JP2009533052A

JP2009533052A - サンプル中のプロテアーゼの活性を測定するための方法

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Publication number: JP2009533052A
Application number: JP2009505323A
Authority: JP
Inventors: アンデッシュ・ブロムグレン; アンデッシュ・エリクソン; トーマス・ハンソン; キース・ジョリー; マッティ・レピステ; カリン・フォン・ヴァッシェンフェルト
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2006-04-12
Filing date: 2007-04-11
Publication date: 2009-09-17
Also published as: EP2010669A4; CN101466846A; US20100021940A1; WO2007117199A1; EP2010669A1

Abstract

サンプル中のプロテアーゼの活性を測定する方法が提供される。本方法は、(ｉ)該サンプルと基質を混合し、ここで、該基質は式(１ａ)
【化１】

〔式中：
Ｒ_１はヒドロカルビル基であり
Ｒ_２は第一ペプチド部分であり
Ｒ_３は第二ペプチド部分であり、そして
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され；
Ｙ_１は適当な置換基であり；
Ｙ_２は適当な置換基である。〕
を有し、そして
(ii)該プロテアーゼの活性を、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１
〔式中：
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され；そして
Ｒ_１はヒドロカルビル基である。〕
を有するレポーターの存在の検出により測定する工程を含む。本基質およびレポーターは、プロテアーゼモジュレーターおよび候補プロテアーゼモジュレーターの効果の測定のためにおよび対象における疾患または障害の診断に有用である。

Description

分野
本発明は、方法、ならびに該方法において使用するための基質および該方法により製造されたレポーターに関する。

特に、本発明は、サンプル中のプロテアーゼの活性の測定方法であって、該サンプルと基質を混合し、該プロテアーゼの活性をレポーターの存在下で測定することを含む方法に関する。

本発明はまたサンプル中のプロテアーゼの活性の測定方法であって、該サンプルと基質を混合し、該プロテアーゼの活性をレポーターの存在下で測定することを含む方法において有用な基質およびレポーターに関する。

他の局面において、本発明はプロテアーゼモジュレーターおよび候補プロテアーゼモジュレーターの効果を測定するための基質およびレポーターの使用に関する。

さらなる局面において、本発明は、対象における疾患または障害の診断における基質およびレポーターの使用に関する。

背景
メタロプロテイナーゼのようなプロテアーゼは、コラーゲン、プロテオグリカンおよびフィブロネクチンのような広範囲の基質を開裂することができる。それ故にメタロプロテイナーゼのようなプロテアーゼは、生物学的に重要な腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)のような細胞メディエーターのプロセシング、または分泌；および低親和性ＩｇＥ受容体ＣＤ２３のような生物学的に重要な膜タンパク質の翻訳後タンパク質分解プロセシング、または分断(shedding)に重要であると見なされている(より完全なリストについてはN. M. Hooper et al., (1997)Biochem J. 321:265-279を参照のこと)。

メタロプロテイナーゼの例は、マトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ) − 例えばコラゲナーゼ(ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３)、ゼラチナーゼ(ＭＭＰ２、ＭＭＰ９)、ストロメライシン(ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１)、マトリライシン(ＭＭＰ７)、メタロエラスターゼ(ＭＭＰ１２)、エナメリシン(ＭＭＰ１９)、ＭＴ−ＭＭＰ(ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７)；レプロライシン(reprolysin)またはアダマリシン(adamalysin)またはＭＤＣファミリー− これはＴＮＦ変換酵素(ＡＤＡＭ１０およびＴＡＣＥ)のようなセクレターゼおよびシェダーゼを含む；アスタシンファミリー− これはプロコラーゲンプロセシングプロテイナーゼ(ＰＣＰ)のような酵素を含む；およびアグリカナーゼ、エンドセリン変換酵素ファミリーおよびアンギオテンシン変換酵素ファミリーのような他のメタロプロテイナーゼを含む。

今日まで、数種のアッセイが、サンプル中のメタロプロテイナーゼのようなプロテアーゼの存在を決定するために使用されている。

例えば、Hanemaaijer et al(1999, Ann. N.Y. Acad. Sci., vol 878, 141-149)は、腫瘍患者の尿におけるＭＭＰ９活性を決定するためのアッセイを開示している。このアッセイは、ＭＭＰ９特異的抗体を使用した体液からのＭＭＰ９の捕捉、続く洗浄工程および次いで基質としての修飾ウロキナーゼおよび発色基質とのインキュベーションを必要とする。

Bicket et al(1993, Analytical chemistry 212:58-64)は、ＭＭＰ１およびＭＭＰ９により加水分解される蛍光性ペプチド基質(Ｄｎｐ−プロ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ(Ｍｅ)−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−(Ｎｍａ)−ＮＨ_２)を開示する。酵素の活性を決定するために、本アッセイは蛍光性ペプチド基質および精製ＭＭＰ９または精製ＭＭＰ１を使用する。

Mucha et al(1998, J Biological chemistry 273:2763-2768)は、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＳＴ３により開裂される合成基質を開示する。Mucha et alにより記載されているアッセイは、ＳＴ３とＭＴ１−ＭＭＰの精製触媒ドメインおよび蛍光標識基質の使用を教示する。

Tung et al(1999 - Bioconjugate Chem 10:892-896)は、細胞培養におけるカテプシンＤ活性を決定するためのＣａＤ基質スペーサーを有する近赤外蛍光(ＮＩＲＦ)プローブの使用を開示する。

蛍光性基質Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ａｒｇ−プロ−Ｌｙｓ−プロ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ(ＥＤＡＮＳ)−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２(ＴＮＯ００３)は、リウマチ性関節炎患者からの滑液におけるストロメライシン(ＭＭＰ−３)活性のミニターに使用された(B. Beekman et al, FEBS Letters 1997, 418(3), 305-309)。

ＷＯ−Ａ−０３／０２５１２５は、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９およびＭＴ１−ＭＭＰ(ＭＭＰ１４)に特異的なポリペプチド配列を開示する。これらのペプチド配列は、治療部分またはフルオロフォアのような診断剤に結合し得る。

ＷＯ−Ａ−０３／１０２５４４は、ＭＭＰ１３に特異的であるポリペプチド配列および該ポリペプチド配列への蛍光、比色、放射活性および発光ラベルの結合を開示する。

先行技術のアッセイの問題点は、基質を、例えば、フルオロフォアまたは放射活性ラベルで標識する必要があることである。先行技術のアッセイの他の問題点は、全てのペプチド結合の開裂が検出される− 特異的ペプチド結合の開裂が検出できないことである。いくつかの先行技術のアッセイのプロテアーゼのさらなる問題点は、最初に精製することが必要であり、その後該プロテアーゼの活性が検出できることである。加えて、先行技術のアッセイを、プロテアーゼモジュレーターの活性の決定に使用できない。

本発明は、先行技術に関連する問題のいくつかに取り組む／軽減しようと努める。

広い局面
以下の文脈において、一般式(１ａ)、(１ｂ)、(１ｃ)および(１ｄ)の基質化合物を参照する。参照を容易にするために、および適用できるときは、これらの化合物を集合的に一般式(１)の基質化合物と呼ぶ。それ故に、一般式(１)の基質化合物への言及は、一般式(１ａ)、(１ｂ)、(１ｃ)および(１ｄ)の基質化合物に等しく適用される。加えて、一般式(１)、(１ａ)、(１ｂ)、(１ｃ)または(１ｄ)の化合物についての好ましい局面は、いずれかの他の一般式(１)、(１ａ)、(１ｂ)、(１ｃ)または(１ｄ)の化合物に等しく適用される。

本発明の一つの広い局面において、サンプル中のプロテアーゼの活性を測定する方法であって：
(ｉ)該サンプルと基質を混合し、ここで、該基質は式(１ａ)

〔式中：
Ｒ_１はヒドロカルビル基であり
Ｒ_２は第一ペプチド部分であり
Ｒ_３は第二ペプチド部分であり、そして
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され；
Ｙ_１は適当な置換基であり；そして
Ｙ_２は適当な置換基である。〕
を有し、そして
(ii)該プロテアーゼの活性を、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１
〔式中：
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され；そして
Ｒ_１はヒドロカルビル基である。〕
を有するレポーターの存在の検出により測定する工程を含む、方法を提供する。

サンプル中のプロテアーゼの活性の測定は、サンプル中のプロテアーゼの活性の定性的評価および／または定量的評価を意味する。
好ましくは、Ｙ_１はＨである。
好ましくは、Ｙ_２はＨである。

それ故に、本発明の非常に好ましい局面において、基質は式(１ｂ)：

〔式中：
Ｒ_１はヒドロカルビル基であり
Ｒ_２は第一ペプチド部分であり
Ｒ_３は第二ペプチド部分であり、そして
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択される。〕
を有する。

好ましくは、Ｒ_１は単または多環式環構造である。
好ましくは、Ｒ_１は１個、２個または３個のヒドロカルビル環を含む。いくつかの場合、より好ましくは、Ｒ_１は２個または３個のヒドロカルビル環を含む。
Ｒ_１が２個のヒドロカルビル環を含むならば、好ましくは、これらの環は非縮合環である。
Ｒ_１が３個のヒドロカルビル環を含むならば、好ましくは、これらの環の２個は縮合環である。

ヒドロカルビル環の１個以上はヘテロ原子 − 例えば１個以上のＮを含んでよい。
ヒドロカルビル環の１個以上は置換されていてよい。
ヒドロカルビル環の１個以上は不飽和であってよい。

好ましくは、Ｒ_２は少なくとも２個のアミノ酸基を含み、ここで、該基は天然アミノ酸または非天然アミノ酸またはそれらの組合せである。

好ましくは、Ｒ_２は少なくとも３個のアミノ酸基を含み、ここで、該基は天然アミノ酸または非天然アミノ酸またはそれらの組合せである。

好ましくは、Ｒ_３は少なくとも２個のアミノ酸基を含み、ここで、該基は天然アミノ酸または非天然アミノ酸またはそれらの組合せである。

いくつかの態様について、好ましくは、Ｒ_３は少なくとも３個のアミノ酸基を含み、ここで、該基は天然アミノ酸または非天然アミノ酸またはそれらの組合せである。

それ故に、本発明の好ましい局面において、基質は式(１ｃ)：

〔式中、
Ｒ_１はヒドロカルビル基であり
Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３、Ｓ_２'およびＳ_３'の各々は、独立して天然アミノ酸または非天然アミノ酸から選択され；
Ｌ_１は結合または１個もしくは数個のアミノ酸であり；
Ｌ_２は結合または１個もしくは数個のアミノ酸であり；
Ｇ_１は適当な末端基であり；
Ｇ_２は適当な末端基であり；
ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ_１は、好ましくは、Ｈであり；そして
Ｙ_２は、好ましくは、Ｈである。〕
を有する

一例として、Ｌ_１は１個以上のα、β...などω−アミノ酸− 例えば(一例として)Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙまたはγ−ブチルアミドであり得る。
一例として、Ｌ_２は１個以上のα、β...などω−アミノ酸− 例えば(一例として)Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙまたはγ−ブチルアミドであり得る。

一例として、Ｇ_１は末端基、保護基、発色団または蛍光団(fluorophoric group)であり得る。
一例として、Ｇ_２は末端基、保護基、発色団または蛍光団であり得る。

本発明の好ましい局面において、基質は式(１ｄ)：

〔式中、
Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３、Ｓ_２'およびＳ_３'の各々は、独立して天然アミノ酸または非天然アミノ酸から選択され；
Ｌ_１は結合または１個もしくは数個のアミノ酸であり；
Ｌ_２は結合または１個もしくは数個のアミノ酸であり；
Ｇ_１は適当な末端基であり；
Ｇ_２は適当な末端基であり；
ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり；そして
Ｒ_１はパネル１：
パネル１：

(ここで、パネル１のＸは、式(１ｄ)の基質の残りを意味する)
から選択される。〕
を有する。

さらなる局面
本発明の一つの局面において、プロテアーゼモジュレーターの効果を測定する方法であって：
(ｉ)該プロテアーゼモジュレーターとプロテアーゼおよび式(１)を有する基質を混合し、そして
(ii)該プロテアーゼの活性を、ここで定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在を検出することにより測定する工程を含む方法を提供する。

この方法の後、より多くのプロテアーゼモジュレーターを製造および／または次いで製剤してよい。製剤工程は：プロテアーゼモジュレーターの誘導体化；プロテアーゼモジュレーターのプロドラッグへの成形；プロテアーゼモジュレーターと１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤の１種以上を含み得る。

本発明の他の局面において、候補プロテアーゼモジュレーターの効果を測定する方法であって：
(ｉ)該候補プロテアーゼモジュレーターとプロテアーゼおよび式(１)を有する基質を混合し、そして
(ii)該プロテアーゼの活性を、ここで定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在を検出することにより測定する工程を含む方法を提供する。

この方法の後、より多くの候補プロテアーゼモジュレーターより多くのを製造および／または次いで製剤してよい。製剤工程は：プロテアーゼモジュレーターの誘導体化；プロテアーゼモジュレーターのプロドラッグへの成形；プロテアーゼモジュレーターと１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤の１種以上を含み得る。

本発明の他の局面において、プロテアーゼモジュレーターを同定する方法であって：
(ｉ)候補プロテアーゼモジュレーターとプロテアーゼおよび式(１)を有する基質を混合し、そして
(ii)該プロテアーゼの活性を、ここで定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在を検出することにより測定する工程を含む方法を提供する。

本発明の他の局面において、プロテアーゼモジュレーターを同定し、より多くの同定されたプロテアーゼモジュレーターを製造しおよび／または次いでそのより多くの同定されたプロテアーゼモジュレーターを製剤する工程を含む方法であって；該同定部分が：
(ｉ)候補プロテアーゼモジュレーターとプロテアーゼおよび式(１)を有する基質を混合し、
(ii)該プロテアーゼの活性を、ここで定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在を検出することにより測定する工程を含む方法を提供する。

製剤工程は：プロテアーゼモジュレーターの誘導体化；プロテアーゼモジュレーターのプロドラッグへの成形；プロテアーゼモジュレーターと１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤の１種以上を含み得る。

さらなる局面において、本発明は式(１)を有する基質を提供する。
他の局面において、本発明はプロテアーゼによりカルボニル基と−ＮＨ−ＣＨ(Ｘ−Ｒ_１)−基の間のペプチド結合で開裂され得る基質であって；
ここで：
Ｒ_１はヒドロカルビル基であり、そして
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択される、基質を提供する。

本発明は、さらなる局面において、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターであって；
ここで、
Ｒ_１はヒドロカルビル基であり、そして
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され；そして該レポーターは式(１)の基質由来であるレポーターを提供する。

他の局面において、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターであって、ここで、Ｒ_１がヒドロカルビル基であり、そしてＸがＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され；そして、Ｒ_１がパネル１：

(パネル１)
(ここで、パネル１のＸはレポーターの残りである)
から選択される、レポーターを提供する。

本発明のさらなる局面は、サンプル中のプロテアーゼの活性を測定するためのキットであって：
(ｉ)式(１)を有する基質；および
(ii)サンプル中のここで定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターを検出するための手段
を含むキットを提供する。

他の局面において、本発明は、サンプル中のプロテアーゼの活性の検出のための式(１)を有する基質の使用を提供する。

本発明は、さらなる局面において、サンプル中のプロテアーゼの活性の検出のための、ここで定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの使用を提供する。

本発明は、他の局面において、対象における疾患または障害を診断する方法であって、該対象からサンプルを得て、該サンプルにおけるプロテアーゼの活性を：
(ｉ)該サンプルと式(１)を有する基質を混合し；
(ii)該プロテアーゼの活性を、ここで定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在を検出することにより測定する
工程を含む方法により測定する工程を含む方法を提供する。

さらなる局面において、本発明は、対象における疾患または障害の診断において使用するための式(１)を有する基質を提供する。

他の局面において、本発明は、対象における疾患または障害の診断において使用するための、ここで定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターを提供する。

他の局面において、サンプル中のプロテアーゼの活性を測定する方法であって、該サンプルと基質を混合し、ここで、該基質は、該プロテアーゼによりカルボニル基と−ＮＨ−ＣＨ(Ｘ−Ｒ_１)−基の間のペプチド結合で開裂されることができ；そして、該プロテアーゼの活性を、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在の検出により測定することを含む、方法を提供する。ＸおよびＲ_１はここに定義した通りである。

さらなる局面において、プロテアーゼモジュレーターの効果を測定する方法であって、サンプルをプロテアーゼモジュレーターで処理するおよび／またはプロテアーゼモジュレーターで処置した対象からサンプルを得て；該サンプルと基質を接触させ、ここで、該基質は、該プロテアーゼによりカルボニル基と−ＮＨ−ＣＨ(Ｘ−Ｒ_１)−基の間のペプチド結合で開裂されることができ；そして該プロテアーゼの活性を、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在の検出により測定することを含む、方法を提供する。ＸおよびＲ_１はここに定義した通りである。

他の局面において、候補プロテアーゼモジュレーターの効果を測定する方法であって、サンプルを候補プロテアーゼモジュレーターで処理するおよび／または候補プロテアーゼモジュレーターで処置した対象からサンプルを得て；該サンプルと基質を接触させ、ここで、該基質は、該プロテアーゼによりカルボニル基と−ＮＨ−ＣＨ(Ｘ−Ｒ_１)−基の間のペプチド結合で開裂されることができ；そして、該プロテアーゼの活性を、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在の検出により測定することを含む、方法を提供する。ＸおよびＲ_１はここに定義した通りである。

利点
ここに記載した方法は、単にサンプル中の該プロテアーゼをコードするｍＲＮＡのレベルまたはポリペプチド自体のレベルではなく、サンプル中のプロテアーゼの活性を検出する。

驚くべきことに、本発明の基質は、プロテアーゼの活性を測定するために、基質に蛍光、発光、比色または放射活性標識を付加する必要性を除く。

驚くべきことに、ここに記載したアッセイ法は、目的の結合の開裂を測定する。本発明において、プロテアーゼが、目的の結合で基質を開裂するとき、それはレポーターの産生(すなわち放出)をもたらす。プロテアーゼが基質をどこかで開裂するならば、レポーターは産生されない。

