JP2010011838A - プラシノ藻によるドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の生産方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】ドコサヘキサエン酸(DHA)とエイコサペンタエン酸(EPA)の両高度不飽和脂肪酸を、海洋性微細藻体のうちのプラシノ藻という一つの藻体によって、複雑な精製過程を経ることなく、無臭かつ高い生産性で製造する方法を提供する。
【解決手段】海洋性微細藻類のプラシノ藻の藻体を前培養した後、該プラシノ培養藻体に栄養塩としての窒素源および/又はリン酸一水素二カリウム等のリン源を添加・培養して生育させ、該プラシノ生育藻体からDHA及びEPAの双方を生産する方法。
【選択図】なし
【解決手段】海洋性微細藻類のプラシノ藻の藻体を前培養した後、該プラシノ培養藻体に栄養塩としての窒素源および/又はリン酸一水素二カリウム等のリン源を添加・培養して生育させ、該プラシノ生育藻体からDHA及びEPAの双方を生産する方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、海洋性微細藻類のうち、プラシノ藻を利用したドコサヘキサエン酸(以下、「DHA」という。)及びエイコサペンタエン酸(以下、「EPA」という。)の生産方法に関するものである。
近年、油脂の栄養研究が進み、これまで知られていなかった高度不飽和脂肪酸の生理機能が解明されつつある。高度不飽和脂肪酸にはDHAやEPAなどのn−3系と、月見草オイルやボラージオイルなどのn−6系があるが、その中で特に注目されているのがDHAとEPAである。DHAやEPAは、ガンへの予防効果、中性脂肪・コレステロールの低減など様々な生理活性を有する。DHA,EPAの供給源はイワシ、マグロ、サバなど主に魚由来であるが、魚由来のものは魚油特有の味や臭い、複雑な精製過程、重金属やダイオキシンをはじめとする環境汚染による品質低下が懸念されていることから、微細藻類由来のDHA,EPAが注目されている。
微細藻類を用いたDHAやEPAの生産性研究においては、ある種の藻体のDHA生産株であるIsocrysis offgalbanaを培養する生産方法やEPA生産株であるMonodus subterraneusを培養する方法が知られている。しかし、いずれの生産株もDHA,EPAのどちらか一方しか持っていないため、片方のみの生産になってしまい、またその藻体にも特有の臭いがあるため、得られたDHAあるいはEPAにしてもその臭いが残ってしまっている。
海洋性微細藻類のうち、4種類のものにDHAとEPAの両者を含有することは知られ ているが、本発明者は、これらのうちプラシノ藻にそれらの含有率が最も高く、かつプ ラシノ藻が無臭であることを知得し、このプラシノ藻を培養することでDHAとEPA 双方の高い生産性が得られるのではないかとのとの発想を具体化させたものである。
すなわち本発明は、海洋性微細藻類のプラシノ藻の藻体を前培養した後、該プラシノ培養藻体に栄養塩としての窒素源および/又はリン源を添加・培養して生育させ、該プラシノ生育藻体からドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の双方を生産することを特徴とするプラシノ藻によるドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の生産方法である。
DHAとEPAの両方の高度不飽和脂肪酸を、海洋性微細藻類のうちのプラシノ藻という一つの藻体によって複雑な精製過程を経ることなく高い生産性で生産でき、かつ、無臭のDHAとEPAが得られる。
本発明方法で用いられるプラシノ藻としては、本発明者がプラシノ藻の中から特にDHA及びEPAの含有率の高い藻体を抽出し、これを「SK0801」と名付けたものを選択するのが好ましいが、これよりは含有率の劣るプラシノ藻を用いることも元より可能である。
本発明方法でプラシノ藻の藻体に添加される栄養源である窒素源としては硝酸カリウム(KNO3)が、リン源としてはリン酸一水素二カリウム(K2HPO4)がそれぞれ選択される。
プラシノ藻の培養に用いるEse培地は、栄養添加人工海水培地Eppley培地にSoil Extractを添加調整したものが用いられる。培地中の栄養塩の濃度は、KNO3の場合で0.25〜2.5mM、K2HPO4で0.005〜0.35mMが好ましい。
