JP2009533684A - 核磁気共鳴技術のための細胞標識及び定量 - Google Patents
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Abstract
Description
こここに記載の発明は、全体的に又は部分的に、連邦助成金番号R01−EB003453、R01−EB004155、P01−HD047675、P50−ES012359及びP41EB−001977により支援された。合衆国政府は、この発明において、一定の権利を有する。
ある面において、この開示は、細胞を、エキソ・ビボで、核磁気共鳴技術によって検出することのできるイメージング用試薬例えばフルオロカーボンイメージング用試薬で修飾するための新規な方法及び試薬を提供する。ある面において、この開示は、特定の位置の標識した細胞の数を、イン・ビボで、定量するための方法及びソフトウェアを提供する。細胞は、フルオロカーボン例えば過フルオロポリエーテル(PFPE)を含む標識を用いて標識することができ、生物学的組織が有する内因性フッ素の含有量は極僅かであるので、イン・ビトロ19F MRIは、標識された細胞を検出する有効な手段を提供することができる。幾つかの具体例においては、これらのイメージを、次いで、慣用の1H MRIに重ね合わせて、解剖学的位置を測定する。
図1.細胞の標識、イメージング及び定量のための経路の図式表示。破線の連結は、随意のステップを示している。
図2.細胞をエキソ・ビボで標識して、宿主にトランスファーし、19F及び1Hを利用してイメージ化し、そして複合19F/1Hイメージにより可視化することの説明。
図3A〜3D.T細胞を、PFPEナノ粒子を用いてエキソ・ビボで十分に標識する。(a)は、ペレット化した、標識したT細胞(1×106)の19F NMRスペクトルを示している。このPFPEは、2つのピーク(一つは、−92ppmで、他は、−79ppm)を有している。トリフルオロ酢酸(TFA)を含むキャピラリーを、細胞ペレットと並べた基準として用いた。そして−76ppmにピークを示している。19F NMRを、470MHzで測定した。(b)標識し、活性化したT細胞の共焦点蛍光顕微鏡写真。PFPEナノ粒子を細胞標識前にDil(桃色)で処理した。細胞核を、TOTO3染色し(青色)、細胞質も弱く染色されている。ナノ粒子を、細胞表面と細胞内の両方で可視化する。スケールバーは、8μmを表している。(c)PEG600のジメチルエステル誘導体であるPFPEの分子構造(約40F’/細胞を有する)。この分子は、例えばプルロニックL35を用いて乳化することができる。(d)動的光散乱法により示されたエマルジョン粒子のサイズ(左のパネル)及び電子顕微鏡観察(EM)(右のパネル)。動的光散乱法を用いて、PBS中のナノ粒子のサイズ分布を測定した。そのプロットは、ナノ粒子の平均数(%)を平均粒子直径(nm)に対してを示している。これらのナノ粒子は、103±4nmの平均直径を有している。
図4A−4B.イン・ビトロでの、細胞の、様々なトランスフェクション剤を用いる、フルオロカーボン(即ち、PFPE)による標識。示した薬剤は、プロタミンサルフェート(Sigma, Inc.)、リポフェクタミン(Invitrogen, Inc.)、DOTAP(Roche, Inc.)、及びFuGene(Roche, Inc.)である。例は、樹状細胞(DC)(パネルa)及びT細胞(パネルb)を含む典型的な細胞型について与えてある。パネルa〜bにおいては、種々のカチオン性トランスフェクション試薬が用いられており、有意に、PFPE粒子の培養における取り込みを高め且つ標識用インキュベーション時間を1〜3時間のオーダーで低減した。この19F含量は、標識細胞ペレットの統合19F NMRスペクトルを利用してアッセイされた(値は、細胞数及び細胞ペレットの次に位置するTFA基準に対して規格化された)。
図5A−5B.イン・ビトロでの、細胞の、電気穿孔法を利用した、過フルオロカーボン(即ち、PFPE)による標識。DCを、培養培地中で電気穿孔法にかけた。パネルaは、標識細胞ペレットの典型的な19F NMRスペクトルを示している。パネルbは、培地中の固定したPFPE濃度での、電気穿孔電圧の関数としての19F含量を示している。細胞内19F含量を、標識細胞ペレットの19F NMR分光法を利用してアッセイした(値は、細胞数及び細胞ペレットの次に位置するTFA基準に対して規格化されている)。
図6.PFPE標識した一次T細胞のイン・ビトロでのMTT毒性アッセイ。PFPE標識による最小毒性が認められる。データは、標識の2時間後及び4時間後に採取した細胞アリコートから得たものである。この例において、一のトランスフェクション剤(FuGene)を用いて、取り込みを高めた。データは、未処理対照に対して規格化されて、100を乗じたものであり、この実験は、n=9を超える試行の平均したものである。
図7A−7C.PFPE標識したT細胞におけるFACSの結果。パネル(a)及び(b)は、それぞれ、トランスフェクション剤法を用いた標識後4及び24時間での、CD62L+及びCD4+の発現レベルである。パネル(c)は、電気穿孔法による標識後4時間での、CD4+及びCD62L+の発現を示している。
図8.PFPE標識したT細胞を受けたNOD SCIDマウスからの膵臓組織の組織学的切片の蛍光顕微鏡写真。マウスは、4×106の標識したBDC2.5T細胞を48時間前に受けた。固定した切片の染色は、次の通りである:インスリンは、緑色に、核は、白色に、アクチンは青色に、そしてT細胞は赤色に染色されている。これらのイメージは、T細胞の島内への及び周囲の血管への浸潤を伴う、初期のインスリン炎を示しており、これは、PFPE標識が、T細胞の交通を害しないことを示唆している。
