JP2009504786A - リステリア属誘導型免疫漸増および活性化、ならびにその使用方法 - Google Patents

リステリア属誘導型免疫漸増および活性化、ならびにその使用方法 Download PDF

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マーティン エー． ギードリン，
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Abstract

癌性または感染状態の処置における使用のための弱毒化細菌を投与するための試薬および方法を提供する。さらに、腫瘍、癌細胞または感染性因子に対する免疫応答の誘導における使用のための弱毒化細菌を投与するための試薬および方法を提供する。また、診断方法およびキットを提供する。本発明の一実施形態により、哺乳動物の肝臓における癌性または非リステリア感染状態を有する哺乳動物の処置方法が提供され、該方法は、該哺乳動物に有効量の代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌を投与することを含み、ここで、該リステリア属菌が、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まず、該弱毒化リステリア属菌が該哺乳動物に反復投与で投与される。

Description

関連出願の引用
本出願は、米国特許第６０／７０９，６９９号（２００５年８月１９日出願）に対する優先権を主張し、この米国出願の内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
合衆国の支援を受けた研究および開発に関する宣言
本発明は、部分的に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＮＨＩ １ Ｋ２３ＣＡ１０４１６０−０１の下の米国政府支援によって行われた。米国政府は、本発明に対し一定の権利を有し得る。
発明の分野
本発明は、免疫漸増のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、腫瘍、腫瘍転移、前癌性障害および感染症を処置するための弱毒化リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）細菌を提供する。
発明の背景
肝臓癌は、世界中で、男性において５番目に最もよく見られる悪性腫瘍であり、女性では８番目に最もよく見られる悪性腫瘍である。この障害は、主に、肝臓に肝硬変を有する人に罹る。この場合、肝硬変は、例えば、肝炎またはアルコール中毒症により生じたものであり得る。肝臓癌のリスクファクターとしては、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、食事性アフラトキシンへの慢性曝露およびアルコール中毒症が挙げられる。肝炎は重要なリスクファクターであるという事実に鑑み、米国では、約１２０万人および３９０万人が、それぞれＢ型肝炎およびＣ型肝炎に慢性的に感染していることに注意されたい（例えば、非特許文献１；Ｂｏｓｃｈら（２００４）Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２７（５ Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ５−Ｓ１６；Ｌｌｏｖｅｔら（２００４）Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ．１０（２ Ｓｕｐｐｌ．ｌ）：Ｓ１１５−Ｓ１２０；ＧｕｙｔｏｎおよびＫｅｎｓｌｅｒ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．４：４６４−４７０；Ｋｅｎｓｌｅｒら（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．１１ Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ５８−Ｓ６４；ＳｃｈｉｆｆおよびＯｚｄｅｎ（２００３）Ａｌｃｏｈｏｌ Ｒｅｓ．Ｈｅａｌｔｈ ２７：２３２−２３９；Ｋｅｎｓｌｅｒら（２００４）Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２７（５ Ｓｕｐｐｌ．１）Ｓ３１０−Ｓ１８；Ｓｚａｂｏら（２００４）Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．１０：５−１１；Ｐｏｙｎａｒｄら（２００３）Ｌａｎｃｅｔ ３６２：２０９５−２１００；Ａｌｔｅｒ（１９９７）Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．１：５５９−６８、ＣＤＣ（２００４）ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐ．５２：１２５２−１２５４を参照）。
肝臓腫瘍は、原発性腫瘍によって、または転移によって生じ得る。肝臓は、腫瘍転移の一般的な部位である。肝臓の腫瘍は、肝臓の他の部分から（例えば、肝細胞、胆管上皮、内皮細胞、および胆道系から）、ならびに胃、結腸、下垂体、膵臓、肺、耳下腺、甲状腺、ブドウ膜黒色腫および小腸などの他の組織からの転移に由来するものであり得る（例えば、非特許文献２；Ｂｒｏｅｌｓｃｈら（２００４）Ｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．８４：４９５−５１１；Ｃｈｅｎら（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．４５：４９２−４９５；Ｋａｎｏｈら（２００４）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ３０８：１６８−１７４；Ｓｕｚｕｋｉら（２００２）Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．４９：１５３−１５８；Ｍａｔｔｈｅｗｓら（２０００）Ａｍ．Ｓｕｒｇ．６６：１１１６−１１２２；Ｃｅｒｖｏｎｅら（２０００）Ａｍ．Ｓｕｒｇ．６６：６１１−６１５；Ｏｂａｒａら（１９９８）Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．１５：２９２−２９４；Ｏｌｓｈａら（１９９５）Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １５：１６３−１６６；Ｍａｒｔｉｎら（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｓｕｒｇ．１９６：４０２−４０９；Ｓａｌｖａｔｏｒｉら（２００４）Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７：５２−５６；Ｆｅｌｄｍａｎら（２００４）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１１：２９０−２９７；Ｋｕｒｓａｒら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：６３８２−６３８７；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：３２５−３２７を参照）。
肝細胞癌は、原発性肝臓癌の最も一般的な形態である。他の肝臓癌としては、胚芽細胞腫（小児癌）、血管肉腫および類上皮血管内皮腫が挙げられる。関連の癌としては、胆管（胆管癌）および胆嚢の癌が挙げられる（例えば、非特許文献３；Ｃｕｒｌｅｙ（１９９８）Ｌｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ、Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、ＮＹを参照）。
肝臓癌は、通常、進行状態になるまで発見されず、発見された場合は、これらは化学療法に対して耐性である。部分肝切除術は、最も一般的な処置であるが、ほとんどの部分肝切除術患者は再発を経験する。肝臓移植もまた肝臓癌の有効な処置であるが、この場合、長期生存は、部分肝切除術とほぼ同じである。他の処置としては、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、腫瘍壊死因子、シスプラチンおよび放射線が挙げられる（例えば、非特許文献４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉｄｉｓら（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２８：８７５−８９０；ＹｏｇｉｔａおよびＴａｓｈｉｒｏ（２０００）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｉｎｖｅｓｔ．４７：９１−１００；Ｃａｒｒ（２００４）Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２７（５ Ｓｕｐｐｌ．１）Ｓ２１８−Ｓ２２４を参照）。
動物の実験的腫瘍を処置するために、グラム陽性菌であるリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を使用することに一部関心がもたれている。リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）は、腫瘍内注射によって投与されている（非特許文献５）。リステリア属菌は、熱殺菌された菌または生きている菌の両方ともが、実験的腫瘍細胞株との混合物として投与するか、または腫瘍内に直接注射すると、腫瘍細胞のその後の増殖をインビボで阻害した（例えば、非特許文献５；Ｙｏｕｄｉｍ（１９７６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：５７９−５８４；Ｙｏｕｄｉｍ（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３７：５７２−５７７；Ｆｕｌｔｏｎら（１９７９）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２５：７０８−７１６；Ｋｅｌｌｅｒら（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４４：５１２−３１７；Ｋｅｌｌｅｒら（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：６９５−６９８；Ｐａｃｅら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：９７７−９８１を参照）。関連の試験により、リステリア属菌を全身に播種した場合（またはリステリア属菌を投与した腫瘍細胞部位と異なる部位に投与した場合）、腫瘍増殖の阻害はないことが示された（非特許文献６）。また、ウシ型結核菌のＢＣＧも免疫応答を刺激するために使用されているが、この細菌は増殖が異常に遅く、遺伝子操作または形質導入による改変に抵抗性である。
リステリア菌は、肝臓および脾臓に対して天然の親和性を有し、小腸などの他の組織に対してある程度の親和性を有する（例えば、非特許文献７；Ｇｏｕｉｎら（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：３５−４５；Ｃｏｓｓａｒｔ（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９１：４０１−４０９；Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｂｏｌａｎｄら（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１４：５８４−６４０；Ｓｃｈｌｕｔｅｒら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．２０１：１８８−１９５を参照）。該細菌が腸に存在する場合、血流への通過はリステリア菌タンパク質、例えば、ａｃｔＡおよびインターナリンＡなどによって媒介される（例えば、非特許文献８；Ｌｅｃｕｉｔら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：６１５２−６１５７；ＬｅｃｕｉｔおよびＣｏｓｓａｒｔ（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８：５３７−５４２を参照）。いったん該細菌が宿主細胞に侵入すると、リステリア菌の生活環は、ファゴリソソームからの、および細胞質ゾルへの逸出を伴う。この生活環は、ファゴリソソーム内部に留まるマイコバクテリウムのものと対照的である（例えば、非特許文献９；Ｓｃｈｌｕｔｅｒら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６６：５９３０−５９３８；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚら（２００４）Ｃｅｌｌ １１９：７５３−７６６を参照）。ファゴリソソームからのリステリア菌の逸出は、リステリア菌タンパク質、例えば、リステリオリシン（ＬＬＯ）、ＰＩ−ＰＬＣおよびＰＣ−ＰＬＣによって媒介される（Ｐｏｒｔｎｏｙら（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５８：４０９−４１４を参照）。
代謝的に活性なリステリア菌および熱殺菌されたリステリア菌はともに、免疫応答の研究に使用されているが、これらの２つの調製物は、同じ様式で免疫系を刺激しないことに注目されたい。代謝的に活性なリステリア属菌と熱殺菌されたリステリア属菌との間の相違に関して、本発明をなんらかの機構に限定することなく、または本発明をなんらかの機構から除外することなく、熱殺菌されたリステリア属菌は、免疫応答もたらし得るが、その場合、保護は長期持続性でないこと；熱殺菌されたリステリア属菌はＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導し得るが、このＣＤ８＋ Ｔ細胞は機能的に損なわれること；代謝において遮断されたリステリア属菌は、一般的に、交差提示によって免疫応答を刺激し得るが、ＭＨＣクラスＩ エピトープ交差提示ではないこと；リステリオリシン（ＬＬＯ）を発現できないリステリア属菌（例えば、熱殺菌されたリステリア属菌）は、細胞質に侵入できず、例えば、ＩＬ−１２、ＭＣＰ−１、ＣＤ４０およびＣＤ８０を効率的に誘導できないことに注目されたい（例えば、非特許文献１０；Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｂｏｌａｎｄら（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．１４：５８４−６４０；Ｂｒｚｏｚａら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２６４１−２６５１；Ｓｅｒｂｉｎａら（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９：８９１−９０１；Ｊａｎｄａら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：５６４４−５６５１；Ｋｕｒｓａｒら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：３１６７−３１７２；Ｂｒｕｎｔら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３５４０−３５４６；Ｌａｕｖａｕら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：１７３５−１７３９を参照）。
癌、腫瘍、転移、前癌性障害、異形成および感染症の処置のための方法は、多くの場合、有効ではない。本発明は、肝臓および他の組織における腫瘍および感染症に対する免疫漸増における使用のため（例えば、転移性肝臓癌の処置のため）に、弱毒化リステリア属菌を提供することによりこの需要を満たす。
ＭｕｌｈａｌｌおよびＹｏｕｎｏｓｓｉ（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３９（１ Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ２３−Ｓ３７ Ｃｈｅｎら（２０００）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３３：９１−９８ ＤｅＶｉｔａら（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｂｉｌｉａｒｙ Ｔｒｅｅ，「Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」第６版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｅｎｓ，Ｐｈｉｌａ．ＰＡ，ｐｐ．１１６２−１２０３ ＲｕａｎおよびＷａｒｒｅｎ（２００４）Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１３：５０５−５１６ Ｂａｓｔら（１９７５）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５４：７５７−７６１ Ｙｏｕｄｉｍら（１９７４）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５２：１９３−１９８ Ｄｕｓｓｕｒｇｅｔら（２００４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：５８７−６１０ Ｍａｎｏｈａｒら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：３５４２−３５４９ Ｃｌｅｍｅｎｓら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７０：５８００−５８０７ Ｅｍｏｔｏら（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５：５００３−５００９
発明の概要
本発明は、腫瘍に対する免疫応答を刺激する非リステリア抗原をコードする核酸を含むように操作されていない弱毒化リステリア菌を、肝臓腫瘍を有する哺乳動物に投与することにより、生存の増進がもたらされるという認識に、一部基づくものである。本発明は、哺乳動物において癌性または感染状態を処置するため、および先天的免疫応答および／または適応的（すなわち、後天的）免疫応答を誘導するためのさまざまなリステリア属菌、組成物および方法を提供する。
一部のある態様において、本発明は、哺乳動物に有効量の弱毒化リステリア属菌を投与することを含む、癌性または非リステリア感染状態を有する哺乳動物を処置するための方法を提供する。一部のある実施形態において、このリステリア属菌は、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸（例えば、腫瘍抗原または感染状態を引き起こす感染性因子由来の抗原）を含まない。一部のある実施形態において、このリステリア属菌は哺乳動物に、該哺乳動物における癌性または感染状態に対して別途生じさせたワクチン誘導型免疫応答の非存在下で投与される。一部のある実施形態において、この癌性または感染状態は哺乳動物の肝臓におけるものである。一部のある実施形態において、この弱毒化リステリア属菌は代謝的に活性である。一部のある実施形態において、この弱毒化リステリア属菌は、食作用性空胞から細胞の細胞質ゾルに到達し得るものである。
一部のある態様において、本発明は、哺乳動物に有効量の弱毒化リステリア属菌を投与することを含む、哺乳動物において癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子に対する免疫応答を誘導するための方法を提供する。一部のある実施形態において、この弱毒化リステリア属菌は、哺乳動物に経口投与されるものではなく、他の型の細菌を少なくとも９９％非含有である組成物として投与され、医薬組成物中で投与され、そして／または天然に存在しない菌株である。一部のある実施形態において、このリステリア属菌は、癌細胞、腫瘍または感染性因子（例えば、腫瘍抗原感染性因子由来の抗原）に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まない。一部のある実施形態において、このリステリア属菌は哺乳動物に、該哺乳動物における癌性または感染状態に対して別途生じさせたワクチン誘導型免疫応答の非存在下で投与される。一部のある実施形態において、この哺乳動物は、癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子をその肝臓内に含むものである。一部のある実施形態において、この弱毒化リステリア属菌は代謝的に活性である。一部のある実施形態において、この弱毒化リステリア属菌は、食作用性空胞から細胞の細胞質ゾルに到達し得るものである。一部のある実施形態において、上記免疫応答は、生得的免疫応答（例えば、ＮＫ媒介型生得的免疫応答）、適応的免疫応答（例えば、全身性の腫瘍特異的記憶応答）または両方である。
一部のある態様において、本発明は、癌性の障害もしくは状態および／または感染性の障害もしくは状態を抑止または低減するための方法を提供する。
本発明は、癌性または感染状態を有する哺乳動物において該状態を抑止または低減するための方法であって、該哺乳動物に、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まない、代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌の有効量を投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、このリステリア属菌が、ａ．コロニーを形成すること；ｂ．複製すること；またはｃ．分裂することの１つ以上を行なうことができない上記の方法を提供する。また別の実施形態は、この代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌が、親または野生型リステリア属菌のものの少なくともａ．１０％；ｂ．２０％；ｃ．５０％；またはｄ．９０％である転写率を有する上記の方法を提供する。
本発明は、哺乳動物に、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まない弱毒化リステリア属菌の有効量を投与することを含む、癌性または感染状態を有する哺乳動物において該状態を抑止または低減するための方法を提供する。
本発明の別の態様は、上記リステリア属菌が、代謝的に活性であり、ａ．コロニーを形成すること；ｂ．複製すること；またはｃ．分裂することの１つ以上を行なうことができない上記の方法を提供する。また別の態様は、このリステリア属菌が本質的に代謝的に不活性である上記の方法を提供する。さらなる実施形態は、該状態が腫瘍、癌または前癌性障害を含む上記の方法を提供する。また別の実施形態は、該状態が感染を含む上記の方法を提供する。さらにまた、提供されるのは、該感染状態が、ａ．Ｂ型肝炎；ｂ．Ｃ型肝炎；ｃ．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；ｄ．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；ｅ．エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）；またはｆ．リーシュマニア症の１つ以上を含む上記の方法である。また、哺乳動物においてａ．腫瘍もしくは癌細胞の数；ｂ．腫瘍質量；またはｃ．感染性因子の力価のうちの１つまたは任意の組合せが抑止または低減される上記の方法が提供される。また、本発明には、該状態が肝臓のものである上記の方法が包含される。さらに、本発明には、上記弱毒化リステリア属菌が、ａ．抗生物質耐性遺伝子；ｂ．変異したａｃｔＡ遺伝子；またはｃ．変異したｉｎｌＢ遺伝子の１つ以上をコードする組換え核酸を含む上記の方法が包含される。また別の態様において、本発明では、該弱毒化リステリア属菌が、ａ．増殖；ｂ．細胞から細胞への拡散；ｃ．宿主細胞への結合もしくはその内部への侵入；ｄ．複製；またはｅ．ＤＮＡ修復の１つ以上において弱毒化されている上記の方法が想定される。本発明により提供されるのは、該リステリア属菌が、ａ．ａｃｔＡ変異；ｂ．ｉｎｌＢ変異；ｃ．ｕｖｒＡ変異；ｄ．ｕｖｒＢ変異；ｅ．ｕｖｒＣ変異；ｆ．核酸標的化化合物；またはｇ．ｕｖｒＡＢ変異および核酸標的化化合物の１つ以上によって弱毒化される上記の方法である。また、想定されることは、該核酸標的化化合物がソラレンである上記の方法である。また、投与により生得的免疫応答が刺激される上記の方法が想定される。また別の実施形態は、投与により後天性免疫応答が刺激される上記の方法である。また、別の実施形態は、有効量の弱毒化リステリア属菌の投与の非存在下での免疫応答と比べ、投与により、ａ．ＮＫ細胞；ｂ．ＮＫＴ細胞；ｃ．樹状細胞（ＤＣ）；ｄ．単球もしくはマクロファージ；ｅ．好中球；またはｆ．ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）またはヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質の１つまたは任意の組合せが刺激される上記の方法である。
本発明に包含されるのは、有効量の弱毒化リステリア属菌の投与の非存在下での発現と比べ、投与により、ａ．ＣＤ６９；ｂ．インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）；ｃ．インターフェロン−α（ＩＦＮα）もしくはインターフェロンβ（ＩＦＮβ）；ｄ．インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、単球化学誘引性タンパク質（ＭＣＰ−１）、またはｅ．インターロイキン−６（ＩＬ−６）のいずれか１つまたは任意の組合せの発現の増大が刺激される上記の方法である。また、包含されるのは、上記弱毒化リステリア属菌の投与が、ａ．静脈内；ｂ．筋肉内；ｃ．皮下；またはｄ．経口のうちの１つまたは任意の組合せである上記の方法である。また、提供されるのは、哺乳動物がヒトである上記の方法である。さらに、提供されるのは、リステリア属菌がリステリア菌である上記の方法である。さらにまた、提供されるのは、ａ．サイトカインのアゴニストもしくはアンタゴニスト；ｂ．調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のインヒビター；またはｃ．増殖もしくは複製において弱毒化された腫瘍細胞の１つまたは任意の組合せを投与することをさらに含む上記の方法である。またさらなる態様において、提供されるのは、Ｔｒｅｇのインヒビターがシクロホスファミド（ＣＴＸ）である上記の方法である。本発明にはまた、哺乳動物が肝白血球を含み、投与により、ａ．弱毒化リステリア属菌の投与なしでの割合と比べたＮＫ細胞である肝白血球の割合の増加；またはｂ．弱毒化リステリア属菌の投与なしでの発現と比べた肝ＮＫ細胞による活性化マーカーの発現の増大の一方または両方が刺激される上記の方法が包含される。そのうえ、提供されるのは、ＮＫ細胞である肝白血球の割合の増加が、弱毒化リステリア属菌の投与なしでの割合と比べたときより、少なくともａ．５％；ｂ．１０％；ｃ．１５％；ｄ．２０％；またはｅ．２５％大きい上記の方法である。また、弱毒化リステリア属菌が、ａ．哺乳動物に経口投与されない、またはｂ．他の型の細菌を少なくとも９９％非含有である組成物として投与されるの一方または両方である上記の方法が想定される。
一部のある態様において、本発明は、生存を増進させるための方法を提供する。
提供されるのは、癌性または感染状態を有する哺乳動物において該状態に対する生存を増進させるための方法であって、該哺乳動物に、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まない弱毒化リステリア属菌の有効量を投与することを含む方法である。また、該リステリア属菌が、代謝的に活性であり、ａ．コロニーを形成すること；ｂ．複製すること；またはｃ．分裂することの１つ以上を行なうことができない上記の方法が提供される。また別の態様は、該リステリア属菌が本質的に代謝的に不活性である上記の方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物に、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まない、代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌の有効量を投与することを含む、癌性または感染状態を有する哺乳動物において該状態に対する生存を増進させるための方法を提供する。また別の実施形態は、該代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌が、親または野生型リステリア属菌のものの少なくともａ．１０％；ｂ．２０％；ｃ．５０％；またはｄ．９０％である転写率を有する上記の方法を提供する。
また別の実施形態は、弱毒化リステリア属菌が投与されていない適切な対照哺乳動物での生存と比較すると、生存期間が向上する上記の方法を提供する。さらに、本発明に包含されるのは、弱毒化リステリア属菌が投与されていない適切な対照哺乳動物での生存と比較すると、少なくとも、ａ．５日間；ｂ．１０日間；ｃ．１５日間；またはｄ．２０日間生存期間が向上する上記の方法である。該状態が癌、腫瘍または前癌性障害を含む上記の方法が提供される。また、該状態が感染を含む上記の方法が提供される。さらに、別の態様では、本発明は、感染状態が、ａ．Ｂ型肝炎；ｂ．Ｃ型肝炎；ｃ．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；ｄ．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；ｅ．エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）；またはｆ．リーシュマニア症の１つ以上を含む上記の方法を提供する。
さらに、提供されるのは、該状態が肝臓のものである生存を増進させるための上記の方法である。さらにまた、提供されるのは、上記弱毒化リステリア属菌が、ａ．抗生物質耐性遺伝子；ｂ．変異したａｃｔＡ遺伝子；またはｃ．変異したｉｎｌＢ遺伝子をコードする組換え核酸を含む上記の方法である。またさらなる態様において、本発明により提供されるのは、上記弱毒化リステリア属菌が、ａ．増殖；ｂ．細胞から細胞への拡散；ｃ．宿主細胞への結合もしくはその内部への侵入；ｄ．複製；またはｅ．ＤＮＡ修復の１つ以上において弱毒化されている上記の方法である。本発明に包含されるのは、上記リステリア属菌が、ａ．ａｃｔＡ変異；ｂ．ｉｎｌＢ変異；ｃ．ｕｖｒＡ変異；ｄ．ｕｖｒＢ変異；ｅ．ｕｖｒＣ変異；ｆ．核酸標的化化合物；またはｇ．ｕｖｒＡＢ変異および核酸標的化化合物の１つ以上によって弱毒化される上記の方法である。さらに、包含されるのは、該核酸標的化化合物がソラレンである上記の方法である。また別の態様において、本発明は、投与により生得的免疫応答が刺激される上記の方法を提供する。また、提供されるのは、投与により後天性免疫応答が刺激される上記の方法である。さらに、投与により、ａ．ＮＫ細胞；ｂ．ＮＫＴ細胞；ｃ．樹状細胞（ＤＣ）；ｄ．単球もしくはマクロファージ；ｅ．好中球；ｆ．ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）；またはｇ．ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメインタンパク質（ＮＯＤタンパク質）の１つまたは任意の組合せが刺激される上記の方法が提供される。さらに、提供されるのは、有効量の弱毒化リステリア属菌の投与の非存在下での発現と比べ、投与により、ａ．ＣＤ６９；ｂ．インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）；ｃ．インターフェロン−α（ＩＦＮα）もしくはインターフェロン−β（ＩＦＮβ）；ｄ．インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）；ｅ．単球化学誘引性タンパク質（ＭＣＰ−１）；またはｆ．インターロイキン−６（ＩＬ−６）のいずれか１つまたは任意の組合せの発現の増大が刺激される上記の方法である。さらにまた、本発明によって提供されるさらなる実施形態は、上記弱毒化リステリア属菌の投与が、ａ．静脈内；ｂ．筋肉内；ｃ．皮下；またはｄ．経口のうちの１つまたは任意の組合せである上記の方法である。また、哺乳動物がヒトである上記の方法が提供される。さらに、上記リステリア属菌がリステリア菌である上記の方法が提供される。さらに、本発明に包含されるのは、ａ．サイトカインのアゴニストもしくはアンタゴニスト；ｂ．調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のインヒビター；またはｃ．増殖もしくは複製において弱毒化された腫瘍細胞の１つまたは任意の組合せを投与することをさらに含む上記の方法である。また別の態様は、Ｔｒｅｇのインヒビターがシクロホスファミド（ＣＴＸ）である上記の方法である。さらに、別の態様は、哺乳動物が肝白血球を含み、投与により、ａ．弱毒化リステリア属菌の投与なしでの割合と比べたＮＫ細胞である肝白血球の割合の増加；またはｂ．弱毒化リステリア属菌の投与なしでの発現と比べた肝ＮＫ細胞による活性化マーカーの発現の増大の一方または両方が刺激される上記の方法である。また、ＮＫ細胞である肝白血球の割合の増加が、弱毒化リステリア属菌の投与なしでの割合と比べたときより、少なくともａ．５％；ｂ．１０％；ｃ．１５％；ｄ．２０％；またはｅ．２５％大きい上記の方法が本発明に包含される。本発明により、投与される弱毒化リステリア属菌が、ａ．哺乳動物に経口投与されない；またはｂ．他の型の細菌を少なくとも９９％非含有である組成物として投与されるの一方または両方である上記の方法が提供される。
別の態様では、本発明は、癌性または感染状態を有する哺乳動物において該状態を抑止または低減するための方法であって、該哺乳動物に有効量の弱毒化リステリア属菌を投与することを含み、弱毒化が、ａ．ａｃｔＡ遺伝子；ｂ．ｉｎｌＢ遺伝子；ｃ．ｕｖｒＡ遺伝子；ｄ．ｕｖｒＢ遺伝子；またはｅ．ｕｖｒＣ遺伝子の１つ以上におけるものであり、該リステリア属菌が、該障害に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まない方法を提供する。
本発明のまた別の態様は、癌性または感染状態を有する哺乳動物において該状態に対する生存を増進させるための方法であって、該哺乳動物に有効量の弱毒化リステリア属菌を投与することを含み、該弱毒化が、ａ．ａｃｔＡ遺伝子；ｂ．ｉｎｌＢ；ｃ．ｕｖｒＡ遺伝子；ｄ．ｕｖｒＢ遺伝子；またはｕｖｒＣ遺伝子の１つ以上におけるものであり、リステリア属菌が、該障害に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まない方法を提供する。
一部のある実施形態において、上記に開示した方法（および試薬）には、少なくとも１種類の腫瘍抗原をコードする核酸を含む弱毒化リステリア属菌、少なくとも１種類の癌抗原をコードする核酸を含む弱毒化リステリア属菌、少なくとも１種類の異種抗原をコードする核酸を含む弱毒化リステリア属菌、あるいは少なくとも１種類の腫瘍抗原、癌抗原および／または異種抗原を発現する弱毒化リステリア属菌の使用が包含される。
一部のある実施形態において、上記に開示した方法（および試薬）には、腫瘍抗原をコードする核酸を含まない弱毒化リステリア属菌、癌抗原をコードする核酸を含まない弱毒化リステリア属菌、異種抗原をコードする核酸を含まない弱毒化リステリア属菌、あるいは腫瘍抗原、癌抗原および／または異種抗原を発現しない弱毒化リステリア属菌の使用が包含される。
一部のある実施形態において、上記に開示した方法（および試薬）には、非リステリア感染性生物体由来の抗原をコードする核酸を含む弱毒化リステリア属菌の使用が包含される。一部のある実施形態において、上記に開示した方法（および試薬）には、ウイルスまたは寄生虫に由来する抗原をコードする核酸を含む弱毒化リステリア属菌の使用が包含される。
一部のある実施形態において、上記に開示した方法（および試薬）には、非リステリア感染性生物体由来の抗原をコードする核酸を含まない弱毒化リステリア属菌の使用が包含される。一部のある実施形態において、上記に開示した方法（および試薬）には、ウイルスまたは寄生虫に由来する抗原をコードする核酸を含まない弱毒化リステリア属菌の使用が包含される。
前述の各方法の一部のある実施形態ならびに本明細書に記載の他の方法では、該方法には、上記哺乳動物に、癌性または感染状態に対する（あるいは癌細胞、腫瘍または感染性因子に対する）さらなるワクチンを投与することが含まれない。前述の各方法の一部のある実施形態ならびに本明細書に記載の他の方法では、上記哺乳動物において、該癌性または感染状態に対する（あるいは癌細胞、腫瘍または感染性因子に対する）ワクチンが以前に投与されたことがない。前述の各方法の一部のある実施形態ならびに本明細書に記載の他の方法では、上記リステリア属菌は哺乳動物に、該哺乳動物における癌性または感染状態（あるいは癌細胞、腫瘍または感染性因子）に対して別途生じさせたワクチン誘導型免疫応答の非存在下で投与される。
前述の各方法の一部のある実施形態ならびに本明細書に記載の他の方法では、上記感染状態または感染性因子は非リステリア型である。前述の各方法の一部のある実施形態ならびに本明細書に記載の他の方法では、上記リステリア属菌は反復投与される。前述の各方法の一部のある実施形態ならびに本明細書に記載の他の方法では、上記リステリア属菌はＨＩＶ−ｇａｇによって弱毒化されたものではない。前述の各方法の一部のある実施形態ならびに本明細書に記載の他の方法では、上記弱毒化リステリア属菌は、食作用性空胞から細胞の細胞質ゾルに到達し得るものである。
上記に開示した各方法の一部のある実施形態では、上記弱毒化リステリア属菌は、動物タンパク質を主成分とする培地で培養することにより調製されたものではなく、異なる型の培地で培養することにより調製されたものである。上記に開示した各方法の一部のある実施形態では、上記弱毒化リステリア属菌は、動物タンパク質由来のペプチドを含有する培地で培養することにより調製されたものではなく、異なる型の培地で培養することにより調製されたものである。さらに、上記に開示した各方法の一部のある実施形態では、上記弱毒化リステリア属菌は、経口ではないか、または経腸的でない経路によって投与される。さらに、上記に開示した各方法の一部のある実施形態では、上記弱毒化リステリア属菌は、腸管腔からリンパ腺または血流への移動を要しない経路によって投与される。
上記に開示した各方法の一部のある実施形態では、上記リステリア属菌は、直接腫瘍内に注射されないか、または癌性もしくは感染性の障害に罹患した部位内に直接注射されない。
さらに、上記の各実施形態には、腫瘍内への直接注射、癌性病変内への直接注射および／または感染病変内への直接注射によってリステリア属菌を投与することが包含される。また、本発明は、投与が腫瘍内への直接注射によるものではなく、癌性病変内への直接注射によるものではなく、そして／または感染病変内への直接注射によるものではない、上記の各実施形態を含む。
本明細書に開示された実施形態のいずれかにおける異種抗原が、腫瘍抗原であるか、または腫瘍抗原に由来するものであるワクチンが提供される。また、本明細書に開示された実施形態のいずれかにおける異種抗原が、癌抗原であるかまたは癌抗原に由来するものであるワクチン提供される。さらに、提供されるのは、本明細書に開示された実施形態のいずれかにおける異種抗原が、感染性生物体、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫もしくは多細胞生物体の抗原であるか、または感染性生物体の抗原に由来するものであるワクチンである。
さらなる実施形態は、本明細書に開示された実施形態のいずれかにおける異種抗原が腫瘍抗原であるかまたは腫瘍抗原に由来するものである核酸を提供する。また、本明細書に開示された実施形態のいずれかにおける異種抗原が、癌抗原であるかまたは癌抗原に由来するものである核酸が提供される。さらに、提供されるのは、本明細書に開示された実施形態のいずれかにおける異種抗原が、感染性生物体、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫もしくは多細胞生物体の抗原であるか、または感染性生物体の抗原に由来するものである核酸である。
別の実施形態において、提供されるのは、本明細書に開示された実施形態のいずれかにおける異種抗原が、腫瘍抗原であるかまたは腫瘍抗原に由来するものであるリステリア属菌である。また、本明細書に開示された実施形態のいずれかにおける異種抗原が、癌抗原であるかまたは癌抗原に由来するものであるリステリア属菌が提供される。さらに、提供されるのは、本明細書に開示された実施形態のいずれかにおける異種抗原が、感染性生物体、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫もしくは多細胞生物体の抗原であるか、または感染性生物体の抗原に由来するものであるリステリア属菌である。
一部のある実施形態において、上記に開示した各方法には、動物タンパク質または肉（ｍｅａｔ）タンパク質を主成分とする培地で培養することにより調製されたものではなく、異なる型の培地で培養することにより調製されたものである弱毒化リステリア属菌が包含される。肉タンパク質または動物タンパク質を主成分とする培地で培養することにより調製されたものではなく、酵母由来タンパク質および／または植物由来タンパク質を主成分とする培地で培養することにより調製された弱毒化リステリア属菌が提供される。
一部のある実施形態において、本発明は、癌性または非リステリア感染状態を有する哺乳動物を処置するための方法であって、該癌性または感染状態が該哺乳動物の肝臓におけるものであり、哺乳動物に、有効量の代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌を投与することを含み、該リステリア属菌は、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まず、該弱毒化リステリア属菌が哺乳動物に反復投与で投与される方法を提供する。一部のある実施形態において、上記哺乳動物は、癌性状態（例えば、腫瘍および／または癌を含む状態）を有する。一部のある実施形態において、上記哺乳動物は、非リステリア感染状態（例えば、感染を含む状態）を有する。本発明には、上記癌性または感染状態が、有効量の弱毒化リステリア属菌の投与によって哺乳動物において抑制または低減される処置方法が包含される。本発明には、さらに、哺乳動物の生存が、有効量の弱毒化リステリア属菌の投与によって増強される処置方法が包含される。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は、増殖、細胞から細胞への拡散、宿主細胞への結合もしくはその内部への侵入、複製またはＤＮＡ修復の１つ以上において弱毒化されている。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、ａｃｔＡ変異、ｉｎｌＢ変異、ｕｖｒＡ変異、ｕｖｒＢ変異、ｕｖｒＣ変異、核酸標的化化合物またはｕｖｒＡＢ変異および核酸標的化化合物の１つ以上によって弱毒化される。一部のある実施形態において、上記リステリア属菌は、コロニー形成、複製または分裂の１つ以上を行なうことができない。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は静脈内投与される。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は３回以上の投与で投与される。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は上記哺乳動物に経口投与されるものではなく、他の型の細菌を少なくとも９９％非含有である組成物として投与されるものではなく、哺乳動物に医薬組成物中で投与され、そして／または天然に存在するものではない。一部のある実施形態において、上記哺乳動物は、該癌性または感染状態に対するワクチンが以前に投与されたことがない。一部のある実施形態において、該方法には、該哺乳動物に該癌性または感染状態に対するさらなるワクチンを投与することがさらに含まれない。リステリア属菌の投与により生得的免疫応答および／または後天性免疫応答が刺激され得る。一部のある実施形態において、上記哺乳動物はヒトである。一部のある実施形態において、上記リステリア属菌はリステリア菌である。一部のある実施形態において、有効量には、少なくとも約１×１０３ＣＦＵ／ｋｇまたは少なくとも約１×１０３リステリア属菌体／ｋｇが含まれる。
本発明は、さらに、肝臓内に癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子を含む哺乳動物（例えば、ヒト）において該癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子に対する免疫応答を誘導するための方法であって、該哺乳動物に、有効量の代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌を投与することを含み、該リステリア属菌は、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まず、該弱毒化リステリア属菌は哺乳動物に反復投与で投与される方法を提供する。一部のある実施形態において、リステリア属菌は哺乳動物に経口投与されるものではなく、他の型の細菌を少なくとも９９％非含有である組成物として投与され、医薬組成物中で投与され、そして／または天然に存在する菌株ではない。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は、増殖、細胞から細胞への拡散、宿主細胞への結合もしくはその内部への侵入、複製またはＤＮＡ修復の１つ以上において弱毒化されている。一部のある実施形態において、上記リステリア属菌は、ａｃｔＡ変異、ｉｎｌＢ変異、ｕｖｒＡ変異、ｕｖｒＢ変異、ｕｖｒＣ変異、核酸標的化化合物またはｕｖｒＡＢ変異および核酸標的化化合物の１つ以上によって弱毒化される。一部のある実施形態において、上記リステリア属菌は、コロニー形成、複製および／または分裂を行なうことができない。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は静脈内投与される。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は３回以上の投与で投与される。上記リステリア属菌の投与により生得的免疫応答および／または後天性免疫応答が刺激され得る。一部のある実施形態において、上記リステリア属菌は、リステリア菌株である。一部のある実施形態において、有効量には、少なくとも約１×１０３ＣＦＵ／ｋｇまたは少なくとも約１×１０３リステリア属菌体／ｋｇが含まれる。一部のある実施形態において、該方法には、上記哺乳動物に、癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子に対する特異的免疫応答を刺激し得るさらなるワクチンを投与することがさらに含まれない。一部のある実施形態において、上記哺乳動物は癌細胞または腫瘍を含む。一部のある実施形態において、哺乳動物は感染性因子を含む。
一部のある実施形態において、本発明は、癌性または非リステリア感染状態を有する哺乳動物を処置するための方法であって、該癌性または感染状態が哺乳動物の肝臓におけるものであり、該哺乳動物に、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まない代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌の有効量を投与することを含む方法を提供する。一部のある実施形態において、該リステリア属菌は該哺乳動物に、該哺乳動物における癌性または感染状態に対して別途生じさせたワクチン誘導型免疫応答の非存在下で投与される。一部のある実施形態において、該弱毒化リステリア属菌は、食作用性空胞から細胞の細胞質ゾルに到達し得るものである。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は、増殖、細胞から細胞への拡散、宿主細胞への結合もしくはその内部への侵入、複製またはＤＮＡ修復の１つ以上において弱毒化されている。一部のある実施形態において、上記リステリア属菌は、ａｃｔＡ変異、ｉｎｌＢ変異、ｕｖｒＡ変異、ｕｖｒＢ変異、ｕｖｒＣ変異、核酸標的化化合物またはｕｖｒＡＢ変異および核酸標的化化合物の１つ以上によって弱毒化される。一部のある実施形態において、上記リステリア属菌は、コロニー形成、複製または分裂の１つ以上を行なうことができない。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は静脈内投与される。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は、反復投与（例えば、３回以上の投与）で投与される。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は上記哺乳動物に経口投与されるものではなく、他の型の細菌を少なくとも９９％非含有である組成物として投与されるものではなく、哺乳動物に医薬組成物中で投与され、そして／または天然に存在するものではない。一部のある実施形態において、上記哺乳動物は、該癌性または感染状態に対するワクチンが以前に投与されたことがない。一部のある実施形態において、該方法には、上記哺乳動物に該癌性または感染状態に対するさらなるワクチンを投与することがさらに含まれない。上記リステリア属菌の投与により生得的免疫応答および／または後天性免疫応答が刺激され得る。一部のある実施形態において、上記哺乳動物はヒトである。一部のある実施形態において、リステリア属菌がリステリア菌である。一部のある実施形態において、有効量には、少なくとも約１×１０３ＣＦＵ／ｋｇまたは少なくとも約１×１０３リステリア属菌体／ｋｇが含まれる。