何らかのあるプロテアーゼの特異性プロファイルが、開裂部位から両方向に伸びる基質アミノ酸配列により大きく決定される。開裂した結合のいずれかの側に隣接するアミノ酸は、しばしば特異性のために最も重要であるが、重要な決定的アミノ酸は、開裂部位から６位ほど離れることが可能である。(J.D.A. Tyndell et al, 2005, Chem. Rev. 105, 973-999 − プロテアーゼによる基質認識のレビュー)。従って、少なくとも二次元構造効果(すなわち折り畳み、螺旋構造)が重要にはり始める限界まで、特異的部位で開裂される可能性は、適当な配列の基質の長さと共に増加することが予測できる。しかしながら、理論に縛られることを望まないが、基質の長さが長くなるほど、その長い配列が特に興味深いプロテアーゼ(複数もある)の開裂部位(複数もある)の間に他のプロテアーゼの開裂部位を含む配列危険性が高まる。それ故に、ここに記載した通りの特異的結合開裂を検出する能力は、有利に特異的プロテアーゼによる開裂を決定できるアッセイをもたらす。

ここに記載した方法は、他の酵素がサンプルに存在することを可能とする。
ここに記載した方法は、この方法が洗浄工程の使用を必要としないため、プロテアーゼモジュレーターの効果のモニターに使用できる。

ここに記載したアッセイ法は、プロテアーゼに特異的である抗体の使用を必要としない。
ここに記載した方法は、サンプルとして組織を使用できる。
ここに記載した基質は、特に興味深いプロテアーゼの非存在下で、血清および血漿のようなサンプル中、安定である。

好ましい局面
好ましくは、プロテアーゼモジュレーターはプロテアーゼ阻害剤である。
好ましくは、プロテアーゼモジュレーターはプロテアーゼアクティベーターである。プロテアーゼアクティベーターの例は、ザイモサンである。

プロテアーゼアクティベーターの他の例は、 Rivera-Marrero et al (2002, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282: L546-L555); Kadish et al (1986, Immunol. Res. 5:129); Czop et al (1978, J. Immunol. 120:1132); Williams(1996, Clin. Immunother. 5:392); Ross et al (1999, Immunopharmacology, 42:61); Williams et al (1978, J Reticuloendothel. Soc. 23:479); Kokoshis et al (1978 Science 199:1340); Itoh (1997, Mediat. Inflamm. 6:267); Williams (1997, Mediat. Inflamm. 6:247)に見ることができる。

好ましくは、候補プロテアーゼモジュレーターは候補プロテアーゼ阻害剤である。
好ましくは、他の態様について、候補プロテアーゼモジュレーターは候補プロテアーゼアクティベーターである。

好ましくは、サンプルは、尿、全血、血漿、血清、滑液、唾液、痰、気管支肺胞液、脳脊髄液、鼻汁、肺内層液(lining fluid)、涙液および皮膚水疱液のような任意の哺乳動物生体液から成る群から選択される。

好ましくは、サンプルは：細胞培養、組織、組織切片および均質化組織から成る群から選択される。
好ましくは、プロテアーゼは哺乳動物マトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)ＥＣ３.４.２４−である。

好ましくは、マトリクスメタロプロテイナーゼはＭＭＰ１(ＥＣ３.４.２４.７)、ＭＭＰ２(ＥＣ３.４.２４.２４)、ＭＭＰ３(ＥＣ３.４.２４.１７)、ＭＭＰ８(ＥＣ３.４.２４.３４)、ＭＭＰ９(ＥＣ３.４.２４.３５)、ＭＭＰ１２(ＥＣ３.４.２４.６５)およびＭＭＰ１３(ＥＣ３.４.２４−)から成る群から選択される。より好ましくは、該マトリクスメタロプロテイナーゼはＭＭＰ９(ＥＣ３.４.２４.３５)である。別のより好ましい態様において、該マトリクスメタロタンパク質はＭＭＰ１２(ＥＣ３.４.２４.６５)である。さらに別のより好ましい態様において、該マトリクスメタロタンパク質はＭＭＰ１３(ＥＣ３.４.２４−)である。

好ましくは、ヒドロカルビル基Ｒ_１は、アリール、ヘテロアリール、アリールオキシアリール、ビアリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル基およびそれらの誘導体から成る群から選択される。

より好ましくは、Ｒ_１は、アリール、ヘテロアリール、アリールオキシアリール、ビアリールおよびそれらの誘導体から成る群から選択される。
好ましくは、Ｒ_１は１０〜２５個の炭素原子、好ましくは、１０〜２０個の炭素原子を含む。

非常に好ましい態様において、Ｒ_１はパネル１から選択され；ここで、パネル１のＸは基質の残りである。
非常に好ましい態様において、Ｒ_１はパネル１から選択され；ここで、パネル１のＸはレポーターの残りである。

好ましくは、基質は１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチルである。
好ましくは、レポーターは４−ニトロアニリン、ビフェニル−４−イル−メタノール、４−(５−ｐ−トリル−[１,３,４]オキサジアゾール−２−イル)−フェニルアミン、Ｎ−ヒドロキシ−２−フェニル−アセトアミド、ビフェニル−４−カルボン酸ヒドロキシアミド、または２−(−４−イソブチル−フェニル)−プロピオン酸(イブプロフェン(登録商標))である。

より好ましくは、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターは、４−ニトロアニリン、４−(５−ｐ−トリル−[１,３,４]オキサジアゾール−２−イル)−フェニルアミン、またはビフェニル−４−イル−メタノールである。
非常に好ましい態様において、レポーターは４−ニトロアニリンである。

好ましくは、疾患または障害は：リウマチ性関節炎、骨関節症；多発性硬化症；喘息、鼻炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性細気管支炎(bronchioliti)、気道線維症および慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)のような気道疾患から成る群から選択される。

より好ましくは、疾患または障害は骨関節症、喘息または慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)である。
一つの非常に好ましい態様において、疾患または障害は骨関節症である。
他の非常に好ましい態様において、疾患または障害は慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)である。

詳細な記載
プロテアーゼ
ここで使用する用語“プロテアーゼ”は、ペプチド結合を加水分解する酵素を意味する。言い換えると、プロテアーゼは、タンパク質の複数アミノ酸の間のペプチド結合を破壊する酵素である − この過程をタンパク分解性開裂と呼ぶ。プロテアーゼはまたプロテイナーゼ、ペプチダーゼまたはタンパク分解性酵素とも呼ばれる。

プロテアーゼは、酵素命名法番号ＥＣ３.４.^＊の下に分類される。プロテアーゼは、それらの活性部位の最も顕著な官能基に基づき分類される。現在まで、６クラスのプロテアーゼ：セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼおよびメタロプロテイナーゼが存在する。

既知プロテアーゼのデータベースはhttp://merops.sanger.ac.uk(Rawlings, N.D., Tolle, D.P. & Barrett, A.J. (2004)MEROPS:the peptidase database. Nucleic Acids Res. 32 Database issue, D160-D164)で利用可能である。

メタロプロテイナーゼ
メタロプロテイナーゼ(またはメタロプロテアーゼ)は、それらの活性部位でＺｎ^２＋またはＣａ^２＋のような金属イオンと結合する。このイオンは、通常２〜４個の側鎖を配位し、そして酵素の活性に必須である。このイオンそれ自体もまた水分子により配位され、これもまた触媒活性に重要である。

メタロプロテイナーゼは酵素前駆体として分泌され、活性化は活性部位亜鉛原子に結合したプロペプチド配列の開裂を必要とする。この活性は、全血をザイモサンとインキュベートすることにより模倣できる。

メタロプロテイナーゼの２つのサブグループ：メタロカルボキシペプチダーゼ(ＥＣ３.４.１７)およびマトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ、メタロエンドペプチダーゼまたはマトリキシン(matrixin)とも呼ばれる − ＥＣ：３.４.２４)がある。
好ましくは、プロテアーゼはマトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)ＥＣ３.４.２４.−である。

マトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ) − ＥＣ３.４.２４. −
ＭＭＰは、中性ｐＨで広範囲の基質を開裂するよう機能する細胞外プロテアーゼである(例えば基底膜および細胞外マトリクス成分、増殖および細胞死因子、サイトカイン、および細胞およびマトリクス接着分子 − Bergers and. Coussens Curr. Opin. Genet. Dev. 2000 10 120;VisseおよびNagase Circ. Res. 2003 92 827;Egeblad and Werb Nat. Rev. Cancer 2002 2 161)。

ＭＭＰの基質特異性および発現パターンの広い範囲が、正常および異常両方の多くの多様な工程におけるそれらの関与をもたらす。ＭＭＰの異常発現が、とりわけ他の疾患および障害の中で、喘息、癌、血管形成、リウマチ性関節炎、骨関節炎、骨粗鬆症、腸炎症性疾患、歯周病、アテローム性動脈硬化症、気腫、多発性硬化症、子癇前症、および慢性創傷において注目されている(Bergers and Coussens Curr. Opin. Genet. Dev. 2000 10 120;Visse and Nagase Circ. Res. 2003 92 827;Nelson. et al. J. Clin. Oncol. 2000 18 1135)。

ＭＭＰタンパク質の一般構造は、細胞からの分泌を指示するプレドメイン、プロドメイン、触媒ドメイン、およびＣ末端ヘモペキシンドメインから成る。ＭＭＰが機能するためには、Ｃａ^２＋およびＺｎ^２＋イオン両方への結合が必要である − Ｚｎ^２＋のみが酵素の活性部位に結合し、Ｃａ^２＋は分子の立体構造の維持にのみ必要である。酵素の不活性な、またはチモーゲン形態は、プロドメインのタンパク分解性除去により活性化される(Woessner and Nagase Metalloproteinases and TIMPs. 2000 Oxford University Press)。

既知マトリクスメタロプロテイナーゼの構造的および機能的考察に基づき、ＭＭＰはN.M. Hooper(1994)FEBS Letters 354:1-6に記載のようなファミリーおよびサブファミリーに分類されている。

マトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)の例は、コラゲナーゼ(ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３)、ゼラチナーゼ(ＭＭＰ２、ＭＭＰ９)、ストロメライシン(ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１)、マトリライシン(ＭＭＰ７)、メタロエラスターゼ(ＭＭＰ１２)、エナメリシン(ＭＭＰ１９)、ＭＴ−ＭＭＰ(ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７)を含む。

好ましくは、マトリクスメタロプロテイナーゼはＭＭＰ１(ＥＣ３.４.２４.７)、ＭＭＰ２(ＥＣ３.４.２４.２４)、ＭＭＰ３(ＥＣ３.４.２４.１７)、ＭＭＰ８(ＥＣ３.４.２４.３４)、ＭＭＰ９(ＥＣ３.４.２４.３５)、ＭＭＰ１２(ＥＣ３.４.２４.６５)およびＭＭＰ１３(ＥＣ３.４.２４.−)から成る群から選択される。

より好ましくは、マトリクスメタロプロテイナーゼは、ＭＭＰ８(ＥＣ３.４.２４.３４)、ＭＭＰ９(ＥＣ３.４.２４.３５)、ＭＭＰ１２(ＥＣ３.４.２４.６５)およびＭＭＰ１３(ＥＣ３.４.２４.−)から成る群から選択される。

非常に好ましい態様において、該マトリクスメタロプロテイナーゼはＭＭＰ９(ＥＣ３.４.２４.３５)である。
他の非常に好ましい態様において、該マトリクスメタロプロテイナーゼはＭＭＰ１２(ＥＣ３.４.２４.６５)である。
さらなる非常に好ましい態様において、該マトリクスメタロプロテイナーゼはＭＭＰ１３(ＥＣ３.４.２４.−)である。

・ＭＭＰ１(ＥＣ３.４.２４.７)
コラゲナーゼ(ＥＣ３.４.２４.７)としても既知のＭＭＰ１は、Brinckerhoff et al(1987 J. Clin. Invest. 79:542-546)により同定された。コラゲナーゼは、間質性コラーゲン、Ｉ型、II型、およびIII型の分解を開始できる唯一の酵素である。それはまた、VII型およびＸ型のコラーゲンも開裂できる。コラーゲンは体内で最も豊富なタンパク質であり、コラゲナーゼは広範に分布する酵素である。

UniProt受託番号Ｐ０３９５６およびＰ０８１５６は、ＭＭＰ１活性を有するポリペプチド配列を詳述する。
例として、Ｐ０３９５６は、コラーゲンの三重螺旋を、Ｎ末端から７７５−Ｇｌｙ−で、分子の約３／４の長さで開裂する。

・ＭＭＰ２(ＥＣ３.４.２４.２４)
ゼラチナーゼ２としても既知のＭＭＰ２は酵素前駆体として分泌される。酵素前駆体の開裂は、可溶性活性形態の産生に至り、それは癌細胞の表面に存在する受容体によりさらにトラップされる(Brooks P. et al., 1996, Cell, 31;85(5):683-93)。プロから成熟形態へのＭＭＰ２活性化は、膜型ＭＭＰ(ＭＴ−ＭＭＰ)が関与する複雑な機構である。ＭＴ１−ＭＭＰ(ＭＭＰ１４)は、ＭＭＰ２の最も強力なアクティベーターである。ＭＭＰの細胞外活性は、それらがＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２のような特異的阻害剤と複合体を形成したときに阻害される。

ＭＭＰ２はゼラチンＩ型およびコラーゲンIV型、Ｖ型、VII型、Ｘ型を開裂する。
UniProt受託番号Ｐ０８２５３は、ＭＭＰ２活性を有するポリペプチド配列を詳述する。
例として、Ｐ０８２５３は、コラーゲン様配列プロ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−｜−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎを開裂する。それはまたＫｉＳＳ１をＧｌｙ−｜−Ｌｅｕ結合で開裂する。

・ＭＭＰ３(ＥＣ３.４.２４.１７)
ＭＭＰ３(線維芽細胞ストロメライシンまたはトランシンとも呼ばれる)は、コラゲナーゼ(ＭＭＰ１)に非常に関連しているプロテオグリカナーゼである。ＭＭＰ３は、結合組織細胞により優勢に産生される分泌型メタロプロテアーゼである。ＭＭＰ３は、広範な基質特異性を有し、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、およびIV型コラーゲンを分解できるが、間質性Ｉ型コラーゲンはできない。

UniProt受託番号Ｐ０８２５４およびＱ６ＧＲＦ８は、ＭＭＰ３活性を有するポリペプチド配列を詳述する。
例として、Ｐ０８２５４は、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型、III型、IV型、およびＶ型のゼラチン；コラーゲンIII、IV、Ｘ、およびIX、および軟骨プロテオグリカンを分解できる。それはまたプロコラゲナーゼを活性化できる。Ｐ０８２５４は、疎水性残基で主に開裂する。

ＭＭＰ−３活性は、炎症を起こしている歯肉から単離された線維芽細胞で証明されており[Uitto V. J. et al, 1981, J. Periodontal Res., 16:417-424]、酵素レベルは歯肉疾患の重症度と相関している[Overall C. M. et al, 1987, J. Periodontal Res., 22:81-88]。ＭＭＰ−３はまた種々の慢性潰瘍における基底ケラチン生成細胞により産生される[Saarialho-Kere U. K. et al, 1994, J. Clin. Invest., 94:79-88]。

ＭＭＰ−３ｍＲＮＡおよびポリペプチドは、恐らく増殖表皮の部位を表している、創傷端に隣接するが、遠位の基底ケラチン生成細胞で見られる。ＭＭＰ−３は、故に、表皮が治癒するのを妨げ得る。

数名の研究者らが、リウマチ様および骨関節症患者からの滑液におけるＭＭＰ−３の、対照と比較して一貫した上昇を証明している[Walakovits L. A. et al, 1992, Arthritis Rheum., 35:35-42; Zafarullah M. et al, 1993, J. Rheumatol., 20:693-697]。

・ＭＭＰ８(ＥＣ３.４.２４.３４)
ＭＭＰ−８(コラゲナーゼ−２または好中球コラゲナーゼ)は、主に好中球で発現される。研究は、ＭＭＰ−８がまた骨関節炎軟骨細胞のような他の細胞でも発現されることを示唆する[Shlopov et al, 1997, Arthritis Rheum, 40:2065]。

UniProt受託番号Ｐ２２８９４およびＱ４５Ｆ９９は、ＭＭＰ８活性を有するポリペプチド配列を詳述する。
例として、Ｐ２２８９４は、原繊維型Ｉ、II、およびIIIコラーゲンを分解できる。さらに、それは、三重螺旋ドメイン内で間質性コラーゲンを開裂する。

好中球により産生されるＭＭＰは、組織リモデリングの原因となり得て、それ故にＭＭＰ−８の遮断は、例えば肺の繊維性疾患、および肺気腫のような分解性疾患においてポジティブな効果を有し得る。
ＭＭＰ−８はまた骨関節症で上方制御されることが判明しており、ＭＭＰ−８の遮断はまたこの疾患にも有用であり得ることを示す。

ＭＭＰ９(ＥＣ３.４.２４.３５)
ＭＭＰ９(ゼラチナーゼＢ；９２ｋＤIV型コラゲナーゼ；９２ｋＤゼラチナーゼ)は、１９８９年に最初に、精製され、その後クローニングおよび配列決定された分泌型タンパク質である[S.M. Wilhelm et al(1989)J. Biol Chem. 264(29):17213-17221;J. Biol Chem. (1990)265(36):22570には誤植]。

UniProt受託番号Ｐ１４７８０、Ｑ８Ｎ７２５、Ｑ９Ｈ４Ｚ１およびＱ３ＬＲ７０は、ＭＭＰ９活性を有するポリペプチド配列を詳述する。
例として、Ｐ１４７８０は、ＫｉＳＳ１をＧｌｙ−で開裂する。Ｐ１４７８０は、ゼラチンＩ型およびＶ型およびコラーゲンIV型およびＶ型を開裂する。