図9A−9D.トランスファーされたT細胞が膵臓に向かうことを示す、イン・ビボのMRI。パネル(a)−(c)は、マウスの胴体の複合19F/1Hイメージであり、19Fは、擬似カラーで与えられ、1Hは、グレースケールになっている。19Fシグナルを含むスライスのみが示されている。(a)NOD SCIDマウスに48時間前にトランスファーされた、PFPE標識され、イン・ビトロで活性化された糖尿病誘発性T細胞(5×106)のイメージ。このイメージは、特異的T細胞(擬似カラー)が膵臓(P)に向かうことを示している。19F基準キャピラリー(R)は、このマウスの次に位置されている。肺、脾臓(S)及び肝臓(L)は、標識されている。パネル(b)は、PBS中の無細胞のPFPEナノ粒子(1×107の標識T細胞の19F投与量に匹敵)を受けたNOD SCIDマウスの負の対照のイメージを示している。我々は、PFPE(擬似カラー)を消化管(G)の近くでのみ検出した。パネル(c)は、活性化された、標識されたMHCミスマッチのT細胞を受けたNOD SCIDマウスの、負の対照のイメージを示している。我々は、膵臓、肝臓若しくは脾臓又はそれらの周囲でシグナルを検出しなかったが、細胞(擬似カラー)を、腎臓(K)に近い部位で見ることができる。パネル(d)は、NOD SCIDマウスの同齢集団についての、見かけのT細胞の膵臓指向性のイン・ビボ定量の結果を示している。これらの値は、膵臓で検出された細胞の、i.p.トランスファーされた細胞の総数と比較したパーセンテージを表している(2〜6×106細胞に及ぶ)。エラーバーの説明のための方法を参照されたい。
図10A−10B.標識したT細胞を接種されたNOD SCIDマウスから摘出した膵臓(a)及び脾臓(b)の19F NMRスペクトル。すべての固定した器官についての、19F NMRを、イン・ビボMRI(図9a)の後に行なった。19Fのピークは、膵臓(a)で検出されるが、脾臓(b)では存在せず、これは、イン・ビボMRIの所見(図9a)と一致する。TFA19F基準を、器官に隣接したシールされたキャピラリー中に位置させた。(a)と比べて、より多くの平均(8倍)を利用して、(b)を得た。
図11A−11B.19F MRイメージを利用したT細胞定量法を確認する像(phantom
)研究。パネル(a)は、複合19F/1Hイメージ(左側)及び、アガロース中に懸濁させた種々の密度の標識T細胞を含むキャピラリーチューブを含む像により強度を適正化した(intensity-rescaled)19Fイメージ(右側)を示している(キャピラリーA=12、B=6、C=3、D=1.5、及びE=0.75(×104)細胞/ボクセルであり、Rは、較正された19F基準キャピラリーである)。19Fイメージ(a、右側)は、中間の細胞密度即ちキャピラリーB、C、Dを示すように適正化されたものである。キャピラリーE(7,500細胞/ボクセル)は、このスケールでは見れないが、我々の定量分析は、この試料中の細胞を検出して測定することができる。これらのデータは、図9と同様のイメージングパラメーターを用いて得られた。CF2末端基の化学シフトのアーティファクト即ち高濃度のRキャピラリーからの「ゴースト」が、キャピラリーAの近くで認められる。パネル(b)は、この像研究における、実際の細胞数対MRIで測定された細胞数を示している。ピアソン相関係数は、0.98である。この線形的適合は、視覚的誘導である。縦座標についてのエラーバーは、示しておらず、それらは、データ点記号より小さい。
図12.急性炎症のマウスモデルのイメージング実験を示す図式表示。抗原特異的な、MHCマッチしたT細胞を、PFPE標識及びトランスファー前に、イン・ビトロで活性化した。宿主マウスは、炎症応答を開始するために、右側の大腿四頭筋(quadrucepts)に、s.c. オバルブミン/IFAを受け、対照として、右肢にPBS注射を受けた。これらのマウスは、その後、身体の長軸に沿って、同じイメージングセッションで、細胞トランスファー後、2、4、7、11及び21日目に、19F及び1Hを用いてイメージ化された。
図13.PFPE標識T細胞の注射後の様々な時点での、鼠蹊リンパ節を含むスライス。これらのT細胞は、オバルブミン/IFAが投与されたスライドにおいてのみ、鼠蹊節で見ることができる(i、4日目のパネル)。腸間膜節への幾らかの局在化も認められる(m、4日目のパネル)。測定可能な19Fシグナルを有するスライスのみを示してある。
図14.トランスファー後、2、4、7、11及び21日目の鼠蹊リンパ節におけるT細胞の平均数のプロット。これらの定量的データは、イン・ビボ19Fイメージから直接測定された。
図15A−15B.細胞トランスファー後、4日目のイン・ビボの光学イメージング。Alexa−PFPE標識は、4日目に、毛を剃ったマウスの皮膚を通して見ることができる。(a)蛍光は、腸間膜領域及び排出鼠蹊リンパ節に集中している。そのボックスは、排出鼠蹊節を超える領域を強調表示している。(b)腸間膜領域からの邪魔なしで鼠蹊節の蛍光を比較するために、それらのリンパ節を摘出して、別個にイメージ化した。そのイメージは、白色光イメージ上への蛍光イメージ(偽カラー)のオーバーレイである。大きさ並びに蛍光の差異は、鼠蹊リンパ節において明らかである(対照用リンパ節は、左にある)。
図16.一般的目的のコンピューターシステム200の、コンピューター104の機能を、この発明の説明のための具体例によって実施するための、機能的ブロックダイヤグラム。
1.概観
ある面において、この開示は、細胞を、エキソ・ビボで、核磁気共鳴イメージング試薬例えばフルオロカーボンイメージング試薬で標識するための並びに標識した細胞を、イン・ビボ又はエキソ・ビボで定量するための新規な方法及び試薬を提供する。標識した細胞は、19F核磁気共鳴技術(例えば、MRI/MRS)によって検出することができ、ここに記載した方法によって定量することができる。19F核磁気共鳴技術は、内因性バックグラウンドシグナルがないので、生物学的系に対する優れたイメージングツールである。フッ素は、生きている生物体においては、あったとしても非常に低レベルで存在し、一般に、液体状態の核磁気共鳴技術により検出可能な化学的形態にない。これは、精密な解剖学的に詳細な可視化を与えるが特定の細胞集団の選択的検出を可能にしない慣用の1H MRIと極めて異なっている。ここに開示したある方法は、生きている被験者における、標識された細胞の分布を可視化するための全身の又は身体の部分的スクリーニングを可能にする。19F核磁気共鳴により検出される標識された細胞の正確な解剖学的位置決めは、例えば、解剖学的詳細を与える1H MRIイメージの重ね合わせにより決定することができる。好適具体例において、1Hイメージは、記録を確実にするために、19Fイメージと同じイメージングセッション中に(被験者を動かさずに)得られる。加えて、ここに開示した核磁気共鳴技術は、組織試料、摘出した器官及び細胞培養物の場合のようなエキソ・ビボのコンテキストにおいて、有効に適用することができる。ここに開示したイメージング技術は、一層多くの生物学的及び医学的問題に適用することができる。