特定のある実施形態において、本発明は、癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子その肝臓内に含む哺乳動物において該癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子に対する免疫応答を誘導するための方法であって、該哺乳動物に有効量の代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌を投与することを含み、該リステリア属菌が、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まず、該弱毒化リステリア属菌は、該哺乳動物に経口投与されるものではなく、他の型の細菌を少なくとも９９％非含有である組成物として投与され、医薬組成物中で投与され、そして／または天然に存在しない菌株である方法を提供する。一部のある実施形態において、上記リステリア属菌は哺乳動物に、該哺乳動物における癌細胞、腫瘍または感染性因子に対して別途生じさせたワクチン誘導型免疫応答の非存在下で投与される。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は、食作用性空胞から細胞の細胞質ゾルに到達し得るものである。一部のある実施形態において、免疫応答は、生得的免疫応答（例えば、ＮＫ媒介型生得的免疫応答）、後天性免疫応答（例えば、全身性の腫瘍特異的記憶応答）または両方である。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は、増殖、細胞から細胞への拡散、宿主細胞への結合もしくはその内部への侵入、複製またはＤＮＡ修復の１つ以上において弱毒化されている。一部のある実施形態において、上記リステリア属菌は、ａｃｔＡ変異、ｉｎｌＢ変異、ｕｖｒＡ変異、ｕｖｒＢ変異、ｕｖｒＣ変異、核酸標的化化合物またはｕｖｒＡＢ変異および核酸標的化化合物の１つ以上によって弱毒化される。一部のある実施形態において、上記リステリア属菌は、コロニー形成、複製および／または分裂を行なうことができない。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は静脈内投与される。一部のある実施形態において、上記弱毒化リステリア属菌は、反復投与（例えば、３回以上の投与）で投与される。一部のある実施形態において、上記リステリア属菌はリステリア菌であり、一部のある実施形態において、有効量には、少なくとも約１×１０３ＣＦＵ／ｋｇまたは少なくとも約１×１０３リステリア属菌体／ｋｇが含まれる。一部のある実施形態において、該方法には、該哺乳動物に、癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子に対する特異的免疫応答を刺激し得るさらなるワクチンを投与することがさらに含まれない。
前述の各方法の一部のある実施形態ならびに本明細書に記載の他の方法では、弱毒化リステリア属菌は、ａｃｔＡ欠失変異体またはａｃｔＡｉｎｌＢ二重欠失変異体である。
本発明は、さらに、前述の各リステリア属菌、ならびに本明細書（例えば、以下の詳細説明または実施例）に記載の他のリステリア属菌および試薬を含むワクチン、免疫原性組成物および医薬組成物などの組成物を提供する。医薬組成物または医薬の製造における本明細書に記載の各リステリア属菌の使用も、同様に提供される。医薬組成物または医薬は、本明細書に記載の方法のいずれかにおいて使用され得る。例えば、本発明は、哺乳動物における癌性状態または（非リステリア型）感染状態の処置のための医薬の製造における本明細書に記載の各リステリア属菌の使用を提供する。本発明は、さらに、哺乳動物において癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造における本明細書に記載の各リステリア属菌の使用を提供する。
上記の態様および実施形態のさらなる記載ならびに本発明のさらなる実施形態および態様を以下に示す。
詳細説明
本明細書（特許請求の範囲を含む）で用いる場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの単数形の単語は、文脈において、そうでないと明白に記載されていない限り、その対応する複数の指示対象物を含む。本明細書に引用したすべての参考文献は、引用によって、個々の各刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号により入手される配列、特許出願、特許、配列表、ヌクレオチドまたは配列表内のオリゴペプチド配列もしくはポリペプチド配列、ならびに上記刊行物および特許文献の図および図面が、具体的かつ個々に示されているのと同程度に本明細書に援用される。
Ｉ．定義
略語は、多くの場合、本明細書では遺伝子または細菌コード遺伝子の変異を示すために用いる。一例として、略語「リステリア属菌ΔａｃｔＡ」、「Ｌｍ ΔａｃｔＡ」、「ΔａｃｔＡ」、「Ｌｍ ａｃｔＡ」、「Ｌｍ−ａｃｔＡ」または「リステリア属菌ａｃｔＡ」は、ａｃｔＡ遺伝子の一部または全部が欠失していることを意味する。略語「リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ」、「Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ」、「ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ」、「Ｌｍ ａｃｔＡｉｎｌＢ」、「ａｃｔＡｉｎｌＢ」、「Ｌｍ ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ」、「Ｌｍ−ａｃｔＡｉｎｌＢ」または「リステリア属菌ａｃｔＡｉｎｌＢ」は、ａｃｔＡ遺伝子およびｉｎｌＢの両方の一部または全部が欠失していることを意味する。Ｌｍは「リステリア菌」を意味する。デルタ記号（Δ）は欠失を意味する。上付きのマイナス記号を含む略語（リステリア属菌ａｃｔＡ−）は、ａｃｔＡ遺伝子を、例えば、欠失、点変異またはフレームシフト変異（これらの型の変異に限定されない）によって変異させたことを意味する。用語「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、本明細書において、用語「ＧＭワクチン」および「ＧＶＡＸ」と互換的に用いる。指数関数は略語で示す。例えば、「３ｅ７」は、３×１０７を意味する。
「投与」および「処置（処理）」は、ヒト、哺乳動物、哺乳動物被験体、動物、獣医学的被験体、プラセボ被験体、研究用被験体、実験用被験体、細胞、組織、器官または生体液に適用される場合、限定されないが、外来性のリガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬用剤、治療用剤、診断用剤または組成物と被験体、細胞、組織、器官または生体液などとの接触をいう。「投与」および「処置（処理）」は、例えば、治療的、薬物動態学的、診断的、研究用、プラセボおよび実験用の方法を示し得る。細胞の処理には、試薬と細胞との接触、ならびに試薬と流動体（この場合、流動体は細胞と接触している）との接触が包含される。「投与」および「処置（処理）」にはまた、例えば、試薬である診断用結合組成物または別の細胞による細胞のインビトロおよびエキソビボ処置が包含される。状況に応じて、被験体の「処置」は、例えば、被験体が試薬の投与によって改善されることが予測される障害を含む状況では、被験体が処置を必要とすることを意味し得る。処置の成功または成績は、プラセボ処置または処置なしと比較した場合の、例えば、生存期間の増大（例えば、生死にかかわる増殖性障害に対して）、腫瘍の大きさの低減、腫瘍の数の減少、特定の組織からの転移の減少、特定の組織への転移の減少、感染性因子の力価などによって評価され得る。
アゴニストは、リガンドおよび受容体に関する場合、受容体を刺激する分子、分子の組合せ、複合体または試薬の組合せを含む。例えば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のアゴニストには、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦのムテインもしくは誘導体、ＧＭ−ＣＳＦのペプチド模倣物、ＧＭ−ＣＳＦの生物学的機能を模倣する小分子、またはＧＭ−ＣＳＦ受容体を刺激する抗体が含まれ得る。アンタゴニストには、リガンドおよび受容体に関する場合、受容体に拮抗する分子、分子の組合せまたは複合体が含まれる。「アンタゴニスト」には、受容体の構成的活性を阻害する任意の試薬が包含される。構成的活性は、リガンド／受容体相互作用の非存在下で顕現されるものである。「アンタゴニスト」にはまた、受容体の刺激された（または調節された）活性を阻害または抑制する任意の試薬が包含される。一例として、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のアンタゴニストとしては、限定を意味するものではないが、ＧＭ−ＣＳＦに結合してＧＭ−ＣＳＦがＧＭ−ＣＳＦ受容体に結合するのを妨げる抗体、またはＧＭ−ＣＳＦ受容体に結合してＧＭ−ＣＳＦが受容体に結合するのを妨げる抗体、または抗体が受容体を不活性なコンホメーションに固定する場合が挙げられる。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、抗原をＴ細胞に提示するために用いられる免疫系の細胞である。ＡＰＣとしては、樹状細胞、単球、マクロファージ、辺縁帯クップファー細胞、小神経膠細胞、ランゲルハンス細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞が挙げられる（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−ＰｉｎｔｏおよびＭｏｒｅｎｏ（２００５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１０９７−１１０５を参照）。樹状細胞は、少なくとも２つの系統で存在する。第１の系統には、プレＤＣ１、骨髄系ＤＣ１および成熟ＤＣ１が包含される。第２の系統には、ＣＤ３４＋＋ＣＤ４５ＲＡ−初期多能性前駆細胞、ＣＤ３４＋＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ３４＋＋ＣＤ４５ＲＡ＋＋ＣＤ４＋ ＩＬ−３Ｒα＋＋ プロＤＣ２細胞、ＣＤ４＋ＣＤ１１ｃ−形質細胞様プレＤＣ２細胞、リンパ様ヒトＤＣ２形質細胞様由来ＤＣ２、および成熟ＤＣ２が包含される（例えば、ＧｉｌｌｉｅｔおよびＬｉｕ（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：６９５−７０４；Ｂａｕｅｒら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５０００−５００７；Ａｒｐｉｎａｔｉら（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５：２４８４−２４９０；Ｋａｄｏｗａｋｉら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：８６３−８６９；Ｌｉｕ（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６３：１０６７−１０７１を参照）。
「弱毒化」および「弱毒化された」には、宿主に対する毒性または病原性を低減させるために改変された細菌、ウイルス、寄生虫、プリオン、腫瘍細胞などが包含される。宿主は、ヒトもしくは動物宿主、または器官、組織もしくは細胞であり得る。細菌は、非限定的な例を示すと、宿主細胞への結合を低減させるため、ある１つの宿主細胞から別の宿主細胞への拡散を低減させるため、細胞外増殖を低減させるため、または宿主細胞内での細胞内増殖を低減させるために弱毒化され得る。弱毒化は、例えば、毒性の指標、ＬＤ５０、器官からのクリアランス速度または競合指数を測定することにより評価され得る（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：５９５３−５９５７を参照）。一般的に、弱毒化の結果、少なくとも２５％；より一般的には少なくとも５０％；最も一般的には少なくとも１００％（２倍）；通常、少なくとも５倍；より通常では少なくとも１０倍；最も通常では少なくとも５０倍；多くの場合、少なくとも１００倍；より多くの場合では少なくとも５００倍；および最も多くの場合では少なくとも１０００倍；通常、少なくとも５０００倍；より通常では少なくとも１０，０００倍；および最も通常では少なくとも５０，０００倍；ならびに慣用的には少なくとも１００，０００倍のＬＤ５０の増加および／またはクリアランス速度の増加がもたらされる。非限定的な例として：増殖を低減させる細菌の改変により細菌の病原特性が低減される。したがって、この改変は弱毒化である。ＤＮＡ修復を低減させる細菌の改変により、細菌の病原特性が低減され得る。したがって、この改変もまた弱毒化である。
「弱毒化された遺伝子」には、宿主に対する毒性、病態もしくはビルレンス、宿主内での増殖、または宿主内での生存を媒介する遺伝子であって、毒性、病態またはビルレンスを軽減、低減または排除する様式で変異された遺伝子が包含される。低減または排除は、変異された遺伝子によって媒介されるビルレンスまたは毒性を、非変異（または親）遺伝子によって媒介されるものと比較することにより評価され得る。「変異された遺伝子」には、該遺伝子の調節領域、該遺伝子のコード領域、該遺伝子の非コード領域における欠失、点変異およびフレームシフト変異、またはその任意の組合せが包含される。
弱毒化は、例えば、熱処理または化学修飾によって行なわれ得る。弱毒化はまた、例えば、代謝、細胞外増殖もしくは細胞内増殖をモジュレートする核酸の遺伝子の改変、ビルレンス因子、例えば、リステリア菌のｐｒｆＡ、ａｃｔＡ、リステリオリシン（ＬＬＯ）、接着媒介因子（例えば、インターナリン）、ｍｐｌ、ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣをコードする核酸の遺伝子（ＰＩ−ＰＬＣ；ｐｌｃＡ遺伝子）の改変、上記のものの任意の組合せなどによって行なわれ得る。弱毒化は、弱毒化リステリア属菌の生物学的機能を適切な親リステリア属菌によって示される対応する生物学的機能と比較することにより評価され得る。
本発明は、核酸標的化剤または核酸標的化化合物、例えば、架橋剤、ソラレン、ナイトロジェンマスタード、シスプラチン、大型の（ｂｕｌｋｙ）付加体、紫外光、γ照射、その任意の組合せなどで処理すること弱毒化されたリステリア属菌を提供する。リステリア属菌はまた、少なくとも１つの核酸修復遺伝子、例えば、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＡＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、ｕｖｒＡＢ、ｐｈｒＡおよび／またはｒｅｃＡを変異させることにより弱毒化され得る。さらに、本発明は、核酸標的化剤および核酸修復遺伝子における変異の両方によって弱毒化されたリステリア属菌を提供する。さらに、本発明には、光感受性核酸標的化剤（例えば、ソラレンなど）または光感受性核酸架橋剤（例えば、ソラレンなど）で処理した後、紫外光に曝露することが包含される（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙらの米国特公開公報許第２００４／０２２８８７７号およびＤｕｂｅｎｓｋｙらの同第２００４／０１９７３４３号を参照）。
「癌性状態」および「癌性障害」には、限定を意味するものではないが、癌、腫瘍、転移、腫瘍の血管形成、および前癌性障害（例えば、異形成など）が包含される。
「有効量」には、限定されないが、病状または障害の症状または徴候が、改善、逆転、軽減、予防または診断され得る量が包含される。別途明白な記載がないか、または文脈に示されない限り、「有効量」は、状態を改善するに充分な最少量に限定されない。
「細胞外液」には、例えば、血清、血漿、血液、間質液、脳脊髄液、分泌液、リンパ液、胆汁、汗および尿が包含される。「細胞外液」には、コロイドまたは懸濁液、例えば、全血液または凝固血液が含まれ得る。
リステリア属菌の細菌の「増殖（ｇｒｏｗｔｈ）」には、限定されないが、コロニー形成、複製、リステリア菌タンパク質含量の増加、リステリア菌脂質含量の増加に関連する、細菌の生理機能および細菌の核酸の機能が包含される。別途明白な記載がないか、または文脈に示されない限り、リステリア属菌の増殖には、宿主細胞外部での細菌の増殖、また、宿主細胞内部での増殖も包含される。増殖関連遺伝子としては、限定を意味するものではないが、エネルギー生成（例えば、解糖）、栄養分輸送、転写、翻訳および複製を媒介するものが挙げられる。
一部のある実施形態において、「増殖」は、感染宿主細胞の細胞質内での細菌の増殖および繁殖をいい、インビトロ増殖をいうのではない。例えば、一部のある実施形態において、「増殖」に対して高度に特異的な遺伝子は、インビトロでの増殖に寄与せず、慣用的な細菌培養液中での増殖に寄与しないが、感染宿主細胞の細胞内増殖および細胞質内での繁殖にはある程度または大きく寄与するタンパク質をコードするものである。
慣用的には、本発明の弱毒化リステリア属菌の増殖は、親リステリア属菌株のものの最大８０％、より慣用的には、弱毒化リステリア属菌の増殖は、親リステリア属菌株のものの最大７０％、最も慣用的には、弱毒リステリア属菌の増殖は、親リステリア属菌株のものの最大６０％、通常、本発明の弱毒化リステリア属菌の増殖は、親リステリア属菌株のものの最大５０％；より通常では増殖は親菌株のものの最大４５％；最も通常では増殖は親菌株のものの４０％；多くの場合、増殖は親菌株のものの最大３５％、より多くの場合では、増殖は親菌株のものの最大３０％；および最も多くの場合では、増殖は親菌株のものの最大２５％；通常、増殖は親菌株のものの最大２０％；より通常では増殖は親菌株のものの最大１５％；最も通常では増殖は親菌株のものの最大１０％；典型的には、増殖は親菌株のものの最大５％；より典型的には、本発明の弱毒化リステリア属菌の増殖は、親菌株のものの最大１％であり；および最も典型的には、増殖は検出可能ではない。親および弱毒化菌株の増殖は、両方の生物体の細胞外増殖を測定することにより比較され得る。親および弱毒化菌株の増殖はまた、両方の生物体の細胞内増殖を測定することにより比較され得る。
増殖関連遺伝子には、細胞外増殖速度が刺激されるのと同じ量で細胞内増殖速度を刺激するものが包含され、細胞外増殖速度を刺激するより少なくとも２０％大きく；細胞外増殖を刺激する速度よりより通常では少なくとも３０％大きく；最も通常では細胞外増殖を刺激する速度より少なくとも４０％大きく；通常、細胞外増殖を刺激する速度より少なくとも６０％大きく；より通常では細胞外増殖を刺激する速度より少なくとも８０％大きく；最も通常では細胞外増殖を刺激する速度より少なくとも１００％（２倍）大きく細胞内増殖速度を刺激する；多くの場合、細胞外増殖を刺激する速度より少なくとも３倍大きい；より多くの場合では、細胞外増殖を刺激する速度より少なくとも４倍大きい；および最も多くの場合では、細胞外増殖を刺激する速度より少なくとも１０倍大きい；典型的には、細胞外増殖を刺激する速度より少なくとも５０倍大きい；および最も典型的には、細胞外増殖を刺激する速度より少なくとも１００倍大きい。
「免疫状態」または「免疫障害」には、有効でない、不適切な、または免疫系の病理学的応答（例えば、持続性の感染もしくは持続性の癌に対する）に起因する障害、状態、症状または疾患が包含される（例えば、Ｊａｃｏｂｓｏｎら（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８４：２２３−２４３を参照）。「免疫状態」または「免疫障害」には、例えば、病的炎症、炎症性障害および自己免疫障害または疾患が包含される。「免疫状態」または「免疫障害」はまた、感染症、持続性の感染症および増殖性状態、例えば、癌、腫瘍および血管形成（例えば、免疫系による根絶（ｉｒｒａｄｉｃａｔｉｏｎ）に抵抗する感染症、腫瘍および癌）などをいうものであり得る。「免疫状態」または「免疫障害」にはまた、感染性因子によって誘導される癌（例えば、非限定的な例としては、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプスタイン−バーウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、カポジ肉腫ヘルペスウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスおよびピロリ菌によって誘導される癌が挙げられる）が包含される（例えば、ＹｏｕｎｇおよびＲｉｃｋｉｎｓｏｎ（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ４：７５７−７６８；Ｐａｇａｎｏら（２００４）Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１４：４５３−４７１；Ｌｉら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５：２６２−２７１を参照）。
「生得的免疫」、「生得的応答」および「生得的免疫応答」には、限定されないが、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の認識により生じる応答が包含される。「生得的応答」には、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって媒介される応答、ＮＯＤタンパク質（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメインタンパク質）によって媒介される応答、またはスカベンジャー受容体、マンノース受容体もしくはβ−グルカン受容体によって媒介される応答が包含され得る（例えば、Ｐａｓｈｉｎｅら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．Ｓｕｐｐｌ．１１：Ｓ６３−Ｓ６８を参照）。「生得的応答」は、ＴＬＲが、あるリガンドファミリーの任意の構成員によって刺激され得る（単に、異なる構造を有する１つのリガンドによってではない）ことを特徴とする。さらに、「生得的応答」は、ＴＬＲを刺激するリガンドが抗原に対する応答を促進し得、このとき、該リガンドは該抗原と、なんら構造的同一性または構造的類似性を有する必要がない点で区別される。生得的応答にはまた、オプソニン（ｏｐｓｏｎ）またはレクチンによって媒介される生理学的活性が包含される（例えば、ＤｏｈｅｒｔｙおよびＡｒｄｉｔｉ（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４：１６９９−１７０３；Ｔｖｉｎｎｅｒｅｉｍら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：１９９４−２００２；Ｖａｎｋａｙａｌａｐａｔｉら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：１３０−１３７；Ｋｅｌｌｙら（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：８３−９０；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら（１９９３）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６１：３６６４−３６７２；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０１：８３−８９；Ｒｏｏｓら（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：２５８９−２５９８；ＴａｋｅｄａおよびＡｋｉｒａ（２００５）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７：１−１４；Ｗｅｉｓｓら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：４４６３−４４６９；Ｃｈａｍａｉｌｌａｒｄら（２００３）Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：５８１−５９２；ＰｈｉｌｐｏｔｔおよびＧｉｒａｒｄｉｎ（２００４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：１０９９−１１０８を参照）。
「標識された」組成物は、分光測光的方法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、同位体による方法または科学的方法によって、直接または間接的いずれかで検出可能である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、安定な同位体、エピトープタグ、蛍光色素、高電子密度試薬、基質もしくは酵素（例えば、酵素結合イムノアッセイにおいて使用されるものなど）、またはフルオレット（ｆｌｕｏｒｅｔｔｅ）が挙げられる（例えば、ＲｏｚｉｎｏｖおよびＮｏｌａｎ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７１３−７２８を参照）。
「リガンド」は、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである小分子、ペプチド、ポリペプチドまたは膜会合もしくは膜結合分子をいう。「リガンド」にはまた、アゴニストまたはアンタゴニストではなく、アゴニストまたはアンタゴニスト特性をもたない結合因子が包含される。慣例により、リガンドが第１の細胞上に膜結合されている場合、受容体は、通常、第２の細胞上に存在するものである。第２の細胞は、第１の細胞と同じ実体を有するものであり得るか、または異なる実体を有するものであり得る。リガンドまたは受容体は、完全に細胞内のものであり得る、すなわち、細胞質ゾル、核または一部の他の細胞内画分内に存在するものであり得る。リガンドまたは受容体は、その位置が（例えば、細胞内画分から原形質膜の外面に）変化するものであり得る。リガンドと受容体の複合体は、「リガンド受容体複合体」と称される。リガンドおよび受容体がシグナル伝達経路に関与している場合、リガンドは、シグナル伝達経路の上流の位置に存在し、受容体は下流の位置に存在する。
「代謝的に活性な」細菌には、コロニー形成が障害または実質的に抑制されるが、転写は本質的に障害されない；複製が損なわれるかまたは実質的に抑制されるが、転写は本質的に損なわれない；または細胞分裂が障害または実質的に抑制されるが、転写は本質的に損なわれない細菌、例えば、リステリア菌が包含される。「代謝的に活性な」細菌にはまた、コロニー形成、複製および／または細胞分裂が障害または実質的に抑制されるが、代謝の指標（例えば、翻訳、呼吸、発酵、解糖、運動性）は本質的に損なわれない細菌、例えば、リステリア菌が包含される。リステリア菌の代謝の種々の指示が開示されている（例えば、Ｋａｒｌｉｎら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：６１８２−６１８７；Ｇｉｌｂｒｅｔｈら（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：９５−９８を参照）。
本発明の代謝的に活性な細菌には、代謝活性レベルが、適当な親（または対照）細菌のものと比較すると、通常、親のものの少なくとも２０％、より通常では親のものの少なくとも３０％、最も通常では親のものの少なくとも４０％、典型的には親のものの少なくとも５０％、より典型的には親のものの少なくとも６０％、最も典型的には親のものの少なくとも７０％、通常、親のものの少なくとも８０％、より通常では親のものの少なくとも９０％、および最も通常では親のものと区別ができない細菌、ならびに別の態様では、親のものより大きい細菌が包含される。一部のある実施形態において、代謝活性は、総発現レベルに関して、または１種類以上の個々のタンパク質の発現レベルによって測定される。一部のある実施形態において、発現レベルは、ＲＮＡレベルで、例えば、定量によって直接的に測定されるか、またはＲＮＡ転写物の定量によって間接的に測定される。一部のある実施形態において、発現レベルは、タンパク質レベルで、例えば、タンパク質合成レベルを一般的に測定することにより測定される。
本発明の代謝的に活性な細菌には、コロニー形成、複製および／または細胞分裂が適当な親（または対照）細菌のものの５％未満であるが、代謝は、適当な親（または対照）細菌のものと比較すると、通常、親のものの少なくとも２０％、より通常では親のものの少なくとも３０％、最も通常では親のものの少なくとも４０％、典型的には親のものの少なくとも５０％、より典型的には親のものの少なくとも６０％、最も典型的には親のものの少なくとも７０％、通常、親のものの少なくとも８０％、より通常では親のものの少なくとも９０％、および最も通常では親細菌のものと区別ができない細菌、ならびに別の態様では、親のものより大きい細菌が包含される。
本発明の代謝的に活性な細菌には、コロニー形成、複製および／または細胞分裂が適当な親（または対照）細菌のものの０．５％未満であり、代謝が、適当な親（または対照）細菌のものと比較すると、通常、親のものの少なくとも２０％、より通常では親のものの少なくとも３０％、最も通常では親のものの少なくとも４０％、典型的には親のものの少なくとも５０％、より典型的には親のものの少なくとも６０％、最も典型的には親のものの少なくとも７０％、通常、親のものの少なくとも８０％、より通常では親のものの少なくとも９０％、および最も通常では親細菌のものと区別ができない細菌、ならびに別の態様では、親のものより大きい細菌が包含される。コロニー形成、複製および／または細胞分裂は、複製を容易化する（例えば、凍結状態でない）条件下で測定される。本質的に代謝的に不活性な細菌としては、限定されないが、熱殺菌された細菌が挙げられる。本質的に代謝的に不活性な細菌の残留代謝活性は、例えば、脂質の酸化、スルフヒドリルの酸化、重金属によって触媒される反応、または熱処理に対して安定な酵素によるものであり得る。
本発明の代謝的に活性なリステリア属菌には、親または野生型リステリア属菌のものの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも９０％である転写率を有するリステリア属菌が包含される。
細菌の代謝活性のレベルアッセイ方法は、当該技術分野でよく知られている。既知のアッセイ方法としては、限定されないが、タンパク質合成のＳ３５−メチオニンパルスチェイスアッセイが挙げられる（例えば、米国特許公開公報第２００４／０１９７３４３号を参照、引用により本明細書に組み込まれる）。あるいはまた、細胞生存度および代謝活性は、ＭＴＴアッセイによって測定され得る（例えば、米国特許公開公報第２００４／０１９７３４３号を参照）。
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび単鎖、二本鎖形態もしくは多重鎖形態いずれかのそのポリマーをいう。核酸という用語は、状況に応じて遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換的に使用され得る。具体的な核酸配列にはまた、暗黙に、「対立遺伝子バリアント」および「スプライスバリアント」が包含される。
「ペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸の短い配列をいう。ペプチドは、遊離または別の部分、例えば、巨大分子、脂質、オリゴ糖もしくは多糖および／またはポリペプチドなどに結合された状態で存在し得る。ペプチドがポリペプチド鎖内に組み込まれている場合、やはり、用語「ペプチド」が、該アミノ酸の短い配列を具体的に示すために使用され得る。「ペプチド」は、ペプチド結合またはなんらかの他の型の結合によって別の部分に連結されたものであり得、ペプチドは、少なくとも２アミノ酸長であり、一般的には約２５未満のアミノ酸長であり、ここで、最大長は、慣例または状況の関数である。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、互換的に使用され得る。
「タンパク質」は、一般的に、ポリペプチド鎖を構成するアミノ酸の配列をいう。タンパク質はまた、ポリペプチドの３次元構造をいうことがあり得る。「変性タンパク質」は、一部残留３次元構造あるいはまた、本質的にランダムな３次元構造、すなわち、完全に変性された構造を有する部分変性ポリペプチドをいう。本発明には、ポリペプチドバリアントを用いる方法（例えば、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、ジスルフィド結合形成、脱アミド化、異性化、シグナルもしくはリーダー配列のプロセッシングにおける切断点、共有結合および非共有結合補因子、酸化バリアントなどが挙げられる）が包含される。ジスルフィド結合タンパク質の形成が報告されている（例えば、ＷｏｙｃｅｃｈｏｗｓｋｙおよびＲａｉｎｅｓ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：５３３−５３９；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１８−２３を参照）。
「前癌性状態」には、限定されないが、異形成、新生物発生前結節；巨大再生性結節（ＭＲＮ）；低悪性度異形成性結節（ＬＧ−ＤＮ）；高悪性度異形成性結節（ＨＧ−ＤＮ）；胆道上皮異形成；改変肝細胞病巣（ＦＡＨ）；改変肝細胞の結節（ＮＡＨ）；染色体不均衡；テロメラーゼの異常な活性化；テロメラーゼの触媒性サブユニットの再発現；ＣＤ３１、ＣＤ３４およびＢＮＨ９などの内皮細胞マーカーの発現が包含される（例えば、ＴｅｒｒａｃｃｉａｎｏおよびＴｏｒｎｉｌｌｏ（２００３）Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ ９５：７１−８２；ＳｕおよびＢａｎｎａｓｃｈ（２００３）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：１２６−１３３；ＲｏｃｋｅｎおよびＣａｒｌ−ＭｃＧｒａｔｈ（２００１）Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．１９：２６９−２７８；Ｋｏｔｏｕｌａら（２００２）Ｌｉｖｅｒ ２２：５７−６９；Ｆｒａｃｈｏｎら（２００１）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３４：８５０−８５７；Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉら（２０００）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ．Ｓｕｒｇ．７：５４２−５５０；Ｎａｋａｎｕｍａら（２００３）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ．Ｓｕｒｇ．１０：２６５−２８１を参照）。癌および異形成の診断方法が開示されている（例えば、Ｒｉｅｇｌｅｒ（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｄｉｓ．７：７４−８７；Ｂｅｎｖｅｇｎｕら（１９９２）Ｌｉｖｅｒ １２：８０−８３；Ｇｉａｎｎｉｎｉら（１９８７）Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３４：９５−９７；Ａｎｔｈｏｎｙ（１９７６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３６：２５７９−２５８３を参照）。
「組換え」は、例えば、核酸、細胞、動物、ウイルス、プラスミド、ベクターなどに関して使用される場合、外来の非天然核酸の導入もしくは天然核酸の変更による改変、または組換え核酸、細胞、ウイルス、プラスミドもしくはベクターの全部もしくは一部の誘導体化による改変を示す。組換えタンパク質は、例えば、組換え核酸、ウイルス、プラスミド、ベクターなどから誘導されたタンパク質をいう。「組換え細菌」には、そのゲノムが組換え方法、例えば、変異、欠失、挿入および／または再編成によって操作された細菌が包含される。「組換え細菌」にはまた、組換えゲノム外核酸、例えば、プラスミドまたは第２の染色体を含むように改変された細菌が包含される。
「試料」は、ヒト、動物由来の試料、プラセボ、または研究用試料、例えば、細胞、組織、器官、流動体（ｆｌｕｉｄ）、ガス、エーロゾル、スラリー、コロイドもしくは凝固した材料をいう。「試料」は、例えば、ヒトもしくは動物から取り出すことなくインビボで試験され得るか、またはインビトロで試験され得る。試料は、加工処理後に、例えば組織学的方法によって試験され得る。「試料」はまた、例えば、流動体もしくは組織試料を含む細胞または流動体もしくは組織試料から分離された細胞をいう。「試料」はまた、ヒトもしくは動物から新たに取り出された細胞、組織、器官もしくは流動体、または加工処理もしくは保存された細胞、組織、器官もしくは流動体をいうことがあり得る。
「特異的に」または「選択的に」結合するとは、リガンド／受容体、核酸／相補核酸、抗体／抗原、または他の結合ペア（例えば、サイトカインとサイトカイン受容体）についていう場合、タンパク質と他の生物学的物質の不均一な集団中の該タンパク質の存在に限定的な結合反応を示す。したがって、指定された条件下では、特定のリガンドが特定の受容体に結合し、試料中に存在する他のタンパク質には有意な量で結合しない。特異的結合はまた、例えば、想定された方法の抗体の抗原結合部位由来の接合性化合物、核酸リガンド、抗体または接合性組成物がその標的に、任意の他の接合性化合物での親和性よりも多くの場合、少なくとも２５％大きい、より多くの場合では少なくとも５０％大きい、最も多くの場合では少なくとも１００％（２倍）大きい、通常、少なくとも１０倍大きい、より通常では少なくとも２０倍大きい、および最も通常では少なくとも１００倍大きい親和性で結合することを意味し得る。
好ましい実施形態において、抗体は、例えば、スキャッチャード解析で測定したとき、約１０９リットル／ｍｏｌより大きい親和性を有する（Ｍｕｎｓｅｎら（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）。当業者には、一部の接合性化合物は、１つより多くの標的に特異的に結合し得ること、例えば、抗体は、その抗原ならびにＦｃ受容体に特異的に結合することが認識されよう。
細菌の「拡散」には、「細胞から細胞への拡散」、すなわち、例えば、小胞によって媒介される第１の宿主細胞から第２の宿主細胞への細菌の伝達が包含される。拡散に関連する機能としては、限定されないが、例えば、アクチンテイルの形成、偽足様伸長の形成、および二重膜空胞の形成が挙げられる。
通常、本発明の弱毒化リステリア属菌の拡散は、親リステリア属菌株のものの最大９０％；より通常では、拡散は親菌株のものの最大８０％；最も通常では、拡散は親菌株のものの最大７０％；多くの場合、拡散は親菌株のものの最大６０％；より多くの場合では、拡散は親菌株のものの最大５０％；および最も多くの場合では、拡散は親菌株のものの最大４０％；通常、拡散は親菌株のものの最大３０％；より通常では拡散は親菌株のものの最大２０％；最も通常では、拡散は親菌株のものの最大１０％；慣用的には、拡散は親菌株のものの最大５％；より慣用的には、本発明の弱毒化リステリア属菌の拡散は、親菌株のものの最大１％であり、最も慣用的には、拡散は検出可能ではない。
「治療有効量」は、患者への利益を示す、すなわち、処置対象の状態の症状の減少、予防または改善をもたらすのに充分な試薬または医薬組成物量と定義される。薬剤または医薬組成物が診断用剤を含むものである場合、「診断有効量」は、シグナル、画像または他の診断用パラメータもたらすのに充分な量と定義される。医薬製剤の有効量は、個体の感受性の程度、年齢、性別および個体の体重、ならびに個体の特異体質応答などの要素に応じて種々である（例えば、Ｎｅｔｔｉらに発行された米国特許第５，８８８，５３０号を参照）。
「ワクチン」には、予防的ワクチンが包含される。ワクチンにはまた、治療用ワクチン、例えば、ワクチンによって提供される抗原またはエピトープと関連する状態または障害を含む哺乳動物に投与されるワクチンが包含される。
ＩＩ．概要．
本発明は、一部のある態様において、哺乳動物における癌性状態および／または感染状態などの状態の処置または予防のために、リステリア属菌、例えば、リステリア菌または他のリステリア菌種を投与する試薬および方法を提供する。一部のある実施形態において、該状態は肝臓のものであるか、またはリステリア属菌が親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を有する任意の他の器官もしくは組織のものである。一部のある実施形態において、肝臓またはリステリア属菌が親和性を有する任意の他の器官もしくは組織の免疫障害の処置または予防のためのリステリア属菌、例えば、リステリア菌または他のリステリア菌種を投与する試薬および方法が提供される。腫瘍、癌、前癌性状態、感染症および感染性障害を処置するための試薬および方法が提供される。本発明のリステリア属菌は、一般的な免疫漸増剤として供され、炎症の増大またはリステリア属菌が蓄積される１つ以上の部位において免疫細胞の活性化をもたらす。リステリア属菌は、異種抗原（例えば、腫瘍抗原）を発現するように操作する必要がないため、本発明の任意の１つの実施形態では、単に１つの腫瘍型に対してだけでなく、複数の腫瘍型（各腫瘍型は、異なる抗原性のプロフィールを発現する）に対する（または抵抗する）免疫応答が刺激され得る。
別の組織から肝臓、例えば、結腸から肝臓への転移を処置するため、ならびに肝臓から別の組織への転移を処置するための方法および試薬が提供される（例えば、ＹａｓｕｉおよびＳｈｉｍｉｚｕ（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：８６−９６；Ｒａｓｈｉｄｉら（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６：２４６４−２４６８；Ｓｔｏｅｌｔｚｉｎｇら（２００３）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１０：７２２−７３３；Ａｍｅｍｉｙａら（２００２）Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．９：３５−４７を参照）。
本発明により、肝臓におけるデノボ腫瘍形成、または肝臓の別の部分から（例えば、肝細胞、胆管上皮、内皮細胞および胆道系から）肝臓への転移、または胃腸管、結腸、直腸、卵巣、神経系、内分泌組織、神経内分泌組織、乳房、肺もしくは他の身体部分から肝臓への転移から生じた肝臓腫瘍が処置され得る（例えば、Ｌｉｕら（２００３）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９：１９３−２００；Ｃｏｒｍｉｏら（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ １３：１２５−１２９；ＳａｒｍｉｅｎｔｏおよびＱｕｅ（２００３）Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１２：２３１−２４２；Ａｔｈａｎｂａｓａｋｉｓら（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１５：１２３５−１２４０；Ｄｉａｚら（２００４）Ｂｒｅａｓｔ １３：２５４−２５８を参照）。一部のある実施形態において、肝臓内の腫瘍は、胃、結腸、下垂体、膵臓、肺、耳下腺、甲状腺、ブドウ膜黒色腫または小腸から転移したものである。一部のある実施形態において、肝臓内の腫瘍は転移性結腸直腸癌である。一部のある実施形態において、該腫瘍は転移性食道癌である。
一部のある実施形態において、本発明の方法によって処置される肝臓内の腫瘍は、原発性肝臓腫瘍である。肝臓癌は、一部のある実施形態において、肝細胞癌、胚芽細胞腫、血管肉腫または類上皮血管内皮腫であり得る。
一部のさらなる実施形態において、癌は、胆管の癌（胆管癌）または胆嚢である。
一部のある実施形態において、本発明の方法は、哺乳動物に、弱毒化リステリア属菌と、処置対象の哺乳動物における状態に対するさらなるワクチンまたは哺乳動物における癌細胞、腫瘍もしくは感染性因子に対するさらなるワクチンとの両方を投与することを含まない。一部のある実施形態において、リステリア属菌は哺乳動物に、該哺乳動物における癌細胞、腫瘍または感染性因子に対して別途生じさせたワクチン誘導型免疫応答の非存在下で投与される。一部のある実施形態において、癌性または感染状態に対するワクチンが哺乳動物において以前に投与されたことがない。一部のある実施形態において、哺乳動物において以前に投与されたことがないワクチン、または本明細書に記載の方法の一部として哺乳動物に投与されないワクチンは腫瘍ワクチン、例えば、米国特許公開公報第２００６／００５１３８０号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のＧＭ−ＣＳＦワクチンである。一部のある実施形態において、哺乳動物には、ＧＭ−ＣＳＦを発現する減弱腫瘍細胞株であるワクチンが以前に投与されたことがない。一部のある実施形態において、リステリア属菌は哺乳動物に、抗原（例えば、腫瘍抗原または感染性因子由来の抗原）との混合物として投与されない。
免疫応答の経路は、マウスおよびヒトにおいて互いに似ている。リステリア菌に対する免疫応答には、生得的応答、ならびに適応的応答が含まれる。生得的応答は、通常、好中球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＤＣ、単球／マクロファージおよびｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性の増大により確認される。生得的応答の経路は、マウスおよびヒトにおいて互いに非常によく似ている。適応的免疫の経路もまた、一般的に、マウスおよびヒトにおいて互いに似ている。要するに、リステリア属菌に対する生得的応答は、マウスおよびヒトにおいて、好中球、ＮＫ細胞および単球などの細胞の早期漸増を伴う。ＴＬＲの活性は、例えば、ＩＬ−Ｉ−Ｒ関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＬ−１８前駆体のカスパーゼ−１依存性切断の活性、またはＩＲＦ−３の活性化を測定することにより評価され得る（例えば、Ｔａｋｅｄａら（２００３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：３３５−３７６を参照）。
マウスおよびヒトのＮＫ細胞は、２つサブセットとして存在し、一方のサブセットは、ＩＬ−１２受容体サブユニット（ＩＬ−１２Ｒβ２）を高発現し、一方は、この受容体サブユニット低発現する。以下の説明は、ＮＫ細胞によって発現される阻害性受容体に関する。マウスＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞のＫＩＲに類似するｇｐ４９Ｂを発現する。マウスＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに類似するＬｙ−４９Ａを発現する。以下のことは、ＮＫ細胞上の受容体の活性化に関する。マウスおよびヒトのＮＫ細胞はともに、ＮＫＧ２Ｄを発現する（例えば、Ｃｈａｋｉｒら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４９８５−４９９３；Ｓｍｉｔｈら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１３４１−１３５４；Ｅｈｒｌｉｃｈら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：１９２２−１９３１；Ｐｅｒｉｔｔら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５８２１−５８２４を参照）。
ＮＫＴ細胞は、ヒトおよびマウスの両方に存在する。ヒトおよびマウスのＮＫＴ細胞は、グリセラミドに対して同じ反応性を示す。ヒトおよびマウスのＮＫＴ細胞はＴＬＲを発現し、表現型および機能の類似性を示す。ＮＫＴ細胞は、腫瘍に対する免疫応答を媒介し、このとき、ＤＣによって産生されるＩＬ−１２がＮＫＴ細胞に対して作用し、ＮＫＴ細胞を刺激してＩＦＮγを産生させ、今度は、これがＮＫ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化して腫瘍を死滅させる（例えば、Ｃｏｕｅｄｅｌら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４３９１−４３９７；Ｓａｋａｍｏｔｏら（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：Ｓ４４５−Ｓ４５１；Ｓａｉｋｈら（２００３）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８８：１５６２−１５７０を参照）。ＮＫＴ細胞は、リステリア属菌に対する応答においてある役割を果たしている（例えば、Ｅｍｏｔｏら（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５：５００３−５００９；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：４８３−５１３；Ｓｉｄｏｂｒｅら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１：１２２５４−１２２５９を参照）。
マウスおよびヒトの両方において、単球は、マクロファージおよび樹状細胞への前駆体である。マウスのＣＸ３ＣＲ１ｌｏｗ単球は、ヒトのＣＤ１４ｈｉｇｈＣＤ１６−単球に相当する。マウスのＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ単球は、ヒトのＣＤ１４ｌｏｗＣＤ１６ｈｉｇｈに相当する（Ｓｕｎｄｅｒｋｏｔｔｅｒら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：４４１０−４４１７）。