VuおよびWerb(1998)は、プロテアーゼＭＭＰ９をレビューしている(Matrix Metalloproteinases. 1998. Edited by W.C. Parks & R.P. Mecham. pp115 - 148. Academic Press. ISBN 0-12-545090-7中)。以下の点が、このT.H. Vu & Z. Werb(1998)から導き出される。

ＭＭＰ９の発現は、通常、栄養芽細胞、破骨細胞、好中球およびマクロファージを含む数細胞型に限定されている。しかしながら、ＭＭＰ９の発現は、これらの同じ細胞および他の細胞型で、細胞の増殖因子またはサイトカインへの暴露を含む数種のメディエーターにより誘発できる。これらは、炎症性応答の開始にしばしば関与するのと同じメディエーターである。他の分泌型ＭＭＰと同様、ＭＭＰ９は不活性酵素前駆体として放出され、その後開裂して、酵素的に活性な酵素を形成する。インビボでこの活性化に必要なプロテアーゼは知られていない。活性ＭＭＰ９対不活性酵素のバランスが、インビボで、さらに、天然に存在するタンパク質であるＴＩＭＰ−１(メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤)との相互作用により制御される。ＴＩＭＰ−１は、ＭＭＰ９のＣ末端領域に結合し、ＭＭＰ９触媒ドメインの阻害に至る。ＰｒｏＭＭＰ９の誘導発現、プロから活性ＭＭＰ９への開裂およびＴＩＭＰ−１の存在が組み合わさって、局所に存在する触媒的に活性なＭＭＰ９の量を決定する。タンパク分解性に活性のＭＭＰ９は、ゼラチン、エラスチン、および天然IV型およびＶ型コラーゲンを含む基質を攻撃する；それは、天然Ｉ型コラーゲン、プロテオグリカンまたはラミニンには活性はない。

ＭＭＰ９は、種々の生理学的および病理学的過程に関与している。生理学的役割は、胚性移植の初期段階における子宮上皮を介した胚性栄養芽細胞の侵襲；骨の成長および発生におけるいくつかの役割；および脈管構造から組織への炎症性細胞の移動を含む。

増加したＭＭＰ９発現は、例えばＣＯＰＤ、喘息、関節炎、腫瘍転移、アルツハイマー、多発性硬化症、および心筋梗塞のような急性冠血管状態に至るアテローム性動脈硬化症におけるプラーク破裂において観察されており、それ故に、ＭＭＰ９は疾患過程に関与する。

・ＭＭＰ１２(ＥＣ３.４.２４.６５)
マクロファージエラスターゼまたはメタロエラスターゼとしても既知のＭＭＰ１２は、最初にShapiro et alによりマウスで(1992, Journal of Biological Chemistry 267:4664)および１９９５年に同じグループによりヒトで(Belaaouaij et al 1995, J biol Chem 270:14568-14575)クローンかされた。

UniProt受託番号Ｐ３９９００は、ＭＭＰ１２活性を有するポリペプチド配列を詳述する。
ＭＭＰ１２は、主に活性化マクロファージにおいて発現され、喫煙者の肺胞マクロファージから分泌されることが示されており(Shapiro et al, 1993, Journal of Biological Chemistry, 268:23824)、ならびに動脈硬化病変における泡沫細胞において発現される(Matsumoto et al, 1998, Am J Pathol 153:109)。

ＣＯＰＤのマウスモデルは、週に６日間、１日２本の煙草で、６ヶ月間の煙草の煙での攻撃に基づく。野生型マウスは、この処置後肺気腫を発症する。ＭＭＰ１２ノックアウトマウスをこのモデルで試験したとき、顕著な気腫は発症せず、ＭＭＰ１２がＣＯＰＤ病因における重要な酵素であることを示す。

ＣＯＰＤ(気腫および気管支炎)におけるＭＭＰ１２のようなＭＭＰの役割は、Anderson and Shinagawa, 1999, Current Opinion in Anti-inflammatory and Immunomodulatory Investigational Drugs 1(1): 29-38において議論されている。

Matetzky et al(2000)は、喫煙がヒト頚動脈プラークKangavariにおけるマクロファージ浸潤およびマクロファージ由来ＭＭＰ−１２発現を増加することを記載する(Matetzky S, Fishbein MC et al., Circulation 102:(18), 36-39 Suppl. S, Oct 31, 2000)。

・ＭＭＰ１３(ＥＣ３.４.２４.−)
ＭＭＰ１３、またはコラゲナーゼ３は、最初に乳房腫瘍由来のｃＤＮＡライブラリーからクローン化された(J. M. P. Freije et al. (1994)Journal of Biological Chemistry 269(24):16766-16773)。UniProt受託番号Ｐ４５４５２およびＱ６ＮＷＮ６は、ＭＭＰ１３活性を有するポリペプチド配列を詳述する。

広範囲の組織からのＲＮＡの分析は、ＭＭＰ１３発現が、それが乳線維腺腫腺腫、正常および休止乳腺、胎盤、肝臓、卵巣、子宮、前立腺または耳下腺または乳癌細胞株(Ｔ４７−Ｄ、ＭＣＦ−７およびＺＲ７５−１)において見られなかったため、乳癌腫に限定されることを示した。この観察の後、ＭＭＰ１３は、形質転換上皮ケラチン生成細胞(Johansson et al., 1997 Cell Growth Differ. 8(2):243-250)、扁平細胞癌腫(Johansson et al., (1997)Am. J. Pathol. 151(2):499-508)および上皮腫瘍(irola et al., (1997)J. Invest. Dermatol. 109(2):225-231)において検出されている。これらの結果は、ＭＭＰ１３が形質転換上皮性細胞により分泌され、そしてとりわけ侵襲性乳癌病巣および皮膚発癌における悪性上皮増殖において観察されるような転移と関連する細胞外マトリクス分解および細胞−マトリクス相互作用に関与し得ることを示唆する。

最近公開されたデータは、ＭＭＰ１３が他の結合組織のターンオーバーにおいて役割を有することを暗示する。例えば、ＭＭＰ１３の基質特異性および、II型コラーゲン分解の優先性と一致して(Mitchell et al., 1996 J. Clin. Invest. 97(3):761-768; Knauper et al., 1996 The Biochemical Journal 271:1544-1550)、ＭＭＰ１３が、リウマチ様および骨関節炎のような破壊性関節疾患(Wernicke et al., 1996 J. Rheumatol. 23:590-595;Mitchell et al., 1996 J. Clin. Invest. 97(3):761-768;Lindy et al., 1997 Arthritis Rheum 40(8):1391-1399)における、初期骨形成および骨格リモデリングの間に(Stahle-Backdahl et al., 1997 Lab. Invest. 76(5):717-728;Johansson et al., 1997 Dev. Dyn. 208(3):387-397)；および人工股関節の無菌的ゆるみの間に(Imai et al., 1998 J. Bone Joint Surg. Br. 80(4):701-710)役割を有することが仮説立てられている。ＭＭＰ１３はまた、慢性に炎症を起こしているヒト歯肉粘膜組織の上皮に局在化しているため、慢性成人歯周炎において(V. J. Uitto et al., 1998 Am. J. Pathol 152(6):1489-1499)および慢性創傷におけるコラーゲン性マトリクスのリモデリングにおいて(Vaalamo et al., 1997 J. Invest. Dermatol. 109(1):96-101)関与が暗示されている。

基質およびレポーター
ここで使用する用語“基質”は、式(１)を有する化合物− すなわち一般式(１ａ)、(１ｂ)、(１ｃ)または(１ｄ)の化合物を意味する。

ここで使用する用語“レポーター”は、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有する化合物を意味し；ここで、Ｒ_１はヒドロカルビル基であり；Ｒ_２は第一ペプチド部分であり；Ｒ_３は第二ペプチド部分であり；そしてＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択される。

好ましくは、ＸはＳである。
別の態様において、好ましくは、ＸはＮＨである。

より好ましくは、Ｒ_１は、アリール、ヘテロアリール、アリールオキシアリール、ビアリールおよびそれらの誘導体から成る群から選択される。

非常に好ましい態様において、Ｒ_１はパネル１から選択され、ここで、パネル１のＸは基質の残りである。
非常に好ましい態様において、Ｒ_１はパネル１から選択され、ここで、パネル１のＸは、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの残りである。

・ヒドロカルビル基
ここで使用する用語“ヒドロカルビル基”は、少なくともＣおよびＨを含み、そして所望により１個以上の他の適当な置換基を含み得る基を意味する。このような置換基の例は、ハロ−、アルコキシ−、ヒドロキシ−、ニトロ−、炭化水素基、アミド基、カルバメートエステル基、エステル基、例えばアシル基、ニトリル基、Ｎ−アシル基、環状基などを含み得る。置換基が環状基である可能性に加えて、置換基の組合せが環状基を形成し得る。ヒドロカルビル基が１個を超えるＣを含むならば、これらの炭素は互いに結合している必要はない。例えば、炭素の少なくとも２個が、適当な元素または基を介して結合し得る。それ故に、ヒドロカルビル基はヘテロ原子を含み得る。適当なヘテロ原子は当業者には明白であり、例えば、硫黄、窒素、酸素、珪素およびリンを含む。

例えば、ヒドロカルビル基はアリール、アリールオキシアリール、ビアリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロ環状基およびそれらの誘導体から選択され得る。例えば、ヒドロカルビル基はピリジル、またはピリミジルから選択され得る。

・炭化水素基
ここで、用語“炭化水素”はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基もしくはアシル基(これらの基は直線状、分枝状または環状であってよい。)またはアリール基のいずれか一つを意味する。用語炭化水素はまた、所望により置換されているこのような基も含む。炭化水素が、その上に置換基(複数もある)を有する分枝状構造であるならば、該置換は、炭化水素骨格または分枝上のいずれかにあり得る；あるいは、置換は炭化水素骨格および分枝上にあり得る。

・ヘテロ環式基
ここで用語“ヘテロ環式基”は、環内に少なくとも１個の炭素原子および少なくとも１個のヘテロ原子を含む環状環を意味する。ヘテロ環式基はヘテロシクロアルキル基またはヘテロアリール基であり得る。適当なヘテロ原子は当業者には明白であり、例えば、硫黄、窒素、酸素、珪素およびリンを含む。

ヘテロ環式環は、所望により１個以上の適当な置換基で置換され得る。このような置換基の例は、ハロ−、アルコキシ−、ハロゲン置換アルコキシ−、ヒドロキシ−、ニトロ−、炭化水素基、アミド基、カルバメートエステル基、アルキルカルバメートエステル基、エステル基、ニトリル基、Ｎ−アシル基、または環状基、例えばアリール基を含み得る。置換基が環状である可能性に加えて、置換基の組合せが環状基を形成し得る。

・化学誘導体
本発明の一つの態様において、化合物は誘導体であり得る。
ここで使用する用語“誘導体”は、化合物の化学修飾を含む。このような化学修飾の説明は、水素のハロ基、アルコキシ基、ハロゲン置換アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、炭化水素基、アミド基、カルバメートエステル基、アルキルカルバメートエステル基、エステル基、例えばアシル基、ニトリル基、Ｎ−アシル基、または環状基、例えばアリール基での置換であろう。

・置換基
本発明の化合物は、ここに示す環系のもの意外に置換基を有し得る。さらにここに記載の環系は、一般式として示し、そのようなものとして解釈すべきである。ある環員上に何ら具体的に示す置換基がないことは、環員が、Ｈが単に一例である任意の部分で置換され得ることを示す。環系は、１以上の不飽和度を含み得て、例えばある局面において、環系の１個以上の環は芳香族性である。本環系は炭素環であってよく、または１個以上のヘテロ原子を含んでよい。

・ペプチド性部分
第一のペプチド部分(Ｒ_２)および第二のペプチド部分(Ｒ_３)は、ペプチド性部分を含む。
ここで使用する、ペプチド性部分は、ペプチド結合により結合している１個以上のアミノ酸を含む基である。アミノ酸は天然アミノ酸でも非天然アミノ酸でも、またはそれらの組合せでも良い。アミノ酸の好ましい例は、α−アミノ酸単位である。ペプチド性部分は、さらに、１個以上のβ−、γ−、ω−またはδ−アミノ酸単位を含み得る。アミノ酸単位は、一端を末端基、保護基、発色団、または蛍光団でキャップされていてよい。

基質がレポーター基に加えて発色団または蛍光団を担持するとき、基質は、同じサンプルで、同時にまたは別々に任意の結合および特異的結合での開裂のアッセイに使用できる。

好ましくは、Ｒ_２はジペプチド、トリペプチドまたはテトラペプチドである。
好ましくは、Ｒ_３はジペプチド、トリペプチドまたはテトラペプチドである。
好ましくは、Ｒ_２はトリペプチド３−Ｓ２−Ｓ１であり、ここで、Ｓ３はプロリンまたはグリシンから選択され、Ｓ２はロイシン、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、チロシンから選択され、そしてＳ１はグリシン、アラニン、セリンおよびヒスチジンから選択される。

より好ましくは、Ｒ_２はプロリン−ロイシン−グリシンである。
あるいは、より好ましくは、Ｒ_２はグリシン−ロイシン−アラニンである。
好ましくは、Ｒ_３はジペプチド２'−Ｓ３'であり、ここで、Ｓ２'はロイシン、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、チロシンから選択され、Ｓ３'はグリシン、β−アラニンから選択されるか、または無い。
より好ましくは、Ｒ_３はロイシン−β−アラニンである。

・末端基
いくつかの態様において、基質は、Ｎ末端および／またはＣ末端での荷電を除くために末端基を含み得る。このような末端基はまた特異的に除去できる保護基であり得る。適当な末端基および保護基は、当業者には容易に明白となろう。このような末端基および保護基およびそれらの付加および／または基質からの除去の方法は、例えば“Protective Groups in Organic Synthesis” by T W Greene and P G M Wuts, John Wiley and Sons Inc. (1991)およびP.J.Kocienski, in “Protecting Groups”, Georg Thieme Verlag (1994)により記載のような慣用の技術により達成できる。

適当なＮ末端基(式１ｃおよび１ｄにおけるＧ１)は、アセチル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルおよびフルオレニルメチルオキシカルボニルを含む。適当なＣ末端基(式１ｃおよび１ｄにおけるＧ２)は、メチルエステル、エチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、メチルアミド、エチルアミドおよびフェニルアミドを含む。

・基質の製造
本発明の基質化合物は、標準的化学技術により製造できる。

例えば、式IIの合成ブロックを− 例えばPaulitz et al, J. Org. Chem., 1997, 62(24), 8474-8により記載の技術により − 製造でき、次いで式(１)の化合物の製造に使用する。

〔式中：
Ｒ_１はヒドロカルビル基またはポリスチレンポリマーであり
Ｓ１はグリシン、アラニン、セリンおよびヒスチジンから選択され、所望により適当であれば保護されており
Ｐｔｎは末端基、好ましくは、保護基であり
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択される。〕。

あるいは、それらの製造は、スルフヒドリル誘導体化ポリマー、好ましくは、ポリスチレンの結合に適合できる。

好ましくは、式IIの合成ブロックは、Ｎ保護されたアミノ酸アミドＰｔｎ−Ｓ１−ＮＨ_２とグリオキシル酸を反応させ、中間体をチオールＲ１−ＳＨおよび硫酸のような酸触媒で処理することにより製造できる：

式IIの構成要素は可溶性でもおよび／または重合体でもよい。
好ましくは、Ｐｔｎはフルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)である。

式IIの構成要素は、ペプチド合成の標準法により、式Ｉｅの基質の完全長前駆体に取り込み得る。ペプチド合成の一般原則ならびにアミノ酸側鎖保護ストラテジーを適用し、そして当業者には既知である。本主題の一般的教則本は、“Principles of Peptide Synthesis” by M. Bodansky (Springer-Verlag 1984)および“Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach” by E. Atherton and R.C. Shepperd (IRL Press, Oxford University Press 1989)を含む。

ａ)結合した固体支持体上の固相ペプチドシンセサイザーを基質の製造のために使用する。Ｎ保護基は、好ましくは、Ｆｍｏｃであり；Ｐｏｌは重合支持体、好ましくは、ポリスチレンビーズであり、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３、Ｓ_２'、Ｓ_３'は式１ｄで定義の通りである。

ｂ)モノ、ジ、トリおよびテトラペプチドブロック等の溶液合成を使用して、基質を製造する。Ｎ−保護基Ｐｔｎは好ましくは、Ｆｍｏｃであり；Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３、Ｓ_２'、Ｓ_３'は式１ｄで定義の通りである。

ｃ)あるいは、Ｒ_１がポリスチレンのような固体支持体であるとき、式IIの合成ブロックは両方向に増殖できる。Ｎ−保護基Ｐｔｎは、好ましくは、Ｆｍｏｃであり；Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３、Ｓ_２'、Ｓ_３'は式１ｄで定義の通りである。

これはＲ_１が好ましくはポリスチレンポリマーである式１ｃのペプチドをもたらす。あるいは、Ｒ_１は、パネル１から選択されるレポーター置換基であり、この場合、該ペプチドは、ＸがＳである式１ｄを構成する。
Ｎ−保護基Ｐｔｎは、好ましくは、Ｆｍｏｃ；Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３、Ｓ_２'、Ｓ_３'は式１ｄで定義の通りである。

ペプチドが必要な配列および適当な末端基キャッピング(必要であるならば)を有するとき、それは、方法ａ)を使用したとき標準法により固体支持体から遊離され、最終的に開裂末端で修飾されるか、または方法ｂ)およびｃ)の産物を(工程ｄにおいて)親チオ試薬、好ましくは、Ｎ−ヨードスクシンイミド(ＮＩＳ)で処理し、過剰のアルコール、フェノール、チオールまたは式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１のアミンで処理して、式１ｄの基質を得る。これらは、好ましくは、−ＸＲ_１残基の立体化学が天然基質のものに対応するときのペプチドが、他の立体異性体と比較して非常に効率的に開裂されることが期待されるため、それらのジアステレオマーに分割する。

