JP2009514552A - モザイク異数体幹細胞の選択、増殖及び使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、その全ての内容が全体として参照により組み込まれる、2005年11月9日に出願された米国仮特許出願第60/735,715号に対する優先権の利益を主張する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたグラント第K02MH01723号の下で、連邦政府の支援を受けて実施された。連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
45未満の染色体が、中期(伝播)に存在する場合、一部は加工中に喪失し、中期(伝播)は分析には不適切であると考えられる。
Barch et al.,(1997)The AGT Cytogenetics Laboratory Manual.Lippincott:Philadelphiaを参照されたい。
本発明は、幹細胞又は前駆細胞の集団の異数体モザイク状態を検出及び定義するための方法を提供する。幾つかの実施形態において、前記方法は、集団における異数体モザイク現象の存在を検出することを含み、少なくとも3つの異なる核型が、集団中の異なる細胞の中から検出される。
「異数性」は、その標準的な意味で使用される。すなわち、獲得及び/又は喪失並びに染色体内変化を含む染色体の一倍体数の正確な倍数性から何らかの逸脱が生じているという意味で使用される。したがって、一倍体ゲノムの少なくとも一部の2つのコピーから逸脱を示している細胞(すなわち1つ若しくはそれ以上の染色体若しくはその一部の3以上のコピーが存在し、又は1つ若しくはそれ以上の染色体若しくはその一部が存在していないこと。)は、異数体と考えられる。異数性を記載するために時々使用される用語が「異数染色体」であり、これは、異数性に関する本定義内に包含される。本明細書で使用される「異数体モザイク現象」とは、細胞集団中に少なくとも3つの異なる核型が存在することを表し、そのうちの少なくとも2つは、異なる異数体状態である。幾つかの実施形態において、細胞集団中には4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の異なる核型が存在する。
図1は、初期及び後期継代H7 HESC由来の染色体計数の割合を示すグラフを提供する。星印は、グラフ中の正倍数体細胞(46染色体)の期待される位置を表す。両系が、初期継代集団中の低倍数体細胞の有意な割合を示すのに対し、後期継代細胞がクローン高倍数性を示す傾向にあることに留意されたい。
I.序論
本発明は、異数体モザイク現象が、幹細胞を正常に発生及び発達させる上で役割を担っているという驚くべき発見に関する。幹細胞研究者は、今日まで、異数性が、必ず異常であり、したがって、移植又は他の治療用途における使用に関して回避されるべきであると考えてきた。実際、幹細胞の単離及び維持に関する近年の方法は、正倍数性の本質的な重要性を強調している。例えば、米国特許第6,200,806号を参照されたい。
幹細胞に関する従来の記載とは異なり、本発明者らは、特異的な異数性のクローン増殖が必ずしも存在するとは限らないことを発見した。それゆえ、核型の分布を決定することが可能であるように、細胞の核型に関して、細胞のより多数を分析することが可能である。典型的には、この分析は、幹細胞研究者によって以前に典型的に分析されたものより、さらに多くの細胞の核型の分析を包含する。当業者は、核型の分布(すなわち「異数体モザイク」)を正確に確立するために、細胞の有意な数を細胞集団内で個別に核型分析すべきであり、前記核型のうちの1つが細胞集団内で正倍数体核型を含み得ることを十分に理解している。それゆえ、幾つかの実施形態において、細胞集団内の異なる核型の正確な分布を確立するために、細胞集団中の30、50、75、100、150、200、300、500、1000超又はそれ以上の細胞が個々に核型分析される。分析される細胞の数は、特定の核型の発生に対する検出限界を決定する。例えば、1%の頻度で生じる核型を検出するためには、細胞集団中の少なくとも100の、より好ましくは、例えば200、300、500又はそれ以上の個々の細胞の核型を決定することが必要である。