JP2009506336A - Fret測定法を用いて生物学的プロセスを解明する方法 - Google Patents
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Abstract
一対のFRETパートナーの第一のメンバーと結合した生体物質X及びFRETパートナー対の第二のメンバーと結合した第二の生体物質Y、FRETパートナー対の長寿命のエネルギー供与メンバー、並びに脂質膜の両側に位置する上記FRETパートナー対のメンバーを、脂質膜を含む測定媒体に組み込み;
前記エネルギー供与メンバーの励起波長で前記測定媒体を励起し;そして
前記媒体中で発光された前記FRETシグナル又は該シグナルにおける変動を測定する、
を含む。
適用:生物学的又は病理学的プロセスの解明及び新しい薬物のスクリーニングの目的のための、生体物質間の相互作用の検出。
Description
本発明は、生物学的又は病理学的プロセスの解明及び新しい薬物のスクリーニングを目的とした、細胞生物学の分野、より特別には場合によって潜在的なリガンドの存在下での生体物質(biological entities)間又はこれらの物質の異なる構成部分間の相互作用の研究に関する。
細胞表面上の膜タンパク質間の相互作用を検出するための時間分解FRETの技術は、Damien Maurelら(文献1を参照のこと)によって記載された。J.P. Pinら及びJianfeng Liuらは、時間分解FRETの技術によってGABAB受容体を研究した(文献2及び3を参照のこと)。
ドナーフルオロフォアとして寿命の長いフルオロフォアを用い、ドナー及びアクセプターフルオロフォアが生体物質に結合しており、そして該ドナー及びアクセプターフルオロフォアが脂質膜の両側に位置する、FRET測定法によって、細胞系中の生物学的プロセスの解明が可能であることが発見された。
一対のFRETパートナーの第一のメンバーと結合した生体物質X及びFRETパートナー対の第二のメンバーと結合した第二の生体物質Y、FRETパートナー対の長寿命のエネルギー供与メンバー、並びに脂質膜の両側に位置する上記FRETパートナー対のメンバーを、脂質膜を含む測定媒体に組み込み;
エネルギー供与メンバーの励起波長で測定媒体を励起し;そして
上記媒体中で発光されたFRETシグナル又は上記シグナルにおける変動を測定する、
を含む。
膜貫通型受容体のホモ二量体化又はヘテロ二量体化などの、2つの内因性タンパク質の二量体化現象;
膜タンパク質への又は膜タンパク質からのサイトソル内可溶性(cytosoluble)化合物の転位現象;
膜受容体に特異的なリガンドの検出及び薬物のスクリーニング;及び
リガンドの存在下での膜貫通型受容体の3次元構造の変化又はタンパク質複合体の構造の変化。
1)測定媒体
測定媒体は、脂質膜を含む生物学的媒体からなる。
生体物質X及びYは、内因性又は外因性の膜タンパク質、膜貫通型受容体などの膜貫通型タンパク質、サイトソル内可溶性化合物、その細胞への効果が試験に望ましい一群の化合物に属する有機又は生物学的化合物(これらを以下、「リガンド」という)、及び抗体から選ばれる。
FRETパートナー対は、ドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアを含み、上記フルオロフォアの1つは長い寿命、すなわち、100ナノ秒超、好ましくは100ナノ秒〜5000マイクロ秒、そして特別に好ましくは100〜3000マイクロ秒の寿命を有するフルオロフォアである。
先に示したように、FRETパートナー対のメンバーの生体物質X又はYとの結合は、1つ以上の共有結合によって直接的に、或いは以下のタイプ:タグ/抗−タグ抗体、抗原/抗体、アビジン又はストレプトアビジン/ビオチン、ハプテン/抗体の結合パートナーを介して間接的に行われる。
1)上記生体物質X又はYと蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現させることによって;
2)上記生体物質X又はYと(一般に自殺酵素と呼ばれる)不可逆的酵素活性を有するタンパク質との融合タンパク質を発現させ、これがフルオロフォアを上記生体物質X又はY上に移動させることによって;又は
3)インテインによるスプライシングによって、達成されることができる。
1)「リガンド/生体物質」又は「タグ/抗−タグ抗体」対を介して;
2)自然の生体物質X又はYを発現させることにより、この場合、蛍光化合物は該生体物質を特異的に認識する抗体と結合され;又は
3)タグを上記生体物質上へ移動させる自殺酵素と結合した生体物質を発現させることにより、達成されることができる。
