JP2009517068A - 単細胞生物の培養方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、地下微生物の培養物の生成方法であって、地下貯留層から加圧流体の試料を取得し、前記試料を加圧下で保持しながら発酵反応器へ移動させ、前記反応器において前記試料を高圧でインキュベーションすることを含むことを特徴とする地下微生物の培養物の生成方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、単細胞生物、特に、例えば真正細菌や古細菌といった原核生物の培養方法、その装置、このような生物の地下での利用における用途および阻害、このような新規な生物、ならびにそれらを含む組成およびライブラリに関する。

天然の地下炭化水素貯留層から供給される油源およびガス源には限りがある。そのため、このような貯留層からの炭化水素回収を最大活用することが重要である。このために多くの技術が用いられているが、新たな技術が引き続き必要とされている。

多くの人が驚いたことに、このような貯留層における炭化水素を含んだ岩石は、地下何千メートルという所にあり、非常な高温および高圧下にあったとしても無菌ではない。単細胞生物、特に、真正細菌や古細菌等の原核生物が存在している。このような微生物を炭化水素の生成に関与していることも提案されてきた。

我々は、このような内生微生物の増殖を促進または阻害したり、地下岩層から単離した微生物の培養物を導入することで、貯留層の管理を向上させる手段が得られることに気付いた。しかしながら、これを行うためには、このような微生物を収集および培養し、適切な場合、増殖阻害手段を発見するために試さなければならない。

地下岩層から回収した微生物は周囲地表条件で培養されていたが、驚いたことに、貯留層自体の物理化学的条件と類似した条件で培養を行った場合、特に、貯留層から採取した試料を培養前および最中に高圧で保持した場合、単離および試験し得る微生物の分布範囲が著しく広いことを発見した。

液体は、ガスと異なり圧縮性に非常に乏しいため、これは大いに驚くべきことである。上述のように、液体培地中の細菌は、本質的に、周囲を液体で囲まれた液体充填膜であり、膜全体にわたる圧力差は、存在するとしても、無視できるものである。したがって、細菌増殖は、本質的に、培地の圧力の影響を受けないものと予想されるであろう。しかしながら、これは事実ではないと判明する。というのも、我々は、炭化水素試料を高圧下および周囲圧力下で培養した結果、全く異なる生物が増殖し、特に、高圧状態で増殖した生物の中には、周囲（すなわち、地表）圧力では全く増殖しないものもあることを発見したからである。さらに、これらの好圧性生物により用いられる酵素の中には、おそらく三次構造の違いに起因して、周囲圧力では機能しないように思われるものもある。

このように、個々の地下微生物を培養することは知られているが、地表条件で成長しない微生物を含む多数の微生物で構成される地下生態系を培養することは、これまで知られていない。ダウンホール処理の効果を実験室条件において再現しようとすると、本発明の新たな方法を用いることが必要である。

したがって、一局面から見ると、本発明は、地下微生物の培養物の生成方法であって、地下貯留層、例えばこのような貯留層からの流体流れから加圧流体の試料を取得し、前記試料を加圧下で保持しながら発酵反応器へ移動させ、前記反応器において前記試料を高圧で、好ましくはさらに高温でインキュベーションすることを含む地下微生物の培養物の生成方法を提供する。

試料は、一般に、１００〜９００バール、好ましくは２３０〜２８０バール、特に好ましくは試料を採取した貯留層の圧力または培養した微生物で処理される構成物の圧力の５０〜１５０％、とりわけ８０〜１２０％、特に９０〜１１０％の圧力で培養されるであろう。

試料は、液体炭化水素試料であることが好ましいが、水性試料を用いても良い。一般的に、貯留層から採取した試料には、ガス、脂質、有機酸等が含まれる。

インキュベーション温度は、一般に、６０〜１６０℃、好ましくは８０〜１００℃、特に好ましくは試料を採取した貯留層または培養した微生物で処理される構成物の温度から２０℃以内、特に１０℃以内であろう。

発酵反応器への移動前、最中または後に試料を栄養素と混合させることでインキュベーションを行うことが好ましい。栄養素は、鉱物および／またはビタミンを含んでいても良いが、少なくとも粉岩、特に好ましくは試料を採取した貯留層もしくは培養した微生物で処理される構成物からの岩石、または地質学的にこのような貯留岩石に匹敵する岩石の粉末を含んでいることが好ましい。栄養素は、必要に応じ、試料を採取する貯留層からの流体も含み得る。一般的に、貯留層の流体は、微生物が増殖するための炭素源を供給するであろう。一般的に、発酵が進行すると、異なる栄養素または阻害剤を添加して微生物の増殖に与える影響を調べても良い。