プラシノ藻の藻体は、Ese培地により前培養された後、上記各栄養塩の濃度調整をしたEse培地に植菌してさらに培養し、培養中の生育量の測定と比増殖速度の測定を経て、定常期に入った藻体を乾燥試料にする。そして、この乾燥試料を所定量秤量し、所定の方法で所定の機器を用いて脂肪酸分析行ない、DHA及びEPAの生産性を求める。
「実施例1」硝酸カリウム(KNO3)によるDNA及びEPAの生産
(1)試薬
本実施例で使用した試薬は市販特級品及び市販一級品を用いた。蒸留水はオートスチール(商品名「アクエリアスGS−2000」 ADVANTEC社製)を用い、イオン交換水を蒸留したものを用いた。培養に用いた水は、水1Lに人工海塩(商品名「潮」 光アクリウム社製)を34.5g溶かしたものを用いた。
(1)試薬
本実施例で使用した試薬は市販特級品及び市販一級品を用いた。蒸留水はオートスチール(商品名「アクエリアスGS−2000」 ADVANTEC社製)を用い、イオン交換水を蒸留したものを用いた。培養に用いた水は、水1Lに人工海塩(商品名「潮」 光アクリウム社製)を34.5g溶かしたものを用いた。
(2)藻体の前培養
藻体は鹿児島県硫黄島から採取した海洋性微細藻類プラシノ藻SK0801を用いた。Ese培地は、栄養添加人工海水培地Eppley培地にSoil Extractを10ml/L添加し調整した。培地はオートクレープ(商品名「KS−322」 TOMY社製)を用いて121℃10分間減菌処理を施した。藻体の前培養は、1Lの三角フラスコを用い、培養条件は培養温度25±2℃、光強度140μE/m2・s、通気量1mL(air)mL・minの条件下で行った。
藻体は鹿児島県硫黄島から採取した海洋性微細藻類プラシノ藻SK0801を用いた。Ese培地は、栄養添加人工海水培地Eppley培地にSoil Extractを10ml/L添加し調整した。培地はオートクレープ(商品名「KS−322」 TOMY社製)を用いて121℃10分間減菌処理を施した。藻体の前培養は、1Lの三角フラスコを用い、培養条件は培養温度25±2℃、光強度140μE/m2・s、通気量1mL(air)mL・minの条件下で行った。
(3)培地中の窒素源である硝酸カリウム(KNO3)濃度の検討
藻体の培養は大型試験管(Φ30mm,200mm)を用い培地量を50mLとし、Ese培地におけるKNO3濃度を0,0.25,1.0,2.5mMに調整した。培地条件は前培養と同様にし、培養を行った。
藻体の培養は大型試験管(Φ30mm,200mm)を用い培地量を50mLとし、Ese培地におけるKNO3濃度を0,0.25,1.0,2.5mMに調整した。培地条件は前培養と同様にし、培養を行った。
(4)植菌
前培養において定常期に達した藻体を植菌に用いた。植菌量は前培養の藻体を分光光度計による750nmでの濁度を測定し、以下の式に代入し求めることにより、培養初期濃度を一定にした。
植菌量(mL/L)=10÷吸光度(at750nm)
前培養において定常期に達した藻体を植菌に用いた。植菌量は前培養の藻体を分光光度計による750nmでの濁度を測定し、以下の式に代入し求めることにより、培養初期濃度を一定にした。
植菌量(mL/L)=10÷吸光度(at750nm)
(5)生育量測定
本藻体の生育量は濁度法を用いて測定を行った。濁度法は、細菌,酵母など単細胞に適用される迅速で正確な方法であり、この方法は細胞という粒子の濃度によって光の透過度が異なることを利用して細胞の量を測定する。生育量は以下の式により得られる。
生育量(g cell/L)=吸光度(at750nm)×生育係数
生育係数は藻体ごとに異なるため、各濁度での体積当たりの乾燥細胞重量を測定し生育係数を求めた。その結果、プラシノ藻の濁度法による生育量を求める式は以下のようになった。
生育量(g cell/L)=吸光度(at750nm)×0.19
本藻体の生育量は濁度法を用いて測定を行った。濁度法は、細菌,酵母など単細胞に適用される迅速で正確な方法であり、この方法は細胞という粒子の濃度によって光の透過度が異なることを利用して細胞の量を測定する。生育量は以下の式により得られる。
生育量(g cell/L)=吸光度(at750nm)×生育係数
生育係数は藻体ごとに異なるため、各濁度での体積当たりの乾燥細胞重量を測定し生育係数を求めた。その結果、プラシノ藻の濁度法による生育量を求める式は以下のようになった。
生育量(g cell/L)=吸光度(at750nm)×0.19
(6)比増殖速度
細胞の量は反応速度論的表示によれば細胞速度として表わすのが適切であり、それをX(g cell/L)とすると、反応速度rxは、
rx∝X
