JP2009510174A - ブデソニドおよびｉｌ−４受容体アルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた併用療法 - Google Patents

ブデソニドおよびｉｌ−４受容体アルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた併用療法 Download PDF

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Abstract

【要約書】
本明細書において提供されるのは、肺炎症および／または気道過敏症の、予防、改善および／または治療のために必要なステロイドの量を削減するための方法であり、IL-4Rアルファを標的化するステロイドおよびオリゴヌクレオチドの投与を含む。また記載されるのは、IL-4Rアルファを標的化する副腎皮質ステロイドおよびオリゴヌクレオチドの投与を含む、肺炎症および／または気道過敏症の、予防、改善および／または治療のための方法である。さらに提供されるのは、副腎皮質ステロイドおよびIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物である。

Description

発明の詳細な説明
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、2005年10月3日に出願されたU.S.仮出願第60/723,426号に関して優先権の利益を主張する。本出願は、2006年2月24日に出願され、WO2006/091841として公開された国際出願PCT/US2006/006645と関連があり、これはU.S.仮特許出願第60/656,760号（2005年2月25日に出願されたもの）；第60/688,897号（2005年6月9日に出願されたもの）；第60/700,656号（2005年7月19日に出願されたもの）；および第60/709,404号（2005年8月18日に出願されたもの）に関して優先権の利益を主張する。それぞれの出願は、参考文献としてその全内容が本明細書中に援用される。
背景
サイトカインIL-4は、抗原受容体との結合に続いてタイプ2ヘルパーT（TH2）細胞によって、および高親和性免疫グロブリンE（IgE）受容体の架橋に際して肥満細胞と好塩基球によって、産生される。IL-4は、防御免疫、アレルギー、喘息、およびあるタイプの自己免疫の阻害に関する重要な応答を誘発する。このサイトカインの多面発現効果は、高親和性の結合を仲介するIL-4Rアルファ鎖（IL-4Ra、CD124、およびインターロイキン4受容体アルファとしても知られる）および二次シグナル（second signal）伝達膜貫通タンパク質からなる受容体複合体との結合に依存する（Kelly-Welch et al., Science, 2003, 300, 1527-1528； Nelms et al, Annu. Rev. Immunol., 1999, 17, 701-738）。造血細胞において、IL-4Rアルファは、当初IL-2受容体の構成要素として特定された共通ガンマ鎖と二量体を形成し、タイプI IL-4R複合体を形成する。タイプII IL-4R複合体は、その代わりにIL-13Rアルファ1との二量体化を通して形成され、主として非造血細胞中に存在し、そしてサイトカインIL-13の結合に関連することもできる（Kelly-Welch et al., Science, 2003, 300, 1527-1528; Nelms et al., Annu. Rev. Immunol., 1999, 17, 701-738; Zurawski et al., Embo J., 1993, 12, 2663-2670）。IL-4R鎖は、IL-4を介した作用のためにいずれの場合でも必要とされるので、しばしば単にIL-4受容体と同一視される。
ヒトIL-4Rアルファ鎖は二つのグループによって独立してクローン化された（Galizzi et al., Int. Immunol., 1990, 2, 669-675; Idzerda et al., J. Exp. Med., 1990, 171, 861-873）。一方の研究において、ヒトIL-4Rアルファ鎖タンパク質は、マウスのIL-4Rアルファと53％の配列同一性を示し、そして、25アミノ酸のシグナルペプチド、207アミノ酸の外部ドメイン、24アミノ酸の膜貫通領域、569アミノ酸の細胞内ドメイン、６つの潜在的なＮ結合型糖鎖結合サイト（そのうち３つはマウスの配列中で保存されていた）、および細胞外ドメインにおける５つの保存されたシステインを含むと予測された（Idzerda et al., J. Exp. Med., 1990, 171, 861-873; Mosley et al., Cell, 1989, 59, 335-348）。もう一方のクローニングのアプローチでは、ヒトIL-4Rの細胞外ドメインとマウスIL-4Rの細胞外ドメインとの間で、タンパク質配列および核酸配列のレベルでそれぞれ50%および67%の同一性があることを明らかにし、そして、N末端および膜貫通ドメインの近くに位置する独特の配列モチーフ（ＷＳＸＷＳ）の近くの固定された距離にある、４つのシステイン残基によって特徴づけられるサイトカイン受容体ファミリーに、ヒトIL-4Rが分類されることが導かれた（Galizzi et al., Int. Immunol, 1990, 2, 669-675）。
IL-4Rサブユニットの細胞内領域は、JAK1、JAK3、およびTYK2を含むヤヌスキナーゼ(JAK)ファミリーのチロシンキナーゼと結合する。IL-4R二量体の形成は、JAK活性を刺激し、結果として、リン酸化タンパク質チロシン結合Srcホモロジー2（SH2）ドメインを含むシグナル伝達分子のドッキング部位として機能するIL-4Rアルファの細胞内ドメイン中チロシン残基のリン酸化が生じ、そして、核に移動して、IL-4およびIL-13に制御される遺伝子のプロモーター中の共通配列に結合することができる活性型STAT6ホモ二量体が引き続いて形成される。STAT6活性は、TH2分化、IgE生産、およびアレルギー性炎症部位におけるケモカイン並びに粘液の生産を含む、多くのIL-4およびIL-13に制御されるアレルギー性応答のために重要であり、そして、リンパ球の増殖と生存を制御することもできる（Kelly-Welch et al., Science, 2003, 300, 1527-1528）。IL-4Rシグナル伝達はまた、インスリン受容体基質（IRS）ファミリータンパク質を動員し、例えばPI3キナーゼの活性化などのシグナル伝達イベントを導き、それは、IL-4に対する応答における増殖、生存、および遺伝子発現の制御のために重要と考えられている（Kelly-Welch et al., Science, 2003, 300, 1527-1528）。
IL-4Rアルファ欠損BALB/cマウスは、明白な表現型の異常を示さず、また、正常なリンパ球数とその発生を有する。これらのマウスにおける免疫応答は、いくつかのモデル系において分析されてきた（Gessner and Rollinghoff, Immunobiology, 2000, 201, 285-307）。一つの研究は、IL-4Rを介したシグナル伝達が、気道粘液生産のTH2細胞刺激において非常に重要であり、これが喘息、気道閉塞、および死に至る臨床症状の原因となる（Cohn et al., J. Immunol, 1999, 162, 6178-6183）。
アレルギー性疾患の中でアトピーは、IgE抗体の形成およびアレルゲン曝露に対する過敏性を特徴としており、これが感受性個体において疾患発症の原因となる。環境要因も関係するのではあるが、アトピーは強い遺伝的素因を持つ（Hershey et al., N. Engl. J. Med., 1997, 337, 1720-1725）。IgE生産におけるIL-4Rアルファの役割は、アトピーを誘発させるような遺伝子変異の可能性を探る研究を促した。ヒトIL-4Rアルファ遺伝子は以前に16p11.2-16p12.1に特定された（Pritchard et al., Genomics, 1991, 10, 801-806）。Hersheyらは、アレルギー性炎症傷害を持つ患者において高い頻度で発生するこの遺伝子の多型を説明した。その変異型対立遺伝子（Q576R）は受容体の細胞内ドメインにおいてグルタミンからアルギニンへの変化を引き起こした（Hershey et al., N. Engl. J. Med., 1997, 337, 1720-1725）。さらなる研究により、第16染色体感受性遺伝子座が存在する可能性およびIL-4Rアルファ遺伝子多型とアトピーとの関連性が確認されたが（Ober et al., Clin. Exp. Allergy, 1999, 29 Suppl 4, 11-15）（Deichmann et al., Clin. Exp. Allergy, 1998, 28, 151-155）（Kruse et al., Immunology, 1999, 96, 365-371）、一方で別の報告では、ある被験者集団においてIL-4R遺伝子の多様性および第16染色体は、アトピー性疾患の素因と結びつかなかったこと、または関連しなかったことが示唆された（Grimbacher et al., N. Engl. J. Med., 1998, 338, 1073- 1074）（Patuzzo et al., J. Med. Genet., 2000, 37, 382-384）（Patuzzo et al., J. Med. Genet., 2000, 37, 382- 384）（Haagerup et al., Allergy, 2001, 56, 775-779）。同様の研究では、喘息とIL-4Rアルファ変異体または第16染色体とが結びつけられたが（Howard et al., Am. J. Hum. Genet., 2002, 70, 230-236）（Faffe et al., Am. J. Physiol. Lung Cell. MoI. Physiol, 2003, 285, L907-914）（Mitsuyasu et al., Nat. Genet., 1998, 19, 119-120）、一方で他の研究では、喘息の子供において、IL-4Rアルファ変異体または第16染色体上のいずれかのその他の遺伝子による遺伝子作用が一つも見いだされなかった（Wjst et al., Eur. J. Immunogenet., 2002, 29, 263-268）。
組換え型可溶性IL-4受容体（sIL-4R）は、細胞培養、動物モデル、およびアレルギー患者からのT細胞において、分泌されたIL-4分子を中和する目的で使用されてきた。このアプローチはまた、ヒトにおけるフェーズI/II研究において実行され、中程度の喘息患者においては、肺機能の安定化が報告された（Borish et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med.,1999, 160, 1816-1823）。
Dreyfusらは、ヒトIL-4R mRNAを標的化する外部ガイド配列の使用を明らかにする（Dreyfus et al., Int. Immunopharmacol., 2004, 4, 1015-1027）。
U.S.付与前公開No.2004-0049022は、呼吸器系疾患関連遺伝子を対象とした、低あるいは無アデノシン含量の単一または複数標的アンチセンスオリゴヌクレオチド（STAオリゴあるいはMTAオリゴ）の製造のための組成物および方法、一あるいは複数の遺伝子、EST、cDNA、mRNA、またはそれらの発現産物に結合する、呼吸器系疾患の予防および／または治療のために有用な候補化合物のスクリーニングのための方法、および、インターロイキン4受容体を含む核酸標的例のリストを、開示する（Nyce et al., 2004）。
U.S.付与前公開No.2004-0040052は、関心がある核酸（NOI）を伴い、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、siRNA、ショートヘアピンRNA、マイクロRNA、またはグループ1イントロンを作製可能な非霊長類レンチウイルス発現ベクターを導入することによって、トランスジェニック細胞を生産する方法を開示する。開示されたのは、ヒトの疾患に関連する遺伝子のリストであり、IL-4Rアルファも含まれる。（Radcliffe et al., 2004）。
U.S.付与前公開No.2003-0078220は、ヒトIL-4Rアルファ遺伝子およびその遺伝子に関する多様な遺伝子型およびハプロタイプにおける、1またはそれ以上の一塩基多型を検出するための組成物および方法を開示する。特定の同質遺伝子（isogene）から転写されたIL-4RアルファmRNAの翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計が記載される（Chew et al., 2003）。
炎症経路におけるIL-4Rの役割は、この標的遺伝子の阻害が、炎症性呼吸器系疾患を含む炎症性疾患の治療のために望ましい可能性があることを示唆する。現在、吸引副腎皮質ステロイドが、例えば喘息などの炎症性呼吸器系疾患を治療するために、しばしば使用される。そのような副腎皮質ステロイドのひとつはブデソニドである（K.R. Chapman, 2003, Clinical Therapeutics 25: C2-C14）。しかしながら、ステロイドはしばしば望ましくない副作用を持ち、治療のために使われるステロイド量の削減の必要性を生じる。
アンチセンス機構は、1またはそれ以上の特定遺伝子産物の発現を減少させるための有効な方法であり、また多くの治療上、診断上、および研究上の用途において比類なく有用である。したがって、本明細書において開示されるのは、例えばRNaseH、RNAi、およびdsRNA酵素などのアンチセンス作用機序および標的分解または標的占有に基づくその他のアンチセンス機構を介する、IL-4Rアルファ発現および関連経路の調節のために有用なアンチセンス化合物である。IL-4Rアルファを標的化するアンチセンス化合物を、単独であるいは副腎皮質ステロイドと併せて使用する、炎症性呼吸器系疾患の治療法が記載される。
概要
本明細書において提供されるのは、炎症性呼吸器系疾患と診断された患者を選択し、そしてその患者に副腎皮質ステロイドおよびIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、炎症性呼吸器系疾患の予防、改善、または治療のための方法である。さらに提供されるのは、副腎皮質ステロイドで治療を受けている患者を選択し、そしてその患者にIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、炎症性呼吸器系疾患の予防、改善、または治療のための療法を必要とする患者における、炎症性呼吸器系疾患の予防、改善、または治療のための方法である。また同様に提供されるのは、副腎皮質ステロイドで治療を受けている患者を選択し、そしてその患者にIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、炎症性呼吸器系疾患と診断された患者における副腎皮質ステロイドの最小有効量を削減する方法である。さらに提供されるのは、副腎皮質ステロイド治療によって疾患が的確に調節されていない患者を選択し、そしてその患者にIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、患者における炎症性呼吸器系疾患に関連した1またはそれ以上の症状を改善するための方法、および患者における炎症性呼吸器系疾患の調節を改善するための方法である。
一態様において、炎症性呼吸器系疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、または気管支炎である。
別の態様において、疾患調節における改善は、症状の数の減少、症状の重症度の減少、症状の持続時間の減少、症状を伴う日数の減少、症状の再発の阻害、または必要とされる副腎皮質ステロイドの用量または頻度の減少によって、計られる。
別の態様において、炎症性呼吸器系疾患の症状は、気道過敏症、肺炎症、粘液貯留、好酸球浸潤、炎症性サイトカインの生産増加、咳、くしゃみ、喘鳴、息切れ、胸部絞扼感、胸痛、疲労、鼻水、後鼻漏、鼻づまり、喉頭炎、涙目、または頭痛から選択される。
一態様において、投与は、副腎皮質ステロイドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを単一の製剤中で送達することを含む。一形態において、単一製剤は吸引によって送達される。