測定されたFRETシグナルは、研究される生物学的現象と直接的に相関し:実際、ドナー蛍光化合物とアクセプター蛍光化合物間のエネルギー移動のレベルはこれらの化合物間の距離の6乗の逆数に比例する。当業者に一般的に使用されるドナー/アクセプター対のためには、(50%の移動効率に対応する)距離Roはナノメーターのオーダーであり、FRETを、生物学的相互作用の研究のための好ましいツールとしている。
使用される生体物質の性質に依存して、本発明の方法は、以下に詳細に説明するように異なる生物学的プロセスを検出することを可能とする。すべての場合において、これらのプロセスは、該プロセスに関与する2つの生体物質間の膜貫通型FRETを測定することによって研究される。
タンパク質の3次元構造が生物学的現象の間に変化しうることは知られており、1つの例は、リガンドのその受容体への結合である。それらのリガンドとの結合に応じた膜貫通型タンパク質の構造の変化は、GABA受容体又はグルタメート受容体(GluR)などの場合のように、非常に詳しく言及されることができる(Parmentier M.L., Prezeau L., Bockaert J., Pin J.P. (2002) A model for the functioning of family 3 GPCRs. Trends Pharmacol. Sci. 23(6): 268-74; Bissantz C. (2003) Conformational changes of G protein-coupled receptors during their activation by agonist binding. J. Recept. Signal Transduct. Res. 23 (2-3): 123-53)。
2つの生体物質X及びYが2つの膜貫通型タンパク質であり、脂質膜が細胞膜である場合、被験化合物の存在下又は不存在下でのFRETシグナルの変動は上記タンパク質間の相互作用の指標となるであろう。
生体物質Xがサイトソル内可溶性化合物であり、物質Yが内因性又は外因性の膜化合物である場合、FRETシグナルの変動は、該サイトソル内可溶性化合物から該膜タンパク質へ、又は該膜タンパク質から該サイトソル内可溶性化合物への転位現象の指標となるであろう。
脂質膜が細胞膜であり、生体物質Xが細胞膜上に位置する膜貫通型受容体であり、その細胞内部分がドナー/アクセプター蛍光化合物対のメンバーで標識され、生体物質Yが上記膜貫通型受容体の潜在的なリガンドであって、一連の被験化合物を形成し、そしてドナー/アクセプター蛍光化合物対の他のメンバーで標識される場合、FRETシグナルの変動は、上記リガンドの受容体への結合の指標となるであろう。このプロセスは、コンビナトリアルケミストリーから得られた一連の化合物のスクリーニングのために特に有利である。
図1に図式的に示される2つの構築物が使用された:
−構築物1:HA-GABAB R-1(「HA-GB1」)+FLAG-GABAB R-2(FLAG-GB2)
−構築物2:HA-GABAB R-1(「HA-GB1」)+FLAG-GABAB R-2 YEP(FLAG-GB2-YFP)
TR-FRETシグナルを、それぞれ50,000又は100,000細胞を含むウエル中で測定し、最終体積100μl中の実施例1に記載の分子構築物を含む細胞に以下の試薬を加える(図2):
1A:PRK6細胞+テルビウムクリプテートと結合した抗−FLAG抗体(以下、「抗−FLAG/テルビウムクリプテート」という)最終1nM+Alexa 647と結合した抗−HA抗体(以下、「抗−HA/A647」という)最終3nM;
1B:HA-GB1及びFLAG-GB2を発現するPRK6細胞+抗−FLAG/テルビウムクリプテート最終1nM;
1C:HA-GB1及びFLAG-GB2を発現するPRK6細胞+抗−FLAG/テルビウムクリプテート最終1nM+抗−HA/A647最終3nM;
2A:PRK6細胞+抗−FLAG/テルビウムクリプテート最終1nM+抗−HA/A647最終3nM;
2B:HA-GB1及びFLAG-GB2-YEPを発現するPRK6細胞+抗−FLAG/テルビウムクリプテート最終1nM;
2C:HA-GB1及びFLAG-GB2-YEPを発現するPRK6細胞+抗−FLAG/テルビウムクリプテート最終1nM+抗−HA/A647最終3nM。
