JP2009511013A - カルシニューリンの保存的膜アクティベーター（ｃＭＡＣ）、新規治療用タンパク質および標的 - Google Patents

カルシニューリンの保存的膜アクティベーター（ｃＭＡＣ）、新規治療用タンパク質および標的 Download PDF

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Abstract

本発明は、ここでＭＡＣと命名する、仮説タンパク質MGC14327の初めて知られた機能および生物学的活性を開示し、ここで、それはＴ細胞活性化の重要なコントローラーとして同定された。ここでは、ｃＭＡＣは、ｃＭＡＣ関連障害の処置のための新規治療剤開発のための適当な薬剤標的として意図される。本発明は、該病理学的状態の処置方法、およびそれ故に医薬組成物に関する。本医薬組成物は、ｃＭＡＣタンパク質活性および／またはｃＭＡＣ遺伝子発現に対する阻害性またはアゴニスト効果を有するモジュレーターを含む。本発明はまた、ｃＭＡＣタンパク質活性および／またはｃＭＡＣ遺伝子発現を阻害またはアゴナイズできる化合物を同定することを含む、該病理学的状態の処置に治療的有用性を有する化合物を同定する方法にも関する。

Description

発明の背景
Ｔ−リンパ球が全身性自己免疫性疾患の進行に必須であるとの概念を支持する証拠がたくさんある。Ｔ細胞数の単なる減少が、自己免疫性疾患の動物モデルにおいて宿主免疫応答を低下させ、生存時間を改善する。例えば、狼瘡の本態性マウスモデルにおいて、Ｔ細胞と抗Ｔ細胞抗体の低下が、循環Ｔ細胞を低下させ、自己抗体濃度を低下させ、腎臓合併症を低下させ、動物生存時間を改善するWofsy D, Ledbetter JA, Hendler PL, Seaman WE. (1985) Treatment of murine lupus with monoclonal anti-T cell antibody. J Immunol. Feb;134(2):852-7)。
Ｔ細胞共刺激受容体を遮断する抗体もまた動物生存時間の延長に有効である(Finck BK, Linsley PS, Wofsy D. (1994) Treatment of murine lupus with CTLA4Ig Science. Aug 26;265(5176):1225-7)。Ｔ細胞増殖または活性化を低下させる薬剤は、ヒトにおける狼瘡の処置に有効である(シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチルおよびシクロスポリンＡ)。Ｔ細胞がヒトにおける自己免疫性疾患に関与することをさらに支持する証拠は、ＨＩＶ感染した狼瘡患者が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少のために寛解を経験し得るとの観察に由来する(Byrd VM, Sergent JS. (1996) Suppression of systemic lupus erythematosus by the human immunodeficiency virus. J Rheumatol. Jul;23(7):1295-6.)
Ｔリンパ球はまた急性移植片拒絶において重要な役割を有する。急性移植片拒絶は、古典的にＴ細胞の移植片への移動、活性化Ｔ細胞のクローン性増殖、細胞毒性Ｔ細胞の増殖および続く組織破壊および移植片の損失により起こる。無胸マウスが、他の種からの移植片を際限なく受け入れる能力は、移植片拒絶においてＴ細胞が果たす特定の重要性を証明する。同様に、Ｔ細胞応答をブロックするまたはＴ細胞を完全に排除する薬剤は、ヒトにおける移植片拒絶の予防に有効である(Sykes M, Auchincloss H, Sachs DH (2003) “Transplantation immunology”, in Fundamental Immunology, ed WE Paul, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, p. 1499.)
未処置Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および共刺激受容体(ＣＤ２８)の刺激が必要である。ＴＣＲ／ＣＤ２８結合は、複雑なシグナリングカスケードを活性化し、それは細胞内カルシウム貯留の放出を介して、続くＣＲＡＣ(カルシウム放出活性化カルシウム電流)チャネルを介したカルシウムを介して、細胞内カルシウムを増加させる。細胞内カルシウムの増加がカルシニューリンの活性化をもたらし、それはＮＦＡＴを脱リン酸化する。ＮＦＡＴタンパク質は、脱リン酸化されたら、核に転位し、そこで、それらが最も重要な細胞性拒絶反応における最も重要なリンホカインの一つであるＩＬ−２の転写を駆動する、転写因子のファミリーである(Hutchinson I, (2001) “Transplantation and rejection” in Immunology, I Roitt, J Brostoff and D Male, Mosby New York p. 389.)。ＩＬ−２は細胞毒性Ｔ細胞の増殖を刺激し、それは移植片の破壊を介在する細胞溶解性分子、パフォルミン(performin)およびグランザイムを放出する。免疫抑制剤シクロスポリンＡは、ホスファターゼ酵素カルシニューリンを阻害し、それはＮＦＡＴの核への転位を防止し、故にＩＬ−２の転写を防止する。
ＴＯＲＣタンパク質は、ＣＲＥＢコアクティベーターであり、それは、ＮＦＡＴと同様、細胞内カルシウム貯蔵の移動に応答して核に転位する。ＴＯＲＣは、ＣＲＥ介在遺伝子発現を促進すると考えられている。ＮＦＡＴおよび／またはＴＯＲＣを制御するタンパク質は、治療的介入のための適当な標的であり得る。出願人は、ここで、ｃＭＡＣがＴ細胞活性化の強力なレギュレーターであり、ＮＦＡＴおよびＴＯＲＣ核転位を防止することを報告する。
発明の要約
本明細書は、ここではｃＭＡＣ(“カルシニューリンの保存的膜アクティベーター”)と呼ぶ、以前は未知の機能であったタンパク質がＴ細胞活性化の強力なレギュレーターであり、そしてＮＦＡＴおよびＴＯＲＣ１のカルシウム介在核転位に関与するとの発見に関連する。それ自体、ｃＭＡＣは、小分子、抗体、核酸およびｃＭＡＣ活性または発現を調節する他の治療剤を使用した、ｃＭＡＣ関連疾患(ここで定義する)の処置のための重要な治療用タンパク質および治療標的である。
一つの局面において、本発明は、成熟または天然ｃＭＡＣポリペプチドに関する。従って、本発明は、配列番号２、またはそのフラグメント、または配列番号２またはその機能的同等物と少なくとも５０％の配列同一性を有し、そして天然配列番号２のイオン輸送、イオン拡散、カルシニューリン経路活性化、Ｔ細胞のカルシウム依存性活性化、ＴＯＲＣの核転位、ＮＦＡＴの核転位またはｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)駆動遺伝子発現活性から選択される生物学的活性を示す、実質的に類似のタンパク質配列の単離ポリペプチドに関する。
他の局面において、本発明は、ｃＭＡＣをコードする単離核酸分子、本核酸分子を含むベクター、好ましくはプロモーターに操作可能に結合した本核酸分子を含む発現ベクター、本ベクター分子を含む哺乳動物および細菌宿主細胞を含む宿主細胞、および本ベクター分子を含む宿主細胞を培養することを含む、ｃＭＡＣの産生にｃＭＡＣをコードする核酸分子を使用する方法を含む。
本発明の他の局面は、本発明のｃＭＡＣポリペプチドと結合できる、抗体または抗体フラグメントを提供する。本発明のさらなる局面は、ｃＭＡＣの発現を下方制御できるＲＮＡｉ試薬に監視、好ましくはこのようなＲＮＡｉ試薬は、表５または表６から選択される少なくとも１個の核酸を含む。
本発明の他の局面は、ｃＭＡＣ関連障害(ここで定義の通り)の処置用薬剤の製造のための、本発明の抗体またはＲＮＡｉ試薬の使用、および対象に有効量のｃＭＡＣの量または活性を調節する薬剤を投与することを含む、対象における障害の処置方法に関する。従って、本発明は、対象における障害の処置におけるｃＭＡＣ特異的結合領域を含む抗体、抗体フラグメントまたはポリペプチドの使用を含み、ここで、とりわけ該障害はｃＭＡＣ関連障害である。あるいは、本発明は、対象における障害の処置における、ｃＭＡＣに特異的なＲＮＡｉ試薬またはｓｉＲＮＡの使用を含み、ここで、とりわけ該障害はｃＭＡＣ関連障害である。
種々の局面において、本方法は、ｃＭＡＣを阻害する薬剤を投与することを含み、ここで、該障害がｃＭＡＣ関連障害(ここで定義の通り)であるか、または該薬剤がｃＭＡＣ特異的結合領域を含む抗体、抗体フラグメントまたはポリペプチドである。所望により該薬剤は医薬組成物として投与する。
他の局面において、この方法は、対象に有効量のｃＭＡＣの発現を阻害する薬剤を投与することを含む。このような薬剤は、ｃＭＡＣの発現を特異的に阻害できる阻害性核酸を含む。種々の態様は、該阻害性核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ試薬、およびリボザイム、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡから成る群から選択されるものを含む。所望により該薬剤を医薬組成物として投与する。
他の局面において、本発明は、対象に有効量のｃＭＡＣの活性を増強する薬剤を投与することを含む、障害の処置方法を提供する。このような方法は、対象に有効量のｃＭＡＣの発現を増加させる薬剤を投与することを含み、例えば、ここで、該薬剤はｃＭＡＣをコードする核酸またはそのフラグメントを含む遺伝子治療用ベクターであるか、または該薬剤はｃＭＡＣ遺伝子転写のエンハンサーである。
組成物の観点で、本発明は、ｃＭＡＣ(配列番号２)に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント、および全てのｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドを含む。このような抗体は、ＦａｂまたはＦ(ａｂ’)２フラグメントである抗体フラグメントを含み、またはここで、該抗体はモノクローナル抗体である。本発明は、有効量のｃＭＡＣの発現を阻害するまたはｃＭＡＣの活性を阻害する薬剤、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を含む。このような薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ試薬、ｃＭＡＣに特異的に結合する抗体フラグメント、またはｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドであり得る。好ましい態様において、本医薬組成物は、ｃＭＡＣ(配列番号２)に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント、または配列番号６、７、８、９、１０から選択されるｃＭＡＣのエピトープに結合する全てのｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドを含む。
本発明はまた、対象に有効量のｃＭＡＣの活性を阻害する薬剤の医薬組成物を投与することを含む、障害の処置方法を提供し、ここで、とりわけ障害はｃＭＡＣ関連障害であり、そして、該薬剤はｃＭＡＣ(配列番号２)またはｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである。このような薬剤は、所望により配列番号６、７、８、９、１０から選択されるｃＭＡＣのエピトープに結合する。
本発明は、さらに、ｃＭＡＣ関連障害の処置に有用な化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ方法であって、(ａ)試験化合物とｃＭＡＣを接触させ；および(ｂ)試験化合物と接触させていないｃＭＡＣと比較したｃＭＡＣの生物学的活性の変化を検出することを含む、方法を含む(ここで変化の検出が、該障害の処置のために有用であるとして該試験化合物を同定する)。同様に、本発明は、ｃＭＡＣ関連障害の処置に有用な化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ方法であって：(ａ)試験化合物とｃＭＡＣをｃＭＡＣ生物学的活性を許容するサンプル条件下で接触させ；(ｂ)ｃＭＡＣ生物学的活性のレベルを測定し；(ｃ)該レベルを、該試験化合物を各コントロールサンプルのレベルと比較し；そして、(ｄ)該障害の処置に有用な可能性のある薬剤としてのさらなる試験のために、該レベルの変化をもたらす試験化合物を選択することを含む、方法を含む。本発明は、化合物がｃＭＡＣ生物学的活性を調節するか否かを試験する方法であって：(ａ)試験化合物とｃＭＡＣを接触させ；および(ｂ)試験化合物と接触させていないｃＭＡＣと比較したｃＭＡＣの生物学的活性の変化を検出することを含む、方法を含む(ここで、変化の検出が、ｃＭＡＣ生物学的活性のモジュレーターとして該試験化合物を同定する)。同様に、本発明は、障害の処置に有用なモジュレーターを同定する方法であって、候補モジュレーターがｃＭＡＣタンパク質の活性を阻害する能力についてアッセイすることを含む、方法；および障害の処置に有用なモジュレーターを同定する豊富であって、候補モジュレーターがｃＭＡＣタンパク質の発現を阻害する能力についてアッセイすることを含む、方法を含む。
これらの方法において、該変化または該調節は、このような生物学的活性の低下または増加であり得る。さらに、該生物学的活性は、イオン輸送、イオン拡散、タンパク質−ｃＭＡＣ相互作用またはｃＭＡＣ修飾、Ｔ細胞のカルシウム依存性活性化、ＴＯＲＣの核転位、およびｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)駆動遺伝子発現から選択される。
本発明によって、ｃＭＡＣ関連またはｃＭＡＣ付随障害は、自己免疫性疾患、免疫抑制、炎症性疾患、癌、心血管疾患および神経学的疾患を含むが、これらに限定されない。
図面の記載
図１ ｃＭＡＣは、予測される膜内在性タンパク質である。ＴＭＨＭＭアルゴリズムを使用した、ｃＭＡＣ配列の経膜ドメイン予測。２個の小さい予測される細胞外ドメインがアミノ酸３６−４９および１０１−１１０に位置する。
図２ ｃＭＡＣは、非常に保存されたタンパク質である。ｃＭＡＣに類似の脊椎動物タンパク質のClustalWアラインメント。ＴＭＨＭＭアルゴリズムにより予測される潜在的な経膜へリックスを線で示す。
図３ Affymetrix発現プロファイリングにより測定したｃＭＡＣ ｍＲＮＡレベル。
図４ ｃＭＡＣ過剰発現は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＯＲＣ転位を誘導する。Bittenger et. al. は、ＴＲＰＶ６およびＰＫＡをＴＯＲＣ−ｅＧＦＰ転位スクリーニングにおけるヒットとして同定した(Bittenger et. al. Curr Biol. 2004 Dec 14;14(23):2156-61)。ｃＭＡＣもまた以前には記載されていないが、同定された。
図５ ＴＯＲＣ１−ｅＧＦＰのｃＭＡＣ仲介転位は、カルシニューリン阻害剤ＣｓＡによりブロックされる。パネルＡにおいて、ＨｅＬａ：ＴＯＲＣ１−ｅＧＦＰ細胞を停止コドンウイルス(ベクター)、またはヒトＴＲＰＶ６、またはヒトＣＭＡＣウイルス(５０uL)で形質導入した。パネルＢ細胞を、細胞を固定前に５uM シクロスポリンＡ(ＣｓＡ)で１時間処理した以外、Ａと同様に処理した。
図６ ｃＭＡＣは、ＮＦＡＴ依存性転写を誘発する。ＨＥＫ２９３細胞を、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポータープラスミド、トランスフェクションコントロール、以下の構築物：空ベクター(ＣＭＶ)、ＴＲＰＶ６およびｃＭＡＣと共トランスフェクトし、ＤＭＳＯ、５μM ＣｓＡ、１０μM ＰＭＡ、または１０μM ＰＭＡおよび５μM ＣｓＡで処理した。
図７ ｃＭＡＣは、Jurkat細胞におけるＮＦＡＴ１転位を誘発する。パネルＡ。レンチウイルス介在過剰発現ｃＭＡＣ、コントロールベクター(翻訳停止配列)、およびＴＲＰＶ６と、シクロスポリンＡ有りおよび無し；Ｂ。細胞を固定前に６時間ＰＭＡでＰＭＡ感作した以外、Ａと同じ処置。
図８ ｃＭＡＣは、Jurkat細胞においてＮＦＡＴ２転位を誘発する。Ａ。ウイルス(ｐＬＬＢ１−ＧＷ−Ｋａｎ)介在過剰発現ｃＭＡＣ、コントロールベクター(翻訳停止配列)、ＴＲＰＶ６と、シクロスポリン有りおよび無し；Ｂ。細胞を固定前に６時間ＰＭＡ感作した以外、Ａと同じ処置。
図９ マウスｃＭＡＣおよびヒトホモログ過剰発現は、Jurkat Ｔ細胞。Jurkat細胞を、ネガティブコントロール空ベクター(翻訳停止配列)、ＴＲＰＶ６カルシウムチャネル、およびNM_177244(マウスｃＭＡＣ)およびNM_053045(ヒトｃＭＡＣ)を含むウイルス発現ベクター(QL-GW-final-Kan)で形質導入した。ＩＬ−２タンパク質(ＥＬＩＳＡ)およびＩＣＯＳ表面マーカー発現を、トランスダクション後７２時間に測定した(トランスダクション４８時間後、細胞をＰＭＡおよび抗ＴＣＲ抗体で感作した)。
図１０ ｃＭＡＣを標的とする多重ウイルスｓｈＤＮＡ配列は、Jurkat Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ２８活性化を遮断する。細胞をウイルス構築物(ｐＬＫＯ.１)で形質導入し、トランスダクション６日後ピューロマイシンで選択し、ＴＣＲ／ＣＤ２８で活性化した。ＩＬ−２タンパク質レベルを測定し、各ウェルに存在する生存細胞数で標準化した。ｓｈＤＮＡ構築物ｐＧＬ３−Ｌｕｃは、ウイルストランスダクションのネガティブコントロールｓｈＤＮＡとして働く。
図１１ ヒトｃＭＡＣ：NM_053045：ホモ・サピエンス仮説タンパク質MGC14327(MGC14327)、ｍＲＮＡ(gi|16596685|ref|NM_053045.1|[16596685])(配列番号１)およびヒト仮説タンパク質ＬＯＣ９４１０７[ホモ・サピエンス；＞gi|16596686|ref|NP_444273.1|](配列番号２)。
図１２ ヒトｃＭＡＣゲノムプロモーター配列(NM_053045.1_5'_-3000＋100 NT_024000.16 886093 882993)(配列番号３)。
図１３ ｃＭＡＣ５’ＵＴＲの単離核酸配列(配列番号４)およびｃＭＡＣ３’ＵＴＲの単離核酸配列(配列番号５)。
図１４ マウスｃＭＡＣ NM_177344：mus musculus RIKEN cDNA C730025P13遺伝子(C730025P13Rik)、ｍＲＮＡ(gi|31340922|ref|NM_177344.2|)(配列番号１１)および＞gi|18490941|gb|BC022606.1|mus musculus RIKEN cDNA C730025P13遺伝子、ｍＲＮＡ(ｃＤＮＡクローンMGC:31129 IMAGE:4165766)、完全ｃｄｓ(配列番号１２)およびNM_177344.２から翻訳したマウスｃＭＡＣアミノ酸配列(配列番号１３)。
図１５ 他の種Mus musculus(配列番号１４)；Rattus norvegicus(配列番号１５)；Canis familiaris(配列番号１６)；Pan troglodytes(配列番号１７)；Xenopus tropicalis(配列番号１８)；Danio rerio(配列番号１９)；Gallus gallus(配列番号２０)；Branchiostoma floridae(配列番号２１)からのヒトｃＭＡＣの他のオルソログ。
発明の詳細な説明
定義
ここに記載の本発明はここに記載の具体的な方法論、プロトコール、および試薬に、それらが変わり得るため、限定されないことは考慮される。ここで使用する用語は、特定の態様のみを記載することを目的とし、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することを意図しないこともまた理解すべきである。
ここに記載のものに類似のまたは同等な全ての方法および物質を本発明の実施に際して使用できるが、好ましい方法、デバイスおよび物質をここに記載する。ここに記載の全ての刊行物は、本発明に関連して使用するはずである該刊行物中に報告されている物質および方法論の記載および開示の目的で、引用により本明細書に包含させる。
本発明の実施に際し、分子生物学における多くの一般法を使用する。これらの方法は既知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory);およびMethods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively)に説明されている。
ここで、および添付の特許請求の範囲で使用される単数表現は、文脈から明らかに違うことが解釈されない限り、複数表現も含む。故に、例えば、“抗体”への言及は、当業者に既知の１個以上の抗体およびその等価物も言及する。
“ｃＭＡＣ”または“カルシニューリンの保存的膜アクティベーター”は、本発明の対象タンパク質であり、以下に詳細に記載する。このタンパク質および遺伝子に割り当てられた種々の名前は、科学的慣用に従い変化し得る。結果として、本特許の請求の範囲および本明細書の内容は、本発明の対象の遺伝子およびタンパク質、およびその種々のフラグメントおよび形態を、割り当てられた具体的な名前に関係なく、言及することを意図する。故に、“ｃＭＡＣ”は、ここで、配列番号２のポリペプチド配列を含む天然に存在するポリペプチドまたは図１４および１５に示すそのオルソログのいずれか一つの、少なくとも１個の生物学的特性(以下に定義の通り)を有する全てのポリペプチド配列であると定義する。
“ｃＭＡＣ付随障害”または“ｃＭＡＣ関連障害”は、ｃＭＡＣの活性の調節により処置し得る障害を意味する。これらの障害は、自己免疫性疾患、免疫抑制、炎症性疾患、癌、心血管疾患および神経学的疾患を含むが、これらに限定されない。
自己免疫性疾患の例は、サルコイドーシス、類繊維肺(fibroid ling)、特発性間質性肺炎、喘息、内在性喘息、外因性喘息、塵埃喘息、特に慢性または難治性喘息(例えば遅発性喘息および気道応答性亢進)のような状態を含む閉塞性気道疾患、気管支喘息を含む気管支炎、小児喘息、アレルギー性リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎(nephrotic syndrome lupus)、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型真性糖尿病およびその合併症、II型成人発症真性糖尿病、ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群、ステロイド依存性およびステロイド耐性ネフローゼ、掌蹠膿疱症、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性湿疹(アトピー性皮膚炎)、接触性皮膚炎およびさらなる湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、扁平苔癬、天疱瘡、類天疱瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管浮腫、脈管炎、紅斑、皮膚好酸球増加症、アクネ、円形脱毛症、好酸球性筋膜炎、アテローム性動脈硬化症、結膜炎、角結膜炎、角膜炎、春季結膜炎、ベーチェット病に関連するブドウ膜炎、疱疹性角膜炎、円錐角膜、角膜上皮ジストロフィー(dystorphia epithelialis corneae)、角膜白斑(keratoleukoma)、眼天疱瘡、モーレン潰瘍、強膜炎、グレーブス眼症、重篤な眼内炎症、ロイコトリエンＢ４介在疾患のような粘膜または血管の炎症、胃潰瘍、虚血性疾患および血栓症が原因の血管損傷、虚血性腸疾患、炎症性腸疾患(例えばクローン病および潰瘍性大腸炎)、壊死性腸炎、間質性腎炎、グッドパスチャー症候群、溶血性尿毒症症候群および糖尿病性腎症を含む腎臓疾患、多重筋炎、ギランバレー症候群、メニエール病および神経根症から選択される神経疾患、強皮症、ウェゲナー肉芽腫およびシェーグレン症候群を含むコラーゲン疾患、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変および硬化性胆管炎を含む慢性自己免疫性肝臓疾患、部分的肝切除、急性肝臓壊死(例えば毒素、ウイルス肝炎、ショックまたは無酸素が原因の壊死)、Ｂ型ウイルス性肝炎、非Ａ／非Ｂ肝炎および硬変、劇症肝炎、膿疱性乾癬、ベーチェット病、活動性慢性肝炎、エバンス羞悪行軍、花粉症、特発性副甲状腺機能低下症、アジソン病、自己免疫性萎縮性胃炎、ルポイド肝炎、尿細管間質性腎炎、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症またはリウマチ熱を含む障害および／または状態を含む。
免疫抑制は、例えば膵臓島、幹細胞、骨髄、皮膚、筋肉、角膜組織、神経組織、心臓、肺、心肺複合、腎臓、肝臓、腸、膵臓、気管または食道の細胞、組織または固形臓器同種または異種移植片の急性または慢性拒絶反応のような急性または慢性移植片拒絶の処置のために望まれる。移植片対宿主病もまた含む。慢性拒絶反応はまた移植片血管疾患または移植片脈管障害とも呼ばれる。