マウスおよびヒトはともに、２つの系統の樹状細胞を有し、該樹状細胞は、その起源をプレ（ｐｒｅ−）樹状細胞（プレＤＣ１およびプレＤＣ２）に有する。ヒトおよびマウスはともに、プレＤＣ１細胞およびプレＤＣ２細胞を有する。プレＤＣ１細胞は、成熟してＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋ＣＤ１１ｂ− ＤＣになり、これは、ＴＨ１型免疫応答誘導する特性を有する。プレＤＣ２細胞は成熟してＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−ＣＤ１１ｂ＋ＤＣになり、これは、ＴＨ２型免疫応答を誘導する特性を有する（Ｂｏｏｎｓｔｒａら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１０１−１０９；Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇら（２００１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７２：１９４６−１９５１；Ｂｅｃｋｅｒ（２００３）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２６：１１９−１３０）。マウスおよびヒトはともに、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を有し、マウスおよびヒトのｐＤＣはともに、ウイルス刺激に応答してインターフェロン−αを発現する（Ｃａｒｉｎｅら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：６４６６−６４７７）。さらに、マウスおよびヒトはともに骨髄系ＤＣを有し、例えば、マウスおよびヒトの骨髄系ＤＣはともにＣＣＬ１７を発現し得る（Ｐｅｎｎａら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：６６７３−６６７６；Ａｌｆｅｒｉｎｋら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：５８５−５９９）。
マウスおよびヒトはともに、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を有する。マウスおよびヒトのＣＤ８＋ Ｔ細胞はともに、類似したサブセット、すなわち、中心記憶Ｔ細胞およびエフェクター記憶Ｔ細胞を含む（例えば、Ｗａｌｚｅｒら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：２７０４−２７１１を参照）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の免疫応答は、マウスおよびヒト両方のＣＤ８＋ Ｔ細胞で類似しており、例えば、ＣＤ１２７およびＩＬ−２の発現にも当てはまる（Ｆｕｌｌｅｒら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：５９２６−５９３０）。
以下の説明は、ＤＣのリステリア属菌誘導型成熟に関する。リステリア菌は、ヒトおよびマウス両方の樹状細胞の成熟を刺激し、これは、例えば、ＣＤ８６のリステリア菌刺激発現によって測定される（例えば、Ｋｏｌｂ−ｍａｕｒｅｒら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６８：３６８０−３６８８；Ｂｒｚｏｚａら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２６４１−２６５１；Ｅｓｐｌｕｇｕｅｓら（２００５）Ｂｌｏｏｄ Ｆｅｂ．３（印刷前に電子公開（ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ））；Ｐａｓｃｈｅｎら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３４４７−３４５６を参照）。
マウスおよびヒトの好中球はともに、リステリア属菌によって刺激される（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１０９４８−１０９５３；Ｔｏｒｒｅｓら（２００４）７２：２１３１−２１３９；Ｓｉｂｅｌｉｕｓら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６７：１１２５−１１３０；Ｔｖｉｎｎｅｒｅｉｍら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：１９９４−２００２を参照）。好中球は、マーカーＧｒ−１（Ｇｒ１およびＬｙ−６Ｇとしても知られる）によって検出または特性評価され得る。Ｇｒ−１の測定方法は利用可能である（例えば、Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒら（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０１：２２１９−２２２６；Ｂｌｉｓｓら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４５１５−４５２１を参照）。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、約１０個の受容体からなるファミリーを構成し、細菌成分、ウイルス成分、ならびにその類縁体、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、リポタイコ酸、ペプチドグリカン成分、リポタンパク質、核酸、フラジェリンおよびＣｐＧ−ＤＮＡに対する生得的応答を媒介する。ヒトおよびマウスはともに、以下のｔｏｌｌ様受容体：ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９を発現する（ＪａｎｓｓｅｎｓおよびＢｅｙａｅｒｔ（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｒｅｖｓ．１６：６３７−６４６）。
マウスおよびヒト系によるリステリア菌に対する応答は、ＩＦＮ−γの発現を伴う（例えば、ＷａｙおよびＷｉｌｓｏｎ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：５９１８−５９２２；Ｏｕａｄｒｈｉｒｉら（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８０：１１９５−１２０４；Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：３４３−３５４；Ｃａｌｏｒｉｎｉら（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １９：２５９−２６４；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５６００−５６０６を参照）。
マウスおよびヒト両方の系によるリステリア菌に対する応答は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の発現を伴う（例えば、Ｆｌｏら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２０６４−２０６９；Ｃａｌｏｒｉｎｉら（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １９：２５９−２６４；Ｂｒｚｏｚａら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２６４１−２６５１を参照）。
マウスおよびヒト試験によって示されるリステリア菌に対する応答は、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）の発現を伴う（例えば、Ｂｒｚｏｚａら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２６４１−２６５１；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６４：１９０６−１９１２；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５６００−５６０６を参照）。
ＣＤ６９は、マウスおよびヒト免疫細胞の試験において測定された免疫細胞の活性化マーカーである（例えば、Ｐｉｓｅｇｎａら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：６８−７４；Ｇｅｒｏｓａら（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：３２７−３３３；Ｂｏｒｒｅｇｏら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９７：１５９−１６５を参照）。
以下のことは、サイトカイン、例えば、インターフェロン−γおよびＭＣＰ−１に関する。インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は、ヒトおよびマウス両方によって発現される。ＩＦＮ−γは、腫瘍および微生物病原体に対する免疫系の応答、ならびに腫瘍血管形成に対する免疫系の応答における重要なサイトカインである。ＩＦＮ−γは、例えば、肝炎ウイルスに対するワクチンを投与、ＩＦＮ−γの投与、または抗ＩＦＮ抗体を投与する試験によって、肝臓腫瘍およびウイルス性肝炎に対する免疫応答を媒介する（例えば、ＧｒａｓｓｅｇｇｅｒおよびＨｏｐｆｌ（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２９：５８４−５８８；ＴａｎｎｅｎｂａｕｍおよびＨａｍｉｌｔｏｎ（２０００）Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１０：１１３−１２３；ＢｌａｎｋｅｎｓｅｔｅｉｎおよびＱｉｎ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１４８−１５４；Ｆｉｄｌｅｒら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：４２８９−４２９６；Ｏｋｕｓｅら（２００５）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．６５：２３−３４；Ｐｉａｚｚｏｌｌａら（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１４２−１５２；Ｘｕら（２００５）Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：２６５８−２６６４；Ｉｒｉｅら（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１１：２３８−２４５を参照）。
単球化学誘引性タンパク質（ＭＣＰ−１；ＣＣＬ２）は、ヒトおよびマウスによって発現される。ＭＣＰ−１は、腫瘍のマクロファージ浸潤を促進する。ＭＣＰ−１は、ウイルス性肝炎感染症に対する免疫応答を媒介する。さらに、投与されたＭＣＰ−１は、マクロファージによる腫瘍根絶を促進する。他の試験では、ＭＣＰ−１を、ウイルス性肝炎に対する薬物療法の有効性と相関させた（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：１−７；Ｌｕｏら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３７０８−３７１６；Ｐａｎａｓｉｕｋら（２００４）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０：３６６３９−３６４２を参照）。
免疫応答は、タンパク質、ペプチド、タンパク質もしくはペプチドを発現する細胞、ならびに核酸、オリゴ糖、糖脂質および脂質などの他の存在体に対する応答を伴うものであり得る。例えば、ウイルスに対する免疫応答は、該ウイルスのペプチド、該ウイルスの核酸、該ウイルスの糖脂質、または該ウイルスのオリゴ糖に対する免疫応答を含み得る（例えば、Ｒｅｋｖｉｇら（１９９５）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：５９３−６０２；Ｗａｉｓｍａｎら（１９９６）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：７−１４；Ｃｅｒｕｔｔｉら（２００５）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：３２７−３３３；Ｏｓｃｈｍａｎｎら（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２５：２９２−２９７；ＰａｒａｄｉｓｏおよびＬｉｎｄｂｅｒｇ（１９９６）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．８７：２６９−２７５を参照）。
広範な腫瘍、ウイルス、細菌および他の病原体が、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞によって攻撃される。ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の標的としては、例えば、結腸腺癌、神経芽細胞腫、肉腫、リンパ腫、乳癌、黒色腫、赤白血病性腫瘍、白血病、肥満細胞腫、結腸癌、乳腺癌、卵巣腺癌、線維肉腫、黒色腫、肺癌、横紋筋肉腫、グリオーム、腎細胞癌、胃癌、肺小細胞癌、肝臓への転移から生じた癌、ならびに一連のウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス、ガンマヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ＨＩＶ、デング熱ウイルス、および一連の細菌（例えば、マイコプラズマ属菌やブルセラ菌が挙げられる（例えば、Ｖｕｊａｎｏｖｉｃら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１１１７−１１２６；Ｋａｓｈｉｉら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５３５８−５３６６；Ｇｉｅｚｅｍａｎ−Ｓｍｉｔｓら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：７１−７６；Ｔｕｒｎｅｒら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：８９−９４；Ｋａｗａｒａｄａら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：５２４７−５２５３；Ｓｃｏｔｔ−ＡｌｇａｒａおよびＰａｕｌ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２：７５７−７６８；Ｋａｒｎｂａｃｈら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２５６９−２５７６；Ｗｅｓｔｗｏｏｄら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：７５７−７６１；Ｒｏｄａら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１６１９−１６２７；Ｐｏｇｇｉら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：２６５３−２６６０；Ｍｅｔｅｌｉｔｓａら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：３１１４−３１２２；Ｗｅｉら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：３８１１−３８１９；Ｂａｋｋｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５２３９−５２４５；Ｍａｋｒｉｇｉａｎｎｉｓら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：１４１４−１４２５；Ｇｏｌｄｉｎｇら（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．３：４３−４８；Ｌａｉら（１９９０）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６１：１２６９−１２７５；Ｏｈｇａら（２００２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４４：２０３−２１５；Ｗａｋｉｍｏｔｏら（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：９８３−９９０；Ｃｈｅｎら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．１２：３８−４５；Ｂａｂａら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：４７−６０；Ｌｉら（２００４）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７６：１１７１−１１７９；Ｓｃａｌｚｏ（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：４７０−４７４；ＡｈｌｅｎｓｔｉｅｌおよびＲｅｈｅｒｍａｎｎ（２００５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１：６７５−６７７；Ｃｈｅｎら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．１２：３８−４５；ＳｕｎおよびＧａｏ（２００４）Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２７：１５２５−１５３９；Ｌｉら（２００４）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７６：１１７１−１１７９；ＡｈｍａｄおよびＡｌｖａｒｅｚ（２００４）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７６：７４３−７５９；Ｃｏｏｋ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．９：１２３９−１２４７；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＲｉｏｒｄａｎ（２０００）Ｊ．Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１５（Ｓｕｐｐｌ．）Ｇ１７−Ｇ２５；ＶａｒａｎｉおよびＬａｎｄｉｎｉ（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．４８：３９−４４；Ｒｕｂｉｎ（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．１：４３９−４５２；Ｌｏｈら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：６６１−６６７；Ｓｈｒｅｓｔａら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１９：２６２−２７３；Ｆｊａｅｒら（２００５）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ９：６８−７３；Ｌｉら（２００４）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０：３４０９−３４１３；Ｃｏｌｌｉｎら（２００４）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．４１：１７４−１７５；Ｏｈｇａら（２００２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４４：２０３−２１５を参照）。
本発明には、標的細胞のＮＫ細胞媒介型死滅の刺激方法が包含され、非限定的な例を示すと、標的細胞が阻害性リガンドの発現の低下を有する場合、および阻害性リガンドがＭＨＣクラスＩであり得る場合である。ＮＫ細胞は、癌細胞およびウイルス感染細胞などの広範な標的細胞を溶解させ、このとき、ＮＫ細胞媒介型溶解により、標的細胞がＭＨＣクラスＩの低発現を有する場合が増加する。多くのまたは大部分の腫瘍細胞、発癌性のウイルスに感染した細胞および非発癌性のウイルスに感染した細胞は、ＭＨＣクラスＩの低発現を示す。ＣＴ２６細胞、ＭＣ３８細胞およびＹＡＣ−１細胞は、低レベルのＭＨＣクラスＩを発現し得る（例えば、ＴａｒｄｉｆおよびＳｉｄｄｉｑｕｉ（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１６４４−１１６５０；Ｉｍｂｏｄｅｎら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：１５００−１５０７；Ｍａｔｓｕｉら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８５：５０８−５１７；Ｙｏｏｎら（２００１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：４０３１−４０４０；Ｂｕｂｅｎｉｋ（２００３）Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．１０：２００５−２００８；ＤｉｅｆｅｎｂａｃｈおよびＲａｕｌｅｔ（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８８：９−２１；Ｋｈａｋｏｏら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：８７２−８７３；Ｐａｒｈａｍ（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：７８６−７８７を参照）。ＹＡＣ−１細胞は、ＮＫ細胞の典型的な（ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃ）標的であり、ＮＫ細胞媒介型溶解を伴う実験に広く使用されている（例えば、Ｋａｔｓｕｍｏｔｏら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９６７−４９７５；Ｙａｎら（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１２：１０５−１１６；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０３：５０８−５１３；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３７２３−３７３１を参照）。ＣＴ２６細胞およびＭＣ３８細胞は、低レベルのＭＨＣクラスＩを発現する（Ｓｅｏｎｇら（２００１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：４０３１−４０３９；Ｓｕら（２００１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８０：５０３−５１２）。ＣＴ２６腫瘍細胞はＢａｌｂ／ｃマウス由来のものであり、一方、ＭＣ３８ 腫瘍細胞はＣ５７Ｂｌ／６マウス由来のものである。Ｂａｌｂ／ｃマウスはＨ−２ｄであり、ＭＨＣクラスＩ分子の２Ｋｄ、２Ｌｄおよび２Ｄｄ ＭＨＣ型を発現する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＨ−２ｂであり、ＭＨＣクラスＩ分子の２Ｋｂおよび２Ｄｂ型を発現する（例えば、Ｓｋｏｂｅｒｎｅら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１４１０−１４１８；Ｇｅｇｉｎａｔら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１８７７−１８８４を参照）。Ｂａｌｂ／ｃマウスはＴｈ２型レスポンダーであり、一方、Ｃ５７Ｂ１／６マウスはＴｈ１型レスポンダーである。ＭＣ３８腫瘍細胞は報告されている（例えば、Ｆｅｌｄｍａｎら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：１５０３−１５０６；Ｗｉｌｄｎｅｒら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：５２３３−５２３８を参照）。
ＮＫ細胞はまた、広範な寄生性生物体および原生動物、例えば、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症およびマラリアの原因となるものなどを排除し得る（例えば、Ｋｏｒｂｅｌら（２００４０ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３４：１５１７−１５２８；Ｍａｖｏｕｎｇｏｕら（２００３）Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１４：１３４−１４２；ＤｏｏｌａｎおよびＨｏｆｆｍａｎ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：８８４−８９２を参照）。
本発明の一部のある実施形態において、本明細書に記載の方法におけるリステリア属菌の投与により、生得的免疫応答が刺激される。例えば、本発明は、ＮＫ媒介型生得的免疫応答（例えば、ＮＫ媒介型抗腫瘍応答）を刺激するためにリステリア属菌を使用する方法を提供する。一部のある実施形態において、哺乳動物へのリステリア属菌の投与により、後天性免疫応答が刺激される（用語「適応的免疫応答」および「後天性免疫応答」は、本明細書において互換的に用いる）。一部のある実施形態において、適応的免疫応答は全身性の腫瘍特異的記憶応答を含む。一部のある実施形態において、適応的免疫応答は、ＣＤ４＋免疫応答および／またはＣＤ８＋免疫応答である。一部のある実施形態において、リステリア属菌の投与により、生得的免疫応答ならびに後天性免疫応答の両方が刺激される。一部のある実施形態において、免疫応答（先天的および／または適応的応答である）により、以下：腫瘍または癌細胞の数、腫瘍質量および感染性因子の力価のうちの１つまたは任意の組合せにおける低減がもたらされる。一部のある実施形態において、該低減は、哺乳動物へのリステリア属菌の投与前の数、質量または力価に相対的なものである。
一部のある実施形態において、哺乳動物へのリステリア属菌の投与により、ａ．ＮＫ細胞；ｂ．ＮＫＴ細胞；ｃ．樹状細胞（ＤＣ）；ｄ．単球もしくはマクロファージ；ｅ．好中球；またはｆ．ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）またはヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質のうちの１つまたは任意の組合せが刺激される（例えば、有効量の弱毒化リステリア属菌の投与の非存在下での免疫応答と比べて）。一部のある実施形態において、哺乳動物へのリステリア属菌の投与により生じる免疫応答によって、ＮＫ細胞が活性化される。一部のある実施形態において、哺乳動物へのリステリア属菌の投与により、肝臓におけるＮＫ細胞の数の増加および／または肝臓における白血球のうちのＮＫ細胞の割合の増加がもたらされる（リステリア属菌の投与前の哺乳動物に対して）。
本発明にはまた、哺乳動物が肝白血球を含み、投与により、ａ．弱毒化リステリア属菌の投与なしでの割合と比べたＮＫ細胞である肝白血球の割合の増加；またはｂ．弱毒化リステリア属菌の投与なし（もしくは投与前）での発現と比べた肝ＮＫ細胞による活性化マーカーの発現の増大の一方または両方が刺激される方法が包含される。本発明は、さらに、ＮＫ細胞である肝白血球の割合の増加が、弱毒化リステリア属菌の投与なし（もしくは投与前）での割合と比べて、少なくとも：ａ．５％；ｂ．１０％；ｃ．１５％；ｄ．２０％；またはｅ．２５％大きい方法を提供する。
本発明には、哺乳動物へのリステリア属菌の投与により、ａ．ＣＤ６９；ｂ．インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）；ｃ．インターフェロン−α（ＩＦＮα）もしくはインターフェロンβ（ＩＦＮβ）；ｄ．インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、単球化学誘引性タンパク質（ＭＣＰ−１）、またはｅ．インターロイキン−６（ＩＬ−６）のいずれか１つまたは任意の組合せの発現の増大（例えば、有効量の弱毒化リステリア属菌の投与の非存在下での発現と比べて）が刺激される方法が包含される。
ＩＩＩ．感染症の処置
本発明は、一部のある実施形態において、感染症、例えば、肝臓の感染症に対する免疫応答を刺激するための方法および試薬を提供する。感染状態には、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症および寄生虫侵入が包含される。一部のある実施形態において、感染状態は、非リステリア属菌感染状態である。一部のある実施形態において、感染症は肝臓におけるものである。また、考えられ得る感染性因子としては、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫が挙げられる。一部のある実施形態において、感染性因子は非リステリア属菌感染性因子である。一部のある実施形態において、感染性因子は肝親和性である。
一部のある実施形態において、感染状態としては、肝親和性ウイルスならびに肝炎を媒介するウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびサイトメガロウイルスによる感染症が挙げられる。本発明では、他の肝親和性ウイルス、例えば、単純疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルスおよびデング熱ウイルスなどを処置するための方法が想定される。例えば、ＮＫ細胞は、これらのウイルスに対する免疫応答を媒介することが示されている（例えば、上記の引用文を参照）。
一部のある実施形態において、感染性因子は、ヒト免疫不全ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス；単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１型および２型；サイトメガロウイルス；メタニューモウイルス；エプスタイン−バーウイルス；水痘−帯状疱疹ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；デルタ肝炎ウイルス；Ｅ型肝炎ウイルス；ならびに肝炎Ｇウイルスからなる群より選択される。さらなる実施形態において、感染性因子は、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルスなど）；カルシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科（例えば、ロタウイルスなど）；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、狂犬病ウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ、ＢおよびＣ型など）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルスなど）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科；パピローマウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス；などの科の任意の１つに由来するウイルスである。これらおよび他のウイルスの説明については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編．１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．ＫｎｉｐｅおよびＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編．１９９６）を参照。
別の態様では、本発明は、寄生虫感染症、例えば、肝臓の寄生虫感染症の処置および／または予防のための方法および試薬を提供する。これらとしては、限定されないが、肝吸虫（例えば、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）、リーシュマニア属、Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、およびｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓが挙げられる。蠕虫としては、例えば、線虫（回虫）、多節条虫類（サナダムシ）および吸虫（扁形動物または吸虫類）が挙げられる。ＮＫ細胞ならびに他の免疫細胞は、これらの感染症に応答する（例えば、Ｔｌｉｂａら（２００２）Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３３：３２７−３３２；ＫｅｉｓｅｒおよびＵｔｚｉｎｇｅｒ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５：１７１１−１７２６；Ｋａｅｗｋｅｓ（２００３）Ａｃｔａ Ｔｒｏｐ．８８：１７７−１８６；Ｓｒｉｖａｔａｎａｋｕｌら（２００４）Ａｓｉａｎ Ｐａｃ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．５：１１８−１２５；Ｓｔｕａｆｆｅｒら（２００４）Ｊ．Ｔｒａｖｅｌ Ｍｅｄ．１１：１５７−１５９；Ｎｙｌｅｎら（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：４５７−４６７；Ｂｕｋｔｅら（２００４）Ａｂｄｏｍ．Ｉｍａｇｉｎｇ ２９：８２−８４；ＳｉｎｇｈおよびＳｉｖａｋｕｍａｒ（２００３）４９：５５−６０；Ｗｙｌｅｒ（１９９２）Ｐａｒｉｓｉｔｏｌ．Ｔｏｄａｙ ８：２７７−２７９；Ｗｙｎｎら（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０１：１５６−１６７；Ａｓｓｅｍａｎら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．５４：１１−２０；Ｂｅｃｋｅｒら（２００３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１３０：６５−７４；ＰｏｃｋｒｏｓおよびＣａｐｏｚｚａ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｒｅｐ．７：６１−７０；Ｈｓｉｅｈら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２６９９−２７０４；Ｋｏｒｔｅｎら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：５１９９−５２０６；ＰｏｃｋｒｏｓおよびＣａｐｏｚｚａ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｒｅｐ．６：２８７−２９６を参照）。
本発明のまた別の態様は、例えば肝親和性細菌による細菌感染症の処置および／または予防のための方法および試薬を提供する。例えば、ヒト結核菌、梅毒トレポネーマおよびサルモネラ属菌種を処置するための方法および試薬が提供される。ＮＫ細胞ならびに他の免疫系の細胞は、これらの細菌感染症に応答する（例えば、Ｃｏｏｋ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．９：１２３９−１２４７；Ｖａｎｋａｙａｌａｐａｔｉら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：１３０−１３７；Ｓｅｌｌａｔｉら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：４１３１−４１４０；Ｊａｓｏｎら（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ．１８２：４７４−４８１；Ｋｉｒｂｙら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：４４５０−４４５９；ＪｏｈａｎｓｓｏｎおよびＷｉｃｋ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２４９６−２５０３；Ｈａｙａｓｈｉら（２００４）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．４３：５２１−５２３；Ａｋｃａｙら（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．５８：６２５−６２７；ｄｅ ｌａ Ｂａｒｒｅｒａら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１０５−１１３を参照）。一部のある実施形態において、感染性因子は、細菌病原体、例えば、マイコバクテリウム属菌、バチルス属菌、エルシニア属菌、サルモネラ属菌、ナイセリア属菌、ボレリア属菌、クラミジア属菌またはボルデテラ属菌などである。一実施形態において、感染性因子は、ヒト結核菌、炭疽菌またはペスト菌である。
一部のある実施形態において、感染状態は、ａ．Ｂ型肝炎；ｂ．Ｃ型肝炎；ｃ．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；ｄ．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；ｅ．エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）；またはｆ．リーシュマニア症の１つ以上を含む。同様に、一部のある実施形態において、感染性因子は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、またはリーシュマニア症である。一部のさらなる実施形態において、感染性因子は、ポリオーマウイルスまたはヒトパピローマウイルスである。
一部のさらなる実施形態において、感染状態は、ジフテリア、百日咳、破傷風、ヒト型結核、細菌性または肺炎、中耳炎、淋病、コレラ、腸チフス、髄膜炎、単核球増加症、ペスト、細菌性赤痢またはサルモネラ症、レジオネラ症、ライム病、ハンセン病、マラリア、鉤虫、オンコセルカ症、住血吸虫症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ジアルジア、アメーバ症、フィラリア症、ボレリア（Ｂｏｒｅｌｉａ）および旋毛虫病からなる群より選択される。
ＩＶ．リステリア属菌の遺伝子およびタンパク質（ビルレンス因子を含む）
リステリア菌は、宿主における増殖またはコロニー形成に寄与する種々の遺伝子および遺伝子産物を発現する。このような遺伝子および遺伝子産物の一部は、「ビルレンス因子」に分類される。ビルレンス因子は、宿主細胞の細菌感染を容易化する。このようなビルレンス因子としては、ａｃｔＡ、リステリオリシン（ＬＬＯ）、タンパク質６０（ｐ６０）、インターナリンＡ（ｉｎｌＡ）、インターナリンＢ（ｉｎｌＢ）、ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ；ｐｌｃＡ遺伝子）が挙げられる。いくつかの他のインターナリン、例えば、ＩｎｌＣ２、ＩｎｌＤ、ＩｎｌＥおよびＩｎｌＦは、特性評価されている（Ｄｒａｍｓｉら（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５：１６１５−１６２５）。プロＰＬ−ＰＬＣを活性なＰＬ−ＰＬＣにプロセッシングするメタロプロテアーゼＭｐｌもまた、ビルレンス因子である（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９０：１６７−１７４；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０００）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８２：８３７−８４１）。このようなビルレンス因子、ならびに増殖もしくは拡散に寄与するいくつかの他の因子をコードする核酸配列のいくつかの非限定的な例を以下に開示する。本発明は、表１に開示する実施形態の一覧に限定されず、本発明は、表１の配列の１つ以上が改変、変異または弱毒化されたリステリア属菌を提供する。表１により、当業者が種々のリステリア菌株の対応する遺伝子またはコード配列を特定すること、および癌、腫瘍、前癌性障害または感染（例えば、肝臓のもの）の処置における使用のための弱毒化リステリア菌を作製することが可能になる。
Figure 2009504786
Figure 2009504786
ｈｌｙ遺伝子にコードされるリステリオリシン（ＬＬＯ）は、ファゴリソソームから宿主細胞の細胞質への細菌の逸出を媒介する。ＬＬＯはまた、１つの宿主細胞から隣接宿主細胞への細菌の有効な移動を媒介する。拡散中、ＬＬＯは、二重膜小胞から隣接細胞の細胞質への細菌の逸出を媒介する（例えば、Ｇｌｏｍｓｋｉら（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：６７５４−６７６５；Ｇｅｄｄｅら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：９９９−１００３；Ｇｌｏｍｓｋｉら（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５６：１０２９−１０３８；Ｄｕｂａｉｌら（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４７：２６７９−２６８８；ＤｒａｍｓｉおよびＣｏｓｓｓａｒｔ（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５６：９４３−９４６を参照）。
ＡｃｔＡは、宿主細胞のアクチンを漸増させるリステリア属菌の表面タンパク質である。換言すると、ＡｃｔＡは、細菌の表面上で行なわれる宿主細胞アクチンおよび細胞骨格の他のタンパク質の合成のための骨格としての機能を果たす。ＡｃｔＡは、宿主細胞の細胞質中へのリステリア属菌の推進を媒介する。ＡｃｔＡ変異体は、食作用性空胞から逸出し得るが、宿主細胞質ゾル内部で「微小コロニー」として増殖し、細胞から細胞へと拡散しない（例えば、Ｍａｃｈｎｅｒら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４００９６−４０１０３；Ｌａｕｅｒら（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１６３−１１７７；Ｐｏｒｔｎｏｙら（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５８：４０９−４１４を参照）。
インターナリンＡは、哺乳動物の膜結合タンパク質Ｅ−カドヘリンのリガンドである。インターナリンＢは、少数の哺乳動物の膜結合タンパク質、例えば、Ｍｅｔ受容体（ＨＧＦ−Ｒ／Ｍｅｔとしても知られる）およびｇＣｌｑ−Ｒ、およびプロテオグリカンのリガンドである。リステリア菌は、インターナリン関連タンパク質ファミリーの約２４の構成員、例えば、ｉｒｐＡ遺伝子にコードされたインターナリンを発現し得る（例えば、ＢｉｅｒｎｅおよびＣｏｓｓａｒｔ（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１５：３３５７−３３６７；Ｓｃｈｌｕｔｅｒら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：５９３０−５９３８；Ｄｏｒｍａｎｎら（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１０１−１０９を参照）。
ソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）タンパク質は、インターナリンＡのプロセッシングおよび成熟を触媒する。２種類のソルターゼ、ｓｒｔＡおよびｓｒｔＢがリステリア菌において同定されている。ｓｒｔＡ変異体は、ヒト腸細胞および肝細胞を用いた試験で測定されるように、細菌インターナリゼーションが欠損している。したがって、成熟インターナリンＡは、腸細胞および肝細胞による取込みに必要である。ｓｒｔＡ変異体は、他の取込み機構（例えば、インターナリンなど）を利用し得る細胞（例えば、ＩｎｌＢなど）によってもなお取り込まれ得る（例えば、Ｂｉｅｒｎｅら（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：８６９−８８１を参照）。
２種類のホスホリパーゼ、ＰＩ−ＰＬＣ（ｐｌｃＡ遺伝子にコードされる）およびＰＣ−ＰＬＣ（ｐｌｃＢ遺伝子にコードされる）もまた、ビルレンス因子に含まれる。ＰＩ−ＰＬＣは、宿主のファゴソームの溶解を媒介し、細胞質ゾル内への細菌の逸出を可能にする。ＰＣ−ＰＬＣにおける細菌の変異体は、ビルレンスの低下を示し、細胞から細胞への伝達を媒介する二重膜小胞内に蓄積することがわかっている（例えば、Ｃａｍｉｌｌｉら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１４３−１５７；Ｓｃｈｕｌｔｅｒら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：５９３０−５９３８を参照）。
ｉａｐ遺伝子にコードされるタンパク質ｐ６０は、細胞内移動および細胞から細胞への拡散を媒介する。ｉａｐ遺伝子変異体における細胞内移動および拡散は、ずっと低減されている（Ｐｉｌｇｒｉｍら（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：３４７３−３４８４）。
本発明ではまた、少なくとも１つの調節因子、例えば、プロモーターまたは転写因子において弱毒化されたリステリア属菌が想定される。ＡｃｔＡ発現は、２種類の異なるプロモーター（１つは、ａｃｔＡのすぐ上流、第２のものは、ａｃｔＡの上流のｍｐｌ遺伝子の前）によって調節される（Ｌａｕｅｒら（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７−４１８６）。本発明は、特定のある実施形態において、少なくとも１つのａｃｔＡプロモーターが不活化、変異または欠失されたコード核酸を提供する。転写因子ｐｒｆＡは、いくつかのリステリア菌遺伝子、例えば、ｈｌｙ、ｐｌｃＡ、ａｃｔＡ、ｍｐｌ、ｐｒｆＡおよびｉａｐの転写に必要とされる。ＰｒｆＡの調節特性は、例えば、ＰｒｆＡ依存性プロモーター（ＰｉｎｌＣ）およびＰｒｆＡ−ボックスによって媒介される。本発明は、一部のある実施形態において、ＰｒｆＡ、ＰｉｎｌＣ、ＰｒｆＡ−ボックスなどの少なくともつにおいて不活化、変異または欠失されたコード核酸を提供する（例えば、Ｌａｌｉｃ−Ｍｕｌｌｔｈａｌｅｒら（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１１−１２０；Ｓｈｅｔｒｏｎ−Ｒａｍａら（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：１５３７−１５５１；Ｌｕｏら（２００４）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：３９−５２を参照）。同時に、ｉｎｌＡおよびｉｎｌＢは、５つのプロモーターによって調節される（Ｌｉｎｇｎａｕら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８９６−３９０３）。本発明は、特定のある実施形態において、これらのプロモーターの１つ以上において弱毒化されたリステリア属菌を提供する。
本発明はまた、ＤＮＡ架橋剤（例えば、ソラレン）での処理によって、およびＤＮＡ修復を媒介する少なくとも１つの遺伝子、例えば、組換え修復遺伝子（例えば、ｒｅｃＡ）または紫外光損傷修復遺伝子（例えば、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＡＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、ｐｈｒＡ、ｐｈｒＢ）を不活化することによって弱毒化されたリステリア属菌の細菌を提供する（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙらの米国特許公開公報第２００４／０２２８８７７号およびＤｕｂｅｎｓｋｙらの米国特許公開公報第２００４／０１９７３４３号を参照）。
本発明のリステリア属菌は、例えば、プラスミド系構築物および／またはゲノム構築物によって、抗生物質耐性遺伝子または抗生物質耐性マーカーを、例えば、リステリア菌ゲノムの一部として、またはプラスミドとして含むように操作される。抗生物質耐性遺伝子は、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；ペニシリン結合タンパク質２；エリスロマイシン耐性決定因子；ペニシリンβ−ラクタマーゼ；またはアミノグリコシドアセチルトランスフェラーゼであり得る（例えば、Ｇｕｏら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：４０−４６；Ｌａｎｇｅｒら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３０６７−３０７７；Ｇｒｉｎｄｌｅｙ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：Ｒ６０８−Ｒ６１２；Ｑｉａｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：７７９４−７８０５；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（２００５）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ｐ．２０を参照）。