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、例えば、1%、0.1%、0.001%、0.0001%、0.00001%又はそれ以下の頻度で生じる個々の核型の存在を検出するために、個々の細胞の十分な数の核型を検出することを含む。幾つかの実施形態において、細胞集団中の細胞の全てまたは実質的に全て(例えば、少なくとも80、90、95又は99%)の核型が決定される。一般的に、個々の細胞の核型分析は、1つの特異的な染色体又は染色体部分の存在に関して単にスクリーニングするのではなく、細胞中の染色体の実質的に全てを決定することを含む。しかしながら、他の実施形態において、本発明は、細胞の幾つかの染色体(例えば、2、3、4、5又はそれ以上の染色体)のみの数を決定することも可能である。
本発明は、幹細胞又は前駆細胞を培養し、増殖し、及び/又は選択する方法、あるいは、幹細胞又は前駆細胞を使用する方法を提供し、前記方法は、特定の異数体モザイクをモニターし、場合により維持する段階を含む。特定の異数体モザイク(すなわち、細胞集団内の核型の具体的な分布)の選択によって、幹細胞又は前駆細胞を使用する全てのアッセイ、手法及びアプローチにおける最適な使用が可能となる。これには、移植のために使用される幹細胞又は前駆細胞、生物学的因子(抗体、低分子干渉RNA等)の作製、薬剤(例えば、幹細胞の増殖又は分化を妨害又は増強する分子)のスクリーニング、毒素及び/又はその効果に関するスクリーニング、生物防御剤の検出(これにより、特定されたモザイクが因子の検出を可能にする特定された性質を有することになる。)、癌治療のための新たな因子の評価、組織生成、組織再生、ワクチン接種(これにより、幹または前駆細胞が適切な抗原提示または免疫応答の促進/阻害を可能にする性質を有することになる。)、正常検体及び病理検体を含む予後目的及び診断目的の両者のための幹細胞又は前駆細胞の遺伝子型同定、遺伝子疾患の治療、非遺伝子疾患の治療、幹細胞又は前駆細胞が異なる刺激に対して応答するように予め選択されており、次いで、生物中へ又は独立型のモニターとして導入されるとき、内部刺激又は外部刺激に応答することが可能なバイオセンサー、傷害の治療、形成外科、及び/又は増殖因子、抗アポトーシス性タンパク質又は他のタンパク質の産生が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
ヒト胚性幹細胞(HESC)の長期的な継代によって生じる染色体の不安定性は、ヒト胚性幹細胞の安全で、効果的な治療用途に対する問題となり得る。近年、古典的な細胞遺伝学的技術によって検出された核型の異常がHESC系において報告された。長期的な継代後に現行のHESCにおいて生じた異常性の範囲を決定するために、本発明者は、初期及び後期継代H7及びH9並びにHESCネズミESCに対して、染色体の獲得及び喪失の定量と組み合わせた「スペクトル核型分析(SKY)」を利用した。H7及びH9に加え、非NIH HESCを含むあらゆるHESC又はネズミESCの検討によって、同様の結果が得られた(データ非表示)。初期継代細胞は、低倍数性を示し、主としてクローン高倍数性を示す後期継代細胞とは対照的であった。神経細胞へ分化する能力に関して、モザイク異数体及び正倍数体哺乳動物ESC培養物を評価し、高倍数体細胞は、分化能の有意な低下を示した。これらのデータは、哺乳動物ESC異数性の生理学的重要性を明らかにするものであり、異数性の異なる形態に対するESCの日常的モニタリングを支持する。
H7及びH9 HESC系(WiCell Research Institute,Madison,WI製)を、継代36ないし44(初期継代)と継代77ないし88(後期継代)との間で分析した。染色体の相補対及び組織化を調べるために、SKYを使用し、染色体の獲得及び喪失の広範な定量と組み合わせた。従来の細胞遺伝学的アプローチのために現在使用されているような異数体細胞の代表的な又は保存された形態のみを同定及び報告するのではなく、許容される中期の伝播全てが、喪失又は獲得された染色体の数に関して定量化され、これらの値はグラフにプロットされる。神経細胞等の特定の細胞種へ分化する異数体哺乳動物ESCの能力を評価することによって、観察された異数性の有意性を調べた。