別の態様において、投与は、副腎皮質ステロイドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを別々の製剤中で送達することを含む。一形態において、別々の製剤は同時に送達される。別の形態において、別々の製剤は、異なる時点で送達される。一形態において、一方または両方の製剤の送達は吸引によるものである。
本方法の一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さで13〜30核酸塩基である。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトIL-4Rアルファの領域を標的化する。一形態において、その領域はヒトIL-4Rアルファ（SEQ ID NO: 3）のヌクレオチド2056-2087の少なくとも8核酸塩基部分である。別の形態において、その領域はヒトIL-4Rアルファ（SEQ ID NO: 3）のヌクレオチド2060-2079の少なくとも8核酸塩基部分である。一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO: 25を含む。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO: 25からなる。
本方法の一態様において、副腎皮質ステロイドはブデソニドである。
また本明細書において同時に提供されるのは、副腎皮質ステロイドおよびIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物である。一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さで13〜30核酸塩基である。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトIL-4Rアルファの領域を標的化する。一形態において、その領域はヒトIL-4Rアルファ（SEQ ID NO: 3）のヌクレオチド2056-2087の少なくとも8核酸塩基部分である。別の形態において、その領域はヒトIL-4Rアルファ（SEQ ID NO: 3）のヌクレオチド2060-2079の少なくとも8核酸塩基部分である。一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO: 25を含む。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO: 25からなる。一態様において、副腎皮質ステロイドはブデソニドである。
さらに提供されるのは、気道過敏症または肺炎症の予防、改善、および／または治療のための医薬を調製するための、副腎皮質ステロイドおよびIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の使用である。また同時に提供されるのは、副腎皮質ステロイドによって治療を受けている患者における、炎症性呼吸器系疾患の治療のための医薬を調製するための、IL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。また同時に提供されるのは、副腎皮質ステロイドによって疾患が的確に調節されていない患者における、炎症性呼吸器系疾患の治療のための医薬を調製するための、IL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。また本明細書において同時に提供されるのは、炎症性呼吸器系疾患と診断された患者において、副腎皮質ステロイドの最小有効量を削減するための医薬を調製するための、IL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。さらに提供されるのは、炎症性呼吸器系疾患の予防、改善、または治療のために必要な副腎皮質ステロイドの用量を削減するための医薬を調製するための、IL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。一態様において、副腎皮質ステロイドはブデソニドである。別の態様において、薬物は吸引によって送達されるように製剤化される。
発明の詳細な説明
概要
アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、および気管支炎を含む（これらには限定されない）、多くの炎症性呼吸器系疾患のための十分な治療に関する、満たされていない多くのニーズがある。吸引副腎皮質ステロイドを含む現在の治療は、しばしば望まない副作用を伴い、特にそれは子供においてみられる。多くの呼吸器系疾患の患者はステロイド治療で良くなるが、しばしば十分な疾患管理が達成されない。加えて、ステロイドによる治療を受けた患者の間では感作されることがよく見られ、同じ治療効果を達成するために必要なステロイドの用量の増加を導く。したがって、治療を必要としている患者に対して送達されるステロイドの量の削減を可能にする、治療的介入を行うことが望ましい。炎症性呼吸器系疾患の調節をさらに改善するための治療の発展がさらに望ましい。
アンチセンス機構は、1またはそれ以上の特定の遺伝子産物の発現を減少させるための有効な手段であり、多くの治療上、診断上、および研究上の用途において比類なく有用である。本明細書において提供されるのは、アンチセンス作用機序を介する、遺伝子発現および関連経路の調節のために有用なアンチセンス化合物である。アンチセンス機構の背後にある原理は、アンチセンス化合物が、標的核酸にハイブリダイズし、多くのアンチセンス機構のうちのひとつを通じて、例えば転写、スプライシング、または翻訳などの遺伝子発現活性を調節することである。アンチセンス化合物の配列特異性は、標的検証および遺伝子機能付与のための道具として、並びに疾患に関連した遺伝子の発現を選択的に調節する治療剤として、アンチセンス化合物を極めて魅力的なものにしている。
本明細書において開示されるのは、IL-4Rアルファをコードする核酸分子の発現調節に利用するための、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス化合物である。
また同時に提供されるのは、副腎皮質ステロイドおよびIL-4Rを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与によって患者における炎症性呼吸器系疾患を予防、改善、または治療する方法である。一態様において、副腎皮質ステロイドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、単一の製剤中で投与される。別の態様において、副腎皮質ステロイドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、別々の製剤中に調製し、そして同時にまたは異なる時点で投与することができる。副腎皮質ステロイドは、経口または吸引を含むいずれの手段で送達されてもよい。一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、吸引によって送達される。本明細書中において記載されるように、炎症性呼吸器系疾患のための副腎皮質ステロイド治療をすでに受けている患者におけるIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、副腎皮質ステロイドの最小有効量を削減し、そのことにより治療のために必要な副腎皮質ステロイドの用量及び頻度の減少を導くことができる。炎症性呼吸器系疾患と診断された患者に対するIL-4Rアルファアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、付加型治療（add-on treatment）として利用可能であり（すなわち、現在副腎皮質ステロイド治療を受けている患者に対して投与することができる）、または副腎皮質ステロイドとともに併用療法として利用可能である。
さらに本明細書において提供されるのは、炎症性呼吸器系疾患の1またはそれ以上の症状を改善する方法、および疾患調節の改善のための方法である。一態様において、副腎皮質ステロイド治療を受けているが、その疾患が的確に調節されていないような患者を、治療のために選択する。選択された患者は、副腎皮質ステロイドおよびIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与される。場合によって、患者は、その患者の通常の副腎皮質ステロイド治療の投与計画を継続し、そしてIL-4Rアルファアンチセンスオリゴヌクレオチド治療は付加型治療として利用される。別の場合において、新しい投与計画が確立され、それによって副腎皮質ステロイドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、単一製剤中で同時投与するか、または、同時に若しくは異なる時点で、別々の製剤中で投与される。
別の態様において、先行する治療を全く受けていない患者または非副腎皮質ステロイド治療を受けていた患者が選択される。上述のように、選択された患者は、副腎皮質ステロイドおよびIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、単一製剤若しくは別々の製剤中で、投与される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、吸引によって投与される。別々の製剤中で送達される場合、副腎皮質ステロイドは、経口または吸引を含む、いずれの方法で送達されてもよい。
本明細書において使用される場合、炎症性呼吸器系疾患には、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー性鼻炎、および気管支炎を含む（ただし必ずしもこれに限定しない）。
本明細書において使用される場合、“疾患調節における改善”は、症状の数の減少、症状の重症度の減少、症状の持続時間の減少、症状を伴う日数の減少、症状の再発の阻止、または必要とされる副腎皮質ステロイドの用量若しくは頻度の減少が含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）、様々な方法によって測定することができる。同様に、症状における改善とは、症状の数の減少、症状の重症度の減少、症状の持続時間の減少、症状を伴う日数の減少、および／または症状の再発の阻止を意味する。
本明細書において使用される場合、炎症性呼吸器系疾患には、気道過敏症、肺炎症、粘液貯留、好酸球浸潤、炎症性サイトカインの生産増加、咳、くしゃみ、喘鳴、息切れ、胸部絞扼感、胸痛、疲労、鼻水、後鼻漏、鼻づまり、喉頭炎、涙目、または頭痛が含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。
本明細書において使用される場合、“要求されるステロイド送達の削減”および“必要とされるステロイドの量の削減”などの用語は、ステロイドの投与の用量または頻度の削減を意味する。
本明細書において使用される場合、“副腎皮質ステロイドの最小有効量”とは、患者において、望ましい効果または治療成績を達成するために必要とされる副腎皮質ステロイドの最小用量を意味し、ここで望ましい効果または治療成績とは、炎症性呼吸器系疾患の1またはそれ以上の症状の重症度、持続時間、若しくは頻度の減少（すなわち1またはそれ以上の症状の改善）、または炎症性呼吸器系疾患の予防若しくは改善が含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。最小有効量とはまた、疾患調節が観察される用量をも意味し得る。本明細書において記載されるように、例えばブデソニドなどの副腎皮質ステロイドを、IL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに投与することによって、治療効果（例えば症状または疾患調節における改善）が、副腎皮質ステロイドのより少ない用量またはより少ない頻度の投与によって達成することができ、それによって、副腎皮質ステロイドによって引き起こされる好ましくない副作用の減少を導くことができる。
本明細書において使用される場合、炎症性呼吸器系疾患が的確に調節されていない患者とは、例えば副腎皮質ステロイド治療などの治療を受けている患者であって、治療に対して反応していないか、または疾患の1またはそれ以上の症状を改善するのに十分なほど効果的に若しくは疾患調節を改善するには十分なほど効果的には反応していないような患者を意味する。
アンチセンス機構
本明細書において使用される場合、“アンチセンス機構”とは、標的核酸に対する化合物のハイブリダイゼーションに関わる全ての機構であって、ハイブリダイゼーションの結果または効果が、例えば転写やスプライシングに関与する細胞機構の付随的な停止を伴う、標的分解かまたは標的占有であるもののいずれか、である。
標的分解には、RNaseHが含まれていてもよい。RNaseHは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。“DNA様”の一本鎖アンチセンス化合物がRNaseHを誘発することが、当該技術分野において知られている。したがって、RNaseHの活性化はRNA標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のDNA様オリゴヌクレオチド媒介性阻害の効率を強く増強する。
標的分解は、RNA干渉（RNAi）を含んでいてもよい。RNAiは、最初に線虫（Caenorhabditis elegans）において定義された、転写後遺伝子サイレンシングの一形態であり、二本鎖RNA（dsRNA）への曝露の結果としてもたらされる。多くの種において、例えば二本鎖RNA（dsRNA）分子などの、二本鎖構造の導入は、遺伝子またはそれの関係する遺伝子産物の機能の強力かつ特異的なアンチセンス媒介性減少を誘導することを示した。RNAi化合物は、しばしば低分子干渉RNAまたはsiRNAと呼ばれる。近年、siRNAのアンチセンス極性の一本鎖RNAオリゴマーこそがRNAiの強力な誘導因子であることが実際に示された（Tijsterman et al., Science, 2002, 295, 694-697）。
RNAi化合物（すなわち一本鎖若しくは二本鎖RNAまたはRNA様化合物）および一本鎖RNaseH依存性アンチセンス化合物の両方とも、塩基対合（すなわちハイブリダイゼーション）によってそのRNA標的に結合し、そして特定のRNaseによって標的RNAの部位特異的切断を誘導する；すなわちこの両者がアンチセンス機構である（Vickers et al, 2003, J. Biol. Chem., 278, 7108-7118）。例えばRNaseIIIおよびリボヌクレアーゼLファミリーの酵素にあるような、二本鎖リボヌクレアーゼ（dsRase）もまた、RNA標的分解において役割を果たす。それらの引き金を引く、二本鎖リボヌクレアーゼおよびオリゴマー化合物は、U.S.特許5,898,031および6,107,094においてさらに記載される。
標的核酸
本明細書において使用される場合、“標的化する”または“標的化される”とは、オリゴマー化合物を、その化合物が選択された核酸分子に対してハイブリダイズするように設計する工程を意味する。オリゴマー化合物をある特定の標的核酸分子に標的化することは、多段階工程であってもよい。その工程は通常、その発現が調節される標的核酸の特定から始まる。本明細書において使用される場合、“標的核酸”および“IL-4Rアルファをコードする核酸”という用語は、IL-4RアルファをコードするDNA、そのようなDNAから転写されるRNA（mRNA前駆体およびmRNAを含む）、およびそのようなRNAに由来するcDNAも包含する。本明細書において開示されているように、標的核酸はIL-4Rアルファをコードする。
標的化の工程にはまた、通常、アンチセンス相互作用が起こるための、標的核酸中の少なくとも一つの標的領域、断片、または部位を決定することが含まれ、これによって望ましい効果（例えば発現の調節）をもたらすことができる。“領域”とは、少なくとも一つの特定可能な構造、機能、または特徴を有する、標的核酸の一部と定義される。標的領域には、例えば、特定のエキソンまたはイントロンが含まれていてもよく、または適切な標的領域として特定されるエキソンまたはイントロン内部の選択された核酸塩基のみが含まれていてもよい。標的核酸の領域内部に断片がある。“断片”とは、標的核酸内部の領域のより小さいまたは下位部分として定義される。“部位”とは、本明細書において使用される場合、標的核酸内部の独特の核酸塩基の位置として定義される。本明細書において使用される場合、オリゴマー化合物の“標的部位”とは、化合物が結合する標的核酸の最も5’末端側のヌクレオチドである。