Ｖ．リステリア属菌
一部のある実施形態において、リステリア属菌は、リステリア菌種に属するものである。一部のある択一的な実施形態において、該細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ＷｅｌｓｈｉｍｅｒｉまたはＬ．ｇｒａｙｉ種の構成員である。
一部のある実施形態において、該リステリア属菌は、天然に存在しないものである。一部のある実施形態において、リステリア属菌は変異体リステリア属菌、組換えリステリア属菌、または別の方法で改変されたものである。一部のある実施形態において、リステリア属菌は弱毒化されたものである。一部のある実施形態において、リステリア属菌は代謝的に活性である。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、細胞質ゾル内に侵入し得る（すなわち、細胞内で食作用性空胞から細胞質ゾルに到達し得る）ものである。
一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌は、増殖、細胞から細胞への拡散、宿主細胞への結合もしくはその内部への侵入、複製またはＤＮＡ修復の１つ以上において弱毒化されている。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、ａｃｔＡ変異、ｉｎｌＢ変異、ｕｖｒＡ変異、ｕｖｒＢ変異、ｕｖｒＣ変異、核酸標的化化合物またはｕｖｒＡＢ変異および核酸標的化化合物の１つ以上によって弱毒化される。一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌は、細胞から細胞への拡散および／または非食作用性細胞内への侵入において弱毒化されている。一部のある実施形態において、リステリア属菌が、ａｃｔＡ変異またはａｃｔＡ変異とｉｎｌＢ変異の１つ以上によって弱毒化される。一部のある実施形態において、リステリア属菌はΔａｃｔＡまたはΔａｃｔＡΔｉｎｌＢである。
一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌は、細胞から細胞への拡散について弱毒化されている。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、細胞から細胞への拡散について弱毒化され、ＡｃｔＡに関して欠損している（例えば、非改変または野生型リステリア属菌に対して）。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、ａｃｔＡ遺伝子に弱毒化変異を含む。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、ａｃｔＡ遺伝子に完全または部分欠失を含む。
一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌の細菌が細胞から細胞への拡散する能力は、弱毒化変異のないリステリア属菌（例えば、野生型リステリア属菌）に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９０％低減される。一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌の細菌が細胞から細胞への拡散する能力は、弱毒化変異のないリステリア属菌に対して少なくとも約２５％低減される。一部のある実施形態において、細胞から細胞への拡散について弱毒化された弱毒化リステリア属菌の細菌の能力は、弱毒化変異のないリステリア属菌に対して少なくとも約５０％低減される。
リステリア属菌の細菌が、細胞から細胞への拡散について弱毒化されているか否かを調べるためのインビトロアッセイは、当業者に知られている。例えば、選択した培養細胞単層の感染後に経時的に形成されるプラークの直径が測定され得る。Ｌ２細胞単層におけるプラークアッセイが、Ｓｕｎ、Ａ．、Ａ．Ｃａｍｉｌｌｉ、ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｐｏｒｔｎｏｙ．１９９０、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｍａｌｌ−ｐｌａｑｕｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ ｓｐｒｅａｄ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：３７７０−３７７８に既報の方法のようにして、測定方法を、Ｓｋｏｂｌｅ、Ｊ．、Ｄ．Ａ．Ｐｏｒｔｎｏｙ、ａｎｄ Ｍ．Ｄ．Ｗｅｌｃｈ．２０００、Ｔｈｒｅｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ＡｃｔＡ ｐｒｏｍｏｔｅ Ａｒｐ２／３ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｎ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｍｏｔｉｌｉｔｙ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５０：５２７−５３８に記載のように改良して行なわれ得る。簡単には、Ｌ２細胞をコンフルエントまで６ウェル組織培養皿にて培養し、次いで、細菌に１時間感染させる。感染後、４０℃まで加温し、０．８％アガロース、ウシ胎児血清（例えば、２％）および所望の濃度のゲンタマイシンを含有するＤＭＥで構成された培地に細胞を重層する。培地中のゲンタマイシンの濃度は、プラークの大きさに劇的に影響し、選択されたリステリア属菌株が細胞から細胞への拡散を行なう能力のめやすとなる（Ｇｌｏｍｓｋｉ、Ｉ Ｊ．、Ｍ．Ｍ．Ｇｅｄｄｅ、Ａ．Ｗ．Ｔｓａｎｇ、Ｊ．Ａ．Ｓｗａｎｓｏｎ、ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｐｏｒｔｎｏｙ．２００２．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５６：１０２９−１０３８）。例えば、一部のある実施形態において、単層の感染後３日目では、細胞から細胞への拡散が欠損した表現型を有するリステリア属菌株のプラークの大きさは、５０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシンを含有する培地に重層した場合、野生型リステリア属菌と比較すると少なくとも５０％低減される。他方において、感染単層を５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンのみを含有する培地＋アガロースに重層した場合、細胞から細胞への拡散が欠損した表現型を有するリステリア属菌株と野生型リステリア属菌とのプラークの大きさは、同様である。したがって、野生型リステリア属菌に対する選択された菌株が感染細胞単層において細胞から細胞への拡散を行なう相対能力は、アガロース含有培地中のゲンタマイシンの濃度を種々に変化させることにより測定され得る。任意選択で、プラーク直径の可視化および測定は、感染の４８時間後に重層にニュートラルレッドを含有する培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ；ＤＭＥ＋アガロース培地中１：２５０希釈度）を添加することによって容易化され得る。さらに、プラークアッセイは、他の一次細胞由来する単層または連続細胞において行なわれ得る。例えば、肝細胞由来細胞株であるＨｅｐＧ２細胞または一次ヒト肝細胞が、選択されたリステリア属菌変異体が細胞から細胞への拡散を行なう能力を、野生型リステリア属菌と比較して評価するために使用され得る。一部のある実施形態において、変異またはリステリア属菌を細胞から細胞への拡散について弱毒化させる他の改変を含むリステリア属菌は、高濃度のゲンタマイシン（約５０μｇ／ｍｌ）において「ピンポイント」プラークをもたらす。
一部のある実施形態において、リステリア属菌は、非食作用性細胞内への侵入について弱毒化されている（非変異体すなわち野生型のリステリア属菌に対して）。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、１種類以上のインターナリン（または同等物）に関して欠損している。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、インターナリンＡに関して欠損している。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、インターナリンＢに関して欠損している。一部のある実施形態において、リステリア属菌はｉｎｌＡに変異を含む。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、ｉｎｌＢに変異を含む。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢの両方に変異を含む。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、機能的ＡｃｔＡおよびインターナリンＢが欠失している。一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌の細菌はΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ二重欠失変異体である。一部のある実施形態において、リステリア属菌の細菌は、ＡｃｔＡおよびインターナリンＢの両方に関して欠損している。
一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌の細菌が非食作用性細胞内に侵入する能力は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９０％、弱毒化変異のないリステリア属菌に対して（例えば、野生型細菌）低減される。一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌の細菌が非食作用性細胞内に侵入する能力は、弱毒化変異のないリステリア属菌に対して少なくとも約２５％低減される。一部のある実施形態において、弱毒化細菌が非食作用性細胞内に侵入する能力は、弱毒化変異のないリステリア属菌に対して少なくとも約５０％低減される。一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌の細菌が非食作用性細胞内に侵入する能力は、弱毒化変異のないリステリア属菌に対して少なくとも約７５％低減される。
一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌は、１つより多くの型の非食作用性細胞内への侵入について弱毒化されたものではない。例えば、弱毒化菌株は、肝細胞内への侵入について弱毒化されているが、上皮細胞内への侵入については弱毒化されていないものであり得る。別の例として、弱毒化菌株は、上皮細胞内への侵入について弱毒化されているが、肝細胞内への侵入については弱毒化されていないものであり得る。また、特定の改変リステリア属菌の非食作用性細胞内への侵入についての弱毒化は、特定の細胞受容体と相互作用し、その結果として非食作用性細胞の感染を容易化するインベーシンタンパク質をコードする指定の遺伝子を変異させた結果（例えば、欠失変異）であることは理解されよう。例えば、リステリア属菌ΔｉｎｌＢ変異体菌株は、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−ｍｅｔ）を発現する非食作用性細胞内、例えば、肝細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２）および一次ヒト肝細胞内への侵入について弱毒化されている。
一部のある実施形態において、リステリア属菌が非食作用性細胞内への侵入について弱毒化されている場合であったとしても、リステリア属菌はなお、食作用性細胞、例えば、少なくとも樹状細胞および／またはマクロファージなどによる取込みを受け得る。一実施形態において、弱毒化リステリア属菌が食作用性細胞内に侵入する能力は、該菌株に対して行なわれた改変、例えば、インベーシンの変異などによって減衰されない（すなわち、該菌株が食作用性細胞にって取り込まれる能力を測定すると、改変後、ほぼ９５％以上が維持されている）。他の実施形態において、弱毒化リステリア属菌が食作用性細胞内に侵入する能力の減衰は、約１０％以下、約２５％以下、約５０％以下または約７５％以下である。
本発明の一部のある実施形態において、リステリア属菌が非食作用性細胞に侵入する能力における弱毒化の量は、２倍低減からずっと大きい弱毒化レベルまでの範囲である。一部のある実施形態において、リステリア属菌が非食作用性細胞に侵入する能力における弱毒化は、少なくとも約０．３ｌｏｇ、約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約５ｌｏｇまたは少なくとも約６ｌｏｇである。一部のある実施形態において、弱毒化は、約０．３〜＞８ｌｏｇ、約２〜＞８ｌｏｇ、約４〜＞８ｌｏｇ、約６〜＞８ｌｏｇ、約０．３〜８ｌｏｇ、また約０．３〜７ｌｏｇ、また約０．３〜６ｌｏｇ、また約０．３〜５ｌｏｇ、また約０．３〜４ｌｏｇ、また約０．３〜３ｌｏｇ、また約０．３〜２ｌｏｇ、また約０．３〜１ｌｏｇの範囲である。一部のある実施形態において、弱毒化は、約１〜＞８ｌｏｇ、１〜７ｌｏｇ、１〜６ｌｏｇ、また約２〜６ｌｏｇ、また約２〜５ｌｏｇ、また約３〜５ｌｏｇの範囲である。
リステリア属菌の細菌が非食作用性細胞内への侵入について弱毒化されているか否かを調べるためのインビトロアッセイは、当業者に知られている。例えば、Ｄｒａｍｓｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６：２５１−２６１（１９９５）およびＧａｉｌｌａｒｄら、Ｃｅｌｌ ６５：１１２７−１１４１（１９９１）の両方に、変異体リステリア菌株がある種の細胞株に侵入する能力をスクリーニングするためのアッセイが記載されている。例えば、特定の改変を有するリステリア属菌の細菌が、特定の型の非食作用性細胞内への侵入について弱毒化されているか否かを調べるためには、弱毒化リステリア属菌の細菌が特定の型の非食作用性細胞に侵入する能力が測定され、非食作用性細胞に侵入するための改変がなわれていない同一のリステリア属菌の細菌の能力と比較される。同様に、特定の変異を有するリステリア属菌株が、特定の型の非食作用性細胞内への侵入について弱毒化されているか否かを調べるためには、変異体リステリア属菌株が特定の型の非食作用性細胞に侵入する能力が測定され、非食作用性細胞に侵入する変異をもたないリステリア属菌株の能力と比較される。例えば、改変リステリア属菌の細菌が非食作用性細胞（例えば、肝細胞など）に感染する能力が、非改変リステリア属菌または野生型リステリア属菌が食作用性細胞に感染する能力と比較され得る。かかるアッセイにおいて、改変および非改変リステリア属菌は、典型的には、非食作用性細胞にインビトロで限定期間（例えば、１時間）添加され、次いで、該細胞をゲンタマイシン含有溶液で洗浄して細胞外細菌（あれば）を死滅させ、該細胞を溶解し、次いでプレーティングして力価を評価する。かかるアッセイの例は、米国特許公開公報第２００４／０２２８８７７号を見るとよい。また、該菌株がインターナリンＢに関して欠損していることの確認は、該菌株の表現型とインターナリンＢ変異体の既報の表現型との比較によっても得られ得る。
リステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９（米国）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州、２０１０８、米国）に、２００３年１０月３日に、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の規定の下に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６２で指定される。別のリステリア菌株であるΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ菌株もまたＡＴＣＣに、２００３年１０月３日に、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の規定の下に寄託されに寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３で指定される。
一部のある実施形態において、リステリア属菌は核酸修復について弱毒化されている（例えば、野生型に対して）。例えば、一部のある実施形態において、リステリア属菌は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損している（例えば、リステリア菌ｕｖｒＡＢ変異体）。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよび／またはＲｅｃＡに関して欠損している。一部のある実施形態において、該細菌は、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢおよび／またはＵｖｒＣに関して欠損している。一部のある実施形態において、該細菌は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよび／またはｒｅｃＡ遺伝子に弱毒化変異を含む。一部のある実施形態において、該細菌は、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢおよび／またはｕｖｒＣ遺伝子に１つ以上変異を含む。一部のある実施形態では、該細菌は、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢおよび／またはＵｖｒＣにおいて機能的に欠失している。一部のある実施形態では、該細菌は機能的ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢにおいて欠失している。一部のある実施形態において、該細菌はｕｖｒＡＢ欠失変異体である。一部のある実施形態において、該細菌はΔｕｖｒＡＢΔａｃｔＡ変異体である。一部のある実施形態において、核酸修復について弱毒化された、および／または少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損している該細菌（ｂａｃｔｅｉａ）の核酸は、核酸標的化化合物との反応によって改変されている。核酸修復変異体（例えば、ΔｕｖｒＡＢリステリア菌変異体など）、および該変異体の作製方法は、米国特許公開公報第２００４／０１９７３４３号（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている（例えば、Ｕ．Ｓ．２００４／０１９７３４３の実施例７を参照）。
一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌の細菌が核酸修復する能力は、弱毒化変異をもたないリステリア属菌の細菌（例えば、野生型細菌）に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９０％低減される。一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌の細菌が核酸修復する能力は、弱毒化変異をもたないリステリア属菌の細菌に対して、少なくとも約２５％低減される。一部のある実施形態において、核酸修復について弱毒化された弱毒化リステリア属菌の細菌の能力は、弱毒化変異をもたないリステリア属菌の細菌に対して少なくとも約５０％低減される。
特定の変異が細菌株に存在することの確認は、当業者に知られたさまざまな方法によって得られ得る。例えば、該菌株のゲノムの関連する部分をクローニングし、配列決定し得る。あるいはまた、欠失または他の変異に隣接する領域をコードする対のプライマーを用いたＰＣＲによって、特異的変異が同定され得る。また、サザンブロットを用いて、細菌ゲノムにおける変化が検出され得る。また、特定のタンパク質が該菌株によって発現されたか否かは、当該技術分野で標準的な手法、例えば、ウエスタンブロッティングなどを用いて解析され得る。また、該菌株が所望の遺伝子に変異を含むことの確認は、該菌株の表現型と既報の表現型比較によって得られ得る。例えば、ヌクレオチド切除修復変異の存在、例えばｕｖｒＡＢの欠失が、該細菌がその核酸をヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）機構を用いて修復する能力を試験するアッセイを用いて、野生型細菌に対する能力と比較することで評価され得る。かかる機能的アッセイは、当該技術分野で知られている。例えば、シクロブタンダイマー切除またはＵＶ誘導型（６−４）産物の切除を測定し、変異体におけるＮＥＲ酵素の欠損が決定され得る（例えば、Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３８２１−３８２４（１９８４）を参照）。あるいはまた、生存の測定を行なうことで、核酸修復における欠損が評価され得る。例えば、リステリア属菌はソラレン／ＵＶＡ処理に供され、次いで、野生型との比較において増殖および／または生存するその能力が評価され得る。
一部のある実施形態において、リステリア属菌は、食作用性空胞から細胞質ゾルに侵入し得るものである。一部のある実施形態において、リステリア属菌が細胞質ゾルに侵入する能力は、野生型リステリア属菌の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％である。リステリア属菌株が細胞質ゾルに侵入し得る程度を評価する方法は、当該技術分野で知られている。該方法としては、限定されないが、電子顕微鏡検査（Ｇｅｄｄｅら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６８：９９９−１００３（２０００）およびＴｉｌｎｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０９：１５９７−１６０８（１９８９）、各々は引用により本明細書に組み込まれる）ならびに間接免疫蛍光を用いるファゴソーム逸出アッセイ（Ｇｌｏｍｓｋｉら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、７１：６７５４−６７６５（２００３）およびＧｌｏｍｓｋｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５６：１０２９−１０３８（２００２）、各々は引用により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
本発明は、本発明の弱毒化リステリア属菌を作製または操作するためのいくつかのリステリア属菌株を提供する（表２）。本発明のリステリア属菌は、この表に開示された菌株に限定されない。
Figure 2009504786
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一部のある実施形態において、リステリア属菌の弱毒化は、宿主に対するリステリア属菌の生物学的効果に関して測定され得る。菌株の病原性は、マウスまたは他の脊椎動物におけるＬＤ５０の測定により評価され得る。ＬＤ５０は、脊椎動物に注射したとき該脊椎動物の５０％において致死を引き起こすのに必要なリステリア属菌の量または投薬量である。ＬＤ５０値は、弱毒化レベルの目安として、特定の改変（例えば、変異）を有する細菌対該特定の改変をもたない該細菌で比較され得る。例えば、特定の変異をもたない細菌株が１０３細菌のＬＤ５０を有し、該特定の変異を有する細菌株が１０５細菌のＬＤ５０を有する場合、該菌株は、ＬＤ５０が１００倍または２ｌｏｇ増加するように弱毒化されている。
一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌は、親または野生型リステリア属菌のＬＤ５０よりも少なくとも約５倍大きい、少なくとも約１０倍大きい、少なくとも約１００倍大きい、少なくとも約１０００倍大きい、または少なくとも約１×１０４大きいＬＤ５０を有する。
さらなる例として、弱毒化の程度はまた、他の生物学的効果、例えば、組織病態の程度または血清肝臓酵素レベルなどによって定性的に測定され得る。血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルブミンおよびビリルビンレベルが、リステリア属菌（または他の細菌）を注射したマウスについて臨床検査室で測定される。マウスまたは他の脊椎動物におけるこれらの効果の比較が、リステリア属菌の弱毒化を評価する方法の一例として、特定の改変／変異を有するリステリア属菌および有しないリステリア属菌について行なわれ得る。リステリア属菌の弱毒化はまた、組織病態によって測定され得る。感染した脊椎動物の種々の組織、例えば、肝臓、脾臓および神経系などから回収され得るリステリア属菌の量もまた、変異体が注射された脊椎動物におけるこれらの値を非変異体リステリア属菌に対して比較することにより、弱毒化レベルの目安として使用され得る。例えば、時間の関数としての、肝臓または脾臓などの感染組織から回収され得るリステリア属菌の量は、変異体が注射されたマウスにおけるこれらの値を非変異体リステリア属菌に対して比較することにより、弱毒化の目安として使用され得る。
したがって、リステリア属菌の弱毒化は、野生型リステリア属菌の標的であることがわかっているマウスの特定の選択した器官における細菌負荷に関して測定され得る。例えば、リステリア属菌の弱毒化は、肝臓または脾臓ホモジネート（Ｈ２Ｏ＋０．２％ＮＰ４０中でホモジナイズ）の希釈物をＢＨＩ寒天培地上にプレーティングすることによって生じるコロニーを数えること（コロニー形成単位；ＣＦＵまたはｃｆｕ）により測定され得る。肝臓または脾臓でのｃｆｕは、任意の数の経路（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内および皮下）による改変リステリア属菌の投与後、例えば、経時的に測定され得る。さらに、リステリア属菌は、上記のような競合指数アッセイによって、投与後、経時的に測定され、肝臓および脾臓（または任意の他の選択した器官）内の薬物耐性、野生型リステリア属菌（または任意の他の選択されたリステリア属菌株）と比較され得る。
変異体リステリア属菌の作製方法は、当該技術分野でよく知られている。細菌の変異は、従来の変異誘発法、例えば、変異原性化学薬品または放射線などによってなされ、その後、変異体の選択が行なわれ得る。細菌の変異はまた、当業者により組換えＤＮＡ手法によってもなわれ得る。例えば、Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏ．８：１４３−１５７（１９９３）に記載のｐＫＳＶ７ベクターを用いる対立遺伝子交換法は、変異体（例えば、欠失変異体）の作製における使用に適している（Ｃａｍｉｌｌｉら．（１９９３）は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。あるいはまた、Ｂｉｓｗａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：３６２８−３６３５（１９９３）に記載の遺伝子置換プロトコルが使用され得る。他の同様の方法は、当業者に知られている。
さまざまな細菌の変異体の構築は、米国特許出願第１０／８８３，５９９号、米国特許公開公報第２００４／０１９７３４３号、および米国特許公開公報第２００４／０２２８８７７号（これらは、各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
非食作用性細胞による弱毒化細菌の取込みにおける弱毒化の程度は、安全で有効なワクチンを提供するために絶対的な弱毒化である必要はない。一部のある実施形態において、弱毒化の程度は、毒性の症状を命にかかわらないレベルに抑制または低減するのに充分な毒性の低減をもたらすものである。
一部のある実施形態において、リステリア属菌は、コロニー形成、複製および／または分裂を行なうことができない。本発明の一部のある実施形態において、リステリア属菌は、親または野生型リステリア属菌に対して増殖について弱毒化されている。
一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌は、死菌であるが代謝的に活性である（米国特許公開公報第２００４／０１９７３４３号およびＢｒｏｃｋｓｔｅｄｔら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１１：８５３−６０（２００５）（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
リステリア属菌は、一部のある実施形態において、核酸標的化化合物によって弱毒化され得る。一部のある実施形態において、核酸標的化化合物は核酸アルキル化剤、例えば、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルなどである。一部のある実施形態において、核酸標的化化合物は、ＵＶＡ照射などの照射によって活性化される。一部のある実施形態において、リステリア属菌はソラレン化合物で処理される。例えば、一部のある実施形態において、該細菌は、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（「Ｓ−５９」）などのソラレンおよびＵＶＡ光での処理によって改変される。一部のある実施形態において、該細菌の核酸は、ソラレン化合物およびＵＶＡ照射での処理によって改変されたものである。核酸標的化化合物を用いて増殖について弱毒化するために細菌を改変する方法の説明は、米国特許公開公報第２００４／０１９７３４３号およびＢｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１１：８５３−６０（２００５）に記載されている。一部のある実施形態において、リステリア属菌は、ＤＮＡ修復について弱毒化されている。
例えば、ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢリステリア菌などのリステリア属菌の処理のため、一部のある実施形態において、Ｓ−５９ソラレンが、（ほぼ）ＯＤ６００＝０．５の対数期培養物に２００ｎＭまで添加され、その後、該培養物が光学濃度１に達したら、６Ｊ／ｍ２のＵＶＡ光での不活化が行なわれ得る。不活化条件は、Ｓ−５９の濃度、ＵＶＡ線量、ＵＶＡ処置前のＳ−５９曝露時間を変更すること、ならびにリステリア属菌ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ菌株の細菌増殖中の処理時間を変更することにより至適化される。親リステリア属菌株は、対照として使用される。リステリア属菌の不活化（ｌｏｇ−死滅）は、該細菌がＢＨＩ（脳心臓浸出物）寒天プレート上でコロニー形成できないことによって測定される。また、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化後に新たに発現されたタンパク質の合成および分泌を調べるための３５Ｓ−パルスチェイス実験を用い、ＬＬＯなどのタンパク質の継続的な代謝活性および発現が、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化リステリア属菌の細菌において確認され得る。３５Ｓ−代謝性標識を用いたＬＬＯの発現は、慣用的に測定され得る。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化リステリア属菌ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢは、Ｓ−メチオニンの存在下で、１時間インキュベートされ得る。ＬＬＯなどのタンパク質の発現および／または分泌は、完全細胞ライセート、および細菌培養液のＴＣＡ沈殿の両方で測定され得る。ＬＬＯ特異的モノクローナル抗体を免疫沈降に用いて、不活化後の組換えリステリア属菌からの継続的な発現および分泌が確認され得る。
一部のある実施形態において、増殖について弱毒化されたリステリア属菌はまた、核酸修復についても弱毒化されており、そして／または少なくとも１種類のＤＮＡ修復酵素に関して欠損している。例えば、一部のある実施形態において、核酸がソラレンなどの核酸標的化化合物（ＵＶＡ処理と併用）によって改変されている該細菌は、ｕｖｒＡＢ欠失変異体である。
一部のある実施形態において、リステリア属菌の増殖は、少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇまたは少なくとも約８ｌｏｇ弱毒化される。別の実施形態において、リステリア属菌の増殖は、約０．３〜＞１０ｌｏｇ、約２〜＞１０ｌｏｇ、約４〜＞１０ｌｏｇ、約６〜＞１０ｌｏｇ、約０．３〜８ｌｏｇ、約０．３〜６ｌｏｇ、約０．３〜５ｌｏｇ、約１〜５ｌｏｇまたは約２〜５ｌｏｇ弱毒化される。一部のある実施形態において、リステリア属菌によるＬＬＯの発現は、非改変リステリア属菌におけるＬＬＯの発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％または少なくとも約９０％である。
一部のある実施形態において、リステリア属菌は、米国特許公開公報第２００６／００５１３８０号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたＨＩＶ−ｇａｇ弱毒化リステリア属菌ではない。一部のある実施形態において、本明細書に記載の方法に使用されるリステリア属菌は、ＨＩＶ ｇａｇポリペプチドを発現しない。一部のある実施形態において、本明細書に記載の方法に使用されるリステリア属菌は、ＨＩＶ ｇａｇポリペプチドをコードする核酸を含まない。
ＶＩ．投与される弱毒化リステリア属菌とともに投与される試薬
本発明は、特定のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌とともに投与するための試薬を提供する。このような試薬としては、生物学的試薬、例えばサイトカインなど、樹状細胞、弱毒化癌細胞ワクチンおよび他の型のワクチン、小分子試薬、例えば５−フルオロウラシルなど、ならびに調節Ｔ細胞をモジュレートする試薬、例えばシクロホスファミドまたは抗ＣＴＬＡ４抗体などが挙げられる。該試薬は、リステリア属菌とともに、またはリステリア属菌とは独立して（前または後に）投与され得る。例えば、該試薬は、リステリア属菌の直前に（または直後）、リステリア属菌と同じ日、１日前（もしくは後）、１週間前（もしくは後）、１ヶ月前（もしくは後）または２ヶ月前（もしくは後）などに投与され得る。
一部のある実施形態において、リステリア属菌の投与に加え、該方法は、ａ．サイトカインのアゴニストもしくはアンタゴニスト；ｂ、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のインヒビター；またはｃ．増殖もしくは複製において弱毒化された腫瘍細胞の１つまたは任意の組合せを投与することを含む。一部のある実施形態において、該方法で使用されるＴｒｅｇのインヒビターはシクロホスファミド（ＣＴＸ）である。
本出願書類には、引用により、米国特許出願第６０／７０９，７００号（２００５年８月１９日出願）のその全体が組み込まれる。
ｉ．生物学的試薬。利用可能な生物学的試薬または巨大分子には、サイトカインのアゴニストもしくはアンタゴニスト、サイトカインアゴニストもしくはアンタゴニストをコードする核酸、サイトカインを発現する細胞、またはアゴニスト性もしくはアンタゴニスト性抗体が包含される。生物学的試薬としては、限定されないが、ＴＨ−１サイトカイン、ＴＨ−２ サイトカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＦＬＴ３−リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、サイトカイン受容体、可溶性サイトカイン受容体、ケモカイン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＤ４０リガンド、または免疫プロテアソームサブユニットへのプロテアソームサブユニットの置き換えを刺激する試薬が挙げられる。
本発明には、生物学的試薬、以下：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、または誘導タンパク質−１０の少なくとも１種類を発現するように操作された細胞が包含される。他の想定される試薬としては、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、ＣＤ４０リガンド、またはＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）のアゴニスト、および可溶性となるように操作された、もしくはように膜結合するように操作された新規な形態が挙げられる（例えば、Ｋａｒｎｂａｃｈら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２５６９−２５７６；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄら（１９９８）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３８９−４１８；ＰａｒｎｅｙおよびＣｈａｎｇ（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．１０：３７−４３；Ｇｒｉら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：９９−１０６；Ｃｈｉｏｄｏｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１２５−１３３；Ｅｎｚｌｅｒら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１２１３−１２１９；Ｓｏｏ Ｈｏｏら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：７３４３−７３４９；Ｍｉｈａｌｙｏら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：５３３８−５３４５；Ｃｈａｐｏｖａｌら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６９７７−６９８４を参照）。
なんら限定を意味するものではないが、本発明は、以下の生物学的試薬を提供する。例えば、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１−α、ＴＮＦ−αおよび／またはインターロイキン−２は、さまざまな腫瘍、例えば肝臓腫瘍の処置に有効である（例えば、Ｎａｋａｍｏｔｏら（２０００）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０（６Ａ）：４０８７−４０９６；Ｋａｍａｄａら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：６４１６−６４２０；Ｌｉら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：４０２３−４０２８；Ｙａｎｇら（２００２）Ｚｈｏｎｇｈｕａ Ｗａｉ Ｋｅ Ｚａ Ｚｈｉ ４０：７８９−７９１；Ｈｏｖｉｎｇら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：４３００−４３０８；Ｔｓｕｃｈｉｙａｍａら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：２６０−２６９；Ｓａｋａｉら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：６９５−７０４を参照）。
本発明は、一部のある実施形態において、Ｆｌｔ３−リガンドアゴニスト、およびリステリア属菌との組合せでのＦｌｔ３−リガンドアゴニストを包含する試薬および方法を提供する。Ｆｌｔ３−リガンド（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド）は、抗腫瘍免疫応答を生じさせ得るサイトカインである（例えば、Ｄｒａｎｏｆｆ（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１８８：１４７−１５４；Ｍａｃｈら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：３２３９−３２４６；Ｆｕｒｕｍｏｔｏら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：７７４−７８３；Ｆｒｅｅｄｍａｎら（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：５２２８−５２３７；Ｍａｃｈら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：３２３９−３２４６を参照）。
別の実施形態において、本発明では、少なくとも１種類の腫瘍抗原および／または感染性因子抗原を発現する樹状細胞（ＤＣ）の投与が想定される。ＤＣによる抗原の発現は、例えば、ペプチド負荷、腫瘍細胞抽出物、腫瘍細胞との融合、ｍＲＮＡによる形質導入、またはベクターによるトランスフェクションによって媒介され得る。関連する方法が報告されている（例えば、Ｋｌｅｉｎら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１６９９−１７０８；Ｃｏｎｒａｄ ａｎｄ Ｎｅｓｔｌｅ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：４０５−４１２；ＧｉｌｂｏａおよびＶｉｅｗｅｇ（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９９：２５１−２６３；Ｐａｃｚｅｓｎｙら（２００３）Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１３：４３９−４４７；Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎら（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：２６４−２７１を参照）。
ｉｉ．小分子試薬。本発明の方法および試薬にはまた、小分子試薬、例えば、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、イリノテカン、ドキソルビシン、プレドニゾン、ドロスタチン−１０（Ｄ１０）、コンブレタスタチンＡ−４、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、ビンクリスチン、コルヒチン、ビンブラスチン、シクロホスファミド、真菌のβ−グルカンなどが包含される（例えば、Ｈｕｒｗｉｔｚら（２００４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：２３３５−２３４２；Ｐｅｌａｅｚら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６６０８−６６１５；Ｈａｖａｓら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ９：１９４−２０４；Ｔｕｒｋら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：７７１−７８２；Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉら（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：３３６−３４４；Ａｎｄｒａｄｅ−Ｍｅｎａ（１９９４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ．１６：９５−１０３；Ｃｈｒｉｓｃｈｉｌｌｅｓら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ １０：３９６−４０３；Ｈｏｎｇら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：９０２３−９０３１を参照）。また、分子ではなく、例えば、塩およびイオンである組成物が想定される。
シクロホスファミドの類縁体が提供される（例えば、Ｊａｉｎら（２００４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７：３８４３−３８５２；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：５３９４−５４００；ＢｏｒｃｈおよびＣａｎｕｔｅ（１９９１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：３０４４−３０５２；Ｌｕｄｅｍａｎら（１９７９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２２：１５１−１５８；Ｚｏｎ（１９８２）Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９：２０５−２４６を参照）。
また、生得的免疫応答を刺激する小分子試薬、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモッドおよびαＧａｌＣｅｒが本発明に包含される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９を介して免疫応答を媒介する（例えば、Ｃｈａｇｎｏｎら（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：１３０２−１３１１；Ｓｐｅｉｓｅｒら（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｆｅｂ．３（印刷前に電子公開）；Ｍａｓｏｎら（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：３６１−３６９；ＳｕｚｕＭら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：８７５４−８７６０；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：４８３−５１３；Ｔａｋｅｄａら（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：３３５−３７６；Ｍｅｔｅｌｉｔｓａら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：３１１４−３１２２を参照）。
他の有用な小分子試薬としては、細菌のペプチドグリカンに由来するもの、例えば、ある種のＮＯＤ１リガンドおよび／またはＮＯＤ２リガンドなど、例えば、ジアミノピメレート含有ムロペプチドなどが挙げられる（例えば、ＭｃＣａｆｆｒｅｙら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１１３８６−１１３９１；ＲｏｙｅｔおよびＲｅｉｇｈｈａｒｔ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：６１０−６１４；Ｃｈａｍａｉｌｌａｒｄら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７０２−７０７；ＩｎｏｈａｒａおよびＮｕｎｅｚ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：３７１−３８２；Ｉｎｏｈａｒａら（２００４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｏｖ．１９［印刷前に電子公開］ を参照）。
ｉｉｉ．調節Ｔ細胞。本発明には、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ；サプレッサＴ細胞）の活性をモジュレートするための試薬および方法が含まれる。Ｔｒｅｇ細胞活性の弱毒化または阻害により、免疫系による腫瘍細胞の死滅が増強され得る。Ｔｒｅｇ細胞活性を阻害するいくつかの試薬が同定されている。このような試薬としては、例えば、シクロホスファミド（別名Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）；ＣＴＸ）、抗ＣＤ２５抗体、ＧＩＴＲ−ＬもしくはＧＩＴＲのモジュレータ、フォークヘッド−ボックス転写因子（Ｆｏｘ）のモジュレータ、ＬＡＧ−３のモジュレータ、抗ＩＬ−２Ｒ、および抗ＣＴＬＡ４が挙げられる（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：８０７−８３９；Ｅｒｃｏｌｉｎｉら（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：１５９１−１６０２；Ｈａｅｒｙｆａｒら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：３３４４−３３５１；Ｅｒｃｏｌｉｎｉら（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：１５９１−１６０２；Ｍｉｈａｌｙｏら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：５３３８−５３４５；Ｓｔｅｐｈｅｎｓら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：５００８−５０２０；Ｓｃｈｉａｖｏｎｉら（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５：２０２４−２０３０；Ｃａｌｍｅｌｓら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０月８日（印刷前に電子公開）；Ｍｉｎｃｈｅｆｆら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｓｅｐｔ．１７［印刷前に電子公開］；Ｍｕｒｉｇｌａｎら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１４９−１５７；Ｓｔｅｐｈｅｎｓら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：５００８−５０２０；ＣｏｆｆｅｒおよびＢｕｒｇｅｒｉｎｇ（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：８８９−８９９；Ｋａｌｉｎｉｃｈｅｎｋｏら（２００４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１８：８３０−８５０；Ｃｏｂｂｏｌｄら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：６００３−６０１０；Ｈｕａｎｇら（２００４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２１：５０３−５１３を参照）。ＣＴＸは、免疫系に対して二方式（ｂｉｍｏｄａｌ）効果を示し、ここで、低用量のＣＴＸはＴｒｅｇを阻害する（例えば、Ｌｕｔｓｉａｋら（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：２８６２−２８６８を参照）。
