JP2011132188A - Lactobacillus having effect of enhancing activation of plasminogen and composition thereof - Google Patents
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本発明は、プラスミノーゲン活性化増強作用を有する乳酸菌又はその処理物を含むプラスミノーゲン活性化剤に関する。また本発明は、該プラスミノーゲン活性化剤を含む医薬組成物及び食品、具体的には、血栓性疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物及び食品に関する。 The present invention relates to a plasminogen activator comprising a lactic acid bacterium having a plasminogen activation enhancing action or a processed product thereof. The present invention also relates to a pharmaceutical composition and food containing the plasminogen activator, and specifically to a pharmaceutical composition and food for the prevention and / or treatment of thrombotic diseases.
欧米はもとより、日本においては心疾患と脳血管疾患を併せた死因率は悪性新生物のそれを上回り第一位である。近年、壮年及び老年層において、この種の疾病、例えば一過性脳虚血発作、脳梗塞（脳血栓、脳塞栓）、虚血性狭心症、心筋梗塞、動脈血栓症、静脈血栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞症、末梢静脈閉塞症、肺血栓症、肺塞栓症などの血栓に起因する種々の疾病患者が多発し、問題となっている。また、進行が緩慢な癌などと比べ血栓性疾患は、突発的に発症し、適切な処置が取られなければ死の転機をとる可能性が高く点で危険性が高い。このことから、発症予防の重要性が高まってきている。 In Europe and the United States, as well as in Japan, the combined cause of death from cardiovascular and cerebrovascular diseases is the highest in number, exceeding that of malignant neoplasms. In recent years, this type of disease, such as transient cerebral ischemic attack, cerebral infarction (brain thrombus, cerebral embolism), ischemic angina, myocardial infarction, arterial thrombosis, venous thrombosis, deep vein Patients with various diseases caused by thrombosis such as thrombosis, peripheral arterial occlusion, peripheral venous occlusion, pulmonary thrombosis, pulmonary embolism, etc. frequently occur and become a problem. In addition, thrombotic diseases suddenly develop compared to cancers that progress slowly, and there is a high risk of taking a turning point of death unless appropriate measures are taken. For this reason, the importance of onset prevention is increasing.
血栓の形成には、血管の変化、血流の変化、及び血液成分の変化の３つが要因とされており、これら要因が相互に関連しあって血栓が形成されると考えられている。通常生体では、身体が傷つくと血栓を形成し、止血を行い（凝固系）、血栓が形成され過ぎた場合は血栓を除去する（線溶系）ように絶妙なバランスが維持されている。しかし、このバランスが、全身的あるいは局所的に崩れることで血栓が成長すると考えられている（池田康夫監修、血栓症−やさしく・くわしく・わかりやすく−、南江堂、2004年）。成長した血栓は、形成された部位で血液の流れを妨げることもあれば、分離して塞栓を形成し遠く離れた血管を閉塞する場合（例えば肺塞栓症、脳卒中など）もあり、いずれの場合にも血管を閉塞して血液を正常に流さなくなり、血栓症を引き起こす。 Thrombus formation is attributed to three factors: changes in blood vessels, changes in blood flow, and changes in blood components, and these factors are considered to be related to each other to form a thrombus. Normally, in a living body, an exquisite balance is maintained such that a thrombus is formed when the body is damaged, hemostasis is performed (coagulation system), and when the thrombus is excessively formed, the thrombus is removed (fibrinolysis system). However, it is thought that the blood clot grows when this balance is broken systematically or locally (supervised by Yasuo Ikeda, thrombosis-gentle, detailed, easy to understand-Nanedo, 2004). Grown thrombus may block blood flow at the site of formation, or may separate and form an embolus to occlude distant blood vessels (eg pulmonary embolism, stroke, etc.) Even blood vessels are blocked and blood can not flow normally, causing thrombosis.
血栓の除去には、主としてプラスミノーゲンとプラスミン系を介する繊維素溶解系（線溶系）が関わっている。血栓が生じるとプラスミノーゲンはプラスミノーゲンアクチベーターと共に血栓の主成分であるフィブリンに結合し、血栓上でプラスミノーゲンアクチベーターに活性化されプラスミンになる。生じたプラスミンはフィブリンを分解して血栓を溶解する（野村武夫ら編、図解 血球-生理・病態・臨床 血小板、上血、凝固、線溶、中外医薬社、1994年）。 The removal of blood clots mainly involves a fibrinolytic system (fibrinolytic system) via plasminogen and plasmin systems. When a thrombus occurs, plasminogen binds to fibrin, which is the main component of the thrombus, together with plasminogen activator, and is activated to plasminogen activator on the thrombus. The resulting plasmin degrades fibrin and dissolves the thrombus (edited by Takeo Nomura et al., Illustrated Blood Cell-Physiology / Pathology / Clinical Platelet, Superior Blood, Coagulation, Fibrinolysis, Chugai Pharmaceutical, 1994).
生体内での血栓溶解がこのような機構であることから、血栓を溶解するためにはプラスミノーゲンアクチベーターを増強する、又は内因性のプラスミノーゲンの活性化を増強することが効果的であると考えられる。実際、臨床において血栓溶解療法としてプラスミノーゲンアクチベーターが使用されている。これまでプラスミノーゲンアクチベーターとしては、ウロキナーゼ（u-PA）及び組織プラスミノーゲンアクチベーター（t-PA）の２種類が知られていたが、いずれも極めて微量しか存在しないため、また静注薬として完全に純化することが必要なため、極めて高価であった。その上、血中での半減期が3〜20分と非常に短いため、持続的な点滴静注が必須であり、患者に多大な苦痛を与える。間接的にプラスミノーゲンを活性化するストレプトキナーゼも、同様に点滴静注が必須であり、抗原性がある等の問題点がある。また、最近では、糸状菌由来のSMTP（Stachybotrys microspora triprenyl phenols）が、内因性のプラスミノーゲンの活性化を増強する化合物として開発されている。活性の面で優れ、医薬品としての利用が考えられるが、生産菌の食経験が知られていないこともあり健康食品としての利用には至っていない。 Because thrombolysis in vivo is such a mechanism, it is effective to enhance plasminogen activator or enhance endogenous plasminogen activation in order to dissolve the thrombus. It is believed that there is. In fact, plasminogen activator is used clinically as a thrombolytic therapy. Until now, two types of plasminogen activator, urokinase (u-PA) and tissue plasminogen activator (t-PA), have been known. Since it was necessary to completely purify as a medicine, it was extremely expensive. Moreover, since the half-life in blood is as short as 3 to 20 minutes, continuous intravenous infusion is essential and causes great pain to the patient. Similarly, streptokinase that indirectly activates plasminogen must be intravenously infused and has problems such as antigenicity. Recently, SMTP (Stachybotrys microspora triprenyl phenols) derived from filamentous fungi has been developed as a compound that enhances activation of endogenous plasminogen. It is excellent in terms of activity and can be used as a medicine, but it has not been used as a health food because the dietary experience of producing bacteria is not known.
また、経口で摂取して血栓溶解効果のあるものとして実用されているものには、ルンブロキナーゼ（ミミズ抽出物）、ナットウキナーゼ（納豆抽出物）などがある（特許文献１及び非特許文献１）。
In addition, those that have been ingested orally and have a thrombolytic effect include lumbrokinase (earthworm extract), nattokinase (natto extract) and the like (
ルンブロキナーゼは分子量24〜43kDaの６種類からなるセリンプロテアーゼであり、これらは生体内で血栓を溶解しているセリンプロテアーゼの一種であるプラスミンに相同性がある。これら酵素にはフィブリン分解活性、プラスミノーゲンアクチベーター活性があることがin vitroの試験で明らかにされている（特許文献１）。ルンブロキナーゼ（混合物）をヒトが1日あたり300〜600mg摂取すると、有意な内因性のt-PA量の増大、有意なフィブリン分解産物の一過的増大、及び有意な血漿のフィブリン分解活性の上昇が確認されている（特許文献１）。 Lumbrokinase is a serine protease consisting of six types having a molecular weight of 24-43 kDa, and these are homologous to plasmin, which is a type of serine protease that dissolves thrombus in vivo. In vitro tests have revealed that these enzymes have fibrinolytic activity and plasminogen activator activity (Patent Document 1). When humans ingest 300-600 mg of lumbrokinase (mixture) per day, significant increases in endogenous t-PA levels, significant transient increases in fibrin degradation products, and significant plasma fibrinolytic activity An increase has been confirmed (Patent Document 1).
ナットウキナーゼは分子量27kDaのプラスミンに相同性があるセリンプロテアーゼを含む。フィブリン分解活性及びプロウロキナーゼ活性化能があることがin vitroの試験で明らかにされている（非特許文献１）。ナットウキナーゼをヒトが1日あたり納豆2パック相当食すると、有意な内因性t-PA量の増大、有意なフィブリン分解産物の一過的増大、及び有意な血漿のフィブリン分解活性の上昇が確認されている（非特許文献１）。 Nattokinase contains a serine protease homologous to plasmin with a molecular weight of 27 kDa. It has been clarified by in vitro tests that it has fibrinolytic activity and prourokinase activation ability (Non-patent Document 1). When humans eat nattokinase equivalent to 2 natto per day, a significant increase in endogenous t-PA levels, a significant transient increase in fibrin degradation products, and a significant increase in plasma fibrinolytic activity were confirmed. (Non-Patent Document 1).
しかし、ミミズは漢方薬あるいは健康食品として中国や韓国での食経験があるものの、現代人にとってはそれを食するにはかなりの抵抗感がある点で問題がある。納豆もヒトによって好き嫌いがあるうえに、ビタミンKを多く含むことから、血液凝固阻害剤であるワルファリンを服用している患者は効果が競合する可能性もあり、そのような患者は摂取することができない。 However, although earthworms have dietary experience in China and Korea as a Chinese herbal medicine or health food, there is a problem in that modern people have considerable resistance to eating it. Natto also likes and dislikes by humans, and because it contains a lot of vitamin K, patients taking warfarin, a blood coagulation inhibitor, may compete for effects, and such patients can take it Can not.
一方、in vitro実験において血栓溶解効果がある素材として、一部の乳酸菌が内因性フィブリノーゲンの活性化を増強する効果を有するという報告がなされている（特許文献２及び非特許文献２）。しかし、これらの報告では、プラスミノーゲンと人工基質のみあるいはそれにプラスミノーゲンアクチベーターを添加した単純な反応系でしかその効果が評価されておらず、生体での効果は実証されていない。また、その乳酸菌に含まれる活性成分の候補としてグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）等が挙げられているが、血液中には線溶阻害因子が存在するため、プラスミノーゲンと基質だけといった単純なin vitro系での評価では、実際血中でどれくらいの活性化を得られるかは不明である。また一方で、調査されている菌種は、主にラクトバチルス属とラクトコッカス属で、その他の菌種についての情報はわずかである。乳酸菌は、菌種によって醗酵に適した素材や生育条件が異なっており、これらの報告の菌種のみでは食品素材としての汎用性の面で課題が残る。
On the other hand, it has been reported that some lactic acid bacteria have an effect of enhancing the activation of endogenous fibrinogen as a material having a thrombolytic effect in in vitro experiments (
乳酸菌は、ヨーグルトやチーズといった乳製品や、日本の伝統食品である漬物や醤油などの製造でも重要な役割を果たしており、日本人にとっても馴染みの深い食品素材であり、食経験や安全性面で優れている。また摂取に対する抵抗感はないと考えられる。 Lactic acid bacteria play an important role in the production of dairy products such as yogurt and cheese, and traditional Japanese foods such as pickles and soy sauce, and are familiar food ingredients for Japanese people. Are better. There is no resistance to ingestion.