免疫力が低下した対象の処置の観点で、免疫抑制はまた、疾患または状態を解消させるために対象において十分には達成されないＴ細胞の活性化によりもたらされ得るような、ｃＭＡＣの調節により達成できる。不完全な免疫応答が原因の疾患は、ＡＩＤＳ、ＳＬＥなどを含むが、これらに限定されない。
ｃＭＡＣの調節により処置し得る炎症性疾患は、ＣｓＡ処置に応答すると考えられる炎症性疾患、障害および／または状態を含む。
癌は、前癌または癌状態と関連する新生組織形成および異常細胞増殖を含むがこれらに限定されない。当業者は、種々の形態の癌、新生組織形成および異常細胞増殖、特にリンパ腫、白血病、および他の血液癌に精通している。
心血管疾患は、心肥大および心不全のような心血管疾患、障害および状態を含むが、これらに限定されない。
神経学的疾患および／または状態は、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病を含むが、これらに限定されない疾患、障害および／または状態を含み、そしてｃＭＡＣの調節のための方法および組成物により達成し得る神経保護を含む。
ｃＭＡＣのアンタゴニストまたは阻害剤は、上記の疾患、障害および／または状態のいずれかまたは全てにおける使用のために示唆されるが、ｃＭＡＣのアゴニストは、癌、不完全な免疫応答が原因の疾患および神経保護に特に関与し、そして望まれる。
“ｃＭＡＣ関連障害”は、ここでは、異常ｃＭＡＣ発現、異常ｃＭＡＣ活性、またはＴ細胞の異常活性化と関連する“病理学的状態”と呼ぶこともある。
ここで使用する“障害”は、存在しているものであれ予後的に同定されたものであれ、疾患、障害、または状態を含み、そして、疾患、障害または状態およびそれらの処置に使用した薬剤の症状または副作用を含む。
物質がｃＭＡＣタンパク質を“調節する”能力(例えば“ｃＭＡＣモジュレーター”)は、物質が、ｃＭＡＣタンパク質の１種以上の生物学的活性を阻害するまたは増強するおよび／またはその発現を阻害するまたは増強する能力を含むが、これらに限定されない。そのようなモジュレーターは、ｃＭＡＣ活性のアゴニストおよびアンタゴニスト両方を含む。そのような調節はまた、他のタンパク質がｃＭＡＣと相互作用する能力、例えば関連制御タンパク質またはｃＭＡＣと結合するタンパク質への影響も含む。
“単離ｃＭＡＣ”または“ｃＭＡＣ”のいずれかと組み合わせて使用するとき“生物学的活性”は、活性または成熟または天然または例えば配列番号２の内在性ｃＭＡＣと比較したとき、イオン輸送活性、イオン拡散活性、Ｔ細胞のカルシウム依存性活性化活性、ＴＯＲＣの核転位、ＮＦＡＴの核転位またはｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)駆動遺伝子発現活性から選択される活性を有することを意味する。
ここで使用する用語“アゴニスト”は、ポリペプチド(例えばｃＭＡＣポリペプチド)を直接的または間接的に調節し得るおよび該ポリペプチドの生物学的活性を増加させる分子(すなわちモジュレーター)を意味する。アゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、有機分子、小有機分子(無機部分を伴うまたは伴わない)または他の分子を含み得る。タンパク質の遺伝子転写、生物学的活性または生化学的機能を増強するモジュレーターは、転写を増加させるか、または、場合によっては該タンパク質の生化学的特性または活性を刺激する何かである。
ここで使用する用語“アンタゴニスト”または“阻害剤”は、該ポリペプチドの発現および／または生物学的活性を遮断または阻害する、ポリペプチド(例えばｃＭＡＣポリペプチド)を直接的または間接的に調節する分子(すなわちモジュレーター)を意味する。アンタゴニストおよび阻害剤は、タンパク質、核酸、炭水化物、または他の分子を含み得る。タンパク質の発現または生化学的機能を阻害するモジュレーターは、該タンパク質の遺伝子発現または生物学的活性を各々阻害する何かである。
ここで使用する“核酸配列”は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそれらのフラグメントまたは一部を意味し、その重合成分はＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド摸倣物またはそれらの組合せであり得る；そしてゲノムまたは合成起源であってよく、そして一本鎖または二本鎖であってよく、センスまたはアンチセンス鎖を示す。
ここで使用する用語“アンチセンス”は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を意味する。用語“アンチセンス鎖”は、“センス”鎖に相補的な核酸鎖に関連して使用する。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに逆配向で、目的の遺伝子(複数もある)をライゲートすることによる合成を含む、任意の方法により製造できる。名称“ネガティブ”はアンチセンス鎖に関連して使用することがあり、そして“ポジティブ”はセンス鎖に関連して使用することがある。
ここで使用する用語“ＲＮＡｉ試薬”は、ＲＮＡ干渉(または“ＲＮＡｉ”)機構を介して作用できる化合物および組成物を意味する(一般的な参考として、He and Hannon, (2004) Nat. Genet. 5:522-532参照)。低分子干渉ＲＮＡ(“ｓｉＲＮＡ”)、二本鎖ＲＮＡ(“ｄｓＲＮＡ”)、ショートヘアピンＲＮＡ(“ｓｈＲＮＡ”、‘合成ＲＮＡ’と呼ばれることもある)のようなＲＮＡｉ試薬は一般的に使用されており、その他は開発中である。細胞に導入するときまたは細胞内で合成するとき、ＲＮＡｉ試薬を、巨大分子複合体内に取り込み、それはＲＮＡｉ試薬の鎖を、相補(または実質的に相補)配列を含むＲＮＡ鎖に向け、そして開裂するために使用する。
ここで意図される通り、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋ＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ＳｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡのようなＲＮＡｉ試薬、リボザイムおよび一本鎖ＲＮＡは、阻害性分子の選択したヌクレオチド配列が、内在性ｃＭＡＣタンパク質合成の阻害をもたらすように設計されるように、ｃＭＡＣ発現を阻害するために設計される。例えば、ここの開示に基づいて、ｃＭＡＣヌクレオチド配列の知識を、過度の実験なしにｃＭＡＣ発現を阻害するｓｉＲＮＡ分子の設計に使用し得る。同様に、リボザイムを、目的のタンパク質の特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを開裂するように合成できる(Cech. J. Amer. Med Assn. 260:3030(1988))。遺伝子発現の標的阻害に使用するためのこのような分子を設計する技術は、当業者に既知である。
ここで使用する用語“サンプル”または“生物学的サンプル”は、その最も広い意味で使用する。対象からの生物学的サンプルは血液、尿またはｃＭＡＣタンパク質の活性または遺伝子発現がアッセイできる他の生物学的を含む。
ここで使用する用語“抗体”は“免疫グロブリン”と置き換え可能であり、ヒト、霊長類、齧歯類、ウサギ、およびこのような免疫グロブリンが同定されている多くの他の種のような哺乳動物を含む脊椎動物種に見られる一般的な形態の免疫グロブリンを意味する。特にこのような免疫グロブリンは、軽鎖を欠き、その結果ＶＬパートナーの不存在を反映する可変ドメインを有する、ラクダ科の動物において見られる重鎖抗体を含む。“抗体”は、完全免疫グロブリンに対応する分子、ならびにエピトープ決定基に結合できるそれらのフラグメント、例えばＦａ、Ｆ(ａｂ')２、およびＦｖを意味する。用語“抗体フラグメント”は、より具体的に、完全免疫グロブリンを含まないフラグメントおよび／または免疫グロブリン様ポリペプチドを意味する。
ここで使用する用語“ヒト化抗体”は、ヒト抗体により緊密に似せるために非抗原結合領域中のアミノ酸が置換されているが、まだ元の結合能を保持する、抗体分子を意味する。文脈に応じて、この用語はまた、最初に非霊長類生物から得た抗体が霊長類免疫グロブリンにより密接に似せるために修飾されている、‘霊長類化’抗体も含み得る。
“ｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチド”は、配列番号２のｃＭＡＣタンパク質に特異的に結合する１個以上の結合領域を包含するポリペプチドを意味する。古典的な種類の抗原特異的結合領域は、免疫グロブリンに見られる相補性決定領域(“ＣＤＲ”)である。ＣＤＲは、問題の抗原に特異的に結合し、それが存在するポリペプチドの結合の選択性の基本を提供する、短アミノ酸配列である。ＣＤＲは、典型的に免疫グロブリンから同定されるが、他の手段により産生できる。ＣＤＲは、Kabat定義、Chothia定義(構造ループ領域の位置に基づく)；ＡｂＭ定義(Oxford Molecular's AbM antibody modelling softwareにより使用された２個の折衷案)；およびこれらが抗原との相互作用に関与する残基であるため抗体親和性を修飾するために変異誘発の実行を願う人々には恐らく最も有用である接触定義のような一般的定義を使用して免疫グロブリン上で元々定義された。抗原特異的結合領域もまた、抗原に結合する相対的に短いアミノ酸配列を、たとえ、このような配列がＣＤＲに由来しなくても含む。ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０４４０１１(引用により本明細書に包含させる)は、どのようにして、このような抗原特異的結合領域(ＣＤＲではない)が同定および開発できるかの例を提供する。他の方法は当業者に既知である。開発されたら、ｃＭＡＣ特異的結合領域を、何らかの免疫グロブリンアイソタイプまたはそのフラグメント、および他の非免疫グロブリンフレームワークまたは足場ポリペプチド(本明細書の他の場所に記載)を含む、広範な既知のおよび将来的なフレームワークまたは足場に用いて、抗原結合特異性を提供し得る。全てのこのようなポリペプチドは、ここでは、“ｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチド”と見なす。
ペプチド摸倣物は、正常ポリペプチド機能を摸倣できる、対象ポリペプチドの必須残基の知識に基づいて創成した合成由来のペプチドまたは非ペプチド試薬である。ペプチド摸倣物は、ポリペプチドのその受容体へのまたは他のタンパク質への結合を崩壊させ、故に、ポリペプチドの正常機能を妨害できる。例えば、ｃＭＡＣ摸倣物は、正常ｃＭＡＣ機能を妨害する。
“治療的有効量”は、ｃＭＡＣの機能、活性または発現に関連する病理学的状態の処置、予防または軽減に十分な薬剤の量である。
“処置”は、文脈が暗示し得る通り、予防または軽減を含み、そして、目的が治療、予防、または症状の軽減のみに向いているような処置を含む。
ここで使用する“関連制御タンパク質”および“関連制御ポリペプチド”は、ここに記載のような通常の方法を使用して当業者により同定できる、ｃＭＡＣタンパク質の制御に関連するポリペプチドを意味する。
Ｔ細胞の異常活性化は、過剰な活性化、例えば、ｃＭＡＣタンパク質をコードするｍＲＮＡが上方制御されているまたはｃＭＡＣタンパク質が細胞内で絶対量または特異的活性の増加のいずれかを介して増加した活性または量を有する状態を含み得る；異常活性化はまた、同様にｃＭＡＣ遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性の下方制御がある、または異常に低いＴ細胞活性化がある状態も含み得る。
処置を受けることに関連して使用するとき、“対象”は、全てのヒトまたは非ヒト生物を意味する。
その最も広い意味で、ヌクレオチド配列に関連してここで使用されるとき、用語“実質的に類似”または“等価物”は、参照ｃＭＡＣヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味し、ここで、対応配列は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するポリペプチドをコードし、ここで、例えば生じるポリペプチド機能に影響しないアミノ酸のみが変化している。望ましくは、実質的に類似のヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドをコードする。実質的に類似のヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列の間の同一性は、望ましくは少なくとも８０％、より望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、または９８％、さらに好ましくは少なくとも９９％である。
参照ヌクレオチド配列に“実質的に類似”のヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列に７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１mM ＥＤＴＡ中、５０℃と２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃の洗浄で、より望ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１mM ＥＤＴＡ中、５０℃と１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃の洗浄で、さらに望ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１mM ＥＤＴＡ中、５０℃と０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃の洗浄で、好ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１mM ＥＤＴＡ中、５０℃と０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃の洗浄で、より好ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１mM ＥＤＴＡ中、５０℃と０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで６５℃の洗浄でハイブリダイズし、なおさらに機能的に同等な遺伝子産物をコードする。一般に、ハイブリダイゼーション条件は、高度にストリンジェントまたはあまり高度でないストリンジェントであり得る。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド(“オリゴ”)であるとき、高度にストリンジェント条件は、例えば、６×ＳＳＣ／０.０５％ピロリン酸ナトリウムで３７℃(１４塩基オリゴについて)、４８℃(１７塩基オリゴについて)、５５℃(２０塩基オリゴについて)、および６０℃(２３塩基オリゴについて)での洗浄を意味し得る。種々の蘇生の核酸についてのこのようなストリンジェンシー条件の適当な範囲は、上記に引用のKrause and Aaronson (1991), Methods in Enzymology, 200:546-556 in addition to Maniatis et alに記載されている。
ポリペプチド配列について使用するとき、“実質的に類似”は、このようなタンパク質の全長中少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％のアミノ酸配列同一性を含むアイソフォーム、ホモログ、オルソログおよび修飾配列を含む、ｃＭＡＣポリペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するタンパク質配列のような、ここに開示のｃＭＡＣポリペプチドに対応するタンパク質配列を意味する。
ここで使用する“機能的等価物”は、上記の異なって発現される遺伝子配列によりコードされる内在性の異なって発現される遺伝子産物と実質的に類似のインビボまたはインビトロ活性を示すことができるタンパク質またはポリペプチドを意味し得る。“機能的等価物”はまた、内在性異なって発現される遺伝子産物の対応部分が行うのと実質的に類似の方法で他の細胞性または細胞外分子と相互作用できるタンパク質またはポリペプチドも意味し得る。例えば、“機能的に同等な”ペプチドは、免疫アッセイにおいて、抗体の内在性タンパク質の対応ペプチド(すなわち、“機能的に同等な”ペプチドを達成するためにアミノ酸配列が修飾されたペプチド)、または内在性タンパク質それ自体への結合を低下させることができ、ここで、抗体は、内在性タンパク質の対応ペプチドに対して産生させた。等モル量の機能的に同等なペプチドは、対応ペプチドの前記結合を、少なくとも約５％、好ましくは約５％から１０％、より好ましくは約１０％から２５％、さらに好ましくは約２５％から５０％、および最も好ましくは約４０％から５０％低下させる。
“フラグメント”は、１個以上の欠失したアミノ酸残基を有する、天然に存在する成熟、天然または内在性完全長ｃＭＡＣ配列の一部である。欠失したアミノ酸残基(複数もある)は、Ｎ末端またはＣ末端末のいずれかまたは内部を含み、ポリペプチドのどこにでも起こり得る。このようなフラグメントは、ｃＭＡＣと共通した少なくとも１種の生物学的特性を有する。ｃＭＡＣフラグメントは、典型的に、配列番号２のｃＭＡＣを含む哺乳動物から単離されたｃＭＡＣの配列と同一である少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸残基の連続配列を有する。
“上昇したｍＲＮＡの転写”は、本発明のｃＭＡＣポリペプチドをコードする天然の内在性ヒト遺伝子が、ｃＭＡＣ遺伝子発現の異常活性化またはＴ細胞の異常活性化に関連する病理学的状態を有する個体の適当な組織または細胞中で、コントロールレベルと比較して、特に、このような状態を有しない対象における対応する組織のｍＲＮＡの量の少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、最も好ましくは少なくとも約１００倍の、大量のメッセンジャーＲＮＡから転写されることを意味する。そのようなｍＲＮＡの上昇したレベルは、最終的に、健康な個体と比較して、該状態を有する個体におけるこのようなｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の増加したレベルに至り得る。
ここで使用する“宿主細胞”は、該細胞に任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染などで導入された異種ＤＮＡを含む原核生物または真核生物細胞を意味する。
ここで使用する“異種”は、“異なる天然起源”を意味するか、または非天然状態を意味する。例えば、宿主細胞を、他の生物、特に他の種由来のＤＮＡまたは遺伝子で形質転換したとき、その遺伝子は、宿主細胞に関しておよびまたその遺伝子を担持する該宿主細胞の子孫に関して異種である。同様に、異種は、同じ天然の、元の細胞型に由来し、そしてその中に導入されているが、非天然状態である、例えば、コピー数が異なる、または異なる制御要素の制御下にあるヌクレオチド配列を意味する。
“ベクター”分子は、異種核酸を導入し得る核酸分子であり、その後それは適当な宿主細胞に導入できる。ベクターは、好ましくは１個以上の複製起点、および組み換えＤＮＡを導入できる１個以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞を有しないものから選択できる簡便な手段を有し、例えば、それらは薬剤耐性遺伝子をコードする。一般的なベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、および(主に酵母および細菌)中の“人工染色体”を含む。
用語“単離”は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存在するならば、天然環境)から除かれていることを意味する。例えば、生存動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系で共存するいくつかのまたは全ての物質から離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それがその後該天然系に再導入されても、単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部でありおよび／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり、なおさらに、そのようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部ではない点で、まだ単離されている。
ここで使用する用語“転写制御配列”は、それらが操作可能に連結している核酸配列がコードするタンパク質の転写を誘発、抑制または他の方法で制御する、イニシエーター配列、エンハンサー配列、およびプロモーター配列のようなＤＮＡ配列を意味する。
ここで使用する“ヒト転写制御配列”は、それが各ヒト染色体において見られるように、本発明のｃＭＡＣタンパク質をコードするヒト遺伝子と通常関連が見られる転写制御配列である。
ここで使用する“非ヒト転写制御配列”は、ヒトゲノムには見られない何らかの転写制御配列である。
ここで使用する本発明のポリペプチドの“化学誘導体”は、通常その分子の一部ではない付加的な化学部分を含む、本発明のポリペプチドである。そのような部分は、分子の溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善する。本部分は、あるいは分子の毒性を低下させ、分子の何らかの望まない副作用などを除くかまたは減弱し得る。このような効果を仲介できる部分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980)に開示されている。
導入
本発明は、以前には公的配列データベースで“ホモ・サピエンス仮説タンパク質MGC14327(MGC14327)、ｍＲＮＡ. (GenBank Accession No. NM_053045)”と呼ばれ、これまで未知の機能であったｃＭＡＣ(“カルシニューリンの保存的膜アクティベーター”)タンパク質が、カルシニューリン経路を介して機能するＮＦＡＴおよびＴＯＲＣ１核転位の強力なレギュレーターであり、Ｔ細胞活性化に重要な役割を有すると驚くべき発見に基づく(表１、図１１)。
Figure 2009511013
ここで使用する“ｃＭＡＣ”は、文脈に応じて、ｃＭＡＣタンパク質、またはｃＭＡＣタンパク質をコードする配列を含む核酸(例えばｃＭＡＣ遺伝子)、またはフラグメントまたはそれらの融合体を意味する。
ここに開示のｃＭＡＣタンパク質は、ここで同定されたｃＭＡＣポリペプチド、ヒト、霊長類、哺乳動物、脊椎動物、無脊椎動物または何らかの他の種由来の部分形態、ホモログ、アイソフォーム、前駆形態、完全長ポリペプチド、該タンパク質配列を含む融合タンパク質、ｃＭＡＣに実質的に類似または同等なタンパク質、または上記いずれかのフラグメントを含むがこれらに限定されない、これらのポリペプチドの何らかのおよび全ての形態を含む。
本発明はまたｃＭＡＣ ｍＲＮＡの転写、機能および安定性に関連する核酸も包含する(表２、図１２および１３)：
Figure 2009511013
目的のｃＭＡＣフラグメントは、通常のｃＭＡＣ機能のために特に重要であるアミノ酸を含むフラグメントを含むが、これに限定されない。表３および図１に説明するようなｃＭＡＣの予測される経膜構造に基づいて、本ポリペプチドを以下のドメインに細分割できる：
Figure 2009511013
膜の内側および外側の明示は、実験的確認を必要とするが、ヒトｃＭＡＣ NM_053045、NP_444273.1についてのＴＭＨＭＭ予測の分析に従うと、治療用抗体のための特に興味深い領域(例えばエピトープ)は、膜外アミノ酸配列１−１２、３６−４９、７３−７８、１０２−１１０、１３１−１３６を含む。
ｃＭＡＣの構造および保存
ヒトｃＭＡＣ ｃＤＮＡは、１３６アミノ酸の疎水性タンパク質をコードする。経膜へリックスを予測するアルゴリズムでの一次アミノ酸配列の予測は、ｃＭＡＣが、４個の経膜ドメインならびに短ＮおよびＣ末端細胞質ドメインを有する膜内在性タンパク質であることを示す、図１。該タンパク質の翻訳後修飾のための２個の可能性のある部位が、モチーフｓＧＣＧプログラムを使用して発見された。可能性のあるタンパク質キナーゼＣ(ＰＫＣ)リン酸化部位およびカゼインキナーゼIIリン酸化部位は、セリン４で同定された。Ｓｅｒ４での提案されるＰＫＣリン酸化部位が予測され、そして同定した全脊椎動物ｃＭＡＣ遺伝子において保存されている。さらなる可能性のあるＰＫＣ部位がまた残基７３(ＳＶＲ)および９７(ＳＬＫ)に存在する。Ｔ細胞に存在する優勢ＰＫＣアイソフォームはＰＫＣθであり、それはＴ細胞活性化に重要であることが知られている。Ｔ細胞活性化中、ＰＫＣθが原形質膜脂質ラフトに存在し(Khoshnan et al. J. Immunol. 165(12):6933-40(2000))、それはシグナル伝達に関与する多くの成分(刺激により一過性のこともある)を含む、界面活性剤不溶性コレステロール富膜ドメインである。興味深いことに、Ｂ細胞において提案されるカルシウムチャネル、ＣＤ２０もまたＢ細胞活性化に必須の４ＴＭタンパク質である。ＣＤ２０は、脂質ラフトと構造的に関連することが知られている。ｃＭＡＣがＰＫＣの基質であるか否かを決定する必要性が残っているが、ＴＣＲ／ＣＤ２８刺激後に活性化されるＰＫＣを介して制御機能を提供し得るｃＭＡＣアミノ酸配列におけるモチーフの発見が切実である。イソプレニル化部位もヒト、ラット、マウス、ゼブラフィッシュおよびツメガエルｃＭＡＣ予測タンパク質からのシステイン１３４で同定された。