HESCは、染色体の無作為な獲得及び喪失を示す。
HESCの重要な特性は、正常な成熟細胞へ分化するその究極的な能力である。濃縮された神経細胞の集団を与えるために、ES細胞の分化を操作できるという十分な証拠がある。間質性PA6細胞は、フィーダーとして使用される場合、マウスESコロニーがTuj−1陽性なり、強固な神経突起生成を有するようにマウスESコロニーを誘導することによって神経の分化を促進する(Kawasaki et al.,2000)。異数体細胞と正倍数体細胞の分化能を比較検討するために、哺乳動物ESCをタキソールありで(異数体)又はタキソールなしで(正倍数体)処理し、PA6細胞と共培養した場合の神経細胞への分化能に関して検討した。分化の1週間後、タキソール処理された細胞の55%が、染色体を獲得した(図3)。さらに、細胞を固定し、tuj1に関して染色すると、タキソールで処理された培養物中で神経細胞に分化したコロニー数に有意な減少が存在した。これらの結果は、異数性の異なるレベル及び形態が、培養されたESCの神経細胞分化能を変化させ得ることを示している。
幹細胞研究の長期的な目標は、衰弱性の疾病を治療するための新たな治療法を開発することである。この目標を達成するために、長期的継代の後でさえ再生可能な特性を示すHESC系を得ることが必要である。HESC系中の染色体の不安定性の存在は、HESCの生理学的特性を変化させ得る。HESCにおける異数性の形態の定量化と組み合わせてSKYを使用することによって、多くの異なる形態の広範な異数性が観察された。哺乳動物ESCにおける異数性の機能的重要性は、過去には調べられておらず、驚くべきことに、異数性の少なくとも2つの形態、すなわち高倍数性対低倍数性は等価ではない。高倍数性は、少なくとも神経細胞の系列に沿った分化の阻害と相関しているが、低倍数性は相関していない。
HESCの培養
DMEM/F12 Glutamax(Gibco,Carlsbad,CA)、20%「ノックアウト」血清置換物(Gibco)、0.1mM非必須アミノ酸(Gibco)、0.1mMβ−メルカプトエタノール(Gibco)、及び4ng/mL FGF−2(R&D systems,Minneapolis,MN)中で、有糸分裂的に不活性化された(ミトマイシンC処理した)マウス胚性線維芽細胞(MEF,Specialty media,Phillipsburg,NJ)上で、H7 HESC(WiCell Research Institute,Inc.,Madison,WI)を培養した。コラゲナーゼ/トリプシン(Gibco)でコロニーを5ないし6日ごとに継代した。Oct4、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81を含む未分化型マーカーに対して、細胞は免疫反応があった。さらに、コロニーの90%超は、アルカリホスファターゼ活性を示した。ネズミ胚性マーカーSSEA−1及び神経前駆体マーカーであるネスチン等の神経マーカー;非成体神経細胞マーカーであるTuj−1及びMap2(a+b);成体神経細胞マーカー;アストロサイトマーカーであるGFAP及びs100−β並びにオリゴデンドロサイトマーカーであるO4、GSTπ及びRIPに関して、細胞は免疫陰性であった。
分化条件(DMEM/F12 Glutamax(Gibco,Carlsbad,CA)、10%「ノックアウト」血清置換物(Gibco)、0.1mM非必須アミノ酸(Gibco)及び0.1mMβ−メルカプトエタノール(Gibco))下で、マウスESCをPA6細胞(Kawasaki et al.,2002)とともに1週間共培養した。2.5nM濃度のタキソール(Sigma)で細胞を処理した。
α−β−チューブリン−III(Tuj−1;1/1000,Covance)を使用して、既に記載のとおり(Gage et al.,1995)、免疫蛍光染色を実施した。二次抗体は、Jackson ImmunoResearchから購入した。
標準的なプロトコール(Barch et al.,1997;Rehen et al.,2001)によってHESC染色体伝播を得た。製造元の説明書に従って、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)(Sigma)及びSKY H−10キット(Applied Spectral Imaging,Inc.,Carlsbad,CA)を使用した。