このように、実用化されているものの中では、広く受け入れられやすく、安心して食することができるものはなく、食経験が豊富な乳酸菌については、一部の菌種についてin vitro系でしか評価されておらず、活性を保有する菌種の情報についても不十分である。したがって、内因性プラスミノーゲンの活性化を増強する効果が高く、生体において線溶活性を有する乳酸菌を単離・取得できれば、食品素材への適応範囲が広がり、有用性も高まると考えられる。 In this way, there is no one that is widely accepted and can be eaten with peace of mind, and for lactic acid bacteria with abundant food experience, only some in vitro strains are evaluated in vitro. It is not done, and there is insufficient information on the bacterial species possessing activity. Therefore, if the effect of enhancing the activation of endogenous plasminogen is high and a lactic acid bacterium having fibrinolytic activity in the living body can be isolated and obtained, it is considered that the range of application to food materials is widened and usefulness is enhanced.
本発明の目的は、内因性プラスミノーゲンを活性化する乳酸菌を見出し、大量生産可能で、かつ経口下で安全性の高い血栓溶解用薬理組成物を提供することである。 An object of the present invention is to find a lactic acid bacterium that activates endogenous plasminogen, to provide a pharmacological composition for thrombolysis that can be mass-produced and is highly safe under oral administration.
本発明者は、各種乳酸菌を広く調べた結果、ある種の乳酸菌の菌体又は菌体抽出液がin vitroの試験においてプラスミノーゲンの活性化を非常に高く増強すること、そしてこのようなプラスミノーゲン活性化増強作用が、動物の血液においても発揮されることを見出し、当該乳酸菌を利用して有効なプラスミノーゲン活性化剤を調製することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。 As a result of extensive examination of various lactic acid bacteria, the present inventor has shown that certain lactic acid bacteria's bacterial cells or bacterial cell extracts greatly enhance the activation of plasminogen in in vitro tests. The inventors have found that a minogen activation enhancing action is also exerted in the blood of animals, and obtained the knowledge that an effective plasminogen activator can be prepared using the lactic acid bacteria, thereby completing the present invention. It came to.
従って、本発明は以下のとおりである。
（１）プラスミノーゲン活性化増強作用を有する少なくとも１種の乳酸菌又はその処理物を有効成分として含むプラスミノーゲン活性化剤。
（２）プラスミノーゲン活性化増強作用を有する乳酸菌が、ロイコノストック・メセンテロイデス、ロイコノストック・ラクチス（別名：ロイコノストック・ガーリカム）、ロイコノストック・オエニ、ラクトコッカス・ラクチス、ラクトコッカス・ガルビエ、ペディオコッカス・アシジラクチシ、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・ナムレンシス、ラクトバチルス・クラストラム、ラクトバチルス・フェルメンタム、ラクトバチルス・パラケフィリ、ラクトバチルス・ペントサス、及びラクトバチルス・プランタラムからなる群より選択される菌、又はその派生株である、（１）に記載のプラスミノーゲン活性化剤。
（３）プラスミノーゲン活性化増強作用を有する乳酸菌が、ロイコノストック・メセンテロイデスNBRC100496、ロイコノストック・ラクチス（別名：ロイコノストック・ガーリカム）JCM1142、ロイコノストック・オエニJCM6125、NBRC100497、PV4及びElios 1、ラクトコッカス・ラクチス・ラクチス亜種NBRC12007、ラクトコッカス・ガルビエNBRC100934、ペディオコッカス・アシジラクチシNBRC3885、ペディオコッカス・ペントサセウスJCM20314及びNK-2、ラクトバチルス・パラカセイKW3110、ラクトバチルス・ナムレンシスJCM15612、ラクトバチルス・クラストラムJCM15951、ラクトバチルス・フェルメンタムNBRC3961、ラクトバチルス・パラケフィリJCM8574、ラクトバチルス・ペントサスJCM8333、JCM8334及びJCM8335、並びにラクトバチルス・プランタラムJCM20110、JCM1551、JCM6551及びKTからなる群より選択される菌、又はその派生株である、（１）又は（２）に記載のプラスミノーゲン活性化剤。
（４）乳酸菌の処理物が、乳酸菌の懸濁物又は無細胞抽出物である、（１）〜（３）のいずれかに記載のプラスミノーゲン活性化剤。
（５）乳酸菌の処理物が、80〜150℃にて10〜20分加熱処理したものである、（１）〜（４）のいずれかに記載のプラスミノーゲン活性化剤。
（６）血栓溶解作用を有する、（１）〜（５）のいずれかに記載のプラスミノーゲン活性化剤。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のプラスミノーゲン活性化剤と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
（８）血栓性疾患の予防及び／又は治療のための、（７）に記載の医薬組成物。
（９）血栓性疾患が、一過性脳虚血発作、脳梗塞、虚血性狭心症、心筋梗塞、動脈血栓症、静脈血栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞症、末梢静脈閉塞症、肺血栓症、及び肺塞栓症からなる群より選択されるものである、（８）に記載の医薬組成物。
（１０）経口投与用である、（７）〜（９）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１１）（１）〜（６）のいずれかに記載のプラスミノーゲン活性化剤が配合された食品。
Therefore, the present invention is as follows.
(1) A plasminogen activator comprising at least one lactic acid bacterium having a plasminogen activation enhancing action or a processed product thereof as an active ingredient.
(2) Lactic acid bacteria having an activity of enhancing plasminogen activation include Leuconostok mesenteroides, Leuconostoc lactis (also known as Leuconostok garlicum), Leuconostok oeni, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis Garbier, Pediococcus ajijirachishi, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus namrensis, Lactobacillus clathram, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus parakephiri, Lactobacillus pentosus, and Lactobacillus pentosus The plasminogen activator according to (1), which is a bacterium selected from the group consisting of plantarum, or a derivative thereof.
(3) Lactic acid bacteria having plasminogen activation enhancing action are Leuconostoc mesenteroides NBRC100496, Leuconostoc lactis (also known as Leuconostok Garlicum) JCM1142, Leuconostoc Oeni JCM6125, NBRC100497, PV4 and Elios 1, Lactococcus lactis subsp.・ Crustram JCM15951, Lactobacillus fermentum NBRC3961, Lactobacillus parakephiri JCM8574, Lactobacillus pentosus JCM8333, JCM8334 and JCM8335, and Lactobacillus plantarum JCM20110, JCM1551, JCM6551 and KT Bacteria selected from the group consisting of, or a derivative strain, plasminogen activator according to (1) or (2).
(4) The plasminogen activator according to any one of (1) to (3), wherein the processed product of lactic acid bacteria is a suspension or cell-free extract of lactic acid bacteria.
(5) The plasminogen activator according to any one of (1) to (4), wherein the treated product of lactic acid bacteria is heat-treated at 80 to 150 ° C. for 10 to 20 minutes.
(6) The plasminogen activator according to any one of (1) to (5), which has a thrombolytic action.
(7) A pharmaceutical composition comprising the plasminogen activator according to any one of (1) to (6) and a pharmaceutically acceptable carrier.
(8) The pharmaceutical composition according to (7) for the prevention and / or treatment of thrombotic diseases.
(9) Thrombotic diseases are transient cerebral ischemic attack, cerebral infarction, ischemic angina, myocardial infarction, arterial thrombosis, venous thrombosis, deep vein thrombosis, peripheral arterial occlusion, peripheral venous occlusion The pharmaceutical composition according to (8), which is selected from the group consisting of pulmonary thrombosis and pulmonary embolism.
(10) The pharmaceutical composition according to any one of (7) to (9), which is for oral administration.
(11) A food containing the plasminogen activator according to any one of (1) to (6).
本発明により、優れたプラスミノーゲン活性化増強作用を有するプラスミノーゲン活性化剤が提供される。本プラスミノーゲン活性化剤は、繊維素溶解系におけるプラスミノーゲンの活性化を増強することで、血栓を溶解する作用を有し、血栓性疾患に対して優れた予防、改善及び治療効果を示す。また、食経験のある乳酸菌を含むものであり、安全性が高く長期間の継続的摂取が容易である。さらに、高温処理後でもそのプラスミノーゲン活性化増強作用が保持される。そのため、本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、血栓形成に対する予防及び改善のための食品及び飼料にも使用できる。 According to the present invention, a plasminogen activator having an excellent plasminogen activation enhancing action is provided. This plasminogen activator has an action to dissolve thrombi by enhancing the activation of plasminogen in the fibrinolysis system, and has an excellent prevention, improvement and treatment effect against thrombotic diseases. Show. In addition, it contains lactic acid bacteria with dietary experience and is safe and easy to take for a long time. Furthermore, the plasminogen activation enhancing action is retained even after high temperature treatment. Therefore, the plasminogen activator of the present invention can also be used in foods and feeds for prevention and improvement of thrombus formation.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、プラスミノーゲン活性化増強作用を有する乳酸菌又はその処理物を含むプラスミノーゲン活性化剤、並びにその医薬及び食品用途に関する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention relates to a plasminogen activator comprising a lactic acid bacterium having a plasminogen activation enhancing action or a processed product thereof, and pharmaceutical and food applications thereof.
本発明において使用する乳酸菌は、プラスミノーゲン活性化増強作用を有する乳酸菌である。乳酸菌とは、発酵によって糖類から乳酸を産生する細菌であり、例えばロイコノストック（Leuconostoc）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属などに属する細菌が含まれる。乳酸菌のより具体的な種としては、ロイコノストック・メセンテロイデス、ロイコノストック・ラクチス（別名：ロイコノストック・ガーリカム）、ロイコノストック・オエニ、ラクトコッカス・ラクチス、ラクトコッカス・ガルビエ、ペディオコッカス・アシジラクチシ、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・ナムレンシス、ラクトバチルス・クラストラム、ラクトバチルス・フェルメンタム、ラクトバチルス・パラケフィリ、ラクトバチルス・ペントサス、及びラクトバチルス・プランタラムなどがある。 The lactic acid bacterium used in the present invention is a lactic acid bacterium having a plasminogen activation enhancing action. Lactic acid bacteria are bacteria that produce lactic acid from saccharides by fermentation. For example, the genus Leuconostoc, the genus Lactococcus, the genus Pediococcus, the genus Lactobacillus, the enterococcus (Enterococcus) ) And bacteria belonging to the genus Bifidobacterium. More specific species of lactic acid bacteria include Leuconostoc mesenteroides, Leuconostok lactis (also known as Leuconostok garlicum), Leuconostok oeni, Lactococcus lactis, Lactococcus galvier, Pediococcus・ Ashijirachishi, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus namrensis, Lactobacillus crustram, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus parakephiri, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum .
本発明に関して、「プラスミノーゲン活性化増強作用」とは、繊維素溶解系における内因性のプラスミノーゲンの活性化を増強する能力を指す。プラスミノーゲンの活性化が増強されることで、フィブリンを分解して血栓を溶解するプラスミンの生成量が増大することになる。このプラスミノーゲン活性化増強作用は、当技術分野で公知の方法（Takayasu, R., Hasumi, K., Shinohara, C. and Endo, A. (1997) Enhancement of fibrin binding and activation of plasminogen by staplabin through induction of a conformational change in plasminogen. FEBS Lett. 418, 58-62；Hasumi, K., Ohyama, S., Kohyama, T., Ohsaki, Y., Takayasu, R. and Endo, A. (1998) Isolation of SMTP-3, -4, -5 and -6, novel analogs of staplabin, and their effects on plasminogen activation and fibrinolysis. J. Antibiotics 51, 1059-1068.）を基に改変した方法にて、in vitroで及び／又はex vivoで評価することができる。例えば、評価対象の乳酸菌サンプル（菌体若しくは処理物）又は組成物サンプルを、プラスミノーゲン（Glu-PLG）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（t-PA）、対照タンパク質（例えばGAPDHなど）、及びプラスミン基質（例えばH-Val-Leu-Lys-pNA、Boc-Val-Leu-Lys-MCAなど）と反応させ、反応後のプラスミン生成量を測定し、対照タンパク質量と比較することによって、in vitroにおいてプラスミノーゲン活性化増強作用を評価することができる。本発明において乳酸菌が有する「プラスミノーゲン活性化増強作用」は、例えば乳酸菌の存在下における一定時間におけるプラスミンの生成量を、対照タンパク質量に対する増加の傾きを単位として、例えば0.1〜100単位、好ましくは0.39単位以上で増加させる能力に相当する。 In the context of the present invention, “plasminogen activation enhancing action” refers to the ability to enhance the activation of endogenous plasminogen in the fibrinolytic system. By enhancing the activation of plasminogen, the amount of plasmin that degrades fibrin and dissolves the thrombus increases. This plasminogen activation enhancing action is known in the art (Takayasu, R., Hasumi, K., Shinohara, C. and Endo, A. (1997) Enhancement of fibrin binding and activation of plasminogen by staplabin through induction of a conformational change in plasminogen. FEBS Lett. 418, 58-62; Hasumi, K., Ohyama, S., Kohyama, T., Ohsaki, Y., Takayasu, R. and Endo, A. (1998) Isolation of SMTP-3, -4, -5 and -6, novel analogs of staplabin, and their effects on plasminogen activation and fibrinolysis. J. Antibiotics 51, 1059-1068.) And / or ex vivo. For example, a sample of lactic acid bacteria to be evaluated (bacteria or treated product) or a composition sample is selected from plasminogen (Glu-PLG), tissue plasminogen activator (t-PA), control protein (eg GAPDH, etc.), and By reacting with a plasmin substrate (eg H-Val-Leu-Lys-pNA, Boc-Val-Leu-Lys-MCA, etc.), measuring the amount of plasmin produced after the reaction and comparing it with the amount of control protein in vitro The effect of enhancing plasminogen activation can be evaluated. The “plasminogen activation enhancing action” possessed by lactic acid bacteria in the present invention is, for example, 0.1 to 100 units, preferably the amount of plasmin produced in a given time in the presence of lactic acid bacteria, with the slope of increase relative to the amount of control protein as a unit, for example. Is equivalent to the ability to increase above 0.39 units.
また本発明において使用する乳酸菌は、プラスミノーゲンを活性化し、その結果として血栓溶解作用を有するものである。例えば、実験動物における、ずり惹起血小板血栓形成・血栓溶解能測定法（Global Thrombosis Test：GTT）は、麻酔下のラット腹大動脈から抗凝固剤を使用しないで採取した血液に、例えば評価対象の乳酸菌サンプル（菌体若しくは処理物）又は組成物サンプル（約37℃）を混合し、直ちにGTTの測定チューブに入れ測定を開始する。血小板血栓形成までの時間（閉塞時間、Occlusion time、OT）及び血栓溶解までの時間（溶解時間、Lysis time、LT）を測定することによって、プラスミノーゲン活性化増強作用に基づく血栓溶解活性を動物の血液で評価することができる。この場合、プラスミノーゲン活性化増強作用が高いほど、血栓溶解までの時間（LT）が短縮される。さらに、実験動物に経口投与した後、GTTを用いて抗血栓活性を評価し、プラスミノーゲン活性化増強作用に基づく抗血栓活性をex vivoで評価することができる。例えば、ラットに評価対象の乳酸菌サンプル（菌体若しくは処理物）又は組成物サンプルを１回又は複数回投与し、一定時間経過の後、上述のように採血し、GTTを用いて血液サンプルにおける血小板血栓形成までの時間（閉塞時間、OT）及び血栓溶解までの時間（溶解時間、LT）を測定することによって、ex vivoにおける抗血栓活性を評価することができる。この場合、プラスミノーゲン活性化増強作用が高いほど、溶解時間（LT）が短縮される。 The lactic acid bacterium used in the present invention activates plasminogen and, as a result, has a thrombolytic action. For example, in a laboratory animal, a shear-induced platelet thrombus formation / thrombolytic ability measurement method (Global Thrombosis Test: GTT) is used for blood collected from anesthetized rat abdominal aorta without using an anticoagulant, for example, lactic acid bacteria to be evaluated. A sample (bacteria or treated product) or composition sample (about 37 ° C.) is mixed and immediately put into a GTT measurement tube to start measurement. By measuring the time to platelet thrombus formation (occlusion time, Occlusion time, OT) and the time to thrombus dissolution (lysis time, Lysis time, LT), the thrombolytic activity based on the plasminogen activation enhancing effect was measured in animals. Can be evaluated with blood. In this case, the higher the plasminogen activation enhancing action, the shorter the time to thrombolysis (LT). Furthermore, after oral administration to experimental animals, anti-thrombotic activity can be evaluated using GTT, and anti-thrombotic activity based on plasminogen activation enhancing action can be evaluated ex vivo. For example, a lactic acid bacteria sample (bacteria or treated product) or composition sample to be evaluated is administered to a rat once or a plurality of times, blood is collected as described above after a certain period of time, and platelets in the blood sample are collected using GTT. By measuring the time to thrombus formation (occlusion time, OT) and the time to thrombus dissolution (dissolution time, LT), ex vivo antithrombotic activity can be assessed. In this case, the higher the plasminogen activation enhancing action, the shorter the dissolution time (LT).
従って、本発明においては、上述したような方法によりプラスミノーゲン活性化増強作用を有すると評価された乳酸菌であれば、任意の乳酸菌を用いることができる。そのようなプラスミノーゲン活性化増強作用を有する好ましい乳酸菌としては、ロイコノストック・メセンテロイデスNBRC100496、ロイコノストック・ラクチス（別名：ロイコノストック・ガーリカム）JCM1142、ロイコノストック・オエニJCM6125、NBRC100497、PV4及びElios 1、ラクトコッカス・ラクチス・ラクチス亜種NBRC12007、ラクトコッカス・ガルビエNBRC100934、ペディオコッカス・アシジラクチシNBRC3885、ペディオコッカス・ペントサセウスJCM20314及びNK-2、ラクトバチルス・パラカセイKW3110、ラクトバチルス・ナムレンシスJCM15612、ラクトバチルス・クラストラムJCM15951、ラクトバチルス・フェルメンタムNBRC3961、ラクトバチルス・パラケフィリJCM8574、ラクトバチルス・ペントサスJCM8333、JCM8334及びJCM8335、並びにラクトバチルス・プランタラムJCM20110、JCM1551、JCM6551及びKTが挙げられる。これらの菌株は、後述する実施例において、in vitro、及びGTTによる評価においてプラスミノーゲンの活性化を高く増強することが確認されている。またこれらの菌株は、高温（100℃又は121℃）で一定時間加熱処理をした後も、所望のプラスミノーゲン活性化増強作用を保持しており、後述する用途においても好適に用いることができる。
Accordingly, in the present invention, any lactic acid bacterium can be used as long as it is evaluated as having a plasminogen activation enhancing action by the method as described above. Preferred lactic acid bacteria having such plasminogen activation enhancing action include Leuconostoc mesenteroides NBRC100496, Leuconostoc lactis (also known as Leuconostok Garlicum) JCM1142, Leuconostoc Oeni JCM6125, NBRC100497, PV4 And
上記菌株の入手先を表１に示す。なお、表中、「入手先」の欄において、「NBRC」は独立行政法人製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門（NBRC）を表し、「JCM」は独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンターを表す。 Table 1 shows the sources of the strains. In the “Source” column of the table, “NBRC” represents the National Institute for Product Evaluation and Technology Biological Genetic Resources (NBRC), and “JCM” represents the RIKEN BioResource Center.
なお、本発明において、上記の乳酸菌の中のL. paracasei KW3110株は、特許文献（特開2005-137357号公報）に記載の通り、本出願人により、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌として選抜された株であり、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基づく国際寄託当局である独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、FERM BP-08634として寄託されている（寄託日：2004年2月20日）。 In the present invention, the L. paracasei KW3110 strain among the above lactic acid bacteria was selected by the present applicant as a lactic acid bacterium having high antiallergic activity, as described in a patent document (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-137357). Incorporated administrative agency National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1st, 1st East, 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan) , FERM BP-08634 (Deposit date: February 20, 2004).
上述した具体的な菌株のうち、特に高いプラスミノーゲン活性化増強作用を有する乳酸菌は、ロイコノストック・ラクチス（別名：ロイコノストック・ガーリカム）JCM1142、ロイコノストック・オエニJCM6125、NBRC100497及びPV4、ペディオコッカス・ペントサセウスNK-2、ラクトバチルス・ナムレンシスJCM15612、ラクトバチルス・クラストラムJCM15951、ラクトバチルス・フェルメンタムNBRC3961、ラクトバチルス・ペントサスJCM8333、JCM8334及びJCM8335、並びにラクトバチルス・プランタラムJCM20110、JCM1551及びKTである。また、特にロイコノストック・ラクチスJCM1142、ラクトバチルス・ペントサスJCM8333、及びロイコノストック・オエニJCM6125は、以前に文献（非特許文献２）において最も高い作用を有すると報告されているLactobacillus gallinarum JCM 8782株（＝Lactobacillus gallinarum T-50株）と比べて約60〜150倍も高いプラスミノーゲン活性化増強作用を有するものである（実施例２参照）。 Among the specific strains described above, lactic acid bacteria having a particularly high plasminogen activation enhancing action are Leuconostoc lactis (also known as Leuconostoc Garlicum) JCM1142, Leuconostoc Oeni JCM6125, NBRC100497 and PV4, Pediococcus pentosaceus NK-2, Lactobacillus namrensis JCM15612, Lactobacillus crustram JCM15951, Lactobacillus fermentum NBRC3961, Lactobacillus pentosus JCM8333, JCM8334 and JCM8335, and Lactobacillus plantarum JCM20110, JCM1551 It is. In particular, Leuconostoc lactis JCM1142, Lactobacillus pentosus JCM8333, and Leuconostoc Oeni JCM6125 have previously been reported to have the highest action in the literature (Non-patent document 2) Lactobacillus gallinarum JCM 8782 strain Compared with (= Lactobacillus gallinarum T-50 strain), it has a plasminogen activation enhancing action that is about 60 to 150 times higher (see Example 2).
また本発明においては、上述した具体的な菌株の変異株又は派生株も、プラスミノーゲン活性化増強作用を有する限り使用することができる。 In the present invention, the mutant strains or derivative strains of the above-mentioned specific strains can also be used as long as they have a plasminogen activation enhancing action.