ｃＭＡＣは非常に保存されたタンパク質である。ここに開示の他の種からのｃＭＡＣのオルソログは図２および１５に明示する。ヒトｃＭＡＣタンパク質は、予測マウスタンパク質と９７％同一であり、Xenopus tropicalisおよびDanio rerioタンパク質と各々８２％および７８％同一である。興味深いことに、古い脊椎動物種ナメクジウオによりコードされる遺伝子は、ヒトｃＭＡＣと５４％同一である。合計で、１３６アミノ酸のうち６３個が全脊椎動物ｃＭＡＣ中で保存されており、９９／１３６アミノ酸が同一であるか、保存的変化を示す。興味深いことに、脊椎動物オルソログと比較して顕著に低い相同性レベル(各々３９％および２７％同一)の類似タンパク質がショウジョウバエおよび線虫タンパク質の無脊椎動物にも存在する。これらの昆虫遺伝子が実際にｃＭＡＣオルソログであるか否かは明らかではない。ここに記載の脊椎動物および無脊椎動物タンパク質を、相互に採点し、最高Ｂｌａｓｔヒットは、それらがオルソログおよび／または一つの先祖遺伝子に由来するようであることを示唆した。現代的な適応免疫系を含む生物においてｃＭＡＣタンパク質配列が最も高度に保存されていることに注意することは興味深い。特に、ｃＭＡＣは、Ｔ細胞を含む動物で高度に保存され(例えば哺乳動物、魚および両生類で＞８０％同一性)、適応免疫のために集合すべき運命の遺伝子の多くのオルソログおよびホモログを有するが、まだ発達したリンパ球を有しないナメクジウオではより異なり(５４％同一)、リンパ球に対する何らかの相関物を欠く無脊椎動物では最も異なる。故に、ｃＭＡＣが、脊椎動物適応免疫系の発展に沿って進化している可能性および、Ｔ細胞活性化および恐らくＢ細胞活性化に必要な容量性カルシウムシグナリングに中心的役割を有することがどうしても推測される。
各種において、一つのｃＭＡＣオルソログが存在し、保存されている。ｃＭＡＣは、４ＴＭドメインタンパク質をコードすることが予測される(図１に説明)。ｃＭＡＣがカルシウム介在シグナルトランスデューサーの新規遺伝子ファミリーを表すことが推測される。
ｃＭＡＣのホモログおよびオルソログはここに記載のもの(例えば表４および図１４および１５)、および当業者には明らかであるものを含み、本発明の範囲内に包含されることが意図される。例えば、本発明において意図される小分子のスクリーニングアッセイは、ヒトｃＭＡＣホモログまたは他の霊長類、哺乳動物、脊椎動物または無脊椎動物のような異なる種由来のｃＭＡＣオルソログを使用する。ｃＭＡＣタンパク質が、ゲノムＤＮＡライブラリーのような何らかの種の天然に存在する源、ならびに発現系を含む遺伝子改変宿主細胞から単離されたもの、または、例えば、自動ペプチド合成装置を使用して、化学的合成により製造されたもの、またはこのような方法の組合せを含むことも意図する。このようなポリペプチドの単離および製造手段は当分野で十分理解されている。
Figure 2009511013
本発明はまた何らかのタンパク質のフラグメントまたは配列番号１−２１に明示のタンパク質のフラグメントをコードする核酸も含む。
さらなるホモログも、当分野で既知の分子生物学的技術により、過度の実験なく、同定し、容易に単離できる。さらに、このような遺伝子産物の１個以上のドメインと非常に相同性を有するタンパク質をコードするゲノム内の他の遺伝子座位に存在する遺伝子があり得る。これらの遺伝子も類似の技術を介して同定できる。
ｃＭＡＣの機能および役割、および細胞型局在化。
何らかの特定の理論に縛られることを意図しないが、ヒトｃＭＡＣが、図１に説明する通り経膜タンパク質であることは可能である。生物情報学分析は、数個のドメインが膜内および膜外形態を採択する傾向であることを示す。この予測は、治療設定においてｃＭＡＣを阻害または活性化するための抗体の使用の可能性を強める。
ｃＭＡＣポリペプチドの機能または生物学的活性は、本明細書の実施例により証明される通り、Ｔ細胞の機能的活性化において明らかに確立されている。ｃＭＡＣの他の生物学的活性は、研究が進むに連れさらにはっきりするであろう。ｃＭＡＣのより特異的な生物学的活性のいくつかは、実施例に基づいてこのような結論が導かれる通り、ＴＯＲＣの核転位、ＮＦＡＴの核転位、およびｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)駆動遺伝子発現を含む。ｃＭＡＣは、例として、イオンチャネル、例えばカルシウムチャネル(電位開口型またはリガンド開口型)としてのいくつかの生化学活性を有し；およびＴ細胞のカルシウム依存性活性化において活性を有し得る。特異的生化学活性はまたミリスチン化(myristilization)、グリコシル化、リン酸化、脱リン酸化および他の翻訳後修飾の標的として、細胞膜および細胞−膜の成分との相互作用も含む。ここの開示に基づいて、当業者は、ｃＭＡＣのこれらおよび他の生物学的活性を同定できる。本発明は、ｃＭＡＣのこれらの活性の１種以上の調節(例えば阻害または増加)の方法を開示する。このような方法は、ｃＭＡＣの同定されたモジュレーターでの治療適用、またはスクリーニングアッセイまたは他の研究ツールにおけるような研究および発見使用のためであり得る。
ｃＭＡＣ ｍＲＮＡは、種々のヒト細胞型において同定されている。図３は、リンパ球、特にＴ細胞における最高レベルのｃＭＡＣを同定する。ほとんどの他の組織もまたある程度のレベルのｃＭＡＣを示し、ｃＭＡＣがカルシウムシグナリングに関連する疾患の調節において一般的に役立つことを示す。
ｃＭＡＣの発現。ｃＭＡＣを発現する細胞の概観を得るために、Affymetrix発現プロファイリングにより示される、多くの組織および細胞型におけるｍＲＮＡのレベルを試験した。図３に示す通り、ｃＭＡＣは広く発現された。しかしながら、観察される最高レベルの発現は、ＴおよびＢ細胞集団においてであった。これらのリンパ球調節物における平均発現レベルは、試験した全組織で見られる発現中央値の３〜１０倍高かった。ｃＭＡＣ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を他の方法で調べているが、これらの結果は、ｃＭＡＣがリンパ球集団において富化され得ることを示唆する。
Ｔ細胞での優勢な存在は、抗ｃＭＡＣ抗体および他のｃＭＡＣ結合性化合物が優勢的にＴ細胞を標的とすることを示唆する；このような抗体または化合物は、本明細書の他の場所でより詳しく記載する通り、多くの顕著な治療および研究用途を有する。
故に、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメント、または配列番号２またはその機能的同等物と少なくとも５０％の配列同一性を有し、天然配列番号２のイオン輸送、イオン拡散、Ｔ細胞のカルシウム依存性活性化、ＴＯＲＣの核転位、ＮＦＡＴの核転位またはｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)駆動遺伝子発現活性から選択される生物学的活性を示す実質的に類似のタンパク質配列を含む、またはそれから成る単離ポリペプチドを提供する。従って、本発明は、さらに、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１のポリペプチドを提供する。さらに、このようなポリペプチドは、例えば、配列番号２の全てまたは一部を含む融合タンパク質であり得る。
本発明はまたｃＭＡＣタンパク質をコードする単離核酸またはヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子、特に配列番号１、配列番号１１または配列番号１２も含む。本発明はまた、配列番号２または配列番号１３から２１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、本発明の単離核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も開示する。
本発明はまた：(ａ)ｃＭＡＣタンパク質のヌクレオチド配列、特に配列番号１、配列番号１１または配列番号１２またはそのフラグメントおよび／またはそれらの相補体(すなわち、アンチセンス)を含むベクター；(ｂ)コード配列の発現を指示する制御要素と操作可能に結合したここに開示のｃＭＡＣタンパク質のいずれかのコード配列を含むベクター分子、好ましくは転写制御配列を含むベクター分子、特に発現ベクター；および(ｃ)ここに記載のベクター分子または宿主細胞中でコード配列の発現を指示する制御要素と操作可能に結合した前記のヌクレオチド配列のいずれかの少なくともフラグメントを含む、遺伝子改変宿主細胞も含む。ここで使用する制御要素は、誘導型および非誘導型プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を駆動および制御することが当業者に既知の他の要素を含むが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は脊椎動物宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞、例えばヒト細胞または齧歯類細胞、例えばＣＨＯまたはＢＨＫ細胞であり得る。同様に好ましいのは、宿主細胞が細菌宿主細胞、特に大腸菌細胞であり得る。
本発明は、故にｃＭＡＣの核酸配列(配列番号１)を含むベクター分子、およびこのようなベクター分子を含む宿主細胞を包含する。
特に好ましいのは、インビトロで繁殖できるおよび培養での増殖によりｃＭＡＣポリペプチド、特に配列番号２に明示のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るポリペプチドを産生できる、特に上記タイプの宿主細胞であり、ここで、該細胞は、該ポリペプチドをコードする天然内在性ヒト遺伝子の転写制御配列ではない少なくとも１個の転写制御配列を有し、ここで、該１個以上の転写制御配列は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を制御する。
このベクターまたは宿主細胞は、配列番号２のｃＭＡＣポリペプチドの製造方法であって、その中にｃＭＡＣベクターを含む発現ベクターが組み込まれた宿主細胞を、該宿主細胞中での該ポリペプチドの発現に十分な条件下で培養することを含む、方法に使用できる。
本発明はまたここに開示の核酸配列のいずれかのフラグメントも含む。配列番号１および配列番号３の核酸配列のフラグメントは、完全長遺伝子を単離するためおよび類似の生物学的活性のｃＭＡＣ遺伝子に高配列類似性を有する他の遺伝子を単離するためのｃＤＮＡライブラリーについてのハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも約２０塩基を有し、例えば、約３０から約５０塩基、約５０から約１００塩基、約１００から約２００塩基、または２００塩基以上を含み得る。本プローブはまた完全長転写物に対応するｃＤＮＡクローン、および制御およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを含む完全ｃＭＡＣ遺伝子を含む１個または複数個のゲノムクローンの同定にも使用できる。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のＤＮＡ配列を使用することによる、ｃＭＡＣ遺伝子のコード領域の単離を含む。本発明の遺伝子と相補的な鎖を有する標識オリゴヌクレオチドをヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーのスクリーニングに使用して、ライブラリーのどのメンバーと該プローブがハイブリダイズするかを決定する。
ｃＭＡＣポリペプチドをコードする本発明の単離ヌクレオチド配列を標識し、目的の生物から得たｍＲＮＡから構築したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用できる。ハイブリダイゼーション条件は、ｃＤＮＡライブラリーが、標識配列が由来した生物のものと異なるタイプの生物であるとき、低いストリンジェンシーである。あるいは、本標識フラグメントを使用して、同様に適当なストリンジェント条件を使用して、目的の生物由来のゲノムライブラリーをスクリーニングできる。そのような低ストリンジェンシー条件は当業者に既知であり、ライブラリーおよび標識配列が由来する具体的生物に依存して、予想通り異なる。このような条件に関するガイダンスのために、例えば、上記のSambrook et al. を参照のこと。
ＰＣＲ技術も、ｃＭＡＣに実質的に類似の完全または部分的ｃＤＮＡ配列の単離に使用できる。例えば、ＲＮＡを、標準法に従い、適当な細胞または組織源から単離できる。逆転写反応を、第一鎖合成を誘発するために増幅したフラグメントの最も５'末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＲＮＡ上で行うことができる。得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、次いで標準末端トランスフェラーゼ反応を使用してグアニンで“尾付加”してよく、本ハイブリッドをＲＮＡａｓｅ Ｈで消化してよく、次いで、第二鎖合成をポリＣプライマーで誘発してよい。故に、増幅したフラグメントのｃＤＮＡ配列上流を容易に単離できる。使用し得るクローニングストラテジーのレビューのために、例えば、上記のSambrook et al. を参照のこと。
同定された遺伝子が正常、または野生型遺伝子であるとき、この遺伝子を使用して、該遺伝子の変異対立遺伝子を同定できる。そのような単離は、遺伝的基礎を有することが既知のまたは疑われる過程および障害に好ましい。変異対立遺伝子を、炎症または免疫応答に関連する疾患症状に関与する遺伝子型を有することが既知のまたは疑われる個体から単離し得る。次いで、変異対立遺伝子および変異対立遺伝子産物を、以下の診断アッセイ系に利用できる。
変異遺伝子のｃＤＮＡを、例えば、当業者に既知の技術であるＰＣＲを使用して、単離できる。この場合、第一ｃＤＮＡ鎖をオリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドを、変異対立遺伝子を担持することが推定される個体において発現されることが既知のまたは疑われる組織から単離したｍＲＮＡとハイブリダイズし、該新鎖を逆転写酵素で伸長することにより合成できる。次いで、ｃＤＮＡの第二鎖を、正常遺伝子の５'末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用して合成する。これらの２個のプライマーを使用して、次いで、産物をＰＣＲを介して増幅し、適当なベクターにクローン化し、そして当業者に既知の方法を介してＤＮＡ配列分析に付す。変異遺伝子のＤＮＡ配列と正常遺伝子のそれを比較することにより、変異遺伝子産物の機能の損失または改変を担う変異(複数もある)が確認できる。
あるいは、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを、変異対立遺伝子を担持することが疑われるまたは既知の個体中の目的の遺伝子を発現することが既知のまたは疑われる組織由来のＤＮＡまたはＲＮＡ各々から構築し、スクリーニングできる。正常遺伝子または何らかの適当なそのフラグメントを次いで標識し、ライブラリー中の対応変異対立遺伝子を同定するためのプローブとして使用できる。この遺伝子を含むクローンを、次いで、当分野で日常的に実施されている方法を介して精製し、上記の通りの配列分析に付し得る。
本発明は、機能的に同等なｃＭＡＣ遺伝子産物を示すタンパク質を含む。そのような同等な遺伝子産物は、上記の遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列内にアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含み得て、故に、機能的に同等な遺伝子産物を産生する。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性特性の類似性に基づいて成し得る。
例えば、無極性(疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む；極性中性アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む；正電荷(塩基)アミノ酸はアルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む；および負電荷(酸性)アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
ここに記載のデータは、特定のポリペプチドフラグメントが、ｃＭＡＣタンパク質の一定の活性に有用であることを示す。故に、これらのｃＭＡＣペプチドフラグメントならびにここに開示のｃＭＡＣポリペプチドの活性部分をコードする核酸のフラグメント、および該フラグメントを含むベクターもまた本発明の範囲内である。ここで使用するｃＭＡＣポリペプチドの活性部分をコードする核酸のフラグメントは、ｃＭＡＣポリペプチドの全アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりも少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を意味し、それはここで定義の通りのｃＭＡＣタンパク質の活性を有するペプチド(すなわち、ｃＭＡＣタンパク質の少なくとも１種の生物学的活性を有するペプチド)をコードする。一般に、ｃＭＡＣタンパク質の活性を有するペプチドをコードする核酸は成熟タンパク質をコードする塩基から選択される。しかしながら、ある場合、ｃＭＡＣタンパク質の核酸のリーダー配列部分から全てまたは一部のペプチドを選択することが望まれることがある。これらの核酸はまたリンカー配列、修飾制限エンドヌクレアーゼ部位および分子クローニング、発現または精製に有用な他の配列も含んでよく、または、またはｃＭＡＣタンパク質の少なくとも１種の生物学的活性を有する組み換えペプチドである。ｃＭＡＣペプチドフラグメントならびにｃＭＡＣタンパク質の活性を有するペプチドフラグメントをコードする核酸は、慣用法により得ることができる。
加えて、これらのペプチドフラグメントを指向する抗体を以下に記載の通り製造できる。ペプチドの免疫原性を増加し得るこれらのポリペプチドフラグメントへの修飾(例えば、アミノ酸置換)もまた用い得る。同様に、当業者によく知られた方法を使用して、ｃＭＡＣタンパク質の該ペプチドを修飾して、シグナルまたはリーダー配列を含ませるか、またはリンカーまたは分子操作を容易にする配列と連結し得る。
本発明のポリペプチドを、当分野で既知の技術を使用して、組み換えＤＮＡ技術により製造できる。故に、本発明のポリペプチドの製造方法が提供され、その方法は、その中に配列番号２、１３−２１、好ましくは配列番号２に明示のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする外来性のポリヌクレオチドを含む発現ベクターが組み込まれた宿主細胞を、該宿主細胞中での該ポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより発現ポリペプチドの産生をもたらすことを含む。所望により、該方法は、さらに、該細胞により産生されたポリペプチドを回収することを含む。このような方法の好ましい態様において、該外来性のポリヌクレオチドは、配列番号２に明示のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードする。好ましくは、該外来性のポリヌクレオチドは、配列番号１のいずれかに明示のヌクレオチド配列を含む。
故に、各ポリペプチド配列をコードする核酸の発現により、本発明のポリペプチドおよびペプチドを製造する方法が、ここに記載される。当業者に既知の方法を使用して、タンパク質−コード配列および適当な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築できる。これらの方法は、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組み換え／遺伝子組み換えを含む。例えば、Sambrook et al., 1989, supra, およびAusubel et al., 1989, supraに記載の方法を参照のこと。あるいは、異なって発現される遺伝子タンパク質配列をコードできるＲＮＡを、例えば、合成装置を使用して科学的に合成できる。例えば、その全体を引用により本明細書に包含させる“Oligonucleotide Synthesis”, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxfordに記載の技術を参照のこと。
種々の宿主−発現ベクター系を使用して、本発明遺伝子コード配列を発現できる。そのような宿主−発現系は、目的のコード配列を製造し、その後精製できる媒体を表すが、また適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトしたとき、本発明のタンパク質をインサイチュで示すことができる細胞も表す。これらは微生物、例えばｃＭＡＣタンパク質コード配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌、枯草菌)；ｃＭＡＣタンパク質コード配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば酵母類、ピキア)；ｃＭＡＣタンパク質コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染またはトランスフェクトした昆虫細胞系；組み換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ)で感染させたまたはｃＭＡＣタンパク質コード配列を含むプラスミド(例えば、Ｔｉプラスミド)を含む組み換えベクターで形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細胞(例えば、メタロチオネインプロモーター)のゲノムまたは哺乳動物ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７.５Ｋプロモーター、またはＣＭＶプロモーター)由来のプロモーターを含む組み換え発現構築物を担持する哺乳動物細胞系(例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３)を含むが、これらに限定されない。
細胞にとって天然であるｃＭＡＣコード遺伝子から、該細胞により本発明のｃＭＡＣタンパク質を発現させる方法も行うことができる。このような発現方法は、例えば、全てその全体を引用により本明細書に包含させる米国特許５,６４１,６７０；５,７３３,７６１；５,９６８,５０２；および５,９９４,１２７に詳述されている。米国特許５,６４１,６７０；５,７３３,７６１；５,９６８,５０２；および５,９９４,１２７の方法によりｃＭＡＣの発現が誘導されている細胞を、組織中のｃＭＡＣの局所濃度を増加させるために、生存動物の望む組織にインプラントできる。このような方法は、例えば、ＣＲＥＢ機能の損失が起こる神経変性状態のための治療用意味を有し、そして、それ自体アゴニストおよび／または外来ｃＭＡＣタンパク質は該状態の処置に有用であり得る。
細菌系において、多くの発現ベクターを、発現するタンパク質について意図される使用に依存して有利に選択できる。例えば、抗体の産生またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、大量のこのようなタンパク質を製造すべきとき、例えば、容易に精製できる融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望まれ得る。この点について、ヘキサヒスチジンタグを含む融合タンパク質を、多くのベンダー(例えばQiagen, Valencia, CA)により提供されるように、使用できる(Sisk et al, 1994:J. Virol 68:766-775)。そのようなベクターは、タンパク質コード配列が個々にベクターにｌａｃ Ｚコード領域と共にライゲートし得て、それにより融合タンパク質を製造する、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８(Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791)；ｐＩＮベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109;Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509)；などを含むが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞からグルタチオン−アガロースビーズへの吸着と、その後の遊離グルタチオンの存在下での溶出により容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計され、その結果標的遺伝子タンパク質がＧＳＴ部分から容易に放出され得る。