主題の方法で用いるイメージング試薬は、フルオロカーボン即ち少なくとも一つの炭素−フッ素結合を含む分子である。19F原子によって、ここに開示したイメージング試薬は、19F MRI及び他の核磁気共鳴技術例えばMRS技術によって検出することができる。ある好適具体例において、フルオロカーボンイメージング試薬は、次の特性の少なくとも一つを有する:1)低減された細胞傷害性;2)単純な(理想的には、化学シフトによるアーティファクトを最小にする、単一で、狭い共鳴を有する)19F NMRスペクトル;3)各分子中に多数のNMR当量フッ素原子を有することによる高い感度;4)多くの細胞型の効率的標識を与えるように配合されて貪食細胞に限られないこと。
ここに記載の方法は、原核細胞及び真核細胞(好ましくは、哺乳動物細胞)の両方を含む広範囲の細胞で利用することができる。細胞調製のための技術には、細胞培養、クローニング、核移植、遺伝子改変及びカプセル封入が含まれる。
ここに記載のように、核磁気共鳴技術を利用して、標識した細胞の集団を検出すことができる。用語「検出する」は、標識された分子又は細胞の存否を、特に核磁気共鳴技術によって確認するための任意の努力を含むように用いられる。用語「検出する」は又、定量測定及び2又は3次元イメージの生成を含む一層複雑な測定を含むことも意図される。例えば、MRIを利用して、かかる細胞のイメージを生成することができる。多くの例において、標識された細胞を生きている被験者に投与することができる。これらの細胞の投与後に、被験者の幾らかの部分又は全被験者を、MRIにより試験して、MRIデータセットを生成することができる。「データセット」は、ここで用いる場合、被験者材料の磁気共鳴プロービング中に集めた生のデータ、獲得パラメーター並びに生データから処理され、トランスフォームされ又は抽出された情報を含むことを意図している。この生データは、MRI/MRSにより得られる一過性のシグナルを含み、これらは、遊離の誘導減衰、スピン−エコー、誘導エコー及び/又は勾配エコーを含む。処理された情報の例には、被験者材料の二次元又は三次元画像表現が含まれる。この処理された情報は又、マグニチュードイメージ、リアル及びイマジナリーイメージ並びに関連相マップイメージをも含みうる。他の抽出されたデータは、被験者材料中のイメージング試薬又は19Fシグナルの濃度量を表すスコアである。被験者材料中の19Fシグナルの量及び細胞予備移植当たりのイメージング試薬の平均量の較正を利用することにより、この被験者材料中の細胞の絶対数を評価することができる。被験者材料中に存在する19Fシグナルは、多くの方法により表し又は計算することができ;例えば、関心ある領域(ROI)についての19Fシグナルの平均シグナル対ノイズ比(SNR)を測定して、標識細胞の豊富さを計算するために利用することができる。ある具体例においては、19Fシグナルの平均強度、又はピクセル又はボクセルワイズの合計を用いて、標識細胞の豊富さを計算することができる。この型のデータは、被験者の単一領域例えば脾臓又は標識細胞と特に関連のある他の器官に集めることができる。標識細胞は、被験者における以外のコンテキストで試験することができる。標識細胞を培養物において試験することは望ましいであろう。ある具体例において、標識細胞を、組織試料に加え又はその試料中で生成させることができ、それ故、標識細胞をそれらのコンテキストにおいてもイメージ化することができる。例えば、再移植すべき器官、組織又は他の細胞材料をイメージング試薬と接触させて標識細胞を生成してから、かかる被験者に移植することができる。
標識細胞を定量する方法は、典型的には、コンピューターの補助を受けて行なわれ、かかる定量の目的のためにデザインされたソフトウェアを作動させることができる。かかるソフトウェアは、スタンドアロンプログラムであってもよいし、又は他のソフトウェアに組み込まれるものであってもよい(例えば、MRIイメージ処理プログラム)。図16は、
この開示の説明のための具体例に従ってコンピューター機能を実施するための、一般的な目的のコンピューターシステム200の機能的ブロックダイヤグラムを示している。典型的なコンピューターシステム200は、中央処理ユニット(CPU)202、メモリ204及びインターコネクトバス206を含む。CPU202は、単一のマイクロプロセッサーを含むか、又はコンピューターシステム200をマルチプロセッサーシステムとして構成するために複数のマイクロプロセッサーを含む。メモリ204は、説明上、メインメモリとリードオンリーメモリを含む。コンピューター200は又、大容量記憶装置208をも含み、これは、例えば、様々なディスクドライブ、テープドライブなどを有する。メインメモリ204は又、ダイナミックランダムアクセスメモリ(DRAM)及び高速キャッシュメモリをも包含する。操作においては、このメインメモリ204は、CPU202による実行のための指示及びデータの少なくとも部分を保存している。