乳酸菌は、乳酸菌の培養に通常用いられる培地を使用して、適当な条件下で培養することにより調製することができる。培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、乳酸菌の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば使用する菌株に適切な公知の培地を適宜選ぶことができる。炭素源としてはラクトース、グルコース、スクロース、フラクトース、ガラクトース、廃糖蜜などを使用することができ、窒素源としてはカゼインの加水分解物、ホエータンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物を使用することができる。また無機塩類としては、リン酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどを用いることができる。乳酸菌の培養に適した培地としては、例えばMRS液体培地、GAM培地、BL培地、Briggs Liver Broth、獣乳、脱脂乳、乳性ホエーなどが挙げられる。好ましくは、滅菌されたMRS培地（Difco社製）を使用することができる。天然培地としては、トマトジュース、ニンジンジュース、その他野菜ジュース、あるいはリンゴ、パイナップル、ブドウ果汁などを使用することができる。 Lactic acid bacteria can be prepared by culturing under suitable conditions using a medium usually used for culturing lactic acid bacteria. As long as the medium used for culture contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like and can culture lactic acid bacteria efficiently, either a natural medium or a synthetic medium may be used. If so, a known medium suitable for the strain to be used can be appropriately selected. Lactose, glucose, sucrose, fructose, galactose, molasses etc. can be used as carbon source, and organic nitrogen containing casein hydrolyzate, whey protein hydrolyzate, soy protein hydrolyzate etc. as nitrogen source Things can be used. As inorganic salts, phosphates, sodium, potassium, magnesium and the like can be used. Examples of the medium suitable for culturing lactic acid bacteria include MRS liquid medium, GAM medium, BL medium, Briggs Liver Broth, animal milk, skim milk, and milky whey. Preferably, a sterilized MRS medium (Difco) can be used. As the natural medium, tomato juice, carrot juice, other vegetable juice, apple, pineapple, grape juice, or the like can be used.
また乳酸菌の培養は、20℃から50℃、好ましくは25℃から42℃、より好ましくは約37℃において、嫌気条件下で行う。温度条件は、恒温槽、マントルヒーター、ジャケットなどにより調整することができる。また、嫌気条件下とは、乳酸菌が増殖可能な程度の低酸素環境下のことであり、例えば嫌気チャンバー、嫌気ボックス又は脱酸素剤を入れた密閉容器若しくは袋などを使用することにより、あるいは単に培養容器を密閉することにより、嫌気条件とすることができる。培養の形式は、静置培養、振とう培養、タンク培養などである。また、培養時間は３時間から96時間とすることができる。培養開始時の培地のpHは4.0〜8.0に維持することが好ましい。 The lactic acid bacteria are cultured at 20 to 50 ° C., preferably 25 to 42 ° C., more preferably about 37 ° C. under anaerobic conditions. The temperature condition can be adjusted by a thermostatic bath, a mantle heater, a jacket, or the like. The anaerobic condition means a low oxygen environment in which lactic acid bacteria can grow. For example, an anaerobic chamber, an anaerobic box, a sealed container or bag containing an oxygen scavenger, or the like is used. Anaerobic conditions can be achieved by sealing the culture vessel. The culture format is stationary culture, shake culture, tank culture, or the like. Further, the culture time can be 3 hours to 96 hours. The pH of the medium at the start of the culture is preferably maintained at 4.0 to 8.0.
乳酸菌の具体的な調製例を簡単に説明する。例えば乳酸菌として表１に列挙した菌株を用いる場合には、前培養として、MRS液体培地において約37℃にて約24時間培養した後、本培養として、MRS液体培地に前培養した乳酸菌を1％程度で植菌し、約37℃で一晩（約18時間）かけて静置培養を行う。 A specific preparation example of lactic acid bacteria will be briefly described. For example, when the strains listed in Table 1 are used as lactic acid bacteria, 1% of lactic acid bacteria pre-cultured in MRS liquid medium after pre-cultured in MRS liquid medium at about 37 ° C. for about 24 hours. Inoculate to a certain degree and perform static culture at about 37 ° C overnight (about 18 hours).
培養後、得られる乳酸菌培養物をそのまま使用してもよいし、さらに必要に応じて遠心分離などによる粗精製及び／又は濾過等による固液分離や滅菌操作を行ってもよい。なお、本発明のプラスミノーゲン活性化剤に使用する乳酸菌は、生菌体であっても死菌体であってもよく、湿潤菌体であっても乾燥菌体であってもよい。また、所望により、乳酸菌にさらなる処理を行って、乳酸菌の処理物を得てもよい。そのような処理の例を以下に記載する。 After culturing, the obtained lactic acid bacteria culture may be used as it is, or may be subjected to solid-liquid separation by centrifuging and / or filtration and / or sterilization, if necessary. The lactic acid bacterium used for the plasminogen activator of the present invention may be a live cell or a dead cell, and may be a wet cell or a dry cell. If desired, the lactic acid bacterium may be further processed to obtain a processed product of the lactic acid bacterium. An example of such processing is described below.
乳酸菌又はその処理物を適当な溶媒に懸濁又は希釈することによって、懸濁物又は希釈物を調製することができる。使用することができる溶媒としては、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などが挙げられる。 A suspension or dilution can be prepared by suspending or diluting lactic acid bacteria or a processed product thereof in a suitable solvent. Examples of the solvent that can be used include water, physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), and the like.
乳酸菌又はその処理物を用いて生乳、脱脂粉乳又は豆乳を発酵することにより、発酵物を調製することができる。例えば、乳酸菌又は他の処理を行った乳酸菌を、生乳、脱脂粉乳又は豆乳などに接種し、当技術分野で公知の乳酸菌発酵条件（上述した乳酸菌培養の条件とほぼ同じである）にて発酵を行う。得られる発酵物は、そのまま使用してもよいし、又は濾過、滅菌、希釈、濃縮などの他の処理を行ってもよい。 A fermented material can be prepared by fermenting raw milk, skim milk powder or soy milk using lactic acid bacteria or a processed product thereof. For example, lactic acid bacteria or other treated lactic acid bacteria are inoculated into raw milk, skim milk powder or soy milk, and fermented under lactic acid bacteria fermentation conditions known in the art (substantially the same as the lactic acid bacteria culture conditions described above). Do. The obtained fermented product may be used as it is, or may be subjected to other treatments such as filtration, sterilization, dilution and concentration.
また、乳酸菌又はその処理物を加熱処理することにより、加熱処理物を調製することができる。加熱処理物を調製するには、乳酸菌又はその処理物を、一定時間、例えば約10分〜１時間（例えば約10〜20分）にわたり、高温処理（例えば80〜150℃）する。 Moreover, a heat-treated product can be prepared by heat-treating lactic acid bacteria or a treated product thereof. In order to prepare the heat-treated product, the lactic acid bacteria or the treated product is treated at a high temperature (for example, 80 to 150 ° C.) for a certain period of time, for example, about 10 minutes to 1 hour (for example, about 10 to 20 minutes).
乳酸菌又はその処理物を滅菌処理によって、滅菌処理物を調製することができる。乳酸菌又はその処理物を滅菌処理するには、例えば、濾過滅菌、放射性殺菌、過熱式殺菌、加圧式殺菌などの公知の滅菌処理を行うことができる。 A sterilized product can be prepared by sterilizing a lactic acid bacterium or a processed product thereof. In order to sterilize lactic acid bacteria or a processed product thereof, for example, known sterilization processes such as filtration sterilization, radioactive sterilization, superheat sterilization, and pressure sterilization can be performed.
乳酸菌又はその処理物を破砕することによって、破砕物、無細胞抽出物を調製することができる。例えばそのような破砕は、超音波処理又はフィルター濾過により行うことができる。 By crushing lactic acid bacteria or a processed product thereof, a crushed product and a cell-free extract can be prepared. For example, such crushing can be performed by sonication or filter filtration.
乳酸菌又はその処理物を、適当な水性溶媒又は有機溶媒を用いて抽出することによって、抽出物を得ることができる。抽出方法としては、水性溶媒又は有機溶媒を抽出溶媒として用いる抽出方法であれば特に制限されないが、上記の乳酸菌又は乳酸菌に他の処理を行った処理物を、水性又は有機溶媒（例えば水、メタノール、エタノールなど）中に浸漬、攪拌又は還流する方法など公知の方法を挙げることができる。 An extract can be obtained by extracting lactic acid bacteria or its processed material using a suitable aqueous solvent or organic solvent. The extraction method is not particularly limited as long as it is an extraction method using an aqueous solvent or an organic solvent as an extraction solvent, but the lactic acid bacterium or a processed product obtained by performing other treatment on the lactic acid bacterium is treated with an aqueous or organic solvent (for example, water, methanol). And a known method such as a method of immersing, stirring or refluxing in ethanol).
また、乳酸菌又はその処理物を乾燥して粉状物又は粒状物とすることができる。具体的な乾燥方法としては、特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、ドラム乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などが挙げられ、これらを単独で又は組み合わせて採用できる。その際、必要に応じて通常用いられる賦形剤を添加してもよい。 Moreover, lactic acid bacteria or its processed material can be dried and it can be set as a powdery thing or a granular material. Although it does not restrict | limit especially as a specific drying method, For example, spray drying, drum drying, vacuum drying, freeze-drying etc. are mentioned, These can be employ | adopted individually or in combination. In that case, you may add the excipient | filler normally used as needed.
さらに、乳酸菌の菌体又はその処理物から、公知の分離・精製法を用いて、プラスミノーゲン活性化増強作用、すなわち血栓溶解作用を有する成分又は画分を精製してもよい。そのような分離・精製法としては、塩沈殿及び有機溶媒沈殿などの溶解性を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティクロマトグラフィーのような特異的結合を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどの疎水性を利用する方法などが挙げられ、これらの方法の１種を、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。 Furthermore, a component or fraction having a plasminogen activation enhancing action, that is, a thrombolytic action, may be purified from lactic acid bacteria or a processed product thereof using a known separation / purification method. Such separation / purification methods include methods utilizing solubility such as salt precipitation and organic solvent precipitation, methods utilizing differences in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration and gel filtration, and ion exchange chromatography. Examples include a method using a difference in charge, a method using specific binding such as affinity chromatography, a method using hydrophobicity such as hydrophobic chromatography and reverse phase chromatography, and the like. , Or two or more types can be used in combination.
上述した処理は、単一の処理を行ってもよいし、あるいは複数を適宜組み合わせて行ってもよい。本発明においては、このような乳酸菌の処理物もプラスミノーゲン活性化剤に用いることができる。 The processes described above may be performed as a single process, or may be performed by appropriately combining a plurality of processes. In the present invention, such a processed product of lactic acid bacteria can also be used as a plasminogen activator.
本発明のプラスミノーゲン活性化剤に含まれる乳酸菌は、乳酸菌数又は処理前の乳酸菌数として、約1.5×107個／ml〜約1.5×1011個／ml程度である。 The lactic acid bacteria contained in the plasminogen activator of the present invention is about 1.5 × 10 7 / ml to about 1.5 × 10 11 / ml as the number of lactic acid bacteria or the number of lactic acid bacteria before treatment.