本発明の方法におけるインキュベーションは、一般に、７〜３６０日間、特に１８０〜２４０日間行われるであろう。微生物の増殖が起こらなかったり、予め設定した許容レベルに達するとインキュベーションが終了するよう、必要に応じ、インキュベーションをモニターおよび制御しても良い。モニターは、ｉｎ ｓｉｔｕで行ったり、発酵反応器から抽出した材料に対して行っても良く、いかなる適切な方法で行っても良い。したがって、例えば試料の濁度、栄養物質における放射性トレーサの採取量、有機固形含有量等は、一般に、モニターするパラメータとして用いても良い。モニターは、一般に、培地のアリコートを引き出し、例えばＧＣ、ＬＣ−ＭＳ、ＭＳ等により分析して、ガス発生もしくは消費または脂質プロファイルを示すように行っても良い。

一旦十分な微生物の増殖が起きると、一般的に、培養物において増殖した微生物を特定することが望ましいであろう。これは、細胞溶解の後に（例えばＤＮＡ分解酵素またはＲＮＡ分解酵素を用いて）核酸を分解し、（例えば原核生物またはその群に一般的なプライマーを用いたＰＣＲにより）断片を複製し、（例えばゲル電気泳動を用いて）断片を分離することにより容易に行うことができる。そして、断片の「シグネチャ」を原核生物の核酸断片のデータベースと比較することで、どの微生物が培養物に存在し、これらのいずれかが新規であるかどうかを調べても良い。新規な微生物が発見された場合、一般的に、それを単離し、ことによると配列を決定することが望ましいであろう。単離は、一般に、希釈の後にインキュベーションを行う、すなわち従来の技術を用いながらも高圧でインキュベーションすることにより行なっても良い。配列決定は、従来の技術により行なっても良い。

単一の微生物または組み合わせによる微生物の生存可能な試料が所望される場合、例えば少なくとも１０時間、好ましくは少なくとも２４時間にわたり、培養物を非常にゆっくり周囲圧力および温度下に置くことにより、これを実現しても良い。必要に応じ、減圧中に培養物を電界のバーストにさらして電気穿孔（electroporosis）を起こし、細胞性膜にわたる圧力差を軽減しても良い。

そして、例えば遠心分離、無菌流体における再懸濁、再遠心分離等の従来の手段により、微生物を培養物から分離しても良い。そして、必要に応じ、その結果生じた物質を、貯蔵および／または輸送用に凍結乾燥しても良い。使用される流体は、一般に、鉱物油またはグリセロールであろう。

しかしながら、培養物の試料は、例えばインキュベーションを行った圧力で、加圧容器内に貯蔵されることがより好ましい。このような加圧試料およびそのライブラリは、本発明のさらなる局面を構成する。

このような一局面から見ると、本発明は、加圧容器であって、例えは１００〜９００バール、特に２００〜３５０バールの内部圧力を有し、任意にヒドロカルビル流体（例えばグリセロールまたは鉱物油）中に、微生物を収容し、好ましくはバルブ付き試料採取口を備えた加圧容器を提供する。さらなる局面から見ると、本発明は、微生物ライブラリであって、このような加圧容器を複数、例えば少なくとも１０、好ましくは少なくとも１００含む微生物ライブラリを提供する。

加圧下にありながらも周囲温度または（例えば液体窒素温度に至る）周囲以下の温度で培養物を貯蔵することは実行可能である。なぜなら、このような条件下にある地下微生物は、本質的に、休眠中であると考えられるためである。

本発明の方法において、異なる地下状態を模倣するため、インキュベーションしている混合物の含有量は異なっていても良い。したがって、例えば硫酸塩、塩、水、メタン、窒素および二酸化炭素含有量は、水が炭化水素支持層に浸透する時に発生する条件、炭化水素回収を向上させるために水、天然ガス、窒素もしくは二酸化炭素を貯留層に注入する時の条件、または（例えばスケール防止剤を投与するために）生産井戸に圧搾を加えてダウンホール井戸処理を行う時に発生する条件を模倣するために異なっていても良い。このように、インキュベーション中の培養物の増殖から、微生物の増殖に適した条件、微生物の増殖を抑制するのに適した条件、（例えば水の流れを妨げるため）バイオマスを生成するためにインジェクションダウンホールに適した微生物等を決定することができる。

そして、このような因子が決定されると、微生物の増殖を促進または抑制することを目的としたダウンホール処理を行うことができる。これは、本発明のさらなる局面を構成する。