本明細書において提供されるのは、IL-4Rアルファ（IL-4受容体アルファ；インターロイキン4アルファ受容体；CD124；IL-4Ra；インターロイキン4受容体アルファ鎖としても知られる）の発現調節のための組成物および方法である。表１において記載されているのは、IL-4Rアルファを標的化したオリゴマー化合物の設計のために使用された配列のGENBANK（登録商標）受入番号である。表１はまた、その遺伝子標的核酸配列内部に含まれる特性も記す。代表的な特性には、5’UTR、開始コドン、コード配列（CDS）、終始コドン、3’ UTR、エキソン、イントロン、エキソン：エキソン連結部位、イントロン：エキソン連結部位、およびエキソン：イントロン連結部位が含まれる。“特性開始部位（feature start site）”および“特性終始部位（feature end site）”とは、指定された配列に関して記されている特性の、最初（最も5’側）および最後（最も3’側）のヌクレオチド番号をそれぞれ意味する。例えば、最初の３つのヌクレオチドからなる開始コドンを含有する配列に関して、“特性開始部位”は“1”そして“特性終始部位”は“3”になる。
本明細書において提供されるオリゴマー化合物には、表１に記載の1またはそれ以上の標的核酸分子とハイブリダイズするオリゴマー化合物、およびIL-4Rアルファをコードするその他の核酸分子にハイブリダイズするオリゴマー化合物が含まれる。オリゴマー化合物は、IL-4Rアルファをコードする核酸分子のいずれの領域、断片、または部位でも標的化することができる。適切な標的領域、断片、および部位には、標的RNA内部の、5’UTR、開始コドン、終始コドン、コード領域、3’UTR、5’キャップ領域、イントロン、エキソン、イントロン-エキソン連結部位、エキソン-イントロン連結部位、エキソン-エキソン連結部位、またはヌクレオチドのいずれかの領域若しくは断片、またはヌクレオチド部位が含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。
Figure 2009510174
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標的発現の調節
標的核酸の発現の調節は、いくつかの核酸（DNAまたはRNA）の機能を変化させることを通して達成され得る。“調節”とは機能の攪乱を意味し、例えば、発現における増加（刺激または誘導）または低下（阻害または低下）を意味する。その他の例として、発現の調節には、mRNA前駆体プロセシングのスプライス部位選択の攪乱が含まれ得る。“発現”には、遺伝子にコードされた情報が、細胞内で存在および機能する構造体に変換されることによって生じる全ての機能が含まれる。これらの構造体には、転写産物及び翻訳産物が含まれる。“発現の調節”とは、そのような機能の攪乱を意味する。調節されるRNAの機能には移動機能が含まれてもよく、この機能には、タンパク質翻訳の部位へのRNAの移動、RNA合成部位から離れた細胞内の部位へのRNAの移動、およびRNAからタンパク質への翻訳が含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。調節され得るRNAプロセシング機能には、1またはそれ以上のRNA種を生産するためのRNAのスプライシング、RNAのキャップ形成、RNAの3’の成熟、およびRNAが関与し得るまたはRNAによって促進され得る、RNAに関わる触媒活性または複合体形成が含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。発現の調節は、一時的にまたは正味の定常状態レベルまで、1またはそれ以上の核酸種レベルの増加、あるいは1またはそれ以上の核酸種レベルの低下をもたらし得る。標的核酸機能に対するそのような干渉の一つの結果は、IL-4Rアルファの発現の調節である。したがって、一態様において、発現の調節は、標的RNAまたはタンパク質濃度の増加または減少を意味し得る。別の態様において、発現の調節は、1またはそれ以上のRNAスプライス産物の増加または低下、あるいは2またはそれ以上のスプライス産物の比における変化を意味し得る。
標的核酸発現に対するオリゴマー化合物の効果は、標的核酸が測定可能なレベルで存在するならば、様々な細胞型のいずれにおいても試験可能である。その効果は、例えばPCRまたはノーザンブロット解析を使って、ごく普通に測定することができる。細胞株は、正常な組織および細胞型、並びに様々な障害に関係した細胞の両方に由来する。複数の組織及び種に由来する細胞株は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、これは当業者においてよく知られている。初代細胞、または動物から単離され、そしてまだ連続培養に供されていない細胞は、当該技術分野において知られている方法に基づいて調製可能であり、またはさまざまな商業的供給者から入手可能である。加えて、初代細胞には、臨床におけるドナーヒト被験者（donor human subjects）（すなわち血液ドナー、外科患者）から入手されるものが含まれる。初代細胞は当該技術分野において知られる方法によって調製される。
発現の調節解析
IL-4Rアルファ発現の調節は、当該技術分野において知られる様々な方法によって解析可能である。IL-4RアルファmRNAレベルは、例えば、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、またはリアルタイムPCRによって定量可能である。RNA解析は、全細胞性RNAまたはpoly(A)+mRNAに対して、当該技術分野において知られている方法によって実施可能である。RNA単離の方法は例えば、Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1-4.2.9および4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993において説明される。
ノーザンブロット解析は、当該技術分野においてごく普通のものであり、例えば、Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996）において説明される。リアルタイム定量（PCR）は、市販のABI PRISMTM7700 Sequence Detection System（PE-Applied Biosystems, Foster City, CAより入手可能であり、製造者の取扱説明書に従って使用される）を使用して、簡単に達成できる。
IL-4Rアルファにコードされるタンパク質レベルは、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロット解析（免疫ブロット法）、ELISAまたは蛍光標識細胞分取（FACS）などの当該技術分野においてよく知られている様々な方法で定量可能である。IL-4Rアルファにコードされるタンパク質に対する抗体は、例えば、MSRS抗体カタログ（Aerie Corporation, Birmingham, MI）などの様々なソースから特定および入手可能であり、または、従来の抗体生産法によって調製可能である。ポリクローナル抗血清の調製のための方法は、例えば、Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997において説明される。モノクローナル抗体の調製は、例えば、Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997において説明される。
免疫沈降法は、当該技術分野において標準的であり、そして、例えば、Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998に見いだすことができる。ウェスタンブロット（免疫ブロット）解析は、当該技術分野において標準的であり、そして、例えば、Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997に見いだすことができる。酵素結合性免疫吸着測定法（ELISA）は、当該技術分野において標準的であり、そして、例えば、Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991に見いだすことができる。
キット、研究試薬および診断
本明細書において提供されるアンチセンス化合物は、診断のために、そして研究試薬およびキットとして利用可能である。さらに、アンチセンス化合物は、特異性により遺伝子発現を阻害し、または遺伝子発現を調節することが可能であり、特定遺伝子の機能解明するため、または生物学的経路の様々な要素の機能を区別するために、当業者によってしばしば利用される。
キット及び診断における使用のために、本明細書において提供されるアンチセンス化合物を、単独でまたはその他の化合物若しくは治療剤と併用して、差分解析および／または組み合わせ解析における道具として利用して、細胞および組織内部で発現される遺伝子の一部または遺伝子の総体の発現パターンを解明することができる。遺伝子発現解析の方法は、当業者においてよく知られている。
治療剤
本明細書において提供されるアンチセンス化合物は、例えばヒトなどの、動物におけるIL-4Rアルファの発現を調節するために利用可能である。一つの限定的ではない態様において、その方法は、IL-4Rアルファの発現を調節する有効量のアンチセンス化合物を、IL-4Rが関係する疾患または病気に対する治療を必要としている前記動物に対して投与する工程を含む。IL-4Rアルファが関係する疾患または病気には、気道過敏症、肺炎症、喘息、鼻炎、および気管支炎が含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。IL-4RアルファRNAの発現またはタンパク質発現産物を効果的に調節するアンチセンス化合物は、活性アンチセンス化合物と見なされる。
例えば、IL-4Rアルファの発現の調節は、体液中で測定可能であり、それは動物の細胞；組織；または器官を含んでいても含んでいなくてもよい。例えば体液（例えば痰、血清）、組織（例えば生検）、または器官などの、解析のためのサンプルを得る方法、および解析を可能にするためのサンプル調製の方法は、当業者においてよく知られている。RNAおよびタンパク質レベルの解析の方法は、上述されており、当業者においてよく知られている。処置の効果は、当該技術分野において知られているごく普通の臨床上の方法によって1またはそれ以上の化合物と接触した動物から集められる、上述の体液、組織または器官において、標的遺伝子発現と関連する生物マーカーを測定することによって評価可能である。これらの生物マーカーには、肝トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、血中尿素窒素、クレアチン、およびその他の腎および肝機能のマーカー；インターロイキン、腫瘍壊死因子、細胞内接着分子、Ｃ反応性タンパク質、ケモカイン、サイトカイン、およびその他の炎症性マーカーが含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。
本明細書において提供されるアンチセンス化合物は、適切な薬剤的に許容される希釈剤または担体に、有効量の化合物を加えることによって、医薬組成物において利用可能である。許容される担体及び希釈剤は、当業者においてよく知られている。希釈剤または担体の選択は、化合物の可溶性および投与の経路（ただし必ずしもこれらには限定されない）を含む、多くの要素に基づく。かかる検討事項は、当業者によってよく理解されている。本明細書において提供される化合物はまた、IL-4Rアルファと関係する疾患及び障害の治療のための医薬の製造においても利用可能である。
体液、器官または組織が有効量の1またはそれ以上のアンチセンス化合物または組成物に接触される方法もまた意図されている。体液、器官または組織は、本明細書において述べられている1またはそれ以上の化合物と接触可能であり、結果として、体液、器官または組織の細胞内においてIL-4Rアルファ発現の調節がもたらされる。有効量は、当業者にとってごく普通の方法により、標的核酸またはその産物に対する1またはそれ以上のアンチセンス化合物または組成物の調節効果を監視することによって決めることができる。
したがって、本明細書において提供されるのは、上述の方法を用いた、疾患または障害の治療のための医薬の製造における、IL-4Rアルファを標的化する単離アンチセンス化合物の使用である。
アンチセンス化合物
“オリゴマー化合物”という用語は、核酸分子のある領域にハイブリダイズすることができる、高分子構造体を意味する。この用語には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、およびこれらのキメラ組み合わせが含まれる。オリゴマー化合物は、ごく普通には直鎖状に調製されるが、結合可能であり、またはそうでなければ環状に調製可能である。それに加えて、分岐構造が当該技術分野において知られている。“アンチセンス化合物”または“アンチセンスオリゴマー化合物”とは、核酸の領域に少なくとも部分的に相補的であり、そこにハイブリダイズし、そしてその発現を調節（増加または低下）するオリゴマー化合物を意味する。結果的に、すべてのアンチセンス化合物はオリゴマー化合物と言えるが、一方ですべてのオリゴマー化合物がアンチセンス化合物であるとは言えない。“アンチセンスオリゴヌクレオチド”とは、核酸を基礎とするオリゴマーのアンチセンス化合物である。アンチセンスヌクレオチドは、化学的に修飾可能である。限定的ではないオリゴマー化合物の例には、プライマー、プローブ、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（EGS）オリゴヌクレオチド、および選択的スプライサー（alternative splicers）が含まれる。一態様において、オリゴマー化合物は、センス鎖に対してハイブリダイズするアンチセンス鎖を含む。オリゴマー化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、分岐状、またはヘアピンの形状において導入してもよく、そして、例えば内部または末端のバルジまたはループなどの構造要素を含有してもよい。オリゴマー二本鎖化合物は、ハイブリダイズして二本鎖化合物を形成する二本の鎖であってもよく、または、ハイブリダイゼーションおよび全体または一部が二本鎖化合物の形成を可能とするような、十分な自己相補性を有する一本鎖であってもよい。
一態様において、二本鎖アンチセンス化合物は、低分子干渉RNA（siRNAs）を包含する。本明細書において使用される場合、“siRNA”という用語は、第一鎖（first strand）および第二鎖（second strand）を有する二本鎖化合物と定義され、そして、前記第一鎖と第二鎖間の中央の相補性部分（central complementary portion）、および前記第一鎖と第二鎖間または標的mRNAに対して相補的であってもよい末端部（terminal portion）を含む。鎖の末端は、1またはそれ以上の天然または修飾核酸塩基が付加されて、突出を形成することにより、修飾がされてもよい。限定的ではない一例として、siRNAの第一鎖は標的核酸に対するアンチセンスであり、一方で第二鎖は第一鎖に対して相補的である。一度アンチセンス鎖が特定の核酸標的を標的化するように設計されると、次いでsiRNAのセンス鎖はアンチセンス鎖の相補体として設計及び合成され、そしてどちらか一方の鎖が、どちらか一方の末端に修飾や付加を含んでいてもよい。例えば、一態様において、siRNA二重鎖の両鎖が中央部核酸塩基にわたって相補的であり、それぞれが一方または両方の末端に突出を有する。二重鎖の一端が平滑末端であり、そしてもう一端が突出する核酸塩基を有していてもよい。一態様において、突出する核酸塩基の数は、二重鎖のそれぞれの鎖の3’末端において、1〜6である。別の態様において、突出する核酸塩基の数は、二重鎖の一方の鎖のみの3’末端において、1〜6である。さらなる態様において、突出する核酸塩基の数は、二重鎖の一方または両方の鎖の5’末端において、1〜6である。別の態様において、突出する核酸塩基の数は0である。
一態様において、二本鎖アンチセンス化合物は、標準siRNAである。本明細書において使用される場合、“標準siRNA”とは、長さでそれぞれ21核酸塩基の第一鎖および第二鎖を有する二重鎖オリゴマー化合物であり、その鎖が19核酸塩基にわたって相補的であり、そしてそれぞれの鎖の3’末端にその二重鎖化合物内において3’突出として機能するデオキシチミジン二量体（dTdT）を有するもの、と定義される。
本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、約8〜約80核酸塩基（すなわち約8〜約80の連結するヌクレオシド）を含む。当業者は、これが8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79または80核酸塩基のアンチセンス化合物を含むと認識することができる。