1:1モル比の、図3cに示したPFPE(Exfluor, テキサス、Round Rock)分子とPluronic L−35(Sigma-Aldrich, ミズーリ、St. Lois)よりなる標識用配合物を調製した。PFPEと水をオートクレーブにかけ、Pluronic L−35は、0.22μmフィルターを通して無菌を確実にした。この混合物を、氷上で、プローブソニケーションにより乳化した。標準的手段を利用する光散乱を、乳化生成物上で行なって、図3dに示したように、粒子サイズ分布を確認した。動的光散乱を、Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, 英国、Worcestershire)器具を利用して行なった。これらのナノ粒子は、103±4nmの平均直径を有している。
T細胞を、マウスの脾臓から抽出して、脾臓細胞の単独細胞懸濁液を、MACSpanT細胞単離用キット(Miltenyi Biotec, カリフォルニア、Auburn)を利用して保存した。(更なる詳細については、実施例6を参照されたい。) T細胞を、それらを、抗TCR、抗CD−28及びIL−2でコートしたプレート中で3日間インキュベートすることにより標識する前に活性化した。これらの細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)、100μg/mlのストレプトマイシン及びペニシリンを含み、10μg/mlのIL−2及び1μl/mlの2−メルカプトエタノールを補ったRPMI中に維持した。その後、細胞を採取して、新鮮な培地に2百万/mlで再懸濁させた。2μlのPFPEエマルジョンと8μlのFuGene6(Roche, Inc., インディアナ、Indianapolis)を、300μlのFBSフリーの培地中で20分間混合することによって、標識を用意し、細胞懸濁液に2μl標識/ml細胞で加えて、3時間標識した。細胞を、PBSで、2回洗い、300μlのHBSSに再懸濁させてから、被験者に投与した。4〜8百万の細胞を、各実験に用いた(n=6)。
T細胞の標識を、最大取込み及び最少細胞傷害性のために最適化した。標識の取込みは、19F NMRにより測定し、細胞傷害性は、標準的アッセイ例えばトリパンブルー排除及びMTTアッセイにより測定した。標識したT細胞の生存力及び表現型を確認するために、我々は、幾つかのイン・ビトロアッセイを実施した。標識した細胞の生存力(標識直後にトリパンブルーを利用してアッセイ)は、未処理対照に対して94±3.7%の生存力を示した。エラーバーは、n=6ウェルについての標準偏差であり;標識後48時間で、これらの細胞は、95±6%の生存力を示した(n=3)。MTTアッセイ(ATCC、バージニア、Manassas)を、標識後2及び4時間で採取したT細胞アリコートにおいて行なった。データは、未処理対照に対して規格化した。標識した細胞は、図6に示したように、MTTにおいて、対照に対して最少の減少を示した。従って、これらのデータは、この標識工程が、何ら明白な傷害性を引き起こさないことを示唆している。加えて、細胞傷害性のないことは、トリパン排除アッセイ及び直接細胞計数によって確認された。
イン・ビボでの、MRI実験を利用して、標識された細胞が、適当な器官(例えば、膵臓)で検出されうることを確認した。トランスジェニックNOD BDC2.5マウスから精製したT細胞を、上記のように、イン・ビトロで活性化して標識し、宿主のNOD SCIDマウス(Jackson Labs, メイン、Bar Harbor)に腹腔内注射により移入させた。すべてのマウスは、8〜10週齢であり、各マウスは、300〜800万の標識細胞を受けた。対照用マウスは、同等量の乳化PFPE(緩衝液中)を、細胞なしで、受けた。すべてのNOD SCIDマウスは、200mg/kgのシクロホスファミド(CY)を、細胞移入の24時間前に、腹腔内注射により、受けた。
イン・ビボ19F MRIデータを利用して、我々は、関心ある領域内に移入された細胞の有効数を定量するためにアルゴリズム(実施例6参照)を適用した。図9dは、動物(n=4)からの膵臓における細胞定量結果の概要を示している。検出された見かけのT細胞の数は、移入された全細胞の凡そ1.5〜3.4%に及んだ(図9d)。この同齢集団について検出された細胞の平均数は、移入された全細胞の2.2±0.9%であり、不確定性は、標準偏差である(n=4)。イン・ビボでの平均細胞密度は、この膵臓では、約28,000細胞/ボクセルであった。
標識の合成及び特性表示
PFPEエマルジョンを、1:1モル比のオートクレーブした過フルオロポリエチレングリコール(分子量約1500、Exfluor, テキサス、Round Rock)と無菌のフィルター処理したPluronicL35(Sigma-Aldrich, ミズーリ、St. Louis)を用いて調製した。乳化を、プローブソニケーションにより、Sonifier Cell Disruptor (Misonix Inc., ニューヨーク、Farmingdale)を用いて行なった。平均エマルジョン粒子直径は、Malvern Zetasizer Nano ZS 器具 (Malvern Instruments, 英国、Worcestershire)を用いる動的光散乱によって、103±4nmであると測定された。蛍光性PFPEエマルジョン粒子を、2μl PFPEエマルジョン、ジメチルスルホキシド(1μl)に溶解させた1μg ジアルキルカーボシアニン染料(DiI, Molecular Probes-Invitrogen, カリフォルニア、Carlsbad)、8μl FuGENE6(Invitrogen)及び100μl Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培地を混合することにより調製した。
