JP2009529885A - リソソーム酵素に対する抗体の検出のためのアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2006年3月17日に出願された、米国仮特許出願第60/783,690号の利益を請求する。米国仮特許出願第60/783,690号の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
本発明は、体液または組織において、酵素補充療法の一環として投与されるリソソーム酵素に対する中和抗体およびアイソタイプ特異的抗体などの抗体をスクリーニングする方法に関する。
ムコ多糖症(MPS)として知られるリソソーム蓄積症(クロック(Klock)ら著,「インターナショナルペディアトリクス(Internat Pediatr.)」第9巻:p.40−48(1994年);スター(Starr)ら著,「グリコシレーションアンドディジーズ(Glycosylation & Disease)」第1版:p.165−176(1994年))の原因は、酵素または酵素の組み合わせの欠損である。こうしたリソソーム蓄積症の特徴として、分解されないグリコサミノグリカンのリソソーム内への蓄積、グリコサミノグリカンの尿中への過剰排泄、進行性の精神および身体機能の悪化および早死にがある。患者は、ほとんどの場合、MPSの明らかな臨床的特徴がなく生まれてくるが、時間経過とともに臨床的病変が発生する。各タイプのMPSとも、特定のリソソーム酵素が欠損しているが、臓器障害の程度と悪化の速度は独特である。ムエンザー(Muenzer)著,「アドバンスズインペディアトリクス(Adv. Pediatri.)」第33巻:p.269−302(1986年)を参照されたい。
マイアー−スルイス(Mire−Sluis)ら,「ジャーナルオブイムノロジカルメソッズ(J.Immunological Methods)」第289巻:p.1−16(2004年)
本発明は、リソソーム貯蔵障害を対象とした酵素補充療法など、タンパク質療法に関連した抗体を測定する特異的かつ選択的アッセイの開発を基礎としている。
本発明は、患者の体液および組織に由来する、リソソーム酵素に特異的な抗体を検出する高感度で特異的なアッセイの開発を基礎としている。
変異体
ある実施形態では、リソソーム酵素(LE)またはLE受容体のアナログおよび変異体については、調製が可能であり、リソソーム酵素およびその受容体を用いる可能性がある様々な用途で有用になる。LEまたはLEフラグメントは、全長酵素、あるいは、少なくとも全長酵素の生物活性(すなわち、酵素活性)の一部を保持しているその任意の変異体、フラグメントまたは修飾体を含むものである。LE受容体またはLE結合フラグメントは、全長受容体、受容体の細胞外部分、あるいは、少なくとも全長LE受容体の生物活性(すなわち、LE結合活性)の一部を保持しているその任意の変異体、フラグメントまたは修飾体を含むものである。
いくつかの実施形態では、アッセイ試薬を標識して検出しやすくする。標識部分または検出可能な部分は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段またはこれ以外の物理的手段で検出可能な組成物である。抗体については、放射性同位元素、親和性標識(たとえば、ビオチン、アビジンなど)、酵素標識(たとえば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど)、蛍光標識(たとえば、フルオレセインイソチオシアナート(FITC:fluorescein isothiocyanate)またはローダミンなど)または発光標識もしくは生物発光標識(たとえば、ユウロピウム、バナジウムなど)、常磁性原子、電気化学発光標識(たとえば、基質を併用したRu系標識など)および同種ものを用いて検出可能に標識することができる。
標識が放射性である場合、オートラジオグラフィーの場合と同様、検出の手段として、シンチレーションカウンターまたは写真フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合、適切な光の波長で蛍光色素を励起し、得られる蛍光を検出して、標識を検出することができる。蛍光については、電荷結合素子(CCD:charge coupled device)または光電子増倍管および同種のものなど、電子検出器を用いて目視検出することができる。酵素標識も同様に、酵素に適切な基質を加え、得られる反応生成物を検出して検出することができる。比色標識については、標識の色をそのまま観察するだけで検出することができる。本発明の方法で用いるのに好適なこれ以外の標識系および検出系に関しては、当業者には容易に明らかになるであろう。こうした標識モジュレーターおよびリガンドを疾患または健康状態の診断に用いてもよい。
リソソーム酵素は、たとえば、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル貯蔵病/ウォルマン病、シスチン蓄積症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病(Farber Lipogranulomatosis/Farber disease)、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシスI/II型、ゴーシェ病I/II/III型ゴーシェ病、グロボイド細胞白質ジストロフィー/クラッベ病、糖原病II型/ポンペ病、GM1ガングリオシドーシスI/II/III型、GM2ガングリオシドーシスI型/テイ−サックス病、GM2ガングリオシドーシスII型サンドホフ病、GM2−ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスI/II型、α−マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコリピドーシスI型/シアリドーシスI/II型 