。次いで、300mL容バッフル付き三角フラスコに2.2W/V％ グルコース、0.3W/V％ 大豆ペプチド、0.5W/V％ ビール酵母（マンガン含有）、0.1W/V％ リン酸二水素一カリウム、0.04W/V％ CaCl2・2H2O、0.04W/V％ MgSO4・7H2O、pH8.0からなる液体培地を100mL添加し、シリコ栓（登録商標）をして、121℃で15分オートクレーブ滅菌を行った液体培地に、上記平板培養したATCC842を一白金耳植菌し、30℃、140rpmで2日間培養を行い培養液を得た。 Paenibacillus polymixer was cultured to obtain a culture solution. Specifically, a single ear of Paenibacillus polymixer ATCC842 (hereinafter sometimes referred to as ATCC842) was inoculated on a plate medium prepared according to the method of use with a pearl core (registered trademark) standard agar medium manufactured by Eiken Equipment Co., Ltd., at 30 ° C. Was cultured overnight to obtain ATCC842 plated. Next, 2.2 W / V% glucose, 0.3 W / V% soybean peptide, 0.5 W / V% brewer's yeast (containing manganese), 0.1 W / V% monopotassium dihydrogen phosphate, 0.04 W in a 300 mL baffle Erlenmeyer flask Add 100 mL of liquid medium consisting of / V% CaCl 2 · 2H 2 O, 0.04 W / V% MgSO 4 · 7H 2 O, pH 8.0, turn on silico stopper (registered trademark), and autoclave at 121 ° C for 15 minutes One platinum loop of ATCC842 cultured on the above plate was inoculated into the sterilized liquid medium and cultured at 30 ° C. and 140 rpm for 2 days to obtain a culture solution.
次に、30W/W％ ローヤルゼリーを精製水で2倍希釈し、10N NaOHでpH8.0に調整したローヤルゼリー希釈液を調製した。 Next, 30 W / W% royal jelly was diluted 2-fold with purified water, and a royal jelly diluted solution adjusted to pH 8.0 with 10N NaOH was prepared.
滅菌した300mL容バッフル付き三角フラスコにローヤルゼリー希釈液80mLおよび前記培養液20mLを混合し、滅菌したシリコ栓（登録商標）をして45℃、140rpmで1日間発酵を行った。発酵終了後のローヤルゼリーを沸騰水中で20分間加熱を行った。その後遠心分離（10,000rpm×10分）を行い、上清を42倍希釈してACE阻害活性を後述する方法により測定した。 A sterilized 300 mL baffled Erlenmeyer flask was mixed with 80 mL of a royal jelly diluent and 20 mL of the above culture solution, sterilized with a silico stopper (registered trademark), and fermented at 45 ° C. and 140 rpm for 1 day. The royal jelly after the fermentation was heated in boiling water for 20 minutes. Thereafter, centrifugation (10,000 rpm × 10 minutes) was performed, and the supernatant was diluted 42 times, and the ACE inhibitory activity was measured by the method described later.
また、前記培養液の一部を遠心分離処理（10,000rpm×10分）し、上清を40倍希釈して、後述する方法でタンパク質分解酵素活性測定を行った。 In addition, a part of the culture solution was centrifuged (10,000 rpm × 10 minutes), the supernatant was diluted 40 times, and proteolytic enzyme activity was measured by the method described later.
その結果、前記培養液のタンパク質分解酵素活性は、ΔA660で表わすと0.781であった。 As a result, the proteolytic enzyme activity of the culture broth was 0.781 when expressed as ΔA660.
また、発酵終了後のローヤルゼリーのACE阻害活性は41.7％であった。このようにパエニバチルス ポリミキサでローヤルゼリーを発酵させるとACE阻害物質が産生されることが判明した。 Moreover, the ACE inhibitory activity of the royal jelly after completion | finish of fermentation was 41.7%. Thus, it was found that fermentation of royal jelly with Paenibacillus polymixer produced ACE inhibitors.