ＣＴＬＡ４遮断剤、例えば、抗ＣＴＬＡ４遮断抗体は、例えば癌に対する免疫応答を増強し得る（例えば、Ｚｕｂａｉｒｉら（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１４３３−１４４０；Ｅｓｐｅｎｓｃｈｉｅｄら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３４０１−３４０７；Ｄａｖｉｌａら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３２８１−３２８８；Ｈｏｄｉら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：４７１２−４７１７を参照）。本発明で抗ＣＴＬＡ４抗体などが使用される場合、本発明は、必ずしもＴｒｅｇを阻害するための使用に限定されず、また、必ずしも常にＴｒｅｇの阻害を包含するとは限らない。
リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）遮断剤、例えば、抗ＬＡＧ−３抗体または可溶性ＬＡＧ−３（例えば、ＬＡＧ−３ Ｉｇ）などにより、増殖性障害に対する免疫応答が増強され得る。抗ＬＡＧ−３抗体はＴｒｅｇの活性を低減させる（例えば、Ｈｕａｎｇら（２００４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２１：５０３−５１３；Ｔｒｉｅｂｅｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６１９−６２２；ＷｏｒｋｍａｎおよびＶｉｇｎａｌｉ（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：９７０−９７９；Ｃａｐｐｅｌｌｏら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：２５１８−２５２５；Ｗｏｒｋｍａｎら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：５４５０−５４５５；Ｍａｃｏｎ−ＬｅｍａｉｔｒｅおよびＴｒｉｅｂｅｌ（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１５：１７０−１７８を参照）。
ｉｖ．ワクチン。腫瘍抗原、腫瘍抗原をコードする核酸、腫瘍抗原をコードする核酸を含むベクター、腫瘍抗原を含む細胞、腫瘍細胞または弱毒化腫瘍細胞を含むワクチンが、本発明にて想定される。腫瘍抗原をコードする核酸、例えば、コドン至適化核酸、または２種類以上の異なる腫瘍抗原をコードする核酸、または腫瘍抗原の再編成エピトープを発現する核酸（例えば、エピトープの天然の順序がＡＢＣＤであり、操作された順序がＡＤＢＣである場合）、または少なくとも２種類の異なる腫瘍抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸に由来する試薬が提供される。
腫瘍細胞、弱毒化腫瘍細胞、またはサイトカインもしくは他の免疫モジュレータ因子を発現するように操作された組換え腫瘍細胞を含むワクチンが、本発明によって提供される。例えば、腫瘍細胞は、免疫応答をモジュレートする因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＦＮγを発現するように操作され得る（例えば、Ｊａｆｆｅｅらに発行された米国特許第６，０３３，６７４号および同第６，３５０，４４５号；Ｇｏｌｕｍｂｅｋら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：７１３−７１６；Ｅｗｅｎｄら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３：４３８−４４８；Ｚｈｏｕら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：１０７９−１０８８；Ｐｏｒｇａｄｏｒら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１４５８−１４７０；Ｐｏｌｏｓｏら（２００１）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：Ｄ７６０−Ｄ７７５を参照）。ワクチンは、ゲルマトリックスによって投与され得る（例えば、Ｓａｌｅｍら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：５１５９−５１６７を参照）。
本発明はまた、一部のある実施形態において、腫瘍抗原を発現するように操作された樹状細胞（または他のＡＰＣ）を含むワクチンを提供する（例えば、Ａｖｉｇａｎ（１９９９）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．１３：５１−６４；ＫｉｒｋおよびＭｕｌｅ（２０００）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：７９７−８０６を参照）。また、腫瘍抗原の供給源として、例えば、合成ペプチド、精製抗原、オリゴ糖および腫瘍細胞ライセートが提供される（例えば、Ｌｅｗｉｓら（２００３）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：８１−１１２；Ｒａｚｚａｑｕｅら（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：６４４−６４７；ＭｅｎｇおよびＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ（２００２）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９：９２６−９３２；Ｌｅ Ｐｏｏｌｅら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：６４１−６４８を参照）。さらに、本発明は、腫瘍特異的免疫を惹起する熱ショックタンパク質を提供する（例えば、Ｕｄｏｎｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０７７−３０８１；Ｗａｎｇら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．２９：１３１−１３７を参照）。
本発明には、ワクチンにおける使用のための少なくとも１種類の抗原、少なくとも１種類の抗原をコードする核酸が含まれる（例えば、表３を参照）。別の態様では、本発明は、腫瘍抗原をコードする核酸を全く提供せず、腫瘍抗原を全く提供せず、感染性因子をコードする核酸を全く提供せず、そして／または感染性因子抗原を全く提供しない。別の態様では、本発明は、腫瘍抗原をコードする核酸を全く提供しないか、または腫瘍抗原を全く提供しないか、または感染性因子をコードする核酸抗原を全く提供しないか、または任意の感染性因子抗原を全くを提供しないか、またはその任意の組合せである。該抗原は、例えば、少なくとも１種類の単離されたタンパク質を含む組成物、少なくとも１種類の単離されたタンパク質断片を含む組成物、核酸ワクチン、またはウイルス系ワクチンなどによって提供または投与され得る（例えば、ＰｏｌｏおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ（２００２）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ７：７１９−７２７；Ｃｈｅｎｇら（２００５）Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：３８６４−３８７４；Ｋｉｍら（２００５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：２６−３４を参照）。
本発明のリステリア属菌は、弱毒化がもたらされるいくつかの方法のいずれかによって操作され得る。リステリア属菌はまた、選択マーカーを発現するように操作され得る。その方法は報告されている（例えば、Ｃａｍｉｌｌｉら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１４３−１５７；Ｃａｍｉｌｌｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｄｏｃｔｏｒａｌ ｔｈｅｓｉｓ；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６６：３５５２−３５６１；Ｓｋｏｂｌｅら（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５０：５２７−５３７；ＳｍｉｔｈおよびＹｏｕｎｇｍａｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７４：７０５−７１１；Ｌｅｉら（２００１）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：１１３３−１１３９；ＬｉおよびＫａｔｈａｒｉｏｕ（２００３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：３０２０−３０２３；Ｌａｕｅｒら（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７−４１８６を参照）。
あるいはまたさらに、ワクチンは、核酸ワクチン、リポソーム、可溶性抗原、粒子抗原、コロイド状抗原、コンジュゲート抗原、操作された腫瘍細胞、または弱毒化腫瘍細胞として投与され得る。ワクチンは、核酸ワクチン、リポソーム、可溶性抗原、粒子抗原、コロイド状抗原、コンジュゲート抗原、操作された腫瘍細胞、または弱毒化腫瘍細胞の形態をとり得る。
投与方法の列挙は、本発明の限定を意図しない。
Figure 2009504786
Figure 2009504786
Figure 2009504786
Figure 2009504786
ＶＩＩ．治療用および他の組成物
弱毒化リステリア属菌を含み、本発明の方法に有用なさまざまな組成物（例えば、医薬組成物、ワクチン、免疫原性組成物など）を、本明細書において提供する。本明細書において提供する弱毒化リステリア属菌、ワクチン、小分子、生物学的試薬およびアジュバントは、宿主に、単独または薬学的に許容され得る賦形剤との組合せでのいずれかで、免疫障害、増殖性障害、癌、癌性障害または感染性障害に対する適切な免疫応答を誘導するのに充分な量で投与され得る。免疫応答には、限定されないが、特異的応答、非特異的応答、特異的および非特異的応答、生得的応答、適応的免疫、一次免疫応答、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖ならびに免疫細胞分化が含まれ得る。
「薬学的に許容され得る賦形剤」または「診断上許容され得る賦形剤」は、限定されないが、滅菌蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、アミノ酸系バッファーまたは重炭酸緩衝溶液を含むことが意図される。選択される賦形剤および賦形剤の使用量は、投与様式に依存する。投与は、経口、静脈内、皮下、経皮、皮内、筋肉内、非経口、器官内、病変内、鼻腔内、吸入、眼内、筋肉内、血管内、直腸内、腹腔内、またはさまざまなよく知られた投与経路の任意の１つであり得る。一部のある実施形態において、投与は粘膜経由である。投与には、注射、輸液またはその組合せが含まれ得る。一部のある実施形態において、投与は経口ではない。一部のある実施形態において、投与は静脈内である。
本発明は、特定のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌を含む医薬組成物は、アジュバントを含む。
一部のある実施形態において、リステリア属菌は、他の型の細菌を少なくとも約９０％、少なくとも約９５または少なくとも９９％非含有である組成物中で投与される。
本発明のリステリア属菌は、例えば、凍結、凍結乾燥、懸濁液として、細胞ペーストとして、または固相マトリックスもしくはゲルマトリックスとの複合体で保存され得る。
特定の患者に対する有効量は、処置対象の状態、患者の健康全般、投与の方法経路および用量ならびに副作用の重症度などの要素に応じて種々であり得る。特定の患者に対する有効量は、処置対象の状態、患者の健康全般、投与の方法経路および用量ならびに副作用の重症度などの要素に応じて種々であり得る。処置および診断の方法の手引きは、入手可能である（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら（１９９６）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫを参照）。
本発明のリステリア属菌は、一部のある実施形態において、各用量が、少なくとも１０００リステリア属菌体／ｋｇ体重；通常、少なくとも１０，０００細胞；より通常では少なくとも１００，０００細胞；最も通常では少なくとも１００万細胞；多くの場合、少なくとも１０００万細胞；より多くの場合では少なくとも１億細胞；最も多くの場合では少なくとも１０億細胞；通常、少なくとも１００億細胞；より通常では少なくとも１０００億細胞；および最も通常では少なくとも１兆リステリア属菌体／ｋｇ体重を含む用量または投薬量で投与され得る。本発明は、リステリア属菌投与の単位が、コロニー形成単位（ＣＦＵ）、ソラレン処理前のＣＦＵ相当量、または単位がリステリア属菌体の数である場合である上記の用量を提供する。一部のある実施形態において、測定される弱毒化リステリア属菌の有効量は、少なくとも約１×１０３ＣＦＵ／ｋｇまたは少なくとも約１×１０３リステリア属菌体／ｋｇを含む。一部のある実施形態において、測定される弱毒化リステリア属菌の有効量は、少なくとも約１×１０５ＣＦＵ／ｋｇまたは少なくとも約１×１０５リステリア属菌体／ｋｇを含む。特定のある実施形態において、測定される弱毒化リステリア属菌の有効量は、少なくとも約１×１０６ＣＦＵ／ｋｇまたは少なくとも約１×１０６リステリア属菌体／ｋｇを含む。一部のある実施形態において、測定される弱毒化リステリア属菌の有効量は、少なくとも約１×１０７ＣＦＵ／ｋｇまたは少なくとも約１×１０７リステリア属菌体／ｋｇを含む。一部のさらなる実施形態において、測定される弱毒化リステリア属菌の有効量は、少なくとも約１×１０８ＣＦＵ／ｋｇまたは少なくとも約１×１０８リステリア属菌体／ｋｇを含む。
本発明のリステリア属菌は、特定のある実施形態において、各用量が１０７〜１０８リステリア属菌／７０ｋｇ体重（または／１．７平方メートル表面積；または／１．５ｋｇ肝臓重量）；２×１０７〜２×１０８リステリア属菌／７０ｋｇ体重（または／１．７平方メートル表面積；または／１．５ｋｇ肝臓重量）；５×１０７〜５×１０８リステリア属菌／７０ｋｇ体重（または／１．７平方メートル表面積；または／１．５ｋｇ肝臓重量）；１０８〜１０９リステリア属菌／７０ｋｇ体重（または／１．７平方メートル表面積；または／１．５ｋｇ肝臓重量）；２．０×１０８〜２．０×１０９リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；５．０×１０８〜５．０×１０９リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；１０９〜１０１０リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；２×１０９〜２×１０１０リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；５×１０９〜５×１０１０ リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；１０１１〜１０１２リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；２×１０１１〜２×１０１２リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；５×１０１１〜５×１０１２リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；１０１２〜１０１３リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積）；２×１０１２〜２×１０１３リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；５×１０１２〜５×１０１３リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；１０１３〜１０１４リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；２×１０１３〜２×１０１４リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；５×１０１３〜５×１０１４リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；１０１４〜１０１５リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；２×１０１４〜２×１０１５リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；５×１０１４〜５×１０１５リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；１０１５〜１０１６リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；２×１０１５〜２×１０１６リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）；および５×１０１５〜５×１０１６リステリア属菌／７０ｋｇ（または／１．７平方メートル表面積または／１．５ｋｇ肝臓重量）を含む用量または投薬量で投与され得る。リステリア属菌の数は、例えば、個々の細菌を顕微鏡下で計数すること、またはコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数することにより測定され得る。マウスの肝臓は、本発明のリステリア属菌の投与時は、約１．５グラムの重量である。ヒト肝臓の重量は、約１．５キログラムである。
一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌は哺乳動物に、２回以上の投与で投与される。一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌は哺乳動物に、３回以上の投与で投与される。一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌は哺乳動物に、４回以上、５回以上または６回以上の投与で投与される。後期の投与（１回または複数）に使用されるリステリア属菌は、初期の投与（１回または複数）でのリステリア属菌と同じであってもそうでなくてもよい。
一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌は反復投与される。哺乳動物には、有効量がリステリア属菌の反復投与の形態で投与され得るか、または有効量のリステリア属菌が反復投与で投与され得る。リステリア属菌が反復投与で投与される方法では、２回目の投与は、最初の投与の少なくとも約５分後、最初の投与の少なくとも約１５分後、最初の投与の少なくとも約１時間後、最初の投与の少なくとも約６時間後、最初の投与の少なくとも約１２時間後、最初の投与の少なくとも約２４時間後、最初の投与の少なくとも約３日後、最初の投与の少なくとも約１週間後、最初の投与の少なくとも約２週間後、最初の投与の少なくとも約１ヶ月後または最初の投与の少なくとも約６ヶ月後に投与され得る。同様に、３回目の投与は、２回目の投与の少なくとも約５分後、２回目の投与の少なくとも約１５分後、２回目の投与少なくとも約１時間後、２回目の投与の少なくとも約６時間後、２回目の投与の少なくとも約１２時間後、２回目の投与の少なくとも約２４時間後、２回目の投与の少なくとも約３日後、２回目の投与の少なくとも約１週間後、２回目の投与の少なくとも約２週間後、２回目の投与の少なくとも約１ヶ月後または２回目の投与の少なくとも約６ヶ月後に投与され得る。本明細書に記載の方法の一部のある実施形態において、弱毒化リステリア属菌の反復投与はすべて、約１時間、約１日、約１週間、約２週間、約１ヶ月、約３ヶ月、約６ヶ月、約１年、約５年または約１０年の期間内に行なわれる。
また、該用量が１日１回の注射、２日に１回の注射、３日に１回の注射、４日に１回の注射、５日に１回の注射、６日に１回の注射、または７日に１回の注射によって投与され、注射スケジュールが例えば、１日だけ、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間またはそれ以上維持される上記の用量の１つ以上が提供される。本発明にはまた、上記の用量およびスケジュールの組合せ、例えば、比較的大きな初期用量のリステリア属菌の後、後続では比較的小用量リステリア属菌が包含される。
例えば、１回／週、２回／週、３回／週、４回／週、５回／週、６回／週、７回／週、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回などの投与スケジュールが、本発明に利用可能である。投与スケジュールには、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月および１２ヶ月の合計期間での投与が包含される。
上記の投与スケジュールのサイクルが提供される。該サイクルは、例えば、約７日毎；１４日毎；２１日毎；２８日毎；３５日間；４２日毎；４９日毎；５６日毎；６３日毎；７０日毎などで反復され得る。投与しない期間がサイクル間に存在し得、該期間は、例えば、約７日間；１４日間；２１日間；２８日間；３５日間；４２日間；４９日間；５６日間；６３日間；７０日間などであり得る。この状況において、用語「約」は、＋もしくは−１日、＋もしくは−２日、＋もしくは−３日、＋もしくは−４日、＋もしくは−５日、＋もしくは−６日または＋もしくは−７日を意味する。
本発明には、経口であるリステリア属菌の投与方法が包含される。また、静脈内であるリステリア属菌の投与方法が提供される。さらに、提供されるのは、筋肉内であるリステリア属菌の投与方法である。本発明は、肉系である培地、または肉もしくは動物系生成物に由来するポリペプチドを含有する培地中で培養することにより調製されるリステリア属菌の細菌またはリステリア属菌の細菌の培養物もしくは懸濁液を提供する。また、本発明によって提供されるのは、肉もしくは動物系生成物を含有しない培地中で培養することにより調製されたか、植物性ポリペプチドを含有する培地で培養することにより調製されたか、酵母生成物系でない培地で培養することにより調製されたか、または酵母ポリペプチドを含有する培地で培養することにより調製されたリステリア属菌の細菌またはリステリア属菌の細菌の培養物もしくは懸濁液である。
本発明には、経口ではないリステリア属菌の投与方法が包含される。また、静脈内ではないリステリア属菌の投与方法が提供される。さらに、筋肉内ではないリステリア属菌の投与方法が提供される。本発明は、肉系ではない培地、または肉もしくは動物系生成物に由来するポリペプチドを含有しない培地中で培養することにより調製されるリステリア属菌の細菌またはリステリア属菌の細菌の培養物もしくは懸濁液を提供する。また、本発明によって提供されるのは、植物性生成物を主成分とする培地、植物性ポリペプチドを含有する培地、酵母生成物系の培地、または酵母ポリペプチドを含有する培地中で培養することにより調製されるリステリア属菌の細菌またはリステリア属菌の細菌の培養物もしくは懸濁液である。
一部のある実施形態において、本発明の方法は、米国特許公開公報第２００６／００５１３８０号に開示されたリステリア属菌の細菌の投与方法を利用するものではなく、明確に排除する。
さらなる治療用剤、例えば、サイトカイン、化学療法剤、抗生物質または放射線との共投与またはこれらでの処置のための方法は、当該技術分野でよく知られている（Ｈａｒｄｍａｎら（編）（２００１）ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｐｏｏｌｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（編）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ．、ＰＡ；ＣｈａｂｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ．、ＰＡ）。
投与された抗体、サイトカインまたは他の治療用剤によって毒性がもたらされる場合、適切な用量は、治療効果が毒性効果を上回るものであり得る。一般的に、本発明の至適投薬量は、治療効果を最大限にする一方、毒性効果（あれば）を患者の生命にかかわらないレベルまたは治療用剤の有効性を低減しないレベルに制限するものである。毒性効果または抗治療効果の表示としては、限定されないが、例えば、抗イディオタイプ応答、治療用抗体に対する免疫応答、アレルギー反応、血液学的および血小板毒性、アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、クレアチンキナーゼの上昇、神経毒性、吐気および嘔吐が挙げられる（例えば、Ｈｕａｎｇら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６：４３１−４３４を参照）。
治療用剤の有効量は、症状を、通常、少なくとも１０％、より通常では少なくとも２０％、最も通常では少なくとも３０％、典型的には少なくとも４０％、より典型的には少なくとも５０％、最も典型的には少なくとも６０％、多くの場合、少なくとも７０％、より多くの場合では少なくとも８０％、および最も多くの場合では少なくとも９０％、慣用的には少なくとも９５％、より慣用的には少なくとも９９％、および最も慣用的には少なくとも９９．９％軽減または改善するものである。
本発明の試薬および方法は、任意選択で、１回だけのワクチン接種を含む；または第１のワクチン接種を含む；または少なくとも１回の追加免疫ワクチン接種；少なくとも２回の追加免疫ワクチン接種；もしくは少なくとも３回の追加免疫ワクチン接種を含むワクチンを提供する。追加免疫ワクチン接種のためのパラメータの手引きは入手可能である（例えば、Ｍａｒｔｈ（１９９７）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２５：１９９−２０３；Ｒａｍｓａｙら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：３８２−３８８；Ｇｈｅｒａｒｄｉら（２００１）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１６：６５５−６６７；Ｌｅｒｏｕｘ−Ｒｏｅｌｓら（２００１）Ａｃｔａ Ｃｌｉｎ．ＢｅＩｇ．５６：２０９−２１９；Ｇｒｅｉｎｅｒら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：６９４４−６９５１；Ｓｍｉｔｈら（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．７０：Ｓｕｐｐｌ．ｌ：Ｓ３８−Ｓ４１；Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ−Ａｍｏｒら（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：２７９０−２７９５を参照）。
リステリア属菌の細菌またはリステリア属菌ワクチンを含む第１の試薬、ならびに例えば、サイトカイン、小分子（シクロホスファミドもしくはメトトレキサートなど）、またはワクチン（サイトカインを発現する弱毒化腫瘍細胞もしくは弱毒化腫瘍細胞など）を含む第２の試薬が提供される。第１の試薬および第２の試薬の以下の投与方法が提供される。
リステリア属菌および第２の試薬は、同時に投与され得、すなわち、これらの試薬の各々の投与は、一部または完全に互いに重複する時間間隔で行なわれ得る。リステリア属菌および第２の試薬は、互いに重複しない時間間隔で投与され得る。例えば、第１の試薬はｔ＝０〜１時間の時間枠内で投与され得、一方で第２の試薬はｔ＝１〜２時間の時間枠内で投与され得る。また、第１の試薬はｔ＝０〜１時間の時間枠内で投与され得、一方で第２の試薬は、ｔ＝２〜３時間、ｔ＝３〜４時間、ｔ＝４〜５時間、ｔ＝５〜６時間、ｔ＝６〜７時間、ｔ＝７〜８時間、ｔ＝８〜９時間、ｔ＝９〜１０時間などの時間枠内のどこかで投与され得る。さらに、第２の試薬は、ｔ＝−２〜３時間、ｔ＝−３〜４時間、ｔ＝−４〜５時間、ｔ＝−５〜６時間、ｔ＝−６〜７時間、ｔ＝−７〜８時間、ｔ＝−８〜９時間、ｔ＝−９〜１０時間などの時間枠内のどこかで投与され得る。
別の例を示すと、第１の試薬はｔ＝０〜１日の時間枠内で投与され得、一方で第２の試薬はｔ＝１〜２日の時間枠内で投与され得る。また、第１の試薬はｔ＝０〜１日の時間枠内で投与され得、一方で第２の試薬は、ｔ＝２〜３日、ｔ＝３〜４日、ｔ＝４〜５日、ｔ＝５〜６日、ｔ＝６〜７日、ｔ＝７〜８日、ｔ＝８〜９日、ｔ＝９〜１０日などの時間枠内のどこかで投与され得る。さらに、第２の試薬は、ｔ＝−２〜３日、ｔ＝−３〜４日、ｔ＝−４〜５日、ｔ＝−５〜６日、ｔ＝−６〜７日、ｔ＝−７〜８日、ｔ＝−８〜９日、ｔ＝−９〜１０日などの時間のどこかで投与され得る。
別の態様では、リステリア属菌の投与は、投与によりリステリア属菌の血漿濃度のピーク（または最大平坦部）がもたらされるｔ＝０時間に開始され得、このとき、第２の試薬の投与は、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度に達する時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の９５％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の９０％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の８５％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の８０％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の７５％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の７０％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の６５％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の６０％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の５５％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の５０％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の４５％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の４０％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の３５％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の３０％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の２５％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の２０％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の１５％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の１０％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の５％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の２．０％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の０．５％になる時点あたり、血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の０．２％になる時点あたり、または血漿リステリア属菌の該濃度が上記ピーク濃度の０．１％もしくはそれ未満になる時点あたりに開始される。
別の態様では、第２の試薬の投与は、投与により第２の試薬の血漿濃度のピーク（または最大平坦部）がもたらされるｔ＝０時間に開始され得、このとき、リステリア属菌の投与は、第２の試薬の血漿レベルの該濃度が上記ピーク濃度に達する時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の９５％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の９０％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の８５％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の８０％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の７５％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の７０％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の６５％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の６０％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の５５％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の５０％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の４５％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度のになる時点あたり４０％、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の３５％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の３０％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の２５％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の２０％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の１５％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の１０％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の５％になる時点あたり、試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の２．０％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の０．５％になる時点あたり、第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の０．２％になる時点あたり、または第２の試薬の該血漿濃度が上記ピーク濃度の０．１％もしくはそれ未満になる時点あたりに開始される。リステリア属菌または第２の試薬の改変がインビボで起こり得ることが認識されるため、上記の濃度は、インタクトな試薬の測定後、またはインタクトな試薬の同定可能な分解生成物の測定後に評価され得る。
治療用および診断用剤の製剤は、保存のために、生理学的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤と混合することにより、例えば、凍結乾燥された粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態で調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照）。
一部のある態様において、本発明はまた、リステリア属菌体、リステリア菌の細胞培養物または凍結乾燥細胞調製物および画分を含むキットを提供する。また、本発明は、リステリア属菌体、リステリア菌の細胞培養物または凍結乾燥細胞調製物および試薬を含むキットを提供する。また、リステリア属菌体、リステリア菌の細胞培養物または凍結乾燥細胞調製物および使用もしくは廃棄のための使用説明書を含むキットが提供される。さらに、本発明は、リステリア属菌体、リステリア菌の細胞培養物または凍結乾燥細胞調製物および画分ならびに試薬を含むキットを提供する。
本発明は、特定のある実施形態において、投与された弱毒化リステリア属菌に応答した組織または器官の炎症を評価するためのキットおよび方法を提供する。炎症には、免疫細胞、白血球、リンパ球、好中球、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、Ｂ細胞、プレ樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球および／または肥満細胞、あるいは上記の任意の組合せなど（生物学的画分内に見られるもの）の数の増加が包含される。本発明のキットはまた、上記の細胞の１つ以上の成熟状態または活性化状態の評価を提供する。細胞およびその数を同定するため、器官、組織または腫瘍は、免疫細胞を分散させるためメッシュフィルターに通して圧縮され、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）を用いて精製され、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によって同定され得る（例えば、Ｗｏｏら（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５８：４８４−４９１；Ｇｏｏｓｓｅｎｓら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３２：１３７−１４４を参照）。炎症は、組織１グラムあたりの細胞数、または非炎症状態の数と比較した組織１グラムあたりの細胞の増加として測定され得る。また、リステリア属菌誘導性組織損傷を評価するための方法、例えば、白血球増加症、リンパ球減少症および／または血清トランスアミナーゼのアッセイが利用可能である（Ａｎｇｅｌａｋｏｐｏｕｌｏｓら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７０：３５９２−３６０１；Ｒｏｃｈｌｉｎｇ（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃｏｒｎｅｒｓｔｏｎｅ ３：１−１２；Ｒｏｅ（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ ４：１７４−１８２）。
本発明の組成物としては、非医薬組成物（例えば、純粋でない、または非滅菌組成物）の製造に有用なバルク薬物組成物および医薬組成物（すなわち、被験体または患者への投与に適した組成物）が挙げられ、これらは、単位投薬形態の調製において使用され得る。
さらに、本発明には、診断用ツール、例えば、超音波、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴、癌遺伝子における点変異、欠失または改変ＤＮＡメチル化の解析、細胞増殖マーカー、血管形成関連マーカー、倍数性の組織学的解析、または腫瘍性病変の分化状態の評価を用いて、本発明の試薬および方法の有効性を評価するための方法が包含される（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎ（２００１）Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２１：２２５−２３６；Ｆｅｉｔｅｌｓｏｎら（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１：２５９３−２６０４；ＱｉｎおよびＴａｎｇ（２００２）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．８：３８５−３９２；Ｂｒａｇａら（２００３）Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ ２１：８７１−８７７を参照）。
ある種のリステリア属菌またはその組成物は、該リステリア属菌が適当なモデル系において免疫応答を刺激する能力を試験することにより、特定の状態の処置に有用であるか否か、または哺乳動物の特定の型の癌細胞、腫瘍もしくは感染性因子に対する免疫応答の誘導に有用であるか否かが決定され得る。免疫応答は、例えば、マウスもしくは他のモデル系へのリステリア属菌の投与後のサイトカインの測定によって、または動物内もしくは動物の肝臓内のある種の細菌集団（例えば、ＮＫ細胞）レベルの測定によって評価され得、これは、後述の実施例およびＹｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６６：１０９６−１１０４（２００６）（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に示されている。また、ワクチン組成物の治療有効性は、マウスモデルなどの動物モデルへの免疫原性組成物またはワクチンを投与した後、生存、腫瘍増殖、腫瘍数または感染性因子の力価を、リステリア属菌の投与後、数日間、数週間または数ヶ月間（例えば、生得的免疫を評価するため）、また、後続の再抗原刺激後（例えば、後天性免疫を評価するため）のいずれかで評価することによって、より直接的に評価され得る。Ｊａｉｎら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１０：８１０−８２０（２００３）（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）、およびＹｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６６：１０９６−１１０４（２００６）に記載された半脾臓注射手法は、肝転移に対するリステリア属菌の効果の調査のためのモデル系の作製に特に有用である。
ＶＩＩＩ．使用．
本発明は、限定されないが、増殖性状態または障害を処置するための免疫細胞の漸増および／または活性化における使用のために弱毒化リステリア属菌を投与するための方法を提供する。リステリア属菌が天然状態で蓄積される組織または器官、例えば、肝臓における状態または障害を処置するための方法が提供される。本発明は肝臓障害を処置することに限定されないが、リステリア菌は肝親和性細菌であることに注目されたい。例えば、尿路経由、生殖路経由、胃腸管経由または吸入による、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経口でのリステリア属菌の投与方法が利用可能である（Ｄｕｓｔｏｏｒら（１９７７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５：９１６−９２４；ＧｒｅｇｏｒｙおよびＷｉｎｇ（２００２）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７２：２３９−２４８；Ｈｏｆら（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．１０：３４５−３５７；Ｓｃｈｌｕｔｅｒら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．２０１：１８８−１９５；Ｈｏｆ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５：１７２７−１７３５；Ｈｅｙｍｅｒら（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ １６（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ１０６−Ｓ１１１；Ｙｉｎら（２００３）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ １１１：５２４−５３０）。
一部のある実施形態において、用語「処置」は、疾患または他の状態に関して使用され、有益なまたは所望の臨床成績を得るためのアプローチが包含される。一部のある実施形態において、有益なまたは所望の臨床成績としては、限定されないが、病状と関連する１つ以上の症状の軽減、生存の延長（処置を受けていない場合の予想生存と比較して）、病状の状態安定化（すなわち、悪化しない）、病状の進行の遅延もしくは遅滞、病状の改善もしくは緩和、寛解（一部もしくは完全にのいずれか）、病状の改善、病状の治癒、病状の重症度の低下および／または病状に罹患した人の生活の質の増大が挙げられる。本明細書に記載の組成物が癌の処置に使用される実施形態において、有益なまたは所望の結果としては、限定されないが、以下：腫瘍性もしくは癌性細胞の増殖の低減（もしくは破壊）、腫瘍性細胞転移の抑制、腫瘍の大きさの縮小、腫瘍の増殖の抑制、腫瘍の退行、癌の寛解、癌に起因する症状の減少、癌に罹患した人の生活の質の向上、癌の処置に必要とされる他の薬物適用の用量の減少、癌の進行の遅延および／または癌を有する患者の生存の延長の１つ以上が挙げられ得る。一部のある実施形態において、病状（例えば、癌性または感染状態）の処置は、該状態の抑制または低減を含む。特定のある実施形態において、病状（例えば、癌性または感染状態）の処置は生存の増進を含む。
本発明は、腫瘍抗原または癌抗原をコードする核酸を含まないリステリア属菌の投与を包含し、肝臓、胆嚢、皮膚、肺、筋肉、心臓、結合組織、血管、膵臓、口、舌、喉、胃、小腸、大腸、結腸、直腸、前立腺、副腎、脳、神経系、目、脾臓、骨、骨髄、内分泌系、細網内皮系、免疫系、リンパ腺、生殖器官、卵巣、子宮などの腫瘍、癌および前癌性障害の処置における用途が見出される。本発明は、感染性生物体（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫）の抗原をコードする核酸を含まないリステリア属菌の投与を包含し、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルス、例えば、ＳＶ４０、ヒトパピローマウイルスなどの処置における用途が見出される。
本発明は、腫瘍抗原または癌抗原をコードする核酸を含まないリステリア属菌の投与を包含し、肝臓、胆嚢、皮膚、肺、筋肉、心臓、結合組織、血管、膵臓、口、舌、喉、胃、小腸、大腸、結腸、直腸、前立腺、副腎、脳、神経系、目、脾臓、骨、骨髄、内分泌系、細網内皮系、免疫系、リンパ腺、生殖器官、卵巣、子宮などの腫瘍、癌および前癌性障害の予防における用途が見出される。本発明は、感染性生物体（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫）の抗原をコードする核酸を含まないリステリア属菌の投与を想定し、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルス、例えば、ＳＶ４０、ヒトパピローマウイルスなどによる感染症の予防における用途が見出される。
本発明は、腫瘍抗原または癌抗原をコードする核酸を含まないリステリア属菌の投与を包含し、肝臓、胆嚢、皮膚、肺、筋肉、心臓、結合組織、血管、膵臓、口、舌、喉、胃、小腸、大腸、結腸、直腸、前立腺、副腎、脳、神経系、目、脾臓、骨、骨髄、内分泌系、細網内皮系、免疫系、リンパ腺、生殖器官、卵巣、子宮などの腫瘍、癌および前癌性障害に対する生存、すなわち生存期間の改善（数日間、数ヶ月および／または数年の単位で）における用途が見出される。本発明は、感染性生物体（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫）の抗原をコードする核酸を含まないリステリア属菌の投与を包含し、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルス、例えば、ＳＶ４０、ヒトパピローマウイルスなどの処置における用途が見出される。