プロモーター領域は、候補プロモーターフラグメント；すなわち、プロモーターを含み得るフラグメントを導入するための１箇所または複数箇所の下流に、制限部位プロモーター領域を欠くレポーター転写ユニット、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(“ＣＡＴ”)、またはルシフェラーゼ転写ユニットを含むベクターを使用して、何らかの望む遺伝子から選択できる。例えば、ベクターへのＣＡＴ遺伝子の上流制限部位でのプロモーター含有フラグメントの導入はＣＡＴ活性の産生を生じ、それは標準ＣＡＴアッセイで検出できる。この目的に適当なベクターは既知であり、容易に利用可能である。２種のこのようなベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。故に、本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターは既知で容易に利用できるプロモーターだけでなく、前記の技術により、レポーター遺伝子を使用して容易に得ることができるプロモーターも含む。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現のために適当な既知の細菌プロモーターの一員は、大腸菌ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、Ｔ５ ｔａｃプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモーター。この点で適当な既知の真核生物プロモーターの一員は、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(“ＲＳＶ”)のもののようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターである。
昆虫系において、Autographa californica核多角体病ウイルス(ＡｃＮＰＶ)は、外来遺伝子を発現させるベクターとして使用できる数種の昆虫系の一つである。本ウイルスは、Spodoptera frugiperd細胞中で増殖する。コード配列を個々に、ウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)中にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター(例えばポリヘドリンプロモーター)の制御下に置き得る。コード配列の導入の精巧は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉塞組み換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質様コートを欠くウイルス)の産生に至る。これらの組み換えウイルスを、次いでSpodoptera frugiperd細胞の感染に使用し、その中で遺伝子が発現する。(例えば、Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584；Smith、米国特許４,２１５,０５１)参照。
哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルスを利用した発現系を利用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用するとき、目的のコード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三者間リーダー配列にライゲートできる。次いで、このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組み換えによりアデノウイルスゲノムに導入できる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域Ｅ１またはＥ３)への導入は、感染した宿主内で生存し、望むタンパク質を発現できる組み換えウイルスをもたらす。(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659参照)。特異的開始シグナルも、導入遺伝子コード配列の効率的な翻訳に必要であり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全遺伝子を適当な発現ベクターに導入するとき、付加的翻訳制御シグナルは必要でないかもしれない。しかしながら、遺伝子コード配列の一部のみを導入するとき、恐らくＡＴＧ開始コドンを含む外来翻訳制御シグナルを提供すべきである。さらに、本開始コドンは、全導入物の翻訳を確実にするために望むコード配列のリーディングフレームと一致しなければならない。これらの外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の種々の起源のものであり得る。発現効率は適当な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどの導入により促進し得る(Bittner et al., 1987, Method in Enzymol. 153:516-544参照)。他の一般的な系はＳＶ４０、レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに基づく。宿主細胞中での発現のための適当なベクターおよびプロモーターの選択は既知の方法であり、発現ベクター構築、ベクターの宿主への導入および宿主における発現のための技術それ自体当分野で日常的な技術である。一般に、組み換え発現ベクターは複製起点、下流構造配列の転写を指示するための高度に発現した遺伝子由来のプロモーター、およびベクターへの暴露後にベクター含有細胞の単離を可能にする選択可能マーカーを含む。
加えて、導入配列の発現を調節する、または望む特異的形態で遺伝子産物を修飾および加工する宿主細胞株を選択できる。タンパク質産物のそのような修飾(例えば、グリコシル化)および加工(例えば、開裂)はタンパク質機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞が、タンパク質の翻訳後加工および修飾のための特徴的および特的機構を有する。適当な細胞系または宿主系を、発現される外来タンパク質の正しい修飾および加工を確実にするために選択できる。この目的のために、一次転写物の正しい加工、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞性機構を有する真核生物宿主細胞を使用できる。そのような哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などを含むが、これらに限定されない。
本発明はまた組み換えｃＭＡＣペプチドおよびｃＭＡＣタンパク質の活性を有するペプチドフラグメントも含む。用語“組み換えペプチド”は、組み換え技術により産生された本発明のタンパク質を意味し、ここで、一般にｃＭＡＣ活性フラグメントをコードするＤＮＡが適当な発現ベクター内に導入され、次にそれが異種タンパク質を製造するための宿主細胞の形質転換に使用される。
本発明の組み換えタンパク質はまた、当業者によく知られた技術に従い製造できる、ｃＭＡＣと異なるポリペプチドのキメラまたは融合タンパク質も含み得る(例えば、Current Protocols in Molecular Biology;Eds Ausubel et al. John Wiley & Sons;1992;PNAS 85:4879(1988)参照)。
組み換えタンパク質の長期の、高収率産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、異なって発現される遺伝子タンパク質を安定に発現する細胞系を設計できる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞を、適当な発現制御要素(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)により制御されたＤＮＡおよび選択可能マーカーで形質転換し得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、設計した細胞を富化培地で１−２日間増殖させ、次いで選択培地に移す。組み換えプラスミド中の選択可能マーカーが選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に統合するのを可能にし、増殖巣を形成させるために増殖させ、次いでそれを細胞系にクローン化し、拡張できる。この方法は、異なって発現される遺伝子タンパク質を発現する細胞系の設計に有利に使用できる。そのような設計した細胞系は、特に発現されたタンパク質の内在性活性に影響する化合物のスクリーニングおよび評価に有用であり得る。
それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler, et al., 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy, et al., 1980, Cell 22:817)遺伝子をを含むが、これらに限定されない多くの選択系を使用できる。また、代謝拮抗剤耐性を、メトトレキサートへの耐性に寄与するｄｈｆｒ遺伝子(Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567;O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527)；ミコフェノール酸に対する耐性に寄与するｇｐｔ遺伝子(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072)；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性に寄与するｎｅｏ遺伝子(Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1)；およびヒグロマイシンに対する耐性に寄与するｈｙｇｒｏ遺伝子(Santerre, et al., 1984, Gene 30:147)の選択のための基礎とそして使用できる。
別の融合タンパク質系は、ヒト細胞系において発現された非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする(Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976)。この系において、目的の遺伝子を、遺伝子のオープンリーディングフレームが６個のヒスチジン残基から成るアミノ末端タグに翻訳性に融合するようにワクシニア組み換えプラスミドにサブクローン化する。組み換えワクシニアウイルスで感染した細胞からの抽出物をＮｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラム上に載せ、ヒスチジンタグ付加タンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出する。
以下のようなアッセイ系における要素として使用するとき、本発明のタンパク質を直接的または間接的に標識し、タンパク質と試験物質の間で形成された複合体の検出を容易にし得る。１２５Ｉのような放射性同位体；基質に曝したときに検出可能な熱量測定シグナルまたは光を産生する酵素標識系；および蛍光標識を含むが、これらに限定されない種々の適当な標識系を使用できる。
組み換えＤＮＡ技術を、このようなアッセイ系のための本発明のタンパク質の製造に使用するとき、標識、固定化、検出および／または単離を容易にし得る融合タンパク質を設計することが有利であり得る。
間接標識は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する標識抗体のようなタンパク質を含む。このような抗体はポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーから産生されたフラグメントを含むが、これらに限定されない。
スクリーニングアッセイにおける、およびｃＭＡＣモジュレーターの同定のための薬剤標的としてのｃＭＡＣの使用
本発明は、ｃＭＡＣが、Ｔ細胞の異常活性化に関連する病理学的状態の処置用治療剤のための有用な標的であることを初めて開示した。この開示は、ｃＭＡＣ活性および／または発現のモジュレーター(例えばアゴニストまたは阻害剤)が、多くの顕著な治療用途を有し得ることを確立する。ｃＭＡＣのモジュレーターにより処置し得る病理学的状態は、ｃＭＡＣ関連障害(上記で定義)を含むが、これに限定されない。
スクリーニング
さらに他の局面において、本発明は、候補モジュレーターがインビトロ、エキソビボまたはインビボでｃＭＡＣ活性を阻害または増強するおよび／またはｃＭＡＣ発現を阻害または増強する能力についてアッセイすることを含む、上記の病理学的状態の処置に有用なモジュレーターを同定する方法に関する。
本開示に基づいて、慣用のスクリーニングアッセイ(例えば、インビトロ、エキソビボおよびインビボ)を使用して、ｃＭＡＣ活性を阻害または増強するおよび／またはｃＭＡＣ発現を阻害または増強するモジュレーターを同定できる。
このようなアッセイのための多くの形態が利用可能であり、当業者に既知である。大まかに言って、このようなアッセイは放射標識、蛍光、発光、基質蓄積および広範囲の他の基本的形態に基づく。アッセイを、精製した、部分的に精製した、細胞抽出物、全細胞または多細胞形態で標的タンパク質を用いるために設計できる。アッセイは、一般に、ハイスループットまたはロースループットとして設計できる。標的タンパク質活性は直接的または間接的に測定できる。
アッセイで測定できるｃＭＡＣの活性は、Ｔ細胞の機能的活性化を含む、本明細書において確立されたｃＭＡＣポリペプチドの機能または生物学的活性のような全ての活性を含む。ＴＯＲＣの核転位、ＮＦＡＴの核転位、ＮＦＡＴ依存性に転写された遺伝子マーカーまたはレポーターの増加した発現、およびｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)駆動遺伝子発現、ＩＣＯＳ、ＣＤ６９、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ２５のようなＴ細胞活性化のマーカーを含む、ｃＭＡＣの他の生物学的活性は、スクリーニングアッセイにおいて増強または阻害される。ｃＭＡＣはまたイオンチャネル、例えばカルシウムチャネル(電位開口型またはリガンド−開口型)として機能でき；そしてＴ細胞のカルシウム依存性活性化において活性を有し得る。故に、ｃＭＡＣ活性を、細胞培養におけるイオン流入または流出に対する効果によりモニターできる。より特異的な生化学レベル、アッセイできる生物学的活性はまたミリスチン化(myristilization)、グリコシル化、リン酸化、脱リン酸化および他の翻訳後修飾の標的としての、細胞膜および細胞−膜の成分との相互作用も含む。ここの開示に基づいて、当業者は、ｃＭＡＣのこれらのおよび他の生物学的活性を同定でき、このいずれもが適当なスクリーニングアッセイを生じさせる。
このようなアッセイは、典型的に背景ｃＭＡＣの活性を確立するネガティブおよび／またはポジティブコントロールのようなコントロールを用いる。小分子、抗体または抗体フラグメントなどのような可能性のある薬剤を連続して本アッセイにおいて試験し、コントロールと比較したときに目的の活性に対する測定可能な作用を発生する薬剤を同定する。当業者は、ハイスループットまたはロースループットであり得るスクリーニング形態において薬剤、特に薬剤の大ライブラリーを試験することをよく知っている。
故に、本発明は以下を含む：
試験化合物とｃＭＡＣを接触させ；そして試験化合物と接触させていないｃＭＡＣと比較してｃＭＡＣの生物学的活性の変化を検出することを含む、ｃＭＡＣ関連障害の処置に有用な化合物を同定する方法(ここで変化の検出が、該障害の処置のために有用であるとして該試験化合物を同定する)。
インビトロまたはインビボで試験化合物とｃＭＡＣをｃＭＡＣ生物学的活性を許容するサンプル条件下で接触させｃＭＡＣ生物学的活性のレベルを測定し；該レベルを、該試験化合物を各コントロールサンプルのレベルと比較し；そして、該レベルの変化をもたらす試験化合物を、該障害の処置のための可能性の薬剤としてのさらなる試験のために選択することを含む、ｃＭＡＣ関連障害の処置に有用な化合物を同定する方法；およびインビトロまたはインビボで試験化合物とｃＭＡＣを接触させ；そして試験化合物と接触させていないｃＭＡＣと比較してｃＭＡＣの生物学的活性の変化を検出することを含む、化合物がＭＡＣ生物学的活性を調節するか否かを試験する方法(ここで、変化の検出が、ｃＭＡＣ生物学的活性のモジュレーターとして該試験化合物を同定する)。
一つの態様において、本方法はｃＭＡＣ生物学的活性の阻害剤を提供する。生物学的活性はイオン輸送、イオン拡散、タンパク質−ｃＭＡＣ相互作用またはｃＭＡＣ修飾、Ｔ細胞のカルシウム依存性活性化、ＴＯＲＣの核転位またはＮＦＡＴまたは他のカルシウム依存性分子、カルシニューリン経路活性化、およびｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)−またはＮＦＡＴ駆動遺伝子発現から選択される。
本発明は、さらに、インビトロスクリーニングアッセイで同定された化合物を、該ｃＭＡＣ関連障害の動物モデルに投与し、該動物において望む応答を観察することを含む、ｃＭＡＣ関連障害の処置に有用な化合物をさらに同定および確認することを含む。
ここで意図される通り、本発明は、ＴＯＲＣ活性、ＮＦＡＴ(活性化Ｔ細胞の核因子)活性化、および／またはＴ細胞活性化を各々誘発または抑制し、種々の治療効果をもたらすアゴニストおよびアンタゴニストを発見するための、ここで開示のｃＭＡＣ遺伝子および遺伝子産物を使用するための方法を含む。
さらなる態様において、本発明は、(ａ)試験化合物とｃＭＡＣを接触させ；および(ｂ)試験化合物と接触させていないｃＭＡＣと比較したｃＭＡＣの生物学的活性の変化を検出することを含む、ｃＭＡＣ関連障害の処置に有用な化合物を同定する方法に関する(ここで変化の検出が、該障害の処置のために有用であるとして該試験化合物を同定する)。
本発明は(ａ)試験化合物とｃＭＡＣをｃＭＡＣ生物学的活性を許容するサンプル条件下で接触させ；(ｂ)ｃＭＡＣ生物学的活性のレベルを測定し；(ｃ)該レベルを、該試験化合物を各コントロールサンプルのレベルと比較し；そして、(ｄ)該障害の処置に有用な可能性のある薬剤としてのさらなる試験のために、該レベルの変化をもたらす試験化合物を選択することを含む、ｃＭＡＣ関連障害の処置に有用な化合物を同定する方法を含む。あるいは、本発明は、(ａ)試験化合物とｃＭＡＣを接触させ；および(ｂ)試験化合物と接触させていないｃＭＡＣと比較したｃＭＡＣの生物学的活性の変化を検出することを含む、化合物がｃＭＡＣ生物学的活性を調節するか否かを試験する方法に関する(ここで、変化の検出が、ｃＭＡＣ生物学的活性のモジュレーターとして該試験化合物を同定する)。
ここの他の場所に関連して、同定すべき変化は、イオン輸送、イオン拡散、タンパク質−ｃＭＡＣ相互作用またはｃＭＡＣ修飾、Ｔ細胞のカルシウム依存性活性化、Ｔ細胞の活性化、または(ＩＣＯＳ、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ４０Ｌ)を含むが、これらに限定されないＴ細胞活性化のマーカー、ＮＦＡＴまたはＴＯＲＣの核転位、ｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)駆動遺伝子発現およびＮＦＡＴまたはＴＯＲＣ駆動遺伝子発現の低下のような生物学的活性の低下であり得る。
本発明は、さらに、ｃＭＡＣ関連障害の処置における、ここに記載のスクリーニングアッセイ法により同定された全ての化合物の使用を含む。
本発明は、候補モジュレーターがｃＭＡＣタンパク質の発現を増強または阻害する能力をアッセイすることを含む、障害の処置に有用なモジュレーターを同定する方法を含む。
このようなアッセイのための多くの形態が当業者に既知である。ｃＭＡＣ発現の阻害剤は、候補モジュレーターを、ｃＭＡＣ ｍＲＮＡ転写、加工、サイトゾルへの輸送、安定性、翻訳(またはこれらの工程に関与する何らかの多くの下位工程)を阻害する能力について試験することにより同定できる。最後に、発現の阻害剤は、コントロールと比較した機能的に活性なｃＭＡＣタンパク質の量の減少により同定する。発現のエンハンサーは発現に至る工程のいずれかを増強し、最後に機能的に活性なｃＭＡＣタンパク質の量の増加をもたらし得る。
典型的発現アッセイはプロモーター活性アッセイを含む。標準プロモーターアッセイにおいて、ＣＡＴ(クロラムフェニコールアセチル−トランスフェラーゼ)またはルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子配列(レポータータンパク質をコードする)に操作可能に連結した配列番号３のｃＭＡＣプロモーター配列の全てまたは一部を含むベクターを構築する。とりわけ好ましいのは、配列番号１のｃＤＮＡ配列に対応する配列を含まない配列番号３のプロモーター配列である。ベクターを細胞または細胞抽出物にトランスフェクトする。候補モジュレーターを試験して、コントロールと比較したレポータータンパク質の活性を測定することにより、それらがプロモーター活性を増加させるか否かを決定する。プロモーター活性アッセイの多くの他の形態が既知であり、当業者に利用可能である。
ｃＭＡＣ遺伝子発現(例えばｍＲＮＡレベル)もまた、例えば、慣用のノーザン分析または市販のマイクロアレイを含む、当業者に良く知られた方法を使用して決定できる。さらに、ｃＭＡＣレベルおよび／または関連制御タンパク質レベルに対する試験化合物の効果を、ＥＬＩＳＡ抗体ベースのアッセイまたは蛍光標識反応アッセイで検出できる。これらの技術はハイスループットスクリーニングのために容易に利用でき、当業者によく知られている。
プロモーターフラグメントをまた、ヒト細胞における発現のために設計されたプロモーター・レスレポーター遺伝子ベクター(例えばClontechプロモーター・レス増強蛍光タンパク質ベクターｐＥＣＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−１、またはｐＥＹＦＰ、Clontech, Palo Alto, CA)に容易に導入できる。次いで、本スクリーニングは、適当な長さの期間、各ウェルに添加した種々の化合物と培養し、次いで、レポーター遺伝子活性についてアッセイすることを含む。
他の態様において、ｃＭＡＣのモジュレーター発現のためのアッセイは、最初にスクリーニング細胞系をスクリーニングして、目的のｃＭＡＣタンパク質を発現するものを発見することを含む。発現する外来ｃＭＡＣ遺伝子を含む組み換え細胞系も試験できる。これらの細胞系を、例えば、９６、３８４または１５３６ウェルプレートで培養できる。遺伝子発現のある既知の修飾因子、例えばデキサメサゾン、ホルボールエステル、一次組織培養および細胞系上における熱ショックの影響の比較は、使用のための最も適当な細胞系の選択を可能にする。次いで、本スクリーニングは、単に、設定した期間の間細胞を各ウェルに添加した種々の化合物と培養し、次いでｃＭＡＣ活性をアッセイすることから成る。
これらの試験から集めたデータを使用して、上記の病理学的状態の処置のために治療的に有用性を有するモジュレーターを同定できる；例えば阻害性物質を、さらに該病理学的状態の慣用のインビトロまたはインビボモデルおよび／または該病理学的状態のヒトでの臨床試験において、慣用の方法の方法に従いアッセイして、該化合物が該病理学的状態をインビボで処置する能力を評価する。
本発明は、ｃＭＡＣポリペプチドの活性部分に関する重要な情報を利用可能とすることにより、当業者によく知られた合理的な薬剤設計を用いることにより、ｃＭＡＣ機能のモジュレーター、例えば、抗体、抗体フラグメント、小分子アゴニストまたはアンタゴニストの開発を可能にする。
ｃＭＡＣ関連障害の処置におけるｃＭＡＣモジュレーターの使用
他の局面において、本発明は、有効量のｃＭＡＣモジュレーターを含む医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、ｃＭＡＣ関連障害の処置方法に関する。
ここに記載のｃＭＡＣスクリーニングアッセイを通して同定および発見されたモジュレーターは、有機小分子(薬剤様特性を有するまたは有しない)を含む、および天然産物を含む、小分子のような薬剤であり得る。ｃＭＡＣのモジュレーターは、ｃＭＡＣ生物学的活性またはｃＭＡＣ発現のアゴニストを含む。モジュレーターはまたｃＭＡＣ生物学的活性の阻害剤またはｃＭＡＣ発現の阻害剤も含む。さらなる詳細は本明細書の他の場所に提供する。