以下に、本実施例で使用したACE阻害活性測定方法およびタンパク質分解酵素活性測定法を説明する。
［ACE阻害活性測定方法］
＜ホウ酸緩衝液の調製＞
50mM Na2B4O7 450mLと220mM H3BO4 550mLを混合し、pH8.3のホウ酸緩衝液を調製した。
＜基質溶液の調製＞
約30mLのホウ酸緩衝液にBz-Gly-His-Leu・H2O（分子量447.49 ペプチド研究所社製）170mg、NaCl 1.78gを溶解後、1N NaOHでpH8.3に調整し、ホウ酸緩衝液で50mLにメスアップして、基質溶液とした。
＜ACE溶液の調製＞
アンギオテンシン変換酵素（ウサギ肺由来 シグマ社製）をホウ酸緩衝液で溶解して60mU/mLの溶液をACE溶液とした。
＜ACE阻害活性の測定方法＞
（1）阻害活性の測定
サンプル30μLと基質溶液250μLを混合し、37℃で5分間放置した。5分間放置した後、ACE溶液を100μL添加し、37℃で30分間反応後、1N HClを250μL添加し、反応を停止させた。反応停止後1.5mLの酢酸エチルを添加し、激しく1分間攪拌した。次に3,000rpmで10分間遠心分離を行い上層の酢酸エチル層を0.5mL分取し、遠心エバポレーター（40℃、1.5時間）で蒸発乾固させた。蒸発乾固させたものに2mLの精製水を加え、溶解後、228nmにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をAとする。
（2）ブランクの測定
サンプル30μLおよび基質溶液250μLを混合し、37℃で35分間放置した。35分間放置した後、1N HCl 250μLを添加しその後、ACE溶液を100μL添加した。さらに、1.5mLの酢酸エチルを添加し、激しく1分間攪拌した。次に3,000rpmで10分間遠心分離を行い上層の酢酸エチル層を0.5mL分取し、遠心エバポレーター（40℃、1.5時間）で蒸発乾固させた。蒸発乾固させたものに2mLの精製水を加え、溶解後、228nmにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をBとする。
（3）コントロールの測定
前記（1）阻害活性の測定でサンプルの代わりにホウ酸緩衝液を用いて同様に操作を行い、228nmにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をCとする。さらに、前記（2）ブランクの測定でサンプルの代わりにホウ酸緩衝液を用いて同様に操作を行い、228nmにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をDとする。
（4）計算
下式によりACE阻害活性を求めた。
ACE残存活性（％）＝（A−B）×100／（C−D）
ACE阻害活性（％）＝100−ACE残存活性（％）
Below, the ACE inhibitory activity measuring method and the proteolytic enzyme activity measuring method used in this Example will be described.
[Method for measuring ACE inhibitory activity]
<Preparation of borate buffer>
450 mM 50 mM Na 2 B 4 O 7 and 550 mL 220 mM H 3 BO 4 were mixed to prepare a borate buffer solution having a pH of 8.3.
<Preparation of substrate solution>
After dissolving 170 mg of Bz-Gly-His-Leu · H 2 O (molecular weight: 447.49, manufactured by Peptide Laboratories) and 1.78 g of NaCl in about 30 mL of borate buffer, adjust the pH to 8.3 with 1N NaOH and borate buffer The volume was made up to 50 mL with the solution to obtain a substrate solution.
<Preparation of ACE solution>
Angiotensin converting enzyme (rabbit lung-derived Sigma) was dissolved in borate buffer to prepare a 60 mU / mL solution as an ACE solution.
<Method for measuring ACE inhibitory activity>
(1) Measurement of inhibitory activity 30 μL of the sample and 250 μL of the substrate solution were mixed and allowed to stand at 37 ° C. for 5 minutes. After leaving for 5 minutes, 100 μL of ACE solution was added, and after reacting at 37 ° C. for 30 minutes, 250 μL of 1N HCl was added to stop the reaction. After stopping the reaction, 1.5 mL of ethyl acetate was added and stirred vigorously for 1 minute. Next, the mixture was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and 0.5 mL of the upper ethyl acetate layer was collected and evaporated to dryness with a centrifugal evaporator (40 ° C., 1.5 hours). After evaporating to dryness, 2 mL of purified water was added and dissolved, and the absorbance at 228 nm was measured. The absorbance at this time is A.
(2) Blank measurement 30 μL of the sample and 250 μL of the substrate solution were mixed and left at 37 ° C. for 35 minutes. After standing for 35 minutes, 250 μL of 1N HCl was added, and then 100 μL of ACE solution was added. Further, 1.5 mL of ethyl acetate was added and stirred vigorously for 1 minute. Next, the mixture was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and 0.5 mL of the upper ethyl acetate layer was collected and evaporated to dryness with a centrifugal evaporator (40 ° C., 1.5 hours). After evaporating to dryness, 2 mL of purified water was added and dissolved, and the absorbance at 228 nm was measured. The absorbance at this time is B.