本発明により、異常増殖細胞の数の低減、癌細胞の数の低減、腫瘍細胞の数の低減、腫瘍体積の低減、単位生体液または組織（例えば、血清）、あたりの感染性生物体または病原体の数の低減、ウイルス力価（例えば、血清）の低減がもたらされ、このとき、通常、少なくとも５％低減され、より通常では少なくとも１０％低減され、最も通常では少なくとも１５％低減され、好ましくは少なくとも２０％低減され、より好ましくは少なくとも２５％低減され、最も通常では少なくとも３０％低減され、通常、少なくとも４０％低減され、より通常では少なくとも５０％低減され、最も通常では少なくとも６０％低減され、慣用的には少なくとも７０％低減され、より慣用的には少なくとも８０％低減され、最も慣用的には少なくとも９０％低減され、およびさらに最も慣用的には少なくとも９９％低減される。低減の単位は、限定されないが、腫瘍細胞数／哺乳動物被験体；腫瘍細胞数／肝臓；腫瘍細胞数／脾臓；腫瘍細胞質量／哺乳動物被験体；腫瘍細胞質量／肝臓；腫瘍細胞質量／脾臓；肝臓１グラムあたりのウイルス粒子もしくはウイルスの数または力価；細胞１つあたりのウイルス粒子もしくはウイルスの数または力価；血液１ｍｌあたりのウイルス粒子もしくはウイルスの数または力価；などであり得る。
本発明は、癌性状態を有するか、または腫瘍、細胞もしくは感染性因子を含む哺乳動物の処置方法を提供する。一部のある実施形態において、癌または腫瘍は転移性である。一部のある実施形態において、該癌性状態は、肝臓の癌または腫瘍である。一部のある実施形態において、該状態は肝臓に転移した癌を含む。一部のある実施形態において、肝臓の癌細胞または腫瘍は、胃腸管、肝細胞癌細胞、血管肉腫細胞または類上皮血管内皮腫細胞由来の転移性細胞である。一部のある実施形態において、癌は結腸癌である。
本発明は、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞ならびに他のＡＰＣ、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびガンマデルタＴ細胞によって媒介される生得的応答を刺激するための試薬および方法を提供する。
例えば、ＡＰＣ、肝臓に遊走するＡＰＣ、生成して肝臓内で成熟するＡＰＣ、または肝臓内に存在するＡＰＣ、例えば、樹状細胞（ＤＣ）、クップファー細胞または肝臓洞様毛細血管内皮細胞（ＬＳＥＣ）などによって媒介される生得的応答を刺激するための試薬および方法が提供される。本発明は、別途明白な記載がないか、または文脈に示されない限り、受容体、シグナル伝達分子、または生得的応答を媒介する細胞限定されない。
リステリア属菌を調製するために使用される増殖培地は、化学的解析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、ガスクロマトグラフィー、分光測光的方法などによって特性評価され得る。増殖培地はまた、リステリア属菌とともに侠雑物として、例えば、リステリア菌の粉末、凍結調製物または細胞ペースト中の侠雑物として存在する該培地の成分に特異的な抗体によっても特性評価され得る。ペプチドもしくはタンパク質抗原または糖脂質、糖ペプチドもしくはリポペプチド抗原に特異的な抗体が、動物起源の侠雑物を検出するために考案されたＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用され得る。動物起源の抗原または抗原性の断片の検出における使用のための抗体が利用である（例えば、Ｆｕｋｕｔａら（１９７７）Ｊｐｎ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．１８：６９６−７０４；ＤｅＶａｙおよびＡｄｌｅｒ（１９７６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：１４７−１６８；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８４）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４６：３４−４１；Ｋａｗａｋｉｔａら（１９７９）Ｊｐｎ．Ｃｉｒ．Ｊ．４３：４５２−４５７；Ｈａｎｌｙら（１９９４）Ｌｕｐｕｓ ３：１９３−１９９；Ｈｕｐｐｉら（１９８７）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１２：６５９−６６５；Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２５：２９１−２９９を参照）。本発明は、免疫系に対するリステリア属菌の影響を試験を容易化するキットおよび診断方法を提供する。試験は、あるリステリア属菌株と別のリステリア属菌株の比較、または親リステリア属菌株と変異リステリア属菌株との比較を伴うものであり得る。試験方法には、例えば、食作用、拡散、抗原提示、Ｔ細胞刺激、サイトカイン応答、宿主毒性、ＬＤ５０、および病理学的状態の改善における有効性が含まれる。
本発明は、増殖性障害、癌、腫瘍、免疫障害および／または感染性因子に対する被験体、宿主、患者、試験被験体、実験用被験体、獣医学的被験体などの生存を増進させる方法を提供する。感染性因子は、ウイルス、細菌もしくは寄生虫またはその任意の組合せであり得る。該方法は、例えば、懸濁液、ボーラス、ゲル、マトリックス、注射または輸液などとしての弱毒化リステリア属菌の投与を含む。投与されたリステリア属菌は、適切な対照（例えば、なにも投与しないか、プラセボ投与など）と比べ、通常、少なくとも１日；より通常では少なくとも４日間；最も通常では少なくとも８日間、通常、少なくとも１２日間；より通常では少なくとも１６日間；最も通常では少なくとも２０日間、多くの場合、少なくとも２４日間；より多くの場合では少なくとも２８日間；最も多くの場合では少なくとも３２日間、慣用的には少なくとも４０日間、より慣用的には少なくとも４８日間；最も慣用的には少なくとも５６日間；典型的には、少なくとも６４日間；より典型的には、少なくとも７２日間；最も典型的には少なくとも８０日間；一般的に、少なくとも６ヶ月；より一般的には少なくとも８ヶ月；最も一般的には少なくとも１０ヶ月；一般的には少なくとも１２ヶ月；より一般的には少なくとも１６ヶ月；および最も一般的には少なくとも２０ヶ月またはそれ以上、生存を増進させる。
本発明は、投与される弱毒化リステリア属菌が他の型の細菌を少なくとも９０％非含有である、他の型の細菌を少なくとも９５％非含有である、他の型の細菌を少なくとも９９％非含有である、または他の型の細菌を少なくとも９９．９％非含有である組成物として投与される上記に開示した各実施形態を提供する。他の型の細菌としては、例えば、上記に開示したもの以外の血清型のリステリア菌が挙げられる。また、他の型の細菌としては、例えば、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌ、ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられる（Ｓｉｌｖａら（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８１：２４１−２４８；ＰｉｎｉおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３１７−３２６；Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｔｓ（２００３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｓｔｓ ｉｎ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｔｒｕｓｔｅｅｓ、ｐｐ．２１４８−２１６２）。
本発明のまた別の実施形態は、有効な数または量の死菌であるが代謝的に活性なリステリア属菌を投与することを含む、増殖性障害のリスクのある被験体または哺乳動物被験体における増殖性障害の予防方法を提供する。提供されるのは、死菌であるが代謝的に活性なリステリア属菌が、（ａ）リステリア菌ゲノムの架橋；（ｂ）核酸標的化化合物を含むリステリア菌ゲノムの架橋；（ｃ）ソラレンを含むリステリア菌ゲノムの架橋；（ｄ）核酸標的化化合物を含むリステリア菌ゲノムの鎖間架橋；および／または核酸標的化化合物を含むリステリア菌ゲノムの鎖間架橋；（ｅ）ビルレンス因子における弱毒化；（ｆ）ａｃｔＡ（例えば、ΔａｃｔＡなど）における弱毒化；（ｇ）ｉｎｌＢ（例えば、ΔｉｎｌＢなど）における弱毒化；（ｈ）ａｃｔＡおよびｉｎｌＢにおける弱毒化；（ｉ）弱毒化ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣまたはｕｖｒＡＢ（例えば、ΔｕｖｒＡＢなど）；（ｊ）弱毒化ｕｖｒＡＢ、鎖間ソラレン架橋および弱毒化ａｃｔＡ；（ｋ）弱毒化ｕｖｒＡＢ、鎖間ソラレン架橋および弱毒化ｉｎｌＢ；（１）ΔｕｖｒＡＢ、鎖間ソラレン架橋およびΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの１つ以上を含む上記の方法である。
本発明は、死菌であるが代謝的に活性な（ＫＢＭＡ）リステリア属菌の細菌またはリステリア属菌株を提供する（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．［７月２４日に印刷前に電子公開］を参照）。ＫＢＭＡリステリア属菌の細菌は代謝的に活性であるが、例えば、寒天上でコロニーを形成することができない。少なくとも１つのＤＮＡ修復遺伝子における変異、例えば、ΔｕｖｒＡＢを不活化することにより、低濃度の核酸架橋剤（例えば、ソラレン）の濃縮物を用いたリステリア属菌の死滅が可能になり、ここで、該濃度は、コロニー形成を抑制するのに充分であるが、代謝を実質的に障害するには充分でないものである。ソラレン／ＵＶＡ光での限定的な処置の結果および／または鎖間ゲノム架橋の作製に高度に特異的な核酸架橋剤での処置の結果は、該細菌体が死菌であるが代謝的に活性なままであるというものである。
上記に開示した方法の各々では、リステリア属菌と賦形剤、リステリア属菌と担体、リステリア属菌とバッファー、リステリア属菌と試薬、リステリア属菌と薬学的に許容され得る担体、リステリア属菌と農業的に許容され得る担体、リステリア属菌と獣医学的に許容され得る担体、リステリア属菌と安定剤、リステリア属菌と防腐剤を含む組成物などを投与することが想定される。
本発明は、一部のある実施形態において、癌性（新生物、悪性腫瘍、癌、腫瘍および／または前癌性障害、異形成など）ならびに感染性（感染症）の両方である状態を処置するための試薬および方法を提供する。癌性（新生物、悪性腫瘍、癌、腫瘍および／または前癌性障害、異形成など）ならびに感染性の両方である障害を処置するための試薬および方法が提供される。ある種のウイルス、例えば、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなどによる感染では、結果が癌性状態となり得、ここで、該状態は癌性および感染性の両方である。癌性および感染性の両方である状態は、非限定的な例として、ウイルス感染により癌性細胞がもたらされる場合、および癌性細胞がウイルスコード抗原を発現する場合に検出され得る。別の非限定的な例として、癌性および感染性の両方である状態は、腫瘍細胞に対する免疫応答が、ウイルスコード抗原に対する特異的認識を伴うものである（例えば、Ｍｏｎｔｅｓａｎｏら（１９９０）Ｃｅｌｌ ６２：４３５−４４５；ＩｃｈａｓｏおよびＤｉｌｗｏｒｔｈ（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：７９０８−７９１６；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３９３３−３９４１；Ｄａｅｍｅｎら（２００４）Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．９：７３３−７４２；Ｂｏｕｄｅｗｉｊｎら（２００４）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９６：９９８−１００６；Ｌｉｕら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１４５６７−１４５７１を参照）。
一部のある実施形態において、本明細書に記載の方法は霊長類に適用される。一部のある実施形態において、本明細書に記載の方法は、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サル、ウサギまたはウマに適用される。一部のある実施形態において、本明細書に記載の方法はヒトに適用される。
本発明の広範な範囲は、以下の実施例を参照すると最良に理解されよう。実施例は、本発明をなんら特定の実施形態に限定することを意図しない。
Ｉ．一般法．
生化学および分子生物学の標準的な方法は記述されている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、第２１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｉｎｎｉｓら（編）（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．を参照。また、標準的な方法は、Ａｕｓｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１〜４巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（これには、細菌細胞のクローニングおよびＤＮＡ変異誘発（第１巻）、哺乳動物細胞および酵母のクローニング（第２巻）、複合糖質およびタンパク質発現（第３巻）ならびにバイオインフォマティクス（第４巻）が記載されている）を見るとよい。融合タンパク質の作製方法は記述されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２００５）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ；Ｌｉｕら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．２：１０７−１２１；Ｇｒａｄｄｉｓら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２８５−２９７を参照）。スプライス重複伸長ＰＣＲおよび関連する方法は記述されている（例えば、Ｈｏｒｔｏｎら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：５２８−５３５；Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８；Ｈｏｒｔｏｎ（１９９５）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：９３−９９；Ｗａｒｒｅｎｓら（１９９７）Ｇｅｎｅ １８６：２９−３５；ＧｕｏおよびＢｉ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９２：１１１−１１９；Ｊｏｈｎｓｏｎ（２０００）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４１：２０１−２０９；Ｌａｎｔｚら（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．５：８７−１３０；ＧｕｓｔｉｎおよびＢｕｒｋ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：８５−９０；ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡを参照）。宿主の至適コドンに適合させるためのシグナルペプチド、分泌タンパク質および異種抗原のコドン優先性の操作は記述されている（Ｓｈａｒｐら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：１２８１−１２９５；Ｕｃｈｉｊｉｍａら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５５９４−５５９９）。
タンパク質精製のための方法、例えば、免疫沈降、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動法、遠心分離および結晶化などは記述されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。タンパク質の化学解析、化学改変、翻訳後修飾およびグリコシル化は記述されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗａｌｋｅｒ（編）（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｗｏｔａ、ＮＪ；Ｌｕｎｄｂｌａｄ（１９９５）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬを参照。結合相互作用の特性評価のための手法は記述されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｐａｒｋｅｒら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５：７７−８８；Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５：２２９−２４０；Ｎｅｒｉら（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１２７１−１２７５；Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０−６２７；Ｆｒｉｇｕｅｔら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７７：３０５−３１９；Ｈｕｂｂｌｅ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：３０５−３０６；Ｓｈｅｎら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４７３１１−４７３１９）。
例えば、抗原性の断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能的ドメイン、グリコシル化部位および配列アラインメントを測定するためのソフトウェアパッケージが利用可能である（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ、Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎら（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０を参照）。コード配列（ＣＤＳ）を調べるための方法が利用可能である（Ｆｕｒｏｎｏら（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：１４７８−１４８７）。
ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを同定するためのコンピュータアルゴリズム（例えば、ＢＩＭＡＳ；ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ）が利用可能である（Ｔｈｏｍａｓら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：２９７−３０６）。このようなアルゴリズムにより、同定されるペプチドを含むタンパク質をコードする本発明の核酸が提供され得る。
リステリア菌のタンパク質および核酸の配列は、（１）ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；（２）ｇｅｎｏｌｉｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ（「ｌｉｓｔｉｌｉｓｔ」をクリック）；および（３）ｔｉｇｒ．ｏｒｇ（「ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｉｃｒｏｂｉｃａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ」をクリック）のワールドワイドウェブに見出され得る。
ＡＰＣによるリステリア属菌のインターナリゼーションを評価するため、およびＡＰＣによるリステリア菌コード抗原の提示を評価するための方法が利用可能である。また、Ｔ細胞へのこのような抗原の提示のための方法、およびＴ細胞の抗原依存的初回抗原刺激を評価するための方法も利用可能である。適当なＡＰＣは、マウスＤＣ ２．４細胞株であり、適当なＴ細胞はＢ３Ｚ Ｔ細胞ハイブリドーマである（例えば、２００３年７月２４日に出願された米国特許仮出願第６０／４９０，０８９号；Ｓｈｅｎら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２７２３−２７３０；Ｋａｗａｍｕｒａら（２００２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：５７０９−５７１５；Ｇｅｇｉｎａｔら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１８７７−１８８４；Ｓｋｏｂｅｒｎｅら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２２０９−２２１８；Ｗａｎｇら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０９１−１０９７；Ｂｕｌｌｏｃｋら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２３５４−２３６１；Ｌｉｐｐｏｌｉｓら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５０８９−５０９７を参照）。樹状細胞（ＤＣ）の調製、ＤＣのエキソビボ改変、および改変ＤＣの投与（例えば、癌、病原体または感染性因子の処置のため）のための方法が利用可能である（例えば、Ｒｉｂａｓら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２７：３５４−３６７；ＧｉｌｂｏａおよびＶｉｅｗｅｇ（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９９：２５１：２６３；Ｄｅｅｓら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５３：７７７−７８５；Ｅｒｉｋｓｓｏｎら（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１２７２−１２８１；Ｇｏｌｄｓｚｍｉｄら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：５９４０−５９４７；ＣｏｕｇｈｌｉｎおよびＶｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：４６６−４７０；ＣｏｌｉｎｏおよびＳｎａｐｐｅｒ（２００３）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．５：３１１−３１９を参照）。
免疫細胞を特性評価するためのＥｌｉｓｐｏｔアッセイおよび細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）が利用可能である（例えば、Ｌａｌｖａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５；Ｗａｌｄｒｏｐら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１７３９−１７５０；Ｈｕｄｇｅｎｓら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８８：１９−３４；Ｇｏｕｌｄｅｒら（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１３３９−１３４７；Ｇｏｕｌｄｅｒら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１８１９−１８３１；ＡｎｔｈｏｎｙおよびＬｅｈｍａｎ（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９：２６０−２６９；ＢａｄｏｖｉｎａｃおよびＨａｒｔｙ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３８：１０７−１１７を参照）。
癌、転移および血管形成の試験における動物の使用方法、ならびにヒト処置に外挿するための動物腫瘍データの使用方法が利用可能である（例えば、ＨｉｒｓｔおよびＢａｌｍａｉｎ（２００４）Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４０：１９７４−１９８０；Ｇｒｉｓｗｏｌｄら（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１０：２５５−２６１；Ｈｏｆｆｍａｎ（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １７：３４３−３５９；Ｂｏｏｎｅら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：２−９；Ｍｏｕｌｄｅｒら（１９８８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１４：９１３−９２７；ＴｕｖｅｓｏｎおよびＪａｃｋｓ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１２：１０５−１１０；Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｇｒｕｓｂｙ（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１：５５０４−５５１４；Ｔｅｉｃｈｅｒ、Ｂ．Ａ．（２００１）Ｔｕｍｏｒ Ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ；Ｈａｓａｎら（２００４）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ７：１−１６；Ｒａｄｏｖａｎｏｖｉｃら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｓ．１１７：９７−１１４；ＫｈａｎｎａおよびＨｕｎｔｅｒ（２００４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｅｐｔ．９［印刷前に電子公開］；ＣｒｎｉｃおよびＣｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４８：５７３−５８１を参照）。
結腸直腸癌の肝転移は、腫瘍細胞の一次肝臓注射、門脈注射または完全脾臓注射を用いて生成させ得る（例えば、Ｓｕｈら（１９９９）Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ７２：２１８−２２４；ＤｅｎｔおよびＦｉｎｌｅｙ−Ｊｏｎｅｓ（１９８５）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５１：５３３−５４１；Ｙｏｕｎｇら（１９８６）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．７６：７４５−７５０；Ｗａｔｓｏｎら（１９９１）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９：１２６−１３８を参照）。
ＩＩ．動物腫瘍モデルに関する方法
本発明の研究に使用されたリステリア菌株は報告されている（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１３８３２−１３８３７を参照）。リステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）からＰＴＡ−５５６２で入手可能である。リステリア菌ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢは、ＡＴＣＣからＰＴＡ−５５６３で入手可能である。他のリステリア菌の菌株が利用可能である（例えば、Ｐｏｒｔｎｏｙらの米国特許公開公報第２００４／００１３６９０号を参照）。
いくつかの動物腫瘍モデルを使用し、ここで、これらのモデルには、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよび同系結腸直腸癌細胞株ＣＴ２６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６３８）を用いた。本発明で用いたモデルには、（１）皮下ＣＴ２６腫瘍；および（２）外科的に両断した脾臓の半分に腫瘍細胞を注射後、直ちに注射した半分を切除したもの（半脾臓モデル）を含めた。半脾臓モデルは、脾臓に原発性腫瘍をもたらさずに、結腸直腸癌の肝転移を確立した。半脾臓法は、注射された脾臓における原発性腫瘍の存在なしで、門脈循環による肝臓への腫瘍細胞の播種を可能にする。表示した場合は、マウスをＧＭ−ＣＳＦ分泌腫瘍ワクチンで処置し、このとき、ワクチン接種は腫瘍抗原刺激の３日後に開始した。
不死化マウス結腸直腸癌細胞株（ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドマウス直腸組織をメチルコラントレンに曝露して作製）であるＣＴ２６を用い、本試験に用いる腫瘍を確立した（Ｃｏｒｂｅｔｔら（１９７５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５：２４３４−２４３９）。該ワクチン細胞株は、マウスＧＭ−ＣＳＦを分泌するように、複製欠陥ＭＦＧレトロウイルスベクターを用いて形質導入したＣＴ２６細胞由来のものであった（Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３５３９−３５４３）。腫瘍細胞株を、（ｖｏｌ／ｖｏｌ）９００ｍｌ ＲＰＭＩ培地、１００ｍｌ １０％熱不活化ウシ胎仔血清、１０ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍｌ）、１０ｍｌ ＭＥＭ非必須アミノ酸（１０ｍＭ）、１０ｍｌ ＨＥＰＥＳバッファー（１ Ｍ）、１０ｍｌピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）および１０ｍｌ Ｌ−グルタミン酸塩（２００ｍＭ）を含有する腫瘍培地中で培養した。
皮下腫瘍モデルの試験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．０５ｍｌ ＨＢＳＳ中に懸濁した１０万のＣＴ２６結腸直腸癌細胞を、左下の乳頭下方に注射した。対照マウスでは、腫瘍を２８日間培養した。腫瘍は、カリパスを用いて３次元で隔週で測定した。処置マウスにはＧＭ−ＣＳＦ分泌腫瘍細胞を、隔週ベースでワクチン接種した。
半脾臓注射は以下のとおりとした。ＢＡＬＢ／ｃマウスに麻酔し、脾臓を露出させた。脾臓を２つの半脾臓に分割し、血管茎は無傷の状態にした。２７ゲージニードルを用い、約１０万の生ＣＴ２６細胞を含む０．４ｍｌ ＨＢＳＳバッファーを脾臓内に注射し、かくして細胞を肝臓に流動させた。血管茎排出性（ｄｒａｉｎｉｎｇ）癌混入半脾臓をクリップで結紮し、ＣＴ２６混入半脾臓を切除し、腫瘍細胞のない機能性の半脾臓は残した。
表示した１つの試験を除き、すべての試験において、ワクチン（腫瘍細胞ワクチン）は、腫瘍細胞をγ線で処理することにより調製した。この１つの試験では、ワクチンは、光化学的処理（ソラレンおよびＵＶ光）によって調製した。表示した場合を除き、すべての試験において、投与するイノキュラムに使用した病理ＣＴ２６腫瘍細胞（ワクチンに用いた弱毒化ＣＴ２６細胞ではない）の数を約１０万細胞とした。腫瘍細胞をγ線または光化学的処理に供することにより、抗原（１種類または複数種）を提供し得、ＧＭ−ＣＳＦなどの免疫調節因子を発現し得るが、増殖および／または複製ができない弱毒化腫瘍細胞がもたらされる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸がワクチンの一部として使用される場合、用語「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」が互換的に使用され得る。
一般に、リステリア属菌を受けたマウスは、体重が２０〜２５グラムで、約０．００６６平方メートルの表面積を有した。
抗ＣＤ １６／３２、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ２５および抗ＣＤ３は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のものであった。ＮＫ細胞およびＮＫ−Ｔ細胞の総数を、以下のカクテル：すべての白血球を染色し、これらを残余肝臓細胞から分離するためのＣＤ４５、およびＢ細胞を解析から排除するためのＣＤ１９を用いて調べた。次いで、ＤＸ−５に対するＣＤ３の２パラメータプロットを用い、Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＤＸ−５−）、ＮＫ細胞（ＤＸ−５＋ＣＤ３−）およびＮＫ−Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＤＸ−５＋）を同定した。
ＩＩＩ．弱毒化リステリア属菌（ワクチンなし）の投与により肝臓腫瘍（半脾臓注射モデルにより作製）に対する生存が増進された
肝腫瘍は、マウスにおいて以下のとおりに誘導した。ＣＴ２６腫瘍細胞をすべてのマウスに対して第０日（ｔ＝０日）に投与し、肝腫瘍形成を開始させた。マウスは、リステリア属菌なし（−■−小四角の下側の下側曲線）、表示した量のリステリア属菌ΔａｃｔＡ（−◇−白菱形；−▲−三角形；−●−黒丸）；または表示した量のリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（−▽−逆三角形；−■−大四角の上側曲線；−◆−黒菱形）で静脈内（ｉ．ｖ．）処置した（図１Ａ）。
以下のことは、マウスに与えたリステリア属菌の投与回数に関する。「１×」は、表示したリステリア属菌株が、腫瘍移植後ｔ＝３日でのみ投与されたこと（１回の投与のみ）を意味する。「３×」は、表示したリステリア属菌株がｔ＝３日、６日および９日に投与されたことを意味する。「５×」は、表示したリステリア属菌株がｔ＝３日、６日、９日、１２日および１５日に投与されたことを意味する。投与したリステリア属菌ΔａｃｔＡ細胞の数は、約１×１０７コロニー形成単位（ＣＦＵ）として、一方、投与したリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの数は約２×１０７ＣＦＵとした（図１Ａ）。
結果は以下のとおりであった。腫瘍担持マウスにリステリア属菌を投与しなかった場合、マウスの５０％が２５日間までに死亡し、第４２日までに１００％が死亡した。対照的に、リステリア属菌ΔａｃｔＡまたはリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢで処置したマウスは、生存の増進を示した。例えば、ｔ＝２５日では、リステリア属菌ΔａｃｔＡまたはリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢのいずれかを受けたすべてのマウスは、少なくとも９０％の生存率を示した。生存率は、リステリア属菌ΔａｃｔＡを３×または５×投与で与えた場合で最大であった（図１Ａ）。
別個の試験（図１Ｂ）において、ＣＴ２６腫瘍細胞処置マウスに、リステリア属菌なし（−■−；四角）；リステリア属菌ΔａｃｔＡ（３日毎、全部で３回投与）（−◆−；菱形）；リステリア属菌ΔａｃｔＡ（毎週、全部で３回投与）（−△−；白三角形）；リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３日毎、全部で３回投与）（−●−黒丸）；またはリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（毎週、全部で３回投与）（−▽−；白逆三角形）を与えた。その結果、処置なしでは、すべての動物がｔ＝３０日前に死亡するが、リステリア処置により、ｔ＝１００日で５０％までの動物に生存がもたらされることが示された（図１Ｂ）。この場合も、図１Ａ、Ｂのデータを得るために使用したリステリア属菌は、異種抗原をコードする任意の核酸を含むように操作したものではなかった。
さらに別の試験（図１Ｃ）では、ＣＴ２６腫瘍細胞接種マウスを以下のとおりに処置した。グルコースを含まない酵母培養液上で細菌を培養し、該細菌はｉ．ｖ．投与した。マウスには、リステリア属菌なし（−◆−；菱形）；リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３×１０７ＣＦＵ、３日毎、全部で３回投与）（−■−；四角）；リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３×１０５ＣＦＵ、３日毎、全部で３回投与）（−▲−；黒三角形）；リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３×１０３ＣＦＵ、３日毎、全部で３回投与）（−●−；黒丸）；リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３×１０７ＣＦＵ、毎週、全部で３回投与）（−□−；白四角）；リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３×１０５ＣＦＵ、毎週、全部で３回投与）（−△−；白三角形）；リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３×１０３ＣＦＵ、毎週、全部で３回投与）（−○−；白丸）を与えた。見られ得る観察結果は、処置なしでは、すべての動物がｔ＝３０日までに死亡したが、リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３×１０７ＣＦＵ）を毎週受けたマウス（−□−；白四角）は最長の生存を有したというものである。
異種抗原を発現するように操作されていないリステリア属菌で処置した腫瘍担持マウスの試験を継続し、ここで、これらの継続した試験には、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）；ＣＴＸ）の投与を含めた（図１ＤおよびＩＥ）。ＣＴＸ処置（ｔ＝第４日）の日は一定に維持したが、リステリア属菌投与の日は種々に変化させた（図１Ｄ）。投与する場合は、ＣＴＸは５０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）で与えた。リステリア菌の用量はすべて、３×１０７とし、該細菌は、グルコースを含まない酵母培養液中で培養することにより調製した。以下に図の説明を示す：処置なし（−■−；黒四角）；ＣＴＸのみ（第４日に注射）（−●−；黒丸）；リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢのみ（リステリア属菌は第３、１０、１７日に投与）（−▲−；黒三角形）；ＣＴＸ（第４日）とともにリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（リステリア属菌は第５、１２および１９日に投与）（−○−；白丸）；ＣＴＸ（第４日）とともにリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（リステリア属菌は第６、１３および２０日に投与）（−□−；白四角）；ＣＴＸ（第４日）とともにリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（リステリア属菌は第７、１４、２１日に投与）（−△−；白三角形）；ＣＴＸ（第４日）とともにリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（リステリア属菌は第８、１５および２２日に投与）（−▽−；白逆三角形）；およびＣＴＸ（第４日）とともにリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（リステリア属菌は第１２、１９および２６日に投与）（−◇−；白菱形）で処置したマウスのデータ。結果は以下のとおりであった。処置なし（ＣＴＸなし；リステリア属菌なし）では、約ｔ＝５０日でのマウスの生存は約２０％であった（−■−；黒四角）。ＣＴＸのみでは、生存は、ｔ＝５０日で約６０％であった（−●−；黒丸）。ＣＴＸおよび細菌の両方を含めた一部のプロトコルでは、生存は、ｔ＝６０日（リステリア属菌はｔ＝第５、６または７日に投与）後で９０〜１００％であった。
図１Ｄは、ＣＴＸ（ｔ＝４日のとき）単独の投与により、いくらかの生存の増進がもたらされること、ならびにＣＴＸ（ｔ＝４日のとき）＋リステリア属菌（リステリア属菌は、第５、１２および１９日に投与；リステリア属菌は、第６、１３および２０日に投与；またはリステリア属菌は、第７、１４および２１日）の投与により、さらに増進された生存がもたらされることを示す。
以下は、ＣＴＸ＋リステリア属菌により生存が改善され得ることを示し、この併用投与がどれだけ長く遅延され得るか、および遅延（ｄｅｌａｔｅｄ）された組合せが依然として生存を改善したことを示す試験を示す。
図１Ｅは、併用療法および併用療法の遅延の効果を示す。この図では、「併用療法」は、リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（なんら異種抗原を発現するように操作されていない）＋シクロホスファミドの組合せを意味する。処置なしの場合は、半数の動物が約ｔ＝３２日までに死亡した。投与の場合は、ＣＴＸを５０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）で与えた。リステリア菌の用量はすべて、３×１０７とし、該細菌は、グルコースを含まない酵母培養液中で培養することにより調製した。
併用投与スケジュールをｔ＝４日のとき（ＣＴＸを第４日ならびにリステリア属菌を第５、１２および１９日）（−▽−；白逆三角形）に開始した場合、ほぼ最長の生存が見られ、ここで、ｔ＝６０日で動物の９０％が生存していた。併用投与スケジュールをいくぶん遅延させ、ｔ＝７日（ＣＴＸを第７日ならびにリステリア属菌を第８、１５および２２日）に開始した場合、ｔ＝４８日で動物の約９０％が生存しており、ｔ＝５３日で約半数が生存していた（−◇−；白菱形）。併用療法の開始をさらに遅延させ、ｔ＝１２日（ＣＴＸをｔ＝１２日ならびにリステリア属菌を第１３、２０および２７日）に開始した場合では、生存は比較的不良であった（−○−；白丸）（図１Ｅ）。
結果を図１Ｆ、１Ｇおよび１Ｈに示す実験は、マウスに注射すると、所定の型の免疫細胞、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＮＫ細胞を枯渇させる枯渇抗体（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の使用を伴う。
図１Ｆに示される結果により、リステリア属菌（なんら腫瘍抗原を発現するように操作されていない）が、第２のワクチンの非存在下で腫瘍に対する生存を改善する機構の洞察が得られる（ＧＶＡＸは、この特定の実験では使用しなかった）。
図１Ｆの実験方法を以下の通りとした。第０日に、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに１×１０５ ＣＴ２６細胞を半脾臓外科処置によって移植し、異なる処置群に無作為に分けた。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞枯渇を腫瘍細胞移植の１週間前に開始させた後、第６日および１３日に、それぞれＧＫ１．５（抗ＣＤ４）、２．４３（抗ＣＤ８）および抗ＡｓｉａｌｏＧＭ（抗ＮＫ）抗体のさらに２回の注射を行なった。それぞれのリンパ球集団の枯渇は、フローサイトメトリーによって別個のマウスコホートにおいて確認した。３ｘ１０７ｃｆｕのＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢでの３回の毎週の処置を第３日に開始し（対照を除く）、マウスを生存に関して追跡した。
図１Ｆは、表示のようにしてＣＴ２６−腫瘍細胞接種マウスをＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢで、またはＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢなしで処置した場合のＣＴ２６腫瘍を接種したマウスの生存割合を示す。処置マウスには、抗体を与えないか、またはＣＤ４＋ Ｔ細胞；ＣＤ８＋ Ｔ細胞；もしくはＮＫ細胞を特異的に枯渇させる抗体を表示のようにして与えるかのいずれかとした。その結果、マウスに、枯渇抗体を与えずにＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを；抗ＣＤ４＋ Ｔ細胞抗体を与えた後Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを；または抗ＣＤ８＋ Ｔ細胞抗体を与えた後Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを与えた場合、最長またはほぼ最長の生存が示された。対照的に、抗ＮＫ細胞抗体を与えたマウスにＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを投与しなかった場合、またはＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを投与した場合では、生存は低かった。このような結果は、腫瘍細胞の初期播種の後、ＮＫ細胞のＬｍ媒介型刺激は、腫瘍に対する生存に非常に重要であるが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞は生存に対して比較的重要でないことを示す。
以下は、リステリア属菌（なんら腫瘍抗原を発現するように操作されていない）が、ＧＭ−ＣＳＦワクチンとの組合せで腫瘍に対する生存を改善する機構に取り組むものである。図１Ｇは、ＣＴ２６腫瘍に対するマウスの生存を示し、ここで、ＣＴ２６−腫瘍細胞接種マウスは、リステリア属菌ΔａｃｔＡ＋ＧＭ−ＣＳＦワクチンとともに、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（−▲−；ＧＫ１．５抗体）、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（−△−；２．４３抗体）またはＮＫ細胞（−□−；抗アシアロ−ＧＭｌ抗体）を特異的に枯渇させる薬剤で、他の薬剤なし（−●−；処置なし、ＮＴ）で処置した。表示した抗体での処置は、肝臓内腫瘍細胞の移植前に２週間行なった。ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＮＫ細胞の９０％を超える抗体依存性枯渇が、各群の１または２匹の動物の肝臓および脾臓のフローサイトメトリー解析によって確認された。結果は、腫瘍細胞担持マウスの最長生存は、該マウスをリステリア属菌＋ワクチン（−○−）またはリステリア属菌＋ワクチンとともにＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇抗体（−▲−；ＧＫ１．５抗体）で処置した場合にもたらされたことを示す。対照的に、腫瘍細胞担持マウスを、リステリア属菌＋ワクチンとともにＣＤ８＋ Ｔ細胞を枯渇させる抗体またはＮＫ細胞を枯渇させる抗体で処置した場合、生存は不良であった（治療用剤を投与しない場合と同程度に不良）。
一部のある実施形態において、本発明は、リステリア属菌＋弱毒化腫瘍細胞を投与することにより、癌に対する生存を改善する方法であって、該弱毒化腫瘍細胞が癌と抗原性特性を共有し、癌に対する生存が、限定されないがＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞によって媒介される方法を提供する。さらに、本発明はまた、一部のある実施形態において、リステリア属菌＋弱毒化された感染性因子を投与することにより、感染性因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫）に対する生存を改善するための方法であって、該弱毒化された感染性因子が感染性因子と抗原性特性を共有し、感染性因子に対する生存が、限定されないがＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞によって媒介される方法を提供する。
図１Ｈは、ＣＴ２６腫瘍細胞の播種後にＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを事前に注射した長期生存動物に、ＣＴ２６腫瘍細胞で再抗原刺激した枯渇試験の結果を示す。簡単には、実験マウス群にＣＴ２６腫瘍細胞（１×１０５ ＣＴ２６細胞）を半脾臓モデルによりｔ＝０日に播種し、続いて、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（１×１０７ 細菌／用量）をｔ＝３、１０および１７日に注射した（３回投与）。ｔ≧１００日で、マウスの約５０〜６０％がなお生存しており、これらは長期生存動物であった。腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を評価するため、長期生存動物にＣＴ２６細胞（２×１０５ ＣＴ２６細胞）を皮下に再抗原刺激した。