一態様において、アンチセンス化合物は10〜50核酸塩基を含む。当業者は、これが10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49または50核酸塩基のアンチセンス化合物を具体的に表すと認識することができる。
ある態様において、アンチセンス化合物は13〜30核酸塩基を含む。当業者は、これが13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29または30核酸塩基のアンチセンス化合物を具体的に表すと認識することができる。
一態様において、アンチセンス化合物は15〜25核酸塩基を含む。当業者は、これが15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24または25核酸塩基のアンチセンス化合物を具体的に表すと認識することができる。
一態様において、アンチセンス化合物は19〜23核酸塩基を含む。当業者は、これが19, 20, 21, 22または23核酸塩基のアンチセンス化合物を具体的に表すと認識することができる。
一態様において、アンチセンス化合物は23核酸塩基を含む。
一態様において、アンチセンス化合物は22核酸塩基を含む。
一態様において、アンチセンス化合物は21核酸塩基を含む。
一態様において、アンチセンス化合物は20核酸塩基を含む。
一態様において、アンチセンス化合物は19核酸塩基を含む。
例示のアンチセンス化合物中から選ばれた、少なくとも8個の連続した核酸塩基の領域を包含する、長さ8〜80核酸塩基のアンチセンス化合物、またはその長さのうちのいずれかの長さのものが、適切なアンチセンス化合物と見なされる。
本明細書において提供される化合物は、例示のアンチセンス化合物の1つの5’末端由来の少なくとも8個の連続した核酸塩基を包含する、オリゴヌクレオチド配列を含む（残りの核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズできるアンチセンス化合物の5’末端のすぐ上流から始まり、そしてそのオリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を包含するまで続く、同じオリゴヌクレオチドの連続した領域である）。別の化合物は、例示のアンチセンス化合物のうちの1つの3’末端由来の少なくとも8個の連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列によって表される（残りの核酸塩基は、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズできるアンチセンス化合物の3’末端のすぐ下流から始まり、そしてそのオリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を包含するまで続く、同じヌクレオチドの連続した領域である）。また、化合物は、例示の化合物の配列の内部部分由来の少なくとも8個の連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列によって表されてもよく、そしてその化合物は、オリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を含有するまで一方向または両方向に伸長されてもよい、と理解される。
本明細書において説明されるアンチセンス化合物を知得した当業者は、過度の実験をせずに、さらなるアンチセンス化合物を特定可能であろう。
有効標的断片
活性オリゴマー化合物がハイブリダイズする対象となる標的核酸上の部位は、以下、本明細書において、“有効標的断片”と呼ばれる。本明細書において使用される場合、“有効標的断片”という用語は、活性オリゴマー化合物が標的化されている標的領域の、少なくとも8核酸塩基部分（すなわち8個の連続した核酸塩基）として定義される。理論に制約されることを望むものではないが、現在、これらの標的断片は、ハイブリダイゼーションのために利用できる標的核酸の一部を表すと考えられている。
標的断片には、有効標的断片の5’末端由来の少なくとも8核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列が含まれていてよい（残りの核酸塩基は、標的断片の5’末端のすぐ上流から始まり、そしてそのDNAまたはRNAが約8〜約80核酸塩基を包含するまで続く、同じDNAまたはRNAの連続した領域である）。同じように、有効標的断片は、有効標的断片の3’末端由来の少なくとも8個の連続した核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列によって表される（残りの核酸塩基は、標的断片の3’末端のすぐ下流から始まり、そしてそのDNAまたはRNAが約8〜約80核酸塩基を包含するまで続く、同じDNAまたはRNAの連続した領域である）。また、有効オリゴマー標的断片は、有効標的断片の配列の内部部分由来の少なくとも8個連続した核酸塩基を含むDNAまたはRNAによって表されてよく、そしてオリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を包含するまで一方向または両方向に伸長されてもよい、と理解される。
本明細書において特定される有効標的断片は、IL-4Rアルファの発現を調節するさらなる化合物のスクリーニングにおいて利用可能である。“調節因子”は、IL-4Rアルファの発現を調節し、そして有効標的断片に相補的な少なくとも8核酸塩基部分（すなわち8個の連続した核酸塩基）を含有する化合物である。スクリーニング法は、IL-4Rアルファをコードする核酸分子の有効標的断片を、1またはそれ以上の候補調節因子と接触させ、そしてIL-4Rアルファをコードする核酸分子の発現を攪乱する1またはそれ以上の候補調節因子について選択する工程を含む。一度、1またはそれ以上の候補調節因子がIL-4Rアルファをコードする核酸の発現を調節できることが示されると、次いでその調節因子は、IL-4Rアルファの機能のさらなる調査研究に使用可能であり、または研究用、診断用、または治療用薬剤として使用可能である。IL-4Rアルファの調節因子化合物はまた、1またはそれ以上の表現型アッセイを使用して特定またはさらなる調査も可能であり、特定の病状または状態の治療における有効性を予測する測定可能なエンドポイントをそれぞれが有する。表現型アッセイ、キット、およびそれに用いる試薬は、当業者においてよく知られている。
ハイブリダイゼーション
“ハイブリダイゼーション”とは、オリゴマー化合物の相補鎖の対合を意味する。特定の機構に制限されるものではないが、最も一般的な対合の機構には、オリゴマー化合物の鎖の相補的な複数のヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間の水素結合が関与しており、この水素結合はワトソン-クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合であってよい。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対合する相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、様々な環境下で生じ得る。
オリゴマー化合物は、特異的な結合が望まれる条件において、すなわちin vivoアッセイ若しくは治療上の処置の場合における生理学的条件下、およびin vitroアッセイの場合における解析が実施される条件下で、非標的核酸配列に対するオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するために、十分な相補性の度合いがある場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”または“ストリンジェントな条件”とは、オリゴマー化合物が、最小数の他の配列へのハイブリダイズを除いて、その標的配列にハイブリダイズできる条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境においては相違してよく、そして、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする“ストリンジェントな条件”は、オリゴマー化合物の性質および組成、および調査されようとする解析によって決定される。
相補性
本明細書において使用される場合“相補性”とは、1または2本のオリゴマー化合物鎖上にある2つの核酸塩基間の、正確に対合する能力を意味する。例えば、アンチセンス化合物の特定の位置にある核酸塩基が、標的核酸の特定の位置にある核酸塩基と水素結合可能な場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の水素結合の位置は、相補的位置であるとみなされる。オリゴマー化合物、そしてさらにDNAまたはRNAは、各分子中の十分な数の相補的位置が、互いに水素結合できる核酸塩基によって占められている場合、互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、オリゴマー化合物と標的核酸の間で安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な数の核酸塩基にわたる正確な対合または相補性の程度を示すために使われる用語である。
当該技術分野において、オリゴマー化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、標的核酸の配列に対して100％相補的である必要はないことが理解されている。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在断片または隣接断片がハイブリダイゼーション事象に関与しないような（例えば、ループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造）、1またはそれ以上の断片とハイブリダイズすることができる。本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、少なくとも70%、または少なくとも75%、または少なくとも80%、または少なくとも85%、または少なくとも90%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%の、標的核酸配列に対する配列相補性を含む。例えば、アンチセンス化合物の20核酸塩基のうち18核酸塩基が標的核酸に対して相補的であり、それ故に特異的にハイブリダイズすることになるオリゴマー化合物は、90パーセントの相補性を示すことになる。この例において、残りの非相補的核酸塩基は、相補的核酸塩基によってクラスター化され、または分散させられてよく、そしてお互いに対して、または相補的核酸塩基に対して近接している必要はない。そのようなものとして、18核酸塩基の長さで、標的核酸に完全に相補的な２つの領域が隣接している４つの非相補的核酸塩基を有するオリゴマー化合物は、標的核酸に77.8%の全相補性を有すことになり、そして、それによって、本明細書において提供される化合物の範疇に入ることになる。オリゴマー化合物の標的核酸の領域に対するパーセント相補性は、当該技術分野において知られている、BLASTプログラム（basic local alignment search tools）およびPowerBLASTプログラムを使用して、ごく普通に決定することができる（Altschul et al., J. MoI. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）。パーセントホモロジー、配列同一性、または相補性は、例えば、スミスとウォーターマンのアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を使用するギャッププログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix（登録商標） , Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI）によって、初期設定を使用して、決定することができる。
同一性
アンチセンス化合物、またはその一部は、SEQ ID NOまたは特定のIsis番号を持つ化合物に対する規定されたパーセント同一性を持つことができる。本明細書において使用される場合、ある配列が本明細書において開示される配列と同一であるのは、それが同じ核酸塩基対合能力を持つ場合である。例えば、開示された配列において、チミジンの代わりにウラシルを含むRNAは、それらがともにアデニンと対合するので、同一であると見なされることになる。この同一性は、オリゴマー化合物の全長にわたっていてもよく、またはアンチセンス化合物の一部であってもよい（すなわち、27塩基長のうちの核酸塩基1〜20を20塩基長と比較して、SEQ ID NOに対するオリゴマー化合物のパーセント同一性を決定することができる）。アンチセンス化合物は、本明細書において記載のアンチセンス化合物と同様に機能するために本明細書において記載の配列と、同一の配列を有する必要はないと、当業者において理解されている。本明細書において説明される、アンチセンス化合物の短縮型、または本明細書において説明される、アンチセンス化合物の非同一型もまた、意図される。非同一型は、それぞれの塩基が、本明細書において開示されるアンチセンス化合物と同じような対合活性を持たない非同一型である。塩基は、より短いために、または少なくとも1つの脱塩基部位を持つために、同じ対合活性を持たない。あるいは、非同一型には、異なる対合活性を持つ別の塩基に置換された、少なくとも1つの塩基が含まれていてもよい（例えば、GはC、A、またはTによって置き換えられてもよい）。パーセント同一性は、SEQ ID NOまたは比較されるアンチセンス化合物に対応する同一の塩基対合を持つ塩基の数に従って、計算される。非同一性塩基は、お互いに隣接していてもよく、オリゴヌクレオチド全体に散在していてもよく、またはその両方であってよい。
例えば、20塩基長のうちの核酸塩基2〜17と同じ配列を持つ16塩基長は、20塩基長に対して80%同一である。あるいは、該20塩基長に対して同一でない4つの核酸塩基を含むある20塩基長もまた、該20塩基長に対して80%同一である。18塩基長のうちの核酸塩基1〜14と同じ配列を持つ14塩基長は、18塩基長に対して78%同一である。そのような計算は、十分に当業者の能力内にある。
パーセント同一性は、修飾された配列の一部に存在する、オリジナル配列中の核酸塩基の％に基づく。したがって、20核酸塩基の活性標的断片の相補体の全配列を含む30核酸塩基のアンチセンス化合物は、20核酸塩基の活性標的断片の相補体と100%の同一性の部分を持つことになり、同時にさらに、追加の10核酸塩基部分を含む。活性標的断片の相補体は、単一の部分を構成することができる。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、例示のアンチセンス化合物のうち一つの少なくとも一部、または本明細書中にある活性標的断片の相補体の少なくとも一部に対して、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または100%同一である。
アンチセンス化合物の長さを増減させること、および／または活性を失うことなしにミスマッチの塩基を導入することが可能であると、当業者により周知である。例えば、Woolfらにおいて（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992, 参考文献として本明細書において援用される）、長さで13〜25核酸塩基の一連のASOは、標的RNAの切断を誘導する能力について、試験された。ASOの末端近辺に8または11のミスマッチ塩基を伴う、長さで25核酸塩基のASOは、ミスマッチを含まないASOと比べてより少ない程度ではあるが、標的mRNAの特異的切断を導くことができた。同様に、標的特異的切断は、1または3つのミスマッチを伴うASO を含む13核酸塩基のASOを使用して達成された。MaherとDolnick（Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988, 参考文献として本明細書において援用される）は、一連の直列14核酸塩基のASO、および2つまたは3つの前記直列ASOの配列を含むそれぞれ28および42核酸塩基のASOのそれぞれを、ウサギ網状赤血球アッセイにおけるヒトDHFRの翻訳を停止するそれら能力について試験した。3つの14核酸塩基のASOそれぞれ単独は、28または42核酸塩基のASOよりはより控えめな程度ではあったが、翻訳を阻害することができた。アンチセンス化合物は、それらが所望の活性を維持するならば、長さおよび標的に対するパーセント相補性について異なってもよいことが理解される。所望の活性を測定するための方法は、本明細書において開示され、そして当業者においてよく知られている。