(3) Measurement of control (1) In the measurement of inhibitory activity, the same operation was performed using a borate buffer instead of the sample, and the absorbance at 228 nm was measured. The absorbance at this time is C. Further, in the above (2) blank measurement, the same operation was performed using a borate buffer instead of the sample, and the absorbance at 228 nm was measured. The absorbance at this time is D.
(4) Calculation The ACE inhibitory activity was determined by the following formula.
ACE residual activity (%) = (A−B) × 100 / (C−D)
ACE inhibitory activity (%) = 100-ACE residual activity (%)
［タンパク質分解酵素活性測定法］
（1）基質溶液の調製
75mLの100mM ビス−トリスプロパン緩衝液（pH7.0）に0.6gのカゼイン（ハマルステイン処方）を懸濁させ、沸騰水中で加熱溶解した。放冷後、pHを7.0に調整し、100mLにメスアップして、基質溶液とした。
（2）タンパク質分解酵素活性の測定
2mLの基質溶液を37℃で5分間放置した後、サンプルを0.4mL添加し、37℃で30分間反応後、0.44M トリクロロ酢酸溶液を2mL添加し、反応を停止させた。反応停止後10分間室温に放置して、No2のろ紙（アドバンテック東洋）でろ過を行った。ろ液0.5mLに0.55M Na2CO3溶液1.25mLおよび精製水で3倍希釈したフェノール試薬0.25mLを添加し、37℃で30分間放置後660nmにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をAとする。
（3）ブランクの測定
0.44M トリクロロ酢酸溶液を2mL添加後にサンプル0.4mLを加えた以外は上記（2）タンパク質分解酵素活性の測定と同様に行った。このときの660nmにおける吸光度をBとする。
（4）希釈
タンパク質分解酵素活性が高く希釈が必要な場合は100mM ビス−トリスプロパン緩衝液（pH7.0）を使用し希釈した。
（5）計算
下式によりΔA660を求めた。下式中、Dは希釈率を意味する。
ΔA660＝（A−B）×D
[Proteolytic enzyme activity assay]
(1) Preparation of substrate solution
In 75 mL of 100 mM bis-trispropane buffer (pH 7.0), 0.6 g of casein (Hamalstein formulation) was suspended and dissolved by heating in boiling water. After standing to cool, the pH was adjusted to 7.0 and made up to 100 mL to obtain a substrate solution.
(2) Measurement of proteolytic enzyme activity
After 2 mL of the substrate solution was allowed to stand at 37 ° C. for 5 minutes, 0.4 mL of the sample was added. After reacting at 37 ° C. for 30 minutes, 2 mL of 0.44 M trichloroacetic acid solution was added to stop the reaction. The reaction was stopped for 10 minutes at room temperature, followed by filtration with No. 2 filter paper (Advantech Toyo). To 0.5 mL of the filtrate, 1.25 mL of a 0.55 M Na 2 CO 3 solution and 0.25 mL of a phenol reagent diluted 3-fold with purified water were added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes, and then the absorbance at 660 nm was measured. The absorbance at this time is A.
(3) Blank measurement
The measurement was performed in the same manner as in the above (2) measurement of proteolytic enzyme activity except that 0.4 mL of the sample was added after adding 2 mL of 0.44 M trichloroacetic acid solution. The absorbance at 660 nm is B.
(4) Dilution When the proteolytic enzyme activity is high and dilution is required, 100 mM bis-trispropane buffer (pH 7.0) was used for dilution.
(5) Calculation ΔA660 was determined by the following equation. In the following formula, D means the dilution rate.
ΔA660 = (A−B) × D
マンガン塩がタンパク質分解酵素の産生に及ぼす影響について検討を行った。 The effect of manganese salts on the production of proteolytic enzymes was investigated.