−ＸＲ_１の導入後にさらなる修飾が望まれるならば、必要な保護基操作は、好ましくは、非酸性条件およびカップリング反応である。

あるいは、Ｒ_１−Ｘ基をクロロまたはブロモ誘導体(１ｆ)を介して交換できる：

所望により、式(１)の置換基ＸＲ_１が式IIおよびIIIのＳＲ_１であるとき、工程(ｄ)のチオール交換反応は必要ではない。

・レポーターを製造するための基質の開裂
式(１)を有する本発明の基質はプロテアーゼにより開裂可能である。言い換えると、基質はプロテアーゼにより酵素的に消化され得る。

式(１)を有する基質がプロテアーゼにより開裂される結果、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターが形成される。この酵素反応は以下の通り示される：

開裂矢印はプロテアーゼ作用を示す。

式(１)を有する基質が目的の結合で開裂されたとき、得られる中間体化合物(Ｖ)は、Ｘがヘテロ原子(Ｏ、Ｓ、またはＮＨ)であるとき不安定中間体である。中間体化合物Ｖにおけるアミノ基が電子供与基であり、側鎖−ＸＲ_１への結合を不安定にし、これは急速に加水分解される。これは化合物VII(すなわちレポーター)の形成をもたらす。

プロテアーゼが、基質をどこかで開裂するならば、化合物VII(すなわちレポーター)は産生されない。
故に、基質のＸおよびＲ_１は、レポーターのＸおよびＲ_１と同一である。

ここで使用する用語“遊離”は、上記の酵素反応において記載のレポーターの産生、続くプロテアーゼによるここに記載の基質の酵素的消化を意味する。
ここで使用する用語“目的の結合”は、プロテアーゼにより開裂されるおよびレポーターＨ−Ｘ−Ｒ_１の形成をもたらす式(１)の基質を意味する。目的の結合は、カルボニル基とＮＨ−ＣＨ(Ｘ−Ｒ_１)基の間である。

・レポーターの検出
ここで使用する用語“プロテアーゼの活性”は、プロテアーゼの酵素反応を意味する。

サンプル中のプロテアーゼの活性は、サンプルと式(１)を有する基質を混合し、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在を検出することにより測定できる。

好ましくは、混合物を５〜１２０分インキュベートし、より好ましくは、式(１)を有する基質がサンプルに添加されてから、該反応を約３０分インキュベートし、非常に好ましい態様において、該反応を、約１５分インキュベートする。

好ましくは、混合物を１５〜４０℃の温度でインキュベートする。より好ましくは、混合物を約３７℃でインキュベートする。

サンプル中の式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在は、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＵＶ、ＬＣ−ＭＳまたは蛍光測定により検出できる(Ｒ１がフルオロフォアならば、消光基が基質のどこかに存在するか、またはその逆)。

それ故にここで使用する用語“レポーターを検出するための手段”は、サンプル中の式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在を検出するための、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳのような適当な手段を意味する。

ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳは、当分野で既知の技術である(例えば、Snyder and Kirkland - Introduction to Modern Liquid Chromatography, Second edition, John Wiley & Sons, Inc. 1979 (HPLC);およびJurgen H Gross - Mass Spectrometry, A textbook, Springer Verlag 2004 (LC-MS)参照)。

サンプル中のプロテアーゼの活性の量を測定するために、式(１)を有する基質と混合したサンプルで一定時間に産生される式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの量を、式(１)を有する基質と混合し、既知量のプロテアーゼで処理した対照サンプルにおいて一定時間に産生される式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの量と比較できる。好ましくは、混合物を５〜１２０分混合し、より好ましくは、式(１)を有する基質がサンプルに添加されてから、該反応を、約３０分インキュベートし、非常に好ましい態様において、該反応を約１５分インキュベートする。

式(１)を有する基質と混合されたサンプルは、式(１)を有する基質の目的の結合に作用できるプロテアーゼがサンプルにないならば、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターを産生しない。それ故に、このようなサンプルにはレポーターが存在しない。

好ましくは、式(１)を有する基質は１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチルである。
ここで、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターは、４−ニトロアニリンである。

あるいは、好ましくは、式(１)を有する基質は、１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−[４−(５−ｐ−トリル−[１,３,４]オキサジアゾール−２−イル)−フェニルアミノ]−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチルである。

ここで、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターは４−(５−ｐ−トリル−[１,３,４]オキサジアゾール−２−イル)−フェニルアミンである。

あるいは、好ましくは、式(１)を有する基質は、メチル１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｎ−フェニル−Ｌ−フェニルアラニンアミドである。

ここで、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターは４−ニトロアニリンである。

あるいは、好ましくは、式(１)を有する基質は、１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｓ−(ビフェニル−４−イルメトキシ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチルである。

ここで、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターはビフェニル−４−イル−メタノールである。

あるいは、好ましくは、式(１)を有する基質は、１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチルである。

プロテアーゼモジュレーター
ここで使用する用語“プロテアーゼモジュレーター”は：
(i) プロテアーゼの活性を上昇させるか、またはプロテアーゼ(複数もある)の遊離を上昇させる − すなわちこれはプロテアーゼアクティベーターである；または
(ii) プロテアーゼの活性を低下させるかまたはプロテアーゼ(複数もある)の遊離を低下させる − すなわちこれはプロテアーゼ阻害剤である
できる、すべての化合物または組成物、例えば医薬組成物を意味する。

プロテアーゼモジュレーターはアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
好ましくは、プロテアーゼモジュレーターはプロテアーゼアクティベーターである。
プロテアーゼアクティベーターの例はザイモサンである。理論に縛られることを望まないが、ザイモサン(酵母細胞壁ベータ−グルカン)の全血への添加は、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−９のようなプロテアーゼを含む細胞内顆粒の活性化および脱顆粒をもたらす。

理論に縛られることを望まないが、プロテアーゼの活性は、例えば、プロテアーゼアクティベーターのプロテアーゼへの結合により増加でき、これはプロテアーゼがその基質により効率的に結合することを可能にし、故に、対照サンプルと比較したとき、ペプチド開裂の量を増加させる。あるいは、プロテアーゼアクティベーターはプロテアーゼの活性を、例えば、プロ−プロテアーゼのプロテアーゼへの開裂により増加させ得る。あるいは、プロテアーゼアクティベーターは、プロテアーゼ(複数もある)の遊離を増加し得る。

別の態様において、好ましくは、プロテアーゼモジュレーターはプロテアーゼ阻害剤である。
理論に縛られることを望まないが、他の態様において、プロテアーゼの活性を、例えば、プロテアーゼ阻害剤のプロテアーゼへの結合により低下させることができ、これは、プロテアーゼがその基質に悪い効率で結合することを可能にし、故に、対照サンプルと比較したとき、ペプチド開裂の量を低下させる。あるいはプロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼの活性を、プロ−プロテアーゼのプロテアーゼへの開裂を阻害することにより低下させ得る。あるいはプロテアーゼアクティベーターは、プロテアーゼ(複数もある)の遊離を低下させ得る。

好ましくは、プロテアーゼ阻害剤は、ＭＭＰ１プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ２プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ３プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ８プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ９プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ１２プロテアーゼ阻害剤およびＭＭＰ１３プロテアーゼ阻害剤から成る群から選択される。より好ましくは、プロテアーゼ阻害剤は、ＭＭＰ８プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ９プロテアーゼ阻害剤およびＭＭＰ１２プロテアーゼ阻害剤から成る群から選択される。非常に好ましい態様において、プロテアーゼ阻害剤はＭＭＰ９プロテアーゼ阻害剤である。他の非常に好ましい態様において、プロテアーゼ阻害剤はＭＭＰ１３プロテアーゼ阻害剤である。さらに他の非常に好ましい態様において、プロテアーゼ阻害剤はＭＭＰ１２プロテアーゼ阻害剤である。

多くのメタロプロテイナーゼ阻害剤が既知である(例えばBeckett R.P. and Whittaker M., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents, 8(3):259-282によるＭＭＰ阻害剤のレビューを参照)。種々のクラスの化合物が、種々のメタロプロテイナーゼの阻害について、種々の効果および選択性の程度を有し得る。

ここで使用する用語“候補プロテアーゼモジュレーター”は、プロテアーゼの活性を増加させるまたはプロテアーゼの活性を低下させるいずれかの能力について評価する、任意の組成物、例えば医薬組成物を意味する。
好ましくは、候補プロテアーゼモジュレーターは候補プロテアーゼ阻害剤である。

好ましくは、候補プロテアーゼ阻害剤は、ＭＭＰ１候補プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ２候補プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ３候補プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ８候補プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ９候補プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ１２候補プロテアーゼ阻害剤およびＭＭＰ１３候補プロテアーゼ阻害剤から成る群から選択される。より好ましくは、候補プロテアーゼ阻害剤は、ＭＭＰ８候補プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ９候補プロテアーゼ阻害剤、ＭＭＰ１２候補プロテアーゼ阻害剤およびＭＭＰ１３候補プロテアーゼ阻害剤から成る群から選択される。非常に好ましい態様において、候補プロテアーゼ阻害剤はＭＭ９阻害剤である。他の非常に好ましい態様において、候補プロテアーゼ阻害剤はＭＭＰ１３プロテアーゼ阻害剤である。さらに他の非常に好ましい態様において、候補プロテアーゼ阻害剤はＭＭＰ１２プロテアーゼ阻害剤である。

別の態様において、好ましくは、候補プロテアーゼモジュレーターは、候補プロテアーゼアクティベーターである。より好ましくは、候補プロテアーゼアクティベーターは、ＭＭＰ８候補プロテアーゼアクティベーター、ＭＭＰ９候補プロテアーゼアクティベーターおよびＭＭＰ１２候補プロテアーゼアクティベーターから成る群から選択される。

メタロプロテイナーゼは、正常な発達および生理学的組織リモデリングおよび修復に重要な役割を有すると考えられている。加えて、それらは、炎症性細胞の動態および機能の制御に重要な役割を有すると考えられている。メタロプロテイナーゼは、多くの疾患または状態と関連付けられている(例えば、Doherty et al, Expert Opin. Ther. Patents 2002;12(5):594-604参照)。１種以上のメタロプロテイナーゼの活性の阻害は、ある種の疾患または状態に有利であり得る。

メタロプロテイナーゼ阻害剤は、細胞外マトリクスの制御されない分解およびリモデリングに関連する種々の炎症性疾患および疾患の処置に使用できる。このような疾患および障害は：リウマチ性関節炎、骨関節症、痛風、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、胃腸管の炎症(とりわけ炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎および胃炎)、皮膚の炎症(とりわけ乾癬、湿疹、皮膚炎)を含む。さらにメタロプロテイナーゼ阻害剤は：腫瘍増殖および転移；骨再吸収疾患(例えば骨粗鬆症およびページェット病)；異常血管形成と関連する疾患；糖尿病と関連する増加したコラーゲンリモデリング；歯周病(例えば歯肉炎)；角膜潰瘍；皮膚の潰瘍化；術後状態(例えば結腸吻合)；皮膚創傷治癒；中枢および末梢神経系の脱髄疾患(例えば多発性硬化症)；アルツハイマー病；再狭窄、アテローム性動脈硬化症(atheroscelerosis)および大動脈瘤(aortic aneurisms)のような心血管疾患において見られる細胞外マトリクスリモデリング；肝臓線維症；喘息、鼻炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性細気管支炎、気道線維症および慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)のような気道疾患の処置において使用できる。

慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)は、気流閉塞または制限により特徴付けられる一群の呼吸器疾患を言う用語である。用語“ＣＯＰＤ”により包含される状態は、慢性気管支炎、気腫および気管支拡張症を含む。ＣＯＰＤは頻脈(速い心拍)、発作、昏睡、呼吸停止および死をもたらし得る。ＣＯＰＤはまた増悪により特徴付けられ、それは典型的に慢性症状の急激な悪化と共に起こる。古典的に、増悪は、息切れ、喘鳴、および痰産生の増加により顕著である。ＣＯＰＤは、通常喫煙が原因である。

サンプル
好ましくは、サンプルはエキソビボサンプルである。
好ましくは、サンプルは生体液である。
好ましくは、サンプルは哺乳動物生体液である。より好ましくは、サンプルは：尿、全血、血漿、血清、滑液、唾液、痰、気管支肺胞液、脳脊髄液、鼻汁、肺内層液、涙液および皮膚水疱液から成る群から選択される。

別の態様において、サンプルは：組織切片、生検サンプル、細胞培養、および均質化組織から成る群から選択される。より好ましくは、サンプルは細胞培養または均質化組織である。

一つの態様において、好ましくは、サンプルはプロテアーゼモジュレーターで処置した対象から得る。
別の態様において、好ましくは、サンプルを、該サンプルを対象から得た後にプロテアーゼモジュレーターで処理する。

他の態様において、好ましくは、サンプルを候補プロテアーゼモジュレーターで処置した対象から得る。
別の態様において、好ましくは、サンプルを、該サンプルを対象から得た後、候補プロテアーゼモジュレーターで処理する。

ここで使用する用語“プロテアーゼとプロテアーゼモジュレーターを接触させる”は、プロテアーゼモジュレーターで処理するサンプルを意味する。サンプルを、プロテアーゼモジュレーターで処置している対象から得てよい − 例えば、患者は、プロテアーゼ阻害剤である医薬組成物のコースにある。あるいは、サンプルはエキソビボサンプル(例えば生体液、生検サンプルまたは細胞培養)であってよく、それをプロテアーゼモジュレーターとインビトロで混合する − 例えば、サンプルを、プロテアーゼモジュレーターである医薬組成物を受けていない患者から得てよい。

ここで使用する用語“プロテアーゼと候補プロテアーゼモジュレーターを接触させる”は、候補プロテアーゼモジュレーターで処理するサンプルを意味する。サンプルは、エキソビボサンプル(例えば体液、生検サンプルまたは細胞培養)であってよく、それを候補プロテアーゼモジュレーターとインビトロで混合する − 例えば、サンプルを、医薬組成物での処置を受けていない患者から得てよい。あるいは、サンプルを、候補プロテアーゼモジュレーターで処置されている対象から得てよい − 例えば、患者は、候補プロテアーゼ阻害剤である医薬組成物のコースにある。

ここで使用する用語“プロテアーゼモジュレーターの効果を測定する”は、プロテアーゼモジュレーターと接触しているサンプル(複数もある)と、プロテアーゼモジュレーターと接触していないサンプル(複数もある)および／または異なるプロテアーゼモジュレーターと接触しているサンプル(複数もある)の比較を意味する。

プロテアーゼ阻害剤は、未処理サンプルと比較したとき、あるサンプルである時間において、低いプロテアーゼ活性をもたらす。本発明においてサンプル中のプロテアーゼ活性を、サンプルと式(１)を有する基質を混合し、ある時間でのレポーターＨ−Ｘ−Ｒ_１の産生を検出することによりモニターする(効力の試験について、反応を完了まで進行させてはならない)。それ故に、プロテアーゼ阻害剤で処理したサンプルは、未処理サンプルと比較したとき、ある時間で少ないレポーターの存在をもたらす。さらに、異なるプロテアーゼ阻害剤(第二プロテアーゼ阻害剤)で処理したサンプルと比較したときに、ある時間で少ないレポーターの産生をもたらすプロテアーゼ阻害剤(第一プロテアーゼ阻害剤)で処理したサンプルは、第一プロテアーゼ阻害剤が、第二プロテアーゼ阻害剤よりもより有効なプロテアーゼ阻害剤であることを証明し、逆もそうである。

プロテアーゼアクティベーターは、未処理サンプルと比較したとき、あるサンプルで、ある時間において、高いプロテアーゼ活性をもたらす。本発明においてサンプル中のプロテアーゼ活性を、サンプルと式(１)を有する基質を混合し、ある時間でのレポーターＨ−Ｘ−Ｒ_１の産生を検出することによりモニターする(効力の試験について、反応を完了まで進行させてはならない)。それ故に、プロテアーゼアクティベーターで処理したサンプルは、未処理サンプルと比較したとき、ある時間で多いレポーターの存在をもたらす。さらに、異なるプロテアーゼアクティベーター(第二プロテアーゼアクティベーター)で処理したサンプルと比較したときに、ある時間で多いレポーターの産生をもたらすプロテアーゼアクティベーター(第一プロテアーゼアクティベーター)で処理したサンプルは、第一プロテアーゼアクティベーターが、第二プロテアーゼアクティベーターよりもより有効なプロテアーゼアクティベーターであることを証明し、逆もそうである。

ここで使用する用語“候補プロテアーゼモジュレーターの効果を測定する”は、候補プロテアーゼモジュレーターと接触しているサンプル(複数もある)と、候補プロテアーゼモジュレーターと接触していないサンプル(複数もある)および／または既知プロテアーゼモジュレーターと接触しているサンプル(複数もある)の比較を意味する。

本発明においてサンプル中のプロテアーゼ活性を、サンプルと式(１)を有する基質を混合し、ある時間でのレポーターＨ−Ｘ−Ｒ_１の産生を検出することによりモニターする(効力の試験について、反応を完了まで進行させてはならない)。それ故に、所望の候補プロテアーゼ阻害剤で処理したサンプルは、未処理サンプルと比較したとき、ある時間で少ないレポーターの存在をもたらす。さらに、既知プロテアーゼ阻害剤で処理したサンプルと比較したときに、ある時間で少ないレポーターの産生をもたらす候補プロテアーゼ阻害剤で処理したサンプルは、該候補がより有効なプロテアーゼ阻害剤であることを証明し、逆もそうである。しかしながら、所望の候補プロテアーゼアクティベーターで処理したサンプルは、未処理サンプルと比較したとき、ある時間で多いレポーターの存在をもたらす。さらに、既知プロテアーゼアクティベーターで処理したサンプルと比較したときに、ある時間で多いレポーターの産生をもたらす候補プロテアーゼアクティベーターで処理したサンプルは、該候補がより有効なプロテアーゼアクティベーターであることを証明し、逆もそうである。