BDC2.5TCRトランスジェニックマウス由来のT細胞を、脾臓細胞の単一細胞懸濁液から、磁気細胞ソーティング(MACS)パンT細胞単離用キット(Miltenyi Biotec, カリフォルニア、Auburn)を用いて精製した。細胞を、10% ウシ胎児血清(FBS) (Gibco, カリフォルニア、Carlsbad)、各100μg/mlのストレプトマイシン及びペニシリン、並びに1μl/mlの2−メルカプトエタノールを含むRPMI(Gibco, カリフォルニア、Carlsbad)中で増殖させた。細胞を、イン・ビトロで、抗TCR抗体をコートしたプレート上で、1μg/ml 抗CD28及び10U/ml IL−2の存在下で3日間インキュベーションすることによって活性化させた。その後、細胞を採取して、新鮮な培地に、2×106/mlで再懸濁させた。PFPEエマルジョン(2μl)を、8μlのFuGENE6(Roche, インディアナ、Indianapolis)トランスフェクション剤と、300μlのFBSフリーの培地中で20分間予備混合し;この混合物を、細胞懸濁液に2μl/mlで加えて、3.5時間インキュベートした。細胞を、リン酸緩衝塩溶液(PBS)で2回洗い、接種前に300μlのハンクス液(HBSS)中に再懸濁させた。或は、電気穿孔法による細胞標識を、5×106のT細胞のアリコートに対してHBSS中で行なった。一方向性の80mVの、20msの長さのパルスを、BTX830電気穿孔機(Harvard Apparatus, マサチューセッツ、Holliston)により送達した。その後、細胞を、培地の添加及び37℃での4時間の更なるインキュベーションの前に、氷上で、10分間インキュベートした。
細胞の生存力を、メチルトリアゾールテトラゾリウム(MTT)アッセイ(ATCC、バージニア、Manassas)を、製造業者の指示に従って利用して測定した。細胞のアリコートを、標識後、2、4及び48時間でアッセイした。標識細胞の細胞傷害性も又、トリパンブルー排除アッセイを利用して評価した(細胞のアリコートをトリパンブルーと混合してから、血球計で計数した)。蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)分析のために、細胞を、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)又はフィコエリトリン(PE)結合したCD4及びCD62Lに対する抗体(PharMingen, カリフォルニア、San Diego)を用いて染色した。これらのマーカーの発現レベルを、LSRII FACS装置(Becton Dickinson, カリフォルニア、Mountain View)におけるフローサイトメトリーによって測定した。
実験を、Carnegie Mellon Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)及び National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsにより与えられたガイドラインに従って行なった。NOD SCID及びBALB/cマウスを、Jackson Laboratriesから購入し、NOD BDC2.5マウスは、血統内で繁殖させた。すべてのマウスを、ピッツバーグ大学又はカーネギーメロン大学の生物医学研究用のピッツバーグNMRセンターの動物施設に収容した。養子移入実験のために、NOD BDC2.5マウスの脾臓由来の精製したT細胞をイン・ビトロで活性化し、標識して、宿主のNOD SCIDマウスに腹腔内注射(i.p.)により移入した。レシピエントマウスは、細胞移入の24時間前に、PBS中の200mg/kgのシクロホスファミド(Sigma-Aldrich)で予備処理(i.p.)した(20)。すべてのマウスは、8〜10週齢であり、各マウスは、2〜6×106の標識細胞を受けた(i.p.)。
イン・ビトロで活性化したT細胞を、蛍光性エマルジョン調製物(上記)とインキュベートして、2回洗った。T細胞を、ポリ−L−リジンコートされたカバーガラス上で30分間インキュベートしてから、1% パラホルムアルデヒド(PFA)で固定した。それらの固定した細胞を、RNアーゼ処理後に、10μg/ml TOTO−3核染料(Molecular Probe-Invitrogen)を含むVectaShield(Vector Labs, カリフォルニア、Burlingame)マウンティングメディウムにてマウントした。その後、これらのスライドを、Leica TCS SP2分光共焦点顕微鏡(Leica Microscopes, Inc., ペンシルベニア、Exton)を用いてイメージ化した。
すべての19F NMR測定は、Bruker DRX500分光計(Bruker BioSpin, Inc., マサチューセッツ、Billerica)を用いて、470MHzで行なった。細胞当たりの平均の細胞内19F投与量、Fcを、1×106の標識細胞をNMRチューブ内でペレット化することによって測定した。このNMRチューブは又、5μlの5%v/vトリフルオロ酢酸(TFA)を含む小さいシールされたキャピラリーをも含み、これは、較正された19Fスピンの量を与える。Fcを計算した。このFcを、PFPEとTFAスペクトルの統合した面積の比から計算した。全器官のNMRのために、MRIの直後にマウスを犠牲にして、これらの器官を採取して4% PFAで48時間固定した。これらの固定した器官を、TFA19F参照基準溶液を含むシールされたキャピラリーをも含むNMRチューブに入れた。すべての19Fスペクトル(記した場合を除く)を、8sのリサイクルディレイ、12μsパルス幅、20kHzのスペクトル幅、256平均、2048獲得点、及び90°のフリップ角を利用して得た。