まず、栄研器材株式会社製パールコア（登録商標）標準寒天培地を使用方法に従い調製した平板培地にパエニバチルス ポリミキサATCC842（以下ATCC842ということがある）を一白金耳植菌し、30℃で一晩培養を行い、平板培養したATCC842を得た。次いで、300mL容バッフル付き三角フラスコに2.2W/V％ グルコース、0.3W/V％ 大豆ペプチド、0.5W/V％ 酵母エキス（オリエンタル工業社製 BSP）、0.1W/V％ リン酸二水素一カリウム、0.04W/V％ CaCl2・2H2O、0.04W/V％ MgSO4・7H2O、pH8.0からなる液体培地を100mL添加し、シリコ栓（登録商標）をして、121℃で15分オートクレーブ滅菌を行った液体培地に、上記平板培養したATCC842を一白金耳植菌し、30℃、140rpmで2日間培養を行い培養液を得た（マンガンなし）。上記液体培地に0.01％ MnSO4・7H2Oを含む以外は同様に操作を行い培養液を得た（マンガンあり）。 First, inoculate one platinum ear of Paenibacillus polymixer ATCC842 (hereinafter sometimes referred to as ATCC842) on a plate medium prepared according to the usage method of Pearl Core (registered trademark) standard agar medium manufactured by Eiken Equipment Co., Ltd., and culture at 30 ° C overnight. To obtain ATCC842 plated. Next, in a 300 mL Erlenmeyer flask with baffle, 2.2 W / V% glucose, 0.3 W / V% soybean peptide, 0.5 W / V% yeast extract (Oriental Kogyo BSP), 0.1 W / V% monopotassium dihydrogen phosphate , 0.04 W / V% CaCl 2 · 2H 2 O, 0.04 W / V% MgSO 4 · 7H 2 O, add 100 mL of liquid medium consisting of pH 8.0, add a silico stopper (registered trademark), and One platinum loop of the above-cultured ATCC842 was inoculated into a liquid medium that had been autoclaved for 15 minutes, and cultured at 30 ° C. and 140 rpm for 2 days to obtain a culture solution (without manganese). A culture solution was obtained (with manganese) in the same manner except that the liquid medium contained 0.01% MnSO 4 .7H 2 O.
それぞれの培養液を遠心分離（10,000rpm×10分）し、上清について40倍希釈して実施例1に示すタンパク質分解酵素活性を測定した。その結果を以下に示す。 Each culture solution was centrifuged (10,000 rpm × 10 minutes), and the supernatant was diluted 40-fold, and the protease activity shown in Example 1 was measured. The results are shown below.
────────────────
ΔA660
────────────────
マンガンなし 0.009
マンガンあり 0.762
────────────────
────────────────
ΔA660
────────────────
Without manganese 0.009
Manganese 0.762
────────────────
このようにマンガン塩を添加してパエニバチルス ポリミキサを培養するとタンパク質分解酵素を効率よく産生することが明らかとなった。 Thus, it was revealed that proteolytic enzymes can be efficiently produced by culturing Paenibacillus polymixers with the addition of manganese salts.
実施例1で得られた発酵終了後のローヤルゼリーを沸騰水中で20分間加熱を行ったものを凍結乾燥しローヤルゼリーの凍結乾燥品を得た。この凍結乾燥品を単回投与血圧降下薬効試験に供した。自然発症高血圧ラット（SHR）を6週間予備飼育後、17週齢のSHR（一群6匹、雄）に、前記凍結乾燥品を2.5mg/mLになるように精製水で懸濁したものを、体重1kg当り10mL経口投与した（25mg/kg）。その結果、投与後6時間後の凍結乾燥品投与群の血圧の平均は181mmHgであった。一方、対照群の血圧の平均は205mmHgであり、凍結乾燥品を投与することにより有意（p<0.05）に血圧降下作用を示した。なお、対照群は精製水を10mL経口投与した。 The royal jelly after the completion of fermentation obtained in Example 1 was heated in boiling water for 20 minutes and freeze-dried to obtain a royal jelly freeze-dried product. This lyophilized product was subjected to a single dose antihypertensive drug efficacy test. After spontaneously raising spontaneously hypertensive rats (SHR) for 6 weeks, 17 weeks old SHR (6 mice per group, male), the suspension of the lyophilized product in purified water to 2.5 mg / mL, 10 mL was orally administered per 1 kg of body weight (25 mg / kg). As a result, the average blood pressure in the lyophilized product administration group 6 hours after administration was 181 mmHg. On the other hand, the average blood pressure of the control group was 205 mmHg, and the blood pressure-lowering effect was significantly (p <0.05) by administering the lyophilized product. In the control group, 10 mL of purified water was orally administered.
本発明によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーは、ローヤルゼリー組成物または血圧降下剤として飲食物などに好適に使用することができ、特に健康食品などに好適に使用することができる。 The royal jelly having a blood pressure lowering effect obtained by the present invention can be suitably used for food and drink as a royal jelly composition or a blood pressure lowering agent, and can be particularly suitably used for health foods and the like.
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