ムコリピドーシスII/III型I細胞病、ムコリピドーシスIIIC型偽ハーラーポリジストロフィー、ムコ多糖症I型(MPS I型)、ムコ多糖症II型ハンター症候群(MPS II型)、ムコ多糖症IIIA型サンフィリポ症候群(MPS IIIA型)、ムコ多糖症IIIB型サンフィリポ症候群(MPS IIIB型)、ムコ多糖症IIIC型サンフィリポ症候群(MPS IIIC型)、ムコ多糖症(MPS)IIID型サンフィリポ症候群(MPS IIID型)、ムコ多糖症(MPS)IVA型モルキオ症候群(MPS IVA型)、ムコ多糖症IVB型モルキオ症候群(MPS IVB型)、ムコ多糖症VI(MPS VI型)、ムコ多糖症VII型スライ症候群(MPS VII型)、ムコ多糖症IX型(MPS IX型)、多種スルファターゼ欠損、ポンペ病、神経性セロイドリポフスチノーシス、CLN1バッテン病、神経性セロイドリポフスチノーシス、CLN2バッテン病、ニーマン−ピック病A/B型ニーマン−ピック病、ニーマン−ピック病C1型ニーマン−ピック病、ニーマン−ピック病C2型ニーマン−ピック病、ピクノディスオストーシス、シンドラー病I/II型シンドラー病およびリソソームタンパク質欠損が病状を引き起こすシアル酸蓄積症、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、クラッベ病およびテイ−サックス病など、リソソーム蓄積症の処置には治療薬として有用である。特に好ましい実施形態では、リソソーム蓄積症は、MPS VI型である。別の好ましい実施形態では、リソソーム蓄積症は、ポンペ病である。
抗体については、以下に限定されるものではないが、プロテインAセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーなど、当該技術分野で標準的な技法を用いて精製することができる。微生物細胞、哺乳類細胞または血清から調製された抗体組成物については、たとえば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製できるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製手法である。プロテインAが親和性リガンドとして好適かどうかは、抗体に存在する任意の免疫グロブリンのFcドメインの種およびアイソタイプによって決まる。重鎖のヒトγ1鎖、γ2鎖またはγ4鎖に基づく抗体については、プロテインAを用いて精製してよい(リンドマーク(Lindmark)ら著,ジャーナルオブイムノロジカルメソッズ 第62巻:p.1−13(1983年))。マウスのすべてのアイソタイプおよびヒトγ3の場合、プロテインGが推奨される(ガス(Guss)ら著,EMBOジャーナル(EMBO J.)第5巻:p.1567−75(1986年))。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースまたはアクリルアミドであるが、他のマトリックスも使用できる。コントロールドポアガラスまたはポリ(スチレンジビニル)ベンゼンなど、機械的に安定したマトリックスを用いると、アガロースの場合に比べて、流速が速くなり、処理時間を短縮できる。CH3ドメインを含む抗体を精製する場合、ベーカーボンド(Bakerbond ABX)(商標)樹脂(J.T.ベーカー(J.T.Baker),ニュージャージー州フィリップスバーグ)が有用である。また、タンパク質精製のこれ以外の技法、たとえば、イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相HPLC(high performance liquid chromatography)、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース(商標)クロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラムなど)、クロマトフォーカシング、SDS−PAGEおよび硫酸アンモニウム沈殿なども、回収される抗体に応じて用いることができる。
本発明の方法の場合、抗体またはリソソーム酵素は、以下に限定されるものではないが、フィルターと、PVC(polyvinyl chloride)膜と、PDVF(polyvinylidene fluoride)膜と、PVCプレートと、タンパク質、マイクロキャリア、マクロ固相ビーズ、磁性ビーズに結合する他のプレート(たとえば、ポリスチレン、銀と金のバイメタルナノ粒子などのナノ粒子(ヤン スイ(Yan Cui)ら著,ジャーナルオブフィジカルケミストリー(J.Phys.Chem.)第B110巻(9号):p.4002−06(2006年)から製造される)と、ポリアミド膜(PAM:polyamide membrane)シート(サン(Sun)ら著,アナリティカルレターズ(Analytical Letters)第34巻:p.1627−37(2001年))など、種々の固体支持体に結合していてもよい。
ほとんどのタンパク質治療薬は、ある程度の抗体反応を惹起する。場合によっては、この抗体反応により、重篤な副作用または有効性の低下が起こることがある。本明細書では、特定の抗体のIgアイソタイプまたはサブクラスに関係なく、リソソーム酵素(LE)に対する全抗体反応を検出することができるアッセイを開発することを目指した。