生物学的過程を調節するためのｃＭＡＣモジュレーターの使用
本発明は、生物学的過程を阻害する方法を開示する。一つの態様において、本発明は、細胞におけるｃＭＡＣ生物学的活性を阻害する方法に関する。そのような阻害は、細胞と、抗ｃＭＡＣ抗体、抗体フラグメント、またはｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドのようなｃＭＡＣの阻害剤を、またはｃＭＡＣ発現を低下させる核酸を接触させることにより達成し得る。阻害される生物学的活性は、Ｔ細胞のカルシウム依存性活性化、ＴＯＲＣの核転位、ｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)駆動遺伝子発現、およびＮＦＡＴ誘導型遺伝子／ＩＬ−２のようなタンパク質の発現から選択される。
あるいは本生物学的活性は、多細胞生物におけるリンパ球活性を選択的に阻害する方法であって、該生物と抗ｃＭＡＣ抗体、抗体フラグメント、またはｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドをまたはｃＭＡＣ発現を低下させる核酸を接触させることを含む、方法であり得る。ここで使用する‘選択的’は、他の組織または細胞型に優先して同定された組織または細胞型を選択する傾向を意味する。
生物学的工程を増強する方法として、本発明はまたＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞と精製ｃＭＡＣポリペプチド、ｃＭＡＣ遺伝子を含む遺伝子治療用ベクター、またはｃＭＡＣ遺伝子発現のエンハンサーを接触させることを含む、Ｔ細胞活性化を増強させる方法にも関する。
生物学的過程を調節するためのｃＭＡＣモジュレーターの使用のさらなる詳細は、本明細書の他の場所に提供する。
ｃＭＡＣに対する抗体
ｃＭＡＣタンパク質に対する適当な抗体は、慣用の方法に従い製造できる。例えば、ここに記載されるのは、１個以上の異なって発現される遺伝子エピトープを特異的に認識できる抗体の製造方法である。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメント（全て、上記‘抗体’の定義において記載の通り）を含み得るが、これらに限定されない。
ここに記載のｃＭＡＣポリペプチドに対する工程の産生のために、種々の宿主動物を、ポリペプチド、またはその一部の注射により免疫し得る。そのような宿主動物は、ウサギ、マウス、およびラットを含み得るが、これらに限定されない。種々のアジュバントを使用して免疫学的応答を増加させることができ、宿主種に依存して、フロインド(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、表面活物質、例えばリソレシチン、pluronicポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および有用な可能性のあるヒトアジュバント、例えばＢＣＧ(カルメット・ゲラン桿菌)およびCorynebacterium parvumを含む。
ここに開示のｃＭＡＣポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として完全長ｃＭＡＣポリペプチドまたは目的の小ペプチドを含むフラグメントを使用して、製造できる。動物の免疫に使用するポリペプチドまたはペプチドは、ＲＮＡの翻訳または化学的に合成に由来し得て、望むならば、担体タンパク質に結合し得る。ペプチドと化学的に結合する一般的に使用される担体は、ウシ血清アルブミンおよびサイログロブリンを含む。次いで、結合したペプチドを使用して動物(例えば、マウス、ラットまたはウサギ)を免疫する。
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物、またはその抗原性機能的誘導体のような抗原で免疫した動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体の産生のために、上記のような宿主動物を、また上記のようなアジュバントで補ったポリペプチド、またはその一部の注射により免疫し得る。
特定の抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体を、培養における連続的細胞系による抗体分子の産生のために提供される技術により得ることができる。これらは、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ技術(1975, Nature 256:495-497；および米国特許４,３７６,１１０)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72;Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030)、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)を含むが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの全てのサブクラスを含む、全ての免疫グロブリンクラスであり得る。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーをインビトロまたはインビボで培養できる。インビボでの高力価のｍＡｂｓの産生が、これを現在好ましい製造法とする。
加えて、遺伝子を適当な抗原特異性のマウス抗体分子から、適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とスプライシングすることによる、“キメラ抗体”の産生のために開発された技術(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855;Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608;Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454)を使用できる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂからの可変または超可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するような、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
あるいは、一本鎖抗体の産生について記載の技術(米国特許４,９４６,７７８；Bird, 1988, Science 242:423-426;Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;およびWard et al., 1989, Nature 334:544-546)を異なって発現される遺伝子−一本鎖抗体の産生に適合できる。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介したＦｖ領域の重および軽鎖フラグメントの連結により形成され、一本鎖ポリペプチドをもたらす。
最も好ましくは、“ヒト化抗体”の産生に有用な技術を、ここに開示のポリペプチド、フラグメント、誘導体、および機能的等価物に対する抗体の産生に適合できる。そのような技術は米国特許５,９３２、４４８；５,６９３,７６２；５,６９３,７６１；５,５８５,０８９；５,５３０,１０１；５,９１０,７７１；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,５４５,５８０；５,６６１,０１６；および５,７７０,４２９に開示されており、これら全ての開示を、その全体を引用により本明細書に包含させる。
ｃＭＡＣの特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技術により産生できる。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により産生できるＦ(ａｂ')２フラグメントおよびＦ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により産生できるＦａｂフラグメントを含むが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築でき(Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281)、望む特異性のモノクローナルＦａｂフラグメントの急速で容易な同定を可能にする。
広範な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたは足場を、得られるポリペプチドが１個以上のｃＭＡＣタンパク質に特異的な結合領域を含む限り、用いることができる。そのようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブリン、またはそのフラグメントの５種の主イディオタイプ(本明細書の他の場所に記載のような)を含み、そして、好ましくはヒト化様相を有する、他の動物種の免疫グロブリンを含む。ラクダ科の動物において同定されたような単一重鎖抗体は、この点で特に興味深い。新規フレームワーク、足場およびフラグメントは、当業者により発見および開発され続けている。
あるいは、既知のまたは将来的な非免疫グロブリンフレームワークおよび足場を、それらが配列番号２のｃＭＡＣタンパク質に特異的な結合領域を含む限り、使用できる。そのような化合物は、ここでは、“ｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチド”として知られる。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたは足場は、Adnectins(fibronectin)(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd(Cambridge, MA)およびAblynx nv(Zwijnaarde, Belgium))、リポカリン(Anticalin)(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小モジュール免疫医薬(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(Avidia, Inc. (Mountain View, CA))、タンパク質Ａ(Affibody AG, Sweden)およびアフィリン(ガンマクリスタリンまたはユビキチン)(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)を含む。
本発明によって、抗ｃＭＡＣ抗体またはそのフラグメント、またはｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドは、用いるフレームワークまたは足場と無関係に、付加的部分と共有的にまたは非共有的に結合できる。付加的部分は、ポリペプチド、不活性ポリマー、例えばＰＥＧ、小分子、放射性同位体、金属、イオン、核酸または他のタイプの生物学的に関連する分子であり得る。免疫複合体、免疫毒素などとして既知であり得るような構築物も、ここで使用するｃＭＡＣ特異的結合領域を含む抗体、抗体フラグメントまたはポリペプチドの意味に含まれる。
本発明は、さらに、ここに記載のような対象における障害の処置における、ｃＭＡＣまたはｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドに特異的な抗体、抗体フラグメントの使用に関する。
本発明はまた、抗体フラグメント(例えばＦａｂまたはＦ(ａｂ’)２フラグメント)またはモノクローナル抗体を含む、ｃＭＡＣ(配列番号２)またはｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含む。本発明はまた、このような抗体、抗体フラグメントまたはｃＭＡＣに特異的に結合する結合領域含有ポリペプチドの医薬組成物も包含する。
ここに記載の抗体によるｃＭＡＣの検出は、インビトロまたはインビボで使用する標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析、および標準造影技術を使用して達成できる。検出は、ｃＭＡＣの検出可能な物質へのカップリング(すなわち、物理的結合)により容易にできる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質を含む。適当な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む；適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンを含む；発光物質の例は、ルミノールを含む；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、そして適当な放射活性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。
検出の容易さのために特に好ましいのは、サンドイッチアッセイであり、その多くの変法が存在し、その全てが本発明により包含させることを意図する。例えば、典型的な前向きアッセイにおいて、非標識抗ｃＭＡＣ抗体を固体支持体に固定し、試験すべきサンプルを結合した分子と接触させる。抗体−抗原二成分複合体の形成を可能にするのに十分な期間である適当な期間のインキュベーション後、検出可能なシグナルの誘発が可能なレポーター分子で標識した第二抗体を添加し、抗体−抗原−標識抗体の３成分複合体の形成に十分な時間インキュベートする。次いで、全ての未反応物質を洗い流し、抗原の存在をシグナルの観察により決定するか、または既知量の抗原を含むコントロールサンプルとの比較により定量し得る。前向きアッセイの変法は、サンプルおよび抗体両方を同時に結合している抗体に添加する同時アッセイ、または標識抗体および試験すべきサンプルを最初に合わせ、インキュベートし、非標識表面結合抗体に添加する後ろ向きアッセイを含む。これらの技術は当業者に既知であり、微細な改変の可能性は容易に明らかとなる。ここで使用する“サンドイッチアッセイ”は、基本的２面技術の全ての変法を含むことを意図する。本発明の免疫アッセイのための唯一の制限因子は、標識抗体がｃＭＡＣポリペプチドまたは関連制御タンパク質、またはそれらのフラグメントに特異的である抗体であることである。
最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア−または放射性核種含有分子のいずれかである。酵素免疫アッセイの場合、酵素が、通常グルタルアルデヒドまたはペリオデートの手段で第二抗体に結合する。容易に認識される通り、しかしながら、広範な種々のライゲーション技術が存在し、それらは当業者に既知である。一般的に使用される酵素は、とりわけホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼを。特異的酵素と共に使用する基質は、一般に対応酵素での加水分解により、検出可能な色変化を産生するように選択する。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリホスファターゼコンジュゲートとの使用に適する；ペルオキシダーゼコンジュゲートについて、１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが一般的に使用される。上記の発色性支持体よりむしろ蛍光産物を生じる蛍光性基質を用いることも可能である。次いで、適当な基質を含む溶液を、３成分複合体に添加する。基質が第二抗体と結合した酵素と反応し、定質的可視シグナルを発し、それは、通常分光光度法でさらに定量でき、血清サンプルに存在する目的のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの量の評価を与える。
あるいは、フルオレッセインおよびローダミンのような蛍光化合物を、それらの結合能を変えることなく抗体と化学的に結合できる。特定波長の光照射により活性化されるとき、蛍光色素−標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子における興奮性の状態を誘発し、続いて、特徴的なより長い波長で光を放出する。放出は、光学顕微鏡で可視的に検出可能な特徴的色として見える。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は両方とも十分に確立された技術であり、特に本方法のために特に好ましい。しかしながら、放射性同位体、化学発光または生物発光分子のような他のレポーター分子も用い得る。要求される用途に適当させるために、どのように方法を変更させるか、当業者には容易に明らかである。
本発明は、故にヒトｃＭＡＣまたはヒトｃＭＡＣポリペプチドの一部に非常に選択的な抗体を含む医薬組成物、およびこのような抗体の使用方法を含む。対象への対象により、このような抗体は、タンパク質と直接相互作用することにより、ｃＭＡＣ活性を阻害または低下させ、またはある場合、ｃＭＡＣ活性を増加させる。阻害剤は、活性部位を遮断するか、または基質の活性部位への接近を遮断し得る。ｃＭＡＣ抗体をまた使用して、ｃＭＡＣタンパク質の制御に関与し得て、タンパク質活性に必須のタンパク質−タンパク質相互作用を妨げることにより、ｃＭＡＣ活性の阻害にも使用できる。ここに記載のような阻害性活性を有する抗体を製造し、当業者によく知られた標準アッセイに従い同定できる。
ｃＭＡＣ抗体はまた診断的に使用できる。例えば、これらの抗体を慣用の方法に従い使用して、対象中のｃＭＡＣタンパク質のレベルを定量できる；増加したレベルは、例えば、望まないＴ細胞活性化、ＣＲＥ依存性遺伝子発現の過剰な活性化(例えばプロモーター領域にＣＲＥを有する遺伝子の活性化)を示し、そして、恐らく、過剰な活性化の程度を示し、そして関連病理学的状態の重症度に対応する。故に、異なるｃＭＡＣレベルは、ｃＭＡＣ関連障害のような病理学的状態の種々の臨床形態または重症度の指標であり得る。そのような情報はまたｃＭＡＣモジュレーターでの処置に応答し得るまたはし得ない病理学的状態に罹患している患者のサブセットの同定にも有用である。
遺伝子治療
他の態様において、ｃＭＡＣタンパク質またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸を、遺伝子治療の方法で、治療目的で投与する。遺伝子治療は、対象への核酸の投与により行われる治療を意味する。本発明のこの態様において、本核酸は、正常Ｔ細胞活性化の促進により治療効果を介在するそのコード化タンパク質を産生する。
当分野で利用可能な遺伝子治療のための全ての方法を本発明に従い使用できる。方法の例を以下に記載する。
好ましい局面において、本治療剤は、適当な宿主にｃＭＡＣタンパク質またはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質を発現する発現ベクターの一部であるｃＭＡＣ核酸を含む。特に、このような核酸は、ｃＭＡＣコード領域に操作可能に連結したプロモーターを有し、該プロモーターは誘導型または構成型であり、そして、所望により、組織特異的である。他の特定の態様において、ｃＭＡＣコード配列および何らかの他の望む配列の側面にゲノム中の望む部位での相同組み換えを促進する領域があり、故に、ｃＭＡＣ核酸の染色体内発現を提供する核酸分子を使用する(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935;Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438)。
核酸の患者への送達は、直接的(この場合、患者が直接核酸または核酸担持ベクターにさらされる）、または間接的（この場合、細胞を最初に核酸をインビトロで形質転換し、次いで患者に移植する）いずれかであり得る。これらの二つの方法は、各々インビボまたはエキソビボ遺伝子治療として既知である。
特異的態様において、核酸を直接インビボで投与し、そこでそれが発現してコード化産物を発現する。これは、当分野で既知の多くの方法のいずれかにより達成でき、例えば、それを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、そして、例えば、不完全または弱毒レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを使用した感染により(例えば、米国特許４,９８０,２８６および上記のその他参照)、または裸のＤＮＡの直接注入により、または微粒子銃法(例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont)、または脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクティング試薬でのコーティングにより、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルへの封入の使用により、またはそれを核に入ることが知られているペプチドと結合させて投与することにより、受容体介在エンドサイトーシスの対象となるリガンドと結合させて投与することにより(例えば、全て引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許５,１６６,３２０；５,７２８,３９９；５,８７４,２９７；および６,０３０,９５４参照)(これは、受容体を特異的に発現する細胞型の標的に使用できる)などにより、達成できる。他の態様において、エンドソームを破壊するためにリガンドが融合性ウイルスペプチドである核酸−リガンド複合体を形成でき、核酸がリソソーム分解を避けることを可能にする。さらに別の態様において、本核酸を、特異的受容体にターゲティングすることにより、インビボで細胞特異的取り込みおよび発現に標的化できる(例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；ＷＯ９２／２０３１６；ＷＯ９３／１４１８８；およびＷＯ９３／２０２２１参照)。あるいは、本核酸を細胞内に導入し、相同組み換えにより発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に取りこませ得る(例えば、米国特許５,４１３,９２３；５,４１６,２６０；および５,５７４,２０５；およびZijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438参照)。
特異的態様において、ｃＭＡＣ核酸を含むウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用できる(例えば、米国特許５,２１９,７４０；５,６０４,０９０；および５,８３４,１８２参照)。これらのレトロウイルスベクターは修飾されており、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの統合に不要なレトロウイルス配列が欠失している。遺伝子治療において使用すべきＣＭＡＣ核酸を、遺伝子の患者への送達を促進するベクターにクローン化する。
アデノウイルスは、遺伝子治療において使用できる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸器上皮への遺伝子送達のためのとりわけ魅力的な媒体である。アデノウイルスは、自然に呼吸器上皮に感染し、そこで、それは穏やかな疾患の原因となる。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に間接可能である利点を有する。アデノウイルスベースの遺伝子治療を実施する方法は、例えば、全て引用によりその全体を本明細書に包含させる、米国特許５,８２４,５４４；５,８６８,０４０；５,８７１,７２２；５,８８０,１０２；５,８８２,８７７；５,８８５,８０８；５,９３２,２１０；５,９８１,２２５；５,９９４,１０６；５,９９４,１３２；５,９９４,１３４；６,００１,５５７；および６,０３３,８８４３に記載されている。
アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)もまた遺伝子治療における使用が提案されている。ＡＡＶを製造するおよび使用する方法は、例えば、全て引用によりその全体を本明細書に包含させる、米国特許５,１７３,４１４；５,２５２,４７９；５,５５２,３１１；５,６５８,７８５；５,７６３,４１６；５,７７３,２８９；５,８４３,７４２；５,８６９,０４０；５,９４２,４９６；および５,９４８,６７５に記載されている。
遺伝子治療への他の方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム介在トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法による、組織培養中の細胞への遺伝子の伝達である。通常、伝達の方法は、選択可能マーカーの細胞への伝達を含む。次いで、本細胞を、伝達された遺伝子を取り込み、発現する細胞を単離するための選択下に置く。このような細胞を、次いで患者に送達する。