化学的修飾
当該技術分野において知られているように、ヌクレオシドは塩基-糖組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常複素環式塩基である（ときにより、“核酸塩基”または単に“塩基”と呼ばれる）。そのような複素環式塩基の二つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基がさらに含まれるヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに対して、リン酸基を、糖の2’、3’、5’水酸基部分に結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖高分子化合物を形成する。オリゴヌクレオチドの中で、リン酸基は一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するといわれる。RNAおよびDNAの通常の結合または骨格は、3’から5’へのホスホジエステル結合である。その活性を変化させるために、オリゴヌクレオチド中に化学的修飾が含まれることがしばしば望まれる。化学的修飾は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的RNAに対する親和性を強めること、ヌクレアーゼ耐性を強めること、および／またはオリゴヌクレオチドの薬物動態を変化させることによって、オリゴヌクレオチド活性を変化させることができる。オリゴヌクレオチドのその標的に対する親和性を強める化学性質の使用は、より短いオリゴヌクレオチド化合物の使用を可能にする。
本明細書において使用される場合“核酸塩基”または“複素環式塩基部分”という用語は、ヌクレオシドの複素環式塩基部分をいう。一般に、核酸塩基は、別の核酸塩基に水素結合可能な、1またはそれ以上の原子または原子群を含む、いずれかの群である。例えばプリン核酸塩基のアデニン（A）およびグアニン（G）、並びにピリミジン核酸塩基のチミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）などの、“修飾されていない”または“天然の”核酸塩基に加えて、当業者に知られている多くの修飾された核酸塩基または核酸塩基模倣体が、本明細書において記載された化合物に受容できる。修飾核酸塩基および核酸塩基模倣体という用語は、重複し得るが、一般に、修飾核酸塩基とは、例えば7-デアザプリン、5-メチルシトシン、またはG-クランプなどの、構造の点で親の核酸塩基に対してかなり似通っている核酸塩基のことをいい、一方で、核酸塩基模倣体は、例えばトリサイクリックフェノキサジン核酸塩基模倣体などの、より複雑な構造を含むことになる。上述の修飾核酸塩基の調製のための方法は、当業者においてよく知られている。
本明細書において提供されるアンチセンス化合物はまた、修飾糖部分を有する1またはそれ以上のヌクレオシドを含んでいてもよい。ヌクレオシドのフラノシル糖環は、置換基の付加、二環式核酸（BNA）の形成のための2つのノンジェミナル環原子の架橋、および、例えば-S-、-N(R)-、または-C(R1)(R2)などの原子または基による4’位の環酸素（ring oxygen）の置換を含む（ただし必ずしもこれらには限定されない）、多くの方法で修飾されてもよい。修飾糖部分はよく知られており、そしてそれらを使用して、その標的に対するアンチセンス化合物の親和性を、典型的には強く、変化させることができ、および／またはヌクレアーゼ耐性を強めることができる。好ましい修飾糖部分の代表的リストには、LNAおよびENA（4’-(CH2)2-O-2’架橋）を含む、二環式修飾糖（BNA）；および、置換糖、特に2'-F、2'-OCH2または2'-O(CH2)2-OCH3置換基を有する置換糖（ただし必ずしもこれらには限定されない）が含まれるｒ。また糖は、特に糖類似体と置き換えることもできる。修飾糖の調製のための方法は、当業者においてよく知られている。
本明細書において記載される化合物には、ヌクレオシドまたはそうでなければ修飾されたモノマー単位を一緒に結合し、それによってアンチセンス化合物を形成する、ヌクレオシド間結合基が含まれてもよい。ヌクレオシド間結合基の主要な2つのクラスは、リン原子の存在または不在によって定義される。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合には、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、およびホスホロチオエートが含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。代表的な非リン酸含有ヌクレオシド間結合基には、メチレンメチルイミノ（-CH2-N(CH3)-O-CH2-）、チオジエステル（-O-C(O)-S-）、チオノカルバメート（-O-C(O)(NH)-S-）；シロキサン（-O-Si(H)2-O-）；およびN,N'-ジメチルヒドラジン（-CH2- N(CH3)-N(CH3)-）が含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。非リン酸ヌクレオシド間結合基を持つアンチセンス化合物は、オリゴヌクレオシドと呼ばれる。天然のリン酸ジエステル結合と比較して、修飾ヌクレオシド間結合を使用することで、アンチセンス化合物のヌクレアーゼ耐性を、典型的には強く、変化させることができる。キラル原子を持つヌクレオシド間結合は、ラセミ、キラル、またはその混合として調製され得る。代表的なキラルヌクレオシド間結合には、アルキルホスホネートおよびホスホロチオエートが含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。リン酸含有および非リン酸含有結合の調製の方法は、当業者においてよく知られている。
本明細書において使用される場合、“模倣体”とは、糖、核酸塩基、および／またはヌクレオシド間結合と置換される基のことをいう。一般に、模倣体は、糖または糖-ヌクレオシド間結合組み合わせの代わりに使用され、そして核酸塩基は、選択された標的にハイブリダイゼーションするために維持される。糖模倣体の代表的な例には、シクロヘキセニルまたはモルホリノが含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。糖-ヌクレオシド間結合組み合わせの模倣体の代表的な例には、ペプチド核酸（PNA）および無電荷アキラル結合により結合されたモルホリノ基結合が含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。場合によって、模倣体は核酸塩基の代わりに使用される。代表的な核酸模倣体は、当該技術分野においてよく知られており、そして、それにはトリサイクリックフェノキサジンアナログおよびユニバーサル塩基（Berger et al., Nuc Acid Res. 2000, 28:2911-14, 参考文献として本明細書において援用される）が含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。糖、ヌクレオシドおよび核酸塩基模倣体の合成の方法は、当業者においてよく知られている。
本明細書において使用される場合、“ヌクレオシド”という用語には、ヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、および模倣体塩基および／または糖の基を持つヌクレオシドが含まれる。
本明細書において使用される場合、“オリゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）のオリゴマーまたは重合体であるオリゴマー化合物をいう。この用語には、天然に存在する核酸塩基および非天然に生じる核酸塩基、糖、および共有ヌクレオシド間結合を含有するヌクレオチドが含まれ、さらに非核酸複合体が含まれていてもよい。
本開示は、例えばホスホジエステルおよびホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むヌクレオシド間結合を形成するために有用な、反応性リン基を持つ化合物を提供する。前駆体またはアンチセンス化合物の調製および／または精製の方法は、本明細書において提供される化合物または方法を限定するものではない。本明細書において提供されるDNA、RNA、およびアンチセンス化合物の合成および精製のための方法は、当業者においてよく知られている。
本明細書において使用される場合、“キメラアンチセンス化合物”という用語は、同じオリゴマー化合物中の他の糖、核酸塩基およびヌクレオシド間結合と比べて、異なる修飾をされた糖、核酸塩基および／またはヌクレオシド間結合を少なくとも一つ持つ、アンチセンス化合物をいう。残りの糖、核酸塩基およびヌクレオシド間結合は、独立して修飾されてもよくまたは修飾されなくてもよい。一般に、キメラオリゴマー化合物は、特定のモチーフを規定し得る領域内で、独立した位置にあり得るかまたはグループ化され得る、修飾ヌクレオシドを持つことができる。修飾および／または模倣体基のいずれの組み合わせも、キメラオリゴマー化合物を含むことができる。
キメラオリゴマー化合物は典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および／もしくは標的核酸への結合親和性の増加を与えるための、少なくとも一つの修飾された領域が含まれる。オリゴマー化合物の追加的領域は、RNA：DNAまたはRNA：RNAハイブリッドの切断を可能にする酵素の基質として働くことができる。一例として、RNaseHは、RNA：DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。RNaseHの活性化は、したがって、RNA標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現の阻害効率を強く促進する。結果的に、例えば同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比べて、キメラを使った場合、より短いオリゴマー化合物によって同程度の結果を得ることができる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動によってごく普通に検出することができ、もし必要であれば、当該技術分野において知られている関連した核酸ハイブリダイゼーション技術によって検出することができる。
本明細書において使用される場合、“完全修飾モチーフ”いう用語は、基本的にそれぞれのヌクレオシドが一様な修飾を有する糖修飾ヌクレオシドであるような、連続したヌクレオシドの配列を含むアンチセンス化合物をいう。
本明細書において記載の化合物は、1またはそれ以上の不斉中心を持ち、よってエナンチオマー、ジアステレオマー、および完全な立体化学の言葉で言えば、(R)若しくは(S)として、α若しくはβとして、または例えばアミノ酸などで(D)若しくは(L)として定義され得るその他の立体異性配置を生じさせる。本開示は、そのような全ての可能性のある異性体、並びにそのラセミ体および光学的に純粋な形が含まれることを意味する。
一形態において、アンチセンス化合物は、1またはそれ以上の複合体基の共有結合によって修飾される。複合体基は、可逆的または非可逆的結合によって結合されてよい。結合基は、アンチセンス化合物に直接またはリンカーを使用して結合されてよい。リンカーは単官能基（monofunctional）または二官能基（bifunctional）のリンカーであってよい。そのような結合の方法およびリンカーは当業者においてよく知られている。一般に、複合体基は、1またはそれ以上の特性を修飾するためにアンチセンス化合物に結合される。そのような検討材料は、当業者においてよく知られている。
オリゴマー合成
修飾および非修飾ヌクレオシドのオリゴマー化は、DNAについての文献手順（Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press）および／またはRNAについての文献手順（Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713）に従って、ごく普通に実施可能である。
アンチセンス化合物は、よく知られた固相合成の手法を通して、便利にそしてごく普通に作られ得る。そのような合成のための設備は、例えばApplied Biosystems（Foster City, CA）を含むいくつかのベンダーによって売られている。当該技術分野において知られている、そのような合成のためのその他の方法が、追加的にまたは代替的に使用できる。例えばホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために同様の手法を使用することがよく知られている。本開示は、アンチセンス化合物合成の方法によっては限定されない。
オリゴマー精製および解析
オリゴヌクレオチド精製および解析の方法は、当業者においてよく知られている。解析法には、キャピラリー電気泳動（CE）およびエレクトロスプレー質量分析が含まれる。そのような合成法および解析法は、マルチウェルプレート中で実施され得る。本明細書において記載の方法は、オリゴマー精製の方法によっては限定されない。
塩、プロドラッグおよび生物学的同等物
本明細書において記載のアンチセンス化合物は、薬剤的に許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、または、ヒトを含む動物に対して投与する際に、（直接的または間接的に）生物学的に活性な代謝産物またはその残留物を提供可能な、その他の機能的、化学的に同等なもののいずれかを含む。したがって、例えば、本開示はまた、アンチセンス化合物のプロドラッグおよび薬剤的に許容な塩、そのようなプロドラッグの薬剤的に許容される塩、およびその他の生物学的同等物まで導かれる。
“プロドラッグ”という用語は、非活性または低活性型で調製され、内在性の酵素、化学物質、または環境の作用によって、体内またはその細胞中で活性型（すなわち薬）に変換される、治療薬を表す。特に、プロドラッグ型のオリゴヌクレオチドは、SATE（(S-アセチル-2-チオエチル) ホスフェート）誘導体として、WO 93/24510またはWO 94/26764において開示される方法に従って調製される。プロドラッグにはまた、一方または両方の末端が、活性化合物を作るために（例えば、末端にホスホジエステル骨格結合を取り込むことによって）切断された核酸塩基を含む、アンチセンス化合物が含まれてもよい。
“薬剤的に許容される塩”という用語は、化合物の生理学的および薬剤的に許容される塩を意味する：すなわち、もとの化合物の所望の生物学的活性を保持し、そしてそこに望まれていない中毒性の影響を与えない、塩を意味する。アンチセンス化合物のナトリウム塩は、有用であり、そしてヒトに対する治療上の投薬のために十分に許容される。別の態様において、dsRNA化合物のナトリウム塩もまた、提供される。
製剤
本明細書において記載のアンチセンス化合物はまた、混合され、被包され、包合され、またそうでなければ、他の分子、分子構造物、または化合物の混合物に付随させることができる。
本開示にはまた、本明細書において記載のアンチセンス化合物を含む、医薬組成物および製剤が含まれる。医薬組成物は、局所的治療かまたは全身的治療が望まれているかどうか、および治療される場所に依存して、様々な方法で投与され得る。一態様において、投与は、呼吸器の表面、特に肺に対して局所的であり、例えば、粉末またはエアロゾルの噴霧、吸引、または吹送により、口および／または鼻（気管内、鼻腔内、上皮性または経皮性）による。経口または非経口を含む、投与のその他の経路が可能である。非経口投与には、静脈、動脈、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；並びに脳内、例えば、くも膜下腔内または脳室内投与が含まれる。投与部位は、当業者において知られている。一態様において、製剤は、抗炎症性合成副腎皮質ステロイドであり、しばしば喘息の治療のために使用される、ブデソニドを含む。一形態において、ブデソニドを含む製剤は、吸引によって送達される。