上記で得られた乳酸菌又はその処理物は、単独で又は他の成分を共に、プラスミノーゲン活性化剤として、又は食品、飼料、化粧料若しくは医薬組成物に配合して継続的に摂取すると、血栓性疾患の予防、改善及び治療効果が期待される。また、乳酸菌又はその処理物は、プラスミノーゲン活性化剤として、プラスミノーゲンを含む線維素溶解系の解明や、他の血栓溶解性物質の探索・スクリーニングなどのために試験又は研究において使用することも可能である。 The lactic acid bacterium obtained as described above or a processed product thereof, alone or together with other components, as a plasminogen activator or when continuously ingested in a food, feed, cosmetic or pharmaceutical composition, Expected to be effective in preventing, improving and treating thrombotic diseases. In addition, lactic acid bacteria or processed products thereof are used as plasminogen activators in tests or research for elucidation of fibrinolytic systems containing plasminogen and for the search and screening of other thrombolytic substances. It is also possible.
本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、有効成分として上述した乳酸菌又はその処理物を含むものであるが、１種の乳酸菌又はその処理物を含んでもよいし、複数の異なる乳酸菌又はその処理物、さらには異なる処理を行った複数の処理物を組み合わせて含んでもよい。 The plasminogen activator of the present invention includes the lactic acid bacterium described above or a processed product thereof as an active ingredient, but may include one kind of lactic acid bacterium or a processed product thereof, a plurality of different lactic acid bacteria or a processed product thereof, May include a combination of a plurality of processed products subjected to different processes.
また本発明のプラスミノーゲン活性化剤には、有効成分である乳酸菌又はその処理物に加えて、目的とする作用を阻害しない限り、後述する添加剤、他の公知のプラスミノーゲン活性化剤、血栓溶解剤などを単独又は複数組み合わせて添加してもよい。 In addition, the plasminogen activator of the present invention includes additives, which will be described later, and other known plasminogen activators, in addition to the lactic acid bacterium which is an active ingredient or a processed product thereof, as long as the intended action is not inhibited. A thrombolytic agent or the like may be added alone or in combination.
本発明のプラスミノーゲン活性化剤の形態は特に制限されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤、吸入剤などの経口剤、坐剤などの経腸製剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤などの皮膚外用剤、点滴剤、注射剤などの剤型としてもよい。これらのうちでは、経口剤とするのが好ましい。なお、液剤、懸濁剤などの液体製剤は、服用直前に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよく、また錠剤、顆粒剤の場合には周知の方法でその表面をコーティングしてもよい。さらに、本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、当技術分野で公知の技術を使用して、徐放性製剤、遅延放出製剤又は即時放出製剤などの放出が制御された製剤としてもよい。 Although the form of the plasminogen activator of the present invention is not particularly limited, for example, oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, powders, syrups, dry syrups, liquids, suspensions, inhalants, Enteral preparations such as suppositories, ointments, creams, gels, external preparations for skin such as patches, drops and injections may be used. Of these, oral preparations are preferred. Liquid preparations such as liquids and suspensions may be dissolved or suspended in water or other appropriate medium immediately before taking. In the case of tablets and granules, the preparations may be prepared by well-known methods. The surface may be coated. Furthermore, the plasminogen activator of the present invention may be a controlled release formulation such as a sustained release formulation, a delayed release formulation or an immediate release formulation using techniques known in the art.
このような剤型のプラスミノーゲン活性化剤は、上述した成分に、通常用いられる賦形剤、崩壊剤、結合剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、滑沢剤、保存剤、界面活性剤、甘味料、矯味剤、芳香剤、酸味料、着色剤などの添加剤を剤型に応じて配合し、常法に従って製造することができる。例えば、プラスミノーゲン活性化剤を医薬組成物とする場合には、医薬上許容される担体又は添加剤を配合することができる。そのような医薬上許容される担体及び添加物の例として、水、医薬上許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などの他、リポゾームなどの人工細胞構造物などが挙げられる。 Such dosage forms of plasminogen activator include the above-mentioned components, commonly used excipients, disintegrants, binders, wetting agents, stabilizers, buffers, lubricants, preservatives, surface active agents. Additives such as agents, sweeteners, flavoring agents, fragrances, acidulants, and coloring agents can be blended according to the dosage form, and can be produced according to conventional methods. For example, when a plasminogen activator is used as a pharmaceutical composition, a pharmaceutically acceptable carrier or additive can be blended. Examples of such pharmaceutically acceptable carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, water-soluble dextrin, carboxy Sodium methyl starch, pectin, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, acceptable as a pharmaceutical additive In addition to surfactants, artificial cell structures such as liposomes can be used.
本発明のプラスミノーゲン活性化剤が、上記添加剤や他のプラスミノーゲン活性化剤、他の血栓溶解剤などを含む場合、有効成分である乳酸菌又はその処理物の含有量は、その剤型により異なるが、処理前の乳酸菌の量として、通常は、0.01〜99質量％、好ましくは0.1〜80質量％、より好ましくは1〜75質量％の範囲であり、乳酸菌の処理物（例えば濃縮物）としては、通常は、0.0001〜80質量％、好ましくは0.001〜50質量％、より好ましくは0.1〜40質量％の範囲であり、有効成分の望ましい摂取量を摂取できるように、１日当たりの投与量が管理できる形にするのが望ましい。 When the plasminogen activator of the present invention contains the above-mentioned additives, other plasminogen activators, other thrombolytic agents, etc., the content of lactic acid bacteria that are active ingredients or processed products thereof is the agent Although it depends on the type, the amount of lactic acid bacteria before treatment is usually in the range of 0.01 to 99% by mass, preferably 0.1 to 80% by mass, more preferably 1 to 75% by mass. In general, it is in the range of 0.0001 to 80% by mass, preferably 0.001 to 50% by mass, more preferably 0.1 to 40% by mass, so that a desired intake of the active ingredient can be ingested. It is desirable to manage the dose.
さらに、本発明のプラスミノーゲン活性化剤には、医薬、食品、飼料の製造に用いられる種々の添加剤やその他種々の物質を共存させてもよい。このような物質や添加剤としては、各種油脂（例えば、大豆油、コーン油、サフラワー油、オリーブ油などの植物油、牛脂、イワシ油などの動物油脂）、生薬（例えばロイヤルゼリー、人参など）、アミノ酸（例えばグルタミン、システイン、ロイシン、アルギニンなど）、多価アルコール（例えばエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、糖アルコール、例としてソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、マンニトールなど）、天然高分子（例えばアラビアガム、寒天、水溶性コーンファイバー、ゼラチン、キサンタンガム、カゼイン、グルテン又はグルテン加水分解物、レシチン、澱粉、デキストリンなど）、ビタミン（例えばビタミンC、ビタミンB群など）、ミネラル（例えばカルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄など）、食物繊維（例えばマンナン、ペクチン、ヘミセルロースなど）、界面活性剤（例えばグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルなど）、精製水、賦形剤（例えばブドウ糖、コーンスターチ、乳糖、デキストリンなど）、安定剤、pH調製剤、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、酸味料、着色料及び香料などが挙げられる。 Furthermore, the plasminogen activator of the present invention may coexist with various additives and other various substances used in the production of pharmaceuticals, foods, and feeds. Such substances and additives include various fats and oils (for example, vegetable oils such as soybean oil, corn oil, safflower oil, olive oil, animal fats such as beef tallow and sardine oil), herbal medicines (eg royal jelly, carrots, etc.), Amino acids (eg, glutamine, cysteine, leucine, arginine, etc.), polyhydric alcohols (eg, ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, sugar alcohols such as sorbitol, erythritol, xylitol, maltitol, mannitol, etc.), natural polymers (For example, gum arabic, agar, water-soluble corn fiber, gelatin, xanthan gum, casein, gluten or gluten hydrolyzate, lecithin, starch, dextrin, etc.), vitamins (for example, vitamin C, vitamin B group), minerals For example, calcium, magnesium, zinc, iron, etc.), dietary fiber (eg, mannan, pectin, hemicellulose, etc.), surfactant (eg, glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, etc.), purified water, excipient (eg, glucose, corn starch, Lactose, dextrin, etc.), stabilizers, pH adjusters, antioxidants, sweeteners, flavoring ingredients, acidulants, colorants and flavors.
また、他の公知のプラスミノーゲン活性化剤や血栓溶解剤の他にも、機能性成分若しくは添加剤として、上記以外に、例えば、タウリン、グルタチオン、カルニチン、クレアチン、コエンザイムQ、グルクロン酸、グルクロノラクトン、トウガラシエキス、ショウガエキス、カカオエキス、ガラナエキス、ガルシニアエキス、テアニン、γ-アミノ酪酸、カプサイシン、カプシエイト、各種有機酸、フラボノイド類、ポリフェノール類、カテキン類、キサンチン誘導体、フラクトオリゴ糖などの難消化性オリゴ糖、ポリビニルピロリドンなどを配合することができる。 In addition to other known plasminogen activators and thrombolytic agents, as functional components or additives, in addition to the above, for example, taurine, glutathione, carnitine, creatine, coenzyme Q, glucuronic acid, glucuronic acid, Chronolactone, pepper extract, ginger extract, cacao extract, guarana extract, garcinia extract, theanine, γ-aminobutyric acid, capsaicin, capsiate, various organic acids, flavonoids, polyphenols, catechins, xanthine derivatives, fructooligosaccharides, etc. Digestible oligosaccharides, polyvinylpyrrolidone and the like can be blended.
これら添加剤の配合量は、添加剤の種類と所望すべき摂取量に応じて適宜決められるが、プラスミノーゲン活性化剤の総量に対して、一般的には0.01〜90質量％の範囲であり、好ましくは0.1〜50質量％の範囲である。 The amount of these additives is appropriately determined according to the type of additive and the amount of intake to be desired, but is generally in the range of 0.01 to 90% by mass with respect to the total amount of plasminogen activator. Yes, preferably in the range of 0.1 to 50% by weight.
本発明のプラスミノーゲン活性化剤を投与又は摂取する対象は、脊椎動物、具体的には、哺乳動物、例えばヒト、霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラットなど）、さらには爬虫類及び鳥類である。特に、遺伝的若しくは環境的要因により血栓を形成しやすいヒト、又は以前に血栓症の発症履歴のあるヒトが対象として好ましい。 Subjects to be administered or ingested with the plasminogen activator of the present invention are vertebrates, specifically mammals such as humans, primates (monkeys, chimpanzees, etc.), livestock animals (bovines, horses, pigs, sheep). Etc.), pet animals (dogs, cats, etc.), laboratory animals (mouse, rats, etc.), reptiles and birds. In particular, a human subject who easily forms a thrombus due to genetic or environmental factors, or a human who has a history of onset of thrombosis in the past is preferable.