となる。ここで比例定数は増殖の活性を表わす係数であり、比増殖速度といい、一般にμで表される。比増殖速度は濁度法によって測定した生育量と測定日数を以下の式に代入することにより求めた。なお、Xは生育量(g cell/L)、tは培養日数である。
μ=In(Xt/X0)/t
細胞の量は反応速度論的表示によれば細胞速度として表わすのが適切であり、それをX(g cell/L)とすると、反応速度rxは、
rx∝X
となる。ここで比例定数は増殖の活性を表わす係数であり、比増殖速度といい、一般にμで表される。比増殖速度は濁度法によって測定した生育量と測定日数を以下の式に代入することにより求めた。なお、Xは生育量(g cell/L)、tは培養日数である。
μ=In(Xt/X0)/t
(7)乾燥試料の作製
定常期に入った藻体に1400×gで3分間遠心分離を施し、上澄みを取り除いた後に3%NaCl水溶液で洗い込みをした。再び1400×gで2分間遠心分離を施し、上澄みを取り除き−30℃で1日凍結させた後、凍結乾燥機で乾燥させ乾燥試料とした。
定常期に入った藻体に1400×gで3分間遠心分離を施し、上澄みを取り除いた後に3%NaCl水溶液で洗い込みをした。再び1400×gで2分間遠心分離を施し、上澄みを取り除き−30℃で1日凍結させた後、凍結乾燥機で乾燥させ乾燥試料とした。
(8)脂肪酸分析
乾燥試料10mg精秤し、標準物質としてペプタデカン酸を0.5mg加え、さらに5%HCl−MeOHを1mL加え、100℃で3時間還流することにより、藻体中の脂肪酸をメチルエステル化させた。室温まで放冷した後、n−ヘキサンを1mL加え5分間攪拌し静置した。静置し、2層に分離した内の上層n−ヘキサン層を移し、減圧濃縮を行った。その後、無水硫酸ナトリウムを加え脱水を行った。得られたサンプルはガスクロマトグラフィー(商品名「Shimadzu GC−14」 島津製作所製)を用いて脂肪酸分析を行った。分析条件は、水素炎イオン化検出器(FID:Frame Ionization Detector)を用いてカラム(30m×0.252mm OV−17 J&W SCIENTIFIC)温度150〜275℃、初期温度保持時間1分、温度上昇速度5℃/min、最終温度保持時間0分、気化室および検出器温度200℃とした。各脂肪酸の定性は市販の標準物質を用いて、各保持時間を求めることにより行ない、定量は内標準物質のピーク面積との比較により行なった。
乾燥試料10mg精秤し、標準物質としてペプタデカン酸を0.5mg加え、さらに5%HCl−MeOHを1mL加え、100℃で3時間還流することにより、藻体中の脂肪酸をメチルエステル化させた。室温まで放冷した後、n−ヘキサンを1mL加え5分間攪拌し静置した。静置し、2層に分離した内の上層n−ヘキサン層を移し、減圧濃縮を行った。その後、無水硫酸ナトリウムを加え脱水を行った。得られたサンプルはガスクロマトグラフィー(商品名「Shimadzu GC−14」 島津製作所製)を用いて脂肪酸分析を行った。分析条件は、水素炎イオン化検出器(FID:Frame Ionization Detector)を用いてカラム(30m×0.252mm OV−17 J&W SCIENTIFIC)温度150〜275℃、初期温度保持時間1分、温度上昇速度5℃/min、最終温度保持時間0分、気化室および検出器温度200℃とした。各脂肪酸の定性は市販の標準物質を用いて、各保持時間を求めることにより行ない、定量は内標準物質のピーク面積との比較により行なった。
各KNO3濃度で検討を行ったときの生育量を図1に、最大比増殖速度を図2に示す。KNO3濃度1.0mMにおいて最も高い生育量を示し0.20g cell/Lであった。窒素源を加えなかった培養では生育が確認できなかった。1.0,2.5mMは0.25,0.5mMのときと比べて定常期の期間が短いことが確認された。図2から、最大比増殖速度は1.0mMのとき最も高い値1.45day−1を示した。一般に、藻体は高い窒素濃度下において増殖速度に阻害作用を示すことが知られているが、本藻体では濃度が高くなるにつれて上昇していることから、高濃度になっても増殖速度を阻害しないと考えられる。DHAおよびEPA含有量を図3に示す。0.5mMのときにDHA、EPAともに最も高い含有量を示し、それぞれ乾燥試料1g当たり5.5mgと13.3mgであった。生産性は、これまでに得られた定常期における最大生育量、最大比増殖速度、各脂肪酸の含有量を掛けることにより求めた。求めた生産性を図4に示す。1.0mMのときDHA,EPA共に最も高い生産性を示し、それぞれ0.6,1.9mg/L・dayであった。また、DHAの生産性において0.5mMと1.0mMで同様の値を示した。DHA,EPAの生産性において、共に1.0mMのときに最も高い生産性を示したことから、KNO3濃度はDHAおよびEPAの合成経路に同様に作用すると考えられる。