単位投与剤形中に都合よく与えられる治療用製剤は、従来の製薬産業においてよく知られた手法に従って調製され得る。そのような手法には、活性有効成分を、（1またはそれ以上の）薬剤担体または（1またはそれ以上の）賦形剤に、結びつける工程が含まれる。一般に、製剤は、活性有効成分を、液状担体、微粉化した固体担体、またはその両方と均一におよび緊密に結びつけられ、そして次いで、必要であれば、製品を形成する（例えば、送達のための特定の粒子サイズにする）ことによって調製される。好ましい態様において、治療用製剤は、例えば水または通常の塩類溶液などの適切な溶剤中で、場合によっては無菌製剤中で、経肺投与のために担体またはその他の薬剤とともに調製され、吸引器、経鼻送達装置、噴霧器、および経肺送達のためのその他の装置を使用して送達するための、所望の直径の液滴を形成させる。。あるいは、治療用薬剤は、乾燥粉末吸引器において使用するための、乾燥粉末として製剤化されてもよい。
“薬剤担体”または“賦形剤”は、薬剤的に許容される溶剤、懸濁剤、または1またはそれ以上の核酸を動物に送達するための薬理学的に不活性ないずれかその他のビヒクルであってよく、それらは当該技術分野において知られている。賦形剤は、液体でも固体でもよく、そして、核酸および所定の治療用組成物のその他の構成物と組み合わされる場合、考慮した投与の計画された方法によって選択され、それにより所望の容積、堅さなどを提供する。
組み合わせ
本明細書において提供される組成物は、2またはそれ以上のアンチセンス化合物を含むことができる。別の関係する態様において、組成物は、第一の核酸を標的化した1またはそれ以上の、特にオリゴヌクレオチドである、アンチセンス化合物、および、第二の核酸標的を標的化した1またはそれ以上の追加のアンチセンス化合物を含むことができる。あるいは、本明細書において提供される組成物は、同じ核酸標的の異なる領域を標的化した2またはそれ以上のアンチセンス化合物を含むことができる。2またはそれ以上の組み合わされた化合物は、一緒にまたは経時的に使用され得る。組成物はまた、他の非アンチセンス化合物の治療用薬剤（例えばブデソニドなどの副腎皮質ステロイド）と組み合わされ得る。
限定的ではない開示および参照としての援用
本明細書において提供される、特定の化合物、組成物および方法は、ある態様に従って特異性を持って述べられてきたが、以下の実施例は、本明細書において記載の化合物を説明するためだけに役立つものであり、そして同様のものを限定することを意図しない。本出願において記載されるそれぞれの参考文献、GenBank受入番号などは、その全内容が参照として本明細書において援用される。
実施例１
オリゴマー化合物の標的核酸の発現に対する効果が、以下の細胞型について試験された。
A549:
ヒト肺ガン培養細胞株A549は、the American Type Culture Collection（Manassas, VA）から入手された。A549細胞は、10%ウシ胎児血清、1 mlあたり100ユニットのペニシリン、および1 mlあたり100μgのストレプトマイシン（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を添加したDMEM高グルコース（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）中において、ごく普通に培養された。細胞は、それらが約90%のコンフルエントに達した場合、トリプシン処理および希釈によってごく普通に継代された。細胞は、オリゴマー化合物トランスフェクション実験において使用するために、約5000細胞／ウェルの密度で、96-ウェルプレート（Falcon-Primaria #3872）の中にまかれた。
b.END:
マウス脳内皮細胞株b.ENDは、the Max ^ Plank Institute（Bad Nauheim, Germany）のDr. Werner Risauから入手した。b.END細胞は、10%ウシ胎児血清（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を添加したDMEM高グルコース（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）中において、ごく普通に培養された。細胞は、それらが約90%のコンフルエントに達した場合、トリプシン処理および希釈によってごく普通に継代された。細胞は、オリゴマー化合物トランスフェクション実験において使用するために、約3000細胞／ウェルの密度で、96-ウェルプレート（Falcon-Primaria #353872, BD Biosciences, Bedford, MA）の中にまかれた。
細胞が適切なコンフルエントに達したとき、細胞を、記載したようにLipofectinTMを使用してオリゴヌクレオチドにより処理した。細胞が65〜75%のコンフルエントに達したとき、細胞をオリゴヌクレオチドにより処理した。オリゴヌクレオチドは、Opti-MEMTM-1血清低減培地（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）中で、LIPOFECTINTM（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）と混合され、所望のオリゴヌクレオチド濃度および100 Nmオリゴヌクレオチドあたり2.5〜3μg/MlのLIPOFECTINTM濃度に達した。このトランスフェクション混合物を、室温で約0.5時間培養した。96-ウェルプレート中で増殖させた細胞のために、ウェルを100μlのOPTI-MEMTM-1で一回洗浄し、そして次いで130μlのトランスフェクション混合物で処理した。24-ウェルプレートまたは標準組織培養プレート中で増殖させた細胞を、適切な容量の培養液およびオリゴヌクレオチドを使用して、同じように処理した。細胞を処理し、そしてデータを2回または3回の繰り返しで取得する。37℃にて約4〜7時間の処理の後、トランスフェクション混合物を含む培養液を、新しい培養液に置き換えた。細胞を、オリゴヌクレオチド処理の16〜24時間後に回収した。
本出願において開示される方法とともに使用することができる、多数のその他の商業的に入手可能なトランスフェクション試薬が、利用可能である。これらの試薬には、製品の取扱説明書に提供されている方法を使用することによる、CytofectinTM（Gene Therapy Systems, San Diego, CA）、 LipofectamineTM（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）、OligofectamineTM（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）、およびFuGENETM（Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN）が含まれる（ただし必ずしもこれらには限定されない）。オリゴヌクレオチドはまた、当業者においてよく知られた方法を使用して、エレクトロポレーションによって送達することができる。
対照オリゴヌクレオチドを使用して、特定の培養細胞株について最適なオリゴマー化合物の濃度を決定する。さらに、オリゴマー化合物スクリーニング実験または表現型アッセイにおいてオリゴマー化合物を試験する場合、対照オリゴヌクレオチドは、平行して試験される。使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに異なる。
実施例２
IL-4RアルファmRNAレベルのリアルタイム定量PCR解析
IL-4RアルファmRNAレベルの定量は、ABI PRISMTM 7600, 7700,または7900 Sequence Detection System（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）を製品の取扱説明書に従って使用する、リアルタイム定量PCRによって達成された。
定量的PCR解析の前に、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブのセットが、GAPDH増幅反応に関して“多重（multiplexed）”である能力を評価された。単離の後、RNAは、続けて行われる逆転写酵素（RT）反応およびリアルタイムPCRに供され、その両方は同じウェル中で実施される。RT試薬およびPCR試薬は、Invitrogen Life Technologies（Carlsbad, CA）から入手した。RT、リアルタイムPCRは、20μlのPCRカクテル（MgCl2非含有2.5×PCRバッファー、6.6 mMのMgCl2、375μMずつのdATP、dTTP、dCTPおよびdGTP、375 nMずつのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、125 nMのプローブ、4ユニットのRNase阻害剤、1.25ユニットのPLATINUM（商標登録）Taq、5ユニットのMuLV逆転写酵素、および2.5×ROX色素）を、30μlの全RNA溶液（20〜200 ng）の入った96-ウェルプレートに加えることで同じように実行された。RT反応は、48℃で30分のインキュベーションにより実行された。PLATINUM（商標登録）Taqを活性化するための95℃で10分間インキュベーションした後、40サイクルの二段階PCR手順が実行された：95℃で15秒（変性）、その後60℃で1.5分（アニーリング／伸長）。
RT、リアルタイムPCRによって得られる遺伝子標的の量は、その発現が一定であるGADPHの発現レベルを使用して、または、RiboGreenTM（Molecular Probes, Inc. Eugene, OR）を使用した全RNAの定量によって、標準化された。GAPDH発現は、標的と同時にすなわち多重に、または別々に実行されることで、RT、リアルタイムPCRによって、定量された。全RNAは、RiboGreenTMRNA定量試薬（Molecular Probes, Inc. Eugene, OR）によって定量された。
170μlのRiboGreenTM作用試薬（1：350で 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5に溶解されたRiboGreenTM試薬）は、30μlの精製細胞性RNAの入った96-ウェルプレート中へ、ピペットで加えられた。プレートは、CytoFluor 4000（PE Applied Biosystems）で、485 nmの励起光と530 nmの放射光によって読まれた。
リアルタイムPCRで使用するためのプローブおよびプライマーを、標的特異的配列に対してハイブリダイズするように設計した。プライマーおよびプローブ、並びにそれらがハイブリダイズする標的核酸の配列は、表２に示される。標的特異的PCRプローブは、5’末端に共有結合したFAMおよび3’末端に共有結合したTAMRAまたはMGBを持っており、この場合FAMは蛍光色素であり、TAMRAまたはMGBはクエンチャー色素である。
Figure 2009510174
実施例３
オリゴマー化合物によるヒトIL-4Rアルファのアンチセンス阻害
一連のオリゴマー化合物を、表1に引用の公開された配列を使用して、ヒトIL-4RアルファRNAの異なる領域を標的化するように設計した。全ての化合物は、長さで20核酸塩基のキメラオリゴヌクレオチド（“ギャップマー（gapmers）”）であり、両側（5’および3’）に5個のヌクレオチド“ウィング”を隣接する10個の2’デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される。ウィングは、2'-MOEヌクレオチドとしても知られる、2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたり、ホスホロチオエートである。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。化合物は、その遺伝子標的mRNAレベルに対する効果を、本明細書における他の実施例に記載の定量的リアルタイムPCRによって、表２において示した標的特異的プライマーおよびプローブを使用して、解析された。データは、A549細胞をLipofectinTMを使用して85 nMの化合物で処理した、二つの実験の平均である。
SEQ ID NO: 2を標的化する化合物の標的部位（アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合する標的配列の、最も5’側）のヌクレオチドには、ヌクレオチド8231, 20215, 27651, 47104および49717が含まれる。SEQ ID NO: 3を標的化する化合物の標的部位には、ヌクレオチド21, 167, 173, 176, 193, 194, 196, 197, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 217, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 234, 246, 284, 287, 317, 353, 355, 428, 429, 430, 431, 487, 494, 496, 497, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 506, 508, 509, 510, 530, 531, 619, 620, 621, 642, 645, 647, 649, 735, 736, 737, 741, 777, 917, 931, 936, 998, 999, 1000, 1001, 1003, 1004, 1005, 1006, 1053, 1077, 1078, 1079, 1080, 1082, 1083, 1085, 1087, 1088, 1090, 1092, 1093, 1094, 1095, 1096, 1098, 1100, 1160, 1175, 1182, 1184, 1221, 1223, 1224, 1227, 1395, 1397, 1398, 1399, 1400, 1401, 1492, 1499, 1506, 1507, 1508, 1509, 1608, 1670, 1671, 1673, 1674, 1676, 1700, 1701, 1703, 1705, 1706, 1708, 1716, 1777, 1779, 1780, 1781, 1782, 1845, 1976, 1997, 2000, 2038, 2043, 2056, 2057, 2058, 2058, 2059, 2060, 2062, 2064, 2065, 2066, 2067, 2067, 2068, 2082, 2087, 2126, 2128, 2130, 2131, 2230, 2301, 2315, 2390, 2403, 2469, 2524, 2526, 2528, 2529, 2530, 2531, 2532, 2541, 2548, 2569, 2578, 2579, 2626, 2643, 2674, 2731, 2743, 2751, 2763, 2772, 2836, 2856, 2861, 2909, 2915, 2952, 3048, 3053, 3103, 3168, 3198, 3238, 3290, 3297, 3303, 3420, 3432, 3477, 3572および3578が含まれる。
次のSEQ ID NO: 3のヌクレオチド断片を標的化するオリゴヌクレオチドは、ヒトIL-4Rαの発現を少なくとも約19％阻害する点で有効であった：ヌクレオチド167-265; 284-306; 317- 336; 353-374; 428-450; 487-525; 530-550; 619-640; 642-668; 735-760; 777-796; 917-955; 998-1025; 1053-1072; 1077-1119; 1160-1203; 1221-1246; 1395-1420; 1492-1528; 1608-1627; 1670-1695; 1700- 1735; 1777-1801; 1845-1864; 1976-1995; 1997-2019; 2038-2106; 2056-2087; 2126-2150; 2230-2249; 2301-2334; 2390-2422; 2469-2488; 2524-2567; 2569-2598; 2626-2662; 2674-2693; 2731-2791; 2856- 2880; 2909-2934; 2952-2971; 3048-3072; 3103-3122; 3168-3187; 3198-3217; 3297-3322; 3420-3451;および3477-3496。次のSEQ ID NO: 2のヌクレオチドを標的化するオリゴヌクレオチドは、ヒトIL-4Rαの発現を少なくとも約35％阻害する点で有効であった：ヌクレオチド8231-8250; 20215-20234; 27651-27670;および47104-47123。