リソソームコンパートメントでは、低pH(pH4〜4.5)であることとタンパク質分解とにより、抗体とrhASBなどのリソソーム酵素との相互作用が低下または解消される可能性があるため、抗LE抗体が直接酵素活性を阻害するとは考えられない。しかしながら、活性を中和する可能性は残っており、酵素治療の有効性に干渉すると考えられる。本明細書では、患者の酵素補充療法の一環として投与されるリソソーム酵素(LE)に対する中和抗体を検出するアッセイであって、この治療用結合タンパク質が酵素活性を示す条件下で、患者から単離された中和抗体が、LEに結合する能力を保持している、アッセイを開発することを目指した。
治療薬とその受容体との結合に干渉する中和抗体により薬の取り込みが制限されれば、薬剤処置の有効性が阻害されるであろう。したがって、抗体による受容体リガンドの中和を検出する方法の開発が、当該技術分野において引き続き求められている。本明細書では、同族LE受容体への結合に用いられる複数のエピトープをLE自体が持っている場合に、LE受容体によるLE取り込みを阻害する抗体を検出するアッセイを開発することを目指した。
薬物投与に対して過敏症反応を示した一部のヒト患者では、薬物特異的IgE抗体の増加を観察することができた。アナフィラキシーなどの極端なアレルギー反応には、IgEが介在するヒスタミン遊離または他の細胞機構が関連している可能性がある。アレルギー反応では、重要なアナライトは血清総IgEではなく、むしろMPS VI型疾患の酵素補充療法の過程で、rhASBなどの投与薬物に結合がすることができる総IgEの画分である。本明細書では、患者の体液中の大部分の抗体、特に抗rhASB抗体などのLE特異的抗体においてアイソタイプが異なる場合、とりわけIgGアイソタイプである場合に、LE特異的IgEアイソタイプ抗体を検出するアッセイの開発を目指した。
血清由来のヒトアリールスルファターゼB特異的抗体の検出
このアッセイ開発の目的は、組換えヒトアリールスルファターゼB(rhASB)の免疫原性を判定する方法を創出することにあった。
rhASBの緩衝液を標識化緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.8)に交換し、2mg/mLに濃縮した。標識化の直前に、MSD Sulfo−タグおよびビオチンの原液を調製した。このMSDタグおよびビオチンの原液を、1.25〜12倍モル過剰負荷比で加えた。
複数の人の未処置血清を用いて、アッセイで陽性結果となるシグナル(カットポイント)を判定するため、複数の未処置の人のアッセイシグナルの平均値を3回の反復実験から算出し、個々の平均値から標準偏差を計算した。この標準偏差に1.645、すなわち、片側95%信頼区間のt値を掛けた。カットポイントを95%信頼区間で設定し、偽陽性率は5%とした。
このアッセイにおいて検出可能だが、必ずしも定量、精製できるとは限らない、血清中のアナライトの最低濃度を判定するため、未処置のプール血清で50〜100,000ng/mLの抗体を調製した。各調製濃度の1:10希釈液からのシグナルと、未処置のプール血清の1:10希釈液からのシグナルとを比較検討した。
濃度反応関係に対する遊離薬物の作用を評価するため、0〜100ng/mLのrhASBを含む未処置ヒト血清で、0.5〜50μg/mLの親和性精製ヒト抗rhASBを調製した。総容量150μLにおいて、1:10サンプル希釈液からのシグナルと未処置血清の1:10希釈液とを比較検討した。rhASBの様々な血清濃度に対する検出限界を比較検討した。
濃度反応関係に対するマトリックス(すなわち、ヒト血清)の作用を評価するため、未処置のプール血清と、10%血清と、2%ブロッカー Aとで、50〜50,000ng/mLの親和性精製ポリクローナル抗体を調製した。1:10サンプル希釈液からのシグナルを様々な血清濃度において比較検討した。検出限界に近い正確度は、96〜110%であった。濃度が上昇するとばらつきも大きくなるが、報告値はタイター値で、検出限界に近い抗体濃度を与える希釈液から判定されるため、こうしたばらつきは、許容できるものである。
使用した試薬(3.5〜4.5μg/mLのRu−rhASBおよびビオチン−rhASB)およびインキュベーション時間(プレインキュベーション時間が14〜22時間およびストレプトアビジンアッセイプレートインキュベーション時間が20〜40分間)を変化させて用いてアッセイのロバストネスを評価した。その結果から、試薬濃度をわずかに変化させても、比較的高濃度の対照に対してはあまり影響がないが、ビオチン−ASB濃度がRu−ASB濃度よりも高い場合、100ng/mLの対照ではカットポイントを下回ることが示された。サンプル解析の過程でこの状態が生じた場合、低陽性対照を検出することができないため、このプレートを使用しないことになった。プレインキュベーション時間は、16時間から22時間までの幅があってもよく、すべての対照でシグナルに大きな変化はなかった。ストレプトアビジンアッセイプレートのインキュベーションは、25〜35分間の幅があってもよかった。
rhASBに対する抗体アッセイの特異性を判定するため、未処置ヒト血清中で抗rhASBまたは抗rhIDUのサンプルを試験した。100、1000または50,000ng/mLの抗rhASBを調製し、50,000ng/mLの抗IDUを調製した。対照としてrhIDUに対する抗体を選択した。rhIDUも、rhASBに特有ではないエピトープを介して抗体に特異的に結合することができるマンノース−6−リン酸の翻訳後修飾体を含むためである。50,000ng/mLの抗IDUのシグナルは、100ng/mLの抗rhASBのシグナルを下回っており、このアッセイが抗rhASB抗体に高度に特異的であることが明らかになった。