ここで使用する用語“疾患または障害を診断する”は、対象からのサンプルにおけるプロテアーゼの活性のレベルを測定し、プロテアーゼの活性のレベルを、該疾患または障害を有することが既知の対象(複数もある)からのサンプルおよび該疾患または障害を有しない対象(複数もある)からのサンプルにおけるプロテアーゼの活性のレベルと比較することを意味する。例えば、ＣＯＰＤの対象、喫煙対象および非喫煙対象由来のサンプルにおけるＭＭＰ９活性のレベルを測定し、比較できる。喫煙し、そしてＣＯＰＤの初期段階にある対象を、こうして検出できる。

ここに記載した方法はまた対象における一定期間の疾患進行の測定にも使用できる。
さらにここに記載した方法は、プロテアーゼモジュレーターで処置した対象の応答の測定に使用できる。

他の局面において、ここに記載した方法は、疾患または障害の進行を停止するまたは疾患または障害の進行を逆転させるような有利な効果を達成するために、対象に投与すべきプロテアーゼモジュレーターの量(すなわち投与量)の決定に使用できる。

好ましくは、疾患または障害は：リウマチ性関節炎、骨関節症、痛風、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、胃腸管の炎症(とりわけ炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎および胃炎)、皮膚の炎症(とりわけ乾癬、湿疹、皮膚炎)、腫瘍増殖、腫瘍転移；骨再吸収疾患(例えば骨粗鬆症およびページェット病)；異常血管形成と関連する疾患；糖尿病と関連する増加したコラーゲンリモデリング；歯周病(例えば歯肉炎)；角膜潰瘍；皮膚の潰瘍化；術後状態(例えば結腸吻合)；皮膚創傷治癒；中枢および末梢神経系の脱髄疾患(例えば多発性硬化症)；アルツハイマー病；アテローム性動脈硬化症および大動脈瘤のような心血管疾患において見られる細胞外マトリクスリモデリング；肝臓線維症；喘息、鼻炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性細気管支炎、気道線維症および慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)のような気道疾患から成る群から選択される。

好ましくは、疾患または障害は：リウマチ性関節炎、骨関節症；多発性硬化症；喘息、鼻炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性細気管支炎、気道線維症および慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)のような気道疾患から成る群から選択される。

より好ましくは、疾患または障害は骨関節症、喘息または慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)である。

一つの非常に好ましい態様において、疾患または障害は骨関節症である。
他の非常に好ましい態様において、疾患または障害は慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)である。

実施例
本発明を、例示の方法で、以下の構造式および図を参照してさらに記載する：
４−ニトロアニリンの構造式

１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α(４−ニトロフェニルアミノ)−Ｌ−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチルの構造、レポーターを産生するために基質が開裂される結合を強調。

[ ^１３Ｃ]６−４−ニトロアニリンの構造

図１. 種々の濃度のザイモサンで全血を刺激した後に健常ボランティアから得た４−ニトロアニリンの平均濃度プロファイル。
図２. 種々の濃度のザイモサンで全血を刺激した後に喫煙者から得た４−ニトロアニリンの平均濃度プロファイル。
図３. 種々の濃度のザイモサンで全血を刺激した後にＣＯＰＤ患者から得た４−ニトロアニリン平均濃度プロファイル。

本実施例で使用する略語は以下を含む：

実施例１基質の製造
材料および方法
本実施例において、^１Ｈ−ＮＭＲおよび^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルをVarian ^UnityInova 400MHzまたはVarian Mercury-VX 300MHz装置のいずれかで記録した。ジメチルスルホキシド−ｄ_６(δ_Ｈ２.５０ppm、δ_Ｃ３９.５ppm)、アセトニトリル−ｄ_３(δ_Ｈ１.９５ppm、δ_Ｃ１１８.２、１.３ppm)、メタノール−ｄ_４(δ_Ｈ３.３１ppm、δ_Ｃ４９.０ppm)またはピリジン−ｄ_５(δ_Ｈ８.７１、７.５５、７.１９ppm、δ_Ｃ１４９.９、１３５.５、１２３.５ppm)の中央溶媒ピークを内部参照として使用した。低解像度マススペクトルを、ＡＰＣＩイオン化チャンバーまたはＥＳイオン化チャンバーを備えたAgilent 1100 LC-MSシステムで得た。

薄層クロマトグラフィーを、ガラスプレート上に吸着させたシリカゲル６０Ｆ_２５４を有するMerckから得たＴＬＣプレートを使用して行った。ゼーバッハ溶液を使用してＴＬＣスポットを可視化し、２５ｇホスホモリブデン酸、１０ｇＣｅ(ＳＯ_４)_２.Ｈ_２Ｏ、６０mL 濃Ｈ_２ＳＯ_４および９４０mL Ｈ_２Ｏから調製した。
粒子径０.０４０−０.０６３mmのシリカゲル６０をMerckから得た。

ＨＰＬＣは、Gilson分析または半分取系を使用して行った。本実施例で使用した条件は以下の通りである。
・ＨＰＬＣ系Ａ：Kromasil KR-100-7-C18、２５０ｘ２０mmカラム、６２％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏのアイソクラチック溶媒系、６mL／分の溶媒流速。および検出用ＵＶ＝２２０nm。
・ＨＰＬＣ系Ｂ：Kromasil 100-C18-5μm １５０ｘ４.６mmカラム。溶媒Ａ：Ｈ_２Ｏ／ＭｅＯＨ(＝８０／２０)Ｂ：ＭｅＯＨ。２０％Ｂから９０％Ｂへの２０分勾配を使用、流速０.６ mL／分および検出用ＵＶ＝２２０nm。
・ＨＰＬＣ系Ｃ：Kromasil 100-C18-5μm １５０ｘ４.６mmカラム。溶媒Ａ：Ｈ_２Ｏ＋０.１％ＴＦＡＢ：ＭｅＣＮ＋０.１％ＴＦＡ。１０％Ｂから９０％Ｂの１５分勾配を使用、流速１mL／分および検出用ＵＶ＝２２０nm。
・ＨＰＬＣ系Ｄ：Kromasil 100-5C-18、２５０ｘ２０mm、流速：６.０ml／分、溶離剤：７５％ＭｅＯＨ、２５％Ｈ_２Ｏ、ＵＶ＝２２０nm。
・ＨＰＬＣ系Ｅ：Kromasil KR-100-5-C18、２５０ｘ２０mmカラム、８２％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏのアイソクラチック溶媒系、６mL／分の溶媒流速。および検出用ＵＶ＝２２０nm。
・ＨＰＬＣ系Ｆ：Kromasil 100-C18-5μm １５０ｘ４.６mmカラム、８０％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏのアイソクラチック溶媒系、１mL／分の溶媒流速。および検出用ＵＶ＝２２０nm。
・ＨＰＬＣ系Ｇ：Kromasil KR-100-5-C18、２５０ｘ２０mmカラム、８５％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏのアイソクラチック溶媒系、６mL／分の溶媒流速。および検出用ＵＶ＝２２０nm。
・ＨＰＬＣ系Ｈ：Kromasil 100-C18-5μm １５０ｘ４.６mmカラム、８５％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏのアイソクラチック溶媒系、１mL／分の溶媒流速。および検出用ＵＶ＝２２０nm。
・ＨＰＬＣ系Ｉ：Kromasil 100-C18-5μm １５０ｘ４.６mmカラム、３０分勾配、５％ＭｅＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋０.１％ＴＦＡから１００％ＭｅＣＮ＋０.１％ＴＦＡ、１mL／分の溶媒流速。および検出用ＵＶ＝２２０nm。
・ＨＰＬＣ系Ｊ：Kromasil 100-C18-10μm ２５０ｘ５０mmカラム、アイソクラチック５２％ＭｅＣＮ／Ｈ_２Ｏ、５０mL／分の溶媒流速。および検出用ＵＶ＝２５４nm。
・ＨＰＬＣ系Ｋ：Kromasil 100-C18-5μm １５０ｘ４.６mmカラム、２０分勾配、５％ＭｅＣＮ／Ｈ_２Ｏから６０％ＭｅＣＮ、次いでアイソクラチック６０％ＭｅＣＮ、１mL／分の溶媒流速。および検出用ＵＶ＝２５４nm。

全溶媒および市販試薬は研究室グレードであり、受け取ったまま使用した。市販されていない試薬は、当分野で既知の方法を使用して合成した。

実施例１.１基質の製造：１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチル。

ａ)９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル(２−アミノ−２−オキソエチル)カルバメート。(＝Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＮＨ_２)
グリシンアミドヒドロクロライド(１１.０５ｇ；１００mmol)およびＮａＨＣＯ_３(１６.８ｇ；２００mmol)を水(１５０mL)に溶解し、ＣＯ_２(ｇ)が形成されなくなったとき、透明溶液が得られた。アセトン(１００mL)を添加し、溶液を氷／水浴で冷却した。Ｆｍｏｃ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(３２ｇ；９５mmol)をアセトン(４００mL)に溶解し、反応混合物にゆっくり添加し、スラリーを形成した。添加完了後、冷浴を除き、スラリーを室温で３日間撹拌した。溶媒を蒸発により除去し、残った無色固体を水(１Ｌ)に懸濁させた。スラリーを１時間撹拌し、固体生成物を濾過により回収し、水(２ｘ５００mL)で洗浄した。減圧下、＋３０℃で定量になるまで乾燥させた。
２８.１ｇ(１００％収率)の副題化合物を無色固体として得た。
ＨＰＬＣ系Ｃ：Ｒ_ｔ＝１０.０９分、純度９７％。
APCI-MS m/z:297.2 [MH⁺]
¹H-NMR(CD₃OD):δ 7.80(2H,d), 7.67(2H,d), 7.39(2H, t), 7.31(2H, t), 4.39(2H,d), 4.23(1H, t), 3.76(2H, s)ppm。

ｂ)Ｎ−[(９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]グリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシン。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＮＨ_２(１４ｇ；４７mmol)およびグリオキシル酸一水和物(８.７ｇ；９４mmol)をアセトン(４００mL)およびＨ_２Ｏ(５mL)に懸濁した。スラリーを加熱還流して、わずかに不透明な溶液を形成させた。４８時間後、さらにグリオキシル酸一水和物(８.７ｇ；９４mmol)を添加し、還流をさらに２４時間続けた。アセトンの蒸発により油状物を得て、それをＨ_２Ｏ(２００mL)で処理し、得られるスラリーをＥｔＯＡｃ(３ｘ２００mL)で抽出した。有機相を次いで５％ＮａＨＣＯ_３(水性)(４００mL＋２００mL＋１００mL)で抽出した。有機相を廃棄した。所望の中間体Ｎ−[(９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]グリシル−α−Ｒ,Ｓ−(ヒドロキシ)−グリシンを含む塩基性水相を、濃ＨＣｌを使用して注意深くｐＨ１−１.５に酸性化し、スラリーを形成した。酸性水相をＥｔＯＡｃ(４ｘ２００mL)で抽出し、有機相を塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、泡沫油状物を得た。この油状物をＤＣＭ(２００mL)で処理し、得られる固体物質を濾過により回収した。固体物質をＭｅＯＨおよびＴＨＦに再溶解し、蒸発させて、Ｎ−[(９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]グリシル−α−Ｒ,Ｓ−(ヒドロキシ)−グリシンの粗生成物を得た。この粗生成物をさらに精製せず、それを直接得られたまま次工程に使用した。１４.４ｇの粗中間体を無色固体として得た。純度を、ＨＰＬＣ系Ｃを使用して測定した：Ｒ_ｔ＝９.５６分、純度６８％。

粗Ｎ−[(９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]グリシル−α−Ｒ,Ｓ−(ヒドロキシ)−グリシン(１４.４ｇ)をＡｃＯＨ(２５０mL)および濃Ｈ_２ＳＯ_４(２.５mL)に溶解した。エタンチオール(１５mL；０.２mol)を撹拌している溶液に室温で添加した。２１時間後、反応混合物を１Ｌの破砕氷にゆっくり注ぎ、固体が形成され、氷が溶けたとき、スラリーを得た。固体生成物を濾過により回収し、水(２５０mL)で洗浄した。固体物質を次いでＥｔ_２Ｏ、続いてヘプタンおよび最後に再びＥｔ_２Ｏで洗浄し、その後それを減圧下定量になるまで乾燥させた。
１０.２ｇ(５２％)の副題化合物を無色固体として得た。
ＨＰＬＣ系Ｃ：Ｒ_ｔ＝１１.４６分、純度９２.５％。
ＡＰＣＩ−ＭＳｍ／ｚ：４１５.２ [ＭＨ^＋]
¹H-NMR(DMSO-D6):δ 13.23(1H, brs), 8.63(1H, d), 7.89(2H, d), 7.71(2H, d), 7.55(1H, t), 7.42(2H, t), 7.33(2H, t), 5.36(1H, d), 4.28(2H, d), 4.23(1H, t), 3.70(2H, d), 2.62(2H, m), 1.78(3H, t)ppm。
¹³C-NMR(DMSO-D6):δ 169.60, 168.59, 156.26, 143.65, 140.53, 127.47, 126.92, 125.08, 119.96, 65.66, 52.76, 46.58, 43.07, 23.93, 14.49ppm。

ｃ)１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチル。
副題化合物を、一部、Pioneer^TMペプチド合成系を使用して、Tenta Gel S PHB Leu Fmocを出発点として固相上で合成した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸で使用するために開発された標準ペプチドカップリングプロトコールは以下である。
Ｎ−[(９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]グリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシンを１,３−ジイソプロピルカルボジイミドで活性化させた。市販されているＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＰｆｐおよびＦｍｏｃ−Ｌ−プロ−ＯＰｆｐを使用した。Ｎ−アシル化を、２５％酢酸無水物および５％ピリジン含有ＤＭＦ溶液を使用して行った。１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｌ−ロイシンを９５％ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏを使用して樹脂から溶離し、凍結乾燥した。β−アラニンメチルエステルとの最終カップリングを、ＨＡＴＵおよびＤＩＥＡとＤＭＦ中で行った。最終ペプチドの精製を、Kromasil KR-100-7-C18、２５０ｘ５０.８mmカラムのGilson分取ＨＰＬＣ系で行った。最終ペプチドを凍結乾燥し、ＥＳイオン化チャンバーを備えたAgilent 1100 LC-MS系で分析した。Waters Symmetryカラム、Ｃ１８５μm ２.１ｘ３０mm、ＵＶ＝２２０nm、１０−９０％ＭｅＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋０.１％ＴＦＡの１０分勾配および流速＝０.６mL／分を使用した。ジアステレオマー混合物をさらに精製せずに使用した。
Ｒ_ｔ＝４.５４分。ＥＳ−ＭＳｍ／ｚ：６４３.３ [ＭＨ^＋]
Ｒ_ｔ＝４.６７分。ＥＳ−ＭＳｍ／ｚ：６４３.３ [ＭＨ^＋]

ｄ)１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ,Ｓ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチル。
１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチル(５００mg；０.７８mmol)および４−ニトロアニリン(２１５mg；１.５６mmol)をＤＣＭ(２０mL)およびＴＨＦ(１５mL)に溶解し、黄色不透明溶液を得た。Åモレキュラー・シーブを添加し、混合物を室温でアルゴンの保護雰囲気下６０分間撹拌した。Ｎ−ヨードスクシンイミド(１９７mg；０.８８mmol)およびＴｆＯＨ(２μl；２２μmｏｌ)を添加した。反応を室温で２.５時間撹拌した。
反応を１０％Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３(水性)(１５mL)を使用してクエンチし、ＤＣＭ(３０mL)を使用して分液漏斗に移した。塩水を添加し、下部黄色有機相を分離した。水相を無色になるまでＤＣＭで抽出した。合わせた黄色有機溶液をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。

残った物質を小量のＤＣＭに溶解し、短Ｓｉ−６０ゲルカラム上に添加し、不純物 − 未反応４−ニトロアニリンを含む − をＥｔＯＡｃを使用して流し、次いで生成物をＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ＝５／３およびＭｅＯＨを使用して流した。溶媒の蒸発により黄色固体を得た。この物質を再び短Ｓｉ−６０ゲルカラムを通して濾過した(上記の通り)。
３３９mgの粗生成物を２個のジアステレオマーの混合物として得た。
ＴＬＣ(Ｓｉ−６０、ＤＣＭ／ＩＰＡ＝９／１) Ｒ_Ｆ＝０.４８およびＲ_Ｆ＝０.３２の２個の長い黄色スポット。
この生成物は酸性条件に不安定である。

ｅ)１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチル。
１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ,Ｓ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチル(３３９mg)の粗ジアステレオマー混合物をＨＰＬＣ系Ａを使用して分離し、さらに精製した。
“速い”ジアステレオマーを３９−４５分のフラクション中に回収し、“遅い”ジアステレオマーを５４−６２分のフラクション中に回収した。
ＭｅＯＨの蒸発および水残渣の凍結乾燥により、表題化合物およびそのジアステレオマーを黄色粉末として得た。
生成物は酸性条件に不安定である。
“速く”溶出するジアステレオマーは、それがＭＭＰにより急速に開裂して４−ニトロアニリンを遊離し、一方、“遅い”ジアステレオマーはしなかったため、“Ｌ様”Ｒ−立体化学を有すると仮定した。

１２７mg(２２％)の“速い”Ｌ様ジアステレオマー、表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ系Ｂ：Ｒ_ｔ＝１６.０７分。＞９９％純度。
TLC(Si-60, DCM/IPA=9/1):R_F=0.31
¹H-NMR(CD₃CN):δ 8.06(2H, d), 7.68(1H, d), 7.65(1H, t), 7.36(1H, d), 7.13(1H, d), 6.92(1H, brt), 6.79(2H, d), 6.41(1H, d), 5.69(1H, t), 4.25(1H, q), 4.11(1H, dt), 4.02(1H, dd), 3.89(1H, dd), 3.67(1H, dd), 3.62(1H, m), 3.61(3H, s), 3.49(1H, m), 3.37(2H, m), 2.47(2H, t), 2.11(1H, m), 2.03(3H, s), 1.96-1.83(3H, m), 1.68-1.50(6H, m), 0.93-0.84(12H, m)ppm.
¹³C-NMR(CD₃CN):δ 174.63, 173.86, 172.84, 172.45, 172.34, 171.36, 168.29, 152.11, 139.70, 126.62, 113.44, 62.07, 61.27, 53.99, 53.39, 52.10, 49.23, 43.69, 41.50, 39.71, 35.93, 34.48, 30.20, 25.65, 25.56, 25.32, 23.41, 23.20, 22.96, 21.84, 21.39ppm