実施例４
オリゴマー化合物によるマウスIL-4Rアルファのアンチセンス阻害
一連のオリゴマー化合物を、SEQ ID No: 5を使用して、マウスIL-4RアルファRNAの異なる領域を標的化するように設計した。全ての化合物は、長さで20核酸塩基のキメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー）であり、両側（5’および3’）に5個のヌクレオチド“ウィング”を隣接する10個の2’-デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される。ウィングは、2'-MOEヌクレオチドとしても知られる、2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたり、ホスホロチオエートである。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。化合物は、その遺伝子標的mRNAレベルに対する効果を、本明細書における他の実施例に記載の定量的リアルタイムPCRによって、表２において示した標的特異的プライマーおよびプローブを使用して、解析された。データは、b.END細胞をLipofectinTMを使用して150 nMの化合物で処理した、二つの実験の平均である。
次のSEQ ID NO: 5のヌクレオチド断片を標的化した全てのオリゴヌクレオチドは、IL-4Rαの発現を少なくとも40%阻害する点で有効であった：ヌクレオチド2506-2525および2804-2323。次のSEQ ID NO: 9のヌクレオチド断片を標的化した全てのオリゴヌクレオチドは、IL-4Rαの発現を少なくとも40%阻害するのに有効であった：ヌクレオチド78-97; 233-263; 330-349; 388-407; 443-462; 611-630; 716-740; 758-777; 918-937; 1014-1033; 1114-1133; 1136-1155; 1385-1314; 1424-1459; 1505-1534; 1575-1594; 1834-1863; 1880-1899; 1991-2030; 2979-2103; 2166-2185; 2437-2461; 2469- 2488; 2497-2526; 2719-2738; 2788-2817; 2827-2846; 2859-2888; 3345-3374;および3671-3697。
実施例５
IL-4Rアルファを標的化する二重鎖オリゴマー化合物の設計およびスクリーニング
本開示に従って、dsRNAおよびその模倣体を含み、オリゴマー化合物およびその相補体を含有する、一連の二重鎖は、IL-4Rアルファを標的化するように設計可能である。二重鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、本明細書において開示されているように、少なくともIL-4Rアルファを標的化するオリゴヌクレオチドの一部を含む。鎖の末端を、1またはそれ以上の天然または修飾核酸塩基に付加して、突出を形成することによって修飾することができる。核酸二重鎖のセンス鎖は、次いで、アンチセンス鎖の相補体として設計および合成され、そしてどちらかの末端に修飾または付加を含んでいてもよい。二重鎖のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、約17〜25ヌクレオチドを含み、または約19〜23ヌクレオチドを含む。あるいは、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、20，21または22ヌクレオチドを含む。
例えば、一態様において、dsRNA二重鎖の両鎖は、中央部核酸塩基に対して相補的であり、そのそれぞれが一方または両方の末端に突出を持つ。
例えば、配列CGAGAGGCGGACGGGACCG（SEQ ED NO: 20）を有し、そしてデオキシチミジン（dT）の2核酸塩基の突出を有するアンチセンス鎖を含む二重鎖は、以下の構造を持つことになる。
Figure 2009510174
突出は、2〜6核酸塩基の範囲であってもよく、そしてこれらの核酸塩基は、標的核酸に対して相補的であっても、または相補的でなくてもよい。別の態様において、二重鎖は、ただ一方の末端において突出を持つことができる。
別の態様において、例えばCGAGAGGCGGACGGGACCG（SEQ ED NO: 20）という、同じ配列を持つアンチセンス鎖を含む二重鎖は、以下のように平滑末端（一本鎖の突出を持たない）で調製され得る。
Figure 2009510174
RNA二重鎖は、単分子または二分子であり得る；すなわち、二本の鎖は、単一の分子の一部分であり得るし、また別々の分子であってもよい。
二重鎖のRNA鎖は、当業者にとってごく普通の方法によって合成することができ、またはDharmacon Research Inc.（Lafayette, CO）から購入することもできる。いったん合成されると、相補鎖がアニールされる。一本鎖は、等分され、50μMの濃度に希釈される。いったん希釈されると、30μlのそれぞれの鎖は、アニーリングバッファーの5×溶液15μlと、混ぜ合わされる。前記バッファーの最終濃度は、100 mM酢酸カリウム、30 mM HEPES-KOH pH 7.4、および2 mM酢酸マグネシウムである。最終容量は75μlである。この溶液は、90℃で1分間インキュベートされ、そして次いで15秒間遠心される。チューブは37℃で1時間置いておかれ、この時にdsRNA二重鎖が実験において使用される。dsRNA二重鎖の最終濃度は20μMである。
いったん調製されると、二重鎖化合物は、それがIL-4Rアルファを調節する能力について評価される。細胞が80%のコンフルエントに達した場合、それらの細胞は二重鎖化合物で処理される。96-ウェルプレート中で増殖した細胞の場合、200μlのOPTI-MEM-1TM血清低減培地（Gibco BRL）で一度洗われ、そして次いで12μg／mLのLIPOFECTINTM（Gibco BRL）および最終濃度200 nMの所望の二重鎖アンチセンス化合物（100 nMの二重鎖アンチセンス化合物あたり、6μg／mLのLIPOFECTINTMの割合）を含む、130μlのOPTI-MEM-1TMで処理される。5時間の処理後、培地は新鮮な培地に置き換えられる。細胞は、処理の16時間後に回収され、その時にRNAが単離され、そしてRT-PCRによって標的の減少が測定される。
実施例６
アレルギー性炎症のマウスモデル
実施例４に記載のin vitroスクリーニングに基づいて、マウスIL-4Rアルファ（ISIS 231894; CCGCTGTTCTCAGGTGACAT; SEQ ID NO: 24）を標的化するリードアンチセンスオリゴヌクレオチド（lead antisense oligonucleotide）が、in vivoマウスモデル系において試験されるために選ばれた。ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドと比較して、ISIS 231894は、マウスb.END細胞の処理後24時間において、用量依存的なマウスIL-4RアルファmRNAの減少を引き起こした（表３）。
Figure 2009510174
アレルギー性炎症のマウスモデルにおいて、マウスは、エアロゾル化されたニワトリオボアルブミン（OVA）に対して感作され、そしてそれに曝露される。気道の反応性は、気道閉塞の誘導によって、非侵襲性の方法を使用して評価され、それにより、無拘束の覚醒OVA感作マウスを、プレチスモグラフ（Buxco Electronics, Inc. Troy, NY）の主室の中に置き、そしてエアロゾル化されたメタコリンに曝露する。この主室と参照室の間の圧力差を使用して、毎分呼吸量、すなわち呼吸頻度及び肺気流抵抗（enhanced pause）（Penh）を外挿する。Penhは、マウスの呼吸サイクル中の全肺気流（すなわち、上気道および下気道における気流の合計）の関数の無次元パラメータであり、そしてそれは、気流が増大すると減少する。このパラメータは、人工呼吸される動物を使用する伝統的な侵襲性の手法（Hamelmann et al., 1997, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156:766-775）によって測定される場合に肺抵抗と密接に相関する。
ヒトの喘息における疾患およびアレルギー性炎症のマウスモデルに共通するいくつかの重要な特性には、肺炎症、杯細胞過形成および気道過敏症（AHR）が含まれる。肺炎症は、TH2特性のサイトカイン発現プロフィールによって特徴づけられるが、一方、杯細胞過形成はそのマウスにおける粘液生成の増加の指標であり、そしてAHRは、例えばアセチルコリンまたはメタコリンなどの、コリン作動性受容体アゴニストに対する感受性の増加に関与する。本明細書において提供される組成物および方法を使用して、ヒトを含む動物におけるAHRおよび肺炎症を治療することができる。ヒトIL-4Rアルファに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、1またはそれ以上の従来の喘息の薬物療法との併用が、意図されている。
アレルギー性炎症のマウスモデルを使用して、マウスIL-4Rアルファを標的化する吸引アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を試験した。ミスマッチのIL-4Rアルファオリゴヌクレオチド（ミスマッチ対照オリゴヌクレオチド）を、ネガティブ対照として使用した。8〜10週齢のオスBalb/cマウス（Charles River Laboratory, Taconic Farms, NY）は、特異的病原体フリー（SPF）の設備内に収容されたマイクロアイソレーターのケージ内で維持された。動物コロニーの中のセンチネルケージ（sentinel cage）は、ウイルス抗体に対して陰性であるか、および知られているマウス病原体が存在するかを調査した。
オボアルブミン誘導性アレルギー性炎症−急性モデル
アレルギー性炎症の急性モデルのために、マウスは、0日目および14日目に20μgのミョウバン沈殿OVAを腹腔に注入されて、感作された。24、25および26日目に、動物は超音波噴霧によって1% OVA（生理食塩水中）に20分間曝露された。17、19、21、24および26日目に、動物はビヒクルのみ（生理食塩水）、1μg／ kgまたは10μg／ kgのISIS 231894またはミスマッチ対照オリゴヌクレオチドを投与された。オリゴヌクレオチドまたはビヒクルは、0.9%塩化ナトリウムに懸濁され、鼻部エアロゾル送達曝露系（nose-only aerosol delivery exposure system）を使用して吸引を経由して送達された。毎分10リットルの全流量へ毎分1.4リットルの流量が流れ込むように設定されたラブレース噴霧器（Lovelace nebulizer）を使用して、オリゴヌクレオチドを送達した。曝露室は、マウスがその室に付属した拘束チューブにセットされる前に5分間オリゴヌクレオチドエアロゾル溶液で平衡化された。拘束されたマウスは、全部で10分間処理を受けた。解析は、28日目に実施された。その結果は表４に示す。
Figure 2009510174
ISIS 231894は、全身プレチスモグラフィーおよびPenhパラメータを通して測定されるように、感作マウスにおいて、顕著な用量依存的なメタコリン誘導性AHRの抑制を引き起こしたが、ミスマッチ対照ヌクレオチドは引き起こさなかった。ISIS 231894による肺機能における顕著な改善もまた、肺抵抗および肺コンプライアンスを測定した場合に観察されたが、ミスマッチ対照ヌクレオチドでは観察されなかった。
ISIS 231894による処理はまた、致死量のケタミンの注入後の処理されたマウスの肺から集められた、気管支肺胞洗浄（BAL）液において起こる細胞分化（cell differentials）によって測定されるように、結果として好酸球浸潤の顕著な減少がみられたが、ミスマッチ対照ヌクレオチドではみられなかった。コラゲナーゼ消化された肺から回収された、樹状細胞、好酸球、マクロファージおよび上皮細胞を、フローサイトメトリーによってIL-4Rアルファタンパク質の発現について解析した。IL-4Rアルファタンパク質のオリゴヌクレオチド特異的な顕著な減少は、樹状細胞および上皮細胞、並びにISIS 231894で処理されたマウスからの好酸球およびマクロファージ混合集団において見られた。マウスが10μg／ kgのISIS 231894を投与された第二の実験は、急性モデルにおいてAHRおよび好酸球増加症を軽減させるISIS 231894 の有効性を確認した。
ISIS 231894の最低肺組織濃度は、10 ng/g未満（1〜10μg／ kgと推定される吸引用量）と決定された。その他のin vivo研究は、1 mg／ kgまでの肺内エアロゾル用量は、マウスにおいて良好な耐容性を示し、そしてISIS 231894の肺における半減期は、2〜4日と推定された。さらに、毎週一回の投与がIL-4Rアルファのアンチセンス効果を維持し、そして十分に確立されたアレルゲン誘導性の肺炎症を有するマウスにおけるAHRおよび気道炎症を軽減した。
これらのデータは、IL-4Rアルファが、喘息および慢性閉塞性肺疾患（COPD）を含むAHRおよび肺炎症に関係する疾患の、予防、改善および／または治療のための妥当な標的であることを示す。
アレルギー性炎症のマウスモデル−再誘発モデル
アレルギー性炎症の再誘発モデルには、急性モデルの感作および誘発工程に加えて、66および67日目における２回目の一連の噴霧OVA誘発が含まれる。このモデルは、イニシエータ分子としての役割とは反対に、リコール応答における標的の役割の評価を可能にする。再誘発モデルにおいて、マウスは、OVA誘発性急性炎症応答の発症および回復に続いて、52、54、56、59および61日目に、鼻部吸引によって送達された10、100または500μg／ kgのISIS 231894またはミスマッチ対照オリゴヌクレオチドのいずれかで処理された。研究の終点は、急性モデルにおける場合と同様であり、そしてPenh応答（すなわちAHRの軽減）、BALにおける炎症細胞およびサイトカイン（ELISAによって測定される）、粘液貯留（肺における過ヨウ素酸-シッフ塩基[PAS]染色によって測定される）、肺組織診断および肺上皮細胞と炎症細胞におけるIL-4Rアルファタンパク質の減少（フローサイトメトリーによって測定される）、が含まれた。その結果は、下記表５および表６に示される。
Figure 2009510174
メタコリン誘導性AHR（Penh）における顕著な軽減が、ビヒクル対照で処理した動物と比較して、ISIS 231894の三つの用量全ておよび高用量ミスマッチ対照群に対する応答において観察された。加えて、BAL液中の好酸球の％は、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドによる処理と比較して、顕著に減少していた。
Figure 2009510174
ISIS 231894による処理はまた、肺好酸球マクロファージおよび樹状細胞上のIL-4Rアルファ細胞表面発現の量（フローサイトメトリーによって測定される）を減少させたが、ミスマッチ対照は減少させなかった。
加えて、肺IL-5 mRNAは、ISIS 231894の10μgおよび100μg投与で、阻害された。ISIS 231894による処理はまた、ビヒクル対照と比較して、100μgおよび500μgのオリゴヌクレオチドの投与量において、BAL液中の、炎症指標KC（IL-8、MCP-1、並びにTH2サイトカインIL-5およびIL-13のマウスホモログ）を含む、多くの試験されたサイトカインの発現を減少させた。合わせて、これらのデータは、IL-4Rアルファ標的化アンチセンスヌクレオチドによるアプローチが、マウスにおける免疫学的リコール炎症応答の設定において、効果的であることを示す。
アレルギー性炎症のマウスモデル−慢性モデル
アレルギー性炎症の慢性モデルにおいて、マウスは鼻腔内OVA投与を繰り返され、慢性炎症応答を生じる。このモデルにおいて、マウスは、先行のモデルにおける場合と同様、0日目および14日目に100μgのOVAを腹腔に注入されることによって、感作された。OVAは14、27、28、29、47、61、73、74および75日目に500μgの用量で投与された。オリゴヌクレオチド、すなわちISIS 231894またはミスマッチ対照のいずれか、が、31、38、45、52、59、66および73日目に、5μg／ kgまたは500μg／ kgのいずれかの用量で、鼻部エアロゾル送達曝露系を経由して、投与された。抗炎症剤であるデキサメタゾンが、47、62、73、74および75日目に、2.5 mg／ kgが腹腔内注入によって投与された。終点の解析は、62日目に評価されたサイトカインを除いて、76日目に、OVA誘発後6時間目に実施された。終点は、急性および再誘発モデルにおける場合と同様であり、Penh（AHR）、BAL炎症細胞集積およびサイトカインと粘液の貯留が含まれた。その結果は、以下に記され、そして表７に示される。