rhASB試薬に関する調製のロバストネスおよび保存の安定性の特性評価を行うため、rhASB試薬を複数のロットで調製し、これを用いて未処置ヒト血清に加えた精製抗体の同様のサンプルを解析した。3ロットのアリコートを、最初の4℃での7週間の保存期間後、4℃、−20℃および−70℃で保存した。2ヶ月間にわたり、保存温度の異なるアリコートを用いて、未処置ヒト血清に加えた精製抗体の等価サンプルを解析した。試薬の小ロットを複数作製し、これらを陽性対照希釈液を参照して検査して、試薬調製におけるロバストネスを試験した。ロット全体でばらつきが観察されたものの、感度は同等であった。保存条件下、3ロットを用いて安定性を試験した。保存条件は、3とおりの保存温度すべてで8週間維持された。インスタディバリデーションでは、試薬の安定性は最長6ヶ月であるが、継続調査に基づき期間がさらに長くなることが明らかになっている。
セクターPR400リーダーのシステムノイズを評価するため、溶液なし(ダークノイズ)または2倍リードバッファ TまたはMSD 遊離タグを用いてプレートを試験した。この3つのばらつきを、非コーティングプレート上と標準的なストレプトアビジンプレート上とで試験した。ダークノイズは、標準偏差がそれぞれ14および15であった。リードバッファは、標準偏差がそれぞれ18および14であった。遊離タグは、非コーティングプレート上の変動係数(CV:coefficient of variation)が1.2%であった。これらの数字については、96回の反復実験から算出した。いかなるアッセイ成分もない場合のシステムのばらつきは、許容できるものであり、サンプルの測定において、ばらつきの原因となる可能性はない。
精密度については、未希釈血清中で100、1000および50,000ng/mLの陽性対照に対して判定した。2名の分析者が、合計5日間にわたり、3種類のサンプルすべてから類似のシグナルを得た。17回の試験におけるG192のCV%は、50μg/mL、1μg/mL、100ng/mLおよび0ng/mLで、それぞれ19%、10%、10%および7%であった。2名の分析者は、合計3日間にわたり類似のタイター値を得た。6回の試験におけるタイター値は、各濃度の隣り合う2つの希釈倍率以下であった。
様々な保存条件に対する抗体サンプルの安定性を評価するため、対照を、複数の凍結融解サイクルと、4℃での複数日の保存と、1:10スクリーニング希釈液用の4℃での複数日の保存とに付した。抗rhASBの場合、未希釈血清または未希釈血清の1:10希釈液に対して、5回の凍結融解サイクルおよび4℃での3日間の保存を超えるサンプルの安定性を確立した。
血清のヒトα−グルコシダーゼ特異的抗体の検出
このアッセイ開発の目的は、ヒトα−グルコシダーゼ(rhGAA)の免疫原性を判定する方法を創造することであった。rhASBアッセイに導入したアッセイの改善点の多くを、rhGAAアッセイにおいて試験したが、すべてが成功したわけではなく、さらに最適化する必要があった。
実施例1でrhASBに関して記載したのと同様の要領でrhGAAを標識した。ビオチン−rhGAAとRu−rhGAAとの負荷率をともに約4にすると、標識率は約3となることが実験において明らかになった。その後最適化を行ったところ、標識率が約1〜2となり、シグナルを得るのに必要なrhGAA標識のバランスがとれると同時に、rhGAAにほとんど変化がなくエピトープのマスキングが回避される条件を特定することができた。
このアッセイにおいて検出可能だが、必ずしも定量、精製できるとは限らない、血清中のアナライトの最低濃度を判定するため、未処置のプール血清で50〜100,000ng/mLの抗体を調製した。各調製濃度の1:10希釈液からのシグナルと、対応する未処置のプール血清の希釈液からのシグナルとを比較検討した。
濃度反応関係に対するマトリックス(ラット血清)の作用を評価するため、2%ブロッカー Aに加えた0、5、10、25、50および100%の未処置のプール血清で、100〜10,000ng/mLの親和性精製ポリクローナル抗体を調製した。1:10サンプル希釈液からのシグナルと、0%血清中の1:10サンプル希釈液とを比較検討した。25%までの血清濃度では、正確度は67〜119%の範囲に維持された。
さらに、10μg/mLのrhGAAに加えた1:10サンプル希釈液からのシグナルと、2%ブロッカー Aに加えた1:10サンプル希釈液からのシグナルとを比較検討した。このアッセイは、遊離薬物に対する耐性はあったものの、サンプル希釈薬液中にrhGAAが10μg/mL存在すれば、陽性結果の確認試験としての役割を果たすことができた。この濃度は、この製剤の濃度の20%であるため、実際の患者サンプルでは生じる可能性がなかった血清濃度100μg/mLに相当する。
複数の人の未処置血清を用いて、アッセイで陽性結果となるシグナル(カットポイント)を判定するため、複数の未処置の人のアッセイシグナルの平均値を3回の反復実験から算出し、個々の平均値から標準偏差を計算した。カットポイントを95%信頼区間で設定し、偽陽性率は5%とした。標準偏差に1.645、すなわち、片側95%信頼区間のt値を掛けた。
rhGAAアッセイでは、カラムにおけるシグナルの減少によりプレートのアーチファクトが見られたが、これは、リードバッファの添加からプレートの読み取りまでの経過時間に起因していた。実施可能な対処法は、ばらつきがサンプル間ではなく、サンプル内に広がるプレートレイアウトを設計することであった。
リソソーム酵素中和抗体のアッセイ
rhASB活性中和抗体の存在を評価するため、バイオマリン(BioMarin)で精製rhASBのロットリリースアッセイとして以前開発された活性アッセイを改変した。rhASBの活性は、pH5.6で蛍光分子が蛍光発生基質から遊離するのを測定するもので、無血清条件において検証済みのアッセイである。このアッセイでは、合成基質である4−メチルウンベリフェリルスルファート(4−MUS:4−methylumbelliferyl sulfate)を用いるが、この基質は、rhASBによって遊離硫酸および4−メチルウンベリフェロン(4−MU:4−methylumbelliferone)に切断される。この活性アッセイは、ともに患者の血清中に様々な量で存在するリン酸塩および硫酸塩により阻害される。中和抗体の検出アッセイを作製するため、抗体単離の前処理ステップを開発し、抗体結合とrhASB酵素活性とがともに維持される条件においてリン酸塩および硫酸塩を除去した。