９５mg(１７％)の“遅い”Ｄ様ジアステレオマーを得た。
ＨＰＬＣ系Ｂ：Ｒ_ｔ＝１６.９８分。＞９９％純度。
ＴＬＣ(Ｓｉ−６０、ＤＣＭ：ＩＰＡ＝９：１)：Ｒ_Ｆ＝０.４６
¹H-NMR(CD₃CN):δ 8.06(2H, d), 7.78(1H, d), 7.69(1H, brt), 7.63(1H, d), 7.22(1H, d), 7.02(1H, brt), 6.81(2H, d), 6.47(1H, d), 5.80(1H, t), 4.28-4.17(3H, m), 3.75(2H, d), 3.65(3H, s), 3.63(1H, m), 3.52(1H, m), 3.46(1H, m), 3.34(1H, m), 2.52(2H, dt), 2.20(1H, m), 1.97(2H, m), 1.94(1H, m), 1.89(3H, s), 1.82-1.50(6H, m), 0.98-0.82(12H, m)ppm
¹³C-NMR(CD₃CN):δ 175.00, 174.90, 173.06, 172.91, 172.68, 171.24, 168.71, 152.56, 139.63, 126.84, 113.21, 62.18, 60.72, 53.81, 52.85, 52.25, 49.36, 44.73, 41.19, 38.94, 36.18, 34.48, 30.54, 25.72, 25.66, 25.60, 23.46, 23.38, 22.81, 21.63, 21.58ppm。

実施例１.２基質の製造：１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチル。

ａ)Ｎ−[(９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]グリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチル。
Ｎ−[(９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]グリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシン(２.０９ｇ；５.０４mmol)をＤＭＦ(７５ml)に溶解し、ＨＢＴＵ(２.８７ｇ；７.５７mmol)およびＤＩＥＡ(０.９ml；５.２６mmol)を添加した。この溶液に、Ｌ−ロイシル−グリシンメチルエステルヒドロクロライド(１.３７ｇ；５.７４mmol)およびさらにＤＩＥＡ(１.９ml；１１.１mmol)を添加した。わずかに黄色の混合物を室温で５時間撹拌し、赤色反応混合物を蒸発させてＤＭＦを除去し、得られる赤色油状物をＥｔＯＡｃに溶解し、５％ＫＨＳＯ_４、塩水、５％ＮａＨＣＯ_３および塩水で洗浄し、その後Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。
濾過および蒸発後、オレンジ色油状粗生成物を、溶離剤としてＥｔＯＡｃ：ヘプタン(５：２)と共にＳｉ−６０ゲルフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製した。副題化合物をわずかに黄色の油状物として回収し、それはエーテルに溶解し、蒸発させたときに、泡状物となり、それはわずかに黄色の粉末に固化し、２個の可能なジアステレオマーの１：１混合物として２.３１ｇ(７７％)を得た。
ＴＬＣＳｉ−６０、ＥｔＯＡｃ：ヘプタン(５：１)Ｒ_ｆ＝０.３７＋０.３９
¹H-NMR(CDCl₃):δ 8.59+8.46(tot 1H, d+d), 7.90+7.83(tot 1H, brt+brt), 7.75-7.70(3H, brd), 7.59+7.56(tot 2H, d+d), 7.37(2H, t), 7,28(2H, m), 6.61+6.33(tot 1H, brt+brt), 5.99+5.91(tot 1H, d+d), 4.90-4.75(1H, m), 4.46-3.76(7H, m), 3.54+3.50(tot 3H, s+s), 2.83-2.59(2H, m), 1.80-1.60(3H, m), 1.30-1.16(3H, m), 0.98-0.88(6H, m)ppm。
¹³C-NMR(CDCl₃):δ 172.49+172.16, 169.88+169.86, 168.78+168.70, 168.20+168.09, 156.78+156.70, 143.95+143.84+143.70+143.62, 141.18+141.17+141.13, 127.67, 127.03, 125.16+125.12+125.08, 119.90, 67.33, 54.46+54.25, 52.06, 51.90+51.60, 46.98, 44.33+44.25, 42.25+42.13, 41.05+40.95, 24.70+24.57, 24.29+23.77, 23.02+22.63+22.46+21.99, 14.35+14.27ppm。

ｂ)グリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチルヒドロクロライド。
Ｎ−[(９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ)カルボニル]グリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチル(２.８０ｇ；４.６８mmol)をＤＭＦ(１００ml)に溶解し、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(６０ml)を添加した。反応をＴＬＣＳｉ−６０、ＥｔＯＡｃ：ヘプタン(４：１)で追跡し、２０分後、反応が完了した。反応混合物を蒸発させ、残渣を最小量のＤＣＭに溶解し、さらにＤＣＭを使用してＳｉ−６０ゲルを通し、速く移動する不純物を洗い流し、次いで、遊離塩基としての生成物を溶媒としてＭｅＯＨを使用してシリカゲルから抽出した。次いで生成物をＨＣｌ／エーテルで処理し、副題化合物を定量的収量で得た。
わずかに黄色の生成物は吸湿性であり、空気に触れると粘性になる。
¹H-NMR(ピリジン-d₅):δ 10.47+10.20(tot 1H, d+d), 10.12+9.92(tot 1H, d+d), 9.91+9.75(tot 1H, t+t), 9.55-9.00(3H, brs), 6.46+6.42(tot 1H, d+d), 5.27-5.16(1H, m), 4.76+4.73+4.61(tot 2H, s+d+d), 4.36-4.14(tot 2H, m), 3.48(3H, s), 2.95-2.74(2H, m), 2.12-1.92(3H, m), 1.14+1.09(tot 3H, t+t), 0.94+0.85+0.83(tot 6H,d+d+d)ppm。
¹³C-NMR(ピリジン-d₅):δ 173.60+173.44, 171.03+170.91, 168.79+168.69, 167.50+167.25, 55.63+55.39, 52.97+52.82, 51.77+51.74, 42.13+41.87, 41.99+41.49, 41.81+41.38, 25.12+25.08, 24.79+24.49, 23.33+23.13, 22.01+21.72, 14.76+14.64ppm。

ｃ)１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチル。
グリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチルヒドロクロライド(１０６mg；０.２６mmol)、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシン(７４mg；０.２７mmol)およびＨＢＴＵ(１５９mg；０.４２mmol)をＤＭＦ(５ml)に溶解した。撹拌しているわずかに黄色の溶液に、ＤＩＥＡ(０.１４ml；０.８２mmol)を添加し、反応を室温で２１時間進行させた。暗赤色溶液を蒸発させて溶媒を除去し、赤色油状残渣をＤＣＭ(５０ml)に溶解し、５％ＫＨＳＯ_４(３ｘ４０ml)、塩水(５０ml)、５％ＮａＨＣＯ_３(３ｘ４０ml)および塩水(５０ml)で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過および蒸発させて赤色固体粗生成物(１０３mg)を得た。これを、Ｓｉ−６０ゲルフラッシュクロマトグラフィーで、速く移動する不純物が回収されるまで溶離剤としてＤＣＭ：ＩＰＡ(１０：１)を使用し、次いで、溶離剤をＤＣＭ：ＩＰＡ(１０：２)に変えて精製した。生成物含有フラクションを回収し、蒸発させて、副題化合物(７７mg、４７％)をわずかに黄色の粉末として得た。
分析ＨＰＬＣ系：カラムKromasil 100-5C18、１５０ｘ４.６mm、流速１.０ml／分、１００％Ｈ_２Ｏ：ＭｅＯＨ８０：２０(０−０.５分)、１００％ＭｅＯＨ(０.５−６分)、１００％ＭｅＯＨ(６−７分)に勾配、ＵＶ＝２２０nm。
ジアステレオマーはＲｔ＝６.４０および６.６２分を有する。
¹H-NMR(ピリジン-D5):δ 9.98-9.10(5H, m), 6.36+6.22(tot 1H, d+d), 5.15-5.04(1H, m), 5.04-4.90(1H, m), 4.75-4.58(1H, m), 4.50-4.00(4H, m)3.55+3.54(tot 3H, s+s), 3.51-3.39+3.29-3.16(1H+1H, m+m), 2.91-2.70(2H, m), 2.35-1.52(10H, m), 1.91(3H, s), 1.20-1.02(3H, m), 0.92-0.62(12H, m)ppm。
¹³C-NMR(ピリジン-D5):δ 173.88, 173.85, 173.34, 173.49, 173.29, 173.24, 170.96, 170.84, 170.46, 170.33, 169.74, 169.44, 168.93, 168.79, 60.92, 60.85, 55.47, 55.22, 52.59, 52.51, 52.42, 52.40, 51.80, 51.79, 48.42, 48.38, 43.54, 43.50, 41.76, 41.75, 41.48, 41.48, 40.84, 40.77, 29.88, 29.82, 25.21, 25.21, 25.09, 25.05, 24.95, 24.94, 24.71, 24.38, 23.23, 23.19, 23.16, 22.99, 22.53, 22.50, 21.91, 21.63, 21.60, 21.57, 14.78, 14.78ppm。

ｄ)１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチル。
１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチル(０.１０ｇ；０.１６mmol)のジアステレオマー混合物をＤＣＭ(９ml)およびＤＭＦ(１ml)に溶解して、わずかに黄色の溶液を得た。ｐ−ニトロアニリン(０.０３ｇ；０.２４mmol)および粉砕３Ａモレキュラー・シーブを添加した。黄色溶液を室温で２時間窒素下撹拌した。乾燥ＴＨＦ(１ml)に溶解したＮ−ヨードスクシンイミド(０.０５ｇ；０.２１mmol)を添加し、直接、続いてトリフルオロメタンスルホン酸(２μl；２２μmol)を添加した。反応をＴＬＣ、Ｓｉ−６０、ＤＣＭ：ＩＰＡ(１０：１)で追跡した。３時間後、赤色反応混合物を濾過してモレキュラー・シーブを除去し、フィルターケーキをＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄し、その後溶媒を蒸発させ、残渣をＤＣＭに溶解し、１０％Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３(２０ml)で洗浄し、黄色相を分離し、黄色水相を１回ＤＣＭ(１０ml)で逆抽出した。合わせた有機相を塩水で洗浄し、乾燥させ(ＭｇＳＯ_４)、濾過し、溶媒を蒸発させて、黄色粗生成物を得た。精製およびジアステレオマーの分離を以下の方法に従い行った。粗生成物を最初に溶離剤としてＤＣＭ：ＩＰＡ(１０：１)を使用するＳｉ−６０ゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し、２個のジアステレオマーを分離した。生成物含有フラクションを、次いで逆相ＨＰＬＣ系Ｄを使用してさらに精製し、ジアステレオマーを１２.５８分および１５.１７分で回収した。
ＭｅＯＨの蒸発および水残渣の凍結乾燥により、表題化合物およびそのジアステレオマーを黄色粉末として得た。
生成物は酸性条件に不安定である
“速く”溶出するジアステレオマーは、それがＭＭＰにより急速に開裂して４−ニトロアニリンを遊離し、一方、“遅い”ジアステレオマーはしなかったため、“Ｌ様”Ｒ−立体化学を有すると仮定した。

１０mg(９％)の“速い”Ｌ様ジアステレオマー、表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ系Ｄ：Ｒｔ＝１２.５８分。
ＴＬＣ(Ｓｉ−６０、ＤＣＭ：ＩＰＡ＝１０：１)：Ｒ_Ｆ＝０.２７
¹H-NMR(ピリジン-D5):δ 9.89(1H, d), 9.57(1H, t), 9.48(1H, d), 9.24(1H, d), 9.23(1H, t), 8.19(1H, d), 8.10(2H, d), 6.97(2H, d), 6.44(1H, t), 5.16-5.06(1H, m), 4.95-4.88(1H, m), 4.65-4.59(1H, m), 4.43-4.10(4H, m), 3.55(3H, s), 3.50-3.43+3.26-3.18(1H+1H, m+m), 2.30-1.55(10H, m), 1.90(3H, s), 0.85-0.72(12H, m)ppm。
¹³C-NMR(ピリジン-D5):δ 173.82, 173.58, 173.33, 171.02, 170.93, 170.66, 168.76, 152.54, 138.89, 126.31, 112.91, 61.14, 61.02, 52.78, 52.74, 51.81, 48.45, 43.45, 41.47, 41.42, 40.29, 29.94, 25.23, 25.09, 24.96, 23.16, 23.14, 22.52, 21.77, 21.49ppm。

１８mg(１６％)の“遅い”Ｄ様ジアステレオマーを得た。
ＨＰＬＣ系Ｄ：Ｒｔ＝１５.１７分。
ＴＬＣ(Ｓｉ−６０、ＤＣＭ：ＩＰＡ＝１０：１)：Ｒ_Ｆ＝０.４８
¹H-NMR(ピリジン-D5):δ 9.50(1H, d), 9.34(1H, t), 9.22(1H, d), 9.18(1H, t), 9.05(1H, d), 8.18(1H, d), 8.11(2H, d), 7.04(2H, d), 6.63(1H, t), 5.09-5.00(1H, m), 4.89-4.80(1H, m), 4.68-4.61(1H, m), 4.41-4.32+4.25-4.13(2H+2H, m+m), 3.58(3H, s), 3.54-3.46+3.29-3.20(1H+1H, m+m), 2.22-1.66(10H, m), 1.91(3H, s), 0.88-0.74(12H, m)ppm。
¹³C-NMR(ピリジン-D5):δ 174.36, 173.61, 173.48, 170.99(2C), 170.86, 168.99, 152.71, 138.95, 126.38, 112.93, 61.04, 60.82, 52.99, 52.33, 51.84, 48.47, 43.95, 41.59, 41.26, 39.82, 29.85, 25.19, 25.10, 25.00, 23.12(2C), 22.42, 21.68, 21.56ppm。

実施例１.３基質の製造：１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｓ−(ビフェニル−４−イルメトキシ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチル
１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチル(３０mg；０.０４８mmol)のジアステレオマー混合物をＤＣＭ(２mL)およびＤＭＦ(０.３mL)に溶解した。ビフェニル−４−イルメタノール(１４.５mg；０.０７９mmol)および破砕３Ａモレキュラー・シーブを添加した。スラリーを室温で４０分間窒素下で撹拌した。乾燥ＴＨＦ(０.２mL)に溶解したＮ−ヨードスクシンイミド(１２mg；０.０５３mmol)を添加し、続いてトリフルオロメタンスルホン酸(０.００１mL；０.０１１mmol)を添加した。褐色赤色スラリーを室温で３.５時間撹拌した。
反応を１０％Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３(２mL)の添加によりクエンチし、無色混合物を濾過し、ＤＣＭ(２mL)の添加により希釈し、有機相を分離した。水相をＤＣＭ(２ｘ２mL)で抽出し、合わせた有機相を３Å モレキュラー・シーブで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗生成物を得た。精製をＨＰＬＣ系Ｅを使用して行った。
生成物は酸性条件に不安定である
“遅く”溶出するジアステレオマーは、それがＭＭＰにより急速に開裂してビフェニル−４−イルメタノールを遊離し、一方、“速い”ジアステレオマーはしなかったため、“Ｌ様”Ｒ−立体化学を有すると仮定した。

６.５mgの“遅い”Ｌ様ジアステレオマー、表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ系Ｆ：Ｒｔ＝４.６４分。
¹H-NMR(ピリジン-D5):δ 9.82(1H. d), 9.46(1H, t), 9.35(1H, d), 9.33(1H, t), 9.09(1H, d), 7.65-7.47(6H, m), 7.43(2H, t), 7.33(1H, t), 6.31(1H, d), 5.12(1H, m), 4.95(1H, m), 5.00+4.85(1H+1H, d+d), 4.69(1H, dd), 4.45(2H, ddd), 4.31+4.12(1H+1H, dd+dd), 3.53(3H, s), 3.49+3.22(1H+1H, m+m), 2.33-1.54(10H, m), 1.95(3H, s), 0.88-0.70(12H, m)ppm。

１０mgの“速い”Ｄ様ジアステレオマーを得た。
ＨＰＬＣ系Ｆ：Ｒｔ＝４.３０分。
¹H-NMR(ピリジン-D5):δ 9.88(1H, d), 9.66(1H, t), 9.25(1H, d), 9.15(1H, t), 9.12(1H, d), 7.65-7.50(6H, m), 7.43(2H, t), 7.33(1H, t), 6.30(1H, d), 5.13(1H, m), 5.01(1H, m), 4.99+4.84(1H+1H, d+d), 4.71(1H, dd), 4.47+4.32(1H+1H, dd+dd), 4.37+4.18(1H+1H, dd+dd), 3.54(3H, s), 3.46+3.21(1H+1H, m+m), 2.30-1.60(10H, m), 1.92(3H, s), 0.88-0.70(12H, m)ppm。

実施例１.４基質の製造：１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−[４−(５−ｐ−トリル−[１,３,４]オキサジアゾール−２−イル)−フェニルアミノ]−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチル

実施例１.３に記載の方法に従い、粗生成物を得て、それを以下の通りさらに精製した。粗ジアステレオマー混合物をＤＣＭに溶解し、Ｓｉ−６０カラムに添加し、次いでＥｔＯＡｃを使用して、未反応４−(５−ｐ−トリル−[１,３,４]オキサジアゾール−２−イル)−フェニルアミンを含む速く移動する不純物を洗い流した。次いで生成物をＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝５：１で溶出し、ＴＬＣ(Ｓｉ−６０)Ｒｆ＝０.２７。
ＴＬＣ(Ｓｉ−６０、ＤＣＭ：ＩＰＡ＝８：１)Ｒｆ＝０.３＋０.５
ジアステレオマーの分離をＨＰＬＣ系Ｇを使用して行った。
速く溶出するジアステレオマーを１２.７５分に回収した。
遅く溶出するジアステレオマーを１５.２２分に回収した。
ＭｅＯＨの蒸発および水残渣の凍結乾燥により、表題化合物およびそのジアステレオマーを無色粉末として得た。
生成物は酸性条件に不安定である
“速く”溶出するジアステレオマーは、それがＭＭＰにより急速に開裂して４−(５−ｐ−トリル−[１,３,４]オキサジアゾール−２−イル)−フェニルアミンを遊離し、一方、“遅い”ジアステレオマーはしなかったため、“Ｌ様”Ｒ−立体化学を有すると仮定した。