大型試験管を用いて、Ese培地におけるKNO3濃度をそれぞれ0,0.025,0.5,1.0,2.5mMに調整し、プラシノ藻のDHAおよびEPAの生産性の検討を行った結果、DHA,EPA共に1.0mMが最適濃度であることが確認された。そして、1.0mMにおける生産性は、DHA,EPAそれぞれ0.6,1.9mg/L・dayであった。
「実施例2」リン酸一水素二カリウム(K2HPO4)によるDHA及びEPAの生産
藻体の培養は、実施例1と同様の大型試験管(Φ30mm,200mm)を用い培地量を50mLとし、Ese培地におけるリン源K2HPO4濃度を0.05,0.10,0.25mMに調整した。培養条件は前培養と同様にし、培養を行った。なお、試薬、藻体の前培養、植菌、生育量の測定、比増殖速度、乾燥資料の作成及び脂肪酸分析については実施例1に準じる。
藻体の培養は、実施例1と同様の大型試験管(Φ30mm,200mm)を用い培地量を50mLとし、Ese培地におけるリン源K2HPO4濃度を0.05,0.10,0.25mMに調整した。培養条件は前培養と同様にし、培養を行った。なお、試薬、藻体の前培養、植菌、生育量の測定、比増殖速度、乾燥資料の作成及び脂肪酸分析については実施例1に準じる。
培養の結果、生育量の変化を図5に、最大比増殖速度を図6に示す。図6に示すように、いずれの濃度でも高い生育量を示し、最大で0.14g cell /Lであった。また、最大比増殖速度についても、濃度に差のない高い値をそれぞれ示し、最大で1.56day−1であった。脂肪酸含有量を図7に、得られた生産性を図8に示す。脂肪酸含有量についても、各濃度での差異は殆んどなく、藻体中のDHA,EPAの含有量はそれぞれ6.7,12.8mg/gd.w.cと高い値を示した。得られた結果から生産性を求めると、K2HPO4濃度0.05〜0.25mMの範囲でほぼ一定の値を示し、DHAは1.3mg/L・day、EPAは2.7mg/L・dayであった。
「実施例3」硝酸カリウム(KNO3)とリン酸一水素二カリウム(K2HPO4)との二重栄養制御によるDHA及びEPAの生産
Ese培地におけるKNO3とK2HPO4濃度を以下に示す表に従い調整した。表1中、KNO3濃度0.5mM、K2HPO4濃度0.05mMで調整したものをcontrolとした。なお、試薬、藻体の前培養、植菌、生育量の測定、比増殖速度、乾燥資料の作成及び脂肪酸分析については実施例1に準じる。
Ese培地におけるKNO3とK2HPO4濃度を以下に示す表に従い調整した。表1中、KNO3濃度0.5mM、K2HPO4濃度0.05mMで調整したものをcontrolとした。なお、試薬、藻体の前培養、植菌、生育量の測定、比増殖速度、乾燥資料の作成及び脂肪酸分析については実施例1に準じる。
上記の二重栄養制御による培養を行い得られた生育量、比増殖速度をそれぞれ図9及び図10に示す。図9に示すように、▲5▼、▲6▼、▲9▼、▲10▼の培地組成において0.18〜0.20g cell/Lの高い生育量を示し、▲10▼のとき最大生育量0.20g cell/Lであった。比増殖速度については、図10に示すように、▲4▼〜▲7▼とcontrolにおいて1.85〜2.01day−1の高い比増産速度を示し、▲4▼のとき最も高い比増産比率2.01day−1だった。一般に、藻体は富栄養下では栄養素の取り込み能は低く、貧栄養下では取り込み能が高くなる。このことから、KNO3とK2HPO4の濃度ともに最も低い▲7▼の比増殖速度が高くなったと考えられる。また、リン濃度の高い▲4▼、▲5▼、▲6▼においても高い比増殖速度を示したことから、二重栄養制御においてリン濃度は栄養素の取り込み速度、増殖速度に作用し、濃度が高いほど増殖速度は高くなると考えられる。
脂肪酸分析により得られた脂肪酸含有量、脂肪酸含有率をそれぞれ図11、図12に示す。図11に示すように、脂肪酸含有量について、DHA、EPA共に▲5▼のときに最も高い含有量を示し、それぞれ9.2,20.0mg/gd.w.cであった。また、図12に示すように、DHA及びEPAの総脂肪酸量(TFA)における含有率に関して、含有量と比べると各培養条件による差は少なく、EPAに関しては14〜16%の間でほぼ一定の値をとり、DHAに関しては▲4▼、▲5▼で7.5%と最も高い含有率を示した。脂肪酸分析の結果より、各培養条件におけるDHA、EPAの含有量の変化とTFAの含有量の変化が同様に変化しており、DHA、EPAの脂肪酸含有率もほぼ一定の値を示していることから、本実施例の培養条件においては、DHA、EPAの含有量の変化は藻体中の脂肪酸組成の変化に因るものではなく、TFAの変化に依存していると考えられる。よって、N/Pの物質量比は総脂肪酸の生合成に大きな影響を与えると考えられる。図13に、生育量、比増殖速度、脂肪酸含有量から算出した生産性を示す。この図から分かるように、DHA、EPA共に▲5▼のとき最も高い生産性を示し、それぞれ3.2,7.0mg/L−dayであった。