本発明のプラスミノーゲン活性化剤の投与又は摂取量は、対象の年齢及び体重、投与・摂取経路、投与・摂取回数により異なり、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。例えば、経口的に投与又は摂取する場合には、プラスミノーゲン活性化剤に含まれる乳酸菌及び／又はその処理物の投与・摂取量は、処理前の乳酸菌の量として、通常0.1〜5000 mg/day、好ましくは1〜500 mg/dayである。乳酸菌の含有割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量等に合わせて適宜調節すればよい。例えば剤型が液体の場合には、乳酸菌体濃度を1×10５cells/ml〜1×1010cells/mlとすることが好ましく、固体の場合には、1×10５cells/g〜1×1010cells/gとすることが好ましい。本発明のプラスミノーゲン活性化剤は安全性の高いものであるため、摂取量をさらに増やすこともできる。１日当たりの摂取量は、１回で摂取してもよいが、数回に分けて摂取してもよい。また、その投与又は摂取の頻度も、特に限定されず、投与・摂取経路、対象の年齢及び体重、血栓性疾患の症状、及び疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。 The administration or intake of the plasminogen activator of the present invention varies depending on the age and weight of the subject, the administration / intake route, the number of administration / ingestion, and can be widely changed at the discretion of those skilled in the art. For example, in the case of oral administration or ingestion, the administration / intake amount of lactic acid bacteria and / or processed products thereof contained in the plasminogen activator is usually 0.1 to 5000 mg / day, preferably 1 to 500 mg / day. The content ratio of lactic acid bacteria is not particularly limited, and may be appropriately adjusted in accordance with ease of production, a preferable daily dose, and the like. For example, when the dosage form is liquid, the concentration of lactic acid bacteria is preferably 1 × 10 5 cells / ml to 1 × 10 10 cells / ml, and when solid, 1 × 10 5 cells / g to 1 × 10 10 cells / g is preferable. Since the plasminogen activator of the present invention is highly safe, the intake can be further increased. The daily intake may be taken once, but may be taken in several divided doses. In addition, the frequency of administration or ingestion is not particularly limited, and should be appropriately selected according to various conditions such as administration / intake route, age and weight of the subject, symptoms of thrombotic disease, and severity of the disease. Is possible.
本発明のプラスミノーゲン活性化剤の投与・摂取経路は特に限定されず、経口投与若しくは摂取、又は非経口投与（例えば気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内投与）などが挙げられる。本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、特に経口的に投与又は摂取することが好ましい。 The route of administration / intake of the plasminogen activator of the present invention is not particularly limited, and includes oral administration or ingestion, parenteral administration (eg, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous administration) and the like. . The plasminogen activator of the present invention is particularly preferably administered or ingested orally.
本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、繊維素溶解系におけるプラスミノーゲンの活性化を増強することで、血栓を溶解する作用を有し、血栓性疾患に対して、優れた予防、改善及び治療効果を示す。また、安全性が高く長期間の継続的摂取が容易である。そのため、本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、血栓形成に対する予防及び改善のための食品、飼料及び化粧料にも使用できる。さらに、本発明のプラスミノーゲン活性化剤、食品、化粧料又は飼料を、上述した摂取量を管理できる形態で摂取することにより、血栓性疾患に対する予防方法及び治療方法が提供される。 The plasminogen activator of the present invention has an action of dissolving a thrombus by enhancing the activation of plasminogen in a fibrinolysis system, and has excellent prevention, improvement and Shows therapeutic effect. In addition, it is safe and easy to take for a long time. Therefore, the plasminogen activator of the present invention can also be used in foods, feeds and cosmetics for prevention and improvement of thrombus formation. Furthermore, by taking the plasminogen activator, food, cosmetics or feed of the present invention in a form in which the above-mentioned intake can be controlled, a method for preventing and treating thrombotic diseases is provided.
上述したように、本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、医薬組成物又は機能性食品として、血栓性疾患の予防又は治療のために用いることができる。本発明において「血栓性疾患」とは、血液の塊、すなわち血栓が、血管（動脈及び静脈）を防ぐことにより又は血管壁の細胞（血管内皮細胞）を傷害することにより引き起こされる疾患を指す。血栓性疾患には、例えば限定されるものではないが、一過性脳虚血発作、脳梗塞（脳血栓、脳塞栓）、虚血性狭心症、心筋梗塞、動脈血栓症、静脈血栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞症、末梢静脈閉塞症、肺血栓症及び肺塞栓症が含まれる。 As described above, the plasminogen activator of the present invention can be used as a pharmaceutical composition or functional food for the prevention or treatment of thrombotic diseases. In the present invention, the term “thrombotic disease” refers to a disease caused by a blood clot, that is, a thrombus, by preventing blood vessels (arteries and veins) or damaging vascular wall cells (vascular endothelial cells). Examples of thrombotic diseases include, but are not limited to, transient cerebral ischemic attack, cerebral infarction (cerebral thrombosis, cerebral embolism), ischemic angina, myocardial infarction, arterial thrombosis, venous thrombosis, deep Venous thrombosis, peripheral artery occlusion, peripheral vein occlusion, pulmonary thrombosis and pulmonary embolism are included.
また本発明において、血栓性疾患の「予防又は治療」とは、動物やヒトなどの対象において、血栓性疾患の発症の予防、血栓性疾患の発症後（病的状態）の治療を意味するが、血栓性疾患の発症を遅延又は抑制することも意味する。また、血栓性疾患に起因して発症する疾患又は障害の発症を防止することも含まれる。例えば、予防目的で本発明のプラスミノーゲン活性化剤を使用する場合、血栓性疾患の素因となる遺伝的要因、環境的要因若しくは他の異常を有する対象、又は以前に血栓症の発症履歴のある対象に投与又は摂取させることが好ましい。具体的には、静脈血栓塞栓症の傾向を増大させる遺伝的要因として、活性化プロテインC（APC）に対する抵抗性を生じる第V因子Leiden変異、プロトロンビン20210遺伝子変異、及びプロテインC、プロテインS、プロテインZ又はアンチトロンビン欠乏症が知られている。また、静脈及び動脈血栓症の素因となる後天性異常として、ヘパリン誘発性血小板減少症/血栓症、抗リン脂質抗体の存在、及び高ホモシステイン血症が知られている。また、静脈血栓のリスク要因として、手術又は麻痺などによる寝たきり状態に関連して起こるうっ血、心不全、妊娠、肥満、外傷又は手術による組織損傷、腫瘍、敗血症、アテローム性動脈硬化症が知られている。また、以前に血栓症の発症履歴がある場合には、その再発の防止のために本発明のプラスミノーゲン活性化剤を使用することができる。 In the present invention, “prevention or treatment” of a thrombotic disease means prevention of the development of a thrombotic disease or treatment after the onset of a thrombotic disease (pathological condition) in a subject such as an animal or a human. It also means delaying or suppressing the onset of thrombotic diseases. It also includes preventing the onset of diseases or disorders that develop due to thrombotic diseases. For example, when using the plasminogen activator of the present invention for prophylactic purposes, subjects with genetic factors, environmental factors or other abnormalities that predispose to thrombotic disease, or a history of the onset of thrombosis previously It is preferable to administer or ingest a subject. Specifically, genetic factors that increase the tendency of venous thromboembolism include factor V Leiden mutation, prothrombin 20210 gene mutation, and protein C, protein S, protein that cause resistance to activated protein C (APC) Z or antithrombin deficiency is known. Also known as acquired abnormalities that predispose to venous and arterial thrombosis are heparin-induced thrombocytopenia / thrombosis, the presence of antiphospholipid antibodies, and hyperhomocysteinemia. Known risk factors for venous thrombosis include congestion, heart failure, pregnancy, obesity, trauma or tissue damage due to trauma or surgery, tumors, sepsis, atherosclerosis associated with bedridden conditions such as surgery or paralysis . Also, if there is a history of thrombosis before, the plasminogen activator of the present invention can be used to prevent recurrence.
本発明に係るプラスミノーゲン活性化剤により治療又は予防の対象となる血栓性疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよい。 The thrombotic disease to be treated or prevented by the plasminogen activator according to the present invention may be a single disease, a concurrent disease, or a disease other than the above. Also good.
本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、他の医薬、治療又は予防法等と併用してもよい。このような他の医薬は、本発明のプラスミノーゲン活性化剤と共に一製剤を成していてもよいし、また、別々の製剤であって同時に又は間隔を空けて投与してもよい。 The plasminogen activator of the present invention may be used in combination with other medicines, treatment or prevention methods. Such other medicaments may form one preparation together with the plasminogen activator of the present invention, or may be administered in separate preparations at the same time or at intervals.
上述したように、本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、血栓溶解作用を有するうえ、食経験のある乳酸菌を含むものであり、安全性が高い。また、有効成分として含まれる乳酸菌又はその処理物は、高温処理後でもプラスミノーゲン活性化増強作用を保持することから、食品などの加工処理に適している。さらに、様々な食品に添加しても食品自体の風味を阻害しないため、種々の食品に添加して継続的に摂取することができ、血栓性疾患の予防及び改善が期待される。 As described above, the plasminogen activator of the present invention has a thrombolytic action and includes lactic acid bacteria having a dietary experience, and has high safety. Moreover, the lactic acid bacteria contained as an active ingredient or a processed product thereof is suitable for processing foods and the like because it retains the plasminogen activation enhancing action even after high temperature treatment. Furthermore, since it does not inhibit the flavor of the food itself even if added to various foods, it can be added to various foods and continuously ingested, and prevention and improvement of thrombotic diseases are expected.
本発明の食品は、上述したプラスミノーゲン活性化剤を含有する。本発明において、食品には飲料も包含される。本発明のプラスミノーゲン活性化剤を含有する食品には、血栓溶解作用により健康増進を図る健康食品、機能性食品、特定保健用食品などの他、上記プラスミノーゲン活性化剤を配合できる、全ての食品が含まれる。 The food of the present invention contains the plasminogen activator described above. In the present invention, the food includes beverages. The food containing the plasminogen activator of the present invention can be blended with the above plasminogen activator in addition to health foods, functional foods, foods for specified health use, etc. that promote health by thrombolytic action, All foods are included.
本発明のプラスミノーゲン活性化剤を含有する食品として、機能性食品はとりわけ好ましい。本発明の「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ[特定保健用食品]を含む）及び栄養機能食品を含む保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤などの各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。本発明の機能性食品はまた、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康食品を包含する。 As a food containing the plasminogen activator of the present invention, a functional food is particularly preferable. The “functional food” of the present invention means a food having a certain functionality for a living body, and includes, for example, food for specified health use (including conditional tokuho [food for specified health use]) and nutritional function food. So-called health foods such as functional health foods, special-purpose foods, dietary supplements, health supplements, supplements (for example, in various dosage forms such as tablets, coated tablets, dragees, capsules and liquids) and beauty foods (for example, diet foods) Includes all foods. The functional food of the present invention also includes a health food to which a health claim based on the food standards of Codex (FAO / WHO Joint Food Standards Committee) is applied.
食品の具体例としては、経管経腸栄養剤などの流動食、錠菓、錠剤、チュアブル錠、錠剤、粉剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤及びドリンク剤などの製剤形態の健康食品及び栄養補助食品；緑茶、ウーロン茶及び紅茶などの茶飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、スポーツ飲料、乳飲料、炭酸飲料、野菜飲料、果汁飲料、醗酵野菜飲料、醗酵果汁飲料、発酵乳飲料（ヨーグルトなど）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳など）、粉末飲料、ココア飲料、牛乳並びに精製水などの飲料；バター、ジャム、ふりかけ及びマーガリンなどのスプレッド類；マヨネーズ、ショートニング、カスタードクリーム、ドレッシング類、パン類、米飯類、麺類、パスタ、味噌汁、豆腐、ヨーグルト、スープ又はソース類、菓子（例えば、ビスケットやクッキー類、チョコレート、キャンディ、ケーキ、アイスクリーム、チューインガム、タブレット）などが挙げられる。 Specific examples of foods include liquid foods such as tube enteral nutrition, tablet foods, tablets, chewable tablets, tablets, powders, powders, capsules, granules, drinks, and other health foods and nutritional supplements. Foods: Tea drinks such as green tea, oolong tea and black tea, soft drinks, jelly drinks, sports drinks, milk drinks, carbonated drinks, vegetable drinks, fruit juice drinks, fermented vegetable drinks, fermented fruit drinks, fermented milk drinks (yogurt etc.), lactic acid bacteria Beverages, milk drinks (coffee milk, fruit milk, etc.), powdered drinks, cocoa drinks, milk and drinks such as purified water; spreads such as butter, jam, sprinkles and margarine; mayonnaise, shortening, custard cream, dressings, bread , Rice, noodles, pasta, miso soup, tofu, yogurt, soup or sauces, confectionery (for example, biscuits and Cookie class, chocolate, candy, cake, ice cream, chewing gum, tablets), and the like.