実施例3に記載の1A、1B、2B、2A、1C及び2Cの条件下での細胞のインキュベーション後、ウエルから発せられた蛍光を、Analyst(Molecular Devices)、TRF Digitalモード、ディレイ時間50マイクロ秒、インテグレーション時間400マイクロ秒、励起波長330nm(フィルター330/80)、二色性BBUV、発光:テルビウムについては490nm及びA647については682nmで検出、で測定する。アクセプター化合物により発せられたシグナルは、測定シグナルの比を考慮して、ドナー化合物により発せられたシグナルによって較正する。
実施例3に記載の1A、1B、2B、2A、1C及び2Cの条件下での細胞のインキュベーション後、ウエルにより発せられた蛍光を、Analyst(Molecular Devices)、TRF Digitalモード、ディレイ時間50マイクロ秒、インテグレーション時間400マイクロ秒、励起波長330nm(フィルター330/80)、二色性BBUV、発光:テルビウムについては490nm及びYEPについては520nmで検出、で測定する。アクセプター化合物により発せられたシグナルは、測定シグナルの比を考慮して、ドナー化合物により発せられたシグナルにより較正する。
Claims (22)
- FRET測定法を用いて生物学的プロセスを解明する方法であって、以下のステップ:
一対のFRETパートナーの第一のメンバーと結合した生体物質X及び前記FRETパートナー対の第二のメンバーと結合した第二の生体物質Y、前記FRETパートナー対の長寿命のエネルギー供与メンバー、並びに脂質膜の両側に位置する上記FRETパートナー対のメンバーを、前記脂質膜を含む測定媒体に組み込み;
前記エネルギー供与メンバーの励起波長で前記測定媒体を励起し;そして
前記媒体中で発光された前記FRETシグナル又は該シグナルにおける変動を測定する、
を含むことを特徴とする、前記方法。 - 前記生体物質が、以下の:内因性又は外因性の膜タンパク質、膜貫通型タンパク質、サイトソル内可溶性化合物、被験リガンド及び抗体から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記脂質膜が、以下の:細胞膜、小胞体膜、ミトコンドリア二重膜、リソソーム膜、核膜、及びゴルジ体膜から選ばれる生体膜であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 化学的刺激、熱刺激、電気的刺激及び機械的刺激から選ばれる、前記測定媒体を刺激するステップを含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記刺激が被験化学化合物を前記測定媒体に加える化学的刺激であり、そして前記FRETシグナルがこの被験化合物の存在下及び不存在下で測定されることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記生物学的プロセスが、膜貫通型受容体のコンホメーションの変化であって、ここで、前記生体物質X及びYが、膜の両側においてドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物で標識された同一の膜貫通型受容体であり、さらにここで、前記被験化合物が前記膜貫通型受容体に結合可能な化合物であり、前記FRETシグナルの変動が前記被験化合物の存在下における前記受容体のコンホメーションの変更の指標であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記生体物質X及びYが膜貫通型タンパク質であり、前記生物学的プロセスがこれらの2つのタンパク質間の相互作用における変動であり、前記FRETシグナルにおける変動が前記タンパク質間の相互作用における変動の指標であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記膜貫通型タンパク質X及びYが同じタンパク質であり、それらの一方がドナー蛍光化合物で標識され、かつ他方がアクセプター蛍光化合物で標識され、該ドナー及びアクセプター蛍光化合物が前記膜の両側に位置しており、前記FRETシグナルにおける変動がホモ二量体化現象の指標であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記測定された相互作用が、GABAB受容体のホモ二量体化であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記測定された相互作用が、ヘテロ二量体化であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記膜貫通型タンパク質の二量体化に影響を及ぼすことのできる被験リガンドが前記測定媒体