リン酸塩および硫酸塩から抗体を単離するため、プロテインA/Gによるアフィニティー精製ステップを選択した。プロテインA/G樹脂法では、酸性溶離ステップが必要になるが、その後、rhASB活性を測定する際にpH5.6に戻す必要がある。樹脂を試験する前に、20mLの0.1Mグリシン(pH2.70)については、1M Naアセテート6.9mL(pH7.20)あるいは2M Naアセテート3.4mL(pH7.29)でpH5.6に調整し得ることを確認した。トリス緩衝液についても様々なpH値およびモル濃度で調べたが、量のわずかな違いに過敏な反応を示した。Naアセテートの量の変化に対するpHの反応が低いため、1MのNaアセテート緩衝液を選択した。
単離ステップを用いると、ロットリリースアッセイと比較して緩衝液組成物が変化したことから、rhASB活性の直線性に対するこの緩衝液の変化の作用を評価した。0〜62.5ng/mLのrhASB原液10μLと、40μLのグリシン/アセテート緩衝液とを混合し、次いで4−MUS基質とともに20分間インキュベートした。このグリシン/アセテート緩衝液系は、スルファターゼ活性を阻止するグリシン/カルボナート停止溶液の能力に影響を与えず、すでに観察された直線性および時間に対するロバストネスは、維持された。
このアッセイの特異性を試験するため、12.5ng/mLのrhASBを、未処置血清に加えた0〜150μg/mLの様々な抗rhASB抗体(G192、BP14、BP15、J3549、J3550)、および未処置血清に加えた40および150μg/mLの抗アウドラザイム(組換えヒトイズロニダーゼ(IDU))抗体(BP 13)とともにプレインキュベートした。rhASB活性のレベルを、未処置血清および緩衝液と抗体との比較で検討した。
陽性と見なす最低のシグナルを判定するため、50種の未処置血清を試験して信頼区間(CI:confidence interval)を設定した。未処置血清は、かなり広範囲に分布し、負のバイアスが示された。低下が統計学的に有意であることが90%確実になるよう、片側t検定でカットポイントを10%(平均値プラス標準偏差(SD)の1.282倍)に設定した。95%信頼区間は、15%(平均値プラスSDの1.645倍)であった。99%信頼区間は、25%(平均値プラスSDの2.326倍)であった。サンプル解析には、90%信頼区間を選択した。
先の実験において、ウサギ血清の親和性精製BP15 IgGポリクローナル抗体は、rhASBの酵素活性を中和できることが示された。抗体または阻害血清を用いないrhASBからのシグナルを100%と判定した。11.8μg/mLのBP15とともにインキュベートしたrhASBからのシグナルは、54%減少した。したがって、このアッセイは、異なる緩衝液条件でrhASBの阻害を検出することが可能であった。
以前の薬物動態解析において、注入療法を24週間行ってから5時間後の患者では、血漿中のrhASBが100ng/mL未満の患者が50%を超え、いずれの患者も663ng/mL以下であることが明らかになった。遊離薬物の作用を評価するため、10〜150μg/mLの抗rhASBを、0〜1000ng/mLのrhASBを含む未処置血清で調製した。血清サンプル中の遊離rhASBが抗体精製ステップを通じて保持されれば、活性アッセイにおけるシグナルが高まり、抗体による減少がマスクされる可能性がある。rhASBの濃度ごとに、0ng/mLのrhASBに対する相対的な正確度を算出した。
抗体活性反応の関係に対するマトリックス(血清など)の作用を評価するため、プロテインA/G樹脂法を用いて血清を調製し、この血清サンプルに対するrhASBの活性と、緩衝液単独の活性とを比較検討した。血清はアッセイに干渉することがすでに明らかになっていたため、サンプル調製ステップの能力を評価して、干渉の除去における有効性を判定した。3回の実験において、未処置血清は、緩衝液対照の10%以内にあり、抗体精製ステップでは、血清干渉が活性アッセイから効果的に除去されることが示された。
複数のサンプル調製において血清中の抗体に対して同等の活性抑制を与えるアッセイの性能を判定するため、抗体調製物の個々のアリコートを、プロテインA/G精製ステップにより試験し、分析者間および日数間で比較検討した。アッセイは優れた再現性を示し、CVは5.6〜23.4%で、検出限界に近づくと観察されたCVは高くなった。このサンプル解析の精密度は、通常の使用時において信頼性を示す指標となる。
さらに、方法のパラメータをわずかだが故意に変動させても影響を受けないアッセイの性能を判定し、通常の使用時における信頼性の指標を示す必要もあった。
様々な保存条件に対する抗体サンプルの安定性を評価するため、対照を、複数の凍結融解サイクル、4℃での複数日の保存および抗体溶出液用の4℃での複数日の保存に付した。抗rhASBの場合、5回の凍結融解サイクルおよび未希釈血清用の4℃での4日間の保存を超えるサンプルの安定性を確立した。抗体溶出液の保存は、正確度が不十分であったため、アッセイの実施には望ましくない。
酵素/受容体結合に干渉する抗酵素抗体の測定
リソソーム酵素(LE)治療が成功するには、LEは細胞に取り込まれ、リソソームを標的にしなければならない。この取り込み機構は、主にLEのマンノース−6−リン酸残基のカルシウム非依存性マンノース−6−リン酸受容体(CIMPR)への結合によるものである。取り込みには、この受容体への結合が、必要かつ十分であることが明らかにされている(ディンチスら,ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー 第269巻:p.12159−66(1994年))。したがって、CIMPR結合の中和を評価するアッセイの場合は、受容体介在性の取り込みの中和に関する代理アッセイとして使用することができる。