ＣＴ２６腫瘍細胞再抗原刺激の前に、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ８抗体を一部の長期生存動物に投与した。実験に用いた抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体は、Ｃｅｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡで調製されたものであったが、枯渇実験に適した抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体は市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。枯渇抗体は、ＣＴ２６細胞再抗原刺激の８日、４日および１日前に注射した（０．２５ｍｇ注射、ｉ．ｐ．）。Ｔ細胞サブセットの枯渇が、フローサイトメトリー解析によって確認された。ＣＴ２６細胞再抗原刺激に対するマウスの生存は、ＣＴ２６細胞再抗原刺激投与後、少なくとも６０日間待機した後に調べた。
実験マウスの再抗原刺激時、未処置マウス（対照）にもまた、ＣＴ２６細胞を播種した。対照マウスは、以前にＣＴ２６腫瘍細胞またはＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢのいずれかに曝露されたことがないものであった、すなわち、これらは、ＣＴ２６細胞およびＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢに関して未処置であった。
図１Ｈに示す結果は、対照群では、２０匹のうち１匹のマウスだけがＣＴ２６細胞再抗原刺激に対して生存したことを示す。実験群（すなわち、長期生存動物）では、マウスの約３分の２（３３匹のうち２１匹のマウス）が腫瘍細胞再抗原刺激に対して生存した。しかしながら、実験マウスに、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ８抗体のいずれかもまた与えた場合では、ほとんどのマウスが、腫瘍細胞再抗原刺激に応答して死亡した。このような結果は、なんら腫瘍抗原をコードする核酸を含まないように操作された細菌であるＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢが、長期腫瘍特異的適応的（記憶）免疫応答を刺激し得ること、ならびにこの長期適応的免疫応答が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方に依存性であったことを示す。
ＩＶ．リステリア属菌は、再生肝臓において毒性効果を誘発しなかった
以下の対照試験では、部分肝切除術からの回復の時間経過を評価した（表４）。部分肝臓切除は、肝臓腫瘍の処置において一般的に使用されている。部分肝切除術からの回復の時間経過を、肝酵素（血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）；血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ））の放出によって評価した（例えば、Ｎａｔｈｗａｎｉら（２００５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１：３８０−３８３；Ｃｌａｖｉｅｎら（２００３）Ａｎｎ Ｓｕｒｇ．２３８：８４３−８５０を参照）。血清酵素レベルは、部分肝切除術後ｔ＝３日までに基底レベルに達することがわかった（表４）。
表４．部分肝切除術後の諸間隔での平均血清酵素レベル
Figure 2009504786
以下の対照試験 により、リステリア属菌のＬＤ５Ｏは、正常マウスおよび半脾臓マウスにおいて同じであるか、または類似することが示された。正常マウスでは、リステリア属菌ΔａｃｔＡのＬＤ５０は１．０×１０８細菌（また、以下の専門用語：１．０ｅ８を用いて示される）であり、リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢでは２〜５×１０８細菌であった。半脾臓マウスでは、リステリア属菌ΔａｃｔＡのＬＤ５０は１．２３×１０８細菌（また、以下の専門用語：１．２３ｅ８を用いて示される）であり、リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢでは、１．４９×１０８細菌よりも大きかった（表５）。
未処置マウスまたは部分肝切除術を受けたマウスを、リステリア属菌ΔａｃｔＡまたはリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢで滴定し、 部分肝切除術がリステリア属菌毒性に影響するか否かを調べた（表５）。ｔ＝０日では、マウスには外科処置を施さないか、または部分肝切除術を施した（約４０％）。ｔ＝３日に、すべてのマウスに、表示した量のリステリア属菌を与えた（表５）。
Figure 2009504786
Ｖ．リステリア属菌の投与により肝臓において免疫細胞が活性化される
リステリア菌をマウスに投与した後、免疫細胞を肝臓および脾臓から抽出すること、およびこれらの細胞を同定することにより測定される免疫応答のインビボモジュレーションを評価した。表示した場合を除き、リステリア属菌をマウスに、ｔ＝０時間に投与した後、ｔ＝２４時間に致死させた。時間経過実験において、表示した場合は、マウスをｔ＝２４時間またはｔ＝４８時間に致死させた。肝臓および脾臓をホモジナイズし、分散させた。細胞をハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、次いで、４％ＨＡＢおよび抗ＣＤ１６／３２抗体で氷上にて１５分間遮断した。ＨＡＢは、「ハンクスのアジ化物バッファー」であり、１％ウシ血清アルブミン、０．１％アジ化ナトリウム、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含むものである。
目的の細胞マーカーに特異的な抗体を添加し、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、次いで１％ホルムアルデヒド中に懸濁し、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によって解析した。リステリア菌（ΔａｃｔＡまたはΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ）は、ゼロＬＤ５０（ＨＢＳＳのみ）；０．０１ＬＤ５０；０．１ＬＤ５０；または０．２５ＬＤ５０に相当する量で投与した。表６は、以下の実験で試験したパラメータのいくつかを開示する。
Figure 2009504786
結果は以下のとおりであった（図２Ａ〜２Ｄ）。ＮＫ細胞の割合（全白血球の％）は肝臓において、リステリア属菌の用量の増加とともに増加した。用量の増加とともに、ＮＫ細胞である全白血球の割合は、約７％（ＨＢＳＳのみ投与、細菌なし）、約２０％（０．０１ＬＤ５０の用量）；約３５％（０．１ＬＤ５０）；および約４４％（０．２５ＬＤ５０）から増加した（図２Ａ）。発現されたＣＤ６９の平均蛍光強度によって評価した肝臓におけるＮＫ細胞活性化は、約１０（細胞が非存在の値をゼロとする自由裁量単位）（ＨＢＳＳのみ、細菌なし）から約１００（０．０１ＬＤ５０）、約１３０（０．１ＬＤ５０）、約１９０（０．２５ＬＤ５０）（図２Ｃ）に増加した。「ＨＢＳＳのみ投与」という表示は、細菌を投与しなかったこと、およびデータ点が対照値を表すことを意味する。図２Ｂおよび２Ｄは、脾臓データを開示する。
以下のことは、ＮＫＴ細胞に関する。肝臓におけるＮＫＴ細胞の活性化は、リステリア属菌の投与により増大し、このとき、リステリア属菌ΔａｃｔＡの投与後の活性化は、約５（ＨＢＳＳのみ、細菌なし）；２００（０．０１ＬＤ５０）；３００（０．１ＬＤ５０）；および４００（０．２５ＬＤ５０）（図３Ａおよび３Ｃ）であった。他方の欠失変異体リステリア属菌（リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ）の投与後、最大活性化はまた、０．２５ＬＤ５０の投与で見られた（用語「最大活性化」は、表示した用量で見られたその最大活性化を意味し、必ずしもそれより高用量ではより高い活性化状態がもたらされ得ないということを意味するのではない）（図３Ａおよび３Ｃ）。図３Ｂおよび３Ｄは脾臓データを示す。
図４Ａおよび４Ｂは、全肝臓Ｔ細胞での結果を開示する。
以下のことは、肝臓におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞に関する（図４Ｃ〜４Ｆ）。リステリア属菌ΔａｃｔＡの投与後、活性化は、約０（ＨＢＳＳのみ、細菌なし）、１００（０．０１ＬＤ５０）、３５０（０．１ＬＤ５０）および６００（０．２５ＬＤ５０）であった。他方のリステリア属菌株リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの投与では、最大活性化はまた、最高用量（図４Ａ、ＣおよびＥ）で起こった。図４Ｂ、ＤおよびＦは、脾臓データを開示する。
以下のことは、肝臓におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞に関する（図５Ａ〜５Ｄ）。リステリア属菌ΔａｃｔＡによる肝臓でのＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化は、約０（ＨＢＳＳのみ、細菌なし）、６０（０．０１ＬＤ５０）、１２０（０．１ＬＤ５０）および２３０（０．２５ＬＤ５０）であった。他方のリステリア属菌株リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの投与では、同様の活性化プロフィールがもたらされた（図５Ａおよび５Ｃ。図５Ｂおよび５Ｄは、脾臓データを示す。
以下のことは、好中球に関する（図６Ａおよび６Ｂ）。肝臓好中球は、リステリア属菌ΔａｃｔＡの３つの投与用量すべてで、約１％（ＨＢＳＳのみ、細菌なし）から約４〜５％まで増加した。リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの投与では、好中球が全白血球の約５〜１０％を占めた（図６Ａ）。図６Ｂは、脾臓データを示す。
ＣＤ２５を発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の存在もまた測定され、これは、個々の細胞上で発現されたＣＤ２５の平均量とした（図７Ａ〜７Ｄ）。ＣＤ２５発現は、リステリア属菌ΔａｃｔＡまたはリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの投与後に測定した。肝臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞および脾臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞のデータを示す（図７Ａ〜７Ｄ）。
以下のことは、樹状細胞、すなわち、ＣＤ８＋α陰性樹状細胞に関する。対照マウスにはＨＢＳＳを投与し、一方、実験マウスには、リステリア菌ΔａｃｔＡ（卵（ｏｖａ）を示す）を投与した。これらの樹状細胞の割合を、すべての脾細胞との比較で、数日間にわたって測定した。本研究の目的は、この樹状細胞集団に対する投与されたリステリア属菌効果を調べることであった。（この目的の評価では、リステリア属菌が卵を示す場合は、関連することが期待されない）。ＤＣの変異もまた測定され、これをマーカーＣＤ８０およびＣＤ８６によって評価した。ＣＤ８０およびＣＤ８６はＤＣ成熟マーカーである（Ｇｅｒｏｓａら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：７２７−７３４；Ｋｕｂｏら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：７２４９−７２５８）。これらの樹状細胞では、対照処置（ＨＢＳＳ塩溶液）により、比較的一定の割合値（２．０％（第１日）；１．９％（第２日）；１．９％（第４日）；１．６％（第７日））が得られた。実験処置（リステリア属菌ΔａｃｔＡ卵）により、この型の樹状細胞の割合の著しい増加がもたらされた（３．４％（第１日）；７．３％（第２日）；２．０％（第４日）；１．９％（第７日））。ＣＤ８０およびＣＤ８６マーカーに関し、以下の結果が見られた。マウスの対照処置（ＨＢＳＳ塩溶液）により、脾臓から単離されたＤＣについて以下のＣＤ８０相対発現値：１０５（第１日）；７８（第２日）；９１（第３日）、５３（第４日）がもたらされた。実験処置（リステリア属菌ΔａｃｔＡ卵）により、これらのＣＤ８０発現値の劇的な増加（例えば、第１日および第２日において）：３７２（第１日）；２９８（第２日）；９８（第３日）；１０２（第７日）がもたらされた。以下のデータは他方のマーカーＣＤ８６に関する。対照処置（ＨＢＳＳ塩溶液）により、これらのＣＤ８６発現値：３１（第１日）；１８（第２日）；３０（第４日）；および３０（第７日）がもたらされた。実験処置により、第１日および第２日においてＣＤ８６発現の劇的な増加：２５７（第１日）；８０（第２日）；３８（第４日）；および２４（第７日）が誘発された。
上記の結果は、樹状細胞の集団および樹状細胞の成熟に関するものであり、いくつかの理由のため、腫瘍および感染症に対する免疫応答に重要である。２つの例を挙げると、ＤＣ集団またはＤＣ成熟を増強する投与されたリステリア属菌は、ＮＫ細胞機能増強すること、また、調節Ｔ細胞の抑制効果を軽減することが予測される（例えば、Ｇｅｒｏｓａら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：７２７−７３４；Ｋｕｂｏら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：７２４９−７２５８を参照）。
ＶＩ．弱毒化リステリア属菌投与での時間経過試験、データは、ＮＫ細胞および好中球の刺激を開示する
マウスにＨＢＳＳ、リステリア属菌ΔａｃｔＡまたはリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを投与し、２４時間後（Ｄ１）または４８時間後（Ｄ２）に死滅させた後、ＮＫ細胞または好中球の数を調べ、白血球総数と比較した。肝臓から回収した白血球の解析のデータにより、ＮＫ細胞として存在する白血球の割合は、ＨＢＳＳの投与でいずれの日でも同じ（約６％）、リステリア属菌ΔａｃｔＡの投与でいずれの日でも同じ（約１６％）、他方のリステリア属菌株リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの投与後では、ｔ＝２４時間（１４％）においてｔ＝４８時間（１０％）よりもいくぶん高い（図８Ａ）ことが示された。図８Ｂは、脾臓データを開示する。
肝臓から回収された好中球の解析のデータにより、ＨＢＳＳ投与マウスにおいて、好中球は、肝臓白血球の約０．２〜０．８％を占めることが示された。リステリア属菌ΔａｃｔＡの投与の１日後、好中球は肝臓白血球の約３％を占め、他方の実験条件下では、より低い割合値が見られた（図９Ａ）。図９Ｂは、脾臓データを開示する。
別個の試験によって、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢをマウスに投与することにより、活性化ＮＫ細胞のインビボ生成がもたらされることが示され、このとき、活性化ＮＫ細胞は、ＹＡＣ−１細胞をインビトロで死滅させる能力の増強を示した。ＹＡＣ−１細胞は、ＮＫ細胞標的として慣用的に使用されている。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに３×１０７ｃｆｕのＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢまたは陰性対照ビヒクルを注射した。２４時間、４８時間または７２時間の遅延後、リンパ球を肝臓または脾臓から採取し、採取したリンパ球（ＮＫ細胞を含む）をクロム標識ＹＡＣ−１細胞（標的細胞）と混合し、次いで、４時間インキュベートした。４８時間の時点で採取したリンパ球では、例えば、肝臓ＮＫ細胞は、標的細胞の約５０％の溶解をもたらした（一方、リンパ球がビヒクル処置マウス由来のものの場合では、生じた標的細胞溶解はわずか３％であった）。４８時間の時点で採取したリンパ球では、脾臓ＮＫ細胞は、標的細胞の約３０％の溶解をもたらした（一方、リンパ球がビヒクル処置マウス由来のものの場合では、生じた標的細胞溶解はわずか７％であった）。したがって、本発明の方法は、ＮＫ細胞が標的細胞の溶解に有効である肝臓のＮＫ細胞レベルを活性化および／または増大させるためのＬｍの投与を提供する。
ＶＩＩ．リステリア属菌の投与により、肝臓において免疫細胞の数が増加する（時間経過試験）
以下は、リステリア属菌ΔａｃｔＡの投与後の肝臓における種々の免疫細胞の蓄積の時間経過を開示する。併行研究では、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように操作された腫瘍細胞（ＧＶＡＸ）のみの投与によってもたらされる、またはＧＶＡＸと一緒にリステリア属菌ΔａｃｔＡの投与によってもたらされる免疫細胞蓄積に対する影響を示す。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを以下の条件下で処置した後、肝臓内の種々の免疫細胞の数を調べた。処置は、
（１）未処置マウス（腫瘍細胞は何も投与せず）；
（２）処置なし（ＮＴ）マウス（腫瘍細胞を投与したが、リステリア属菌で処置せず、ＧＶＡＸで処置しない）；
（３）腫瘍細胞およびＧＶＡＸを投与；
（４）腫瘍細胞およびリステリア属菌ΔａｃｔＡ（Ｌｍ−ａｃｔＡ）を投与；ならびに
（５）腫瘍細胞、ＧＶＡＸおよびリステリア属菌ΔａｃｔＡ（Ｌｍ−ａｃｔＡ）を投与
とした。
リステリア属菌ΔａｃｔＡを投与した場合では、細菌投与数を１×１０７ＣＦＵとした。同定および計数した免疫細胞は、ＮＫ細胞（図１０Ａ）；ＮＫＴ細胞（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図１０Ｃ）；形質細胞様樹状細胞（形質細胞様ＤＣ）（図１０Ｄ）；骨髄系ＤＣ（図１０Ｅ）；および腫瘍特異的ＣＤＳ＋ Ｔ細胞（図１０Ｆ）であった。腫瘍特異的ＣＤＳ＋ Ｔ細胞（肝臓内）の活性化状態を、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ ｍＲＮＡ）の発現を測定することにより評価した（図１０Ｇ）。また、ＮＫ細胞（肝臓内）の活性化状態も評価し、ここで、活性化は、ＩＦＮγ ｍＲＮＡを測定することにより評価した（図１０Ｈ）。
結果は以下のとおりであった。一般的なベースライン集団範囲に関して、肝臓内の樹状細胞（ＤＣ）は最少集団範囲で存在する傾向にあったが、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞は、最大集団範囲で存在する傾向にあった。すべての細胞型のベースラインは、未処置マウスに対して一定であった（図１０Ａ〜１０Ｆ）。リステリア属菌単独を腫瘍担持マウスに投与した場合、ＮＫ細胞集団は、約ｔ＝９日でピークを示した（図１０Ａ）；ＮＫＴ細胞集団は、少なくとも１７日間まで増加傾向を示した（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、少なくとも１７日間まで一様な増加傾向を示した（図１０Ｃ）；形質細胞様ＤＣは、約ｔ＝９日でピークを示した。（図１０Ｄ）；骨髄系ＤＣ集団は、約ｔ＝１３日（図１０Ｅ）でピークを示した；一方、腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞約ｔ＝１３日でピークを示した（図１０Ｆ）。
ＧＶＡＸ単独では、すべての免疫細胞の集団が増加した（図１０Ａ〜１０Ｆ）。ＧＶＡＸ との組合せでのリステリア属菌により、ＮＫＴ細胞（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図１０Ｃ）；形質細胞様ＤＣ（図１０Ｄ）；および腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（図１０Ｆ）の場合で、相加効果または相乗効果が示された。
いくつかの免疫細胞の活性化状態を評価し、評価は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ｍＲＮＡのアッセイによるものとした。腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞によって発現されたＩＦＮ−γ ｍＲＮＡのアッセイにより、発現の最大の増大は、マウスへのリステリア属菌およびＧＶＡＸの両方の投与で起こることが示された（図１０Ｇ）。また、ＮＫ細胞によって発現されたＩＦＮ−γ ｍＲＮＡのアッセイでも、発現の最大の増大は、マウスへのリステリア属菌およびＧＶＡＸの両方の投与の投与で起こることが示された（図１０Ｈ）。リステリア属菌およびＧＶＡＸの両方を受けたマウスに関して、腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞による後のＩＦＮ−γ発現において差が認められ、すなわち、ＣＤＳ＋ Ｔ細胞による発現は、後期で非常に高く、ＮＫ細胞により発現は初期において非常に高かった（図１０ＧおよびＨ）。
以下のことは、図１０Ｉに関する。図１０Ｉは、例えば、種々の治療用剤のまた投与されたＣＴ２６腫瘍細胞接種マウス肝臓から採取したＣＤ８＋ Ｔ細胞の解析を示す。治療的処置には、対照を含む、治療的処置なし（ＮＴ）；リステリア菌ΔａｃｔＡ；ＧＭ−ＣＳＦワクチンのみ（ＧＶＡＸ）；およびリステリア菌ΔａｃｔＡ＋ＧＶＡＸを含めた。治療的処置なし（ＮＴ）では、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合は２．６３％であった。
結果は以下のとおりであった。リステリア属菌のみでは、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合は高く（３．５％）；ＧＶＡＸのみでも、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合は高かった（３．９１％）。しかしながら、リステリア属菌＋ＧＶＡＸでは、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の発現の割合はずっと高く（６．３８％）、リステリア属菌とＧＭ−ＣＳＦワクチンとの相乗効果を示す（図１０Ｉ）。
詳細には、この図は、肝転移を有する処置マウスの肝臓内に浸潤する腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の解析を示す。第１３日に致死させたマウスの肝臓から単離し、抗ＣＤ８（ＦＩＴＣ）およびＬｄ−ＡＨ１テトラマー（サイクロム）で染色した細胞に対する特異的フローサイトメトリープロットを示す。ＡＨ１は、ＣＴ−２６特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞によって認識される免疫優性ＭＨＣクラスＩ拘束腫瘍抗原であることに注目されたい。試験には、陽性および陰性対照（ＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞クローンを陽性対照として；および未処置非腫瘍担持マウス由来の肝ＣＤ８＋細胞を陰性対照として）を含めた。データは、３匹のマウスのプールし、加工処理した肝臓の結果を示す。ＣＴ−２６／ＧＭ−ＣＳＦおよびリステリア属菌ΔａｃｔＡでの処置により、最高レベルの肝ＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞がもたらされた。
ＶＩＩＩ．ＧＭ−ＣＳＦを発現する弱毒化腫瘍細胞株の投与により、腫瘍に対する生存が増進され、一方、該腫瘍細胞株をリステリア属菌ΔａｃｔＡまたはリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢとともに投与することにより、腫瘍に対する生存がさらに増進される
腫瘍を有するマウスを、（１）塩水のみ（ＨＢＳＳ）；（２）サイトカインを分泌する腫瘍細胞株（サイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するＣＴ２６細胞）を含むワクチン（ＧＭ−ＣＳＦワクチン）；（３）該ワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡ；または（４）該ワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを投与することにより処置した。
腫瘍細胞（１×１０５ ＣＴ２６細胞）を含む０．０５ｍｌ ＨＢＳＳを半脾臓内に投与した後、０．２５ｍｌ ＨＢＳＳでフラッシュ洗浄した。照射したＧＭ−ＣＳＦ発現ＣＴ２６細胞（１×１０６細胞）（また、「ワクチン」として知られる）を０．３０ｍｌのＨＢＳＳにて、０．１０ｍｌ注射／部位（皮下；ｓ．ｃ）で投与した。リステリア属菌は、０．１ＬＤ５０に相当する量で投与し、投与は、０．２０ｍｌ ＨＢＳＳ（ｉ．ｐ．）または０．１０ｍｌ ＨＢＳＳ（静脈内；ｉ．ｖ．）にて行なった。実験過程での種々の投与に対するスケジュールは、以下の通りとした：腫瘍（ｔ＝０日）；ワクチン（ｔ＝３日）；ワクチン＋リステリア属菌（ｔ＝６日）；ワクチン（ｔ＝１３日）；およびワクチン（ｔ＝２１日）。実験条件には、処置なし（−■−；黒四角）；ワクチンのみ（−◆−；菱形）；ワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡ（−▲−；黒三角形）；およびワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（−●−；黒丸）を含めた。ＣＴ２６腫瘍細胞は、ｔ＝第０日に投与し、一方、ＧＭ−ＣＳＦワクチンはｔ＝３日、リステリア属菌はｔ＝６日に与えた。図１１Ａおよび１１Ｂでは、リステリア属菌用量を１×１０７ＣＦＵとした。
図１１Ａは、試験中の時間（日）に対するマウスの生存割合を開示する。その結果、「処置なし」群では、ｔ＝４０日までに生存動物はゼロであること、および生存は、ワクチンのみの群（ｔ＝５５日までに生存動物はゼロ）でいくぶん高いことが示された。ワクチン＋リステリア属菌群により、著しい生存の増進がもたらされ、ワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡ群およびワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ群の両方においてｔ＝４８日で約２８％生存であり、一方、ｔ＝７５日では、２８％生存がワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡ群において、約１５％生存がワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ群において見られた（図１１Ａ）。図１１Ｂは、上記と同じ実験の反復試行のデータを示す。この場合も、処置なしのマウスは、最も不良な生存を示し、ｔ＝９０日では１匹のみのマウスが生存していた。この場合も、ＧＭ−ＣＳＦワクチンとともにリステリア属菌を受けたマウスは、最良の生存を示した。ここで、ＧＭ−ＣＳＦワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡを受けた１０匹のうち６匹のマウスが、ｔ＝９０日でなお生存しており、ＧＭ−ＣＳＦワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを受けた１０匹のうち４匹のマウスが、ｔ＝９０日で生存していた（図１１Ｂ）。
本発明は、弱毒化リステリア属菌（例えば、リステリア菌ΔａｃｔＡまたはリステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ）を弱毒化腫瘍細胞（例えば、照射転移性細胞）とともに投与することを含む方法であって、該細胞は、サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦを発現するように操作されたものである方法を提供する。本発明において、リステリア属菌は、任意の異種抗原、例えば、腫瘍または感染性因子抗原をコードする任意の核酸を含むように操作されたものではない。本発明の別の態様において、リステリア属菌は、異種抗原をコードする核酸を含むように操作されたものである。
ＩＸ．シクロホスファミドは腫瘍に対する生存を増進させる
シクロホスファミド（ＣＴＸ）の投与により、これらの３つ：
（１） ＧＭ−ＣＳＦワクチンのみで処置したマウス；
（２） ＧＭ−ＣＳＦワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡで処置したマウス；
（３） ＧＭ−ＣＳＦワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢで処置したマウス
の各条件下で、腫瘍を担持するマウスの生存が増進された。
マウスにＣＴ２６腫瘍細胞を第０日に播種した（図１２）。腫瘍を生成させるために使用したＣＴ２６腫瘍細胞の用量は１０万細胞であった。治療的処置は以下のとおりとした：処置なし（−■−；黒四角）；ＧＭ−ＣＳＦワクチンのみで処置（−◇−；白菱形）；ＧＭ−ＣＳＦワクチンおよびシクロホスファミド（ＣＴＸ）で処置（−△−；白三角形）；ＧＭ−ＣＳＦ＋リステリア属菌ΔａｃｔＡで処置（−●−；黒丸）；ＧＭ−ＣＳＦ、シクロホスファミドで処置、ならびにリステリア属菌ΔａｃｔＡ（−▽−；白逆三角形）；ＧＭ−ＣＳＦ＋リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（−□−；白四角）；またはＧＭ−ＣＳＦ、シクロホスファミドおよびリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢで処置（−◆−；黒菱形）（図１３）。ＣＴＸは、１００ｍｇ ＣＴＸ／ｋｇ体重（腹腔内；ｉ．ｐ．）で与えた。シクロホスファミドはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）製のものとし、動物に注射する前にＨＢＳＳ溶解した。
腫瘍細胞は第０日に投与した。この試験では、ＧＭ−ＣＳＦワクチンを受けた各マウスに、３回のＧＭ−ＣＳＦワクチン投与を与えた（ｔ＝３、１５および３１日）。シクロホスファミドを投与する場合は、１回のみの投与で、ｔ＝第２日に与えた。リステリア属菌ΔａｃｔＡは、ｔ＝６、１９および３４日に投与した（１×１０７ＣＦＵ）。リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢもまた、同じ日に同じ投薬量で投与した（ｔ＝６、１９および３４日（１×１０７ＣＦＵ））（図１２）。
最低の生存率が、処置なし群およびＧＭ−ＣＳＦワクチンのみを受けたマウスにおいて見られた（図１２）。ＧＭ−ＣＳＦワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡで処置したマウスは、生存期間の著しい増大を示し、このとき、ｔ＝４０日で約３０％の生存が見られた。以下のことは、ＣＴＸを受けた群に関する。ＧＭ−ＣＳＦワクチンにＣＴＸのみを補給した場合、ｔ＝４５日で９０％生存が見られた。ＧＭ−ＣＳＦワクチンにＣＴＸ＋リステリア属菌を補給した場合には、より増進された生存率が見られた。例えば、ＧＭ−ＣＳＦワクチンにＣＴＸ＋リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを補給した場合、ｔ＝５５日での生存は１００％であった（−◆−；黒菱形）（図１３）。
本発明は、弱毒化リステリア属菌（例えば、リステリア菌ΔａｃｔＡまたはリステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ）を、弱毒化腫瘍細胞（例えば、照射転移性細胞）（該細胞は、サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように操作されたものである）とともに、また、調節Ｔ細胞の作用を阻害する薬剤（例えば、ＣＴＸ）とともに投与することを含む方法を提供する。本発明において、リステリア属菌は、任意の異種抗原、例えば、腫瘍または感染性因子抗原をコードする任意の核酸を含むように操作されたものではない。
Ｘ．ワクチンの定常投与を伴うリステリア属菌による腫瘍担持マウスの滴定
図１３Ａ〜１３Ｃは、種々の数のリステリア属菌を腫瘍担持マウスに投与した結果を開示する（ワクチンの定常投与）。詳細には、該研究には、リステリア属菌ΔａｃｔＡ（定常ＧＭ−ＣＳＦワクチン処置）またはリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（定常ＧＭ−ＣＳＦワクチン処置）によるＣＴ２６細胞−腫瘍担持マウスの滴定を含めた。
以下の試験では、腫瘍担持マウスを種々の量の弱毒化リステリア属菌で「滴定」した。すべての場合において、ＧＭ−ＣＳＦワクチンは３日（ｔ＝第３、１７および３１日）に投与し、すべての場合において、リステリア属菌ΔａｃｔＡ（またはリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ）を３日（ｔ＝第 ６、２０および３４日）投与した。
マウスにＣＴ２６腫瘍細胞を播種した。マウスには、処置なし（−■−；四角）；ＧＭ−ＣＳＦワクチンのみ（−▲−；三角形）；ＧＭ−ＣＳＦワクチンとともに３×１０７ リステリア属菌（−▼−；逆三角形）；ＧＭ−ＣＳＦワクチンとともに１×１０７リステリア属菌（−◆−；菱形）；またはＧＭ−ＣＳＦワクチンとともに３×１０６リステリア属菌（−●−；黒丸）のいずれかを与えた。図１３Ａは、投与された弱毒化リステリア属菌が１つだけのビルレンス遺伝子において欠失したもの（リステリア属菌ΔａｃｔＡ）（３×１０６〜３×１０７細菌の範囲）の結果を示し、図１３Ｂは、２つの異なるビルレンス遺伝子において欠失したリステリア属菌（リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ）（３×１０６〜３×１０７細菌の範囲）の結果を示す。図１３Ｃはまた、細菌が３×１０３〜３×１０７細菌の範囲で投与されたリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢでの結果を示す。
最も不良な生存率は、処置なしまたはＧＭ−ＣＳＦワクチンのみを投与されたマウスにおいて見られた。ＧＭ−ＣＳＦワクチンとともにリステリア属菌を投与すると生存が改善され、低〜中程度の細菌用量レベル（３×１０３〜３×１０５）は、生存において同様の改善をもたさすようであった。ここで、３×１０６細菌の用量は１×１０７ 細菌と同程度に作用するようであった。高用量（３×１０７細菌）では、さらに良好な生存が見られた。最高細菌用量（ＧＭ−ＣＳＦワクチンとともに）では、ｔ＝５３日で約３０〜４０％生存が見られた。（図１３ＡおよびＢ）。
図１３Ｃは、細菌の最大投与レベル（３×１０７細菌；−▲−；三角）で最高生存率が得られたことを示し、ｔ＝３５日で７０％生存が見られた。生存は、３×１０６細菌の投与（−●−；黒丸）では同様またはやや低かった。より少ない数の細菌（３×１０５細菌；−▼−；逆三角形）（３×１０４細菌；−■−；四角）（３×１０３ 細菌；−◆−；菱形）の投与では、さらに低レベルの生存が見られた。細菌投与レベルの１つ（３×１０５ 細菌；−▼−；三角形）では、処置なし群よりもいくぶん良好な生存が見られたが、ｔ＝３０日以降の時点では、生存は「処置なし」群と同程度に低かった。「処置なし」群（−■−；四角）およびＧＭ−ＣＳＦワクチンのみの群（−◆−；菱形）の結果は、表示のとおりであった。
本発明は、反復投与による弱毒化リステリア属菌（例えば、リステリア属菌ΔａｃｔＡまたはリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ）の投与方法、および、および反復投与による弱毒化腫瘍ワクチンの投与方法を提供する。一態様において、弱毒化された腫瘍は、サイトカインをコードする核酸を含むように操作されたもの、例えば、ＧＭ−ＣＳＦである。別の態様では、弱毒化された腫瘍は、サイトカインをコードする核酸を含むように操作されたものではない。
ＸＩ．リステリア属菌（腫瘍抗原をコードする核酸を含まない）は、肺への腫瘍転移を低減させる
図１４は、肺腫瘍（肝臓腫瘍ではない）のデータを示す。図１４は、種々の用量の投与されたリステリア属菌に対する肺腫瘍の応答を示す用量応答曲線を開示する。該腫瘍は、脾臓に注射したＣＴ２６細胞から生じたものである。この図は、腫瘍細胞接種マウスを塩溶液（ＨＢＳＳ）で処置した対照試験を開示する。また、なんら腫瘍抗原をコードする核酸を含まないリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢでの処置（１×１０７細菌が投与される）、およびｇｐ１００由来のエピトープである陽性対照腫瘍抗原（ＡＨ１〜Ａ５）をコードする核酸を含むように操作されたリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（１×１０７細菌を投与）での処置の結果を示す。塩水処置では、約５０の肺転移が見られた。なんら腫瘍抗原を発現するように操作されていないリステリア属菌では、肺転移の数は半数（約２５〜３０肺転移）に減少した。ＡＨ１〜Ａ５を発現するように操作されリステリア属菌では、本質的に肺転移はゼロであった（図１４）。
ＸＩＩ．リステリア属菌（腫瘍抗原をコードする核酸を含むように操作されたものではない）により、腫瘍に対する長期適応的免疫が刺激される。
図１５および１６は、腫瘍担持マウスをリステリア属菌（なんら異種抗原をコードする操作されたものではないリステリア属菌）処置することにより、腫瘍、すなわち腫瘍の抗原に対する適応的免疫が刺激されることを示す。最初に、マウスにＣＴ２６腫瘍細胞を半脾臓モデルによって播種し（ｔ＝０日）、次いで、
（１）なんら治療用剤で処置しない（「未処置マウス」）；
（２）リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３サイクルのリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ、ＣＴ２６腫瘍細胞の播種後ｔ＝３日に開始。リステリア属菌の投与毎週１回で３週間行なった。リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢは、なんら腫瘍抗原を発現するように操作されたものではなかった；
（３）ＧＭ−ＣＳＦワクチンとともにリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（ｔ＝６日にリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの１回の注射）。ＧＭ−ＣＳＦワクチンの投与は、半脾臓への腫瘍細胞の注射後３日、すなわち第３、６および１０日に開始した；あるいは
（４）シクロホスファミド（ＣＴＸ）（５０ｍｇ／ｋｇ）
で処置した。
ｔ＝１００日（再抗原刺激直前）およびｔ＝１０７日（再抗原刺激後）に、各群の生存しているマウスを、ＣＴ２６細胞の免疫優性抗原（ＡＨ１抗原）に対する長期免疫について評価（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）した。第１のＥｌｉｓｐｏｔアッセイ（再抗原刺激前）を、適応的免疫応答の評価における使用のためのベースラインアッセイとした。第２のＥｌｉｓｐｏｔアッセイ（１０７日；再抗原刺激後）を用いて適応的免疫応答を評価した。ｔ＝１０２日に、すべてのマウスに皮下再抗原刺激によってＣＴ２６腫瘍細胞を播種した。皮下ＣＴ２６腫瘍細胞再抗原刺激には２×１０５細胞を用いた（最初に半脾臓に注射された用量の２倍）。図１５は、ＣＴ２６腫瘍細胞での再抗原刺激により、
（１）なんら治療用剤で処置しなかったマウスの群（「処置なし」群）では検出可能な抗ＡＨ１免疫は刺激されない；
（２）最初にリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ単独を与えたマウスでは、検出可能な、または中程度のＥｌｉｓｐｏｔ応答がもたらされる；
（３）最初にＧＭ−ＣＳＦワクチンおよびリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの両方を与えたマウスでは、より強いＥｌｉｓｐｏｔ応答がもたらされる；ならびに
（４）最初にシクロホスファミド（ＣＴＸ）のみを与えたマウスでは中程度のＥｌｉｓｐｏｔ応答がもたらされる
ことを示す（図１５）。
要するに、結果は、リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ単独；ＧＭ−ＣＳＦワクチンおよびリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ；またはシクロホスファミド（ＣＴＸ）単独のいずれかでの処置により、免疫系に対する長期効果がもたらされ得ることを示す。長期効果により、再抗原刺激に対する明白に検出可能な免疫応答がもたらされた。
腫瘍体積をＣＴ２６腫瘍細胞再抗原刺激後の数日間評価した（図１６）。皮下注射により生じた腫瘍は皮下に瘤として提示された。これらの腫瘍を経皮的に測定した。その結果、再抗原刺激後数日間で、再抗原刺激により生じた腫瘍は増殖し体積が増加することが示された。しかしながら、腫瘍増殖は、なんら治療用剤を受けなかった動物で最大であり、一方、最初にリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ単独またはＧＭ−ＣＳＦワクチンおよびリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢで処置した動物では腫瘍増殖は有意に抑制された（図１６）。
再抗原刺激実験で試験したいくらかのマウスは、無腫瘍であることがわかった。これらの無腫瘍マウスに関して、結果は、いずれの未処置マウス（治療的処置なし）（全部で２匹の未処置マウスのうち）も、再抗原刺激後、腫瘍なしではないことを示した。ＣＴＸのみのマウス約５０％（全部で４匹のＣＴＸのみのマウスのうち）は、腫瘍なしであったが、リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢのみ処置マウスの約７５％（全部で１１匹のリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢのみマウスのうち）およびＧＭ−ＣＳＦワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ処置マウスの約９０％（全部で１１匹のＧＭ−ＣＳＦワクチン＋リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢのうち）が腫瘍なしであった。
以下のことは、ＣＴ２６細胞ではなくＭＣ３８細胞によって誘導された腫瘍に関する。ＭＣ３８細胞を播種したＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた別個の試験により、すべての対照マウスがｔ＝４３日までに死亡し、約ｔ＝３８日までに半数が死亡したことが示された。３×１０７ｃｆｕ Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを投与（ｔ＝３、１０および１７日に投与）した実験マウスは少なくともｔ＝９０日まで生存した。Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ処置群では、約半数のマウスがｔ＝５０日までに死亡し、ｔ＝９０日までに約８０％が死亡した。ＭＣ３８細胞に関する上記の注釈は、ＣＴＸを投与しなかった試験を示す。要するに、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢは、なんらＣＴＸの投与なく、ＭＣ３８細胞に対する生存を改善した。上記のように、ＣＴ２６腫瘍細胞はＢａｌｂ／ｃマウス由来であるが、ＭＣ３８腫瘍細胞はＣ５７Ｂ１／６マウス由来であり、Ｂａｌｂ／ｃマウスはＴｈ２型レスポンダーであり、Ｃ５７Ｂ１／６マウスはＴｈ１型レスポンダーである。
本発明は、例えば、腫瘍、癌、感染性因子、ウイルス、寄生虫または細菌性の抗原に対する適応的免疫（例えば、長期適応的免疫；記憶応答；および記憶応答）を刺激するための代謝的に活性なリステリア属菌の投与を含む方法を提供する。本発明には、サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦ、弱毒化された腫瘍、サイトカインを発現する弱毒化された腫瘍、またはＴｒｅｇのインヒビター、例えばシクロホスファミド（ＣＴＸ）などの１種類以上の投与をさらに含む上記の方法が包含される。別の態様では、上記の本発明は、リステリア属菌が、異種抗原、例えば、腫瘍細胞、癌細胞または感染性因子由来の抗原を発現するように操作されていない上記の方法を含む。
また、例えば、腫瘍、癌、感染性因子、ウイルス、寄生虫または細菌性の抗原に対する適応的免疫（例えば、長期適応的免疫；記憶応答；および記憶応答）を刺激するための、代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌投与することを含む方法が提供される。本発明には、サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、弱毒化された腫瘍、サイトカインを発現する弱毒化された腫瘍、またはＴｒｅｇのインヒビター、例えばシクロホスファミド（ＣＴＸ）などの１種類以上の投与をさらに含む上記の方法が包含される。別の態様では、上記の本発明は、リステリア属菌が、異種抗原、例えば、腫瘍細胞、癌細胞または感染性因子由来の抗原を発現するように操作されていない上記の方法を含む。
ＸＩＩＩ．サイトカイン
Ａ．マウスサイトカイン
マウスにおけるサイトカイン発現に対するリステリア属菌の影響を図１７ならびに図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃに示す。
図１７は、リステリア属菌の投与により、いくつかのサイトカインの発現が刺激されることを示す。静脈内リステリア属菌の単回投与後の血清サイトカインレベルを示す。塩（ＨＢＳＳ）、または０．１ＬＤ５０リステリア菌ΔａｃｔＡ、リステリア菌ΔｉｎｌＢもしくは野生型リステリア菌の静脈内単回投与の２４時間後、マウス（３匹／群）のコホートの血清試料を採取した。アッセイしたサイトカインは、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）のｐ７０サブユニット；ＴＮＦα；ＩＦＮγ；ＭＣＰ−１；ＩＬ−１０；およびＩＬ−６であった。サイトカインレベルは、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａ）を用いて測定した。結果を平均＋／−ＳＤで示す。その結果、野生型リステリア属菌、リステリア属菌ΔａｃｔＡ；およびリステリア属菌ΔｉｎｌＢは、インターフェロン−γ；ＭＣＰ−１；およびＩＬ−６の発現を刺激することが示された。これらの３種のうち、野生型リステリア属菌またはリステリア属菌ΔａｃｔＡの投与により、これらのサイトカインの発現の最も著しい増加がもたらされた。
本発明は、リステリア属菌ΔａｃｔＡ；リステリア属菌ΔｉｎｌＢ；または弱毒化変異体リステリア属菌ΔａｃｔΔｉｎｌＢを投与することを含む、ＩＦＮ−γ；ＭＣＰ−１；ＩＬ−６；またはＩＦＮ−γとＭＣＰ−１の両方；ＩＦＮ−γとＩＬ−６の両方；またはＩＬ−６とＭＣＰ−１の両方；またはＭＣＰ−１、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γの３種類すべての発現を刺激するための方法を提供する。
また、リステリア属菌ΔａｃｔＡ；リステリア属菌ΔｉｎｌＢ；または弱毒化変異体リステリア属菌ΔａｃｔΔｉｎｌＢを投与することを含む、ＭＣＰ−１依存性免疫応答；ＩＦＮγ依存性免疫応答；またはＩＬ−６依存性免疫応答を刺激するための方法が提供される。さらに、提供されるのは、リステリア属菌ΔａｃｔＡ；リステリア属菌ΔｉｎｌＢ；または弱毒化変異体リステリア属菌ΔａｃｔΔｉｎｌＢを投与することを含む、ＩＦＮ−γとＭＣＰ−１の両方；ＩＦＮ−γとＩＬ−６の両方；ＭＣＰ−１とＩＬ−６の両方に依存するか；またはＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６の３種類すべてに依存する、免疫応答を刺激するための方法である（図１７）。
以下のことは、図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃに関する。リステリア属菌（なんら異種抗原を発現するように操作されていないもの）は、肝臓に対するＮＫ細胞の活性化および漸増を誘発し、ここで、これらの効果は、インターフェロン−βによって媒介されることが示された。以下は、ＩＦＮ−α／βシグナル伝達が、リステリア属菌に応答した肝臓に対するＮＫ細胞の活性化および漸増に必要とされることを示す。個々の３匹のマウス／実験群から、１×１０７ｃ．ｆ．ｕ．のリステリア菌ΔａｃｔＡのＩＶ単回投与の２４時間後に肝臓を採取した。採取した肝臓を加工処理し、白血球集団をフローサイトメトリーにより前方および側方散乱によって計数した。ＮＫ細胞画分を、ＤＸ５および／またはＣＤ６９の両方について陽性に染色された細胞を計数することにより評価した。その結果、リステリア属菌投与では、ＮＫ細胞におけるＣＤ６９発現は、約２５０の基底レベル（リステリア属菌なし）から約１５００（リステリア属菌あり）に増大することが示された（図１７Ａ）。この増大は、マウスがＩＦＮ受容体ノックアウトマウスである場合、著しく低下し、したがって、ＮＫ細胞活性化に対するリステリア属菌の影響におけるインターフェロン−α／βの役割が示される。ＮＫ細胞漸増に関し、図１７Ｂは、全肝白血球のうちのＮＫ細胞の割合が約１３％（リステリア属菌なし）から約３０％（リステリア属菌あり）に増加したことを示し、このとき、この効果は、ＩＦＮ受容体ノックアウトマウスでは低減された。