１４.４mg(３６％)の“速い”Ｌ様ジアステレオマー、表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ系Ｈ：Ｒｔ＝２.６４分。
ＴＬＣ(Ｓｉ−６０、ＤＣＭ：ＩＰＡ＝８：１)：Ｒ_Ｆ＝０.３
¹H-NMR(ピリジン-D5):δ 9.85(1H, d), 9.55(1H, t), 9.40(1H, d), 9.24(1H, t), 9.23(1H, d), 8.10(2H, d), 8.02(2H, d), 7.48(1H, d), 7.28(2H, d), 7.12(2H, d), 6.47(1H, t), 5.13(1H, m), 4.94(1H, m), 4.63(1H, dd), 4.39(2H, d), 4.35+4.18(1H+1H, dd+dd), 3.56(3H, s), 3.46+3.22(1H+1H, m+m), 2.24(3H, s), 1.92(3H, s), 2.20-1.65(10H, m), 0.88-0.70(12H, m)ppm。

３.１mg(８％)の“遅い”Ｄ様ジアステレオマーを得た。
ＨＰＬＣ系Ｈ：Ｒｔ＝３.２１分。
TLC(Si-60, DCM:IPA=8:1):R_F=0.5
¹H-NMR(ピリジン-D5):δ 9.46(1H, d), 9.27(1H, t), 9.25(1H, d), 9.20(1H, t), 9.05(1H, d), 8.11(2H, d), 8.04(2H, d), 7.51(1H, d), 7.28(2H, d), 7.21(2H, d), 6.65(1H, t), 5.09(1H, m), 4.85(1H, m), 4.67(1H, dd), 4.39+4.24(1H+1H, dd+dd), 4.38+4.19(1H+1H, dd+dd), 3.59(3H, s), 3.50+3.25(1H+1H, m+m), 2.24(3H, s), 1.93(3H, s), 2.22-1.67(10H, m), 0.87-0.76(12H, m)ppm。

実施例１.５基質の製造：１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｎ−フェニル−Ｌ−フェニルアラニンアミド

ａ)１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｎ−フェニル−Ｌ−フェニルアラニンアミド。
実施例１.２ａ−ｃに略記の方法に従うが、工程１.２ａにおけるＮ末端アミノ酸をＮ−フェニル−Ｌ−フェニルアラニンアミドに変えて、１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ,Ｓ−(エチルチオ)−グリシル−Ｎ−フェニル−Ｌ−フェニルアラニンアミドのジアステレオマー混合物を合成した。
ＨＰＬＣ系Ｉ：Ｒｔ＝１８.９分。
ＥＳ−ＭＳｍ／ｚ：６６７.４ [ＭＨ^＋]

ｂ)１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｎ−フェニル−Ｌ−フェニルアラニンアミド。
化合物１.５ａと４−ニトロアニリンの反応を、実施例１.２ｄに記載の通り行った。ジアステレオマー混合物含有粗生成物をＨＰＬＣ系Ｊを使用して精製し、分離した。ＭｅＣＮの蒸発および水残渣の凍結乾燥により、表題化合物およびそのジアステレオマーを黄色粉末として得た。
生成物は酸性条件に不安定である
“速く”溶出するジアステレオマは、それがＭＭＰにより急速に開裂して４−ニトロアニリンを遊離し、一方、“遅い”ジアステレオマーはしなかったため、“Ｌ様”Ｒ−立体化学を有すると仮定した。

“速い”Ｌ様ジアステレオマー、表題化合物。
ＨＰＬＣ系Ｋ：Ｒｔ＝２３.２０分。
¹H-NMR(ピリジン-D5):δ 11.02(1H, s), 9.95(1H, d), 9.74(1H, d), 9.24(1H, d), 9.23(1H, t), 8.28(1H, d), 8.08(2H, d), 7.92(2H, d), 7.36-6.90(10H, m), 6.49(1H, t), 5.29(1H, m), 4.98(1H, m), 4.63(1H, dd), 4.39+4.31(1H+1H, dd+dd), 3.48+3.30(1H+1H, m+m), 3.45+3.21(1H+1H, m+m), 1.88(3H, s), 2.20-1.65(7H, m), 0.81(3H, d), 0.72(3H, d)ppm。
¹³C-NMR(ピリジン-D5):δ 173.96, 173.52, 171.11, 170.66, 170.50, 168.67, 152.59, 139.74, 138.93, 137.86, 129.81, 129.19, 128.80, 127.03, 126.32, 124.21, 120.59, 112.91, 61.14, 61.03, 56.62, 52.72, 48.46, 43.39, 40.39, 38.67, 29.94, 25.23, 25.09, 23.14, 22.51, 21.48ppm。

“遅い”Ｄ様ジアステレオマー。
ＨＰＬＣ系Ｋ：Ｒｔ＝２３.９６分。
¹H-NMR(ピリジン-D5):δ 11.05(1H, s), 9.41(1H, d), 9.16(2H, d+t), 8.94(1H, d), 8.10(3H, m), 7.89(2H, d), 7.40-7.08(8H, m), 6.99(2H, d), 6.48(1H, t), 5.20(1H, m), 4.92(1H, m), 4.62(1H, dd), 4.37+4.18(1H+1H, dd+dd), 3.55+3.37(1H+1H, dd+dd), 3.35+3.13(1H+1H, m+m), 1.84(3H, s), 2.20-1.63(7H, m), 0.85(3H, d), 0.83(3H, d)ppm。
¹³C-NMR(ピリジン-D5):δ 174.70, 173.67, 171.23, 171.01, 170.91, 168.95, 152.80, 139.58, 138.89, 137.99, 129.80, 129.20, 128.85, 127.11, 126.42, 124.38, 120.73, 112.77, 61.15, 60.68, 57.16, 52.13, 48.40, 44.28, 39.53, 38.48, 30.01, 25.12(2C), 23.19, 22.32, 21.64ppm。

実施例２ − 精製プロテアーゼでの生化学基質活性
種々のＭＭＰについて基質特異性を確認するために、標準酵素アッセイをレポーター遊離をモニターするために適合させた。レポーターを、実施例３ａに記載のＬＣ−ＭＳ方法、または実施例４に記載のＬＣ−ＵＶ方法のいずれかで分析した。

ＭＭＰ８
精製プロ−ＭＭＰ８をCalbiochemから購入した。酵素(１０μg／mlで)をｐ−アミノ−フェニル−水銀(II)アセタート(ＡＰＭＡ)で、１mMで２.５時間、３５℃で活性化させる。活性化酵素を使用して、基質の活性を以下の通りモニターできる：ＭＭＰ８(２００ng／ml 最終濃度)を、９０分間、３５℃(８０％Ｈ_２Ｏ)で実施例１の基質の１個(１２.５μM)とアッセイ緩衝液(０.１ＭＮａＣｌ、３０mM ＣａＣｌ_２、０.０４０mM ＺｎＣｌおよび０.０５％(ｗ／ｖ)“Ｂｒｉｊ３５”(商標)界面活性剤含有０.１Ｍ “Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ”(商標)緩衝液、ｐＨ７.５)中、阻害剤の存在下または非存在下でインキュベートする。活性を、実施例３ａの方法を使用して、レポーター４−ニトロアニリンの遊離の測定により決定する。

ＭＭＰ９
組み換えヒトＭＭＰ９触媒ドメインを発現させ、次いでＺｎキレートカラムクロマトグラフィー、続いてヒドロキサメート親和性カラムクロマトグラフィーで精製した。酵素を使用して、基質の活性を以下の通りモニターできる：ＭＭＰ９(５ng／ml 最終濃度)を３０分間、室温(ＲＴ)で、実施例１の基質の１個(５μM)とアッセイ緩衝液(０.１ＭＮａＣｌ、２０mM ＣａＣｌ_２、０.０２０mM ＺｎＣｌおよび０.０５％(ｗ／ｖ)“Ｂｒｉｊ３５”(商標)界面活性剤含有０.１Ｍ “Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ”(商標)緩衝液、ｐＨ７.３)中、阻害剤の存在下または非存在下でインキュベートする。活性を、実施例３ａの方法を使用して、レポーター４−ニトロアニリンの遊離の測定により決定する。

ＭＭＰ１２
組み換えヒトＭＭＰ１２触媒ドメインを、Parkar A.A. et al, (2000), Protein Expression and Purification, 20, 152により記載の通り発現および精製し得る。精製酵素を使用して、基質の活性を以下の通りモニターできる：ＭＭＰ１２(５０ng／ml 最終濃度)を、６０分間、室温で、実施例１の基質の１個(１０μM)と、アッセイ緩衝液(０.１ＭＮａＣｌ、２０mM ＣａＣｌ_２、０.０２０mM ＺｎＣｌおよび０.０５％(ｗ／ｖ)“Ｂｒｉｊ３５”(商標)界面活性剤含有０.１Ｍ “Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ”(商標)緩衝液、ｐＨ７.３)中、阻害剤の存在下または非存在下でインキュベートする。活性を、実施例３ａの方法を使用して、レポーター４−ニトロアニリンの遊離の測定により決定する。

ＭＭＰ１４
組み換えヒトＭＭＰ１４触媒ドメインを、Parkar A.A. et al, (2000), Protein Expression and Purification, 20, 152により記載の通り発現および精製し得る。精製酵素を使用して、基質の活性を以下の通りモニターできる：ＭＭＰ１４(１０ng／ml 最終濃度)を、６０分間、室温で、実施例１の基質の１個(１０μM)と、アッセイ緩衝液(０.１ＭＮａＣｌ、２０mM ＣａＣｌ_２、０.０２０mM ＺｎＣｌおよび０.０５％(ｗ／ｖ)“Ｂｒｉｊ３５”(商標)界面活性剤含有０.１Ｍ “Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ”(商標)緩衝液、ｐＨ７.５)中、阻害剤の存在下または非存在下でインキュベートする。活性を、実施例３ａの方法を使用して、レポーター４−ニトロアニリンの遊離の測定により決定する。

ＭＭＰ１９
組み換えヒトＭＭＰ１９触媒ドメイン、Parkar A.A. et al, (2000), Protein Expression and Purification, 20, 152により記載の通り発現および精製し得る。精製酵素を使用して、基質の活性を以下の通りモニターできる：ＭＭＰ１９(４０ng／ml 最終濃度)を、１２０分間、３５℃で、実施例１の基質の１個(５μM)と、アッセイ緩衝液(０.１ＭＮａＣｌ、２０mM ＣａＣｌ_２、０.０２０mM ＺｎＣｌおよび０.０５％(ｗ／ｖ)“Ｂｒｉｊ３５”(商標)界面活性剤含有０.１Ｍ “Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ”(商標)緩衝液、ｐＨ７.３)中、阻害剤の存在下または非存在下でインキュベートする。活性を、実施例３ａの方法を使用して、レポーター４−ニトロアニリンの遊離の測定により決定する。

発現および精製したプロＭＭＰを使用した、ＭＭＰ９を含む他のマトリクスメタロプロテイナーゼに対して試験するためのプロトコールは、例えば、C. Graham Knight et al., (1992)FEBS Lett., 296(3), 263-266に記載されている。

＊を付けた酵素源は、AstraZenecaにより社内で産生した。

実施例−３ａ − ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用した、血漿中の４−ニトロアニリンの測定
サンプルの調製
ヘパリン処理した全血(１mL)のサンプルをザイモサン(０、５０、３００、６００、９００および１２００μg／mL)で刺激し、ボルテックス処理し、３７℃で１５分インキュベートした。遠心後に血漿を回収し、基質(１０μM)と混合し、３７℃で６０分インキュベートした。内部標準として(^１３Ｃ)_６−４−ニトロアニリン(１μM)と共に、メタノール(３００μl)を１００μlアリコートの上記混合物に添加し、遠心分離して沈殿したタンパク質を除去した。上清(１００μl)を水(１００μl)で希釈し、抽出物を直接ＨＰＬＣカラムに注入した。

較正曲線
７点較正曲線を、ブランク血漿に４−ニトロアニリンを１.４〜２９７６nMの間の濃度に添加(spiking)することにより産生した。較正サンプルを、次いで上記方補に従い沈殿させ、希釈した。
また、非添加(unspiked)血漿サンプルを産生し、ブランクサンプルとして使用する。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ系
ＬＣ−ＭＳ系は２個の勾配ポンプ、１個のアイソクラチックポンプ、オートインジェクターおよび三連四極子(triquadropole)質量分光計(Sciex API3000)から成る。サンプルをプレカラム(ＮＨ_２、２ｘ１０mm)に注入し、それはマトリクス成分を保持し、それを次いでエタノールで逆流させる。最終溶出を、０から１００％Ｂへの６分の勾配(Ｃ_１８−カラム、２ｘ４０mm)、続く１.５分間の平衡化により行う。移動相Ａ：ＭｅＯＨ：５０mM ＮＨ_４ＡｃｐＨ４.０(２：９８)およびＢ：ＭｅＯＨ：５０mM ＮＨ_４ＡｃｐＨ４.０(９０：１０)。
検出を、マルチプル反応モニタリング(ＭＲＭ)により行う。４−ニトロアニリンについて、１３９.１のｍ／ｚを、１２２.２のフラグメントと共に使用し、そしてデキサメサゾンについて、３９３.１のｍ／ｚを３７３.０のフラグメントと共に使用する。

評価
比率(４−ニトロアニリン面積／内部標準面積)を、全較正サンプルについて計算し、濃度に対してプロットする。次いで、全ての未知サンプルを較正曲線から計算する。

実施例３ｂ − 患者から採った血漿サンプル中の４−ニトロアニリンの分析を介した全血中のＭＭＰ９活性の測定
この試験の目的は、中程度ＣＯＰＤ患者、無症候喫煙者および健常ボランティアから採った血漿サンプル中の４−ニトロアニリンの分析を介した、血液サンプル中のＭＭＰ９活性の測定であった。

・ＬＣ−ＭＳにより血漿サンプル中の４−ニトロアニリンを測定するための材料および方法
以下の材料を使用した：
ジメチルスルホキシド、Fisher Scientific, Loughborough, UKから。
メタノール２０５グレード、Romil Ltd., Waterbeach, UKから。
ＨＰＬＣグレードアセトニトリル、Fisher Scientific, Loughborough, UKから。
アンモニア(０.８８、３５％)、ＨＰＬＣグレード、Fisher Scientific, Loughborough, UKから。
４−ニトロアニリン、コード番号18531-0、Aldrich Chemical Co. Milwaukee, USA。
[^１３Ｃ]６−４−ニトロアニリン、Medicinal Chemistry AstraZeneca R & D Charnwood。[^１３Ｃ]６−４−ニトロアニリンを、市販されている^１３Ｃ_６Ｎ−フェニルアセトアミドのニトロ化および加水分解により製造できる。
１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチル − 実施例１.１に記載の通り製造。
対照ヒト血漿(リチウムヘパリン)、Charterhouse Clinical Research Unit, London, UKから。
MilliQ精製系, Millipore, Watford, UKにより新たに調製した水。

・装置
以下の装置を使用した
Unicam UV300シリーズＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計、Spectronic Unicam, Cambridge, UKから。
専用データシステムと共にSciex API 150ex質量分光計、Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, UKから。
ＨＰ１１００溶媒デガッサー、ＨＰ１１００バイナリー勾配ポンプ、ＨＰ１１００サーモスタット付きオートサンプラーおよびＨＰ１１００カラムオーブン、Agilent Technologies Ltd., Altrincham, Cheshire, UKから。
Lunaフェニル−ヘキシルＨＰＬＣカラム(５μm、５０ｘ２.０mm)(Phenomenex, part no. 00B4257-B0)。
Lunaフェニル−プロピルＨＰＬＣセキュリティーガードカラム(４.０ｘ２.０mm)(Phenomenex, part no. AJO-4350)。
ここで使用する試薬は当分野で既知である。

・較正および品質管理サンプルの調製
１. 較正サンプルの調製
適当なピペットを使用して、表１に示す通り、０.０５０、０.１００、０.２００、０.５００、１.００、２.００、５.００、および１０.０μMで４−ニトロアニリンの血漿較正サンプルを調製する。ボルテックスミキサーを使用して徹底的に混合。

２. 血漿品質管理サンプルの調製
適当なピペットを使用して、表２に示す通り、０.１００、２.００、および８.００μM ４−ニトロアニリンで品質管理サンプルを調製する。バイアル内容物のボルテックスによる徹底的な混合、および各サンプルのプラスチックSarstedtチューブ(２.０mL)への一定量での分配(約３００μl、２種の分析に十分量)。チューブを冷凍庫中、−２０℃以下で貯蔵。

・サンプル分析法
１. 血漿中の１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチルインキュベーション
貯留対照ヒト血漿、品質管理および試験サンプルを必要に応じて融解。
１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチル(２μl、溶液Ｄ)の、２mLネジ蓋付きマイクロチューブ中の試験血漿サンプル(２００μl)への添加およびボルテックスミキサーでの混合。
チューブの６０分、３７℃での、振盪水浴中のインキュベート。工程３での試験サンプルの６０分間インキュベーション中、表１に詳述した血漿中の較正サンプルの調製。サンプルのボルテックスミキサーでの混合。
適当なピペットを使用した、各血漿サンプルの、９６深ウェル２mLプレートの各個々のウェルへの一定量(１００μl)の手動分配。(注：工程３において試験サンプルがインキュベーションを終了する約１０分前に較正、品質管理およびブランクサンプルのピペット輸送開始)。Tecanを使用した、各ウェルへのメタノール(３００μl)中の内部標準の分配。プレートをポリスチレンカバーでカバー。３０００rpmで５分、室温で遠心。
Tecanを使用した、サンプル上清の一定量(１００μl)の９６深ウェル２mLプレートの別のウェルへの移動。Tecanを使用した、９６深ウェルポリプロピレンプレートのウェル中の各サンプルとの水(１００μl)の混合。プレートのプレスピリット９６ウェルシールでのカバー。
ＬＣ／ＭＳによる１０μl量の分析。