本発明の食品は、上記プラスミノーゲン活性化剤のほかに、その食品の製造に用いられる他の食品素材、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、食物繊維、種々の添加剤（例えば呈味成分、甘味料、有機酸などの酸味料、安定剤、フレーバー）などを配合して、常法に従って製造することができる。 In addition to the above plasminogen activator, the food of the present invention includes other food materials used in the production of the food, various nutrients, various vitamins, minerals, dietary fiber, various additives (for example, taste ingredients, A sweetener, a sour agent such as an organic acid, a stabilizer, a flavor) and the like can be blended and manufactured according to a conventional method.
本発明の食品において、プラスミノーゲン活性化剤の配合量は、食品の形態や求められる食味又は食感を考慮して、当業者が適宜定めることができる。通常は、添加されるプラスミノーゲン活性化剤中の乳酸菌及び／又はその処理物の総量が、0.001〜100質量％、好ましくは0.01〜80質量％、より好ましくは0.01〜50質量％となるようなプラスミノーゲン活性化剤の配合量が適当である。本発明のプラスミノーゲン活性化剤は安全性の高いものであるため、食品におけるその配合量をさらに増やすこともできる。プラスミノーゲン活性化剤の望ましい摂取量を飲食できるよう、１日当たりの摂取量が管理できる形にするのが好ましい。 In the food of the present invention, the blending amount of the plasminogen activator can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the form of the food and the required taste or texture. Usually, the total amount of lactic acid bacteria and / or processed products thereof in the added plasminogen activator is 0.001 to 100% by mass, preferably 0.01 to 80% by mass, more preferably 0.01 to 50% by mass. A suitable amount of plasminogen activator is appropriate. Since the plasminogen activator of the present invention is highly safe, the blending amount in food can be further increased. It is preferable that the daily intake can be controlled so that the desired intake of the plasminogen activator can be consumed.
本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、当業者が利用可能である任意の適切な方法によって、食品に含有させればよい。例えば、本発明のプラスミノーゲン活性化剤を、液体状、ゲル状、固体状、粉末状又は顆粒状に調製した後、それを食品に配合することができる。あるいは本発明のプラスミノーゲン活性化剤を、食品の原料中に直接混合又は溶解してもよい。本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、食品に塗布、被覆、浸透又は吹き付けてもよい。本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、食品中に均一に分散させてもよいし、偏在させてもよい。本発明のプラスミノーゲン活性化剤を入れたカプセルなどを調剤してもよい。本発明のプラスミノーゲン活性化剤を、可食フィルムや食用コーティング剤などで包み込んでもよい。また本発明のプラスミノーゲン活性化剤に適切な賦形剤等を加えた後、錠剤などの形状に成形してもよい。本発明のプラスミノーゲン活性化剤を含有させた食品はさらに加工してもよく、そのような加工品も本発明の範囲に包含される。 The plasminogen activator of the present invention may be contained in food by any suitable method available to those skilled in the art. For example, after preparing the plasminogen activator of the present invention in a liquid form, a gel form, a solid form, a powder form or a granule form, it can be blended in a food. Or you may mix or melt | dissolve the plasminogen activator of this invention directly in the raw material of a foodstuff. The plasminogen activator of the present invention may be applied, coated, permeated or sprayed on food. The plasminogen activator of the present invention may be uniformly dispersed in food or may be unevenly distributed. Capsules containing the plasminogen activator of the present invention may be prepared. The plasminogen activator of the present invention may be wrapped with an edible film or an edible coating agent. Moreover, after adding a suitable excipient | filler etc. to the plasminogen activator of this invention, you may shape | mold in the shape of a tablet. The food containing the plasminogen activator of the present invention may be further processed, and such processed products are also included in the scope of the present invention.
本発明の食品の製造においては、食品に慣用的に使用されるような各種添加物を使用してもよい。添加物としては、限定するものではないが、発色剤（亜硝酸ナトリウム等）、着色料（クチナシ色素、赤102等）、香料（オレンジ香料等）、甘味料（ステビア、アステルパーム等）、保存料（酢酸ナトリウム、ソルビン酸等）、乳化剤（コンドロイチン硫酸ナトリウム、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）、酸化防止剤（EDTA二ナトリウム、ビタミンC等）、pH調整剤（クエン酸等）、化学調味料（イノシン酸ナトリウム等）、増粘剤（キサンタンガム等）、膨張剤（炭酸カルシウム等）、消泡剤（リン酸カルシウム）等、結着剤（ポリリン酸ナトリウム等）、栄養強化剤（カルシウム強化剤、ビタミンA等）、賦形剤（水溶性デキストリン等）等が挙げられる。さらに、オタネニンジンエキス、エゾウコギエキス、ユーカリエキス、杜仲茶エキス等の機能性素材をさらに添加してもよい。 In the production of the food of the present invention, various additives that are conventionally used in food may be used. Additives include, but are not limited to, color formers (sodium nitrite, etc.), colorants (cuttlefish pigment, red 102, etc.), flavorings (orange flavors, etc.), sweeteners (stevia, aster palm, etc.), storage (Sodium acetate, sorbic acid, etc.), emulsifier (sodium chondroitin sulfate, propylene glycol fatty acid ester, etc.), antioxidant (disodium EDTA, vitamin C, etc.), pH adjuster (citric acid, etc.), chemical seasoning (inosine) Sodium phosphate, etc.), thickeners (xanthan gum, etc.), swelling agents (calcium carbonate, etc.), antifoaming agents (calcium phosphate, etc.), binders (sodium polyphosphate, etc.), nutrient enhancers (calcium enhancer, vitamin A, etc.) ) And excipients (such as water-soluble dextrin). Furthermore, functional materials such as ginseng extract, sorghum extract, eucalyptus extract, and Tochu tea extract may be further added.
本発明の食品は、上述したとおり、プラスミノーゲン活性化増強作用を有し、結果的に血栓溶解作用を有するため、血栓性疾患に対して優れた予防及び改善作用を奏する上に、安全性が高く副作用の心配がない。また、本発明のプラスミノーゲン活性化剤は風味がよく、様々な食品に添加してもその食品の風味を阻害しないため、得られる食品は長期間の継続的摂取が容易であり、血栓性疾患の優れた予防及び改善作用が期待される。なお、本発明の食品を、プラスミノーゲン活性化剤の望ましい摂取量を管理できる形態で飲食することにより、該食品を用いる、血栓性疾患に対する予防方法及び改善方法が提供される。 As described above, the food of the present invention has a plasminogen activation enhancing action and, as a result, has a thrombolytic action. There is no worry about side effects. In addition, the plasminogen activator of the present invention has a good flavor and does not inhibit the flavor of the food even when added to various foods. It is expected to have an excellent preventive and ameliorating effect on diseases. In addition, by eating and drinking the food of the present invention in a form that can manage the desired intake of the plasminogen activator, a method for preventing and improving thrombotic diseases using the food is provided.
さらに本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、ヒト用の食品のみならず、家畜、競走馬、ペットなどの飼料にも配合することができる。飼料は、対象がヒト以外であることを除き食品とほぼ等しいことから、上記の食品に関する記載は、飼料についても同様に当てはめることができる。 Furthermore, the plasminogen activator of the present invention can be blended not only in human foods but also in livestock, racehorses, pets and other feeds. Since the feed is almost the same as the food except that the subject is other than a human, the above description regarding the food can be similarly applied to the feed.
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further more concretely based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
［実施例１］
＜各種乳酸菌の培養とサンプルの調製＞
表１に示す各種乳酸菌について、前培養として、M.R.S液体培地（Difco社製）にて、37℃、24時間培養を行った。次に本培養としてM.R.S液体培地に1％植菌し、37℃、一晩（約18時間）、静置培養を行った。
[Example 1]
<Cultivation of various lactic acid bacteria and sample preparation>
The various lactic acid bacteria shown in Table 1 were cultured in a MRS liquid medium (manufactured by Difco) at 37 ° C. for 24 hours as a preculture. Next, as a main culture, 1% inoculation was carried out in an MRS liquid medium, followed by stationary culture at 37 ° C. overnight (about 18 hours).
培養後、遠心分離により菌体を回収し、PBS（リン酸緩衝液）にて菌体を2回洗浄し、再度PBSに懸濁し、便宜上、OD600＝0.5を2.0×10の8乗と換算して菌濃度を求めた。なお、コントロールとして、非特許文献２に記載されている中で、最も強くプラスミノーゲンの活性化を増強していた株であるLactobacillus gallinarum JCM 8782株（＝Lactobacillus gallinarum T-50株）を同様に調製した。
After incubation, the cells are collected by centrifugation, washed twice with PBS (phosphate buffer), and suspended again in PBS. For convenience, OD600 = 0.5 is converted to 2.0 × 10 8 to the power. The fungus concentration was determined. As a control, Lactobacillus gallinarum JCM 8782 strain (= Lactobacillus gallinarum T-50 strain), which is the strain most strongly enhancing the activation of plasminogen among those described in
（１）CFE（無細胞抽出液）サンプル調製
3.0×109細胞/mlの菌液を、37℃、5時間インキュベートを行い、その後、4℃にて遠心分離を行い、得られた上清を遠心フィルターユニット（0.22μm）でろ過を行い、-80℃で保存した。これをCFE（セル・フリー・エクストラクト）とした。
（２）菌体懸濁液サンプル調製
3.0×109細胞/mlの菌液をエッペンドルフ試験管にとり、遠心（11,000rpm、4℃、10分）し、上清除去して、-80℃で保存した。使用時にPBSにて元の菌体濃度に調整した。
(1) CFE (cell-free extract) sample preparation
Incubate the bacterial solution of 3.0 × 10 9 cells / ml at 37 ° C. for 5 hours, then centrifuge at 4 ° C., and filter the resulting supernatant through a centrifugal filter unit (0.22 μm). Stored at -80 ° C. This was designated as CFE (Cell Free Extract).
(2) Preparation of cell suspension sample
The bacterial solution of 3.0 × 10 9 cells / ml was taken into an Eppendorf test tube, centrifuged (11,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes), the supernatant was removed, and stored at −80 ° C. At the time of use, the original bacterial cell concentration was adjusted with PBS.
［実施例２］
＜プラスミノーゲン活性化増強作用の評価＞
実施例１で調製したCFEサンプル及び菌体懸濁液サンプルについて、以下の条件にて反応を行い、吸光値をy軸、時間の二乗（h2）をx軸としてプロットし、直線部分の傾きを求めた。下記の濃度のGAPDHで測定した傾きを基準として、この傾きと同じ傾きとなった場合を１GAPDH単位と定義して、各乳酸菌サンプルの活性を算出した。なお、測定の際、各サンプルはPBSにて適宜希釈し、原液濃度に換算して活性を求めた。
[Example 2]
<Evaluation of plasminogen activation enhancing action>
The CFE sample and the cell suspension sample prepared in Example 1 were reacted under the following conditions, and the absorbance value was plotted on the y-axis and the square of time (h 2 ) was plotted on the x-axis. Asked. Based on the slope measured with GAPDH at the following concentration, the activity of each lactic acid bacteria sample was calculated by defining the case where the slope was the same as this slope as 1 GAPDH unit. At the time of measurement, each sample was appropriately diluted with PBS, and the activity was determined in terms of the stock solution concentration.