Figure 2009510174
ISIS 231894のそれぞれの用量またはデキサメタゾンによるマウスの処理は、ビヒクル（すなわち生理食塩水）による処理と比較して、メタコリン誘導性AHR（Penh）の顕著な軽減をもたらした。加えて、500μg／ kgのISIS 231894またはデキサメタゾンによるマウスの処理は、ビヒクル対照と比較して、BAL液中の好酸球の％における顕著な減少をもたらした。デキサメタゾンがBAL好中球を減少させなかった一方で、ISIS 231894の両方の用量は、BAL中の%好中球を顕著に減少させた。BAL液の解析もまた、ビヒクル処理動物に比べて、500μg／ kgのISIS 231894およびデキサメタゾン処理動物中の、IL-5およびKCの顕著な減少を明らかにした。これらのデータは、治療上の投与スケジュールを使用する喘息のマウスモデルにおける、吸引IL-4Rアルファアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を示す。
実施例７
アレルギー性炎症マウスモデルにおける吸引ブデソニドおよびIL-4Rアルファアンチセンスオリゴヌクレオチド
ブデソニドは、アレルギー性鼻炎、喘息および気管支炎を含む呼吸器系疾患の治療のために使用される、吸引副腎皮質ステロイドである。ブデソニドは、主に、肺炎症の抑制および気道過敏症の軽減によって作用する。アレルギー性炎症の急性マウスモデルを使用して、吸引IL-4Rアルファアンチセンスオリゴヌクレオチドの同時投与が、吸引ブデソニドの活性を強化し得るかどうか、または抗炎症活性を生じるために必要とされる用量を削減し得るかどうか、を決定した。実施例６において記載のように、マウスは、0日目および14日目にミョウバン沈殿OVAによって感作され、そして24、25および26日目に生理食塩水中OVAを噴霧された。全てのマウスは、28日目に解析された。ブデソニド（20% DMSOを含むPBS中に0.3、3、30および300μg／ kg溶解される）は、23日目に開始し（OVA曝露前24および20時間）、そして次いで26日目まで毎日、一日一回のOVA曝露の1時間前に、鼻部エアロゾル曝露によって投与された。30μg／ kg用量はまた、別の群として、23〜26日目まで一日二回（ビッド（bid））投与された。実施例６のように、ISIS 231894は、17，19、21、23および26日目に鼻部エアロゾル曝露によって投与された。終点は、実施例６において記載されている条件と同じであった。AHRおよびBAL好酸球浸潤に対するブデソニド単独の処理結果は、以下の表８に示される。
Figure 2009510174
30および300μg／ kgのブデソニドの用量は、ビヒクル単独の投与と比較して、Penh、BAL好酸球集積および粘液貯留における顕著な改善を誘導した。これは、30μg／ kgが最小有効量であることを示唆する。
IL-4Rアルファアンチセンスオリゴヌクレオチドの同時投与が、ブデソニドの活性を強化するかどうか、そして最小有効量を削減するかどうかを決定するために、マウスは、3または30μg／ kgのブデソニドにより、1μg／ kgのISIS 231894を伴って、または伴わずに、処理された。AHR、BAL好酸球浸潤および粘液貯留に対する、ブデソニドおよび／またはISIS 231894処理の効果（PAS陽性気道の数）が、決定された。その結果は表９において示される。
Figure 2009510174
1μg／ kgのISIS 231894が3または30μg／ kgのブデソニドと同時投与された場合、生理食塩水（ビヒクル）またはブデソニド若しくはIL-4Rアルファアンチセンスいずれかの処理のみと比較して、Penhにおいて顕著な変化が観察された。これは、IL-4Rアルファアンチセンスの同時投与が、マウス肺炎症モデルにおけるブデソニドの活性を改善し得ることを示す。3μg／ kgのブデソニドの併用における同様の活性は、吸引IL-4Rアルファアンチセンスの同時投与もまた、ブデソニドの有効用量を削減することを示す。加えて、30μg／ kgのブデソニドの、1μg／ kgのISIS 231894との併用による処理は、30μg／ kgのブデソニドまたはISIS 231894いずれか単独よりも、BAL好酸球％および粘液貯留の減少において顕著により効果的であった。これらのデータは、二つの化合物が粘液生産およびBAL好酸球に対して相加効果を生じたこと、およびPenhに関して相乗的に作用し得ることを示す。
実施例８
アレルギー性鼻炎マウスモデルにおけるブデソニドおよびISIS 231894の鼻腔内投与
アレルギー性鼻炎のマウスモデルにおいて、動物は、1、5、10および15日目にミョウバン沈殿OVAによって、腹腔内で感作された。生理食塩水で希釈されたOVAは、18〜22、25〜29および32〜35日目に、毎日鼻腔内に（それぞれの鼻腔中に25μl の500μg OVA）投与された。ISIS 231894およびブデソニドは、それぞれの鼻腔内OVA感作の1時間前にブデソニドを投与することにより、鼻腔内に投与された。ISIS 231894は、11、13、15日目に、そしてそれぞれの鼻腔内OVA感作の一時間前に投与された。終点は、36日目に評価され、そして鼻腔粘液貯留（鼻腔病理）、鼻腔好酸球、好中球（上皮組織における鼻腔洗浄解析および顕微鏡での好酸球計数によって）およびアレルギー症状（固定された期間にわたって観察される、くしゃみおよび鼻擦り（nose-rub）の回数）を含んだ。その結果は表1０および11において示される。
Figure 2009510174
Figure 2009510174
結果は、このモデルにおいて、ISIS 231894またはブデソニド単独の鼻腔内投与およびそれらの併用療法における鼻腔内投与が、鼻腔好酸球、好中球およびアレルギー症状（くしゃみおよび鼻擦り）を軽減することを示す。
実施例９
ヒトIL-4Rアルファアンチセンスオリゴヌクレオチド
ヒトIL-4Rアルファを積極的に阻害した（実施例３を参照）化合物のさらなる評価のために、追加研究を、4つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASOs）：ASO1、ASO2、ASO3（TGGAAAGGCTTATACCCCTC; SEQ ID NO: 25）およびASO4に特に焦点を合わせて、ヒトA549上皮細胞株および初代小気道上皮細胞（primary small airway epithelial cells）において行った。IL-4RアルファmRNAに対するA549細胞のオリゴヌクレオチド処理の結果は、表１２に示される。
Figure 2009510174
両方の細胞型において、ASO処理の24時間後の計測で、100 nM、50 nMおよび25 nMの濃度におけるASO1〜ASO4はそれぞれ、全細胞性mRNAに顕著な影響を与えることなく、標的（IL-4Rアルファ）mRNAおよびタンパク質（フローサイトメトリーによって計測される）の用量依存的減少をもたらした。さらに、初代細胞において、4つの化合物全てが、サイトカイン誘導性MUC2 mRNAの減少をもたらした（表1３）。これは、化合物がヒトIL-4Rアルファ活性の阻害を誘導することを示す。
Figure 2009510174
これらの発見に基づいて、ASO3が、マウスにおけるin vivo耐用性に関する試験のために選ばれた。対照動物と比較して、鼻部エアロゾル投与（1、10および100 mg/kg、3回/週）または全身性（腹腔内）注入（10、60、100 mg/kg、2回/週）を経由してASO3を3週の間にわたって受容したマウスは、ベースラインPenhの増加および肺における好中球またはリンパ球の増加のどちらも示さなかった。処理動物はまた、本明細書の前出実施例に記載の組織学的検査によって測定されるように、血清化学マーカーまたは肺の形態における変化がないことを示した。しかし、用量相関性のマクロファージ浸潤が、エアロゾル投与後の肺において観察された。これらのデータは、ヒトIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、IL-4RアルファmRNAおよびタンパク質、並びにヒト肺上皮細胞におけるIL-4Rアルファ生物活性を顕著に減少させること、そしてIL-4Rアルファアンチセンスオリゴヌクレオチドの吸引が、マウスにおいて十分な耐用性を示すこと、を示す。

Claims (34)

  1. 炎症性呼吸器系疾患の予防、改善または治療のための方法であって、
    （i）炎症性呼吸器系疾患と診断された患者を選択し、そして
    （ii）前記患者に対して副腎皮質ステロイドおよびIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する
    ことを含む、前記方法。
  2. 炎症性呼吸器系疾患の予防、改善または治療の療法を必要としている患者における炎症性呼吸器系疾患の予防、改善または治療のための方法であって、
    （i）副腎皮質ステロイドによる治療を受けている患者を選択し、そして
    （ii）前記患者に対してIL-4Rアルファを標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する
    ことを含む、前記方法。
  3. 炎症性呼吸器系疾患と診断された患者における副腎皮質ステロイドの最小有効量を削減するための方法であって、
    （i）副腎皮質ステロイド剤による治療を受けている患者を選択し、そして
    （ii）前記患者に対して副腎皮質ステロイドおよびIL-4アルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する
    ことを含む、前記方法。
  4. 患者における、炎症性呼吸器系疾患に付随する1またはそれ以上の症状を改善するための方法であって、
    （i）副腎皮質ステロイド治療によって、疾患が的確には調節されていない患者を選択し、そして
    （ii）前記患者に対して副腎皮質ステロイドおよびIL-4アルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する
    ことを含む、前記方法。
  5. 患者における、炎症性呼吸器系疾患の調節を改善するための方法であって、
    （i）副腎皮質ステロイド治療によって、疾患が的確には調節されていない患者を選択し、そして
    （ii）前記患者に対して副腎皮質ステロイドおよびIL-4アルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する
    ことを含む、前記方法。
  6. 炎症性呼吸器系疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患または気管支炎である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 疾患調節の改善が、症状の数の減少、症状の重症度の減少、症状の持続時間の減少、症状を伴う日数の減少、症状の再発の阻止、または必要な副腎皮質ステロイドの用量および頻度の減少によって計られる、請求項５に記載の方法。
  8. 症状が、気道過敏症、肺炎症、粘液貯留、好酸球浸潤、炎症性サイトカインの生産増加、咳、くしゃみ、喘鳴、息切れ、胸部絞扼感、胸痛、疲労、鼻水、後鼻漏、鼻づまり、喉頭炎、涙目、および頭痛から選択される、請求項４または７に記載の方法。
  9. 投与が、副腎皮質ステロイド剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを単一の製剤中で送達することを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 単一製剤の送達が吸引によるものである、請求項９に記載の方法。
  11. 投与が、副腎皮質ステロイドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを別々の製剤中で送達することを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  12. 別々の製剤が同時に送達される、請求項１１に記載の方法。
  13. 別々の製剤が、異なる時点で送達される、請求項１１に記載の方法。
  14. 一方または両方の製剤の送達が吸引によるものである、請求項１１〜１３に記載の方法。
  15. アンチセンスヌクレオチドが、長さ13〜30核酸塩基である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. アンチセンスヌクレオチドが、ヒトIL-4Rアルファ（SEQ ID NO: 3）のヌクレオチド2056-2087の、少なくとも8核酸塩基部分を標的化する、請求項１５に記載の方法。
  17. アンチセンスヌクレオチドが、ヒトIL-4Rアルファ（SEQ ID NO: 3）のヌクレオチド2060-2079の、少なくとも8核酸塩基部分を標的化する、請求項１５に記載の方法。
  18. アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 25を含む、請求項１５に記載の方法。
  19. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの配列がS EQ ID NO: 25からなる、請求項１５に記載の方法。
  20. 副腎皮脂質ステロイドがブデソニドである、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 副腎皮質ステロイド剤およびヒトIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
  22. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さ13〜30核酸塩基である、請求項２１に記載の組成物。
  23. アンチセンスヌクレオチドが、ヒトIL-4Rアルファ（SEQ ID NO: 3）のヌクレオチド20 56-2087の、少なくとも8核酸塩基部分を標的化する、請求項２１に記載の組成物。
  24. アンチセンスヌクレオチドが、ヒトIL-4Rアルファ（SEQ ID NO: 3）のヌクレオチド2060-2079の、少なくとも8核酸塩基部分を標的化する、請求項２１に記載の組成物。
  25. アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 25を含む、請求項２１に記載の組成物。
  26. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの配列がSEQ ID NO: 25からなる、請求項２１に記載の組成物。
  27. 副腎皮脂質ステロイドがブデソニドである、請求項２１〜２６のいずれかに記載の組成物。
  28. 炎症性呼吸器系疾患の予防、改善および／または治療のための医薬を調製するのための、副腎皮質ステロイドおよびIL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の使用。
  29. 副腎皮質ステロイドによって治療を受けている患者における、炎症性呼吸器系疾患の治療のための医薬を調製するのための、IL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
  30. 副腎皮質ステロイド治療によって疾患が的確は調節されていない患者における、炎症性呼吸器系疾患の治療のための医薬を調製するのための、IL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
  31. 炎症性呼吸器系疾患と診断された患者において、副腎皮質ステロイドの最小有効量を削減するための医薬を調製するのための、IL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
  32. 炎症性呼吸器系疾患の予防、改善、または治療のために必要な副腎皮質ステロイドの用量を削減するための医薬を調製するのための、IL-4Rアルファを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
  33. 副腎皮質ステロイドがブデソニドである、請求項２８〜３２のいずれかに記載の使用。
  34. 医薬が吸引によって送達されるために製剤化される、請求項２８〜３２のいずれかに記載の使用。
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