CIMPRの可溶性細胞外ドメイン(sCIMPR)を、ホスホマンナンアフィニティーカラムに続いて酸性のサイズ排除クロマトグラフィーを用いてウシ胎仔血清から精製した(バレンザノ(Valenzano)ら著,アナリティカルバイオケミストリー(Analytical Biochemistry)第209巻:p.156−162(1993年))。細胞外ドメイン(分子量250kDa)は、正常なCIMPR分子(分子量275kDa)をおよそ90%含むものである。
ビオチン−rhASBを実施例1に記載されているように調製した。酵素活性の代わりに用いるビオチン−rhASBによる検出の能力を評価するため、一連のサンプルを両方の検出方法で調べた。サンプルは、ブロッキング緩衝液単独と、未処置血清と、受容体結合の阻害で知られている抗rhASBポリクローナル抗体の希釈液シリーズ(BP 14またはBP15)とを含んだ。
陽性と見なす最低のシグナルを判定するため、50種の未処置血清を試験して、未処置のプール血清に対するシグナル低下に関する95%信頼区間(CI)を設定した。低下が統計学的に有意であることが95%確実になるよう、片側t検定でカットポイントを8.5%(標準偏差(SD)の1.645倍)で設定した。さらに、99%信頼区間も11.5%(SDの2.326倍)で算出した。
アッセイの特異性を、サンプル血清と同じようにインキュベートした抗rhIDU(BP 13)を用いて判定した。抗rhIDUは、抗血清の同じ希釈液ではrhASB−sCIMPR結合に大きな変化を引き起こさず、未処置血清にスパイクした場合は125μg/mLまでrhASB−sCIMPR結合に大きな変化を引き起こさなかった。
カットポイントを超えてrhASB/sCIMPR結合を中和できる抗体の最低濃度の希釈液を設定するため、精製G192を、15、20、25、30、35、40、45および50μg/mLの希釈液シリーズに加えた未処置ヒト血清にスパイクした。35μg/mLでは、カットポイント8.5%を超えて結合を低減できたが、ばらつきが非常に大きかった。許容可能な精密度で結合を低減できた最低濃度は、45μg/mLであった。酵素活性を阻害することができる抗体の母集団はごく一部にとどまる可能性があるため、LODは、約45μg/mL以下と記録する方がより正確である。
注入療法を24週間行ってから5時間後の患者では、血漿中のrhASBが100ng/mL未満の患者が50%を超え、いずれの患者も663ng/mL以下であることが明らかになった。血清サンプル中の遊離rhASBは、sCIMPRの結合部位に対して競合することでビオチン−rhASBの結合を阻害する可能性があった。抗体による結合阻害を抑制する遊離rhASBの能力を調べるため、rhASBを増量(10、50および100ng/mL)させながら、低濃度(10μg/mL)、中濃度(50μg/mL)および高濃度(100μg/mL)でBP14とともに10%血清に加えてインキュベートし、標準的な条件における結合と比較検討した。rhASBの濃度ごとに、0ng/mLのrhASBに対する相対的な正確度を算出した。
濃度反応関係に対するマトリックス(血清など)の作用を評価するため、10〜100μg/mLの抗rhASB抗体を0〜20%ヒト血清で希釈した。結果からは、20%血清ではrhASB−sCIMPR結合の中和測定値が50%以上減少することが明らかになった。10%血清では、シグナルの減少は0%血清と比べて2.5〜12%であった。したがって、推奨する最小希釈倍率は10である。
2名の分析者が、43、72および125μg/mLの抗rhASBの一連の品質管理サンプルを複数日にわたり評価した。アッセイ内の精密度を単一プレート上の反復実験において評価したところ、CVは1〜15%であった。アッセイ間の精密度をすべての反復実験における変動係数として評価したところ、6つのプレートでは5〜7%であった。
インキュベーション温度およびビオチン−rhASBの濃度など、アッセイパラメータのわずかな変動を調べて、アッセイ性能への影響を判定した。方法のパラメータがわずかに変動しても、アッセイの変動性は、LODでは25%を超えることがなく、これ以外では20%を超えることがなかった。
様々な保存条件に対する抗体サンプルの安定性を評価するため、対照に複数の凍結融解サイクルを施した。抗rhASBでは、3回を超える凍結融解サイクルでサンプルの安定性を確立した。
IgEアイソタイプの抗rhASB抗体の測定
ヒト血清中のrhASB特異的IgE抗体の存在を、未処置ヒト母集団の血清サンプルが示す反応範囲と比較して検出できるように逆イムノアッセイ(抗rhASB IgE ELISA)を開発した。このアッセイでは、ELISAマルチウェルプレートへの抗ヒトIgE抗体の結合と、IgE抗体への血清サンプルの結合と、ビオチン化rhASBおよびストレプトアビジン−HRPコンジュゲートによる検出とが行われる。
アッセイにおいて検出可能だが、必ずしも定量できるとは限らないアナライトの最低濃度を特定するため、一連の未処理ヒト血清(50サンプル)を試験して、IgEのベースラインバックグラウンドの制御範囲を設定した。50種のヒト血清サンプルについて、個々に未処置血清のシグナル分布を判定した。プールロットとの差をアッセイプレートごとに算出した。平均および標準偏差については、個々のシグナルから算出した。95%信頼区間に関しては、0.030(SDの1.645倍)として算出した。95%信頼区間をカットポイント係数として用い、次いでこれを各アッセイプレート上の未処置血清プールの平均値に加え、プレートカットポイントを得た。95%CIを用いると、偽陽性率はおよそ5%(95%信頼区間)になる。試験対象の50種の未処置ヒト血清サンプルのうち、3種では吸光度値がカットポイントを上回り、偽陽性率は6%であった。