イメージング前に、マウスを、ケタミン/キシラジンカクテルで麻酔し、IPカテーテルを縫合糸で固定し、実験の持続期間(2〜3時間)にわたってマウスに追加のカクテルを注入するためのシリンジポンプに接続した。最大総投与量約0.33mgのケタミン及び0.02mgのキシラジンを、インクリメンタルステップ−ダウン投与量プロトコールにて送達した。スキャン中、このマウスを保温して、機械式ベンチレーター(Harvard Apparatus Inc., マサチューセッツ、Hilliston)に接続し、これは、2:1のO2/NO2を送達する。マウスをクレードル中に位置させて、11.7T、89mm垂直孔ミクロイメージングシステム(Bruker)を用いてイメージ化した。大きな鳥かご型共鳴器を用いたが、これは、19Fについての470MHz又は1Hについての500MHzを調べることができる。このマウスの温度を、動物クレードルを囲む水充填ジャケット(調節された閉サイクルの水浴に接続されている)を用いて、35〜37℃に維持した。希釈PFPEエマルジョンを含むシールされたチューブを、イメージ視野内で、胴体の隣りに置いて、較正された外部19F参照基準とした。19Fイメージを、増大された緩和による迅速な獲得(RARE)シーケンスを、8に等しいRARE因子、TR/TE=1000/6.4ms、64×32イメージ点及び50kHzのバンド幅で利用して得た。1Hイメージを、2DFTスピン−エコーシーケンスを、TR/TE=1200/22ms及び512×256イメージ点で利用して得た。19F及び1Hの両者につき、正確に同じ座標で、胴体内の8個の隣接した2mm厚のスライスを得た。この視野は、すべての獲得につき、5×2.8cmであった。全MRI励起物を、呼吸ゲート制御した。
見かけのPFPE標識された細胞の量を、MRIデータセット、外部19F参照基準、及び測定されたFcから直接計算した。この計算を、スライス当たりベースで行なった。19Fイメージの実数値のノイズ等級Nを、イメージの周辺付近のボクセル値の標準偏差を計算することにより測定した。このNは、実又は虚のコンポーネントから等しく計算することができる。次に、これらの等級値を、各ボクセルにつき計算し、その後、生成したRician分布したノイズ(低シグナル対ノイズ比イメージで認められる)を補償するように修正された(21)。我々のRician修正は、等級値mを一層低い値m’にリセットし、それで、各コンポーネントm’に加えられるノイズNでの(m’+0i)の等級の予想される値は、m=E(|(m’+n1)+n2i|)であり、式中、Eは、予想された値を示し、n1及びn2は、正規分布するランダム変数 (ゼロが平均で、標準偏差はN) である。このmは、所定のm’について、n1及びn2の一組のランダムな値についてのmの平均値を見出すことにより、統計的に見積もることができる。n1及びn2のランダムな対(1,000,000試行)が、mの各見積りにつき引かれた。各ピクセル値についてのこの計算を回避するために、mは、m’=0、0.1N、0.2N、・・・8Nについて見積もられた。このm’は、mにおいて単調であり、それ故、更なるm値は、m’結果を、Matlab関数のinterp1()を用いて補間することによって計算された。8Nより上では、Rician分布がガウス分布に近似し、修正の意味がないので、調整を行なわなかった。次に、平均等級シグナル値Rを、19F参照基準を含むROI内で計算した。このRは、参照基準を含むボックスを対話的に選択して、その中の等級が2.5Nより大きいボクセルを自動的に同定し、それにより、記録したボクセルが実際の19Fシグナルを含むことの99%より大きい信頼因子を設定することによって計算された。この自動的に計算されたROIを、次いで、任意の近くのシグナルを捕らえるための平面内の半ボクセル及び部分的ボリューム効果の計算によって広げた。この分析から、我々は、パラメーターr(参照基準内のボクセル当たりの19Fの量)をも計算した。次に、膵臓中の全シグナルPを計算した。ROIは、この膵臓を含むボックスを対話的に選択することにより規定され、2.5Nより大きいシグナルを有するボクセルを自動的に等級イメージ内に同定した。やはり、同定された領域の周辺も、1/2ボクセルにより広げられた。このPを、次いで、すべての同定されたボクセルからの調整された等級値のシグナルを合計することにより計算した。この膵臓に含まれる見かけの細胞の数Cは、関係C=(Pr)/(RFc)を利用して計算された。Cにおける不確定性は、方程式σ(R)r/(RFc)を利用することにより見積もられた。式中、
フルオロカーボンベースの細胞標識及びイメージング法の有用性の更なる例として、急性炎症モデルにおける実験を記載する。我々は、二重の19F MRI−蛍光細胞PFPE標識の有用性を、局所的炎症のマウスモデルにおいて示す。我々は、活性化されたT細胞をPFPEナノ粒子を用いて、エキソ・ビボで、効率的に標識することができることを示す(ホーミングの選択的可視化及び炎症位置のイン・ビボでの体軸に沿ったMRI並びに光学的イメージング方法による定量を可能にする)。これは、T細胞動力学の研究に便利なモデルを与える。我々は、抗原特異的なT細胞のイン・ビボでの移動を最長で21日間追跡した。細胞数の定量を、5つの時点で、イン・ビボイメージのデータセットから直接行なった。我々は、移入された細胞の約30%が、移入後48時間で排液リンパ節に到達することを見出した。19F PFPE標識に共有結合した蛍光染料は、イン・ビボで、光学イメージング並びに標識T細胞の回収及び特性決定を、組織学及びFACSにより可能にした。まとめると、我々のデータは、この新規な二重モデルが、細胞移動の非侵襲的追跡及び定量を、細胞移入後少なくとも最大で3週間可能にすることを示している。ここに記載した局所的炎症モデルは、臓器拒絶、癌治療及び自己免疫疾患などの多くの病状の免疫学的及び炎症的面を研究するために利用することができる。この実施例の動物モデル及びPFPEイメージングプラットフォームを利用して、炎症応答を変調し又は減衰するためにデザインされた小型分子薬物、組換えタンパク質又は任意の他の生物学的若しくは細胞ベースの治療の効力を定量的に評価することもできる。
本明細書中で言及されたすべての刊行物及び特許を、本明細書中に参考として、そっくりそのまま、個々の刊行物又は特許が特に個別に参考として援用されることを示されたように援用する。それらが矛盾する場合には、本願は、本願における任意の定義を含めて、調整する。
本明細書では、主題の発明の特別の具体例を明示的に開示したが、上記の明細書は、説明のためのものであって、制限するものではない。これらの発明の多くの変形は、当業者には、この明細書及び下記の請求の範囲を見ることによって明らかとなろう。この発明の全範囲は、請求の範囲をそれらの同等物の全範囲と共に参照すること及び明細書をかかる変形物と共に参照することにより決定されるべきである。