CFEサンプルの評価法
CFE（この反応系あたり、濁度ベースで1.5×108個からの無細胞抽出液）、又は 135 nM ウサギ筋肉由来GAPDH（SIGMA, D-0763）、220 nM ヒトプラスミノーゲン（Glu-plg；ヒト血漿より精製）、0.58 U/ml アルテプラーゼ（遺伝子組換えtPA、協和発酵工業）、0.1 mM H-Val-Leu-Lys-pNA（BACHEM, L-1450）を、PBS（pH 7.4）100μl中に調製した。37℃で2.5時間反応を行い、405 nmの吸光度を5分毎に測定した。
CFE sample evaluation method
CFE (cell-free extract from 1.5 × 10 8 turbidity per reaction system), or 135 nM rabbit muscle-derived GAPDH (SIGMA, D-0763), 220 nM human plasminogen (Glu-plg; Purified from human plasma), 0.58 U / ml alteplase (GMO tPA, Kyowa Hakko Kogyo), 0.1 mM H-Val-Leu-Lys-pNA (BACHEM, L-1450) in 100 μl of PBS (pH 7.4) Prepared. The reaction was performed at 37 ° C. for 2.5 hours, and the absorbance at 405 nm was measured every 5 minutes.
上記組成よりGlu-plgおよびアルテプラーゼを省いたものの吸光度をブランクとした。測定は３回行った。
その結果を表２及び図１に示す。
Absorbance of Glu-plg and alteplase was omitted from the above composition. The measurement was performed 3 times.
The results are shown in Table 2 and FIG.
表２及び図１に示すとおり、文献記載の最も強くプラスミノーゲンの活性化を増強していた株であるLactobacillus gallinarum JCM 8782株よりも、さらに強く活性化する株が見出され、JCM8782株と比較して、活性の最も強いLeuconostoc oeni JCM6125株は約150倍、それに順ずるLeuconostoc garlicum（＝Leuconostoc lactis） JCM1142株は約70倍、及びLactobacillus pentosus JCM8333株は約60倍の強さを示した。 As shown in Table 2 and FIG. 1, a strain that was activated more strongly than Lactobacillus gallinarum JCM 8782, which was the strain most strongly enhancing the activation of plasminogen described in the literature, was found. In comparison, the most active Leuconostoc oeni JCM6125 strain was about 150 times stronger, the Leuconostoc garlicum (= Leuconostoc lactis) JCM1142 strain was about 70 times stronger, and the Lactobacillus pentosus JCM8333 strain was about 60 times stronger.
［実施例３］
＜耐熱性の評価＞
実施例１で調製したLactobacillus paracasei KW3110、Leuconostoc garlicum（＝Leuconostoc lactis） JCM1142株、及びLactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007の菌体懸濁液サンプルについて、（i）加熱処理なし、（ii）100℃、10分処理、（iii）121℃、15分処理をそれぞれ行い、以下に示す菌体懸濁液サンプルの評価方法に従ってプラスミノーゲン活性化増強作用を測定した。
[Example 3]
<Evaluation of heat resistance>
Regarding the cell suspension samples of Lactobacillus paracasei KW3110, Leuconostoc garlicum (= Leuconostoc lactis) JCM1142 and Lactococcus lactis subsp. Lactis NBRC12007 prepared in Example 1, (i) No heat treatment, (ii) 100 ° C, 10 Minute treatment, (iii) treatment at 121 ° C. for 15 minutes, respectively, and the plasminogen activation enhancing action was measured according to the following method for evaluating a cell suspension sample.
菌体懸濁液サンプルの評価法
細菌細胞（この反応系あたり、濁度ベースで1.5×108個の細胞）、又は 135 nM ウサギ筋肉由来GAPDH（SIGMA, D-0763）、220 nM ヒトGlu-plg（ヒト血漿より精製）、0.58 U/ml アルテプラーゼ（遺伝子組換えtPA、協和発酵工業）、0.01 mM Boc-Val-Leu-Lys-MCA（Peptide Institute, Inc, 3104-v）を、PBS（pH 7.4）100μl中に調製した。37℃で1.5時間反応を行い、励起波長355 nm、蛍光波長460 nmの蛍光強度を5分毎に測定した。
Evaluation method of cell suspension sample Bacterial cells (1.5 × 10 8 cells based on turbidity per reaction system), or 135 nM GAPDH derived from rabbit muscle (SIGMA, D-0763), 220 nM human Glu- plg (purified from human plasma), 0.58 U / ml alteplase (GMO tPA, Kyowa Hakko Kogyo), 0.01 mM Boc-Val-Leu-Lys-MCA (Peptide Institute, Inc, 3104-v), PBS (pH 7.4) Prepared in 100 μl. The reaction was carried out at 37 ° C. for 1.5 hours, and the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 460 nm was measured every 5 minutes.
上記組成よりGlu-plgおよびアルテプラーゼを省いたものの蛍光強度をブランクとした。実験は３回行った。 The fluorescence intensity of Glu-plg and alteplase omitted from the above composition was blank. The experiment was performed three times.
その結果を図２のＡ（相対活性）とＢ（GAPDH単位）に示す。図２に示すとおり、（ii）の処理（100℃、10分処理）でもプラスミノーゲン活性化増強作用が低下しないばかりか、（iii）の処理（121℃、15分処理）でさらに増強され、元に比較して150〜225％の活性になっていることが示された。また、活性の強さを表すGAPDH単位は、CFE、あるいは菌体で測定した場合のいずれも、ほぼ同等の値であった。 The results are shown in A (relative activity) and B (GAPDH units) in FIG. As shown in FIG. 2, the treatment of (ii) (100 ° C., 10 minutes treatment) does not decrease the plasminogen activation enhancing action, but is further enhanced by the treatment of (iii) (121 ° C., 15 minutes treatment). , It was shown to be 150-225% active compared to the original. Moreover, the GAPDH unit representing the intensity of activity was almost the same value when measured with CFE or bacterial cells.
［実施例４］
＜ずり惹起血小板血栓形成（ずり惹起血小板反応性）・血栓溶解能測定法：Global Thrombosis Test (GTT) による乳酸菌サンプルの抗血栓活性の評価＞
GTT法は山本らの報告に従い行った（Platelets, 17(8), 555-564, 2006）。Wistar/ST系ラット（13週齢以上、雄、日本SLC）をソムノペンチルで麻酔し（60mg/kg body weight, 筋注）、麻酔30分後に麻酔の効果を確認して開腹し、腹部大動脈から、37℃に予め温めた生理食塩水が含まれているシリンジに、生理食塩水と同量の血液を採取した（血液:生理食塩水＝1:1、抗凝固剤無添加）。400μlの生理食塩水（コントロール）又は乳酸菌CFEサンプル溶液を含むシリンジを予め37℃で温めた後、シリンジに3.6mlの2倍希釈血液を吸引（血液:試料＝9:1）、混和し、37℃に保たれたGTTチューブ内に流し込み、血小板血栓形成までの時間（閉塞時間、Occlusion time、OT）及び血栓溶解までの時間（溶解時間、Lysis time、LT）を測定した。それぞれにつき測定は４回行った。
[Example 4]
<Measurement of shear-induced platelet thrombus formation (shear-induced platelet reactivity) / thrombolytic ability: Evaluation of antithrombotic activity of lactic acid bacteria samples by Global Thrombosis Test (GTT)>
The GTT method was performed according to the report of Yamamoto et al. (Platelets, 17 (8), 555-564, 2006). Wistar / ST rats (13 weeks of age and older, male, Japan SLC) are anesthetized with somnopentyl (60 mg / kg body weight, intramuscular injection), 30 minutes after anesthesia, the effect of anesthesia is confirmed and the abdomen is opened. The same amount of blood was collected in a syringe containing physiological saline pre-warmed at 37 ° C. (blood: saline = 1: 1, no anticoagulant added). After pre-warming a syringe containing 400 μl of physiological saline (control) or lactic acid bacteria CFE sample solution at 37 ° C., 3.6 ml of 2-fold diluted blood is sucked into the syringe (blood: sample = 9: 1), mixed, and 37 The solution was poured into a GTT tube kept at 0 ° C., and the time to platelet thrombus formation (occlusion time, Occlusion time, OT) and the time to thrombus dissolution (dissolution time, Lysis time, LT) were measured. Each measurement was performed four times.
なお、乳酸菌CFEサンプル溶液としては、Lactobacillus gallinarum JCM 8782株（陰性対照）、Leuconostoc oeni Elios1株、及びLactobacillus paracasei KW3110株を用いた。これらのサンプル溶液は、希釈せずに用いた。 In addition, as a lactic acid bacteria CFE sample solution, Lactobacillus gallinarum JCM 8782 strain (negative control), Leuconostoc oeni Elios1 strain, and Lactobacillus paracasei KW3110 strain were used. These sample solutions were used without dilution.
測定の結果、図３〜６に示すとおり、プラスミノーゲン活性化増強作用の強さに応じてLeuconostoc oeni Elios1株、及びLactobacillusparacasei KW3110株の溶解時間LTはコントロールに比較して有意に短縮されていることがわかった（それぞれ63％及び49％）。また、閉塞時間OTに関しても、Leuconostoc oeni Elios1株については、コントロールよりも有意に延長（1.27倍）されていた。 As a result of the measurement, as shown in FIGS. 3 to 6, the lysis time LT of Leuconostoc oeni Elios1 strain and Lactobacillus paracasei KW3110 strain was significantly shortened as compared with the control according to the strength of plasminogen activation enhancing action. It was found (63% and 49% respectively). In addition, regarding the occlusion time OT, the Leuconostoc oeni Elios1 strain was significantly extended (1.27 times) than the control.
本発明により、優れたプラスミノーゲン活性化増強作用を有するプラスミノーゲン活性化剤が提供される。本プラスミノーゲン活性化剤は、繊維素溶解系におけるプラスミノーゲンの活性化を増強することで、血栓を溶解する作用を有し、血栓性疾患に対して優れた予防、改善及び治療効果を示す。また、食経験のある乳酸菌を含むものであり、安全性が高く長期間の継続的摂取が容易である。さらに、高温処理後でもそのプラスミノーゲン活性化増強作用が保持される。そのため、本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、血栓形成に対する予防及び改善のための食品及び飼料にも使用できる。 According to the present invention, a plasminogen activator having an excellent plasminogen activation enhancing action is provided. This plasminogen activator has an action to dissolve thrombi by enhancing the activation of plasminogen in the fibrinolysis system, and has an excellent prevention, improvement and treatment effect against thrombotic diseases. Show. In addition, it contains lactic acid bacteria with dietary experience and is safe and easy to take for a long time. Furthermore, the plasminogen activation enhancing action is retained even after high temperature treatment. Therefore, the plasminogen activator of the present invention can also be used in foods and feeds for prevention and improvement of thrombus formation.
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