各試料に関し、40の細胞分裂中期広がりを捕捉し、SKYによって分析し、DAPIにより対比染色された70の細胞分裂中期広がりを異数性定量化に関して捕捉した。
Claims (20)
- 集団における異数体モザイク現象の存在を検出することを含み、少なくとも3つの異なる核型が、前記集団中の異なる細胞の中から検出される、幹細胞又は前駆細胞の集団の異数体モザイク状態を検出及び定義するための方法。
- 集団中の少なくとも30の細胞が、異数性に関してスクリーニングされる、請求項1に記載の方法。
- 細胞の異数性が記録される、請求項2に記載の方法。
- 少なくとも5つの異なる核型が、集団中の異なる細胞内で検出される、請求項1に記載の方法。
- 正味の低倍数体モザイク核型を有する細胞を検出すること、及び分化、さらなる増殖、又は移植のために、正味の低倍数体モザイク核型を有する前記細胞から、染色体の少なくとも一部に関して低倍数体である幹細胞系又は前駆細胞系を選択することを含む、請求項1に記載の方法。
- 正味の低倍数体モザイク核型を有する細胞を検出すること、及び薬物スクリーニングのために、正味の低倍数体モザイク核型を有する前記細胞から、染色体の少なくとも一部に関して低倍数体である幹細胞系又は前駆細胞系を選択することを含む、請求項1に記載の方法。
- 正味の高倍数体モザイク核型を有する細胞を検出すること、及び分化、さらなる増殖、又は移植のために、正味の高倍数体モザイク核型を有する前記細胞から、染色体の少なくとも一部に関して高倍数体である幹細胞系又は前駆細胞系を選択することを含む、請求項1に記載の方法。
- 正味の高倍数体モザイク核型を有する細胞を検出すること、及び薬物スクリーニングのために、正味の高倍数体モザイク核型を有する前記細胞から、染色体の少なくとも一部に関して高倍数体である幹細胞系又は前駆細胞系を選択することを含む、請求項1に記載の方法。
- 検出段階前に細胞分裂の少なくとも1周期を通じて幹細胞を継代することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞集団中の細胞の少なくとも80%の核型が決定される、請求項1に記載の方法。
- 検出段階が、多重蛍光インサイツハイブリダイゼーション(FISH)を含む蛍光インサイツハイブリダイゼーション(FISH)を含む、請求項1に記載の方法。
- 検出段階が、スペクトル核型分析(SKY)を含む、請求項1に記載の方法。
- 検出段階が、Gバンド形成、DAPI又はフローサイトメトリを含む、請求項1に記載の方法。
- 正味の高倍数体モザイク核型を有し、望ましい細胞種へ分化できない細胞へ薬剤を接触させること;及び
前記細胞の増殖を阻害する薬剤を選択すること
を含む、望ましい細胞種へ分化できる細胞と比較して、分化できない細胞を優先的に阻害する薬剤をスクリーニングする方法。 - 低倍数体核型を有し、望ましい細胞種へ分化できない細胞へ薬剤を接触させる段階;及び
分化できない高倍数体細胞の増殖を阻害するが、望ましい細胞種へ分化できる低倍数体細胞の増殖を著しく阻害しない薬剤を選択する段階
をさらに含む、請求項14に記載の方法。 - 細胞集団中の細胞中で、少なくとも1つの染色体又はその一部の核型を検出すること;及び
細胞集団中の少なくとも1つの染色体又はその一部で正倍数体又は低倍数体の核型を有する細胞を、少なくとも1つの染色体又はその一部で高倍数体である細胞から分離し、これにより、細胞集団中の正倍数体細胞及び低倍数体細胞を維持しながら高倍数体細胞を除去することによって幹細胞又は前駆細胞集団を維持又は改良すること
を含む、幹細胞又は前駆細胞の集団を維持又は改良するための方法。 - 検出段階及び分離段階が、蛍光標示式細胞分取(FACS)によって実施される、請求項16に記載の方法。
- 分離段階の後、正倍数体又は低倍数体の核型を有する細胞を分化させる、請求項16に記載の方法。
- 分離段階の後、正倍数体又は低倍数体の核型を有する細胞が増殖される、請求項16に記載の方法。
- 分離段階の後、正倍数体又は低倍数体の核型を有する細胞が個体内へ移植される、請求項16に記載の方法。
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