に加えられ、そして、前記FRETシグナルが前記被験リガンドの存在下及び不存在下で測定されることを特徴とする、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生体物質Xがサイトソル内可溶性化合物であり、かつ、前記生体物質Yが内因性又は外因性膜タンパク質であり、前記FRETシグナルにおける変動が前記サイトソル内可溶性化合物の前記膜タンパク質へ又は前記膜タンパク質からの転位現象の指標であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記サイトソル内可溶性化合物の前記膜タンパク質への又は前記膜タンパク質からの転位に影響を及ぼすことのできる被験化合物が前記測定媒体に加えられ、そして、前記FRETシグナルが前記被験化合物の存在下及び不存在下で測定されることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記膜タンパク質が膜貫通型受容体であり、かつ、前記サイトソル内可溶性化合物がアレスチン又はGタンパク質であることを特徴とする、請求項12又は13に記載の方法。
- 前記生体物質Xが細胞膜上に位置する膜貫通型受容体であり、その細胞内部分がドナー/アクセプター蛍光化合物対のメンバーで標識され、かつ、前記生体物質Yが前記膜貫通型受容体の潜在的なリガンドであって一連の被験化合物の一部を形成しており、前記ドナー/アクセプター蛍光化合物対の他のメンバーで標識され、かつ、前記化合物Yの存在下又は不存在下での前記FRETシグナルにおける変動がYの前記膜貫通型受容体への結合の指標であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記生体物質Xが細胞膜上に位置する膜貫通型受容体であり、その細胞内部分がドナー/アクセプター蛍光化合物対のメンバーで標識され、かつ、前記生体物質Yが前記膜貫通型受容体の知られたリガンドであって前記ドナー/アクセプター蛍光化合物対の他のメンバーで標識され、かつ、被験化合物が前記測定媒体に加えられ、前記被験化合物の存在下又は不存在下での前記FRETシグナルにおける変動が前記被験化合物の前記膜貫通型受容体Xへの結合の指標であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 長寿命を有する前記フルオロフォア化合物が100ナノ秒〜5000マイクロ秒、好ましくは100〜3000マイクロ秒の寿命を有することを特徴とする、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 長寿命を有する前記フルオロフォアが希土類キレート又は希土類クリプテートであり、好ましくは該希土類がユーロピウム及びテルビウムから選択されることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 長寿命を有する前記フルオロフォアがピリジン単位を含む希土類クリプテートであることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 長寿命を有する前記フルオロフォアがテルビウムクリプテート又はキレートであり、かつ、前記アクセプター蛍光化合物が蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 前記アクセプターフルオロフォアが、ローダミン、シアニン、スクアラン、BODIPY、フルオレセイン、AlexFluorファミリーの化合物、量子ドット、B-フィコエリスリン、R-フィコエリスリン、C-フィコシアニン及びアロフィコシアニンなどのフィコビリタンパク質、GFR及びその誘導体、YFP、CFP並びに蛍光サンゴタンパク質から選ばれることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生体物質X又はYと前記ドナー及びアクセプター蛍光化合物の結合が以下の:共有結合による結合;ビオチン/ストレプトアビジン系又は6HIS/抗−6HIS抗体、FLAG/抗−FLAG抗体、DNP/抗−DNP抗体、GST/抗−GST抗体、c-myc/抗−c-myc抗体及びHA/抗−HA抗体系から選ばれるタグ/抗−タグ抗体系;並びに標識される前記物質X又はYに特異的な抗体を介する結合から選ばれることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
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