この態様において、得られた組み換え細胞のインビボでの投与に、核酸を細胞に導入する。そのような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体−仲介遺伝子伝達、微小核体−仲介遺伝子伝達、スフェロプラスト融合などを含むが、これらに限定されない当分野で既知の何らかの技術により実施できる。外来遺伝子を細胞に導入するための多くの技術が当分野で既知であり、レシピエント細胞の必要な発育性および生理学的機能が妨害されない限り、本発明に従い使用できる。本技術は、核酸が細胞により発現可能であり、そして好ましくはその細胞子孫に遺伝可能であり発現可能であるように、細胞に核酸の安定な伝達を提供すべきである。
得られた組み換え細胞を、当分野で既知の種々の方法により患者に送達できる。好ましい態様において、上皮性細胞を、例えば、皮下的に注入する。他の態様において、組み換え皮膚細胞を患者への皮膚移植片として適用する。組み換え血液細胞(例えば、造血幹または前駆細胞)を、好ましくは静脈内に投与する。使用のために構想される細胞の量は、望む効果、患者の状態などに依存して変化し、当業者により決定できる。
遺伝子治療の目的で核酸を導入できる細胞は、全ての望む、利用可能な細胞型を含み、そして上皮性細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血液細胞；例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓から得られる種々の幹または前駆細胞、特に造血幹または前駆細胞などを含むが、これらに限定されない。
好ましい態様において、遺伝子治療に使用する細胞は患者に対して自己である。
組み換え細胞を遺伝子治療に使用する態様において、ｃＭＡＣ核酸を、それが細胞またはそれらの子孫で発現可能であるように細胞に導入し、次いで、該組み換え細胞を、治療効果のためにインビボで投与する。特異的態様において、幹または前駆細胞を使用する。インビトロで単離および維持できる全ての幹および／または前駆細胞が、本発明のこの態様に従い、使用できる可能性がある。そのような幹細胞は、造血幹細胞(ＨＳＣ)、皮膚および腸の内側のような上皮性組織由来の幹細胞、胚性心臓筋肉細胞、肝臓幹細胞(例えば、ＷＯ９４／０８５９８参照)、および神経幹細胞(Stemple and Anderson, 1992, Cell 71:973-985)を含むが、これらに限定されない。
上皮性幹細胞(ＥＳＣ)またはケラチン生成細胞を、皮膚および腸の内側のような組織から既知の方法で得ることができる(Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229)。皮膚のような重層化した上皮性組織において、再生は、基底膜に最も近い層である基底層内の幹細胞の有糸分裂により起こる。腸の内側の内の幹細胞は、この組織の速い再生速度を提供する。患者またはドナーの皮膚または腸の内側から得たＥＳＣまたはケラチン生成細胞を、組織培養で増幅できる(Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771)。ＥＳＣがドナーにより提供されたら、宿対移植片反応性を抑制するための方法(例えば、中程度の免疫抑制を促進するための照射、薬剤または抗体投与)も使用できる。
造血幹細胞(ＨＳＣ)に関して、インビトロでのＨＳＣの単離、繁殖、および維持を提供する全ての技術を、本発明のこの態様において使用できる。これが達成できる技術は、(ａ)将来の宿主、またはドナーから単離された骨髄細胞からのＨＳＣ培養の単離および確立、または(ｂ)同種または異種であり得る先に確立した長期ＨＳＣ培養の使用を含む。非自己ＨＳＣを、好ましくは将来の宿主／患者の移植免疫応答を抑制する方法と組み合わせて使用する。本発明の特定の態様において、ヒト骨髄細胞を、後部腸骨稜から針吸引により得ることができる(例えば、Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384参照)。本発明の好ましい態様において、ＨＳＣを非常に富化されたまたは実質的に純粋な形で製造できる。この富化は、長期培養の前、途中または後に達成でき、当分野で既知の任意の技術により行い得る。骨髄細胞の長期培養は、例えば、改変Dexter細胞培養技術(Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91:335)またはWitlock-Witte培養技術(WitlockおよびWitte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612)を使用して、確立および維持できる。
特異的態様において、遺伝子治療の目的で導入すべき核酸は、核酸の発現が転写の適当なインデューサーの存在または非存在による制御により制御可能なように、コード領域に操作可能に連結した誘導型プロモーターを含む。
本発明の医薬組成物はまた核酸レベルでｃＭＡＣタンパク質の発現を阻害する物質も含む。このような分子は、ｃＭＡＣ核酸の適当なヌクレオチド配列に対するリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋ＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、および二本鎖または一本鎖ＲＮＡを含む。これらの阻害性分子は、過度の負担または実験なく、当業者により慣用の技術を使用して創成できる。例えば、遺伝子発現の修飾(例えば阻害)は、ここに記載のｃＭＡＣポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域に、すなわちプロモーター、エンハンサー、およびイントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを設計することにより得ることができる。転写開始部位、例えば開始部位から−１０から＋１０の位置由来の、例えば、オリゴヌクレオチドを使用できる。それにもかかわらず、遺伝子の全領域を使用して、ｍＲＮＡに対して最強のハイブリダイゼーションを与えるアンチセンス分子を設計するために使用でき、そしてこのような適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造でき、当業者によく知られた標準アッセイ法により同定できる。
同様に、遺伝子発現の発現阻害は、“三重螺旋”塩基対形成方法を使用して達成できる。三重螺旋対形成は、それがポリメラーゼ、転写因子、または制御分子と結合するために十分に開く二重螺旋の能力の阻害をもたらすために、有用である。三本鎖ＤＮＡを使用した最近の治療用利点は文献に記載されている(Gee, J.E. et al. (1994)In:Huber, B.E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.)。これらの分子は、転写物がリボソームに結合するのを妨げることにより、ｍＲＮＡの翻訳を遮断するためにも設計できる。
酵素的ＲＮＡ分子であるリボザイムをまた使用して、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することにより遺伝子発現を阻害できる。リボザイム作用の機構は、リボザイム分子の相補標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、続くエンドヌクレアーゼ的開裂を含む。使用し得る例は、遺伝子配列、例えば、ｃＭＡＣについてのｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ的開裂を特異的におよび効率的に触媒するために設計できる、操作した“ハンマーヘッド”または“ヘアピン”モチーフリボザイム分子を含む。
何らかの可能性のあるＲＮＡ標的内の特異的リボザイム開裂部位は、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム開裂部位について標的分子のスキャンニングにより最初に同定された。同定されたら、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５から２０リボヌクレオチドの間の短ＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを操作不可能にし得る二次構造特性について評価し得る。候補標的の適性を、また、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近性を試験することにより評価できる。
リボザイム方法は、細胞をリボザイムに暴露するか、または細胞内でこのような小ＲＮＡリボザイム分子の発現を誘導することを含む(Grassi and Marini, 1996, Annals of Medicine 28:499-510;Gibson, 1996, Cancer and Metastasis Reviews 15:287-299)。ここに記載の遺伝子の少なくとも１つに対応するｍＲＮＡを標的とするハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの細胞内発現を、該遺伝子によりコードされるタンパク質の阻害に使用できる。
リボザイムは、リボザイム配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドの形で、細胞に直接送達するか、または望むリボゾーム(ribozymal)ＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞に導入し得る。リボザイムは、ｍＲＮＡの開裂に際して触媒として有効な十分な数にインビボで日常的に発現でき、それにより細胞におけるｍＲＮＡ存在量を修飾する(Cotten et al., 1989 EMBO J. 8:3861-3866)。特に、慣用の既知のルールに従い設計され、例えば、標準ホスホロアミデイト化学により合成されたリボザイムをコードするＤＮＡ配列を、ｔＲＮＡをコードする遺伝子のアンチコドン幹およびループにおける制限酵素部位にライゲートでき、次いで、それを当分野で日常的な方法により目的の細胞に形質転換し、発現させ得る。好ましくは、誘導型プロモーター(例えば、グルココルチコイドまたはテトラサイクリン応答要素)をまた、リボザイム発現が選択的に制御できるように、この構築物に導入する。飽和使用のために、高度におよび構成的に活性なプロモーターを使用できる。ｔＤＮＡ遺伝子(すなわち、ｔＲＮＡをコードする遺伝子)は、それらの小サイズ、転写の高い割合、および様々な種類の組織における偏在的発現のために、この適用に有用である。
故に、リボザイムを、事実上全てのｍＲＮＡ配列を開裂するように日常的に設計でき、そして細胞を、制御可能なおよび触媒的に有効量のリボザイムが発現されるように、このようなリボザイム配列をコードするＤＮＡで日常的に形質転換できる。従って、細胞における事実上全てのＲＮＡ種の存在量を修飾または改変させ得る。
リボザイム配列は、アンチセンスヌクレオチドについて記載のものと本質的に同じ方法で修飾でき、例えば、リボザイム配列は修飾塩基部分を含み得る。
ＲＮＡアプタマーをまた細胞内に導入するかまたは発現させて、ＲＮＡ存在量または活性を修飾し得る。ＲＮＡアプタマーは、その翻訳を特異的に阻害できるＴａｔおよびＲｅｖ ＲＮＡのようなタンパク質に対する特異的ＲＮＡリガンドである(Good et al., 1997, Gene Therapy 4:45-54)。
遺伝子発現の遺伝子特異的阻害は、ＲＮＡ干渉(“ＲＮＡｉ”)ストラテジーを使用してまた達成できる。ＲＮＡｉは比較的新しく発見された。それは二本鎖ＲＮＡに依存する。このような技術の記載は、その全体を引用により包含するＷＯ９９／３２６１９に記載見ることができる。ＲＮＡｉ技術は、遺伝子発現の阻害のための手段として有用であることが証明されている(例えば、Cullen, BR Nat. Immunol. 2002 Jul;3(7):597-9参照)。
ここで使用するＲＮＡｉ試薬は、ＲＮＡｉ機構を介して作用できる化合物および組成物を意味する(一般的参照として、He and Hannon, (2004)Nat. Genet. 5:522-532を参照)。低分子干渉ＲＮＡ(“ｓｉＲＮＡ”)、二本鎖ＲＮＡ(“ｄｓＲＮＡ”)、ショートヘアピンＲＮＡ(“ｓｈＲＮＡ”、‘合成ＲＮＡ’と呼ばれることもある)のようなＲＮＡｉ試薬は一般的に使用されており、その他は開発中である。細胞に導入するときまたは細胞内で合成するとき、ＲＮＡｉ試薬を、巨大分子複合体内に取り込み、それはＲＮＡｉ試薬の鎖を、相補(または実質的に相補)配列を含むＲＮＡ鎖に向け、そして開裂するために使用する。
ＲＮＡｉ試薬は化学的に修飾できる。当業者に既知の種々の適当な化学修飾が、引用により本明細書に包含させるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７０９１８に記載されている。化合物のＲＮＡｉ活性を無くさない他の修飾および修飾の組合せも、ここで意図される。
本発明での使用に適当なＲＮＡｉ試薬は、表５、および表６(実施例参照)に示す一本鎖センスおよびアンチセンス鎖のハイブリダイゼーション由来のｄｓＲＮＡ鎖を含む(実施例参照；配列はＲＮＡ(ＤＮＡではない)として合成しなければならず、所望により化学的に修飾し得る)。
表５または表６に基づき、または当業者により他に指摘される通りに製造できるＲＮＡｉ試薬は、１７から３０量体二本鎖化合物に、１−６ntsの３’オーバーハング有りまたは無しで、化学修飾または末端修飾有りまたは無しで、そして標的配列に対する正確な相補性有りまたは無しで短くでき、この場合、これらは低分子干渉ＲＮＡ(“ｓｉＲＮＡ”)化合物と呼ばれる。
Biopredアルゴリズム(Huesken et al. (2005)Nat. Biotech. 23(8):995-1001)を使用して計算して、好ましいｓｉＲＮＡ化合物は、以下である：
Figure 2009511013
Figure 2009511013
Figure 2009511013
本発明は、さらに、対象における障害の処置におけるｃＭＡＣに特異的なｓｉＲＮＡのようなＲＮＡｉ試薬の使用に関する。
本発明のアンチセンス分子、三重螺旋ＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムを、核酸分子の合成の分野で既知の何らかの方法を使用して製造できる。これらは、固相ホスホロアミデイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法を含む。あるいは、ＲＮＡ分子を、ここに記載のポリペプチドの遺伝子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により産生できる。そのようなＤＮＡ配列を、Ｔ７またはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターと共に広範なベクターに取り込み得る。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘導的に合成するｃＤＮＡ構築物を、細胞系、細胞、または組織に導入できる。
ペプチド摸倣物
ｃＭＡＣタンパク質のペプチド摸倣物はまたｃＭＡＣモジュレーターとして作用することが予測される。故に、本発明の一つの態様は、ｃＭＡＣ機能を機能する、ｃＭＡＣ由来のまたはそこから設計されたペプチドである。ｃＭＡＣタンパク質の適当なペプチド摸倣物は、ｃＭＡＣタンパク質活性に必要なポリペプチドの領域の理解に基づき、慣用法により製造できる。簡単に言うと、短アミノ酸配列を、野生型タンパク質の欠失または変異分析のような慣用の構造機能試験によりタンパク質において同定する。重要な領域が同定されたら、タンパク質のそれが非常に保存されたであるか、この領域が重要な機能(例えばタンパク質−タンパク質相互作用)を担うか否かを予測する。該重要な領域に似せた小合成摸倣物は、完全なタンパク質と競合し、故にその機能を妨害することが予測される。合成アミノ酸配列は、この領域全体および一部とマッチングするアミノ酸から構成され得る。そのようなアミノ酸を、元のアミノ酸と似ているが、高い阻害性活性、安定性、半減期またはバイオアベイラビリティのような薬理学的に良好な特性を付与する他の化学構造に置き換え得る。
小分子
ここに記載のｃＭＡＣスクリーニングアッセイを通して同定および発見されたモジュレーターが、有機小分子(薬剤様特性有りまたは無し)を含む、および天然産物を含む、小分子であることが意図される。これらの小分子ｃＭＡＣのモジュレーターはｃＭＡＣ生物学的活性またはｃＭＡＣ発現のアゴニストを含む；それらはまたｃＭＡＣ生物学的活性の阻害剤またはｃＭＡＣ発現の阻害剤を含み得る。当業者は、ロースループット、メディウム・スループット、ハイスループットおよび超ハイスループット形式での天然化合物、半合成化合物のライブラリーまたはコンビナトリアル化合物ライブラリーのスクリーニングをよく知っている。コントロール化合物と比較してｃＭＡＣ活性を調節することが判明した化合物を同定し、化学構造により分類する。次いで、化学構造を修飾し、該アッセイにおいてさらなる活性についてアッセイする。標的に対する化合物の構造−活性相関(ＳＡＲ)を評価する。標的に対する高い効力および高い選択性の化合物を開発する。次いで、そのような化合物を一連の他のアッセイで厳密に試験し、その後治療効果について動物およびヒトで試験する。全てのこれらの工程は当業者に既知である。
ｃＭＡＣのさらなる研究用途
本発明はまたさらなる研究に有用であることも注意すべきである。例えば、ｃＭＡＣタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび／またはｃＭＡＣタンパク質それら自体、ｃＭＡＣタンパク質によりカスケード中で修飾されるかまたは間接的に活性化される、他のタンパク質、例えばキナーゼ、プロテアーゼまたは転写因子の同定に使用できる。このようにして同定されたタンパク質を、例えば、ここで述べている病理学的状態の処置のための薬剤スクリーニングに使用できる。ｃＭＡＣタンパク質の下流であるこれらの遺伝子を同定するために、例えば、特異的ｃＭＡＣ阻害剤で疾患状態動物を処置し、動物を殺し、関連組織を摘出し、そしてこれらの細胞から全ＲＮＡを単離し、そしてコントロール動物(薬剤が投与されていない動物)と比較して変わっているメッセージレベルを同定するための標準マイクロアレイアッセイを用いる慣用の方法を使用できることが意図される。
加えて、慣用のインビトロまたはインビボアッセイを使用して、ｃＭＡＣタンパク質の過剰発現を導く可能性のある遺伝子を同定し得る。このようにして同定された遺伝子によりコードされるこれらの関連制御タンパク質を使用して、ここに記載の病理学的状態の処置のための強力な治療剤であるはずである薬剤をスクリーニングし得る。例えば、ｃＭＡＣタンパク質のプロモーター領域がレポーター遺伝子の上流に配置され、構築物が適当な細胞(例えばATCC, Manassas, VAから)にトランスフェクトされ、そして慣用の技術を使用し、レポーター遺伝子の発現の検出によりｃＭＡＣプロモーターの活性化をもたらす上流遺伝子について細胞をアッセイする、慣用のレポーター遺伝子アッセイを使用できる。
ここでは、慣用法により、例えば、これらのタンパク質またはペプチド摸倣物に対する抗体を設計することによりおよび／またはこのようなタンパク質の遺伝子を標的とする阻害性アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋ＤＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、二本鎖または一本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーを設計することにより、ここに記載の病理学的状態を処置する一手段として関連制御タンパク質またはｃＭＡＣを修飾するタンパク質の機能および／または遺伝子の発現を阻害できることを意図する。該病理学的状態の処置のためのこのような阻害性物質を含む医薬組成物もまたここで意図される。
医薬組成物および投与
本発明のさらなる態様は、ここに記載の病理学的状態のいずれかの処置のための、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と一緒の医薬組成物の投与に関する。そのような医薬組成物は、ｃＭＡＣタンパク質、またはそのフラグメント、ｃＭＡＣポリペプチドに対する抗体、核酸(例えば遺伝子治療用ベクター、アンチセンス、リボザイムまたはＲＮＡｉ試薬)、ｃＭＡＣペプチド摸倣物、小分子モジュレーターおよび何らかの他のｃＭＡＣモジュレーター(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、またはｃＭＡＣ発現および／または機能の阻害剤)を含む、ここに開示のｃＭＡＣモジュレーターのいずれかを含み得る。本組成物は、単独で、または安定化化合物のような少なくとも１種の他の薬剤と組み合わせて投与でき、それは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を含む、何らかの滅菌、生体適合性医薬担体中で投与できる。本組成物はまた患者に単独で、または他の試薬、薬剤またはホルモンと組み合わせて投与できる。
本発明は、さらに、対象における障害の処置方法であって、ｃＭＡＣの活性または発現を阻害または増強する、有効量の薬剤、または薬剤の医薬生物を該対象に投与することを含む方法も含む。
ｃＭＡＣモジュレーターを含む医薬組成物は、例えば、アルツハイマー、パーキンソンおよびハンチントン病のような神経変性障害のような、ｃＭＡＣのアゴニスト機能の治療効果が治療効果を有する状態において、医学的利益が当業者により判断されるときに、投与し得る。本発明に従い使用するためのそのような医薬組成物は、１個以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、慣用法で製剤できる。
ここに開示の病理学的状態の予防、処置または軽減に有用であるとしてここに記載の医薬組成物は、患者に治療的有効量で投与されるべきである。治療的有効量は、該状態の予防、処置または軽減をもたらすのに十分な化合物の量を意味する。
化合物およびそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物を、吸入または吹き入れ(insufflation)(口または鼻のいずれかを介して)または局所、経口、口腔、非経腸または直腸投与による投与のために製剤できる。
経口投与のために、本医薬組成物は、結合剤(例えば、前ゼラチン化メイズデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；増量剤(例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム)；滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプングリコレート)；または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)のような薬学的に許容される賦形剤と慣用手段により製造される、例えば、錠剤またはカプセルの形を取り得る。錠剤は、当分野で既知の方法によりコートし得る。経口投与用液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形を取り得るか、またはそれらは、使用前に水または他の適当な媒体で構成する乾燥産物として存在し得る。そのような液体製剤は、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化可食脂肪)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性媒体(例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分画植物油)；および防腐剤(例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)のような薬学的に許容される添加剤と、慣用手段により製剤できる。本製剤はまた必要に応じて、緩衝性塩、風味剤、着色剤および甘味剤も含み得る。
経口投与用製剤は、適当には活性化合物の制御された放出を与えるために製剤できる。
口腔投与のために、本組成物は、慣用法で製剤された錠剤またはロゼンジの形を取り得る。
吸入による投与のために、本発明に従い使用する化合物は、簡便には、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザーから、エアロゾルスプレー・プレゼンテーションの形で送達する。加圧エアロゾルの場合、投与単位を、一定量を送達するためのバルブを備えることにより決定し得る。化合物と、ラクトースまたはデンプンのような適当な粉末基剤の粉末混合物を含む、吸入器または吹き入れ器(insufflator)に使用するための、例えばゼラチン製のカプセルおよびカートリッジを製剤できる。