Claims (62)
- 細胞数をイン・ビボで定量するための方法であって、下記を含む当該方法:
a.被験者にフルオロカーボンイメージング試薬で標識された細胞を投与すること;
b.被験者の少なくとも一部分を、核磁気共鳴技術により調べ、それにより、その被験者中の標識細胞を検出すること;
及び
c.目的領域(ROI)における標識細胞数を定量すること。 - フルオロカーボンイメージング試薬が、パーフルオロポリエーテルである、請求項1に記載の方法。
- フルオロカーボンイメージング試薬が、パーフルオロ−クラウンエーテルである、請求項1に記載の方法。
- イメージング試薬が、パーフルオロ−15−クラウン−5−エーテルである、請求項1に記載の方法。
- フルオロカーボンイメージング試薬を、直鎖状過フルオロポリエーテル、環状過フルオロポリエーテル及びこれらの混合物よりなる群から選択する、請求項1に記載の方法。
- 被験者への投与前に、細胞を、フルオロカーボンイメージング試薬を含む組成物と接触させ、それにより、該細胞がフルオロカーボンイメージング試薬で標識される、請求項1に記載の方法。
- 被験者への投与前に、細胞を、電気穿孔法を利用して、過フルオロカーボンエマルジョン粒子で標識する、請求項1に記載の方法。
- フルオロカーボンイメージング試薬を含む組成物が、取込み増進用試薬を更に含む、請求項7に記載の方法。
- フルオロカーボンイメージング試薬を含む組成物が、更に、下記を含む、請求項7に記載の方法:
a.界面活性剤;及び
b.カチオン性脂質。 - 取込み増進用試薬が、下記よりなる群から選択する化合物を含む、請求項9に記載の方法:
a.カチオン性脂質;及び
b.カチオン性ポリペプチド。 - カチオン性ペプチドが、プロタミンである、請求項11に記載の方法。
- フルオロカーボンイメージング試薬の少なくとも一部分が細胞内に内在化される、請求項7に記載の方法。
- フルオロカーボンイメージング試薬を含む組成物が、Pluronic L-35を更に含む、請求項7に記載の方法。
- フルオロカーボンイメージング試薬をエマルジョンとして配合する、請求項7に記載の方法。
- エマルジョンが、30〜500nmの平均直径を有する粒子を含む、請求項7に記載の方法。
- 細胞が、哺乳動物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、免疫系の細胞である、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、T細胞である、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、樹状細胞である、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 核磁気共鳴技術によるイメージングが、19Fデータセットを集めることを含む、請求項1に記載の方法。
- 1Hデータセットを集めることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 19Fイメージ及び1Hイメージを生成すること及び比較することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 核磁気共鳴技術が、磁気共鳴イメージング(MRI)である、請求項1に記載の方法。
- 核磁気共鳴技術が、磁気共鳴分光法(MRS)である、請求項1に記載の方法。
- 細胞を被験者に、細胞治療養生法の部分として投与する、請求項1に記載の方法。
- フルオロカーボンイメージング試薬で標識された細胞を含む移植物のレシピエント中の該標識された細胞の数を定量する方法であって、下記を含む当該方法:
a.被験者の少なくとも一部分を核磁気共鳴技術により調べ、それにより、その被験者中の標識細胞を検出すること、
b.標識された細胞の数を定量すること。 - 移植(recipient)レシピエントにおいて標識細胞の位置を検出し、適宜、標識細胞の追跡を行なう、請求項28に記載の方法。
- 核磁気共鳴技術を、磁気共鳴イメージング及び磁気共鳴分光法よりなる群から選択する、請求項28に記載の方法。
- 移植レシピエントが、骨髄移植レシピエントである、請求項28に記載の方法。
- 移植用の細胞が、造血幹細胞を含む、請求項28に記載の方法。
- 移植用の細胞を、骨髄、臍帯血又は末梢血から得る、請求項28に記載の方法。
- 移植レシピエントが、ドナーの器官のレシピエントである、請求項28に記載の方法。
- ドナーの器官の細胞の少なくとも一部分が、フルオロカーボンイメージング試薬で標識される、請求項28に記載の方法。
- 移植レシピエントが、ヒトである、請求項28に記載の方法。
- 定量することが、ROIにおける較正された19Fシグナルの利用を含む、請求項1に記載の方法。
- 定量することが、ROIにおける較正された19Fシグナルの利用を含む、請求項28に記載の方法。
- 調べることが、予め較正された19Fシグナルを検出することを含み、それからROIにおける19Fシグナルと19F分子の代表的数又は細胞量との関係を推定することができる、請求項1又は28に記載の方法。
- 調べることが、ROIにおける同時のシグナルを検出することを含み、それからそのシグナルと19F分子の代表的数又は細胞量との関係を推定することができる、請求項1又は28に記載の方法。
- 調べることが、ROIにおける後で較正された19Fシグナルを検出することを含み、それからそのシグナルと19F分子の代表的数又は細胞量との関係を推定することができる、請求項1又は28に記載の方法。
- フルオロカーボンイメージング試薬の細胞投与量を、細胞の被験者への投与の前に計算する、請求項37に記載の方法。
- フルオロカーボンイメージング試薬の細胞投与量を、移植の前に計算する、請求項38に記載の方法。
- 定量することが、被験者の19F MRI/MRSスキャン中に、較正された外部19F参照基準との比較によって行なわれる、請求項1に記載の方法。