ＮＫ細胞数の評価に加え、血清サイトカインをリステリア菌ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ のＩＶ単回投与の２４時間後に測定した。５匹のマウスのコホートに、ＩＶ単回投与でリステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを、図に表示した用量で与え、２４時間後に血清試料を採取した。生得的活性化に関する陽性対照は、ポリＩ：Ｃの１００マイクログラム ＩＶ単回投与で構成した（図１８Ｃ）。結果は、血清ＭＣＰ−１の増大におけるリステリア属菌の劇的な効果を示す。詳細には、マウスをリステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢで滴定し、滴定には、０；１０，０００；１０万；１００万；および１０００万の投与菌を含めた。この場合も、結果は、リステリア属菌によりＭＣＰ−１発現の増大が刺激されることを示す。ＤＸ５発現の評価方法が利用可能である（例えば、Ａｒａｓｅら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１１４１−１１４４を参照）。
サイトカインレベルを血清中において測定し、このとき、血清は、リステリア属菌またはｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト投与後の種々の時点でマウスから採取した血液から誘導した。処置群は、（１）塩水（ＨＢＳＳ）処置のみ（０．２ｍｌ）；（２）リステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（１×１０７細菌）；（３）リステリア菌Δｈｌｙ（リステリオリシンをコードする遺伝子において欠失）（３×１０８細菌）；（４）死菌であるが代謝的に活性なリステリア菌（ＫＢＭＡ）（３×１０８細菌）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１：８５３−８６０を参照）；（５）熱殺菌リステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３×１０８細菌）；（６）ポリ（Ｉ：Ｃ）（０．１ｍｇ）；または（７）ＣｐＧ（０．１ｍｇ）であった。末梢血液を種々の時点で採取し、サイトカイン濃度について評価した（Ｍｏｕｓｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ＬＩＮＣＯｐｌｅｘ＠Ｋｉｔ Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ＭＣＹＴＯ−７０Ｋ；Ｌｉｎｃｏ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ；またはＢＤ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）。ＣｐＧは、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから購入したＣｐＧ ＯＤＮ １８２６であった。サイトカインレベルを細菌またはＴＬＲ アゴニストの投与後に２、４、８、１２および２４時間後に採取した試料にて測定した。
測定したサイトカインには、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）；インターロイキン−１α（ＩＬ−Ｉα）；インターロイキン−６（ＩＬ−６）；インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）；インターロイキン−１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０）；インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）；ＩＰ−１０；ＫＣ（ＩＬ−８のマウスオルソログ）；ＭＣＰ−１；ＭＩＰ−１ａ；およびＴＮＦを含めた。
以下の サイトカインもまた測定し、これらのサイトカイン：ＩＬ−ｌβ；ＩＬ−２；ＩＬ−４；ＩＬ−５；ＩＬ−７；ＩＬ−９；ＩＬ−１５；ＩＬ−１７；および顆粒球−単球−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は血清に検出されなかった。要するに、これらのサイトカインは、記載の条件下では検出されなかった。
表７は、一部の結果を開示する。
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Ｂ．サルサイトカイン
サイトカイン発現を、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを投与した非ヒト霊長類において測定した。雄および雌両方のカニクイザルに、ビヒクル、１×１０７、３×１０８または１×１０１０ｃｆｕのＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを投与した。合計３２匹のカニクイザル（各性１６匹ずつ）を、４つの用量群に無作為に割り当てた。
投与は、３０分間の（ｉ．ｖ．）輸液により合計５回の投薬で毎週行なった。連続血清および血漿試料を、それぞれのサイトカイン：ＩＬ−１Ｒα；ＩＦＮγ；ＴＮＦα；ＭＣＰ−１；ＭＩＰ−１β；およびＩＬ−６ について解析した（図１９Ａ〜Ｆ）。また、図１９Ｇは、カニクイザルによるサイトカイン発現を示し、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの最初の輸液後のサイトカイン発現を開示する。ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＭＩＰ１βおよびＭＣＰ−１は、表示のとおり、初期輸液後に測定した（図１９Ｇ）。これらの各サイトカインの血清レベルは、特異的にＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢに応答して増大し、その増大はすべて、用量に対する依存性を示した。
ＸＩＶ．至適抗腫瘍活性には、リステリア菌の細胞質ゾル侵入が必要とされる
肝臓特異的ＣＴ−２６転移は、Ｊａｉｎら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１０：８１０−８２０（２００３）に記載のプロトコルに従ってわずかに修正を伴って確立した。ＣＴ２６は、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のＮ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレタン誘導型マウス結腸腺癌細胞株である。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（５０Ｕ／ｍｌ）を補給したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養状態に維持した。
第０日に、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに半脾臓外科処置によって１×１０５ ＣＴ２６細胞を移植した。簡単には、Ｂａｌｂ／ｃマウスをイソフルランによって麻酔し、左側腹部切開を行ない、脾臓を露出させた。中型Ｈｏｒｉｚｏｎ チタン製外科用クリップ（Ｗｅｃｋ Ｃｌｏｓｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、ＮＣ）を用いることにより、脾臓を２つの半脾臓に分割し、血管茎は無傷の状態にした。２７ゲージニードルを用い、１０５バイアブルＣＴ−２６細胞を片方の脾臓内に注射した。次いで、ＣＴ−２６腫瘍細胞を脾静脈および門脈内に流動させ、肝臓に沈積させた。血管茎排出性癌混入半脾臓を結紮し、ＣＴ−２６混入半脾臓を切除し、腫瘍細胞のない機能性の半脾臓は残した。
細胞質ゾル内への細菌侵入の必要性を理解するため、腫瘍担持マウスを、生菌Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ、熱殺菌（ＨＫ）Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢまたはＬＬＯを産生できないリステリア菌（Δｈｌｙ、食作用性空胞から逸出できない）のいずれかで免疫処置した。リステリア属菌は、ＨＢＳＳ中で適切な濃度に希釈し、マウスに１００または２００μｌの最終容量で静脈内投与した。３日で確立された肝転移を有するＢａｌｂ／ｃマウスを、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３ｅ７ ｃｆｕ）、熱殺菌Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（３ｅ８ ｃｆｕ）またはΔｈｌｙ Ｌｍ（３ｅ８ ｃｆｕ）で処置した。ワクチン接種は、第３、１０および１７日に行なった。生存割合を、各群（ｎ＝６〜１０マウス／群）について図２０に示す。
ＨＫ−Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢおよびＬＬＯ欠損リステリア菌ではともに、未処置対照（ＭＳＴ ３１日間）に対して、生存中央値（それぞれ、ＭＳＴ ４０日間および５２日間）が有意に延長されたが、大部分の動物は、腫瘍負荷により死亡した。これは、その８０％が試験持続期間中、無腫瘍のままであったＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ処置マウスとは著しく対照的である（図２０）。このような結果は、至適Ｌｍ誘導型抗腫瘍活性には細胞質ゾル侵入が必要とされることを示す。
本発明の目的、精神および範囲が維持されるように、特定の状況、材料、物質の組成物、方法、プロセス工程または諸工程に適合させるために、当業者に自明の本発明の多くの修正および変形がなされ得る。かかる改変は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に添付された特許請求の範囲内であることが意図される。本明細書に記載の具体的な実施形態は、一例として示したものであるにすぎず、本発明は、添付の特許請求の範囲の文言とともに該特許請求の範囲に与えられる充分な均等範囲のみによって限定され、本発明は、一例として本明細書に示した具体的な実施形態によって限定されない。
図１Ａ〜１Ｅに生存データを開示する。図１Ａは、なんらの異種抗原を発現するように操作しなかったリステリア菌ΔａｃｔＡまたはリステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの投与により、腫瘍に対する生存が改善されたことを示す。この図は、異なる回数の投与、すなわち、１回投与、３回投与または３回投与に応答した生存を示す。 図１Ａ〜１Ｅに生存データを開示する。図１Ｂもまた、なんらの異種抗原を発現するように操作しなかったリステリア菌ΔａｃｔＡまたはリステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢの投与により、腫瘍に対する生存が増大したことを示す。この図は、異なる回数の投与、すなわち３日間隔または１週間隔に応答した生存を示す。 図１Ａ〜１Ｅに生存データを開示する。図１Ｃは、なんらの異種抗原を発現するように操作しなかったリステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢにより腫瘍に対する生存が増大したことを示す。投与は３日間隔で行ない、ここでは、３つの異なるレベルの１つの細菌を投与した。また、投与を１週間隔で行ない、ここでも３つの異なるレベルの１つの細菌を与えた。 図１Ａ〜１Ｅに生存データを開示する。図１Ｄは、ＣＴＸ（ｔ＝４日目）単独の投与により、いくらかの生存の増進がもたらされること、およびＣＴＸ（ｔ＝４日目）＋リステリア属菌（リステリア属菌は、５日目、１２日目および１９日目に投与；リステリア属菌は、６日目、１３日目および２０日目に投与；またはリステリア属菌は、７日目、１４日目および２１日目）の投与により、さらに増進された生存がもたらされることを示す。 図１Ａ〜１Ｅに生存データを開示する。図１Ｅは、ＣＴＸ＋リステリア属菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを用いた併用療法の進行的な遅延の結果を開示する。 図１Ｆは、ＣＴ２６腫瘍細胞接種マウスを、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢでまたはＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢなしで表示のようにして処置した場合の、ＣＴ２６腫瘍に対するマウスの生存を示す。また、マウスには抗体を投与しないか、またはＣＤ４＋ Ｔ細胞；ＣＤ８＋ Ｔ細胞；もしくはＮＫ細胞を特異的に枯渇させる抗体を表示のようにして投与した。 図１Ｇは、ＣＴ２６腫瘍細胞接種マウスを、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＮＫ細胞を特異的に枯渇させる薬剤とともにリステリア属菌ΔａｃｔＡ＋ＧＭ ＣＳＦワクチン（ＧＶＡＸ）で処置した場合の、ＣＴ２６腫瘍に対するマウスの生存を示す。 図１Ｈは、腫瘍の再抗原刺激の６０日後に腫瘍なしであったマウスの割合を示す。対照マウス（「対照」）およびＬｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを事前に注射したＣＴ２６の播種後の長期生存動物に関する結果を示す。長期生存動物に、抗ＣＤ４＋抗体の注射後（「抗ＣＤ４＋抗体」）または抗ＣＤ８＋抗体（「抗ＣＤ８＋抗体」）の注射後、枯渇抗体の注射なしで再抗原刺激した（「抗体なし」）。 図２Ａは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝ＮＫ細胞の用量依存的増加がもたらされたことを示す。 図２Ｂは、弱毒化リステリア属菌の投与により、脾ＮＫ細胞の割合は増加しなかったことを示す。 図２Ｃは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝ＮＫ細胞によるＣＤ６９の発現が用量依存的に増大したことを示す。 図２Ｄは、弱毒化リステリア属菌の投与により、脾ＮＫ細胞によるＣＤ６９の発現が増大したことを示す。 図３Ａは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝ＮＫＴ細胞の増加がもたらされたことを開示する。 図３Ｂは、弱毒化リステリア属菌の投与により、脾ＮＫＴ細胞の割合は増加しなかったことを開示する。 図３Ｃは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝ＮＫＴ細胞によるＣＤ６９の発現が増大したことを示す。 図３Ｄは、弱毒化リステリア属菌の投与により、脾ＮＫＴ細胞によるＣＤ６９の発現が増大したことを示す。 図４ＡおよびＢは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝臓または脾臓において全Ｔ細胞（白血球の割合として）の増加はもたらされなかったことを示す。 図４ＡおよびＢは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝臓または脾臓において全Ｔ細胞（白血球の割合として）の増加はもたらされなかったことを示す。 図４ＣおよびＤは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝臓または脾臓においてＣＤ４＋ Ｔ細胞（白血球の割合として）の増加はもたらされなかったことを開示する。 図４ＣおよびＤは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝臓または脾臓においてＣＤ４＋ Ｔ細胞（白血球の割合として）の増加はもたらされなかったことを開示する。 図４Ｅは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝ＣＤ４＋ Ｔ細胞による用量依存的ＣＤ６９の発現が刺激されたことを示す。 図４Ｆは、弱毒化リステリア属菌の投与により、脾ＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＣＤ６９の発現が刺激されたことを示す。 図５ＡおよびＢは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝臓または脾臓においてＣＤ８＋ Ｔ細胞（白血球の割合として）の増加はもたらされなかったことを示す。 図５ＡおよびＢは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝臓または脾臓においてＣＤ８＋ Ｔ細胞（白血球の割合として）の増加はもたらされなかったことを示す。 図５Ｃは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＣＤ６９発現が増大したことを示す。 図５Ｄは、弱毒化リステリア属菌の投与により、脾ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＣＤ６９発現が増大したことを示す。 図６Ａは、弱毒化リステリア属菌の投与により、ＧＲ−１＋好中球として存在する全肝白血球の割合が増大したことを示す。 図６Ｂは、弱毒化リステリア属菌の投与により、ＧＲ−１＋好中球として存在する全脾白血球の割合が増大したことを示す。 図７Ａは、弱毒化リステリア属菌の投与により、ＣＤ２５を発現する肝ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合が増大したことを示す。 図７Ｂは、弱毒化リステリア属菌の投与により、肝ＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＣＤ２５の発現中央値が増大したことを示す。 図７Ｃは、弱毒化リステリア属菌の投与は、ＣＤ２５を発現する脾ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合に対してほとんどまたは全く影響がなかったことを示す。 図７Ｄは、弱毒化リステリア属菌の投与は、脾臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＣＤ２５の発現に対してほとんどまたは全く影響がなかったことを示す。 図８および９は、時間経過試験を開示する。図８Ａは、弱毒化リステリア属菌の投与により、ＮＫ細胞である肝白血球の割合が増大したことを示す。 図８および９は、時間経過試験を開示する。図８Ｂは、弱毒化リステリア属菌の投与は、ＮＫ細胞である脾白血球の割合に対してほとんどまたは全く影響がなかったことを示す。 図８および９は、時間経過試験を開示する。図９Ａは、弱毒化リステリア属菌の投与により、好中球である肝白血球の割合が増大したことを示す。 図８および９は、時間経過試験を開示する。図９Ｂは、弱毒化リステリア属菌の投与により、好中球である脾白血球の割合が増大したことを示す。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈおよび１０Ｉは、リステリア菌ΔａｃｔＡ（リステリア属菌は、異種抗原をコードする核酸を含むように改変しなかった）の投与後の肝臓における免疫応答を開示する。また、リステリア属菌およびＧＶＡＸワクチンの両方の投与後の肝臓における免疫応答も示す。その後に生じる免疫応答には、ＮＫ細胞数（図１０Ａ）；ＮＫＴ細胞数（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｃ）；形質細胞様ＤＣ数（図１０Ｄ）；骨髄系ＤＣ数（図１０Ｅ）；腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｆ）；ならびにインターフェロン−γをコードするｍＲＮＡの発現によって評価される細胞活性化（図１０Ｇおよび１０Ｈ）が含まれる。図１０Ｉは、ＣＴ２６腫瘍細胞処置マウスの肝臓由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ここで、マウスにはまた、例えば、種々の治療用剤も投与した。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈおよび１０Ｉは、リステリア菌ΔａｃｔＡ（リステリア属菌は、異種抗原をコードする核酸を含むように改変されていない）の投与後の肝臓における免疫応答を開示する。また、リステリア属菌およびＧＶＡＸワクチンの両方の投与後の肝臓における免疫応答も示す。その後に生じる免疫応答には、ＮＫ細胞数（図１０Ａ）；ＮＫＴ細胞数（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｃ）；形質細胞様ＤＣ数（図１０Ｄ）；骨髄系ＤＣ数（図１０Ｅ）；腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｆ）；ならびにインターフェロン−γをコードするｍＲＮＡの発現によって評価される細胞活性化（図１０Ｇおよび１０Ｈ）が含まれる。図１０Ｉは、ＣＴ２６腫瘍細胞処置マウスの肝臓由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ここで、マウスにはまた、例えば、種々の治療用剤も投与した。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈおよび１０Ｉは、リステリア菌ΔａｃｔＡ（リステリア属菌は、異種抗原をコードする核酸を含むように改変されていない）の投与後の肝臓における免疫応答を開示する。また、リステリア属菌およびＧＶＡＸワクチンの両方の投与後の肝臓における免疫応答も示す。その後に生じる免疫応答には、ＮＫ細胞数（図１０Ａ）；ＮＫＴ細胞数（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｃ）；形質細胞様ＤＣ数（図１０Ｄ）；骨髄系ＤＣ数（図１０Ｅ）；腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｆ）；ならびにインターフェロン−γをコードするｍＲＮＡの発現によって評価される細胞活性化（図１０Ｇおよび１０Ｈ）が含まれる。図１０Ｉは、ＣＴ２６腫瘍細胞処置マウスの肝臓由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ここで、マウスにはまた、例えば、種々の治療用剤も投与した。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈおよび１０Ｉは、リステリア菌ΔａｃｔＡ（リステリア属菌は、異種抗原をコードする核酸を含むように改変されていない）の投与後の肝臓における免疫応答を開示する。また、リステリア属菌およびＧＶＡＸワクチンの両方の投与後の肝臓における免疫応答も示す。その後に生じる免疫応答には、ＮＫ細胞数（図１０Ａ）；ＮＫＴ細胞数（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｃ）；形質細胞様ＤＣ数（図１０Ｄ）；骨髄系ＤＣ数（図１０Ｅ）；腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｆ）；ならびにインターフェロン−γをコードするｍＲＮＡの発現によって評価される細胞活性化（図１０Ｇおよび１０Ｈ）が含まれる。図１０Ｉは、ＣＴ２６腫瘍細胞処置マウスの肝臓由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ここで、マウスにはまた、例えば、種々の治療用剤も投与した。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈおよび１０Ｉは、リステリア菌ΔａｃｔＡ（リステリア属菌は、異種抗原をコードする核酸を含むように改変されていない）の投与後の肝臓における免疫応答を開示する。また、リステリア属菌およびＧＶＡＸワクチンの両方の投与後の肝臓における免疫応答も示す。その後に生じる免疫応答には、ＮＫ細胞数（図１０Ａ）；ＮＫＴ細胞数（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｃ）；形質細胞様ＤＣ数（図１０Ｄ）；骨髄系ＤＣ数（図１０Ｅ）；腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｆ）；ならびにインターフェロン−γをコードするｍＲＮＡの発現によって評価される細胞活性化（図１０Ｇおよび１０Ｈ）が含まれる。図１０Ｉは、ＣＴ２６腫瘍細胞処置マウスの肝臓由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ここで、マウスにはまた、例えば、種々の治療用剤も投与した。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈおよび１０Ｉは、リステリア菌ΔａｃｔＡ（リステリア属菌は、異種抗原をコードする核酸を含むように改変されていない）の投与後の肝臓における免疫応答を開示する。また、リステリア属菌およびＧＶＡＸワクチンの両方の投与後の肝臓における免疫応答も示す。その後に生じる免疫応答には、ＮＫ細胞数（図１０Ａ）；ＮＫＴ細胞数（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｃ）；形質細胞様ＤＣ数（図１０Ｄ）；骨髄系ＤＣ数（図１０Ｅ）；腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｆ）；ならびにインターフェロン−γをコードするｍＲＮＡの発現によって評価される細胞活性化（図１０Ｇおよび１０Ｈ）が含まれる。図１０Ｉは、ＣＴ２６腫瘍細胞処置マウスの肝臓由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ここで、マウスにはまた、例えば、種々の治療用剤も投与した。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈおよび１０Ｉは、リステリア菌ΔａｃｔＡ（リステリア属菌は、異種抗原をコードする核酸を含むように改変されていない）の投与後の肝臓における免疫応答を開示する。また、リステリア属菌およびＧＶＡＸワクチンの両方の投与後の肝臓における免疫応答も示す。その後に生じる免疫応答には、ＮＫ細胞数（図１０Ａ）；ＮＫＴ細胞数（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｃ）；形質細胞様ＤＣ数（図１０Ｄ）；骨髄系ＤＣ数（図１０Ｅ）；腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｆ）；ならびにインターフェロン−γをコードするｍＲＮＡの発現によって評価される細胞活性化（図１０Ｇおよび１０Ｈ）が含まれる。図１０Ｉは、ＣＴ２６腫瘍細胞処置マウスの肝臓由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ここで、マウスにはまた、例えば、種々の治療用剤も投与した。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈおよび１０Ｉは、リステリア菌ΔａｃｔＡ（リステリア属菌は、異種抗原をコードする核酸を含むように改変されていない）の投与後の肝臓における免疫応答を開示する。また、リステリア属菌およびＧＶＡＸワクチンの両方の投与後の肝臓における免疫応答も示す。その後に生じる免疫応答には、ＮＫ細胞数（図１０Ａ）；ＮＫＴ細胞数（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｃ）；形質細胞様ＤＣ数（図１０Ｄ）；骨髄系ＤＣ数（図１０Ｅ）；腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｆ）；ならびにインターフェロン−γをコードするｍＲＮＡの発現によって評価される細胞活性化（図１０Ｇおよび１０Ｈ）が含まれる。図１０Ｉは、ＣＴ２６腫瘍細胞処置マウスの肝臓由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ここで、マウスにはまた、例えば、種々の治療用剤も投与した。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈおよび１０Ｉは、リステリア菌ΔａｃｔＡ（リステリア属菌は、異種抗原をコードする核酸を含むように改変されていない）の投与後の肝臓における免疫応答を開示する。また、リステリア属菌およびＧＶＡＸワクチンの両方の投与後の肝臓における免疫応答も示す。その後に生じる免疫応答には、ＮＫ細胞数（図１０Ａ）；ＮＫＴ細胞数（図１０Ｂ）；ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｃ）；形質細胞様ＤＣ数（図１０Ｄ）；骨髄系ＤＣ数（図１０Ｅ）；腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞数（図１０Ｆ）；ならびにインターフェロン−γをコードするｍＲＮＡの発現によって評価される細胞活性化（図１０Ｇおよび１０Ｈ）が含まれる。図１０Ｉは、ＣＴ２６腫瘍細胞処置マウスの肝臓由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ここで、マウスにはまた、例えば、種々の治療用剤も投与した。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１１ＡおよびＢは、ワクチン単独の投与により、いくらかの生存の増進がもたらされたが、ワクチンとの弱毒化リステリア属菌の投与により、より増進された生存がもたらされたことを示す。投与された細菌数は、１０７コロニー形成単位（１ｅ７コロニー形成単位；ＣＦＵ）であった。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１１ＡおよびＢは、ワクチン単独の投与により、いくらかの生存の増進がもたらされたが、ワクチンとの弱毒化リステリア属菌の投与により、より増進された生存がもたらされたことを示す。投与された細菌数は、１０７コロニー形成単位（１ｅ７コロニー形成単位；ＣＦＵ）であった。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１２は、ワクチン（ＧＭ）単独の投与により、生存のわずかな改善がもたらされ、ワクチン＋弱毒化リステリア属菌（ＧＭ＋Ｌｍ ａｃｔＡまたはＧＭ＋Ｌｍ ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ）の投与により、より増進された生存がもたらされ、ＧＭワクチン＋弱毒化リステリア属菌およびシクロホスファミド（ＣＴＸ）の投与により、さらに増進された生存がもたらされたことを示す。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１３Ａ〜Ｃは、動物にワクチン（ＧＭ）のみ、またはワクチン（ＧＭ）＋異なるレベルの弱毒化リステリア菌を投与した場合の、腫瘍に対する生存を示す。図１３Ａは、リステリア菌ΔａｃｔＡ（欠失変異体）を３×１０６ＣＦＵ、１×１０７ＣＦＵまたは３×１０７ＣＦＵで投与した場合の生存データを示す。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１３Ａ〜Ｃは、動物にワクチン（ＧＭ）のみ、またはワクチン（ＧＭ）＋異なるレベルの弱毒化リステリア菌を投与した場合の、腫瘍に対する生存を示す。図１３Ｂは、リステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ（欠失変異体）を３×１０６ＣＦＵ、１×１０７ＣＦＵまたは３×１０７ＣＦＵで投与した場合の生存データを開示する。 図１０〜１３は、サイトカインを発現するように操作された弱毒化腫瘍細胞（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むワクチンの投与による結果を開示する。このワクチンをＧＶＡＸと呼ぶ。用語「ＧＶＡＸ」、「ＧＭワクチン」および「ＧＭ−ＣＳＦワクチン」は、互換的に使用され得る。図１３Ａ〜Ｃは、動物にワクチン（ＧＭ）のみ、またはワクチン（ＧＭ）＋異なるレベルの弱毒化リステリア菌を投与した場合の、腫瘍に対する生存を示す。図１３Ｃは、ワクチンのみ、またはリステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢを３×１０３ＣＦＵ、３×１０４ＣＦＵ、３×１０５ＣＦＵ、３×１０６ＣＦＵもしくは３×１０７ＣＦＵで投与した場合の生存データを示す。 図１４は、リステリア菌ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢでの肺腫瘍の処置を開示する。 図１５は、腫瘍播種マウスを最初に、治療用剤なし、リステリア属菌のみ、ＧＭ−ＣＳＦワクチン＋リステリア属菌、またはシクロホスファミド（ＣＴＸ）のみで処置した場合の、ＣＴ２６腫瘍細胞での再抗原刺激により生じた記憶応答（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）を示す。 図１６は、腫瘍播種マウスを最初に、治療用剤なし、リステリア属菌のみ、ＧＭ−ＣＳＦワクチン＋リステリア属菌、またはシクロホスファミド（ＣＴＸ）のみで処置した場合の、ＣＴ２６腫瘍細胞での再抗原刺激により生じた腫瘍の腫瘍体積を示す。 図１７は、サイトカイン発現を示す。 図１８は、ＮＫ細胞の活性化および漸増、ならびにＭＣＰ−１発現を開示する。 図１９Ａは、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ投与後のサルにおけるＩＬ−１Ｒαの発現を開示する。 図１９Ｂは、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ投与後のサルにおけるインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の発現を開示する。 図１９Ｃは、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ投与後のサルにおける、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の発現を示す。 図１９Ｄは、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ投与後のサルにおける、ＭＣＰ−１の発現を開示する。 図１９Ｅは、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ投与後のサルにおける、ＭＩＰ−１βの発現を示す。 図１９Ｆは、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ投与後のサルにおける、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現を開示する。 図１９Ｇは、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ投与のサルにおける、種々のサイトカインの発現を開示する。 図２０は、Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ、熱殺菌された（ＨＫ）Ｌｍ ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ、およびΔｈｌｙ Ｌｍによって誘導された抗腫瘍活性の比較を示す。

Claims (55)

  1. 癌性または非リステリア感染状態を有する哺乳動物の処置方法であって、該癌性または感染状態が該哺乳動物の肝臓におけるものであり、該哺乳動物に有効量の代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌を投与することを含み、該リステリア属菌が、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まず、該弱毒化リステリア属菌が該哺乳動物に反復投与で投与される、該哺乳動物の処置方法。
  2. 前記癌性または感染状態が前記哺乳動物において、前記有効量の前記弱毒化リステリア属菌の前記投与によって抑制または低減される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記哺乳動物の生存が前記有効量の前記弱毒化リステリア属菌の前記投与によって増強される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記弱毒化リステリア属菌が、
    ａ．増殖；
    ｂ．細胞から細胞への拡散；
    ｃ．宿主細胞への結合もしくはその内部への侵入；
    ｄ．複製；または
    ｅ．ＤＮＡ修復
    の１つ以上において弱毒化されている、請求項１に記載の方法。
  5. 前記弱毒化リステリア属菌が、
    ａ．細胞から細胞への拡散；または
    ｂ．細胞から細胞への拡散および非食作用性細胞内への侵入の両方
    において弱毒化されている、請求項４に記載の方法。
  6. 前記リステリア属菌が、
    ａ．ａｃｔＡ変異；
    ｂ．ｉｎｌＢ変異；
    ｃ．ｕｖｒＡ変異；
    ｄ．ｕｖｒＢ変異；
    ｅ．ｕｖｒＣ変異；
    ｆ．核酸標的化化合物；または
    ｇ．ｕｖｒＡＢ変異および核酸標的化化合物
    の１つ以上によって弱毒化される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記リステリア属菌は、：
    ａ．ａｃｔＡ変異；または
    ｂ．ａｃｔＡ変異およびｉｎｌＢ変異の両方
    によって弱毒化されている、請求項６に記載の方法。
  8. 前記核酸標的化化合物がソラレンである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記リステリア属菌が、
    ａ．コロニーを形成すること；
    ｂ．複製すること；または
    ｃ．分裂すること
    の１つ以上を行なうことができない、請求項１に記載の方法。
  10. 前記リステリア属菌が、死菌であるが代謝的に活性である（ＫＢＭＡ）、請求項１に記載の方法。
  11. 前記弱毒化リステリア属菌が静脈内投与される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記弱毒化リステリア属菌が３回以上の投与で投与される、請求項１に記載の方法。
  13. 前記弱毒化リステリア属菌が、
    ａ．哺乳動物に経口投与されない、または
    ｂ．他の型の細菌を少なくとも９９％非含有である組成物として投与される
    の一方または両方である、請求項１に記載の方法。
  14. 前記弱毒化リステリア属菌が前記哺乳動物に医薬組成物中で投与される、請求項１に記載の方法。
  15. 前記哺乳動物には、前記癌性または感染状態に対するワクチンが以前に投与されたことがない、請求項１に記載の方法。
  16. 前記哺乳動物に前記癌性または感染状態に対するワクチンを投与することをさらに含まない、請求項１に記載の方法。
  17. 前記哺乳動物に前記癌性状態が含まれる、請求項１に記載の方法。
  18. 前記状態が腫瘍または癌を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記状態が肝臓に転移した癌を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記癌が結腸直腸癌である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記哺乳動物が非リステリア感染を含む、請求項１に記載の方法。
  22. 前記感染状態が、
    ａ．Ｂ型肝炎；
    ｂ．Ｃ型肝炎；
    ｃ．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；
    ｄ．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；
    ｅ．エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）；または
    ｆ．リーシュマニア症
    の１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
  23. 前記投与により、前記状態に対する生得的免疫応答が刺激される、請求項１に記載の方法。
  24. 前記投与により、前記状態に対する後天性免疫応答が刺激される、請求項１に記載の方法。
  25. 前記投与により、前記有効量の前記弱毒化リステリア属菌の前記投与の非存在下での免疫応答と比べ、
    ａ．ＮＫ細胞；
    ｂ．ＮＫＴ細胞；
    ｃ．樹状細胞（ＤＣ）；
    ｄ．単球もしくはマクロファージ；
    ｅ．好中球；または
    ｆ．ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）もしくはヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質
    の１つまたは任意の組合せが刺激される、請求項１に記載の方法。
  26. 前記投与により、前記有効量の前記弱毒化リステリア属菌の前記投与の非存在下での発現と比べ、
    ａ．ＣＤ６９；
    ｂ．インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）；
    ｃ．インターフェロンα（ＩＦＮα）もしくはインターフェロンβ（ＩＦＮβ）；
    ｄ．インターロイキン１２（ＩＬ １２）；
    ｅ．単球化学誘引性タンパク質（ＭＣＰ １）；または
    ｆ．インターロイキン６（ＩＬ ６）、
    のいずれか１つまたは任意の組合せの発現の増大が刺激される、請求項１に記載の方法。
  27. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
  28. 前記リステリア属菌がリステリア菌である、請求項１に記載の方法。
  29. ａ．サイトカインのアゴニストもしくはアンタゴニスト；
    ｂ．調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のインヒビター；または
    ｃ．成長もしくは複製において弱毒化された腫瘍細胞
    の１つまたは任意の組合せを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  30. 前記Ｔｒｅｇのインヒビターがシクロホスファミド（ＣＴＸ）である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記有効量が少なくとも約１×１０３ＣＦＵ／ｋｇまたは少なくとも約１×１０３リステリア属菌体／ｋｇを含む、請求項１に記載の方法。
  32. 哺乳動物において癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子に対する免疫応答を誘導するための方法であって、該哺乳動物が該癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子をその肝臓内に含み、該哺乳動物に有効量の代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌を投与することを含み、該リステリア属菌が、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まず、該弱毒化リステリア属菌が該哺乳動物に反復投与で投与され、該弱毒化リステリア属菌が、
    ａ．哺乳動物に経口投与されない、または
    ｂ．他の型の細菌を少なくとも９９％非含有である組成物として投与される、
    の一方または両方である、方法。
  33. 前記弱毒化リステリア属菌が、
    ａ．増殖；
    ｂ．細胞から細胞への拡散；
    ｃ．宿主細胞への結合もしくはその内部への侵入；
    ｄ．複製；または
    ｅ．ＤＮＡ修復
    の１つ以上において弱毒化されている、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記弱毒化リステリア属菌が、
    ａ．細胞から細胞への拡散；または
    ｂ．細胞から細胞への拡散および非食作用性細胞内への侵入の両方
    において弱毒化されている、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記リステリア属菌が、
    ａ．ａｃｔＡ変異；
    ｂ．ｉｎｌＢ変異；
    ｃ．ｕｖｒＡ変異；
    ｄ．ｕｖｒＢ変異；
    ｅ．ｕｖｒＣ変異；
    ｆ．核酸標的化化合物；または
    ｇ．ｕｖｒＡＢ変異および核酸標的化化合物
    の１つ以上によって弱毒化される、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記リステリア属菌が、
    ａ．ａｃｔＡ変異；または
    ｂ．ａｃｔＡ変異およびｉｎｌＢ変異の両方
    によって弱毒化される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記核酸標的化化合物がソラレンである、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記リステリア属菌が、
    ａ．コロニーを形成すること；
    ｂ．複製すること；または
    ｃ．分裂すること
    の１つ以上を行なうことができない、請求項３２に記載の方法。
  39. 前記リステリア属菌が、死菌であるが代謝的に活性である（ＫＢＭＡ）、請求項３２に記載の方法。
  40. 前記弱毒化リステリア属菌が静脈内投与される、請求項３２に記載の方法。
  41. 前記弱毒化リステリア属菌が３回以上の投与で投与される、請求項３２に記載の方法。
  42. 前記哺乳動物に、前記癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子に対する特異的免疫応答を刺激し得るワクチンが投与されない、請求項３２に記載の方法。
  43. 前記哺乳動物が前記癌細胞または腫瘍を含む、請求項３２に記載の方法。
  44. 前記哺乳動物が前記非リステリア感染性因子をその肝臓内に含む、請求項３２に記載の方法。
  45. 前記免疫応答により、前記哺乳動物において
    ａ．腫瘍もしくは癌細胞の数；
    ｂ．腫瘍質量；または
    ｃ．感染性因子の力価
    の１つまたは任意の組合せが抑制または低減される、請求項３２に記載の方法。
  46. 前記投与により、前記癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子に対する生得的免疫応答が刺激される、請求項３２に記載の方法。
  47. 前記投与により、前記癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子に対する後天性免疫応答が刺激される、請求項３２に記載の方法。
  48. 前記投与により、前記有効量の前記弱毒化リステリア属菌の前記投与の非存在下での免疫応答と比べ、
    ａ．ＮＫ細胞；
    ｂ．ＮＫＴ細胞；
    ｃ．樹状細胞（ＤＣ）；
    ｄ．単球もしくはマクロファージ；
    ｅ．好中球；または
    ｆ．ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）もしくはヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質
    の１つまたは任意の組合せが刺激される、請求項３２に記載の方法。
  49. 前記投与により、前記有効量の前記弱毒化リステリア属菌の前記投与の非存在下での発現と比べ、
    ａ．ＣＤ６９；
    ｂ．インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）；
    ｃ．インターフェロンα（ＩＦＮα）もしくはインターフェロンβ（ＩＦＮβ）；
    ｄ．インターロイキン１２（ＩＬ １２）；
    ｅ．単球化学誘引性タンパク質（ＭＣＰ １）；または
    ｆ．インターロイキン６（ＩＬ ６）
    のいずれか１つまたは任意の組合せの発現の増大が刺激される、請求項３２に記載の方法。
  50. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３２に記載の方法。
  51. 前記リステリア属菌がリステリア菌である、請求項３２に記載の方法。
  52. 前記免疫応答が、
    ａ．前記弱毒化リステリア属菌の投与なしでの割合と比べたＮＫ細胞である肝白血球の割合の増加；または
    ｂ．前記弱毒化リステリア属菌の投与なしでの発現と比べた肝ＮＫ細胞による活性化マーカーの発現の増大
    の一方または両方を刺激することを含む、請求項３２に記載の方法。
  53. 前記有効量の前記弱毒化リステリア属菌が、少なくとも約１×１０３ＣＦＵ／ｋｇまたは少なくとも約１×１０３リステリア属菌体／ｋｇを含む、請求項３２に記載の方法。
  54. 癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子をその肝臓内に含む哺乳動物において該癌細胞、腫瘍または非リステリア感染性因子に対する免疫応答を誘導するための方法であって、該哺乳動物に有効量の代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌を投与することを含み、該リステリア属菌が、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まず、該弱毒化リステリア属菌が該哺乳動物に反復投与で投与され、該弱毒化リステリア属菌が、
    ａ．医薬組成物中で投与されるか；または
    ｂ．天然に存在しない菌株である、
    の一方または両方である方法。
  55. 癌性または非リステリア感染状態を有する哺乳動物を処置するための方法であって、該癌性または感染状態が該哺乳動物の肝臓におけるものであり、該哺乳動物に有効量の代謝的に活性な弱毒化リステリア属菌を投与することを含み、該リステリア属菌が、該状態に対する特異的免疫応答を刺激し得る非リステリア抗原をコードする核酸を含まず、該哺乳動物に、該哺乳動物における癌性または感染状態に対して別途生じさせたワクチン誘導型免疫応答の非存在下で投与される方法。
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