したがって、さらなる局面から見ると、本発明は、地下貯留層処理プロセスであって、微生物の培養物を、任意に前記微生物の栄養素と共に、前記貯留層に注入することを含み、前記培養物は、高圧培養によって生成されたものである地下貯留層処理プロセス、例えば炭化水素の井戸の処理プロセスを提供する。

さらなる局面から見ると、本発明は、地下炭化水素貯留層からの炭化水素回収を向上させるプロセスであって、流体を前記貯留層に注入して炭化水素を生産井戸に至らしめることを含み、前記流体の組成は、例えば本発明の方法の性能に基づき、前記貯留層に内生する微生物の増殖を阻害または促進するように予め選択されている地下炭化水素貯留層からの炭化水素回収を向上させるプロセスを提供する。

その際用いられる駆動流体は、一般に、水、窒素、メタンまたは二酸化炭素であり、二酸化炭素であることが好ましい。流体の組成は、例えば内生微生物を水性条件で増殖させ、すなわちバイオマスが貯留層の水性ゾーンにおいて増加することで岩石の細孔を詰まらせ、生産井戸への水の流れを軽減させる栄養素を含むように選択しても良い。このような栄養素は、一般に、水溶性鉱物塩を含んでいても良い。

このような工程は、一般に、井戸処理を行うための圧搾や炭化水素回収を向上させるための流体注入における従来の注入条件を伴うものであり、よってさらなる詳細な説明は必要ない。

本発明の方法が新規な、すなわち今まで知られていなかった微生物を産出する場合、それらを含み岩石を伴わない組成に関して、これらは本発明のさらなる局面を構成する。このような組成は、乾燥（例えば、任意に例えば糖といった凍結保護剤と共に親水化）させてもよく、または液体で加圧下もしくは周囲圧力下にあっても良い。液体の場合、溶媒は、例えば鉱物油またはグリセロールといった、微生物が発見された天然の炭化水素以外の有機溶媒であることが好ましい。

本発明の方法は、一般に、ダウンホールの圧力で動作可能な発酵反応器において行われる。これは、一般的にガラス容器や薄い金属外皮の容器である従来の発酵反応器と全く異なる。このような高圧反応器は、本発明のさらなる局面を構成する。この局面から見ると、本発明は、微生物発酵反応器であって、吸気口と、好ましくは試料除去口とを有するインキュベーションチャンバを含み、前記チャンバの壁は、少なくとも１８０バール、より好ましくは少なくとも２００バール、特に少なくとも３００バール、とりわけ９００バールに至る圧力差に耐えられるよう十分な強度を有する材料からなることを特徴とする微生物発酵反応器を提供する。

本発明の反応器は、バルブに加え、発酵モニターおよび熱源を備えていることが好ましい。ここで、前記バルブは、例えば５０バール／時間未満、好ましくは１０バール／時間未満、さらに好ましくは１バール／時間未満の速度でチャンバ内の圧力をゆっくり下げる動作が可能なバルブである。一般に、熱源はインキュベーションチャンバに不可欠であるが、実験室規模では、反応器を単にオーブン内に設置するだけで良い。

ダウンホールの試料は、井戸内の炭化水素が侵入する地点またはその近くで収集しても良い。このようにして試料を取ることができる装置は既に知られている。しかしながら、試料は、加圧ディスプレーションセル（pressurized displacement cell）を用いて地面から離れた後に加圧流体流れから採取することが好ましい。そして、流体試料の高温を保持するため、それを発酵反応器に移動させる前に、加圧ディスプレーションセルを絶縁するか加熱容器内に設置することが好ましい。異なる貯留層のゾーンから異なる微生物フローラを検出することができるよう、試料は、必要に応じ、貯留層からの異なる流れラインが合流する前に、それら異なる流れラインから採取しても良い。

試料の採取から発酵反応器への移動に至るまで、試料の圧力を保持することが重要である。さもなければ、圧力低下に弱い微生物は断片化し、反応器内で増殖しないであろう。さらに、圧力および温度を保持することで、増殖培地は、溶解ガス含有量等に関してダウンホールの状態に確実に近似するようになる。