K2HPO4濃度をさらに高濃度(0.35mM)にした場合の生産性の結果を図14に、比増殖速度の結果を図15に示す。生産性については、contorolと▲12▼において高い生育量を示し、それぞれ0.14g cell/Lであった。また、比増殖速度では、▲11▼、▲12▼が高い値を示し▲12▼のとき最も高い比増殖速度1.97day−1だった。
また、K2HPO4濃度を0.35mMにした場合における脂肪酸含有量を図16に、DHA、EPAの生産性を図17に示す。図16に示すように、DHA、EPAの含有量は、▲12▼の場合が▲5▼の培養条件に続く高い値を示し、それぞれ6.7,18.6mg/gd.w.cであった。また、DHA、EPAの生産性も、図17に示すように、▲12▼が▲5▼の培養条件に続く高い値を示し、それぞれ1.8,5.0mg/L・dayであった。
上記のKNO3とK2HPO4との二重栄養制御による結果から、N/Pの物質量比が、藻体の生産量、比増殖速度、DHA、EPAの合成に影響を及ぼすことが考えられるため、各培地組成の物質量比を表2に示した。
表2に示すように、DHA,EPA共に生産性の高かった▲5▼の培地組成が、物質量比でN/P=4となっていることが分かる。すなわち、窒素源、リン源の濃度に加え、N/Pの物質量比にも着目し、N/P=4の物質量比の場合がプラシノ藻のDHA及びEPAの生産において最適培養条件となることが示された。
Claims (2)
- 海洋性微細藻類のプラシノ藻の藻体を前培養した後、該プラシノ培養藻体に栄養塩としての窒素源および/又はリン源を添加・培養して生育させ、該プラシノ生育藻体からドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の双方を生産することを特徴とするプラシノ藻によるドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の生産方法。
- 上記窒素源として硝酸カリウムが、上記リン源としてリン酸一水素二カリウムが選択される請求項1に記載のプラシノ藻によるドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の生産方法。
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JP2008201242A JP2010011838A (ja) | 2008-07-07 | 2008-07-07 | プラシノ藻によるドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の生産方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015190116A1 (ja) * | 2014-06-13 | 2015-12-17 | 株式会社デンソー | 微細藻類の培養方法、微細藻類、及び油脂の製造方法 |
CN107201314A (zh) * | 2017-07-08 | 2017-09-26 | 东北师范大学 | 一种同时提高生物量和油脂含量的微藻异养培养方法 |
WO2017169713A1 (ja) * | 2016-03-29 | 2017-10-05 | 富士フイルム株式会社 | 微細藻類の培養方法、及び藻類バイオマスの製造方法 |
WO2020174019A1 (de) * | 2019-02-26 | 2020-09-03 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Verfahren zum erhalt von fucoxanthin und fettsäuren aus algenbiomasse |
-
2008
- 2008-07-07 JP JP2008201242A patent/JP2010011838A/ja active Pending
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