LODは、反応の測定平均値が、未処置のプールヒト血清の平均値とカットポイント係数との和を上回るアナライト濃度とした。ヒトIgE抗rhASBは入手できなかったため、0.41〜300ng/mLのウサギIgG抗rhASBおよび代替の捕獲抗体を用いて検出限界を推計した。0.41ng/mL以下の濃度では、プレートのカットポイントを下回った。したがって、約1.23ng/mLをこのアッセイのLODと見なすことができる。
抗rhASB IgEの検出の特異性を試験するため、検証の過程で、いくつかのパラメータを調べた。シグナルがrhASB特異的抗体に起因することを確認するため、非標識rhASBをビオチン−rhASBとのインキュベーションの過程で加え、ウサギIgG抗rhASBに対するrhASB特異的な競合を明らかにした。2000ng/mLを加えると、20および50ng/mLの抗rhASB対照ではそれぞれ、64.6%および52.1%の阻害率が観察された。さらに、50ng/mLのウサギ抗rhIDU抗体では、シグナルはLODを有意に下回り、吸光度は、緩衝液のバックグラウンドレベルとほぼ等しかった。これらの結果から、このアッセイはrhASB抗体に特異的であることが明らかになった。
IgEサンプルは、過敏症反応の後、すぐに採取することができるため、注入によるrhASBがかなりの量で存在し得る可能性がある。
濃度反応関係に対する血清の作用を評価するため、1%、2%および10%ヒト血清がウサギIgG抗rhASB標準物質の正確度に及ぼす作用を判定した。
適切な捕獲抗体を同定するため、ヒトIgGおよびヒトIgEの曲線をプレート上でコーティングし、ビオチンまたはHRPで直接標識した様々な抗ヒトIgEで検出した。アッセイ開発用に選択した抗体のシグナルは、0.41ng/mLのIgEよりも300ng/mLのIgGの方が低かった。この約730倍の差から、総IgGよりも総IgEが優先的に捕獲されることが確認される。一部のIgGが捕獲されることもあるが、検出可能なrhASBに特異的に結合するIgG抗体は、そのように誤って捕獲されたIgGのごく一部にすぎないであろう。
アッセイ内およびアッセイ間の精密度を、低濃度(0.4ng/mL)、中濃度(3ng/mL)および高濃度(20ng/mL)でウサギIgG抗rhASBを試験して調べた。アッセイ内の精密度については、三重反復サンプルからCV%として算出し、6つのプレートにおいて1〜5%以内であった。アッセイ間の精密度については、6つのプレートにおける平均値のCV%として算出し、2〜11%以内にあり、濃度が下がるとCV%が上昇した。
ロバストネスアッセイでは、標準濃度の10%の変動までアッセイが正確に測定できることが示され、サンプルに対する複数回の凍結融解の影響は、アッセイ結果には認められない。
様々な保存条件に対する抗体サンプルの安定性を評価するため、サンプルに複数の凍結融解サイクルを施した。ウサギIgG抗rhASBでは、3回を超える凍結融解サイクルでサンプルの安定性を確立した。
Claims (40)
- ヒトのリソソーム酵素(LE)特異的抗体を検出する方法であって:
(a)前記ヒト由来の体液サンプルと、捕獲部分で標識した第1のリソソーム酵素および検出部分で標識した第2のリソソーム酵素とを接触させて、LE特異的抗体/リソソーム酵素複合体を形成するステップと、
(b)前記LE特異的抗体/リソソーム酵素複合体と、前記捕獲部分に特異的に結合する固体支持体とを接触させて、ステップ(a)の前記LE特異的抗体/リソソーム酵素を捕獲するステップと、
(c)前記検出部分で標識した前記第2のリソソーム酵素の存在を検出することで前記体液サンプルから捕獲したLE特異的抗体の存在を検出するステップと
を含む、方法。 - 前記第1のリソソーム酵素の前記捕獲部分は、非共有結合性相互作用により前記固体支持体に結合している、請求項1に記載の方法。
- 前記非共有結合性相互作用は、ビオチン−アビジン相互作用である、請求項2に記載の方法。
- 前記体液と、第1のリソソーム酵素と、第2のリソソーム酵素とはすべて、同じ溶液中で接触している、請求項1に記載の方法。
- 前記体液と、第1のリソソーム酵素と、第2のリソソーム酵素とは、ステップ(b)の前に少なくとも約30分間接触している、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のリソソーム酵素のモル濃度は、前記第2のリソソーム酵素のモル濃度とほぼ同じか、それよりも低い、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のリソソーム酵素および前記第2のリソソーム酵素は、ほぼ等モル比で用いられる、請求項1に記載の方法。
- 検出限界は、約500ng/mL未満である、請求項1に記載の方法。
- 検出限界は、約100ng/mL未満である、請求項1に記載の方法。
- 検出限界は、約1.7ng/mL〜約8.5ng/mLである、請求項1に記載の方法。
- LE特異的抗体は、ヒト、カニクイザル、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよびマウスからなる群から選択される種から検出することができる、請求項1に記載の方法。
- 前記種は、ヒトである、請求項11に記載の方法。
- 前記体液は、血清である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2のリソソーム酵素は、組換えヒトアリールスルファターゼ(rhASB)である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2のリソソーム酵素は、組換えヒトα−グルコシダーゼ(rhGAA)である、請求項1に記載の方法。