・調製抽出物のＬＣ／ＭＳ分析
１. 装置 −
PUM HP1100
デガッサー：HP1100オートサンプラー：HP1100 A/Sサーモスタット：HP1100カラム：HP1100 MS：Sciex API 150ex

２. 試験サンプルのＨＰＬＣ条件
カラム：Lunaフェニル−プロピルＨＰＬＣセキュリティーガードカラムプレ−カラム(４.０ｘ２.０mm)を備えたLunaフェニル−ヘキシルＨＰＬＣカラム(５μm、５０ｘ２.０mm)
溶媒Ａ：０.０１％水性アンモニア
溶媒Ｂ：メタノール
組成物：表３参照
流速：表３参照
カラム温度：４０℃
ラン時間：１０分
注入量：１０μl
針洗浄：２５％アセトニトリル／水で３秒

ＨＰＬＣ溶離剤を、１〜４分に質量分光計に向ける。ランの残りについて、それを廃棄物に向ける。

３. ＭＳ獲得
ＨＰＬＣカラム流出液を、加熱ネブライザーインターフェースを介して、負モードで、質量分光計に向ける。４−ニトロアニリンおよび[^１３Ｃ]６−４−ニトロアニリンを、各々ｍ／ｚ１３７および１４３の質量対荷電比で、[Ｍ−Ｈ]⁻イオンのシングルイオンモニタリングを使用して検出する。
温度：４２５℃
ネブライザーガス：１１(任意のスケール)
カーテンガス：１０(任意のスケール)
補助的ガス約１Ｌ／分
休止時間：５００ms
分割：約１amu
獲得時間：５.０分
プロセシングソフトウェア：PE Sciex ‘Analyst' v1.1
オリフィスおよびリングボルト数は、感受性を最大にするために筆由生に応じて選択し得る。

サンプルは以下の順番で分析すべきである：
ａ)コンディショニングサンプル(１０μM×４)
ｂ)較正サンプル(１０.０、２.００、０.５００、０.１００μM)
ｃ)品質管理サンプル(０.０１、２.００、８.００μM)
ｄ)ブランクサンプル
ｅ)試験サンプル
ｆ)品質管理サンプル(０.０１、２.００、８.００μM)
ｇ)ブランクサンプル
ｈ)較正サンプル(５.００、１.００、０.２００、０.０５０μM)
各サンプルの分析物および内部標準のピーク応答の決定(予測保持時間約１.８分)。較正サンプルからのデータにAnalystソフトウェア中の適当な曲線適合を適用し、各サンプルに存在する４−ニトロアニリン濃度の定量を可能とする。

・データのための標準法
各サンプルの分析物のピーク面積を測定し、較正サンプルからのデータに対して適当な線形回帰法を適用。

実験
ヒト血漿サンプルを、有効なタンパク質沈殿ＬＣ−ＭＳ法を使用して、１２分析バッチで分析した。分析バッチは試験サンプル、較正サンプルおよびデュプリケート品質管理サンプルを含んだ。全１２バッチは許容されたが、しかしながら１つの結果は、不正確なサンプル調製のために拒絶された。

全血サンプルを種々の濃度のザイモサン(０、５０、３００、６００、９００および１２００μg／mL)で刺激した。刺激全血サンプルから得た血漿サンプルを基質１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチルと、１０μMの血漿濃度で混合し、次いでサンプルを３７℃で６０分インキュベートした。一定量(１００μl)のヒト血漿を、内部標準として[^１３Ｃ]６−４−ニトロアニリンを含むメタノール(３００μl)と混合し、タンパク質を沈殿させ、サンプルを遠心分離し、上清(１００μl)を水(１００μl)と混合した。抽出物１０μlを直接Phenomenex Lunaフェニル−ヘキシルカラム(５０ｘ２.０mm、５μm)に抽出し、化合物を、０.０１％アンモニア／メタノールから成る勾配移動相で輸出した。４−ニトロアニリンを内因性血漿成分から分解し、ＨＰＬＣ流出液を、直接、加熱ネブライザーインターフェースを介して、負モードで、質量分光計に向けた。４−ニトロアニリンおよび[^１３Ｃ]６−４−ニトロアニリンを、上記の通り各々ｍ／ｚ１３７および１４３の質量対荷電比で、[Ｍ−Ｈ]⁻イオンのシングルイオンモニタリングを使用して検出した。この方法は上に記載する。

この方法は、１００μl 血漿サンプルの分析に基づいて、４−ニトロアニリンについて０.０５００〜１０.０μMの範囲で有効である。０.１００、２.００および８.００μM ４−ニトロアニリンの濃度の品質管理サンプルを、各分析バッチの許容性を決定するために包含した。本方法の定量限界(ＬＯＱ)は、１００μlアリコートの血漿について０.０５００μM ４−ニトロアニリンである。

結果
平均および標準偏差を通して、データを３つの顕著な数字で示す。
１. 試験サンプル
来院３および４からの健常ボランティアからの４−ニトロアニリンを決定するための個々の濃度を、各々表４および表５に、図１に示す平均値と共に示す。平均値は、来院３について０μg ザイモサンで０.１２１μMから１２００μg ザイモサンで３.５９μMの範囲、および来院４について０μg ザイモサンで０.１３１μMから１２００μg ザイモサンで３.３９μMの範囲である。

ＡＲ＝分析拒否

来院３および４からの喫煙者からの４−ニトロアニリンを決定するための個々の濃度を、各々表６および表７に、図２に示す平均値と共に示す。平均値は、来院３について０μg ザイモサンで０.１４９μMから１２００μg ザイモサンで４.４７μMの範囲、および来院４について０μg ザイモサンで０.１４２μMから１２００μg ザイモサンで４.４１μMの範囲である。

来院３および４からのＣＯＰＤ患者からの４−ニトロアニリンを決定するための個々の濃度を、各々表８および表９に、図３に示す平均値と共に示す。平均値は、来院３について０μg ザイモサンの０.１２８μMから９００μg ザイモサンの４.４７μMの範囲、および来院４について０μg ザイモサンの０.１４１μMから１２００μg ザイモサン４.５４μMの範囲である。

全３群からの結果は、４−ニトロアニリン濃度がザイモサン濃度増加と共に増加することを示す。この増加は０〜６００μg ザイモサンで大きく、６００〜１２００μg ザイモサンで徐々にプラトーに達する。４−ニトロアニリン平均濃度は、健常ボランティアと比較して喫煙者およびＣＯＰＤ患者で一般に高く、喫煙者およびＣＯＰＤ患者で顕著な差はない。

２. 較正および品質管理サンプル
品質管理サンプルの分析からの４−ニトロアニリンの測定の結果を表１０に記載する。平均バイアスは、０.１００で−３％から８.００で２％の範囲である。精度は８.００μMで３.２％から０.１００μMで１０.６％の範囲である。
逆算した較正曲線からの４−ニトロアニリン濃度の決定を表１１に示す。平均バイアスは、０.２００で−３％から１０.０で３％の範囲である。精度は２.００μMで２.６％から０.１００μMで６.０％の範囲である。
４−ニトロアニリン較正曲線回帰パラメータを表１２に示す。結果は、０.２８９の平均傾斜値を、３.７％の精度で示す。Ｒ二乗値の範囲は、０.９９１４−０.９９９５であった。

要約
ヒト血漿サンプルを、有効なＬＣ−ＭＳ分析法を使用して、４−ニトロアニリンについて分析した。試験サンプルと共に分析した品質管理サンプルから得たデータは、許容される限界内であり、本試験において作成されるデータの信頼を与える。
全３群からの結果は、４−ニトロアニリン濃度がザイモサン濃度増加と共に増加することを示す。この増加は０〜６００μg ザイモサンで大きく、６００〜１２００μg ザイモサンで徐々にプラトーに達する。４−ニトロアニリン平均濃度は、健常ボランティアと比較して喫煙者およびＣＯＰＤ患者で一般に高く、喫煙者およびＣＯＰＤ患者で顕著な差はない。

実施例４ − 滑液中のプロテアーゼの活性
滑液(ＳＦ)を、リウマチ性関節炎(７対象)および全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)(１対象)から得た。
サンプル調製
予測活性範囲の概算をするために、サンプルを、市販のＥＬＩＳＡキットで全ＭＭＰタンパク質含有量についてアッセイした。ＭＭＰ１レベルは３.５−１０nM、ＭＭＰ９は０.０５−０.８１nMの範囲であった。総タンパク質レベルは３０−５６mg／mlであった(Biorad DCタンパク質アッセイキット、試薬Ａ、ＢおよびＳ)。
各サンプルの量を、約４mgの総タンパク質をアッセイに使用するように調整した(表１３)。
サンプルを、５０mM トリシンｐＨ７.５、２００mM ＮａＣｌ、１０mM ＣａＣｌ_２、２０μM ＺｎＣｌ_２および０.０５％Ｂｒｉｊ−３５を含む緩衝液で１８０μlにした。

ＭＭＰ活性アッセイ
サンプルに、２０μlの基質１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチル(実施例１.２)溶液(１０mMのメタノール溶液)を添加した。３時間、３７℃でインキュベーション後、反応を５μl ２００mM ＥＤＴＡで停止させた。サンプルをプレカラム(Waters OASIS HLB Icc, part no. 94225、１mlのエタノール、続いて１ml 水でプレコンディショニング)を通して濾過し、それを１ml 水および１mlの９０％エタノールで溶出した。サンプルを窒素流下で蒸発乾固し、２００μl ５０％エタノールに再溶解し、ボルテックスミキサーで激しく撹拌し、遠心分離した(１０００ｇ、２分)。上清の、１０−１６０μlアリコートをレポーター４−ニトロアニリンについてＨＰＬＣで分析した(実施例３に記載のようにまたは３８０nMのＵＶで検出)。標準曲線を、一定量のレポーター(４ＮＡ)を添加し、分析サンプルと同じ方法で処置したサンプルから得た。

同様に、表１３の全対象からの滑液の貯留サンプルを使用して、１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｓ−(ビフェニル−４−イルメトキシ)−グリシル−Ｌ−ロイシルグリシン酸メチル(実施例１.３)を、レポーター４−ビフェニルメタノールについて分析する以外、同じ方法に使用した。この基質で、遊離は３３.２nmol／ml ＳＦであった。

上記明細書に記載の全ての刊行物は、引用により本明細書に包含させる。本発明の種々の修飾および改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明白である。本発明は具体的な好ましい態様に関連して記載しているが、請求している本発明は、そのような具体的な態様に不当に限定すべきではないことは理解されるべきである。

種々の濃度のザイモサンで全血を刺激した後に健常ボランティアから得た４−ニトロアニリンの平均濃度プロファイル。種々の濃度のザイモサンで全血を刺激した後に喫煙者から得た４−ニトロアニリンの平均濃度プロファイル。種々の濃度のザイモサンで全血を刺激した後にＣＯＰＤ患者から得た４−ニトロアニリン平均濃度プロファイル。

Claims

サンプル中のプロテアーゼの活性を測定する方法であって：
(ｉ)該サンプルと基質を混合し、ここで、該基質は式(１ａ)

〔式中：
Ｒ_１はヒドロカルビル基であり
Ｒ_２は第一ペプチド部分であり
Ｒ_３は第二ペプチド部分であり、そして
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され；
Ｙ_１は適当な置換基であり；
Ｙ_２は適当な置換基である。〕
を有し、そして
(ii)該プロテアーゼの活性を、式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１
〔式中：
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され；そして
Ｒ_１はヒドロカルビル基である。〕
を有するレポーターの存在の検出により測定する工程を含む、方法。
プロテアーゼモジュレーターの効果を測定する方法であって、プロテアーゼと該プロテアーゼモジュレーターを接触させ、そして請求項１に記載の方法により該プロテアーゼの活性を測定する工程を含む、方法。
該プロテアーゼモジュレーターがプロテアーゼ阻害剤である、請求項２に記載の方法。
該プロテアーゼモジュレーターがプロテアーゼアクティベーターである、請求項２に記載の方法。
該プロテアーゼアクティベーターがザイモサンである、請求項４に記載の方法。
候補プロテアーゼモジュレーターの効果を測定する方法であって、プロテアーゼと該候補プロテアーゼモジュレーターを接触させ、そして請求項１に記載の方法により該プロテアーゼの活性を測定する工程を含む、方法。
該候補プロテアーゼモジュレーターが候補プロテアーゼ阻害剤である、請求項６に記載の方法。
該候補プロテアーゼモジュレーターが候補プロテアーゼアクティベーターである、請求項６に記載の方法。
該サンプルが：尿、全血、血漿、血清、滑液、唾液、痰、気管支肺胞液、脳脊髄液、鼻汁、肺内層液(lining fluid)、涙液および皮膚水疱液から成る群から選択される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
該サンプルが：細胞培養、組織、組織切片および均質化組織から成る群から選択される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
該プロテアーゼがマトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)ＥＣ３.４.２４−である、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
該マトリクスメタロプロテイナーゼが、ＭＭＰ８(ＥＣ３.４.２４.３４)、ＭＭＰ９(ＥＣ３.４.２４.３５)、ＭＭＰ１２(ＥＣ３.４.２４.６５)およびＭＭＰ１３(ＥＣ３.４.２４.−)から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
該マトリクスメタロプロテイナーゼがＭＭＰ９(ＥＣ３.４.２４.３５)である、請求項１２に記載の方法。
ヒドロカルビル基Ｒ_１がアリール、ヘテロアリール、アリールオキシアリール、ビアリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル基およびそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
Ｒ_１がアリール、ヘテロアリール、アリールオキシアリール、ビアリールおよびそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
Ｒ_１が：

〔式中、Ｘは式(１ａ)の基質の残りおよび／または式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの残りである。〕
から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
該基質が１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−α−Ｒ−(４−ニトロフェニルアミノ)−グリシル−Ｌ−ロイシル−β−アラニン酸メチルである、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
該レポーターが４−ニトロアニリンである、請求項１７に記載の方法。
請求項１から１８のいずれかに定義した式(１ａ)を有する基質。
プロテアーゼによりカルボニル基と−ＮＨ−ＣＨ(Ｘ−Ｒ_１)−基の間のペプチド結合で開裂され得る基質であって；
Ｒ_１はヒドロカルビル基であり、そして
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択される基質。
式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターであって、
ここで：
Ｒ_１はヒドロカルビル基であり、そして
ＸはＯ、ＳおよびＮＨから成る群から選択され、
そして、該レポーターは請求項１から２０のいずれかに定義した式(１ａ)の基質である、レポーター；
ただし該レポーターは２−(４−イソブチル−フェニル)−プロピオン酸ではない。
ヒドロカルビル基Ｒ_１がアリール、ヘテロアリール、アリールオキシアリール、ビアリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル基およびそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項２１に記載のレポーター。
Ｒ_１がアリール、ヘテロアリール、アリールオキシアリール、ビアリールおよびそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項２２に記載のレポーター。
Ｒ_１が：

〔式中、Ｘはレポーターの残りである〕
から成る群から選択される、請求項２３に記載のレポーター。
サンプル中のプロテアーゼの活性を測定するためのキットであって：
(ｉ)請求項１から２４のいずれかに定義した基質；および
(ii)サンプル中の請求項１から２４のいずれかに定義したレポーターを検出するための手段
を含むキット。
サンプル中のプロテアーゼの活性を測定するための請求項１から２５のいずれかに定義した基質の使用。
サンプル中のプロテアーゼの活性を測定するための請求項１から２６のいずれかに定義したレポーターの使用。
対象における疾患または障害を診断する方法であって、該対象からサンプルを得て、該サンプルにおけるプロテアーゼの活性を請求項１から１８のいずれかに記載の方法により測定する工程を含む、方法。
対象における疾患または障害の診断において使用するための、請求項１から２８のいずれかに定義した基質。
対象における疾患または障害の診断において使用するための、請求項１から２９のいずれかに定義したレポーター。
該疾患が慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)である、請求項２８に記載の方法、請求項２９に記載の基質または請求項３０に記載のレポーター。
プロテアーゼモジュレーターの効果を測定する方法であって：
(ｉ)該プロテアーゼモジュレーターとプロテアーゼおよび請求項１から３１のいずれかに定義した式(１ａ)を有する基質を混合し；
(ii)該プロテアーゼの活性を、請求項１から３１のいずれかに定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在を検出することにより測定する工程を含む、方法。
候補プロテアーゼモジュレーターの効果を測定する方法であって：
(ｉ)該候補プロテアーゼモジュレーターとプロテアーゼおよび請求項１から３２のいずれかに定義した式(１ａ)を有する基質を混合し；そして
(ii)該プロテアーゼの活性を、請求項１から３２のいずれかに定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在を検出することにより測定する工程を含む、方法。
プロテアーゼモジュレーターを同定する方法であって：
(ｉ)候補プロテアーゼモジュレーターとプロテアーゼおよび請求項１から３３のいずれかに定義した式(１ａ)を有する基質を混合し；そして
(ii)該プロテアーゼの活性を、請求項１から３３のいずれかに定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在を検出することにより測定する工程を含む、方法。
プロテアーゼモジュレーターを同定し、より多くの同定されたプロテアーゼモジュレーターを製造しおよび／または次いでそのより多くの同定されたプロテアーゼモジュレーターを製剤する工程を含む方法であって；該同定部分が：
(ｉ)候補プロテアーゼモジュレーターとプロテアーゼおよび請求項１から３４のいずれかに定義した式(１ａ)を有する基質を混合し；そして
(ii)該プロテアーゼの活性を、請求項１から３４のいずれかに定義した式Ｈ−Ｘ−Ｒ_１を有するレポーターの存在を検出することにより測定する工程を含む、方法。
実質的にここに記載の通りのおよび請求項１に関連した、方法。