本化合物は、注射により、例えば、ボーラス注射により、または連続的輸液により、非経腸投与のために製剤できる。注射用製剤は単位投与形態で、例えば、アンプル中または複数用量容器中、防腐剤を添加されて存在し得る。本組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形を取り得て、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤用薬剤(formulatory agents)を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に適当な媒体、例えば、滅菌無発熱源水で構成するための粉末形であり得る。
本化合物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセライドのような慣用の坐薬基剤を含む、坐薬または停留浣腸のような直腸組成物にも製剤できる。
先に記載の製剤に加えて、本化合物はまたデポ剤としても製剤できる。そのような長時間作用型製剤を、インプラント(例えば皮下にまたは筋肉内に)または筋肉内注射により投与し得る。故に、例えば、本化合物を、適当な重合または疎水性物質(例えば許容される油中のエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂と共に、またはわずかに可溶性の誘導体として、例えば、わずかに可溶性の塩として製剤できる。
本組成物は、望むならば、本活性成分を含む１以上の単位用量を含み得る、包装または分配装置中に存在し得る。本包装は、例えば、ブリスターパックのような金属またはプラスチックホイルを含み得る。包装または分配装置に投与のための指示を添付し得る。
本発明において使用するのに適当な医薬組成物は、活性成分が、意図する目的を達成するための有効量で含まれる、組成物を含む。有効量の決定は、当業者の技術範囲内である。
何らかの化合物について、治療的有効量は、最初、例えば、新生物細胞の細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタにおいて概算できる。動物モデルはまた適当な濃度範囲および投与経路の決定のためにも使用できる。動物モデルにおいて、ＩＣ５０(すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物濃度)を含む、循環血漿濃度範囲を達成する用量を製剤し得る。そのような情報を次いで使用して、ヒトにおける有用な投与量および投与経路を決定できる。
治療的有効量は、目的の特定の病理学的状態の予防、処置または軽減に有用な活性成分の量を意味する。治療効果および毒性、例えば、ＥＤ５０(集団の５０％で治療的に有効な量)およびＬＤ５０(集団の５０％に致死的な量)を、細胞培養または実験動物における標準薬務により決定できる。毒性および治療効果の間の用量比が治療指数であり、そしてそれは、比率、ＬＤ５０／ＥＤ５０として示すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータをヒト使用のための投与量の範囲の計算に使用する。このような組成物に含まれる用量は、好ましくは、毒性がわずかしかないまたは全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。豐量は、この範囲内で、用いる豐形態、患者の感受性および投与経路に依存して変わる。
正確な投与量は、処置を必要とする対象に関連する因子に照らして、実施者により決定される。投与量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するためにまたは望む効果を維持するために調節する。考慮し得る因子は、疾患状態の重症度、対象の全体的健康、年齢、体重、および対象の性別、食習慣、投与時間および頻度、薬剤組合せ(複数もある)、反応感受性、および治療に対する耐容性／応答を含む。長時間作用型医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に依存して、３〜４日毎、毎週、または２週間毎に投与し得る。
通常の投与量は、０.１から１００,０００マイクログラムから、総量約１ｇまで、投与経路に依存して変化し得る。特定の投与量および送達方法についてのガイダンスは文献に提供され、当分野の実施者に一般的に利用可能である。当業者は、タンパク質またはそれらの阻害剤と異なる製剤をヌクレオチドについて用いる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的である。タンパク質の経口投与に適当な医薬製剤は、例えば、米国特許５,００８,１１４；５,５０５,９６２；５,６４１,５１５；５,６８１,８１１；５,７００,４８６；５,７６６,６３３；５,７９２,４５１；５,８５３,７４８；５,９７２,３８７；５,９７６,５６９；および６,０５１,５６１に記載されている。
ここでは、ｃＭＡＣレベルまたは活性のモニタリングおよび／またはｃＭＡＣ発現(ｍＲＮＡレベル)検出を、例えば、ある処置レジメンの効果を決定するための臨床試験法の一部として使用し得ることを意図する。例えば、薬剤が投与されている患者を評価し、医師は、ｃＭＡＣレベル、活性および／または発現レベルが所望値より高い(すなわち関連疾患状態を経験していないコントロール患者または臨床的介入により疾患状態が十分に軽減されている患者におけるレベルより高いまたは低いレベルである)患者を同定できる。これらのデータに基づいて、その後医師は豐量、投与レジメンまたは処方する薬のタイプを調節できる。
患者のために治療を最適化するために考慮すべき因子は、処置する特定の状態、処置する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、活性化合物の送達部位、活性化合物の特定のタイプ、投与方法、投与スケジュール、および医療従事者には既知の他の因子を含む。投与すべき治療的有効量の活性化合物は、このような考慮により決定され、ある病理学的状態の処置に必要な最小量である。
以下の実施例は本発明をさらに説明し、本発明を限定する意図はない。
実施例
一般的方法
ＴＯＲＣ−１転位スクリーニング
スクリーニングは、記載の通り行った(Bittinger et. al. Curr Biol. 2004 Dec 14;14(23):2156-61.)簡単に言うと、蛍光融合構築物を創成し(Ｔｏｒｃ１−ｅＧＦＰ)、該構築物を７６８０個の個々のｃＤＮＡクローン(主にＭＧＣクローンコレクションから)と共にＨｅＬａ細胞に共トランスフェクトした。Ｔｏｒｃ融合タンパク質の核転位を、自動蛍光顕微鏡プラットホームを使用して評価した。
ＴＯＲＣ−ｅＧＦＰ転位定量：Ｔｏｒｃ１−ＧＦＰを発現する、安定に発現するＨｅＬａ細胞系を調製し、細胞を播種し(９６ウェルプレート中６０００細胞／ウェル)、空ベクター(翻訳停止配列)、ＴＲＰＶ６またはヒトｃＭＡＣを含むレンチウイルス構築物(ｐＬＬＢ１−ＧＷ−Ｋａｎ)で形質導入した。トランスダクション４８時間後、細胞をシクロスポリン(５μM)有りまたは無しで１時間処理し、その後CellomicsアレイスキャンII(固定法は欠き参照)を使用して固定し、造影し、定量した。核細胞質蛍光強度および細胞質蛍光強度の差異を、ウェル当たり５００細胞画像から測定した。
モロニーレトロウイルス発現粒子：トランスフェクション２４時間前、１.４７×１０６ ＧＰ２−２９３パッケージング細胞を、ＰＤＬプレート(ポリｄ−リシン６ウェルプレート、Becton Dickinson)上に、抗生物質無しの１０％血清中播種した。２.５μg ｏｆ発現構築物 QL-GW-final-KanベクターＤＮＡおよび２.５μg ｐｖｐａｃｋＶＳＶ−Ｇプラスミド(Stratagene)を最終容量２５０μl Optimem(Life Technologies)と合わせた。１２μl Lipofectamine 2000試薬を、最終容量２５０μl Optimemと混合し、５分、室温でインキュベートした。希釈したＤＮＡを、希釈したリポフェクタミンと合わせた(２０分、室温)。この複合体をＧＰ２細胞(抗生物質無しの２ml培地中)に添加し、一晩インキュベートした。翌日、培地を除去し、抗生物質を含む新鮮培地を補給した。トランスフェクション４８時間後、ウイルスを含む培地を集め、４℃で貯蔵した；細胞新鮮培地を補給した。トランスフェクション７２時間後、ウイルスの最終コレクションを行い、前の(４８時間)コレクションサンプルと共に貯蔵した。ウイルス上清を０.４５μM ＰＶＤＦフィルターで除去して、全ての非接着細胞および細胞残骸を除去した。
レンチウイルス発現粒子のパッケージング：パッケージング構築物のトランスフェクション２４時間前、１.４７×１０６ ２９３Ｔパッケージング細胞を、ＰＤＬプレート(ポリｄ−リシン６ウェルプレート、Becton Dickinson)上に、抗生物質無しの１０％血清中播種した。２μgのレンチウイルス発現構築物(ｐＬＬＢ１−ＧＷ−Ｋａｎ)および１μg ｐＬＰ−ＶＳＶＧプラスミド、１μg ｐＬＰ１、１μg ｐＬＰ２(Invitrogen)を２５０μl Optimem(Life Technologies)に懸濁した。１２μl Lipofectamine 2000試薬を最終容量２５０μl Optimem中で混合し、５分、室温でインキュベートした。希釈したＤＮＡを希釈したリポフェクタミンと合わせた(２０分、室温)。この複合体を２９３ Ｔ細胞(抗生物質無しの２ml培地中)に添加し、一晩インキュベートした。培地を除去し、抗生物質を含む新鮮培地を補給した。トランスフェクション４８時間後、ウイルスを含む培地を集め、４℃で貯蔵した；細胞に新鮮培地を補給した。トランスフェクション７２時間後、ウイルスの最終コレクションを行い、前の(４８時間)コレクションサンプルと共に貯蔵した。ウイルス上清を０.４５μM ＰＶＤＦフィルターで除去して、全ての非接着細胞および細胞残骸を除去した。
レンチウイルスｓｈＤＮＡ構築物のパッケージング：下記を除いて、記載のレンチウイルス発現構築物と同じ一般法：２.６×１０４ ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクション２４時間前に９６ウェルプレートに播種した。１００ng ｓｈＤＮＡ 構築物(ｐＬＫＯ.１)および１０ng ｐＬＰ−ｖｓｖｇプラスミド、５０ng ｐＬＰ１、５０ng ｐＬＰ２(Invitrogen)を３０μl Optimem(Life Technologies)に懸濁し、０.６μL fugene6(Roche)と合わせた。複合体を３０分形成させ、その後パッケージング細胞に添加した。
ウイルス構築物の記載：
ｐＬＬ−Ｂ１−ＧＷ−Ｋａｎベクターは、MIT lab(Luk VanParijs lab)からのｐＬＬ３.７ベクター由来であった。GatewayカセットはｅＧＦＰマーカーの代替であり、Ｕ６(ｓｈＲＮＡプロモーター)を欠失させた。カナマイシン耐性カセットは、アンピシリンカセットの代替であった。
QL-GW-final-Kanベクターは、BD BiosciencesからのｐＱＣＸＩＸベクター由来であった。ＣＭＶプロモーターおよびＩＲＥＳ配列を除き、gatewayカセットを該ベクターに挿入した。３’ＬＴＲを挿入した遺伝子の発現を駆動する野生型 ３’ＬＴＲに代えた。
ｐＬＫＯ.１ ｓｈＤＮＡ レンチウイルスベクターは未修飾であり、Cambridge MAのThe Broad Institute(The RNAi Consortium)から得た。
ＮＦＡＴ転写活性化
ＨＥＫ２９３細胞を、２０ngの示すプラスミドで、１０ng Renilla、２０ng ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６、および５０ng ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ(Stratagene Inc)と組み合わせてトランスフェクトした。トランスフェクションを約２０,０００細胞／ウェルを使用して９６ウェル形式で行った。細胞をＤＭＳＯ、５μM ＣｓＡ、１０μM ＰＭＡ、または１０μM ＰＭＡおよび５μM ＣｓＡのいずれかに１６時間曝した。レポーター活性を、トランスフェクション７２時間後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬で、製造者(Promega)の指示に従い測定した。
ＨｅＬａ細胞固定：細胞を、３.７％ホルムアルデヒド、０.５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で、ＰＢＳ中、２０分、室温で固定した。細胞を０.５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００のＰＢＳ溶液で２回洗浄した。
Jurkat細胞の固定および染色、ＮＦＡＴ転位アッセイ：処理後、Jurkat細胞を、Becton Dickinson細胞−Ｔａｋ細胞接着を使用して、９６ウェルプレートに付着させた。懸濁細胞を５分、予めコートしたプレート(製造者の指示に従う)上で遠心(８００×Ｇ)した。付着細胞を３.７％ホルムアルデヒド、０.５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で透過性にし、洗浄緩衝液(０.５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ ｉｎ ＰＢＳ)で２回洗浄し、２％ＢＳＡ、０.１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００のＰＢＳ溶液で遮断した。細胞を、遮断緩衝液中で一次抗体ＮＦＡＴ−１(Cellomics K01-0011-1、１：１００希釈)およびＮＦＡＴ−２(Affinity Bioreagents MA3-024、１：２５０希釈)で１時間、室温でインキュベートした。細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄し、遮断緩衝液中でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＧαＭに接合した二次ヤギ抗マウスＩｇＧ(Cellomics K01-0011-１試薬抗体、１：２０００希釈、およびHoechst色素１：２０００)とインキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、造影した。
ウイルスベクターへのGateway伝達ｃＤＮＡ配列：本試験で使用した遺伝子のｃＤＮＡ配列は、ＭＧＣ ｃＤＮＡクローンコレクションから得たGateway transfer of clonsから得て、それは直接使用したか、またはウイルスベクターＱＬ−ＧＷ−Ｋａｎ／ｐＬＬＢ１−ＧＷ−Ｋａｎに移された。これは、一チューブ反応および２段階反応工程を使用して達成した。ＢＰ反応を、１００ng ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６ ｃＤＮＡプラスミドと１００ng ｐＤＯＮＲ２０７(Invitrogen)中間プラスミドを合わせることにより行った。本反応は、１.５μLのＢＰ ５Ｘ Ｃｌｏｎａｓｅ緩衝液(Invitrogen)および１.５μL ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ(Invitrogen)を、総容量８μLで、室温で一晩添加することにより開始させた。ＬＲ反応を、４μL ＢＰ反応と１００ng 目的ベクター(ＱＬ−ＧＷ−ＫａｎまたはｐＬＬＢ１−ＧＷ−Ｋａｎ)を、０.４μL ０.７５Ｍ ＮａＣＬ、１μL ５×ＬＲ(Invitrogen)緩衝液および１.８μL ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅと共に最終容量１２μLで合わせることにより行った。室温で一晩インキュベートし、ＳＴＢ３細胞中に形質転換した(２０μL コンピテント細胞中２μL)。
ＨｅＬａ細胞のトランスダクション。細胞をトランスダクション２４時間前に、透明底組織培養処置９６ウェルプレートに、ＤＭＥＭ／ＦＢＳ(１０％熱不活性化血清、Invitrogen)および抗生物質／抗真菌剤(１％、Invitrogen)中、６０００細胞／ウェル(１００μl／ウェル)で播種した。培地を、８μg／ml ポリブレン(Sigma)および１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液(Invitrogen)の最終濃度でトランスダクション培地に置き換えた。５０μlのレトロウイルス上清を各ウェルに添加し、プレートを８００×ｇで９０分遠心した。
Jurkat細胞のトランスダクションおよび感作：Jurkat細胞をＲＰＭＩ １６４０(GIBCO ２１８７０−０７６)、１０％ＦＣ１胎仔クローン１(Hyclone)、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ１、０.１％ｂｅｔａ メルカプトエタノールに維持した。トランスダクション前に、細胞を：２.２５ｇ グルコース１％抗生物質／抗真菌剤、１％１Ｍ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)、１％１００mM ピルビン酸ナトリウム、１０ml ７.５％重炭酸ナトリウム１０％Ｆｅｔａｌクローン血清１で強化したＲＰＭＩ １６４０(上記)を含むトランスダクション培地に移した。細胞を最終濃度ウイルス(説明文中の容量)および４ug／ml ポリブレンと合わせたトランスダクション培地中、５×１０４で播種し、〜８００×ｇで３時間遠心した。ＩＣＯＳの活性化およびＩＬ−２発現実験のために、細胞を５０μlのレトロウイルス上清(QL-GW-final-Kan)で形質導入し、トランスダクション４８時間後、培地をＰＭＡ(ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート)１０ng／mlで強化し、添加２４時間後、細胞または培地をＩＣＯＳまたはＩＬ−２測定のために取り出した。ＮＦＡＴ転位実験のために、細胞を５０μlのレトロウイルス上清(ｐＬＬ−Ｂ１−ＧＷ−Ｋａｎ)で形質導入し、トランスダクション４８時間後、細胞をＰＭＡ １０ng／mlで６時間感作し、その後固定および染色した。
ＩＣＯＳ表面マーカーおよびＩＬ−２タンパク質発現の分析：１.５uLのＩＣＯＳ−ＰＥ(BD-Parmingen 557802)を〜１Ｘ１０６ Jurkat細胞と合わせ、氷上で３０分インキュベートした。細胞を、〜５００×ｇで５分遠心し、２×ＰＢＳで洗浄し、平均チャネル蛍光を、フローサイトメトリー(BD FACSCaliber)を使用して測定した。ＩＬ−２レベルを、QuantiGlo IL-2 Elisa kit(R&D Systems)を使用して測定した。
ｓｈＤＮＡ阻害試験のためのJurkat細胞活性化：ｓｈＤＮＡ効力の評価のために、Jurkat細胞(１５０００)を１０μL ＬＫＯウイルスで記載のように形質導入し、トランスダクション２４時間後、培地をピューロマイシンで強化した(下記参照)。トランスダクション６日後、細胞の半分を９６ウェルプレート表面に結合したＴＣＲおよびＣＤ２８受容体を標的とする抗体で活性化し、一晩インキュベートし、培地をＩＬ−２測定のために集めた。残った細胞を使用して、各ウェル中の生存細胞の画分を、細胞Titer-Gloアッセイを使用して測定した(下記参照)。
活性化プレートを、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)５５μl／ウェルで、ＰＢＳ中１０μg／mlの最終濃度でコーティングすることにより調製した。プレートを、３時間、室温でインキュベートした。過剰のＩｇＧを除去し、プレートをブロットした。プレートを３００μL ２％ＢＳＡ／ＰＢＳ(ＢＳＡ、Fraction V lyophilizate、Roche)でブロックし、２時間、室温でインキュベートした。プレートを、３回ＰＢＳで洗浄し、抗ＴＣＲ ０.０１ug／ml(BD Biosciences 347770 clone WT31)および抗ＣＤ２８ ０.３ug／ml(BD Pharmingen 555725)の抗体を、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、最終容量５０μL／ウェルで刺激した。プレートを一晩インキュベートし、３回ＰＢＳで洗浄し、その後活性化のために細胞を添加した。
ｓｈＤＮＡ形質導入Jurkat細胞のピューロマイシン選択および細胞生存に対する標準化：本試験で使用したＬＫＯウイルスベクターはピューロマイシン選択マーカーを含んだ。ｓｈＤＮＡ構築物(ＬＫＯ.１)で感染させたJurkat細胞を、感染２４時間後、ピューロマイシン(２μg／ml)添加によりピューロマイシン選択下に置き、実験期間中維持した(感染後６日間、ｍＲＮＡ定量のために３日間)。ピューロマイシン選択後の差異を説明するため(恐らくウイルス力価の変化のため)、我々は、細胞数に比例的な細胞性ＡＴＰアッセイを採用した(Cell Titer-Glo Luminescent Assay Kit, Promega)。本アッセイは製造者の指示に従い、行った。標準曲線を、各細胞型について作成し、本アッセイの直線性を測定した。ＩＬ−２濃度を、計算したＩＬ−２濃度を細胞力価−ｇｌｏアッセイのｒＬＵ値で割ることにより細胞数で標準化し、それは、ＩＬ−２発現／細胞数と等しい。ｍＲＮＡ発現レベルを、感染後３日間測定した。
ｃＭＡＣについてのｍＲＮＡノックダウンの測定：Jurkat ｍＲＮＡ発現レベルを、感染後３日間(ピューロマイシン選択後２日間)測定した。
ｓｈＤＮＡ構築物の調製およびＬＫＯ.１ベクターへのライゲーション：ＤＮＡオリゴを、ループ配列ＴＴＣＡＡＧＡＧＡを伴う５’ ＡｇｅＩおよび３’ ＥｃｏＲ１のアダプターと共に合成した。オリゴをアニールし、直接予め消化させたＬＫＯベクターにライゲートした。オリゴ配列について表６参照。
Figure 2009511013
実施例１
ｃＭＡＣがＴＯＲＣ１の核転位を誘発するとの発見。
ＮＦＡＴ、ＮＦｋＢおよびＡＰ−１は、恐らく、Ｔ細胞活性化における３個の最も重要な転写因子である(Quintana Eur J Physiol(2005)450:1-12)。全ての３種のプロモーター要素はＩＬ−２プロモーター上に示され、全３種ともカルシウム依存性(ＮＦｋＢおよびＡＰ−１は間接的)であることが決定されている。Ｔ細胞の活性化は、核へのＮＦＡＴ転位に必要である。これは、ホスファターゼ酵素カルシニューリンによる、ＮＦＡＴ上の核局在化配列の暴露により仲介される。カルシニューリンは、カルシウム動員により活性化させ、免疫抑制剤シクロスポリンＡにより遮断される。ＴＯＲＣ−１は、転写のｃＡＭＰ依存性コアクティベーターである。ＴＯＲＣ−１は、Ｔｏｒｃ−１がカルシウム動員後の活性化により核に転位する点でＮＦＡＴに似ている。ＴＲＰＶ６は、ストア感受性カルシウムチャネルであると考えられており、議論の余地はあるが、カルシウム活性化制御遺伝子の誘導を担うカルシウム(caclium)放出活性化カルシウム(ＣＲＡＣ)チャネルとの類似性を有することが示唆されている(Feske Nat Immunol. 2(4):316-24(2001))。
ｃＡＭＰ依存性ＣＲＥＢコアクティベーターＴＯＲＣ１の転位に関与する遺伝子を同定するための、高含量造影スクリーニングが行われている。このスクリーニングは、ＴＯＲＣ核転位のインデューサーとして、多くの遺伝子を同定したが、図４および表７(Bittinger et. al. Current Biology 14(23):2156-61(2004))、我々がここでｃＭＡＣ(カルシニューリンの保存的膜アクティベーター)と呼ぶ以前は特徴付けされていなかったものの正体は、その刊行物では開示されていなかった。公開されたマウスｃＭＡＣの配列(Accession NM_177344)およびヒトオルソログｃＭＡＣ(Accession NM_053045)は、GenBankに見られる。本スクリーニングで見られたＣＭＡＣクローンは、NM_177344と類似しているとしてアノテートされたＭＧＣクローンであった。しかしながら、NM_177344は、ヒトｃＤＮＡまたは予測されるｃＭＡＣのオルソログには存在しない、別の３’末端を有するタンパク質をコードする。一次スクリーニングで活性なｃＤＮＡならびにマウスｃＭＡＣのヒトオルソログを回収し、再形質転換し、配列確認し、ウイルスベクターに挿入し、そしてＴＯＲＣ１−ｅＧＦＰを安定に発現するＨｅＬａ細胞に挿入し、そして、サイトソルおよび核内のＴＯＲＣ１−ｅＧＦＰ量を、下記実施例２の自動顕微鏡プラットホームを使用して計算した。Ｔｏｒｃ−ｅＧＦＰ転位はカルシニューリン阻害剤シクロスポリンＡにより遮断され、これはまたｃＤＮＡが、自動顕微鏡プラットホームにより転位として誤解釈され得る細胞形態学または他の表現型とは対照的に、実際にＴＯＲＣ転位を誘発することをも説明する。
Figure 2009511013
実施例２
ｃＭＡＣはカルシウムおよびカルシニューリンを介して作用する。