- 定量することが、被験者の19F MRI/MRSスキャン中に、較正された外部19F参照基準との比較によって行なわれる、請求項28に記載の方法。
- 参照基準が、無細胞参照基準である、請求項44に記載の方法。
- 参照基準が、無細胞参照基準である、請求項45に記載の方法。
- 定量することが、19Fシグナルの強度と、参照基準と比較されるROI中の標識細胞の体積との比を計算することを含む、請求項1に記載の方法。
- 定量することが、19Fシグナルの強度と、参照基準と比較されるROI中の標識細胞の体積との比を計算することを含む、請求項28に記載の方法。
- 標識細胞の数を定量することが、下記よりなる群からのパラメーターの少なくとも一つを利用することを含む、請求項1に記載の方法:
(i)イン・ビトロで測定された標識剤の細胞内投与量(即ち、Fc);(ii)標識細胞投与後の一以上の時点において被験者に取り込まれたイン・ビボの19F MRI/MRSデータセット;(iii)ボクセル体積;(iv)平面内のボクセル領域(即ち、イメージピクセルの領域);(v)19F参照基準からのMRI/MRSデータセット;(vi)被験者材料における19F MRI/MRSデータの測定されたジョンソンノイズ;(vii)患者材料における19F MRI/MRSデータセットの一以上のボクセルの測定されたシグナル対ノイズ比(SNR);(viii)参照基準からの19F MRI/MRSデータセットの一以上のボクセルの測定されたSNR;(ix)被験者材料の19F NMRの緩和時間(T1、T2及びT2*);及び(x)参照基準の19F NMRの緩和時間(T1、T2及びT2*)。 - 標識細胞の数を定量することが、下記よりなる群からのパラメーターの少なくとも一つを利用することを含む、請求項28に記載の方法:
(i)イン・ビトロで測定された標識剤の細胞内投与量(即ち、Fc);(ii)標識細胞投与後の一以上の時点において被験者に取り込まれたイン・ビボの19F MRI/MRSデータセット;(iii)ボクセル体積;(iv)平面内のボクセル領域(即ち、イメージピクセルの領域);(v)19F参照基準からのMRI/MRSデータセット;(vi)被験者材料における19F MRI/MRSデータの測定されたジョンソンノイズ;(vii)患者材料における19F MRI/MRSデータセットの一以上のボクセルの測定されたシグナル対ノイズ比(SNR);(viii)参照基準からの19F MRI/MRSデータセットの一以上のボクセルの測定されたSNR;(ix)被験者材料の19F NMRの緩和時間(T1、T2及びT2*);及び(x)参照基準の19F NMRの緩和時間(T1、T2及びT2*)。 - 19F標識した細胞の定量のための計算システムであって、該システムは、下記:
コンピューター;
該コンピューターに機能的に結合されたコンピューター読み取り可能な媒体
を含み、
コンピューター読み取り可能な媒体のプログラムコードが、下記を含む機能を実行する当該システム:
核磁気共鳴技術により調べられたROI中の19F標識した細胞の定量。 - 定量が、較正されたNMRシグナルを細胞投与量又は細胞量と関係付けることを含む、請求項54に記載のシステム。
- 機能が、下記を含む、請求項54に記載のシステム:
標識細胞の数を、19Fシグナルの強度と参照基準と比較されたROI中の標識細胞の体積との比によって計算すること。 - 機能が、下記を含む、請求項54に記載のシステム:
標識細胞の数を、下記よりなる群からのパラメーターの少なくとも一つを利用して計算すること:
(i)標識剤の細胞内投与量(即ち、Fc);(ii)標識細胞投与後の一以上の時点において被験者に取り込まれたイン・ビボの19F MRI/MRSデータセット;(iii)ボクセル体積;(iv)平面内のボクセル領域(即ち、イメージピクセルの領域);(v)19F参照基準からのMRI/MRSデータセット;(vi)被験者材料における19F MRI/MRSデータの測定されたジョンソンノイズ;(vii)患者材料における19F MRI/MRSデータセットの一以上のボクセルの測定されたシグナル対ノイズ比(SNR);(viii)参照基準からの19F MRI/MRSデータセットの一以上のボクセルの測定されたSNR;(ix)被験者材料の19F NMRの緩和時間(T1、T2及びT2*);及び(x)参照基準の19F NMRの緩和時間(T1、T2及びT2*)。 - 19F標識された細胞のイン・ビボ定量を実行するためのコンピューター読み取り可能なプログラムコードを内部に包含して有するコンピューター読み取り可能な媒体であって、コンピューター読み取り可能なプログラムコードが、下記を含む機能を実行する当該媒体:
磁気共鳴技術により検出されたROI中の19F標識された細胞の数を計算すること。 - 機能が下記を含む、請求項59に記載のシステム:
標識細胞の数を、19Fシグナルの強度と、参照基準と比較されたROI中の標識細胞の体積との比によって計算すること。 - 機能が下記を含む、請求項59に記載のシステム:
標識細胞の数を、下記よりなる群からのパラメーターの少なくとも一つを利用して計算すること:
(i)標識剤の細胞内投与量(即ち、Fc);(ii)標識細胞投与後の一以上の時点において被験者に取り込まれたイン・ビボの19F MRI/MRSデータセット;(iii)ボクセル体積;(iv)平面内のボクセル領域(即ち、イメージピクセルの領域);(v)19F参照基準からのMRI/MRSデータセット;(vi)被験者材料における19F MRI/MRSデータの測定されたジョンソンノイズ;(vii)患者材料における19F MRI/MRSデータセットの一以上のボクセルの測定されたシグナル対ノイズ比(SNR);(viii)参照基準からの19F MRI/MRSデータセットの一以上のボクセルの測定されたSNR;(ix)被験者材料の19F NMRの緩和時間(T1、T2及びT2*);及び(x)参照基準の19F NMRの緩和時間(T1、T2及びT2*)。
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