ここで、添付の図面を参照して本発明を説明する。

図１、図５および図６は、本発明による反応器の概略図である。

図２および図３は、図１の反応器を用いて培養された試料および対照条件で培養された試料のゲル電気泳動パターンである。

図４は、本発明の方法により生成された培養物および対照ランにおいて生成された培養物における微生物の数および種類を示す棒グラフである。

図１を参照すると、開口シリンダ１の水平断面が示されている。これは、３１６スチールまたはハステロイＣを機械加工したもので、３５０バールの圧力に耐えられる。

シリンダ１の開放端は、Ｏリングが溝３に組み込まれ、流体の追加または除去のための中心孔４を有するテーパプラグ２により閉ざされていても良い。プラグ２は、シリンダ１の開口部における内部ねじと係合する中空のねじ込みボルト５により所定の位置に保持される。ボルト５を締めたり緩めたりする間のプラグ２の回転が最小限に抑えられるよう、プラグ２とボルト５の間にワッシャー（図示せず）を設置することが好ましい。

図２および図３を参照すると、２１種類の培養物のＤＧＧＥパターンが示されている。ＣＨＰと指定されたものは、１バールで培養された対照試料である文字Ｋを含む指定を除き、貯留層条件で採取および培養された試料のものである。ＣＨＰ−Ｋ試料において増殖しなかった細菌が、ＣＨＰ試料において増殖したことが分かるであろう。

図２は、真正細菌に一般的なプライマーを用いて増幅した試験試料に関する。図３は、古細菌（Achaea）に一般的なプライマーを用いて増幅した試験試料に関する。

図４は、貯留層から採取した４つの異なる試料を高圧（圧力セル）および周囲圧力（対照）のいずれかにおいて培養し、その結果生じた培養物にＰＣＲ増幅を行って生成したクローンの数を示している。

図５および図６はそれぞれ、３１６スチールのシリンダ２１、ＪＭ７（アルミ青銅）のボルト２２、テフロン（登録商標）プランジャー２３、ＪＭ７のディスク２４、３１６スチールのプラグ２５およびヴァイトン（登録商標）Ｏリング２６を示す、分解および組み立て図である。

図１は、本発明による反応器の概略図である。 図２は、図１の反応器を用いて培養された試料および対照条件で培養された試料のゲル電気泳動パターンである。 図３は、図１の反応器を用いて培養された試料および対照条件で培養された試料のゲル電気泳動パターンである。 図４は、本発明の方法により生成された培養物および対照ランにおいて生成された培養物における微生物の数および種類を示す棒グラフである。 図５は、本発明による反応器の概略図である。 図６は、本発明による反応器の概略図である。

Claims (18)

1. 地下貯留層から加圧流体の試料を取得し、前記試料を加圧下で保持しながら発酵反応器へ移動させ、前記反応器において前記試料を高圧でインキュベーションすることを含む、地下微生物の培養物の生成方法。
2. 前記試料は、前記反応器において高温でインキュベーションされる、請求項１記載の方法。
3. 地下貯留層からの加圧流体の前記試料は、このような貯留層からの流体流れから取得される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
4. 前記試料は、１００〜９００バールの圧力でインキュベーションされる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
5. 前記試料は、２３０〜２８０バールの圧力でインキュベーションされる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
6. 前記試料は、６０〜１６０℃の温度でインキュベーションされる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
7. 前記試料は、８０〜１００℃の温度でインキュベーションされる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
8. 前記試料を、少なくとも粉岩を含む栄養素と混合させることでインキュベーションを行う、前記請求項のいずれかに記載の方法。
9. インキュベーションは、７〜３６０日間行う、前記請求項のいずれかに記載の方法。
10. 前記培養物を、少なくとも１０時間にわたり周囲圧力および温度下に置くことをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
11. バルブ付き試料採取口を備え、ヒドロカルビル流体中の微生物を収容した加圧容器。
12. 内部圧力が１００〜９００バールである、請求項１１に記載の加圧容器。
13. 前記ヒドロカルビル流体は、グリセロールまたは鉱物油である、請求項１１または１２のいずれかに記載の加圧容器。
14. 請求項１１〜１３のいずれかに記載の容器を複数含む微生物ライブラリ。
15. 微生物の培養物を、任意に前記微生物の栄養素と共に前記貯留層に注入することを含み、前記培養物は、請求項１〜１０のいずれかに記載の高圧インキュベーションによって生成されたものである、地下貯留層処理プロセス。
16. 前記地下貯留層は、炭化水素の井戸である、請求項１５に記載のプロセス。
17. 前記貯留層に流体を注入して炭化水素を生産井戸に至らしめることを含み、前記流体の組成は、前記貯留層に内生する微生物の増殖を阻害または促進するように予め選択されている、地下炭化水素貯留層からの炭化水素回収を向上させるプロセス。
18. 吸気口と、好ましくは試料除去口とを有するインキュベーションチャンバを含み、前記チャンバの壁は、少なくとも１８０バールの圧力差に耐えられるよう十分な強度を有する材料からなることを特徴とする微生物発酵反応器。

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