ｃＭＡＣによるＴＯＲＣ転位がカルシウムおよびカルシニューリンを介するか否かを決定するために、ｃＭＡＣを、カルシウムチャネルＴＲＰＶ６およびヒトｃＭＡＣ配列を含むレンチウイルス粒子で細胞を感染させることにより、Ｔｏｒｃ１−ｅＧＦＰ融合構築物を安定に発現するＨｅＬａ細胞において過剰発現させた。細胞をカルシニューリン(calcineirin)阻害剤シクロスポリンＡ(ＣｓＡ)で１時間処理し、その後造影した。図５に示す通り：ＣｓＡ処置はＴＯＲＣ１転位に終わり、その結果ＴＯＲＣ１−ｅＧＦＰのほとんどが細胞質に戻った。これらのデータは、ＴＯＲＣ−１のｃＭＡＣ転位がカルシニューリン活性化に依存性であることを示唆する。別のセットの実験で、細胞外カルシウムの必要性もＥＧＴＡを使用して試験した。培地中のＥＧＴＡの存在が、ｃＭＡＣ誘発核ＴＯＲＣ１転位を遮断した。ＥＧＴＡの効果は、しかしながら培地への過剰のカルシウムの添加により逆転できた(データは示していない)。故に、ｃＭＡＣは、カルシニューリンのカルシウム依存性活性化を介してＴＯＲＣ１転位を誘発する。
カルシニューリン依存性ＮＦＡＴ転写因子に対するｃＭＡＣ過剰発現の効果も試験した。ｃＭＡＣまたは先に記載したＮＦＡＴアクティベーターＴＲＰＶ６を、ＮＦＡＴ駆動ルシフェラーゼレポーターと共トランスフェクトした。ＰＭＡ存在下で、ｃＭＡＣ(およびＴＲＰＶ６)過剰発現は、ＮＦＡＴ駆動発現の著しい増加を誘発し(図６)、この活性化はＣｓＡにより部分的に遮断された。このデータはカルシニューリン活性化と一致する。ｃＭＡＣによる活性化は、カルシウムチャネルＴＲＰＶ６とほぼ同程度に強力ではないことに注意すべきである。
実施例３
ＮＦＡＴの核転位およびＴ細胞活性化に対するｃＭＡＣの影響
ｃＭＡＣの、転写因子ＮＦＡＴの核転位に対する影響、およびそのカルシニューリンへの依存性も試験した。Jurkat細胞を、空ウイルスベクター(翻訳停止配列)、カルシウムチャネルＴＲＰＶ６またはヒトｃＭＡＣで形質導入した。細胞を内在性ＮＦＡＴ−１(図７)およびＮＦＡＴ−２(図８)タンパク質の位置について試験した。ＮＦＡＴ−１およびＮＦＡＴ−２は、コントロールウイルス感染細胞の細胞質で検出されたが、ＮＦＡＴの両アイソフォーム共ｃＭＡＣ形質導入細胞の大部分において主に核に局在した。転位は、細胞のＰＭＡでの感作に依存した。ＰＭＡ単独ではＮＦＡＴ転位に影響しないことが証明されたが、ｃＭＡＣまたはＴＲＰＶ６と組み合わせたＰＭＡは、劇的に核転位を増加させた。カルシニューリン阻害剤シクロスポリンＡは、ＮＦＡＴ−１およびＮＦＡＴ−２両方のＰＭＡ感作ｃＭＡＣ(およびＴＲＰＶ６)誘発転位を遮断した。
カルシウム動員および続くＮＦＡＴ転位は、Ｔ細胞活性化におけるシグナル伝達経路の必須要素であり、ＮＦＡＴはＩＬ−２の産生に必要である。これらのデータは、Ｔ細胞活性化におけるＮＦＡＴおよびカルシニューリンの役割をさらに指示し、そして、Ｔ細胞系におけるｃＭＡＣ過剰発現がカルシニューリン依存性内在性ＮＦＡＴ−１およびＮＦＡＴ−２転位を誘発することを特に証明する。
我々は、Ｔ細胞活性化スクリーニングにおいてＴＲＰＶ６およびｃＭＡＣの役割を評価した。Jurkat Ｔ細胞をＴＲＰＶ６およびｃＭＡＣ(図９)で形質導入し、抗ＴＣＲ抗体およびＰＭＡでプライミングした後にＴ細胞活性化マーカーを誘発するそれらの能力について試験した(ＰＭＡ単独では類似の結果が得られた)。ＴＲＰＶ６およびｃＭＡＣ両方とも、ＩＬ−２の誘発および表面マーカーＩＣＯＳの発現により評価してＴ細胞の強力なアクティベーターであったが、ＰＭＡ単独またはＰＭＡ＋抗ＴＣＲはＩＬ−２またはＩＣＯＳ発現レベルを上方制御しなかった。逆に言えば、ｃＤＮＡの発現は、ＰＭＡ感作なしにＩＬ−２およびＩＣＯＳの顕著な情報制御を証明し、これはＮＦＡＴの転位で観察された発見と一致する。このアッセイにおいて、それぞれRefSeq配列NM_0539045およびNM_177344としてアノテーションされたヒトおよびマウスｃＭＡＣｃＤＮＡの両方をコードするｃＤＮＡを試験した。両種のｃＭＡＣｃＤＮＡは、ＩＬ−２分泌およびＩＣＯＳ発現について同様に活性であった。故に、ｃＭＡＣ過剰発現はまたＴ細胞活性化マーカーを誘発する。
実施例４

ｃＭＡＣがJurkat Ｔ細胞の活性化に重要であることを証明するためのｓｈＲＮＡの使用
ｃＭＡＣがＴ細胞活性化に必須であるか否かを評価するために、我々は、ｃＭＡＣをターゲティングする数種のｓｈＤＮＡ構築物を設計した。これらの実験において、Jurkat Ｔ細胞にｃＭＡＣまたは他の非関連遺伝子をターゲティングするウイルス構築物で形質導入した。トランスダクション６日後、細胞をＴＣＲ／ＣＤ２８抗体で活性化させ、ｃＭＡＣ ｍＲＮＡおよび培地に分泌されたＩＬ−２のレベルを測定した。２種以外全てのｃＭＡＣをターゲティングするｓｈＤＮＡ構築物が、ＩＬ−２産生の顕著な低下を証明した。図１０。別の実験において、ＣＤ２９タンパク質および無作為マウス遺伝子をターゲティングする他のネガティブコントロールは、ネガティブコントロールｐＧＬ３と類似の阻害プロファイルを証明した。
ｓｈＤＮＡ構築物の特異性を決定するために、ｃＭＡＣ ｍＲＮＡの低下を各構築物で測定し(表８)、観察されたＩＬ−２の阻害と比較した。ｐＧＬ３−ＬｕｃおよびＣＤ２９ ｓｈＤＮＡ構築物は、ネガティブコントロールとして働いた。ＣＤ２９ ｓｈＤＮＡ構築物は、ＣＤ２９ ｍＲＮＡ(およびＣＤ２９タンパク質；データは示していない)を強力に低下させたが、ｃＭＡＣメッセージに影響しなかった。１種の構築物(ＢＬ８)のみが、ＩＬ−２を何ら低下させることなく、満足いくメッセージノックダウン(７０％)を証明し、第二の構築物(ＢＬ６)は、何らＩＬ−２を低下させることなく、最低限のｍＲＮＡノックダウン(３６％)を証明した。残りの構築物は、顕著なＩＬ−２減少をｍＲＮＡ減少と共に証明したが、ある場合ｍＲＮＡ低下は最低限であった。これらの場合において、恐らくｓｈＤＮＡがマイクロＲＮＡ作用を介してｃＭＡＣタンパク質の発現低下をもたらすであろう。故に、２種の構築物(ＢＬ６およびＢＬ８)以外、表現型上活性なＩＬ−２構築物は低下したｃＭＡＣ ｍＲＮＡレベルと相関するように見える。
Figure 2009511013
ｃＭＡＣは、予測される膜内在性タンパク質である。ＴＭＨＭＭアルゴリズムを使用した、ｃＭＡＣ配列の経膜ドメイン予測。２個の小さい予測される細胞外ドメインがアミノ酸３６−４９および１０１−１１０に位置する。 ｃＭＡＣは、非常に保存されたタンパク質である。ｃＭＡＣに類似の脊椎動物タンパク質のClustalWアラインメント。ＴＭＨＭＭアルゴリズムにより予測される潜在的な経膜へリックスを線で示す。 Affymetrix発現プロファイリングにより測定したｃＭＡＣ ｍＲＮＡレベル。 ｃＭＡＣ過剰発現は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＯＲＣ転位を誘導する。Bittenger et. al. は、ＴＲＰＶ６およびＰＫＡをＴＯＲＣ−ｅＧＦＰ転位スクリーニングにおけるヒットとして同定した(Bittenger et. al. Curr Biol. 2004 Dec 14;14(23):2156-61)。ｃＭＡＣもまた以前には記載されていないが、同定された。 ＴＯＲＣ１−ｅＧＦＰのｃＭＡＣ仲介転位は、カルシニューリン阻害剤ＣｓＡによりブロックされる。パネルＡにおいて、ＨｅＬａ：ＴＯＲＣ１−ｅＧＦＰ細胞を停止コドンウイルス(ベクター)、またはヒトＴＲＰＶ６、またはヒトＣＭＡＣウイルス(５０uL)で形質導入した。パネルＢ細胞を、細胞を固定前に５uM シクロスポリンＡ(ＣｓＡ)で１時間処理した以外、Ａと同様に処理した。 ｃＭＡＣは、ＮＦＡＴ依存性転写を誘発する。ＨＥＫ２９３細胞を、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポータープラスミド、トランスフェクションコントロール、以下の構築物：空ベクター(ＣＭＶ)、ＴＲＰＶ６およびｃＭＡＣと共トランスフェクトし、ＤＭＳＯ、５μM ＣｓＡ、１０μM ＰＭＡ、または１０μM ＰＭＡおよび５μM ＣｓＡで処理した。 ｃＭＡＣは、Jurkat細胞におけるＮＦＡＴ１転位を誘発する。パネルＡ。レンチウイルス介在過剰発現ｃＭＡＣ、コントロールベクター(翻訳停止配列)、およびＴＲＰＶ６と、シクロスポリンＡ有りおよび無し；Ｂ。細胞を固定前に６時間ＰＭＡでＰＭＡ感作した以外、Ａと同じ処置。 ｃＭＡＣは、Jurkat細胞においてＮＦＡＴ２転位を誘発する。Ａ。ウイルス(ｐＬＬＢ１−ＧＷ−Ｋａｎ)介在過剰発現ｃＭＡＣ、コントロールベクター(翻訳停止配列)、ＴＲＰＶ６と、シクロスポリン有りおよび無し；Ｂ。細胞を固定前に６時間ＰＭＡ感作した以外、Ａと同じ処置。 マウスｃＭＡＣおよびヒトホモログ過剰発現は、Jurkat Ｔ細胞。Jurkat細胞を、ネガティブコントロール空ベクター(翻訳停止配列)、ＴＲＰＶ６カルシウムチャネル、およびNM_177244(マウスｃＭＡＣ)およびNM_053045(ヒトｃＭＡＣ)を含むウイルス発現ベクター(QL-GW-final-Kan)で形質導入した。ＩＬ−２タンパク質(ＥＬＩＳＡ)およびＩＣＯＳ表面マーカー発現を、トランスダクション後７２時間に測定した(トランスダクション４８時間後、細胞をＰＭＡおよび抗ＴＣＲ抗体で感作した)。 ｃＭＡＣを標的とする多重ウイルスｓｈＤＮＡ配列は、Jurkat Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ２８活性化を遮断する。細胞をウイルス構築物(ｐＬＫＯ.１)で形質導入し、トランスダクション６日後ピューロマイシンで選択し、ＴＣＲ／ＣＤ２８で活性化した。ＩＬ−２タンパク質レベルを測定し、各ウェルに存在する生存細胞数で標準化した。ｓｈＤＮＡ構築物ｐＧＬ３−Ｌｕｃは、ウイルストランスダクションのネガティブコントロールｓｈＤＮＡとして働く。 ヒトｃＭＡＣ：NM_053045：ホモ・サピエンス仮説タンパク質MGC14327(MGC14327)、ｍＲＮＡ(gi|16596685|ref|NM_053045.1|[16596685])(配列番号１)およびヒト仮説タンパク質ＬＯＣ９４１０７[ホモ・サピエンス；＞gi|16596686|ref|NP_444273.1|](配列番号２)。 ヒトｃＭＡＣゲノムプロモーター配列(NM_053045.1_5'_-3000＋100 NT_024000.16 886093 882993)(配列番号３)。 ｃＭＡＣ５’ＵＴＲの単離核酸配列(配列番号４)およびｃＭＡＣ３’ＵＴＲの単離核酸配列(配列番号５)。 マウスｃＭＡＣ NM_177344：mus musculusRIKEN cDNA C730025P13遺伝子(C730025P13Rik)、ｍＲＮＡ(gi|31340922|ref|NM_177344.2|)(配列番号１１)および＞gi|18490941|gb|BC022606.1|mus musculusRIKEN cDNA C730025P13遺伝子、ｍＲＮＡ(ｃＤＮＡクローンMGC:31129 IMAGE:4165766)、完全ｃｄｓ(配列番号１２)およびNM_177344.２から翻訳したマウスｃＭＡＣアミノ酸配列(配列番号１３)。 他の種Mus musculus(配列番号１４)；Rattus norvegicus(配列番号１５)；Canis familiaris(配列番号１６)；Pan troglodytes(配列番号１７)；Xenopus tropicalis(配列番号１８)；Danio rerio(配列番号１９)；Gallus gallus(配列番号２０)；Branchiostoma floridae(配列番号２１)からのヒトｃＭＡＣの他のオルソログ。

Claims (72)

  1. 配列番号２またはそのフラグメント、または配列番号２と少なくとも５０％の配列同一性を有する実質的に類似のタンパク質、またはそれらの機能的同等物であって、天然配列番号２のイオン輸送、イオン拡散、カルシニューリン経路活性化、Ｔ細胞のカルシウム依存性活性化、ＴＯＲＣの核転位、ＮＦＡＴの核転位またはｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)駆動遺伝子発現活性から選択される一つの生物学的活性を示す、単離ポリペプチド。
  2. 配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１から成る群から選択される配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 請求項１または２に記載のポリペプチドと結合できる、抗体または抗体フラグメント。
  4. ｃＭＡＣ(配列番号２)、またはｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドと特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント。
  5. ＦａｂまたはＦ(ａｂ’)２フラグメントである、請求項３または４に記載の抗体フラグメント。
  6. モノクローナル抗体である、請求項３から５のいずれかに記載の抗体。
  7. 請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする、単離核酸分子。
  8. 配列番号１、配列番号１１または配列番号１２を含む、請求項７に記載の核酸分子。
  9. 核酸分子に操作可能に結合したプロモーターをさらに含む、請求項７または８に記載の核酸分子。
  10. 配列番号３、４および５から選択される、単離核酸配列。
  11. 請求項７から１０のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター分子。
  12. ｃＭＡＣ(配列番号１)の核酸配列を含む、請求項１１に記載のベクター分子。
  13. レポータータンパク質核酸配列に操作可能に結合したｃＭＡＣ(配列番号３)のプロモーターを含む、ベクター。
  14. 請求項１１から１３のいずれかに記載のベクター分子を含む、宿主細胞。
  15. 請求項１または２に記載のポリペプチドの製造方法であって、その中に請求項１１または１２のベクターを含む発現ベクターが組み込まれた宿主細胞を、該宿主細胞中での該ポリペプチドの発現に十分な条件下で培養することを含む、方法。
  16. 配列番号２のｃＭＡＣポリペプチドの製造方法であって、その中に請求項１１または１２のベクターを含む発現ベクターが組み込まれた宿主細胞を、該宿主細胞中での該ポリペプチドの発現に十分な条件下で培養することを含む、方法。
  17. 対象に有効量のｃＭＡＣの活性を阻害する薬剤を投与することを含む、障害の処置方法。
  18. 障害がｃＭＡＣ関連障害である、請求項１７に記載の方法。
  19. 該薬剤がｃＭＡＣ特異的結合領域を含む抗体、抗体フラグメントまたはポリペプチドである、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 薬剤としてｃＭＡＣ特異的結合領域を含む、請求項３から６のいずれかに記載の抗体、抗体フラグメントまたはポリペプチド。
  21. 対象における障害の処置における、ｃＭＡＣ特異的結合領域を含む抗体、抗体フラグメントまたはポリペプチドの使用。
  22. 障害がｃＭＡＣ関連障害である、請求項２１に記載の使用。
  23. ｃＭＡＣ関連障害の処置用薬剤の製造のための、請求項３から６のいずれかに記載の抗体の使用。
  24. 対象に有効量のｃＭＡＣの発現を阻害する薬剤を投与することを含む、障害の処置方法。
  25. 障害がｃＭＡＣ関連障害である、請求項２４に記載の方法。
  26. 該薬剤が、ｃＭＡＣの発現を特異的に阻害できる阻害性核酸である、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 該阻害性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ試薬、およびリボザイムから成る群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  28. ＲＮＡｉ試薬が、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡから成る群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. ＲＮＡｉ試薬が、配列番号２２から配列番号１０１、および配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３６、および配列番号１３７から成る群から選択される少なくとも１個の核酸を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 配列番号２２から配列番号１０１、および配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３６、および配列番号１３７から成る群から選択される少なくとも１個の核酸を含む、ＲＮＡｉ試薬。
  31. 薬剤としての、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡから成る群から選択されるｃＭＡＣに特異的なＲＮＡｉ試薬(ここで、該ＲＮＡｉ試薬は、配列番号２２から配列番号１０１、および配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３６、および配列番号１３７から成る群から選択される少なくとも１個の核酸を含む)。
  32. 対象における障害の処置のための、ｃＭＡＣに特異的なＲＮＡｉ試薬またはｓｉＲＮＡの使用。
  33. 障害がｃＭＡＣ関連障害である、請求項３２に記載の使用。
  34. ｃＭＡＣ関連障害の処置用薬剤の製造のための、請求項３１に記載のＲＮＡｉ試薬の使用。
  35. 対象に有効量のｃＭＡＣの活性を増強する薬剤を投与することを含む、対象における障害の処置方法。
  36. 対象に有効量のｃＭＡＣの発現を増加させる薬剤を投与することを含む、対象における障害の処置方法。
  37. 該薬剤がｃＭＡＣ遺伝子転写のエンハンサーである、請求項３６に記載の方法。
  38. 該薬剤がｃＭＡＣをコードする核酸またはそのフラグメントを含む遺伝子治療用ベクターである、請求項３６に記載の方法。
  39. 該薬剤が、請求項１１または１２に記載のベクターである、請求項３８に記載の方法。
  40. 障害がｃＭＡＣ関連障害である、請求項３６から３９のいずれかに記載の方法。
  41. 有効量のｃＭＡＣの発現を阻害するまたはｃＭＡＣの活性を阻害する薬剤、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  42. 薬剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ試薬である、請求項４１に記載の医薬組成物。
  43. ＲＮＡｉ試薬が配列番号２２から配列番号１０１、および配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３６、および配列番号１３７から成る群から選択される少なくとも１個の核酸を含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
  44. 薬剤がｃＭＡＣ、またはｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである、請求項４１に記載の医薬組成物。
  45. 抗体が請求項３から６のいずれかに記載の抗体である、請求項４４に記載の医薬組成物。
  46. 薬剤が、配列番号６、７、８、９、１０から選択されるｃＭＡＣのエピトープに結合する、請求項４４または４５に記載の医薬組成物。
  47. 対象に有効量のｃＭＡＣの活性を阻害する薬剤の医薬組成物を投与することを含む、障害の処置方法。
  48. 障害がｃＭＡＣ関連障害である、請求項４７に記載の方法。
  49. 該薬剤がｃＭＡＣ(配列番号２)またはｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである、請求項４７または４８に記載の方法。
  50. 抗体が請求項３から６のいずれかに記載の抗体である、請求項４９に記載の方法。
  51. 薬剤が配列番号６、７、８、９および１０から選択されるｃＭＡＣのエピトープに結合する、請求項４９に記載の方法。
  52. 対象に有効量のｃＭＡＣの発現を阻害する薬剤の医薬組成物を投与することを含む、障害の処置方法。
  53. 薬剤がｃＭＡＣの発現を特異的に阻害できる阻害性核酸である、請求項５２に記載の方法。
  54. 該阻害性核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ試薬、およびリボザイムから成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. ＲＮＡｉ試薬がｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡから成る群から選択される、請求項５４に記載の方法。
  56. ＲＮＡｉ試薬が配列番号２２から配列番号１０１、および配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３６、および配列番号１３７から成る群から選択される少なくとも１個の核酸を含む、請求項５５に記載の方法。
  57. ｃＭＡＣ関連障害の処置に有用な化合物の同定方法であって：
    (ａ)試験化合物とｃＭＡＣを接触させ；そして
    (ｂ)試験化合物と接触させていないｃＭＡＣと比較したｃＭＡＣの生物学的活性の変化を検出することを含む、方法(ここで変化の検出が、該障害の処置のために有用であるとして該試験化合物を同定する)。
  58. ｃＭＡＣ関連障害の処置に有用な化合物の同定方法であって：
    (ａ)試験化合物とｃＭＡＣを、ｃＭＡＣ生物学的活性を許容するサンプル条件下で接触させ；
    (ｂ)ｃＭＡＣ生物学的活性のレベルを測定し；
    (ｃ)該レベルを、該試験化合物を各コントロールサンプルのレベルと比較し；そして
    (ｄ)該障害の処置に有用な可能性のある薬剤としてのさらなる試験のために、該レベルの変化をもたらす試験化合物を選択する
    ことを含む、方法。
  59. 該変化が、このような生物学的活性の低下である、請求項５７または５８に記載の方法。
  60. 該生物学的活性がイオン輸送、イオン拡散、タンパク質−ｃＭＡＣ相互作用またはｃＭＡＣ修飾、Ｔ細胞のカルシウム依存性活性化、ＴＯＲＣの核転位、およびｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)駆動遺伝子発現から選択される、請求項５７から５９のいずれかに記載の方法。
  61. 化合物がｃＭＡＣ生物学的活性を調節するか否かを試験する方法であって：
    (ａ)試験化合物とｃＭＡＣを接触させ；そして
    (ｂ)試験化合物と接触させていないｃＭＡＣと比較したｃＭＡＣの生物学的活性の変化を検出することを含む、方法(ここで、変化の検出が、ｃＭＡＣ生物学的活性のモジュレーターとして該試験化合物を同定する)。
  62. 障害の処置に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがｃＭＡＣタンパク質の活性を阻害する能力についてアッセイすることを含む、方法。
  63. 障害の処置に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがｃＭＡＣタンパク質の発現を阻害する能力についてアッセイすることを含む、方法。
  64. 請求項５７から６３のいずれかに記載の方法により同定された、化合物。
  65. ｃＭＡＣ関連障害の処置に有用な化合物の同定方法であって、請求項６５の方法により同定された化合物を、該ｃＭＡＣ関連障害の動物モデルに投与することを含む、方法。
  66. ｃＭＡＣ関連障害が自己免疫性疾患、免疫抑制、炎症性疾患、癌、心血管疾患および神経学的疾患から成る群から選択される、請求項１８、２５、４０、５７から６０もしくは６５に記載の方法または請求項２２、２３、３３もしくは３４に記載の使用。
  67. 細胞においてｃＭＡＣ生物学的活性を阻害する方法であって、細胞と抗ｃＭＡＣ抗体またはそのフラグメントを、ｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドを、またはｃＭＡＣ発現を低下させる核酸を接触させることを含む、方法。
  68. 該生物学的活性がＴ細胞のカルシウム依存性活性化、ＴＯＲＣの核転位、ＮＦＡＴの核転位およびｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)駆動遺伝子発現から成る群から選択される、請求項６７に記載の方法。
  69. 多細胞生物においてリンパ球活性を選択的に阻害する方法であって、該生物と抗ｃＭＡＣ抗体またはそのフラグメントを、ｃＭＡＣ特異的結合領域を含むポリペプチドを、またはｃＭＡＣ発現を低下させる核酸を接触させることを含む、方法。
  70. Ｔ細胞活性化を増強する方法であって、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞と、精製ｃＭＡＣポリペプチド、ｃＭＡＣ遺伝子を含む遺伝子治療用ベクター、またはｃＭＡＣ遺伝子発現のエンハンサーを接触させることを含む、方法。
  71. ｃＭＡＣポリペプチドが請求項１または２に記載のポリペプチドである、請求項７０に記載の方法。
  72. ｃＭＡＣ遺伝子を含む遺伝子治療用ベクターが、請求項１１または１２に記載のベクターである、請求項７０に記載の方法。
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