- ヒトのリソソーム酵素(LE)特異的抗体を検出する方法であって:
(a)前記ヒト由来の体液サンプルと、固体支持体に結合した第1のリソソーム酵素とを接触させることで、前記体液サンプル中の前記LE特異的抗体を捕獲するステップと、
(b)ステップ(a)で捕獲したLE特異的抗体と、検出部分で標識した第2のリソソーム酵素とを接触させるステップと、
(c)前記検出部分で標識した前記第2のリソソーム酵素の存在を検出することで、前記血清サンプルから捕獲したLE特異的抗体の存在を検出するステップと
を含む、方法。 - ヒトのリソソーム酵素(LE)の中和抗体を検出する方法であって:
(a)前記ヒトの体液サンプル中のリン酸イオンおよび硫酸イオンから抗体を単離するステップと、
(b)ステップ(a)の前記単離した抗体とリソソーム酵素とを接触させて、LE特異的抗体/リソソーム酵素複合体を形成するステップと、
(c)酵素基質を加えるステップと、
(d)前記体液サンプル中の前記単離した抗体の存在下および非存在下で前記リソソーム酵素による前記酵素基質の切断量を検出するステップと
を含み、前記単離した抗体が存在しない場合に比べて存在する場合の方が切断が減少していることから、前記体液サンプル中にLEの中和抗体が存在することが示される、方法。 - ステップ(a)は、前記体液サンプルとプロテインA/G樹脂とを接触させることで行われる、請求項17に記載の方法。
- 前記LEは、組換えヒトアリールスルファターゼB(rhASB)であり、前記酵素基質は、4−メチルウンベリフェリルスルファート(4−MUS)である、請求項17に記載の方法。
- 検出限界は、約7.5μg/mL以下である、請求項17に記載の方法。
- 前記体液は、血清である、請求項17に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素は、組換えヒトアリールスルファターゼ(rhASB)である、請求項17に記載の方法。
- ヒトのリソソーム酵素(LE)の取り込みを阻害する抗体を検出する方法であって:
(a)検出部分で標識したリソソーム酵素と前記ヒト由来の体液サンプルとをインキュベートするステップと、
(b)ステップ(a)のインキュベーション混合物と、固体支持体に結合しているLE受容体またはそのLE結合フラグメントとを接触させるステップと、
(c)ステップ(a)の前記検出部分で標識した前記リソソーム酵素が前記LE受容体またはそのLE結合フラグメントに結合したことを検出するステップとを
含み、前記体液サンプルの存在下での結合の減少から、前記体液サンプルは、LEの取り込みを阻害する抗体を含むことが示される、方法。 - 前記リソソーム酵素は、ビオチンとの結合により標識され、ストレプトアビジン蛍光標識を用いて検出される、請求項23に記載の方法。
- 前記LE受容体またはそのLE結合フラグメントは、非共有結合性相互作用により前記固体支持体に結合している、請求項23に記載の方法。
- 前記インキュベーションステップ(a)は、少なくとも約30分間行われる、請求項23に記載の方法。
- 前記接触ステップ(b)は、少なくとも約1時間行われる、請求項23に記載の方法。
- 前記LEは、マンノース−6−リン酸を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記LEは、組換えヒトアリールスルファターゼ(rhASB)であり、前記LE受容体は、CIMPRまたはそのrhASB結合フラグメントである、請求項23に記載の方法。
- 前記CIMPRは、CIMPRの可溶性細胞外ドメイン(sCIMPR)またはそのrhASB結合フラグメントである、請求項29に記載の方法。
- 検出限界は、約45μg/mL以下である、請求項23に記載の方法。
- 前記体液は、血清である、請求項23に記載の方法。
- ヒトのIgEアイソタイプのリソソーム酵素(LE)特異的抗体を検出する方法であって:
(a)前記ヒト由来の体液サンプルと固体支持体に結合したIgE特異的抗体とを接触させることで、前記体液サンプル中のIgEを捕獲するステップと、
(b)ステップ(a)で捕獲されたIgEと検出部分で標識したリソソーム酵素とを接触させるステップと、
(c)前記検出部分で標識したリソソーム酵素の量を検出することで、前記血清サンプル中のIgEアイソタイプLE特異的抗体の量を検出するステップと
を含む、方法。 - 前記IgE特異的抗体は、非共有結合性相互作用により前記固体支持体に結合している、請求項33に記載の方法。
- 前記非共有結合性相互作用は、ビオチン−アビジン相互作用である、請求項34に記載の方法。
- IgGがIgEよりも少なくとも約730倍高い濃度で存在する場合、前記IgE特異的抗体は、IgGに対して検出可能な交差反応を示さない、請求項33に記載の方法。
- ステップ(a)の後に第1の洗浄ステップが行われ、ステップ(b)の後に第2の洗浄ステップが行われる、請求項33に記載の方法。
- 検出限界は、ヒトIgEで約1.23ng/mlである、請求項33に記載の方法。
- 前記体液は、血清である、請求項33に記載の方法。
- 前記LEは、組換えヒトアリールスルファターゼB(rhASB)である、請求項33に記載の方法。
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- 2009-02-25 HK HK09101774.1A patent/HK1121530A1/xx not_active IP Right Cessation
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